WO1997010341A1 - D-pantolactone hydrolase et gene codant ladite substance - Google Patents

D-pantolactone hydrolase et gene codant ladite substance Download PDF

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WO1997010341A1
WO1997010341A1 PCT/JP1996/002620 JP9602620W WO9710341A1 WO 1997010341 A1 WO1997010341 A1 WO 1997010341A1 JP 9602620 W JP9602620 W JP 9602620W WO 9710341 A1 WO9710341 A1 WO 9710341A1
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protein
hydrolase
pantolactone
genus
amino acid
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PCT/JP1996/002620
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Keiji Sakamoto
Hideaki Yamada
Sakayu Shimizu
Michihiko Kobayashi
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Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
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    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/001—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by metabolizing one of the enantiomers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
    • C12P41/005—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of carboxylic acid groups in the enantiomers or the inverse reaction

Definitions

  • the present invention relates to a novel enzyme useful for optical resolution of D, L pantractone by D-selective asymmetric hydrolysis and a gene encoding the same.
  • the present invention relates to a natural D-pan lactone hydrolase derived from Fusarium oxysporum or a protein having an activity substantially equivalent thereto, and a gene encoding the same.
  • the present invention provides a DNA containing a nucleotide sequence encoding the protein, a host cell transformed with the DNA, a method for producing the D-pantolactone hydrolase using the host cell, Relates to the use of these proteins and host cells. Background art
  • D pantolactone is known as an intermediate in the production of D pantothenic acid and pantethine, which are useful as medically or physiologically important vitamins.
  • D-pantolactone has been produced by optical resolution of chemically synthesized D, L pantractone:
  • this method requires expensive resolving agents such as quinine and brucine.
  • the present inventors have proposed optical resolution by enzymatic asymmetric hydrolysis of D, L pantolactone. The method is disclosed in JP-A-3-65619 and JP-A-4-144681.
  • the method comprises the steps of producing D-pantoic acid, separating the D-pantoic acid, and converting it to D-pantolactone. This is a method for producing D-pantone hydrolase.
  • microorganisms do not necessarily have the hydrolytic activity that can be immediately used industrially. In order to raise the level to a possible level, it is necessary to perform complicated and difficult studies that require a long time on culture conditions and activity induction conditions.
  • these microorganisms are fungi, the preparation of immobilized cells that are more advantageous for industrial production than cells having a single form, such as fungi having various forms of mycelia, is required.
  • disclosure of fairly even when purified from bacterial cells c further enzyme is a problem that it is difficult to, D- pan tractor tons hydrolysis and about the degrading enzyme has a problem such as poor quite recoveries c iNVENTION
  • the present invention solves these problems, further D- pan c that is intended to occupy if possible a dramatic increase in the enzyme activity by tractor tons modification of hydrolytic enzymes themselves, the present invention is natural D — Pantolactone hydrolase, for example, natural D-pantolactone hydrolase derived from Fusarium oxysporum, or a tan having substantially the same activity.
  • a host cell transformed with a DNA containing a base sequence encoding the protein, which clarifies a gene encoding the protein, a method for producing the protein using the host cell, and a method for producing the protein and the host An object of the present invention is to provide a use of cells and the like.
  • the present inventors isolated a gene encoding D-pantolactone hydrolase from the microorganism having the ability to degrade lactone and efficiently used the D-pantolactone hydrolase gene thus isolated.
  • Developing a D-pantolactone production system that is more productive and not only solves the various problems described above, but also improves the lactone hydrolytic ability that has newer functions and functions. It is thought to contribute much to the development of the enzyme of the roller and the development of technology using it.
  • microorganisms of the genus Fusarium that produce D-pantolactone hydrolase, such as D-pantrac derived from Fusarium oxysporum We succeeded in isolating a novel gene encoding a hydrolase that has hydrolytic activity and completed the present invention.
  • the present invention relates to a natural D-pantolactone hydrolase or a protein having substantially the same activity, or a protein having substantially the same primary conformation or a salt thereof, and a feature of the protein.
  • a method for producing the protein or a salt thereof by culturing the host cell transformed by the method described above, and further using a host cell recombinant protein or a salt thereof genetically engineered in this manner.
  • a D-pantractone hydrolase or a salt thereof which has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or an amino acid sequence substantially equivalent thereto.
  • the natural D-pantolactone hydrolase is selected from the group consisting of Fusarium, Sindrocarpon, Gibberella, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Volterra, Griocladium, Eurotium, The above (1), which is derived from a microorganism belonging to the genus Nectria, Schizophyllum, Myrosesium, Neurosbora, Acrimonium, Tuberculina, Abscissia, Sporothrix, Verticillium or Arsloderma. )
  • nucleic acid having a base sequence encoding the protein or the partial peptide thereof according to any one of the above (1) to (7); (9) SEQ ID NO: : The nucleic acid according to the above (8), which has an open reading frame portion or a nucleotide sequence having substantially the same activity as the open reading frame portion of the nucleotide sequence represented by 2,
  • the transformant according to the above (11) is cultured in a nutrient medium capable of growing, and the recombinant protein contains D-pantolactone hydrolase or a salt thereof as a recombinant protein.
  • (1) to (7) including the D-pantolactone hydrolase or a salt thereof, which produces the protein or the partial peptide thereof according to any one of (1) to (7).
  • D, L-pantolactone optics using the protein according to any one of the above (1) to (7) or a partial peptide thereof or the transformant according to the above (11). Provides a method for producing D-pantolactone by splitting.
  • the present invention provides a D-pantolactone hydrolase or a salt thereof, which has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence obtained by analyzing the digestion peptide of D-pantolactone hydrolase.
  • FIG. 2 shows the site corresponding to the cDMA amino acid sequence of the digestion peptide of D-pantolactone hydrolase.
  • FIG. 3 shows the structure of a primer used for PCR in which D-pantolactone hydrolase genomic DNA was type II.
  • Figure 4 is, c indicating a primer structure used for PCR using the construct D- pan tractor tons hydrolase expression base Kuta one
  • FIG. 5 shows the amino acid sequence of D-pantolactone hydrolase and the nucleotide sequence encoding it.
  • a gene encoding a natural D-pantolactone hydrolase for example, a natural D-pantolactone hydrolase derived from Fusarium oxysporum or a protein having an activity substantially equivalent to that of the natural D-pantolactone hydrolase is used.
  • Cloning, identification, and determination of characteristic sequences (e.g., quenching), recombination of the expression vector of the gene, and the use of DNA containing a base sequence encoding the protein Preparation, culturing, and propagation of transformed host cells, production of the protein using the host cell, and uses of the protein and the host cell are provided. These are described in detail below in order.
  • the present invention provides various means using the gene encoding the D-pantolactone hydrolase, and more efficiently and more utilizing the D-pantolactone hydrolase gene thus isolated.
  • a highly productive D-pantolactone production system will be provided.
  • a natural D-pan lactone hydrolase or a protein having an activity substantially equivalent to that of a natural D-pan lactone hydrolase, or a protein or a salt thereof having a substantially equivalent primary conformation, or a characteristic of its protein Vectors or plasmids containing such partial peptides or their salts, genes encoding them such as DNA, RNA, etc., so that they can be manipulated by genetic recombination techniques, or vectors such as these
  • the transformed host cell a method of culturing the host cell to produce the protein or its salt, etc., and further using the genetically engineered host cell, recombinant protein or its salt, etc.
  • D pan concepton hydrolase or a salt thereof which preferably has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or an amino acid sequence substantially equivalent thereto, is specifically mentioned.
  • the D pantolactone hydrolase of the present invention may be any as long as it has a novel amino acid sequence having the ability to hydrolyze D pantolactone.
  • D Pan lactone hydrolyzing ability may be any as long as its activity is the same.
  • the D-pan lactone hydrolase of the present invention is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or any sequence having substantially the same amino acid sequence as Z or the same amino acid sequence.
  • the D-pantolactone hydrolase gene of the present invention can be cloned, for example, by the following method. Genetic recombination technology, for example,
  • the obtained cells of Fusarium oxysporum are disrupted, the chromosome DNA is centrifuged by a conventional method, the RNA is decomposed and removed, and the protein is removed to purify the DNA component.
  • the chromosome DNA is centrifuged by a conventional method, the RNA is decomposed and removed, and the protein is removed to purify the DNA component.
  • microorganisms belonging to the genus Fusarium and capable of producing D-pantolactone hydrolase are suitable as DNA sources.
  • genus Sylindrocarpon Gibberella, Ashergillus, Benicillium, Rhizopus, Volterra, Griocladium, Eurotime, Nectria, Schizophyllam, Myrosesium, Neurolo Microorganisms belonging to the genera Spora, Atarimonium, Tuberculina, Absizia, Sporostrix, Verticillium, or Arsroderma, and microorganisms capable of producing D-pantolactone hydrolase are also DNA sources.
  • microorganisms include, for example, silicon carpone, tonkinens IFO 305, 61, diperera, fujikuroi IFO 63349, and Aspergillus amori IFO.
  • a synthetic oligonucleotide primer is prepared based on the amino acid information of the internal peptide of D-pantolactone hydrolase.
  • the microorganism is the above-mentioned microorganism and has an ability to produce D-pantolactone hydrolase.
  • a synthetic oligonucleotide primer can be prepared based on the acid information.
  • a digitized primer is produced based on the amino acid sequence.
  • the primer can be prepared by a method known in the art, for example, by using an automatic DNA synthesizer by a phosphodiester method, a phosphotriester method, a phosphoramigite method, or the like.
  • D-pantolactone hydrolase is purified from the cells obtained by culturing Fusarium oxysporum I FO 5.9 42 in a nutrient medium, and fragmented with a peptide hydrolase if necessary. And collects information on the amino acid sequence of the internal peptide of the enzyme. Based on the information on the amino acid sequence thus obtained, a preferred synthetic oligonucleotide primer is prepared. Using these primers, PCR is performed using the D-pantolactone hydrolase genomic DNA as type III. The PCR reaction can be performed by a method known in the art or a method substantially similar to or a modification thereof. For example, R. Saiki, et al., Science, Vol. 230, pp. 1350 ( 1985); R. Saiki, et al., Science, Vol. 239, pp. 487
  • reaction can be carried out, for example, using a commercially available kit reagent.
  • the obtained wide DNA fragment was sequenced and confirmed to contain a sequence homologous to the amino acid sequence of the internal peptide of the purified enzyme, which was labeled with an isorobe and used as a probe in subsequent experiments.
  • the nucleotide sequence can be determined using the Didoxy method, for example, the Maxam-Gilberl method such as the M13 dideoxy method ⁇ , a commercially available sequencing kit, for example, Taq dye primer cycle sequencing. It can be performed using a kit or the like, or using an automatic sequencing device such as a fluorescent DXA sequencer device. Labeling can be performed using a commercially available labeling kit, for example, a random primed DNA labeling kit (Boehringer Mannhai'm).
  • RNA isolation can be performed by a method known in the art or a method substantially similar thereto ⁇ a modified method.
  • the total RNA obtained may be Oligo (dT) —Poly (A) mRNA can be obtained by purification using a cellulose column, etc. c , or a microorganism belonging to the genus Fusarium that has the ability to produce D-pantolactone hydrolase. It can be used favorably as a source.
  • Fusarium microorganisms for example, Fusarium 'Oxysporum IFO 5942, Fusarium' semi-technical IFO 3200 can be used:
  • genus Cylindrocarpon Gibberella, Asvergillus, Beni Genus Silium, Rhizopus, Volterra, Gliocladium, Eurotium, Nectria, Schizophyllum, Myrosesium, Neurospora, Ata-limonium, Tuberculina, Absizia, Sborosurix, Microorganisms belonging to the genus Verticillium or the genus Arsloderma and capable of producing D-pantolactone hydrolase could also be used as the mRNA source.
