WO2001092885A1 - Methode immunologique de turbidimetrie provoquee par du latex et reactif pour la mise en oeuvre de ladite methode - Google Patents

Methode immunologique de turbidimetrie provoquee par du latex et reactif pour la mise en oeuvre de ladite methode Download PDF

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latex
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Atsushi Miyamoto
Tokio Sawai
Takeshi Matsuya
Tsuneo Okuyama
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Iatron Laboratories, Inc.
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    • G01N2333/96472—Aspartic endopeptidases (3.4.23)

Definitions

  • the present invention relates to an immunological latex turbidimetric analysis method and a reagent for immunological latex turbidimetric analysis utilizing an antigen-antibody reaction. More specifically, the present invention relates to an immunological latex turbidimetric analysis method and a reagent for immunological latex turbidimetric analysis that can reduce nonspecific agglutination and can be suitably applied to analysis using an automatic analyzer. .
  • analysis in this specification includes “measurement” for quantitatively or semi-quantitatively determining the amount of the antigen or antibody to be analyzed, and “detection” for determining the presence or absence of the antigen or antibody to be analyzed. And both are included. Background art
  • an immunological analysis reagent utilizing an antigen-antibody reaction.
  • an immunological latex ratio in which latex particles carrying an antigen or antibody and latex particles resulting from an antigen-antibody reaction with an antibody or antigen in a liquid test sample are analyzed by changes in absorbance or turbidity.
  • the turbidity analysis method is widely used because it can be quantified by a simple operation using an automatic analyzer.
  • a reagent for immunological latex turbidimetric analysis for detecting an SLO antibody carrying an antigen derived from a hemolytic streptococcal cell component (strebtridine 0; hereinafter, sometimes referred to as SL 0) is used.
  • SL 0 hemolytic streptococcal cell component
  • an object of the present invention is to provide an immunological latex turbidimetric analysis method capable of eliminating and improving the effects of non-specific reactions while maintaining high specificity with the antigen or antibody to be analyzed, and a reagent therefor.
  • the object of the present invention is to provide: (1) a step of bringing a test sample which may contain an antigen or an antibody to be analyzed into contact with albumin treated with protease;
  • the method can be solved by an immunological latex turbidimetric analysis method for analyzing an antigen or an antibody to be analyzed in the test sample.
  • the present invention provides: (1) a first component containing albumin treated with protease;
  • a protease-treated albumin (preferably a protease-treated serum albumin) is used as a non-specific reaction reducing agent in immunological latex turbidimetry.
  • a protease-treated serum albumin preferably a protease-treated serum albumin
  • bumin more preferably BSA treated with protease, non-specific reaction of latex particles can be prevented without reducing reagent specificity.
  • immunological latex turbidimetric analysis refers to an immunological reaction that occurs when a latex carrier carrying an antigen (or an antibody) comes into contact with an antibody (or an antigen) in a test sample. This means that the phenomenon of aggregation is analyzed optically (for example, by using changes in absorbance or turbidity).
  • a test sample that can be analyzed using the immunological latex turbidimetric analysis method of the present invention or the immunological latex turbidimetric reagent of the present invention may contain an antigen or antibody to be analyzed.
  • the sample is not particularly limited as long as it is a sample, and examples thereof include biological fluids generally used for clinical diagnosis, for example, serum, plasma, and urine.
  • the albumin treated with protease used in the present invention is not particularly limited as long as it is albumin (preferably serum albumin, more preferably BSA) fragmented by protease treatment.
  • the albumin includes not only albumin produced from natural sources but also recombinant albumin (preferably recombinant bovine albumin) or partially synthesized albumin. Further, the following description will be made along BSA which is a preferred embodiment.
  • the protease is particularly limited as long as it does not reduce the sensitivity of the reagent for immunological latex turbidimetric analysis of the present invention and can reduce nonspecific agglutination.
  • pepsin, papain, or tribcine can be mentioned, and these proteases can be used alone or in combination of two or more.
  • pepsin it is preferable to use pepsin in terms of cost and stability.
  • a protease-treated BSA can be prepared by maintaining the BSA under acidic conditions, adding a protease thereto, and treating the protease.
  • the protease-treated reaction liquid thus obtained can be used in the present invention without purification.
  • the protease treatment means a treatment for decomposing natural albumin into a plurality of fragments.
  • about 2 to 0 albumin (preferred (About 4 to 8 fragments) means, for example, treatment of serum albumin with pepsin can be broken down into 2 to 7 fragments, and in this case the molecular weight of each fragment Is known to be about 5000-50,000.
  • the fragment mixture thus obtained can be used as it is without being separated into individual fragments, or the fragment mixture can be used as it is, or after being separated into individual fragments, a plurality of fragments (for example, , 2-9) can also be used in combination.
  • the test sample and the protein are mixed.
  • the usual immunological latex turbidimetric analysis method can be applied as it is, except that it is brought into contact with the BSA-treated with the enzyme.
  • the concentration of the protease-treated BSA is such that the non-specific reaction can be suppressed and the latex turbidity reaction does not affect the turbidity reaction itself.
  • it may be preferably 0.1 to 1.5%, more preferably 0.35 to 0.8%.