  • microorganisms include, for example, silica gel Rupont-Tonkinens IF03506 zipperella fujikuroi IFO63349, Aspergillus ⁇ amori IF04033, Penicillium chrysogenum IF04 6 2 6, Rhizobus oryzae IF 0 4 7 0 6, Volterra, Buxi IF 0 6 0 3, Glio cladium Catennuratam I FO 6 1 2 Eurotime 'Chebaerieri IF ⁇ 4 3 3 4, Nectria' Elegance IF 0 7 1 8 7, Schizophyllam. Komune IF 0
  • the obtained clones are sequenced, and D-pantorak is determined by examining the amino acid sequence. It can be confirmed that the ton hydrolase gene is cloned.
  • transformation of host cells such as Escherichia coli can be performed by a method known in the art, such as the calcium method, rubidium Z calcium method, or a method substantially similar thereto. (D. Hanahan. J. ol. Biol .. Vol. 166. p.557 (1983), etc.).
  • the prepared cDNA can also be used to perform a PCR amplification reaction on type II:
  • the primer obtained in 2) above can be used:
  • Plasmids that incorporate the D-pantolactone hydrolase gene include DXA in host cells commonly used in genetic engineering (eg, prokaryotic host cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, and eukaryotic host cells such as yeast). Any plasmid can be used as long as it can express c. In such a sequence, for example, a codon suitable for expression in a selected host cell should be introduced, or a restriction enzyme site should be provided. Is also possible.
  • target genes such as control sequences and facilitating sequences for facilitating the expression of the target genes can be linked. It is possible to include linkers, adapters, etc., which are useful for matching, control of antibiotic resistance, etc., metabolism control, and sequences useful for selection and the like.
  • a suitable promoter for example, a plasmid using Escherichia coli as a host, is a tryptophan (trp) promoter, a lactose promoter.
  • trp tryptophan
  • Examples of plasmids using Escherichia coli as a host include, for example, pBR322, pUC18, pUC19 pUC118, pUC119, pSP64, pSP65, and pTZ-1. 8 R /-18 U, p TZ-19 R /-19 '', pGEM-3, p GEM-4, pGEM-3 Z, pGEM-4 Z, p GEM-5 Z f (one), p B 1 uescript KS 1
  • Plasmid vectors suitable for expression in Escherichia coli include pAS, pKK223 (Pharmacia), pMC40.3, PMC931, and pKC3. 0 is also included.
  • Examples of a plasmid using yeast as a host include YI p-type vector, YE p-type vector, YR p-type vector, and YC p-type vector, such as pGPD-2. You.
  • the host cell includes, for example, those derived from Escherichia coli K12 strain, for example, NM533XL1—B1ue, C600, DH1, and HB101.
  • the genetic engineering technique of the present invention includes a structure suitable for cloning restriction enzymes, reverse transcriptase, and DNA fragments known or widely used in the art.
  • DKA modification an enzyme to modify or convert Decorating / degrading enzymes, DNA polymerase, terminal nucleotidyltransferase, DNA ligase and the like can be used.
  • Restriction enzymes include, for example, RJ Roberts, Nucleic Acids Res. Vol. 13, rl65 (1985); S. Linn et al. Ed. Nucleases, p. 109, Cold Spring Harbor Lab .. Cold Spring Harbor, New York, Examples of the reverse transcriptase described in 1982 include reverse transcriptase derived from mouse Moloney leukemia virus (MMLV).
  • MMLV mouse Moloney leukemia virus
  • transcriptase reverse transcriptase derived from avian myeloblastosis virus (AMV), and the like, and in particular, RNase H-deficient can be preferably used.
  • a polymerase include Escherichia coli DNA polymerase, its derivative Klenow fragment, Escherichia coli phage T4 DNA polymerase, Escherichia coli phage T7 DNA polymerase, and thermostable DNA polymerase.
  • silyltransferase include, for example, R. Wu et al. Ed., Methods in Enzymology, Vol. 100, p. 96. Academic Press. New York (1983).
  • DNA modifying and degrading enzymes include exonuclease and endonuclease, such as snake venom phosphodiesterase, spleen phosphodiesterase, E. coli DNA exonuclease I, E. coli DX A exonuclease III, and E. coli DN A exonuclease V11, exonuclease ', DXase I, nuclease S'1, Micrococcus nuclease and the like:
  • DNA ligase include E. coli DXA ligase, T4 DXA ligase and the like.
  • Suitable vectors for cloning the DXA gene to construct a DNA library include plasmid, sphage, cosmid, and P1. Phage, F factor, YAC, etc., preferably sphage-derived vectors, such as Char0n4A, Charon
  • the amino acid sequence of D-pantolactone hydrolase can be incorporated into the amino acid sequence of D-pantolactone hydrolase by using a method commonly used in genetic engineering based on the gene base sequence of D-pantolactone hydrolase according to the present invention.
  • a corresponding protein into which a mutation such as substitution, deletion, insertion, transfer, or addition of one or more amino acids has been introduced can be produced.
  • the obtained protein of the present invention can be modified by modifying the amino acid residues contained in the protein by a chemical method, or by using a peptidase such as pepsin, chymotrypsin, panoin, bromelain, and endopeptida. It can be modified with an enzyme such as zeloid or exopeptidase, or can be partially degraded to obtain its derivative.
  • it is expressed as a fusion protein when produced by genetic recombination, and has a biological activity substantially equivalent to that of natural D-pantolactone hydrolase in vivo or in vitro. Converted to ⁇ May be processed. The ability to use fusion production methods commonly used in genetic engineering. ⁇ Such fusion proteins can also be purified by affinity mouth chromatography using such fusion sites. Modification and alteration of protein structure can be found in, for example,
  • the present invention relates to a method wherein one or more amino acid residues differ from the natural amino acid residue in terms of identity, and the position of the one or more amino acid residues differs from the natural amino acid residue. Is also good.
  • the present invention relates to a method for producing a natural D-pantolactone hydrolase comprising one or more amino acid residues (for example, 1 to 80, preferably 1 to 60, more preferably 1 to 40, More preferably, 1 to 20, especially 1 to 10, and the like.
  • One or more deletion analogs lacking, specific amino acid residues for example, 1 to 80, preferably 1 to 6) 0, more preferably 1-40, more preferably 1-20, especially 1-10, etc.
  • 1 to 80 preferably 1 to 60, more preferably 1 to 40, More preferably, 1 to 20 (especially 1 to 10 and the like) amino acid residues are added.
  • Those having a domain structure characteristic of natural D-pantolactone hydrolase may also be included. Also, those having the same D-pantolactone hydrolase activity can be mentioned.
  • the above mutants are all included in the present invention. It is also considered that those having a primary structural conformation substantially equivalent to the natural D-pantolactone hydrolase of the present invention or a part thereof may be included. It is considered that those having a biological activity substantially equivalent to that of pantolactone hydrolase may be included. It can also be one of the naturally occurring variants. D- pan tractor tons hydrolase such invention, separation as described below - c which can be purified treated, on the one hand, thus the present invention encodes a polypeptide as described above D.
  • ⁇ A sequence, and D-pantolactone hydrolase polypeptide having all or a part of natural characteristics, and ⁇ ⁇ 'A sequence encoding its analog or derivative I do.
  • the base sequence of the D-pantolactone hydrolase can be modified (eg, added, removed, substituted, etc.), and such modified ones can be included. Since the DNA sequence of the present invention provides information on the amino acid sequence of D-pantone hydrolase protein which has not been known until now, the use of such information is also encompassed in the present invention. You. Such uses include, for example, microorganisms encoding D-pantolactone hydrolase and related proteins, particularly preferably D-pantolactone hydrolysis.
  • Microorganisms that have the ability to produce enzymes, such as Fusarium, Silicon carboxylic, Gibberella, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Volterra, Griocladium, Nurotium, Nectria A microorganism belonging to the genus Schizophyllum, Myrosesium, Neurosbora, Acrymonium, Tuberculina, Absizia, Sporostrix, Bertiecilium or Arsrodhama, and has the ability to produce D-pantolactone hydrolase Design of a mouth for isolation and detection of genomic DNA and cDNA of microorganisms.
  • enzymes such as Fusarium, Silicon carboxylic, Gibberella, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Volterra, Griocladium, Nurotium, Nectria
  • the DNA sequence of the present invention may be, for example, a genome of a microorganism having the ability to produce D-pantolactone hydrolase encoding D-pantolactone hydrolase and related proteins, particularly preferably a microorganism such as the above Fusarium genus. It is useful as a probe for isolation and detection of DNA and cDNA.
  • PCR method more reverse transcriptase (RT) PCR method (RT- PCR) can be utilized c D-pan tractor tons hydrolase and its associated DNA with the black
  • RT- PCR reverse transcriptase
  • the characteristic sequence region was selected based on the amino acid sequence deduced from the sequenced and sequenced D-pantolactone hydrolase cDNA sequence.
  • the DNA primer was designed and chemically synthesized.
  • the A primer can be used for the isolation and detection of D-pantolactone hydrolase-related genes using PCR, RT-PCR, and other methods.c
  • the present invention According to this, the gene for D-pantolactone hydrolase and the recombinant DNA molecule are transferred to a host, and the D-pantolactone hydrolase is expressed to obtain the desired D-pantolactone hydrolase. Who There is provided.
  • a recombinant or transfectant that substantially expresses the gene for D-pantolactone hydrolase is provided. / Four
  • the present invention relates to a protein having D-pantolactone hydrolase activity or a protein characterized by having substantially the same activity as the protein or a salt thereof, more preferably a protein derived from Fusarium oxysporum.
  • Polypeptide having at least a part or all of a protein having substantially the same activity as D-pantolactone hydrolase or a salt thereof, or having substantially the same primary structure conformation.
  • the present invention relates to a nucleic acid such as DNA or RNA which enables the expression of a tide in a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote.
  • nucleic acids are (a) a sequence capable of encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or a sequence complementary thereto, (b) the DNA sequence of (a) or a fragment thereof. And (c) a sequence having a degenerate code capable of hybridizing to the sequence of (a) or (b).
  • Prokaryotes such as Escherichia coli, and eukaryotes, which can be transformed with such nucleic acids and express the polypeptides of the invention, also feature the invention.
  • a protein having D-pan lactone hydrolase activity a DNA encoding a protein characterized by having substantially the same activity as the protein, or a DNA capable of expressing the DNA.
  • Microorganisms capable of producing D-pantolactone hydrolase such as vectors containing vectors, such as Fusarium, Sindrolocarboxylic, Gibberella, Asvergillus, Penicillium, Rhizopus, and Volterra , Glio cladium, Eurotium, Nectoria, Schizophyllum, Myrosesium, Neurosbora, Acrimonium, Babellina, Absisidia, Sborothrix, Parthenium, or Alsloderma Into D-pan lactone hydrolase It is also possible to obtain a microorganism having a modified production ability.
  • microorganisms include, for example, Fusarium oxasporum IFO 5942, Fusarium semi-technical IF ⁇ 320, cylinder port carpon tonkinens IFO 3061, Giperella Fujicloi IFO 6 3 4 9, Aspergillus IFO 4 0 3 3,
  • Transformation can be performed by contacting DNA in the presence of calcium chloride, polyethylene glycol, etc., with a cell in the form of a plastic plate prepared using an appropriate cell wall lysing enzyme.
  • a cell in the form of a plastic plate prepared using an appropriate cell wall lysing enzyme.
  • Enzymes can be prepared from various raw materials, for example, cell culture solutions, cell culture crushed products, and the like, using methods known in the art from enzyme-producing materials such as transformed cells.
  • Salting-out such as phenol precipitation, gel filtration using Sephadex, etc., for example, ion-exchange chromatography using a carrier having getylaminoethyl or carboxymethyl groups, etc., for example, butyl, octyl, phenyl
  • a carrier with a hydrophobic group such as a group L, hydrophobic chromatography, dye gel chromatography, electrophoresis, dialysis, ultrafiltration, affinity chromatography, high-performance liquid chromatography It can be obtained by purification by the Rafie method or the like.
  • Enzyme-producing cells When obtained as an inclusion body, it is activated by solubilization treatment, for example, in the presence of a denaturing agent such as guanidine hydrochloride or urea and, if necessary, a reducing agent such as 2-mercaptoethanol or dithiothreitol.
  • Enzyme-producing cells can also be used as they are as enzymes.
  • the immobilized enzyme include those in which an enzyme or an enzyme-producing cell is immobilized by a method known in the art, and can be immobilized by a carrier binding method such as a covalent bonding method or an adsorption method, a cross-linking method, an inclusive method, or the like. .
  • condensing agents such as glutaraldehyde, hexamethylene diisocyanate, and hexamethylene diisothiocyanate can be used and immobilized as needed: monomers can be gelled by a polymerization reaction.
  • Monomer method pre-polymer method of polymerizing larger molecules than ordinary monomer, polymer method of gelling polymer, etc., immobilization using polyacrylamide, alginic acid, collagen, Examples include immobilization using natural polymers such as gelatin, agar, and kappa-ragi-nan, and immobilization using synthetic polymers such as photocurable resins and urethane polymers.
  • Microbial cultivation enzymatic asymmetric hydrolysis using lactone hydrolase, including D-pantone hydrolysis using enzymes, and optical resolution of lactone-based compounds by enzymatic hydrolysis.
  • the processing can be performed as described in JP-A-3-61998 and JP-A-4-144681. For example, transformants cultured with shaking in a liquid medium are collected, and an aqueous solution of D, L-pantolactone (2 to 60% concentration) is added to the obtained cells, and the pH is adjusted to 6 to 8.
  • an organic solvent an ester such as ethyl acetate
  • Aromatic hydrocarbons such as benzene, and halogenated hydrocarbons such as chloroform.
  • EJ M-ES E-1 is the Ministry of International Trade and Industry of the Ministry of International Trade and Industry of 1-3-1, Tsukuba-Higashi, Ibaraki Pref. Deposited with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology ( ⁇ ' ⁇ ⁇ ) (Accession No. FE RM ⁇ - 5 4 ⁇ ⁇ ⁇ ). Requested for transfer to deposit and stored at NI ⁇ ⁇ ⁇ under accession number FE RM ⁇ 5—5 6 3 8:
  • Example 1 EJ M-ES E-1
  • Lyophilized D-pantolactone hydrolase prepared according to Example 1 of JP-A No. 4144681, 14.3 nmol (subunit molecular weight of G000) containing 5 M urea in 5 Om Tris-HCl (pH 9.0) Dissolve in 4 ⁇ 1 and denature with 37 for 1 hour.
  • the suspension was suspended in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0, 1. NaCl, ⁇ % PVP (Polyvinylpyrrol idone. Sigma) and incubated at 65 ° C for 3 to 4 hours.
  • the supernatant obtained by centrifugation was sequentially treated with phenol, phenol Z Clohform and Clohform, and DNA was precipitated with an equal volume of isopropanol. After washing with 70% ethanol and air-drying, it was dissolved in TE (Tris 1 O mM—EDTA 1 m ⁇ pH 7.8).
  • Ri ⁇ A was degraded by ribonuclease A and ribonuclease T1, and treated with phenol, phenol, / form / form, and chloroform in order to remove proteins.
  • a sense primer corresponding to the sense strand of the N-terminal amino acid sequence Based on the amino acid sequence information of the internal peptide of D-pantone hydrolase (Figs. 1 and 2), a sense primer corresponding to the sense strand of the N-terminal amino acid sequence And an antisense primer corresponding to the antisense strand of the internal peptide sequence (FIG. 3).
  • PCR was performed under the following conditions using genomic DIA of D-pantone hydrolase as type II.
  • the PCR width is, for example, R. Saiki, et al., Science, Vol. 230, pp. 1350 (1985); R. Saiki, et al., Science, Vol. 239, pp. 487 (1988); PCR Technology. This was performed according to the method described in Stockton Press (1989) and the like. About lkb of amplified D. ⁇ 'A fragment was obtained by PCR amplification.
  • C Di ⁇ 'A whose nucleotide sequence was determined, was found to have a partial deletion of the ⁇ ⁇ ' end and no start codon, so a new start codon was artificially inserted.
  • the expression vector (designated PFLC40E) was constructed using the cat method. Synthetic oligonucleotides of sense and antisense primers having the restriction enzyme sites shown in FIG. 4 were prepared, and PCR was performed using these primers under the following conditions. PCR amplification is described, for example, in R. Saiki, et al., Science, Vol. 230, pp. 1350 (1985); R. Saiki, et al., Science, Vol. 239, pp. 487 (1988); PCR Technology, Performed according to the method described in Stockton Press (1989), etc.
  • Tth polymerase buffer (X10) 1 0 1
  • the PCR product thus obtained has EcoRl and Xbal restriction enzyme sites at both ends, so that each restriction enzyme (EcoRi (Takara Shuzo) and Xbal (Takara Shuzo))
  • the expression vector (PFLC40E) was constructed by carrying out a ligation reaction with pUC18 (Takara Ligation Kit).
  • the vector was subjected to the method described in "Molecular Cloning" second ed., 1989, ed. By J. Sambrook et al., Cold Spring Habor Laboratory Press.
  • the cells were transformed and transformed.
  • the transformants were selected on a 2 X YT medium (tribton 1.53 ⁇ 4, yeast extract 13 ⁇ 4, NaCl 0.53 ⁇ 4) containing 50 mg / l ampinline: The transformation was performed according to the calcium chloride method.
  • the recombinant E. coli thus obtained contains the above-mentioned 50 mg / l ampicillin.
  • Pre-culture in a test tube containing 10 ml of XYT medium and use this pre-culture solution (total of 100/1) as a seed culture in 100 ml of main culture solution with the same composition as the pre-culture solution for a culture time of 100 ml.
  • Temperature, isopropyl / 3-thiogalactopyranoside (IPTG) addition time, etc. were examined: The culture results are shown in Table 1. After cultivation, the resulting cells were disrupted by ultrasonication, and the supernatant was centrifuged. D Pantolactone hydrolase activity was measured. The specific activity under optimal conditions was 2.25 ⁇ / mg.