  • the unit “%” indicating the concentration of protease-treated BSA means “mass / volume% (w / v%)”. If the concentration is less than 0.1%, non-specific reactions may not be sufficiently suppressed. If the concentration exceeds 1.5%, there is no particular problem.However, it is not possible to expect an increase in the effect of increasing the concentration. It is conceivable that it may affect the reaction itself, and to achieve the effect of the present invention (that is, suppression of non-specific reaction), further addition is not meaningful.
  • latex particles carrying the antigen or antibody used in the present invention can be used without any particular limitation as long as they can be used for known immunological latex turbidimetric reagents.
  • latex particles used in a conventional method can be used.
  • polystyrene, styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl (meth) acrylate copolymer, or styrene-styrene Latex which is fine particles of organic high molecular substances such as latex such as sulfonate copolymer Particles can be used.
  • the average particle size of the latex particles can be the same as the average particle size of the latex particles used in the conventional method, and is not particularly limited.
  • the antigen or antibody carried on the latex particles is not particularly limited as long as it causes an antigen-antibody reaction with the antibody or antigen to be analyzed.
  • anti-microglobulin (? 2-M) Antibody, Anti-fibrin degradation product D fraction (FD PD) antibody, Anti-fibrin degradation product E fraction (FDP-E) antibody, Anti-fibrinolysis product DD fraction (FDP-DD) antibody, Anti-albumin antibody , Anti-puritin antibodies, anti-"-protein protein (AFP) antibodies, insulin, anti-insulin antibodies, as well as Treponema pallidum (TP), streptolysin 0 (SL 0), and hepatitis B virus (HBV) antigens or antibodies can be used.
  • Sensitization of the latex particles with the antigen or antibody can be carried out by a known method, for example, a physical adsorption method or the like. Latex particles carrying the antigen or antibody in an amount of about 0.001 to 1% by mass Can be suitably used.
  • albumin preferably serum albumin, more preferably BSA
  • denatured albumin preferably denatured serum albumin, more preferably Instead of denatured BSA
  • protease-treated albumin can be used, or proteinase-treated albumin can be used together with BSA and Z or modified BSA.
  • the buffer that can be used in the present invention can be used without any particular limitation as long as it can be used for a known reagent for immunological latex turbidimetric analysis. Examples of such a buffer include a Tris buffer, a phosphate buffer, a glycine buffer, a borate buffer, and a good buffer.
  • additives eg, stabilizers
  • stabilizers include an inorganic salt (for example, sodium chloride or sodium azhihi), a protein (for example, serum albumin), or salt of lycoline.
  • an inorganic salt for example, sodium chloride or sodium azhihi
  • a protein for example, serum albumin
  • salt of lycoline for example, sodium salt is added, the concentration is 50 to 300 mmo 1 and in the case of sodium azide, 0.01 to 1%. It is preferably used at a concentration of 0.1 to 10% in the case of serum albumin, and 0.1 to 30% in the case of lycoline.
  • the reagent for immunological latex turbidimetric analysis of the present invention contains BSA treated with protease and latex particles carrying an antigen or an antibody, and is composed of at least two reagent systems.
  • the protease-treated BSA must be brought into contact with the test sample before the test sample and the latex particles are brought into contact with each other. Before performing the test, make it contained in the reagent that comes into contact with the test sample. After bringing the reagent containing BSA into contact with the test sample, the reagent containing latex particles is brought into contact with the test sample to perform an antigen-antibody reaction.
  • protease-treated BSA can be contained, or protease-treated BSA can not be contained.
  • a conventionally known immunological latex turbidimetric reagent comprises a suspension of latex particles carrying an antigen or an antibody and a test sample stabilizing buffer.
  • the reagent for turbidity analysis further contains BSA treated with protease. Therefore, except that the protease-treated BSA is contained in at least the specific reagent, the reagent for immunological latex turbidimetric analysis of the present invention is generally used in the known immunological latex turbidimetric assay.
  • Configuration is basically the same as As described above, latex particles, antigens or antibodies, buffers, and / or additives that can be used in a conventionally known immunological latex turbidimetric reagent are also used in the reagent of the present invention. It can be used as it is, and furthermore, albumin (preferably serum albumin, more preferably BSA) and Z or denatured albumin (preferably denatured serum albumin, more preferably Denatured BSA) can be used.
  • albumin preferably
  • the immunological latex turbidimetric reagent of the present invention comprises a two-reagent system, for example, the first reagent containing the test sample stabilizing buffer and the protease-treated BSA (i.e., the first reagent) Component) and a second reagent (that is, a second component) containing latex particles carrying an antigen or an antibody.
  • the first reagent containing the test sample stabilizing buffer and the protease-treated BSA (i.e., the first reagent) Component)
  • a second reagent that is, a second component
  • the concentration of protease-treated BSA in the immunological latex turbidimetric reagent of the present invention suppresses non-specific reactions when the protease-treated BSA contained in the reagent of the present invention is brought into contact with the test sample.
  • the concentration is not particularly limited as long as the concentration can be controlled and the concentration does not affect the latex turbidity reaction itself.
  • the content of protease-treated BSA in the reagent can be preferably from 0.1 to 1.5%, more preferably from 0.35 to 0.8%.
  • the content is less than 0.1%, non-specific reactions may not be sufficiently suppressed. If the content exceeds 1.5%, there is no particular problem, but not only the effect of increasing the concentration cannot be expected, but also if the concentration is too high, the latex turbidity will be increased. The reaction itself may be affected, and further addition is not meaningful in order to achieve the effect of the present invention (ie, suppression of non-specific reaction).