  • the enzymatic activity of D-pantolactone hydrolase is measured under the following conditions, and the enzyme activity that hydrolyzes l // mol of D-pantolactone per minute is defined as 1 unit (unit).
  • E. coli JVI] 09 transformed with PFLC40E was cultured in 2'Y 2 medium. IPTG was added to a final concentration of 2 mM.
  • I PTG was added to 2X YT medium at the same time as the start of culture.
  • IPTG was added to 2YT medium 4 hours after the start of culture :
  • D-pantractone hydrolase c A was expressed in the E. coli expression system of E. coli. Although some of the enzyme is expressed in a soluble form, most of the enzyme is thought to be expressed as an inclusion body.
  • C The D-pantone hydrolase gene introduced above was introduced.
  • Escherichia coli JM109 (EJM-ESE-1) carrying (PFLC40E) is a member of the Ministry of International Trade and Industry, Ministry of International Trade and Industry, 1-3-1 Tsukuba East, Ibaraki Prefecture, Japan Accession number FERM BP- 5 638 deposited at the National Institute of Technology (NI BH) Accession number FERM P-151 deposited on August 30, 1995 (the date of original deposit) 4 1
  • a gene encoding a natural D-pantolactone hydrolase for example, a natural D-pantolactone hydrolase derived from Fusarium oxysporum, or a protein having substantially the same activity. structure is revealed, the host cell was allowed transformed with D lambda tau a containing the base sequence encoding the protein, a method of manufacturing a host cell use L, and the Ru said evening protein, more the proteins and host Dramatic development can be expected in applications such as the production of D-pantolactone using cells, and a drastic increase in enzyme activity is possible by modifying the D-pantolactone hydrolase itself.
  • Is possible 091 eg! OGI 9H O n [0 o B [v ⁇ d ail 911 usv 1. sq ⁇ ⁇ ⁇ JA ⁇ J3 ⁇ 4 ⁇
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Fusarium fox F 0 5 9 4 2

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Description

明 細 書
D パン トラク トン加水分解酵素およびそれをコードする遺伝子 技術分野
本発明は D , L パン トラク トンの D 選択的不斉加水分解による光 学分割に有用な新規な酵素およびそれをコードする遺伝子に関するもの である。 特に本発明は、 フサリウム 'ォキシスポルム （Fusar i um oxysporum ) 由来の天然の D パン トラク トン加水分解酵素またはそれ と実質的に同等な活性を有するタンパク質およびそれをコ一ドする遺伝 子に関するものであり、 さらに詳しくは、 本発明は該タンパク質をコ一 ドする塩基配列を含有する D N A， 該 D N Aで形質転換せしめた宿主細 胞、 該宿主細胞を用いる該 D パントラク トン加水分解酵素の製造方法、 さらにはそれらタンパク質および宿主細胞の用途に関するものである。 背景技術
D パントラク 卜ンは医学上または生理学上重要なビタミンとして有 用な D パン トテン酸やパンテチンの製造における中間体として知られ ている。 従来、 D—パントラク トンは化学的に合成された D , L パン トラク トンを光学分割することにより製造されている： しかしながら、 この方法は、 キニーネ、 ブルシン等の高価な分割剤を必要とするもので あり、 D パントラク トンの回収も容易でない等の欠点を有している： このような問題点を解決するため本発明者らは D， L パン トラク トン の酵素的不斉加水分解による光学分割法を特開平 3 - 6 5 1 9 8号およ び特開平 4 - 1 4 4 6 8 1号各公報に提示した。
すなわち、 フサリウム属、 シリンドロカルポン属、 ジべレラ属、 ァス P T /0
ペルジラス属、 ぺニシリウム属、 リゾプス属、 ボルテラ属、 グリオクラ ディウム属、 ユーロティゥム属、 ネク 卜 リア属、 シゾフィラム属、 ミ ロ セシウム属、 ノィロスボラ属、 ァク リモニゥム属、 ッベルク リナ属、 ァ ブシジァ属、 スポロスリ クス属、 バーテイ シリゥム属またはァルスロダ 一マ属に属する微生物より選ばれたラク ト ン加水分解能を有する微生物 を用いて D , L—パン トラク トン中の D—体を選択的に不斉加水分解せ しめることにより、 D—パントイン酸を生成せしめ、 その D—パントイ ン酸を分離し、 D—パントラク トンに変換することを特徴とする D—バ ントラク トンの製造法および上記した厲に属する微生物による D—パン トラク 卜ン加水分解酵素の製造法である。
し力、し、 これらの開示されている微生物の多くが直ちに工業的に利用 可能なほどの加水分解活性を有しているとは必ずしも L、えず、 当該微生 物がもつ酵素活性を工業可能なレベルまでに上昇させるためには、 培養 条件や活性誘導条件等について長時間を要する煩雑で難しい検討が必要 とされる。 またこれらの当該微生物は真菌であるため、 菌体が様々な形 態をもつ菌糸状を呈し、 単一な形態を有する細菌などに比べ、 工業的生 産に有利な固定化菌体の調製がかなり難しいという問題がある c さらに 酵素を菌体から精製する際にも、 D—パン トラク トン加水分解酵素に関 してはかなり回収率が悪いなどの問題がある c 発明の開示
本発明はこれらの問題点を解決し、 さらに D—パン トラク トン加水分 解酵素そのものの改変により酵素活性の飛躍的な上昇を可能ならしめる ことを目的とする c すなわち、 本発明は天然の D—パン トラク トン加水 分解酵素、 例えば、 フサリウム · ォキシスポルム由来の天然の D—パン トラク 卜ン加水分解酵素またはそれと実質的に同等な活性を有するタン パク質をコ一ドする遺伝子を明らかにし、 該タンパク質をコードする塩 基配列を含有する D N Aで形質転換せしめた宿主細胞、 該宿主細胞を用 いる該タンパク質の製造方法、 さらにはそれらタンパク質および宿主細 胞の用途等を提供することにある。
本発明者らは、 上記ラク トン加水分解能を有する微生物から D—パン トラク トン加水分解酵素をコードする遺伝子を単離し、 こうして単離し た D—パントラク トン加水分解酵素遺伝子を利用して、 効率よく且つよ り生産性に優れた D—パン トラク ト ン生産システムを開発すれば、 上記 様々な問題点が解決できるだけでなく、 更にはより新し t、機能をも併せ 持つラク トン加水分解能をもっところの酵素の開発及びそれを使用した 技術の開発にも資するところが多いと考え、 特には D—パントラク トン 加水分解酵素を産生するフサリウム属微生物、 例えば、 フサリウム 'ォ キシスポルムからそれ由来の D—パントラク トン加水分解活性を有する 加水分解酵素をコードする新規な遺伝子を単離することに成功し、 本発 明を完成させるに至った。 本発明は、 天然の D—パン トラク ト ン加水分解酵素またはそれと実質 的に同等な活性を有する力、、 あるいは実質的に同等の一次コンフォ メ一 ションを持つタンパク質またはその塩、 そのタンパク質の特徴的な部分 ペプチドまたはその塩、 それらをコードする遺伝子、 例えば D N A、 R N Aなど、 その遺伝子を遺伝子組換え技術で操作することが可能なよう に含有しているべクタ一あるいはプラスミ ド、 こうしたベクタ一などで 形質転換された宿主細胞、 その宿主細胞を、 培養して該タンパク質また はその塩などを製造する方法、 さらにこうして遺伝子操作された宿主細 胞ゃ組換えタンパク質またはその塩などを用いて、 D、 L—パントラク ト ンの光学分割を行い D—パン トラク ト ンを合成する方法及び固定化酵 素などといった D—パン トラク トン生産システム手段に関する。
好ましくは、 本発明では、 配列表の配列番号： 1で表されるアミノ酸 配列またはそれと実質的に同等のァミノ酸配列を有することを特徴とす る D—パン トラク 卜ン加水分解酵素またはその塩が挙げられる c,
特に本発明は、
(】） 天然の D—パン卜ラク トン加水分解酵素またはそれと実質的に同 等な活性を有する力、、 あるいは実質的に同等の一次コンフォメ一シヨ ン を持つものであることを特徴とするタンパク質またはその塩、
(2 ) 該天然の D—パントラク トン加水分解酵素がフサリウ厶属、 シリ ン ドロカルポン属、 ジべレラ属、 ァスペルジラス属、 ぺニシリウム属、 リゾプス属、 ボルテラ属、 グリオクラディウ厶属、 ユーロティゥム属、 ネク トリァ属、 シゾフィラム属、 ミロセシウム属、 ノィロスボラ属、 ァ ク リモニゥム属、 ッベルクリナ属、 アブシジァ属、 スポロスリ クス属、 バーティシリゥム属またはァルスロダーマ属に属する微生物由来のもの であることを特徴とする上記第 （ 1 ) 項記載のタンパク質、
(3 ) 該天然の D—パン トラク トン加水分解酵素がフサリウム属由来の ものであることを特徴とする上記第 （ 1 ) 項記載のタンパク質、
(4 ) 配列表の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列またはそれと実質 的に同等のァミノ酸配列を有する D—パン卜ラク トン加水分解酵素また はその塩であることを特徴とする上記第 （ 1 ) 〜 （ 3) 項のいずれか一 記載のタンパク質、
( 5 ) 外因性 DN A配列を原核生物において発現して得たものであるこ とを特徴とする上記第 （ 1 ) 〜 （4) 項のいずれか一記載のタンパク質、
(6 ) 配列表の配列番号： 1で表されるアミ ノ酸配列またはそれと実質 的に同一のアミノ酸配列を有することを特徴とする上記第 （ 1 ) 〜 （5 ) 項のいずれか一記載のタンパク質、 (7) 上記第 （ 1 ) 〜 （6) 項のいずれか一記載のタンパク質の部分べ プチドまたはその塩、
(8) 上記第 （ 1 ) ~ (7) 項のいずれか一記載のタンパク質またはそ の部分べプチドをコ一ドする塩基配列を有することを特徴とする核酸、 (9) 配列表の配列番号： 2で表される塩基配列のうちオープン ' リー ディング ·フレーム部分またはそれと実質的に同等な活性を有する塩基 配列を有することを特徵とする上記第 （8 ) 項記載の核酸、
( 1 0) 上記第 （8) 又は （9 ) 項記載の核酸を含有することを特徴と するべクター、
( 1 1 ) 上記第 （ 1 0) 項記載のベクターを保有することを特徴とする 形質転換体、
( 1 2) 上記第 （ 1 1 ) 項記載の形質転換体を増殖可能な栄養培地中で 培養し、 組換えタンパク質として D—パントラク トン加水分解酵素また はその塩を包含する上記第 （ 1 ) 〜 （7 ) 項のいずれか一記載のタンパ ク質又はその部分べプチドを生成せしめることを特徴とする D—パン ト ラク トン加水分解酵素またはその塩を包含する上記第 （ 1 ) 〜 （7 ) 項 のいずれか一記載のタンパク質又はその部分べプチドの製造方法、 及び
( 1 3) 上記第 （ 1 ) 〜 （7) 項のいずれか一記載のタンパク質または その部分ペプチドまたは上記第 （ 1 1 ) 項記載の形質転換体を用いての D、 L—パントラク トンの光学分割による D—パントラク トンの製造法 を提供する。
より具体的には、 本発明は配列表の配列番号： 1で表されるアミノ酸 配列を有することを特徴とする D—パントラク トン加水分解酵素または その塩を提供する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 D—パントラク トン加水分解酵素の消化べプチドの解析に より得られたァミノ酸配列を示す。
第 2図は、 D—パン卜ラク トン加水分解酵素の消化べプチドの c D M Aアミノ酸配列に対応する部位を示す。
第 3図は、 D—パントラク 卜ン加水分解酵素のゲノム D N Aを铸型と した P C Rに用いたプライマー構造を示す。
第 4図は、 D—パン トラク トン加水分解酵素発現べクタ一構築に用い た P C Rに使用したプライマーの構造を示す c
第 5図は、 D—パントラク トン加水分解酵素のアミ ノ酸配列とそれを コードする塩基配列を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明では、 天然の D—パン トラク トン加水分解酵素、 例えば、 フサ リウ厶 ' ォキシスポルム由来の天然の D—パントラク トン加水分解酵素 またはそれと実質的に同等な活性を有するタンパク質をコ一ドする遺伝 子のクローニング、 同定、 そして特徴的な配列の決定 （ン一クェンシン グ） 、 該遺伝子の発現べクタ一^ ^の組換えなどの操作、 該タンパク質を コードする塩基配列を含有する D N Aを用いての形質転換せしめた宿主 細胞の作成及び培養 ·増殖、 該宿主細胞を用いる該タンパク質の製造、 さらにはそれらタンパク質および宿主細胞の用途等が提供され、 それら は以下順次詳しく解説される。 また本発明では上記 D—パントラク トン 加水分解酵素をコードする遺伝子を利用する各種の手段が提供され、 さ らにこうして単離した D—パントラク トン加水分解酵素遺伝子を利用し て、 効率よく且つより生産性に優れた D—パントラク トン生産システム が提供される。 本発明では、 天然の D パン トラク トン加水分解酵素またはそれと実 質的に同等な活性を有する力、、 あるいは実質的に同等の一次コンフォ メーンョンを持つタンパク質またはその塩、 その夕ンパク質の特徴的な 部分ペプチドまたはその塩、 それらをコードする遺伝子、 例えば DNA, R N Aなど、 その遺伝子を遺伝子組換え技術で操作することが可能なよ うに含有しているべクタ一あるいはプラスミ ド、 こうしたベクターなど で形質転換された宿主細胞、 その宿主細胞を、 培養して該タンパク質ま たはその塩などを製造する方法、 さらにこうして遺伝子操作された宿主 細胞や組換えタンパク質またはその塩などを用いて、 D、 L パントラ ク トンの光学分割を行い D パン卜ラク トンを合成する方法及び固定化 酵素などといった D パントラク トン生産システム手段が提供されてい る。
本発明では、 好ましくは、 配列表の配列番号： 1で表されるアミノ酸 配列あるいはそれと実質的に同等のァミノ酸配列を有することを特徴と する D パン トラタ トン加水分解酵素またはその塩が具体的に説明され ている力 本発明の D パントラク トン加水分解酵素としては、 D パ ントラク トン加水分解能をもつ新規なアミ ノ酸配列を有するものであれ ばよい。 D パン トラク トン加水分解能としてはその活性が同質のもの であればよい。 より好ましくは本発明の D パン トラク トン加水分解酵 素は、 配列表の配列番号： 1で表されるアミ ノ酸配列またはそれと実質 的に同等及び Z又は同一のァミノ酸配列を有するものがすべて挙げられ る =
本発明の D パン卜ラク トン加水分解酵素遺伝子は、 例えば次の方法 でクローニングできる。 なお、 遺伝子組換え技術は、 例えば
T. Maniatis et a 1.， "Molecular Cloning , 2nd Ed.. Cold Spring Harbor Laboratory., Cold Spring Harbor, K. T. ( 1989) ； 日本生化学会編、 「続生化学実験講座 1、 遺伝子研究法 I I 」 、 東京化学同人 （ 1 9 8 6 ) ： 日本生化学会編、 「新生化学実験講座 2、 核酸 I I I (組換え DN A技術） 」 、 東京化学同人 （ 1 9 9 2 ) ； R. Wu ed. , Methods in Enzymology , Vol. 68, Academic Press. New York (1980) ； R. Wu et al. ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 100 & 101, Academic Press, New York (1983) ； R. Wu et al. ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 153, 154 & 155. Academic Press, New York (1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文 献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行う ことができる。 それらの手法は、 本発明の目的に合わせて公知の手法に 独自の改変改良を加えたものであることもできる。
1 ) D—パン卜ラク トン加水分解酵素の部分ゲノム DN Aの
クローニング
培養し、 得られたフサリウ厶 ·ォキシスポルムの菌体を破砕し、 常法 により染色体 DN Aを遠心分離後、 RN Aを分解除去し、 除タンパク操 作をおこなって、 DN A成分を精製する。 これらの操作については
「植物バイオテクノ ロジー実験マニュアル ：農村文化社、 2 5 2頁. を 参照されたい。 またフサリウ厶属に属する D—パン トラク トン加水分解 酵素産生能をもつ微生物であれば、 DN A源として好適に用いることが 出来る: フサリウ厶属微生物としては、 例えば、 フサリウム ' ォキシス ポルム I F O 5 9 4 2、 フサリウム · セミテクタム I FO 3 0 2 0 0などを用いることが出来る c
同様にシリ ン ドロカルポン属、 ジべレラ属、 ァスヘルジラス属、 ベニ シリウム属、 リゾプス属、 ボルテラ属、 グリオクラディウ厶属、 ユーロ ティゥム厲、 ネク トリァ属、 シゾフィラム属、 ミロセシウム属、 ノイロ スポラ属、 アタ リモニゥム属、 ッベルク リナ属、 アブシジァ属、 スポロ スリ クス属、 バーティ シリウム属またはァルスロダーマ属に属する微生 物であり、 D—パン トラク トン加水分解酵素産生能をもつ微生物も DN A源として用いることが出来よう。 こうした微生物としては、 例えば、 シリ ン ドロカルポン . トンキネンス I FO 3 0 5 6 1、 ジペレラ . フジクロイ I FO 6 3 4 9、 ァスペルジラス · ァヮモリ I FO
4 0 3 3、 ぺニシリウ厶 ク リ ソゲナ厶 I F 0 4 6 2 6、 リゾブス · オリザェ I F〇 4 7 0 6、 ボルテラ ， ブクン I F 0 6 0 0 3、 グリオクラディウム * カテヌラタム I FO 6 1 2 】 、 ユーロティゥ 厶 ' シェバリエリ I FO 4 33 4、 ネク 卜リア ' エレガンス
I F 0 7 1 8 7、 シゾフィラム . コ厶ネ I FO 4 9 2 8、 ミ ロセ シゥム · 口リダム I FO 9 5 3 1、 ノイロスポラ · クラッサ
1 F 0 6 0 6 7、 ァク リモニゥム · フシディオイデス I F〇
6 8 1 3、 ッベルク リナ ·ペルシシナ I F 0 6 4 6 4、 アブシジァ · リ ヒセイ ミ I F〇 4 0 0 9、 スポロスリ クス · シエンキ I FO
5 9 8 3、 バーテイ シリゥム · マルトウセィ I FO 6 6 2 4または ァルスロダーマ ' ゥンシナ トウム I FO 7 8 6 5などが挙げられる ここで ' I FO」 は財団法人醱酵研究所 〔 （郵便番号 5 3 2 ) 大阪市 淀川区十三本町二丁目 1 7番 8 5号〕 を示し、 そこに記載の番号は 財団法人醱酵研究所のカタ口グ番号を示すものである：
2 ) プロ一ブ 作製
D—パン トラク 卜ン加水分解酵素の内部ぺブチドのァミ ノ酸情報に基 づいて合成オリゴヌクレオチドプライマ一を作製する： 例えば、 上記微 生物であり、 D -パントラク トン加水分解酵素産生能をもつ微生物から 得られた精製 D—パン卜ラク トン加水分解酵素の内部べプチドのァミ ノ 酸情報に基づいて合成オリゴヌクレオチドプライマ一を作製することが できる。 典型的な場合、 ァミノ酸配列を基に、 デジ ネレイテツ ド ·プ ライマーなどを作製する。 プライマーの作製は、 当該分野で知られた方 法で行うことができ、 例えば D N A自動合成装置を用い、 フォスフォ ジ エステル法、 フォスフォ ト リエステル法、 フォスフォア ミ グイ ト法など により合成できる。 具体的にはフサリゥム 'ォキシスポルム I FO 5.9 4 2を栄養培地中で培養して得られた菌体から D—パン トラク ト ン 加水分解酵素を精製し、 必要に応じべプチド加水分解酵素などで断片化 し、 その酵素の内部ペプチドのアミノ酸配列の情報を収集する。 こうし て得られたァミノ酸配列の情報より好ましい合成ォリゴヌクレオチドブ ライマーを作製する。 このプライマーを用い、 D—パントラク トン加水 分解酵素のゲノム DN Aを铸型にして P C Rをおこなう。 PC R反応は、 当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法によ り行うことができるが、 例えば R. Saiki, et al., Science, Vol. 230, pp. 1350 (1985); R. Saiki, et al., Science, Vol. 239, pp. 487
(1988) ； Henry A. Erl ic , PCR Technology, Stockton Press などに記 載された方法に従って行うことができる。 反応は、 例えば、 市販のキッ トゃ試薬を利用して行うことが出来る。
得られた增幅 DN A断片をシークェンスし、 精製酵素の内部べプチド のァミノ酸配列と相同な配列を含むことを確認し、 それをァイソ 卜ーブ で標識しプローブとしてその後の実験などに使用する： 塩基配列の決定 は、 ダイデォキシ法、 例えば M 1 3ダイデォキシ法など、 Maxam- Gi lberl 法などを用いて行うことができる力〈、 市販のシークェンシングキッ ト、 例えば Taqダイプライマーサイクルシークェンシングキッ 卜などを用い たり、 自動塩基配列決定装置、 例えば蛍光 DX Aシーケンサー装置など を用いて行うことが出来る - フローブなどを放射性同位体などによって 標識するには、 市販の標識キッ 卜、 例えばランダムプライムド DNAラ ベリングキッ 卜 (Boehringer Mannhai'm)などを使用して行うことが出来 る。
3 ) D—パン トラク トン加水分解酵素 c DN Aのクローニング
a) mRNAの調製および c D Aライブラリ一の作製
培養し、 得られたフサリウム · ォキシスポルムの菌体を破砕し、 AGPC 法に従って全 RNAを抽出し、 ここから適当な方法、 例えばオリゴ dT セルロースカラムを用いて m R N Aを精製する c 典型的には m R N Aの 単離は、 当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法ゃ改 変法により行うことができる力く、 T. Maniatis et al. , "Molecular Cloning ， 2nd Ed.， Chapter 7， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. T. (1989)； し Grossman et al. ed. ,
"Methods in Enzymology , Vol. 12, Part A & B, Academic Press, New York (1968)； S. し Berger et al. ed. , "Methods in Enzymology". Vol. 152, p.33 & p.215, Academic Press, New York (1987);
Biochemistry, 18, 5294-5299. 1979 などに記載の方法、 例えばグァニ ジン一塩化セシウム法、 チォシアン酸グァニジン法、 フヱノール法など の方法で行うことが出来る： 必要に応じ、 得られた全 RN Aはオリゴ (dT) —セルロースカラムなどを使用して精製してポリ （A) mRNAを得ることが出来る c またフサリウム属に属する D—パン トラ ク トン加水分解酵素産生能をもつ微生物であれば、 mRNA源として好 適に用いることが出来る。 フサリウム属微生物としては、 例えば、 フサ リウム ' ォキシスポル厶 I FO 5 9 4 2、 フサリウ厶 ' セミテク夕 厶 I FO 3 0 2 0 0などを用いることが出来る：
同様にシリンドロカルポン属、 ジべレラ属、 ァスベルジラス属、 ベニ シリウム属、 リゾプス属、 ボルテラ属、 グリオクラディウ厶属、 ユーロ ティゥム属、 ネク 卜 リア属、 シゾフィラム属、 ミロセシウム属、 ノイロ スポラ属、 アタ リモニゥム属、 ッベルク リナ属、 アブシジァ属、 スボロ スリ クス属、 バーティ シリウム属またはァルスロダーマ属に属する微生 物であり、 D—パン トラク トン加水分解酵素産生能をもつ微生物も mRNA源として用いることが出来よう。 こうした微生物としては、 例えば、 シリ ン ドロ力ルポン · トンキネンス I F 0 3 0 5 6 ジペレラ · フジクロィ I FO 6 3 4 9、 ァスペルジラス 《 ァヮモリ I F 0 4 0 3 3、 ぺニシリウ厶 ク リ ソゲナ厶 I F 0 4 6 2 6 , リゾブス · オリザェ I F 0 4 7 0 6 , ボルテラ ， ブクシ I F 0 6 0 0 3、 グリオクラディウム · カテヌラタム I FO 6 1 2 ユーロティゥム ' シェバリエリ I F〇 4 3 3 4、 ネク トリア ' エレガンス I F 0 7 1 8 7、 シゾフィラム . コムネ I F 0