  • the method of adding the protease-treated BSA is not particularly limited.
  • a two-reagent system consisting of a first reagent containing a test sample stabilizing buffer and protease-treated BSA, and a second reagent having latex particles carrying an antigen or antibody
  • a predetermined amount of protease-treated BSA can be dissolved in the test sample stabilizing buffer described above.
  • the mode of use of the immunological latex turbidimetric reagent of the present invention is not particularly limited, but the immunological latex turbidimetric reagent of the present invention is particularly suitable for analysis using an automatic analyzer. It is preferably used as an immunological latex turbidimetric reagent for automatic analysis. In particular, it is particularly suitable for immunological latex turbidimetric analysis of strepttridine 0 (SLO) antibody.
  • SLO strepttridine 0
  • a first reagent containing a test sample stabilizing buffer and a protease-treated BSA, and a latex particle carrying an antigen or an antibody are used.
  • the case of a two-reagent system consisting of the contained second reagent is exemplified below.
  • concentrations of the respective substances in the following examples exemplify preferred ranges for reagents, and do not limit the present invention.
  • Second reagent suspension containing the following (4) to (6)
  • the buffer used in the first and second reagents for example, a tris buffer, a phosphate buffer, a glycine buffer, a borate buffer, or a good buffer may be used. it can.
  • the first reagent can be prepared, for example, by mixing the protease with BSA 0.1-1.5% in a buffer solution.
  • serum albumin (Sigma) was added to 1 O mL of purified water, left at room temperature for 1 hour, and adjusted to pH 3.0 by adding formic acid while stirring with a spin bar. After leaving this to stand at room temperature for 30 minutes, add a pepsin solution (hydrochloric acid solution with a pepsin concentration of 1 mg ZmL 0.1 mol ZL) 1 67 I while stirring with a spin bar, and incubate at 25 ° C. The vessel was allowed to stand for 30 minutes. This solution was adjusted to pH 7.0 with a Tris solution at 2 mol / L while stirring with a spin bar, and sodium azide was added to a concentration of 0.1% to obtain protease treated BSA.
  • a pepsin solution hydroochloric acid solution with a pepsin concentration of 1 mg ZmL 0.1 mol ZL
  • a comparative buffer (comparative first reagent) having the same composition was prepared except that the protease-treated BSA was excluded from the first reagent according to the present invention.
  • Anti-SL0 antibody levels higher than the upper limit of measurement were obtained by conventional immunological latex turbidimetry, but normal by the Lanzlandal (Rant zR anda II) method.
  • the four sera identified as non-specific test samples were used. These non-specific test samples are considered to have resulted in high anti-SLO antibody results due to non-specific aggregation.
  • normal human serum was used as a control test sample.
  • Example 2 The first reagent 135 I according to the present invention prepared in Example 2 (2) was added to Example 2 (3
  • Example 2 (1) It was left still for 5 minutes. Next, the second reagent 135I prepared in Example 2 (1) was added and stirred, and the change in optical density at a wavelength of 700 nm from 30 seconds to 190 seconds was measured. The above operations were performed using an automatic analyzer, Hitachi 717 OS (Hitachi, Ltd.).
  • Example 2 (2) As a comparative example, the above operation was repeated except that the comparative buffer (first comparative reagent) prepared in Example 2 (2) was used instead of the first reagent according to the present invention.
  • Table 1 shows the results.
  • the absorbance change (d ABS) could not be measured mechanically, whereas in the method of the present invention using the reagent of the present invention, the SLO was accurately measured. I was able to.
  • Non-specific test sample 1 4 7.
  • 8 4 774 (absorbance over) Non-specific test sample 2 39.1 1 1 1 1 36 (absorbance over) Non-specific test sample 3 30. 3 5 30 0 (absorbance Over) Non-specific test sample 4 47.
  • the reagent for immunological latex turbidimetric analysis of the present invention has high reagent sensitivity and has an effect of reducing non-specific reactions. Therefore, according to the present invention, erroneous measurement due to non-specific agglutination caused by non-specific reaction can be reduced, and highly sensitive analysis using an automatic analyzer can be performed simply and quickly. is there.
  • the present invention has been described in accordance with the specific embodiments. However, modifications and improvements obvious to those skilled in the art are included in the scope of the present invention.