4 9 2 8、 ミ ロセシウム · ロリダム I FO 9 5 3 1、 ノィロスボラ ' クラッサ I FO 6 0 6 7、 ァク リモニゥム ， フシディオイデス I F 0 6 8 1 3、 ッベルク リナ ·ペルシシナ I F 0 6 4 6 4. アブシジァ · リ ヒセイ ミ I F 0 4 0 0 9、 スボロスリ クス - シエンキ I FO 5 9 8 3、 バ一テイ シリゥ厶 · マルトウセィ
I FO 6 6 2 4またはァルスロダーマ · ゥンンナ トウム I FO 7 8 6 5などが挙げられる。
得られた mRNAを铸型として逆転写酵素 （リバース · トランスクリ ブタ一ゼ） などを用いて c DX Aを合成する 尺^ 及び逆転写酵素 を用いての c DN A合成は当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的 に同様な方法や改変法により行うことができる力 H. Land et al.. "Nucleic Acids Resノ'. Vol. 9. 2251 (1981); し. Gubler et al..
"Gene", Vol. 25, 263-269 (1983); S. L. Berger et al. ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 152， p.307, Academic Press, New York (1987) などに記載の方法が挙げられる。 こうして得られた c DNAはこれを市販のファージべクターに挿入し、 さらに常法により ノ ッケージングする。 こうして作製された c Aを基に c DNAライ ブラリーを構築できる。 b) D—パン トラク トン加水分解酵素 c D N Aのクローニング
宿主細胞に上記パッケージングした c DNAライブラリ一を感染させ、 プラークハイブリダイゼ一ションによりポジティブ ·プラークを得る： 得られたクローンをシークェンスし、 ァミノ酸配列を検討することによ り、 D—パントラク トン加水分解酵素遺伝子がクローニングされること が確認できる。 またファージベクターを使用する以外で、 大腸菌などの 宿主細胞の形質転換をするには、 例えばカルシウム法、 ルビジウム Z カルシゥム法など当該分野で知られた方法あるいはそれと実質的に同様 な方法で行うことができる (D. Hanahan. J. ol. Biol.. Vol. 166. p.557 (1983)など） 。
作製された c DN Aを铸型に P C R増幅反応を行うこともできる： 典 型的な場合、 上記 2) で得られたプライマ一を使用することが出来る：
D—パントラク トン加水分解酵素遺伝子を組込むプラスミ ドとしては 遺伝子工学的に常用される宿主細胞 （例えば、 大腸菌、 枯草菌等の原核 細胞宿主、 酵母、 等の真核細胞宿主） 中で該 DX Aが発現できるブラス ミ ドであればどのようなプラスミ ドでもよい c こうした配列内には、 例 えば選択した宿主細胞で発現するのに好適なコ ドンを導入することや、 制限酵素部位を設けることも可能である。 また、 目的とする遺伝子の発 現を容易にするための制御配列、 促進配列など、 目的とする遺伝子を結 合するのに役立つリンカ一、 アダプタ一など、 さらには抗生物質耐性な どを制御したり、 代謝を制御したりし、 選別などに有用な配列等を含ま せることが可能である。
好ましくは、 適当なプロモーター、 例えば大腸菌を宿主とするプラス ミ ドでは、 ト リブトファン （ t r p ) プロモーター、 ラク 卜一ス
(】 a c) プロモータ一、 卜リプトフア ン ' ラク 卜ース （ t a c) プロ モ一夕一、 リポプロティン （ 1 p p) プロモーター、 スファ一ジ P Lブ 口モータ一等を、 酵母を宿主とするプラスミ ドでは、 GAL 1、
G A L 1 0プロモーター等を使用し得る s
大腸菌を宿主とするプラスミ ドとしては、 例えば p BR 3 2 2、 pUC 1 8、 p U C 1 9 p U C 1 1 8 , pUC 1 1 9、 p S P 6 4、 p S P 6 5、 p T Z - 1 8 R/ - 1 8 U、 p T Z - 1 9 R/ - 1 9し'、 pGEM - 3、 p GEM - 4、 pGEM - 3 Z、 pGEM- 4 Z、 p G E M - 5 Z f (一） 、 p B 1 u e s c r i p t K S 1
(Stratagene)などが挙げられる： 大腸菌での発現に適したプラスミ ドべ クタ一としては、 p AS、 p KK 2 2 3 (Pharmacia), p M C 】 4 0 .3、 P M C 9 3 1、 pKC 3 0なども挙げられる。 酵母を宿主とするブラス ミ ドとしては、 Y I p型ベクター、 YE p型べクター、 YR p型べク夕一. Y C p型べクタ一などが挙げられ、 例えば p G P D— 2などが挙げられ る。 宿主細胞としては、 宿主細胞が大腸菌の場合、 例えば大腸菌 K 1 2 株に由来するものが挙げられ、 例えば NM 5 3 3 XL 1 — B 1 u e、 C 6 0 0 , DH 1、 HB 1 0 1、 JM 1 0 9などが挙げられる c 本発明の遺伝子工学的手法においては、 当該分野で知られたあるいは 汎用されている制限酵素、 逆転写酵素、 DNA断片をクローン化するの に適した構造に修飾したりあるいは変換するための酵素である D K A修 飾 ·分解酵素、 DN Aポリメラーゼ、 末端ヌ クレオチジル卜ランスフエ ラーゼ、 DNAリガーゼなどを用いることが出来る。 制限酵素としては、 例えば、 R. J. Roberts, Nucleic Acids Res. Vol. 13， rl65 (1985)； S. Linn et al. ed. Nucleases, p. 109, Cold Spring Harbor Lab.. Cold Spring Harbor, New York, 1982などに記載のものが挙げられる 逆転写酵素としては、 例えばマウスモロネィ白血病ウィルス （mouse Moloney leukemia virus； MMLV) 由来の逆転写酵素 (reverse
transcriptase), ニヮ ト リ骨髄芽球症ウィルス (avian myeloblastosis virus: AMV) 由来の逆転写酵素などが挙げられ、 特には RNase H 欠損体 などは好ましく用いることが出来る。 Aポリメラ一ゼとしては、 例 えば大腸菌 D N Aポリメラ一ゼ、 その誘導体であるクレノウ · フラグメ ン ト、 大腸菌ファージ T 4 DNAポリメラーゼ、 大腸菌ファージ T 7 D N Aポリメラーゼ、 耐熱菌 D N Aポリメラーゼなどが挙げられる： 末端ヌクレオチジル卜ランスフェラ一ゼとしては、 例えば R. Wu et al. ed.， Methods in Enzymology , Vol. 100, p. 96. Academic Press. New York (1983) に記載の 3 ' — O H末端にデォキシヌクレオチ ド
(d XMP) を付加する T d T a s eなどが挙げられる。 D N A修飾 · 分解酵素としては、 ェキソヌクレア一ゼ、 エン ドヌクレア一ゼなどが挙 げられ、 例えばへビ毒ホスホジエステラーゼ、 脾臓ホスホジエステラー ゼ、 大腸菌 DNAェキソヌクレア一ゼ I、 大腸菌 DX Aェキソヌ クレア一 ゼ I I I、 大腸菌 DN Aェキソヌクレア一ゼ V 1 1、 ェキソヌ クレア一 ゼ'、 D X a s e I、 ヌクレア一セ' S 1、 ミ クロコッカス （Micrococcus) ヌクレア一ゼなどが挙げられる： DNAリガーゼとしては、 例えば大腸 菌 DXAリガーゼ、 T 4 DXAリガーゼなどが挙げられる。
DXA遺伝子をクローニングして DN Aライブラリ一を構築するのに 適したベクターとしては、 プラスミ ド、 スファージ、 コスミ ド、 P 1 ファージ、 F因子、 YACなどが挙げられ、 好ましくはスファ一ジ由来 のべクタ一が挙げられ、 例えば C h a r 0 n 4 A、 C h a r o n
1 A, λ g t 1 0 ス g t l l、 ス DA SH I I、 λ F I X I ス EMBL 3、 λ Z A P I I :v (Stratagene) などが挙げられる。 さらに、 本発明に係わる D—パントラク トン加水分解酵素の遺伝子塩 基配列を基に遺伝子工学的に常用される方法を用いることにより、 D - パン卜ラク トン加水分解酵素のァ ミノ酸配列中に適宜、 1個ないし複数 個以上のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 転移あるいは付加したごとき変 異を導入した相当するタンパク質を製造することができる。 こうした変 異 ·変換 ·修飾法としては、 日本生化学会編、 「続生化学実験講座 1、 遺伝子研究法 I I」 、 p 1 0 5 (広瀬進） 、 東京化学同人 （ 1 9 8 6 ) ； 日本生化学会編、 「新生化学実験講座 2、 核酸 I 1 I (組換え DNA技 術） 」 、 p 2 3 3 (広瀬進） 、 東京化学同人 （ 1 9 9 2 ) ； R. Wu， し. Grossman, ed. , "Methods in Enzymology , Vol. 154, p. 350 & p. 307. Academic Press, New York (1987) ； R. Wu, L. Grossman, ed..
"Methods in Enzymology", Vol. 100, p. 457 & p. 468. Academic Press, New York (1983) ； J. A. Wells et al. , "Gene", Vol. 34, p. 315 (1985) ； T. Grundstroem et al. , "Nucleic Acids Res".
Vol. 13, p. 3305 (1985) ； J. Taylor et al. , "Nucleic Acids Res. ", Vol. 13, p. 8765 (1985) ： R. u ed.， "Methods in Enzymology".
Vol. 155. p. 568, Academic Press, New York (1987) ：
A. R. 01 iphant et al. , "Gene", Vol. 44， p. 177 (1986) などに記載 の方法が挙げられる。 例えば合成オリ ゴヌクレオチドなどを利用する位 置指定変異導入法 （部位特異的変異導入法） 、 Kunkel 法、 d\TP:ひ S:法 (Eckstein) 法、 亜硫酸や亜硝酸などを用いる領域指定変異導人法等の 方法が挙げられる。
さらに得られた本発明のタンパク質は、 化学的な手法でその含有され るアミノ酸残基を修飾することもできるし、 ぺプチダーゼ、 例えばぺブ シン、 キモトリブシン、 パノ イン、 ブロメライン、 エン ドべプチダ一ゼ、 ェキソぺプチダーゼなど酵素などを用いて修飾したり、 部分分解したり してその誘導体などにすることができる。 また遺伝子組換え法で製造す る時に融合夕ンパク質として発現させ、 生体内あるいは生体外で天然の D—パントラク 卜ン加水分解酵素と実質的に同等の生物学的活性を有し ているものに変換 ·加工してもよい。 遺伝子工学的に常用される融合産 生法を用いることができる力 <、 こうした融合タンパク質はその融合部を 利用してァフィ二テイ ク口マトグラフィ一などで精製することも可能で ある。 タンパク質の構造の修飾 ·改変などは、 例えば日本生化学会編、
「新生化学実験講座 1、 タンパク質 V I I、 タンパク質工学」 、 東京化 学同人 （ 1 9 9 3 ) を参考にし、 そこに記載の方法あるいはそこで引用 された文献記載の方法、 さらにはそれらと実質的に同様な方法で行うこ とができる
かく して本発明は、 1個以上のァミノ酸残基が同一性の点で天然の のと異なるもの、 1個以上のァミ ノ酸残基の位置が天然のものと異なる ものであってもよい。 本発明は、 天然の D -パントラク トン加水分解酵 素に特有なアミノ酸残基が 1個以上 （例えば、 1 〜 8 0個、 好ましくは 1 〜 6 0個、 さらに好ましくは 1〜 4 0個、 さらに好ましくは 1 〜 2 0 個、 特には 1 〜 1 0個など） 欠けている欠失類縁体、 特有のァミノ酸残 基の 1個以上 （例えば、 1〜 8 0個、 好ましくは 1 〜 6 0個、 さらに好 ましくは 1〜 4 0個、 さらに好ましくは 1 〜 2 0個、 特には 1 〜 1 0個 など） が他の残基で置換されている置換類縁体、 1個以上 （例えば、
1〜 8 0個、 好ましくは 1〜 6 0個、 さらに好ましくは 1 〜 4 0個、 さ らに好ましくは 1〜 2 0個、 特には 1〜 1 0個など） のァミノ酸残基が 付加されている付加類縁体も包含する。 天然の D—パン 卜ラク トン加水 分解酵素の特徴であるドメィン構造を有しているものも包含されてよい。 また、 同質の D—パントラク トン加水分解酵素活性を有するものも挙げ られる。
天然の D—パン卜ラク トン加水分解酵素の特徴である ドメィン構造が 維持されていれば、 上記のごとき変異体は、 全て本発明に包含される。 また本発明の天然の D—パントラク 卜ン加水分解酵素と実質的に同等の 一次構造コンフオメーショ ンあるいはその一部を有しているものも含ま れてよいと考えられ、 さらに天然の D—パン トラ ク ト ン加水分解酵素と 実質的に同等の生物学的活性を有しているものも含まれてよいと考えら れる。 さらに天然に生ずる変異体の一つであることもできる。 こうした 本発明の D—パン トラク ト ン加水分解酵素は、 下記で説明するように分 離 -精製処理されることができる c, 一方では、 こうして本発明は上記し たポリペプチドをコードする D .\: A配列、 そして天然の特性の全部ある いは一部を有する D—パン卜ラク トン加水分解酵素のポリべプチド、 さ らにその類縁体あるいは誘導体をコードする Ι λ' A配列も包含する。 該 D—パン トラク トン加水分解酵素の塩基配列は、 修飾 （例えば、 付加、 除去、 置換など） されることもでき、 そうした修飾されたものも包含さ れてよい。 本発明の D N A配列は、 これまで知られていなかった D—パン卜ラク 卜ン加水分解酵素タンパク質のァミノ酸配列に関する情報を提供してい るから、 こうした情報を利用することも本発明に包含される。 こうした 利用としては、 例えば D—パン トラク トン加水分解酵素及び関連タンパ ク質をコードする微生物、 特に好ましくは D—パン トラク 卜ン加水分解 酵素産生能をもつ微生物、 例えば、 フサリウム属、 シリ ン ドロカルボン 属、 ジべレラ属、 ァスペルジラス属、 ぺニシリウム属、 リゾプス属、 ボ ルテラ属、 グリオクラディウム属、 ュ一ロティゥム属、 ネク トリァ属、 シゾフィラム属、 ミ ロセシウム属、 ノィロスボラ属、 ァク リモニゥム属、 ッベルクリナ属、 アブシジァ属、 スポロスリクス属、 バーテイ シリゥ厶 厲またはァルスロダーマ属に属する微生物であり、 D—パン トラク トン 加水分解酵素産生能をもつ微生物の、 ゲノム DNA及び c DNAの単離 及び検知のためのプ口一プの設計などが挙げられる。
本発明の DNA配列は、 例えば D—パン トラク ト ン加水分解酵素及び 関連タンパク質をコードする D—パントラク トン加水分解酵素産生能を もつ微生物、 特に好ましくは上記フサリウム属をはじめとした微生物の、 ゲノム DNA及び c DN Aの単離及び検知のためのプローブとして有用 である。 遺伝子の単離にあたっては、 PCR法、 さらには逆転写酵素 (RT) を用いた PCR法 （RT— PCR) を利用することが出来る c D—パン トラク トン加水分解酵素及びその関連 DNAは、 クロ一ニング され、 配列決定された D—パントラク トン加水分解酵素 c DNA配列 から推定されるァミノ酸配列に基づき特徴的な配列領域を選び、 .DNA プライマーをデザィンして化学合成し、 得られた DN Aプライマーを用 いて、 PCR法、 RT— PCR、 その他の方法を用いて D—パン トラク トン加水分解酵素関連遺伝子の単離、 検出などに利用することが出来る c 以上述べたように本発明に従えば D—パントラク トン加水分解酵素の 遺伝子及び組換え DNA分子を宿主に移入し、 D—パン 卜ラク ト ン加水 分解酵素を発現させ、 目的とする D—パン卜ラク トン加水分解酵素を得 る方法が提供される。 こうして本発明によれば、 D—パントラク トン加 水分解酵素の遺伝子を実質的に発現する組換え体あるいはトランスフエ / 4
2 0 クタント及びその製造法、 さらにはその用途も提供される c
別の面では、 本発明は D—パン卜ラク トン加水分解酵素活性を有する タンパク質またはそれと実質的に同等な活性を有することを特徴とする タンパク質またはその塩、 より好ましくはフサリウ厶 ·ォキシスポルム 由来の D—パントラク トン加水分解酵素またはその塩と、 実質的に同等 な活性を有する力、、 あるいは実質的に同等の一次構造コンフオメ一ショ ンを持つ該タンパク質の少なくとも一部あるいは全部を有するポリぺフ チドを、 大腸菌などの原核生物あるいは真核生物で発現させることを可 能にする D N Aや R N Aなどの核酸に関するとすることができる。 また こうした核酸、 特には D N Aは、 （a ) 配列表の配列番号： 1で表され るァミノ酸配列をコードできる配列あるいはそれと相補的な配列、 ( b ) 該 （a ) の D N A配列またはその断片とハイブリダィズすること のできる配列、 及び （c ) 該 （a ) 又は （b ) の配列にハイブリダィズ することのできる縮重コードを持った配列であることができる。 こうし た核酸で形質転換され、 本発明の該ポリペプチドを発現できる大腸菌な どの原核生物ある 、は真核生物も本発明の特徴をなす。
本発明に従えば、 D—パン トラク トン加水分解酵素活性を有するタン パク質またはそれと実質的に同等な活性を有することを特徴とするタン パク質をコードする D N A、 あるいは該 D N Aを発現可能に含んでいる ベクターなどの D N Aを、 D—パントラク トン加水分解酵素産生能をも つ微生物、 例えば、 フサリウム属、 シリ ン ドロカルボン属、 ジべレラ属、 ァスベルジラス属、 ぺニシリウム属、 リゾプス属、 ボルテラ属、 グリオ クラディゥム属、 ユーロティゥ厶属、 ネク トリァ属、 シゾフィラム属、 ミロセシウム属、 ノィロスボラ属、 ァク リモニゥ厶属、 ッベルク リナ厲、 アブシジァ属、 スボロスリ クス属、 パーテイ ンリウ厶属またはァルスロ ダーマ属に属する微生物に導入して、 D—パン トラク トン加水分解酵素 産生能を改変した微生物を得ることもできょう。 こうした微生物として は、 例えば、 フサリウム · ォキシスポル厶 I FO 5 9 4 2、 フサリウム · セミテク夕厶 I F〇 3 0 2 0 0、 シリ ン ド口カルポン トンキネンス I FO 3 0 5 6 1、 ジペレラ · フジクロィ I FO 6 3 4 9、 ァスペルジラス · ァヮモリ I FO 4 0 3 3、
ぺニシリウム ク リソゲナム I F 0 4 6 2 6、 リゾプス · ォリザェ I F 0 4 7 0 6、 ボルテラ * ブクシ I FO 6 0 0 3、
グリオクラディウム * カテヌラタム I FO 6 1 2 し
ュ一ロティゥム · シェバリエリ I FO 4 3 3 4、 ネク ト リア ' エレガンス I FO 7 1 8 7、 シゾフィラム . コ厶ネ I FO
4 9 2 8、 ミ ロセシウム ' 口リダ厶 I FO 9 5 3
ノィロスボラ * クラッサ I FO 6 0 6 7、 ァク リモニゥム ' フシディオイデス I F〇 6 8 1 3、 ッベルク リナ · ペルシシナ
I FO 6 4 6 4、 アブシジァ * リ ヒセイ ミ I FO 4 0 0 9、 スポロスリ クス ' シエンキ I FO 5 9 8 3、 バーテイ シリウム ' マルトウセィ I FO 6 6 2 4、 またはァルスロダーマ - ゥンシナ トウム I FO 7 8 6 5などが挙げられる：
形質転換の方法としては、 適当な細胞壁溶解酵素を用いて調製したブ 口 卜プラス ト化した細胞に、 塩化カルシウム、 ポリエチレングリ コール などの存在下 D N Aを接触させると力、、 エレク トロボレ一シヨン法 （例 えば、 E. Neumann et al.， "EMBO J"， Vo. 1. pp.841 (1982) など） 、 マイクロインジヱクショ ン法、 遺伝子銃により打ち込む方法などが挙げ られる。 酵素は、 各種原料、 例えば細胞培養液、 細胞培養破砕物なと'、 形質転 換体細胞などの酵素産生材料から従来公知の方法、 例えば硫酸アンモニ ゥム沈殿法などの塩析、 セフアデックスなどによるゲルろ過法、 例えは ジェチルアミ ノエチル基あるいはカルボキシメチル基などを持つ担体な どを用いたイオン交換クロマトグラフィー法、 例えばブチル基、 ォクチ ル基、 フェニル基など疎水性基を持つ担体などを用 L、た疎水性クロマ卜 グラフィ一法、 色素ゲルクロマトグラフィ一法、 電気泳動法、 透析、 限 外ろ過法、 ァフィ二ティ · クロマトグラフィー法、 高速液体クロマトグ ラフィ一法などにより精製して得ることができる。 また封入体として得 られた場合には、 可溶化処理、 例えば、 塩酸グァニジン、 尿素といった 変成剤、 さらには必要に応じ、 2—メルカプトエタノール、 ジチオスレ ィ トールなどの還元剤存在下に処理して活性型酵素とすることもできる 酵素としては酵素産生細胞をそのまま用いることが出来る。 固定化酵素 としては、 当該分野で知られた方法で酵素又は酵素産生細胞などを固定 化したものが挙げられ、 共有結合法や吸着法といった担体結合法、 架橋 法、 包括法などにより固定化できる。 例えばグルタルアルデヒ ド、 へキ サメチレンジイソシァネー ト、 へキサメチレンジイソチオシァネー卜な どの縮合剤を必要に応じて使用し、 固定化できる: またモノマーを重合 反応でゲル化させて行うモノマー法、 通常のモノマーよりも大きな分子 を重合させるプレボリマー法、 ポリマ一をゲル化させて行うポリマ一法 などが挙げられ、 ポリアクリルアミ ドを用いた固定化、 アルギン酸、 コ ラ一ゲン、 ゼラチン、 寒天、 κ一力ラギ一ナンなどの天然高分子を用い た固定化、 光硬化性樹脂、 ウレタンポリマ一などの合成高分子を用いた 固定化などが挙げられる。 微生物の培養、 酵素を用いた D —パン卜ラク 卜ン加水分解をはじめとしたラク 卜ン加水分解酵素利用の酵素的不斉加 水分解によるラク 卜ン系化合物の光学分割反応及び生成物の処理は特開 平 3 — 6 5 1 9 8号および特開平 4 - 1 4 4 6 8 1号に記載のようにし て行うことができる 例えば、 液体培地で振盪培養した形質転換菌を集菌し、 得られた菌体 に D、 L—パン トラク トン水溶液 （2〜6 0 %濃度） を加え、 p Hを 6〜8に調整しながら温度 1 0〜4 0 ' Cで数時間から 1 日反応させる： 反応終了後、 菌体を分離し、 反応液中の未反応 L一パン トラク トンを有 機溶媒 （酢酸ェチルのようなエステル類、 ベンゼンのような芳香族炭化 水素類、 クロ口ホルムのようなハロゲン化炭化水素等などが好ましい） を用いて抽出分離する。 水層に残存している D -パン 卜ィン酸を塩酸酸 性下、 加熱することによりラク トン化をおこない、 上記した有機溶媒で 抽出することにより生成した D—パントラク 卜ンを得ることができる このようにして、 形質転換菌の処理菌体 （乾燥菌体ゃ固定化菌体等） や 形質転換菌から得られた酵素や固定化酵素等も同様にしておこなうこと が可能である。
本発明の前述した種々の態様を利用することにより、 D—パン 卜ラク 卜ン加水分解をはじめとしたラク トン加水分解酵素利用の酵素的不斉加 水分解によるラク トン系化合物の光学分割法に関わる合成研究に有用な 手段として、 あるいはその他の用途に適用される種々の技術手段を提供 することができる。 以下に実施例を掲げ、 本発明を具体的に説明する力 本発明はこれら実施例に限定されず、 本明細書の思想に基づく様々な実 施形態が可能であることは理解されるべきである。 なお、 明細書及び図 面において、 塩基及びアミ ノ酸等を略号で表示する場合、 I U P A C I U B Commi ss i on on B i ochemi ca l Nomenc la tureによる力、、 あるいは 当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づく ものであり、 アミノ酸に光学異性体が存在する場合は、 特に断らないかぎり L -体を 示す。
後述の実施例 1で得られた D—パン トラク トン加水分解酵素の遺伝子 を導入したベクター （P F L C 4 0 E ) を保有する大腸菌 J M 1 0 9 (E J M- E S E- 1 ) は、 平成 7年 8月 3 0日 （原寄託日） から茨城 県つくば巿東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 ) の通商産業省工業技術 院生命工学工業技術研究所 （λ' Ι ΒΗ) に寄託されており （受託番号 F E RM Ρ— 1 5 1 4 1 ) 、 平成 8年 8月 2 8日に原寄託よりブダぺ ス 卜条約に基づく寄託への移管請求がなされ、 受託番号 F E RM Β Ρ— 5 6 3 8として N I ΒΗに保管されている： 実施例
以下に実施例を挙げ、 本発明を具体的に説明するが、 本発明は実施例 に限定されること無く様々な態様が含まれることは理解されるべきであ る。
実施例 1
1 ) 精製酵素のァミノ酸配列決定
特開平 4 144681号の実施例 1に準じて調製した凍結乾燥 D パン卜 ラク トン加水分解酵素 14.3 nmol (サブュニッ 卜分子量 G万として） を 8 M 尿素を含む 5 Om Tris-HCl (pH9.0) 4 ^ 1 に溶かし、 3 7てで 1時間変性させる c これに 5 OmM Tris- HC1 (pll9.0) 1 u 1 を添加し て尿素濃度を 4 M とする。 12 nmol/mlのリ ジルェン ドぺプチダ一ゼ (和光純薬） 1 2 1 (0.144 nmol, E/S = l/100) を添加し、 3 (TCで 1 2時間消化をおこなう。 得られた消化ペプチドを逆相カラム （ナカラ ィテスク） で分取し、 AB1 社 4 7 7 A プロティンシークェンサ一でァミ ノ酸配列の分析をおこなった。 分取条件
カラム ： Cosmos il 5C18-AR (4.6 x 250 mm)
流速： 1 ml/min
温度： 3 5 °C
検出波長： 2 1 Onm
溶離液： A, 0.1¾ TFA (トリフルォロ酢酸）
B, 0.1¾' TFA/80¾ CH.CN
溶出条件： A →B のグラジェント溶出（15¾ /min)
ァミ ノ酸配列の分析の結果は図 1及び図 2の通りであつた。 2 ) ゲノム DN Aの作製
a ) D—パントラク 卜ン加水分解酵素のゲノム D N A抽出法
対数増殖期後期の菌体を減圧濾過で集菌した。 液体窒素中に菌体を入 れ、 ワーリ ングブレンダ一で細かく破碎した。 ある程度細かくなつた菌 体を乳鉢に移し液体窒素を加えながらすりつぶした： 7 0°Cに保温した 2 X CTAB液（2¾ CTAB (Cetyl trimethyl ammonium bromide. シグマ）.