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Description

明 細 書 免疫学的ラテックス比濁分析方法及びその試薬 技術分野
本発明は、 抗原抗体反応を利用する免疫学的ラテックス比濁分析方法及び免疫 学的ラテックス比濁分析試薬に関する。 更に詳しくは、 非特異的な凝集反応を軽 減し、 自動分析装置を用いた分析に好適に適用することができる免疫学的ラテツ クス比濁分析方法及び免疫学的ラテックス比濁分析用試薬に関する。 なお、 本明 細書における前記 「分析」 には、 分析対象抗原又は抗体の量を定量的又は半定量 的に決定する 「測定」 と、 分析対象抗原又は抗体の存在の有無を判定する 「検出 」 との両方が含まれる。 背景技術
液状被検試料中の特定成分 （例えば、 分析対象抗原又は抗体） を定量的に分析 する試薬として、 抗原抗体反応を利用した免疫学的分析試薬がある。 中でも、 抗 原又は抗体を担持したラテックス粒子と、 液状被検試料中の抗体又は抗原との抗 原抗体反応に起因するラテツクス粒子の凝集を吸光度や濁度の変化で分析する免 疫学的ラテックス比濁分析方法は、 自動分析装置を用いて簡単な操作で定量する ことができることから広く用いられている。
近年、 上記のような自動分析装置を用いた分析においては、 簡便且つ迅速に高 感度の分析を行うことが望まれており、 このような要望に応える免疫学的ラテツ クス比濁分析方法及びその試薬が求められている。
従来から、 免疫学的ラテックス比镯分析用試薬においては、 感度を上げるため に、 また、 懸濁ラテックス粒子を分散させるために、 更には、 被検試料中のタン パク質等のラテックスへの非特異的な結合による非特異的な凝集を防ぐために、 ゥシ血清アルブミン （以下、 B S Aと称することがある） 及び Z又は熱変性 B S Aを添加することが行われている。 これは、 近年の食生活の変^ (ヒなどにより、 B S Aに対する抗体を持っている患者が散見されるからである。 分析用試薬への B S Aの添加は、 患者の持つ抗 B S A抗体を吸収する効果を示す。 しかしながら、 例えば、 溶血連鎖球菌体成分 （ス卜レブ卜リジン 0 ；以下、 S L 0と称すること がある） 由来の抗原を担持した S L O抗体検出用免疫学的ラテックス比濁分析用 試薬においては、 熱変性した B S Aを試薬に添加して非特異的な反応の吸収を行 なっているものの、 熱変性 B S Aの添加だけでは吸収しきれなし、非特異的反応を 示す被検試料が多く存在し、 従来から問題となっていた。 発明の開示
従って、 本発明の課題は、 分析対象抗原又は抗体との高特異性を保持したまま 、 非特異的反応の影響を排除し、 改善することが可能な免疫学的ラテックス比濁 分析方法とその試薬を提供することにあり、 特には、 自動分析装置を用いた分析 に適用した場合に、 簡便且つ迅速に高感度の分析が可能な免疫学的ラテックス比 濁分析方法とその試薬を提供することにある。
前記課題は、 本発明による、 （1 ) 分析対象抗原又は抗体を含む可能性のある 被検試料と、 プロテア一ゼ処理したアルブミンとを接触させる工程；及び
( 2 ) 前記工程 （1 ) で得られた混合物と、 前記分析対象抗原又は抗体に特異的 に反応する抗体又は抗原を担持したラテックス粒子とを接触させ、 ラテックス凝 集反応によつて発生する濁度を分析する工程
を含む、 前記被検試料中の分析対象抗原又は抗体を分析する免疫学的ラテックス 比濁分析方法により解決することができる。
また、 本発明は、 （1 ) プロテア一ゼ処理したアルブミンを含有する第 1成分 ；及び
( 2 ) 分析対象抗原又は抗体に特異的に反応する抗体又は抗原を担持したラテツ クス粒子を含有する第 2成分
を含む、 免疫学的ラテックス比濁分析用試薬に関する。 発明を実施するための最良の形態
本発明では、 免疫学的ラテックス比濁分析における非特異的反応軽減剤として 、 プロテアーゼ処理したアルブミン （好ましくはプロテア一ゼ処理した血清アル ブミン、 より好ましくはプロテア一ゼ処理した B S A) を使用することにより、 試薬特異性を低下させることなく、 ラテツクス粒子の非特異的反応を防止するこ とができる。
本明細書において、 「免疫学的ラテックス比濁分析」 とは、 抗原 （又は抗体） を担持したラテックス担体が、 被検試料中の抗体 （又は抗原） と接触した時に起 こる免疫反応に伴って凝集する現象を、 光学的に （例えば、 吸光度や濁度の変化 を利用して） 分析することを意味する。
本発明の免疫学的ラテックス比濁分析方法又は本発明の免疫学的ラテックス比 濁分析用試薬を用いて分析することのできる被検試料は、 分析対象である抗原又 は抗体を含む可能性のある試料である限り、 特に限定されるものではなく、 例え ば、 臨床診断に一般的に用いられる生体由来液、 例えば、 血清、 血漿、 又は尿を 挙げることができる。
本発明で用いるプロテア一ゼ処理したアルブミンは、 プロテアーゼ処理により 断片化されたアルブミン （好ましくは血清アルブミン、 より好ましくは B S A ) である限り、 特に限定されるものでない。 なお、 前記アルブミンには、 天然供給 源から生成したアルブミンだけでなく、 リコンビナン卜アルブミン （好ましくは リコンビナントウシアルブミン） 、 又は部分合成アルブミンも含まれる。 また、 以下の説明は、 好適な態様である B S Aに沿って説明する。
前記プロテア一ゼは、 本発明の免疫学的ラテックス比濁分析用試薬の感度を低 下させずに、 且つ非特異的な凝集反応を軽減させることができるものである限り 、 特に限定されるものでなく、 例えば、 ペプシン、 パパイン、 又は卜リブシン等 を挙げることができ、 これらのプロテア一ゼを 1種又は 2種以上の組合せで用い ることができる。 これらのプロテア一ゼの中でも、 コストや安定性の面から、 ぺ プシンを使用することが好ましい。 例えば、 B S Aを酸性条件下に保持し、 そこ にプロテアーゼを添加して処理することにより、 プロテア一ゼ処理 B S Aを調製 することができる。 こうして得られたプロテア一ゼ処理反応液は、 精製せずにそ のまま本発明で使用することができる。
本発明において、 プロテア一ゼ処理とは、 天然アルブミンを複数のフラグメン 卜に分解する処理を意味する。 詳細には、 アルブミンを 2〜 0個程度 （好まし くは、 4〜 8個程度） のフラグメントに分解する処理を意味し、 例えば、 血清ァ ルブミンをペプシンで処理すると 2〜7個のフラグメントに分解することができ 、 この場合の各フラグメン卜の分子量は約 5000〜50 000となることが知 られている。 また、 本発明では、 こうして得られたフラグメント混合物を個々の フラグメントに分離せず、 フラグメント混合物のままで使用することもできるし 、 あるいは、 個々のフラグメントに分離した後、 それらのフラグメント複数個 ( 例えば、 2〜9個） を組み合わせて使用することもできる。
本発明の免疫学的ラテックス比濁分析方法においては、 抗原又は抗体を担持し たラテックス粒子 （すなわち、 ラテックス粒子懸濁液） と被検試料とを接触させ る前に、 前記被検試料とプロテア一ゼ処理 BSAとを接触させること以外は、 通 常の免疫学的ラテックス比濁分析方法をそのまま適用することができる。
被検試料とプロテア一ゼ処理 BSAとを接触させる際の前記プロテア一ゼ処理 B SAの濃度は、 非特異的反応を抑制することができ、 且つラテックス比濁反応 自体への影響を与えない濃度である限り、 特に限定されるものではないが、 好ま しくは 0. 1〜1. 5%、 より好ましくは 0. 35〜0. 8%であることができ る。 なお、 本明細書において、 プロテア一ゼ処理 B S Aの濃度を示す単位 「％」 は、 「質量/体積％ (w/v%) 」 の意味である。 前記濃度が 0. 1 %未満であ ると、 非特異的反応を充分に抑制することができないことがある。 また、 前記濃 度が 1. 5%を越えても、 特に問題はないが、 濃度を高くすることに伴う効果の 上昇を期待することができないだけでなく、 あまり高濃度になると、 ラテックス 比濁反応自体へ影響を与えることも考えられ、 本発明の効果 （すなわち、 非特異 的反応の抑制） を達成するためには、 これ以上の添加はあまり意味がない。
本発明で用いる抗原又は抗体を担持したラテックス粒子としては、 公知の免疫 学的ラテックス比濁分析用試薬に使用することのできるものであれば、 特に制限 なく使用することができる。
ラテックス粒子としては、 従来法で使用されているラテックス粒子を使用する ことができ、 例えば、 ポリスチレン、 スチレン一メタクリル酸共重合体、 スチレ ン一グリシジル （メタ） ァクリレー卜共重合体、 又はスチレン一スチレンスルホ ン酸塩共重合体などのラテツクス等の有機高分子物質の微粒子であるラテックス 粒子を使用することができる。 ラテックス粒子の平均粒子径も、 従来法で使用さ れているラテックス粒子の平均粒子径と同様であることができ、 特に限定される ものではない。
また、 ラテックス粒子に担持する抗原又は抗体としては、 それぞれ分析対象で ある抗体又は抗原と抗原抗体反応を起こすものであれば特に限定されず、 例えば 、 抗 ? 2—マイクログロブリン （ ?2— M) 抗体、 抗線維素分解産物 D分画 （F D P-D) 抗体、 抗線維素分解産物 E分画 （F D P— E) 抗体、 抗線維素分解産 物 DD分画 （F D P— DD) 抗体、 抗アルブミン抗体、 抗フヱリチン抗体、 抗" —フヱ 卜プロテイン （AF P) 抗体、 インシュリン、 抗インシュリン抗体、 並び に卜レポネ一マ ·パリダム （T P) 、 ストレプ卜リジン 0 (S L 0) 、 及び B型 肝炎ウィルス （H BV) の抗原又は抗体を使用することができる。
ラテックス粒子への抗原又は抗体の感作は、 公知方法、 例えば、 物理的吸着法 等により実施することができ、 0. 00 1〜1質量％程度の量で抗原又は抗体を 担持させたラテックス粒子を好適に使用することができる。
非特異的反応の原因の中では、 B S Aとの反応に起因する非特異的反応だけで なく、 BS A消化物に起因する非特異的反応も、 多く発生している。 しかしなが ら、 従来は、 B S A消ィ匕物に対応する方法は知られていなかった。 また、 BSA の添加では、 BS A消化物に対する効果は期待することができないか、 あるいは 充分とはいえない。 従って、 抗原抗体反応を実施する前の被検試料に、 B SAだ けでなく、 プロテア一ゼ処理 BSAを接触させることにより、 被検試料中に存在 し、 前記の BSA及び BSA消化物と反応する物質の一部分をマスキングし、 B S A及び B S A消化物との反応に起因する非特異的反応を抑制することの意義は 特に大きい。
従って、 本発明では、 従来、 非特異的反応を抑制するために使用されていたァ ルブミン （好ましくは血清アルブミン、 より好ましくは B SA) 及び/又は変性 アルブミン （好ましくは変性血清アルブミン、 より好ましくは変性 BSA) に代 えて、 プロテア一ゼ処理したアルブミンを使用することもできるし、 あるいは、 B S A及び Z又は変性 B S Aと一緒に、 プロテア一ゼ処理したアルブミンを使用 することもできる。 本発明で用いることのできる緩衝液は、 公知の免疫学的ラテックス比濁分析用 試薬に使用することのできるものであれば、 特に制限なく使用することができる 。 このような緩衝液としては、 例えば、 卜リス緩衝液、 リン酸緩衝液、 グリシン 緩衝液、 ホウ酸緩衝液、 又はグッ ド緩衝液等を挙げることができる。
本発明においては、 本発明の効果を阻害しない範囲で、 公知の免疫学的ラテツ クス比濁分析用試薬で使用することのできる添加剤 （例えば、 安定化剤） を使用 することができる。 前記安定化剤としては、 例えば、 無機塩 （例えば、 塩化ナ卜 リウム又はアジィヒナトリウム） 、 タンパク質 （例えば、 ゥシ血清アルブミン〉 、 又は塩ィヒコリン等を挙げることができる。 これらの成分の添加量は、 特に限定さ れるものではないが、 例えば、 塩ィ匕ナトリウムを添加する場合には 5 0〜3 0 0 m m o 1 しの濃度で、 アジ化ナトリウムの場合には 0 . 0 1 ~ 1 %の濃度で、 ゥシ血清アルブミンの場合には 0 . 1〜1 0 %の濃度で、 そして、 塩ィヒコリンの 場合には 0 . 1〜3 0 %の濃度で用いることが好ましい。
本発明の免疫学的ラテックス比濁分析用試薬は、 プロテア一ゼ処理 B S Aと、 抗原又は抗体を担持したラテックス粒子とを含み、 しかも、 少なくとも 2試薬系 からなる。 本発明においては、 被検試料と前記ラテックス粒子とを接触させる前 に、 プロテア一ゼ処理 B S Aと被検試料とを接触させる必要があるので、 プロテ ァ一ゼ処理 B S Aは、 少なくとも、 抗原抗体反応を行う前に被検試料と接触させ る試薬中に含有させる。 プロテア一ゼ処理 B S Aを含有する試薬と被検試料とを 接触させた後で、 抗原抗体反応を行うためにラテックス粒子含有試薬と被検試料 と接触させる。 このラテックス粒子含有試薬の中に、 プロテアーゼ処理 B S Aを 含有させることもできるし、 あるいは、 プロテアーゼ処理 B S Aを含有させない でおくこともできる。
一般に、 従来公知の免疫学的ラテックス比濁分析用試薬は、 抗原又は抗体を担 持したラテツクス粒子の懸濁液と被検試料安定化緩衝液とからなるが、 本発明の 免疫学的ラテックス比濁分析用試薬は、 プロテア一ゼ処理 B S Aを更に含むもの である。 従って、 プロテアーゼ処理 B S Aを少なくとも特定の試薬中に含有する ことを除けば、 本発明の免疫学的ラテックス比濁分析用試薬は、 一般的に使用さ れている公知の免疫学的ラテックス比濁分析用試薬と基本的に同じ構成であるこ とができ、 先に述べたように、 従来公知の免疫学的ラテックス比濁分析用試薬に 用いることのできるラテックス粒子、 抗原又は抗体、 緩衝液、 及び/又は添加剤 を、 本発明試薬においてもそのまま使用することができ、 更には、 非特異的反応 を抑制するために使用されていたアルブミン （好ましくは血清アルブミン、 より 好ましくは B S A) 及び Z又は変性アルブミン （好ましくは変性血清アルブミン 、 より好ましくは変性 B S A) を使用することができる。
本発明の免疫学的ラテックス比濁分析用試薬が 2試薬系からなる場合には、 例 えば、 被検試料安定化緩衝液とプロテア一ゼ処理 B S Aとを含有する第 1試薬 ( すなわち、 第 1成分） と、 抗原又は抗体を担持したラテックス粒子を含有する第 2試薬 （すなわち、 第 2成分） として構成することができる。
3試薬系とすることも可能であるが、 試薬数が少なく、 分析の際の操作を簡略 化することができる点で、 2試薬系として調製することが好ましい。
本発明の免疫学的ラテックス比濁分析用試薬におけるプロテアーゼ処理 B S A の濃度は、 本発明試薬に含有されるプロテアーゼ処理 B S Aと、 被検試料とを接 触させた際に、 非特異的反応を抑制することができ、 且つラテックス比濁反応自 体への影響を与えない濃度である限り、 特に限定されるものではない。 例えば、 被検試料安定化緩衝液とプロテアーゼ処理 B S Aとを含有する第〗試薬と、 抗原 又は抗体を担持したラテックス粒子を含有する第 2試薬とからなる 2試薬系の場 合には、 第 1試薬中におけるプロテアーゼ処理 B S Aの含有量は、 好ましくは 0 . 1〜1 . 5 %、 より好ましくは 0 . 3 5〜0 . 8 %であることができる。 前記 含有量が 0 . 1 %未満であると、 非特異的反応を充分に抑制することができない ことがある。 また、 前記含有量が 1 . 5 %を越えても、 特に問題はないが、 濃度 を高くすることに伴う効果の上昇を期待することができないだけでなく、 あまり 高濃度になると、 ラテックス比濁反応自体へ影響を与えることも考えられ、 本発 明の効果 （すなわち、 非特異的反応の抑制） を達成するためには、 これ以上の添 加はあまり意味がない。
プロテア一ゼ処理 B S Aの添加方法は、 特に限定されない。 例えば、 被検試料 安定化緩衝液とプロテアーゼ処理 B S Aとを含有する第 1試薬と、 抗原又は抗体 を担持したラテックス粒子を舍有する第 2試薬とからなる 2試薬系の場合には、 前記の被検試料安定化緩衝液に所定量のプロテア一ゼ処理 B S Aを溶解させるこ とができる。
本発明の免疫学的ラテックス比濁分析用試薬の使用態様は特に限定されるもの ではないが、 本発明の免疫学的ラテックス比濁分析用試薬は自動分析装置を用い た分析に特に適しており、 自動分析用免疫学的ラテックス比濁分析用試薬として 使用するのが好適である。 中でも、 ストレブ卜リジン 0 (S LO) 抗体の免疫学 的ラテックス比濁分析にも特に適している。
すなわち、 本発明の免疫学的ラテックス比濁分析用試薬の好適な態^!としては
(A) 被検試料安定化緩衝液試薬中にプロテア一ゼ処理 BS Aを （好ましくは 0
. 1〜1. 5%の量で） 含む第 1試薬と、 抗原又は抗体を担持したラテックス粒 子の懸濁液 （第 2試薬） とからなる自動分析用免疫学的ラテックス比濁分析用試 薬、 又は
(B) 被検試料安定化緩衝液試薬中にプロテア一ゼ処理 BS Aを （好ましくは 0 . 1〜1. 5%の量で） 含む第 1試薬と、 S LOの抗原を担持したラテックス粒 子の懸濁液 （第 2試薬） とからなる S LO抗体検出用自動分析用免疫学的ラテツ クス比濁分析用試薬
等を挙げることができる。
本発明の免疫学的ラテックス比濁分析用試薬の具体的な構成として、 被検試料 安定化緩衝液とプロテア一ゼ処理 B S Aとを含有する第 1試薬と、 抗原又は抗体 を担持したラテックス粒子を含有する第 2試薬とからなる 2試薬系の場合を以下 に例示する。 なお、 以下の例示における各物質の濃度は、 試薬として好ましい範 囲を例示するものであって、 本発明を限定するものではない。
第 1試薬：下記 （ 1 ) ~ (3) を含有する溶液
(1 ) プロテア一ゼ処理 B S A 0. 1〜1. 5%
( 2 ) 緩衝液 20〜"！ O O O mmo l ZL, p H 4〜1 2
( 3 ) 塩ィヒナトリウム 50〜3 00 mmo I /L
第 2試薬：下記 （4) 〜 （6) を含有する懸濁液
( 4 ) 緩衝液 20〜1 000 mmo l ZL， p H 4〜1 2 (5) 抗原又は抗体を担持したラテックス粒子 0. 0 1〜0. 5w/v% ( 6 ) 塩ィヒナトリウム 50〜3 Q 0mmo I /L
ここで、 第 1試薬及び第 2試薬中で用いる緩衝液としては、 例えば、 卜リス緩 衝液、 リン酸緩衝液、 グリシン緩衝液、 ホウ酸緩衝液、 又はグッド緩衝液等を使 用することができる。 また、 前記第 1試薬は、 例えば、 緩衝液にプロテア一ゼ処 理 B SA0. 1 -1. 5%を混合して第 1試薬を調製することができる。 実施例
以下、 実施例によって本発明を具体的に説明するが、 これらは本発明の範囲を 限定するものではない。
実施例 1 ：プロテア一ゼ処理 B S Aの調製
ゥシ血清アルブミン （シグマ社） 500 mgを精製水 1 O m Lに加え、 室温で 1時間静置した後、 スピンバーで攪拌しながらギ酸を添加して p H 3. 0に調整 した。 これを室温で 30分間静置した後、 スピンバーで攪拌しながらペプシン溶 液 （ペプシン濃度が 1 mgZmLである塩酸液 0. O l mo l ZL) 1 67 I を添加して、 25 °Cの恒温槽に 30分間静置した。 この液をスピンバーで攪拌し ながら 卜リス溶液 2mo l /Lで p H 7. 0に調製し、 アジ化ナトリウムを 0. 1 %となるように添加し、 プロテア一ゼ処理 BS Aを得た。
実施例 2 ：血清中のス卜レブ卜リジン 0 (S L 0) 抗原の測定
(1 ) 第 2試薬 （ス トレブ卜リジン 0抗原担持ラテックス懸濁液） の調製 ポリスチレン粒子 （ラテックス濃度 =5%, 平½粒子径 =0. 1 8 / m) 懸濁 液 38 mLにカルポジイミ ド 4 O mgを添加し、 これに、 ホウ酸緩衝液 （p H 8 . 2) 1 0 mm 0 I ZLで 2, 8 m gZm Lに希釈したストレブ卜リジン 0抗原 液 2 O mLを加えて混合した。 4°Cで一晩振とうした後、 20%リジン溶液 9. 5m Lを添加し、 0. 5時間静置した。 次いで遠心分離により得られた沈渣 （ス 卜レブ卜リジン 0抗原担持ラテックス） に、 ゥシ血清アルブミン 0. 5%を含む 水溶液 1 90 m Lを添カ卩し、 更に 0. 5時間静置した。 次いで遠心分離により得 られた沈渣 （ストレブ卜リジン 0抗原担持ラテックス） に、 1 O mmo ホ ゥ酸緩衝液 （p H 8. 2) 950 m Lを加えて懸濁することにより、 本発明の免 疫学的ラテックス比濁測定用試薬における第 2試薬を調製した。
(2) 第 1試薬 （緩衝液） の調製
本発明の免疫学的ラテックス比濁測定用試薬における第 1試薬として、 塩化ナ トリウム 0. 3 1 mo l Zし、 E DTA4. 5 mmo l /L、 ゥシ血清アルブミ ン 0. 2%、 ゼラチン 0. 1 %、 及び実施例 1で調製したプロテアーゼ処理 B S A [最終濃度 （第 1試薬及び第 2試薬の等量系） =0. 4%] 0. 8%を含む卜 リス緩衝液 （p H 8. 2) 0. 1 7mo I /Lを調製した。
比較用として、 本発明による前記の第 1試薬からプロテア一ゼ処理 B S Aを除 いたこと以外は同一の組成からなる比較用緩衝液 （比較用第 1試薬） を調製した o
(3) 液状被検試料の調製
従来の免疫学的ラテックス比濁分析法による測定において測定上限 （60 0 I U/m L) 以上の抗 S L 0抗体値が得られたものの、 ランツランダル （R a n t z-R a n d a I I ) 法による測定では正常と認められた血清 4種類を、 非特異 的被検試料として使用した。 これらの非特異的被検試料では、 非特異的凝集が原 因で、 抗 S LO抗体高値の結果が得られたと考えられる。 一方、 コントロール被 検試料としては、 ヒ卜正常血清を使用した。
(4) 自動分析装置による測定
実施例 2 (2) で調製した本発明による第 1試薬 1 35 Iに、 実施例 2 (3
) で調製した液状被検試料 2 μ I をガラスセル中で添加攪拌した後、 3 7°Cで約
5分間静置した。 次いで実施例 2 (1 ) で調製した第 2試薬 1 35 I を添加攪 拌し、 30秒後から 1 90秒までの波長 700 n mにおける光学密度変化量を測 定した。 以上の操作には、 自動分析装置日立 7 1 7 O S型 （日立製作所） を用い ナ- o
比較例として、 本発明による前記第 1試薬の代わりに、 実施例 2 (2) で調製 した比較用緩衝液 （比較用第 1試薬） を用いること以外は、 前記操作を繰り返し ナ- o
結果を表 1 に示す。 比較例では機械的に吸光度変化 （d ABS) を測定できな かったのに対し、 本発明試薬を用いる本発明方法では、 正確に S LOを測定する. ことができた。 実施例 ( l UZmL) 比較例 ( I U/mし） 正常血清 24. 2 26. 2
非特異的被検試料 1 4 7. 8 4 774 (吸光度オーバー） 非特異的被検試料 2 39. 1 1 1 1 36 (吸光度オーバー） 非特異的被検試料 3 30. 3 5 30 0 (吸光度オーバー） 非特異的被検試料 4 47. 8 839 1 (吸光度才一バー） 産業上の利用可能性
本発明の免疫学的ラテツクス比濁分析用試薬は、 高い試薬感度を有しており、 しかも、 非特異的反応の軽減効果を有する。 従って、 本発明によれば、 非特異的 反応が原因の非特異凝集による誤測定を減らすことができ、 しかも、 自動分析装 置を用いた高感度な分析を簡便且つ迅速に行うことが可能である。 以上、 本発明を特定の態様に沿って説明したが、 当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 - ( 1 ) 分析対象抗原又は抗体を含む可能性のある被検試料と、 プロテアーゼ 処理したアルブミンとを接触させる工程；及び
( 2 ) 前記工程 （1 ) で得られた混合物と、 前記分析対象抗原又は抗体に特異的 に反応する抗体又は抗原を担持したラテックス粒子とを接触させ、 ラテックス凝 集反応によつて発生する濁度を分析する工程
を含む、 前記被検試料中の分析対象抗原又は抗体を分析する免疫学的ラテックス 比濁分析方法。
2 . 前記アルブミンが血清アルブミンである、 請求項 1に記載の免疫学的ラテツ クス比濁分析方法。
3 . 前記アルブミンがゥシ血清アルブミンである、 請求項 2に記載の免疫学的ラ テックス比濁分析方法。
4 . 前記プロテア一ゼがペプシンである、 請求項 1に記載の免疫学的ラテックス 比濁分析方法。
5 . 分析対象抗体が抗ス卜レブ卜リジン 0抗体であり、 ラテックス粒子に担持す る抗原が、 ス卜レブ卜リジン 0抗原である、 請求項 1 に記載の免疫学的ラテック ス比濁分析方法。
6 . ( 1 ) プロテア一ゼ処理したアルブミンを含有する第 1成分；及び
( 2 ) 分析対象抗原又は抗体に特異的に反応する抗体又は抗原を担持したラテッ クス粒子を含有する第 2成分
を含む、 免疫学的ラテックス比濁分析用試薬。.
7 . 前記アルブミンが血清アルブミンである、 請求項 6に記載の免疫学的ラテツ クス比濁分析用試薬。
8 . 前記アルブミンがゥシ血清アルブミンである、 請求項 7に記載の免疫学的ラ テックス比濁分析用試薬。
9 . 前記プロテアーゼがペプシンである、 請求項 6に記載の免疫学的ラテックス 比濁分析用試薬。
1 0 . 分析対象抗体が抗ス卜レブトリジン 0抗体であり、 ラテックス粒子に担持 する抗原が、 ストレブ卜リジン 0抗原である、 請求項 6に記載の免疫学的ラテツ クス比濁分析用試薬。
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