0.1 M Tris-HCl, pH8.0, 1. NaCl, \% PVP (Polyvinylpyrrol idone. シグマ） に懸濁し、 6 5°Cで 3 ~4時間インキュベー トした。 遠心分離 した上清を順次、 フエノール、 フエノール Zクロ口ホルム、 クロ口ホル ムで処理し、 等容のイソプロパノールで DN Aを沈殿させた。 7 0 % エタノールで洗浄し、 風乾後、 TE (T r i s 1 O mM— E DTA 1 m\ p H 7. 8 ) に溶解した。 リボヌクレア一ゼ A およびリボヌク レア一ゼ T1で Ri\Aを分解し、 フエノール、 フエノール， /クロ口ホルム、 クロロホルムで順次処理して除タンパク操作をおこなった。 等容のィソ プロパノールで DNAを沈殿させた c 7 0 %エタノールで洗浄し、 風乾 後、 TEに溶解しゲノム標品を得た c b) D—パン トラク トン加水分解酵素遺伝子の増幅
D—パン トラク 卜ン加水分解酵素の内部べプチドのアミ ノ酸配列の情 報 （図 1及び図 2 ) を基に、 N—末端ァミ ノ酸配列のセンスス卜ラン ド に対応するセンスプライマーと内部べプチド配列のアンチセンスストラ ン ドに対応するアンチセンスプライマ一を各々台成した （図 3) 。
D—パン トラク 卜ン加水分解酵素のゲノム DI Aを铸型として下記の 条件で P C Rをおこなった。 PCR增幅は、 例えば R. Saiki, et al., Science, Vol. 230, pp. 1350 (1985); R. Saiki, et al. , Science, Vol. 239, pp. 487 (1988) ； PCR Technology. Stockton Press (1989) などに記載された方法に従って行われた。 PCR増幅により、 約 l k b の増幅 D.\'A断片を得た。
P C R条件
染色体 DN A
センスプライマー 250 pmol (図 3参照） ァンチセンスプライマ一 250 pmol (図 3参照) d\'TP(2mM) 5 u ]
Tth ボリメラ一ゼ緩衝液（xlO) 5 u 1
Tth D N A ボリメラーゼ （東洋紡） 3 uni ts
H— 0
合計 50 1
9 2 'てノ 1分、 5 5 °C z 1分、 7 3 X/ 3分： 3 0サイクル 本得られた増幅 DN A断片をシークェンスし、 了ミ ノ酸配列に変換し たところ、 D—パン卜ラク 卜ン加水分解酵素の内部べプチドの部分ァ ミ ノ酸配列の箇所が見いだされた： 3 ) c DNAの作製
a ) mRN Aの作製
菌体は対数増殖期前期に集菌し、 ただちに液体窒素で凍結後破碎し、 AGPC (Acid Guanidinium Thiocyanate Phenol Chloroform) 法 (例えば、 実験医学、 Vo l . No. 1 5， p 9 9 ( 1 9 9 1 ) ) に従って全 R N A を抽出した。 得られた全 RN Aをオリゴ dT- セルロースカラム （フアル マシア） にかけることにより精製した。 b ) c DNAライブラリ一の作製
得られた mRN A を铸型として、 c DN Aラビッ ドアダプターライ ケーシヨ ンモジュ一ノレ ( c D N A rap i do adaptor 1 i gat ion module, cDNA synthesis module RPN 1256, 1994： アマシャム社 （Amersham International pic)) を用いて c D N Aを合成した c ) D—パン卜ラク 卜ン加水分解酵素 c D N Aのクローニング
宿主大腸菌に c DNAライブラリーを感染させ、 プラークハイプリダ ィゼ一シヨンによりポジティブプラークを得た = ただし、 ここで用いた ブローブはフサリゥム · ォキシスポルムの D—パン 卜ラク トン加水分解 酵素遺伝子を含む約 1 kbの断片を铸型とし、 マルチプライム法で標識す ることにより作製した。 得られたクローンをシークェンスし、 アミ ノ酸 配列に変換した結果、 上記の D—パン トラタ トン加水分解酵素遺伝子全 長のクローニングに成功したことが判明した c こうして配列番号： 2で表される塩基配列が得られた c この塩基配列 によりコ一ドされる配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と相同性を示 す酉己列は >JBRF (National Biomedical Research Foundation) Protein Sequence Data Ban! (中には存在せず、 この塩基配列を有する D X Aは全く新規なものであることが認められた：
塩基配列を決定した c Di\' Aには、 Γ\'末端部分が一部欠けていて、 開 始コ ドンを有していないことが判明したので、 開始コ ドンを新たに人工 的に挿入した発現べクタ一 （PFLC40E と命名） の構築を P C R法により ねこ/よつた。 図 4で示される制限酵素サイ 卜を有するセンスおよびアンチセンスプ ライマ一の合成オリゴヌクレオチドを作製し、 これらのプライマ一を用 い、 以下の条件で P CR反応をおこなった。 PCR増幅は、 例えば R. Saiki, et al. , Science, Vol. 230, pp. 1350 (1985); R. Saiki, et al. , Science, Vol. 239, pp. 487 (1988) ； PCR Technology, Stockton Press (1989)などに記載された方法に従つて行われた
P C R条件
Total DNA ( c D N A ) 0 U g
センスプライマ一 n m o 1 (図 4参照） ァンチセンスブライマ一 n m o 1 .i参照） d.XTP ( 2 mM) 1 0 I丄 1
Tth ポリメラ一ゼ緩衝液（X 10) 1 0 1
Tth DNA ポリメラーゼ 4 u n i t s
H.0
口 o o
9 てノ i分、 5 5 X/ 1分、 7 5。(：ノ 3分： 3 0サイクル こうして得られた P C R産物は両端にそれぞれ EcoRl と Xbalの制限酵 素サイ トを つので、 各制限酵素 （EcoRi (宝酒造） と Xbal (宝酒造） ） 処理をおこない、 pUC18 とライゲ一シヨ ン反応を行う （宝ライゲーシヨ ン キッ ト） ことにより発現ベクター （P F L C 4 0 E) を構築した。 次に当該べクタ一を "Molecular Cloning" second ed. , 1989, ed. by J. Sambrook et al. , Cold Spring Habor Laboratory Press に言己載され た方法に従い、 E. coli JM 109 のコンビテン卜セルにトランスフォーメ ーシヨ ンし、 形質転換をおこなった。 なお、 当該形質転換体は 50mg/lの アンピンリ ンを含む 2 X YT 培地 （ト リブトン 1.5¾、 酵母エキス 1¾、 NaCl 0.5¾ ) 上で選択した： 形質転換処理は、 塩化カルシウム法に従つ ナ
こうして得られた組換え大腸菌を上記した 50mg/lのアンピシリン含有
2 X YT 培地 10mlを含む試験管で前培養をおこない、 この前培養液 (計 1 0 0 / 1 ) を種菌として前培養液と同じ組成からなる本培養液 1 0 0 m lで培養時間、 培養温度、 イソプロピル /3—チォガラク 卜ピ ラノ シ ド （ I PTG) 添加時間等を検討した: 培養結果を表 1 に示す 培養後、 得られた菌体を超音波破砕し、 遠心上清を用いて D パントラ ク ト ン加水分解酵素活性を測定した。 最適条件での比活性は 2.25·し/ mg であった。 D パン トラク トン加水分解酵素の酵素活性の測定は次の条 件で行い、 1分間に l //mol の D パントラク トンを加水分解する酵素 活性を 1単位 （u n i t ) とする。 D パン トラク トン 1 0 %濃度の 0. 5 M P I P E S 緩衝溶液 （p H 7. 0 ) 2 0 0 ^/ 1 に酵素溶液
5 0 / 1を加え、 3 0 °Cで 1 2 0分間反応させた後 2 m E DT Aの メ夕ノール溶液 2 5 0 ^ 〗を加え反応を停止させる： 反応終了液を H P L C (Nucleosil 5 .6 x 150mm . 溶離液】 0 %メタノール、 流速 l ml/min、 検出波長 230nm ) を用いて加水分解率を求める。 酵素活 性は例えば加水分解率が 1 ¾であれば、 酵素溶液 1 m 1 当たりの活性は 1. 6 1 0 - UZm 1 となる。
P F L C 4 0 Eで形質転換された大腸菌 J VI】 0 9は 2 '· Y Τ培地中 で培養した。 I P T Gは、 最終濃度 2 mMとなるように加えた
I PTG 培養時間 ί 皿 ' 比活性 供給時間
(h r) (h r) (。C) (urn ts/mg
0 '! 6 2 8 0. 8 6
0 J 1 2 2 8 1. 9 4
4 7 2 8 1. 3 3
4 ' 1 2 2 8 2 5
0 6 3 7 1. 0 5
0 " 1 2 3 7 1. 7 3
4 . 1 3 7 1. 1
4 ' 1 2 3 7 1. 6 7
a ： I PTGは、 培養開始と同時に 2 X YT培地中に加えた
b ： I P T Gは、 培養開始後 4時間して 2 Y T培地中に加えた :
SDS-PAGEをおこなつた結果、 遠心沈殿部の不溶性画分に予想分子量の 太いバン ドが検出されたのでこのバン ドについてプロッティ ングをおこ ない、 エドマン分解法により X末端のアミ ノ酸配列を調べた結果、 D パン卜ラク 卜ン加水分解酵素のそれと一致した: 従って D—バン トラク トン加水分解酵素 c Aの本大腸菌発現系において D—パントラク ト ン加水分解酵素の一部は可溶性で発現しているものの、 大部分は inclusion body (封入体） として発現しているものと考えられる c 上記 D—パン トラク 卜ン加水分解酵素の遺伝子を導入したベクタ一
(P F L C 4 0 E) を保有する大腸菌 J M 1 0 9 (EJM— E S E— 1 ) は、 茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 ) の通商産 業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH) に受託番号 FERM B P— 5 6 3 8として寄託保存されている 平成 7年 8月 3 0日 （原寄託日） に寄託された受託番号 FERM P- 1 5 1 4 1
(微ェ研菌寄第 P - 1 5 1 4 1号；原寄託） よりブダぺス卜条約に基づ く寄託への移管請求が平成 8年 8月 2 8日になされた， c 産業上の利用可能性
天然の D—パントラク トン加水分解酵素、 例えば、 フサリウム .ォキ シスポルム （Fusarium oxysporum) 由来の天然の D—パン トラク トン加 水分解酵素またはそれと実質的に同等な活性を有するタンパク質をコー ドする遺伝子構造が明らかにされ、 該タンパク質をコードする塩基配列 を含有する D λτ Aで形質転換せしめた宿主細胞、 該宿主細胞を用 L、る該 夕ンパク質の製造方法、 さらにはそれらタンパク質および宿主細胞を用 いての D—パントラク トンの製造などの用途において飛躍的な発展を期 待でき、 さらに D—パン卜ラク 卜ン加水分解酵素そのものの改変により 酵素活性の飛躍的な上昇を可能ならしめることが可能である = 091 eg! OGI 9H O n[0 o B[v ^^d ail 911 usv 1。 s q 丄《丄 JA丄 J¾ Λ|9 Λ[0 usy
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OJd naq OJd usy 13^ naq 」A丄 na E[y J3S OJJ \2\ dsy dsy Ajg 1113
8 C Z9∑0/96df/X3d €0 6OM 【配列番号： 2】
配列の長さ ： 1 140
配列の型：核酸
鎖の数 ：二本鎖
卜ポロジ一 ：直鎖状
配列の種類： cDNA
起源
生物名 ： フサリ ウム · ォキシ F 0 5 9 4 2
配列
60
GTGCCACCTCCTGCAGTGGCCAATGACTCTCTGGTGTTCACTTGGCCTGGTGTAACTGAG 120 GAGTCTCTTGTTGAGAAGCCTTTCCATGTCTACGATGAAGAGTTTTACGATGTAATTGGA 180 AAAGACCCCTCTTTGACCCTCATCGCAACATCGGACACCGACCCAATCTTCCATGAGGCT 240 GTCGTATGGTATCCTCCTACTGAAGAGGTGTTCTTTGTGCAGAATGCTGGCGCTCCTGCC 300 GCAGGCACTGGCTTGAACAAGTCTTCCATCATTCAGAAGATTTCCCTCAACGAGGCCGAT 360 GCTGTTCGCAAGGGCAAGCAGGATGAGGTCAAGGTCACAGTTGTTGACTCGAACCCTCAG 420 GTTATCAACCCAAATGGTGGTACTTACTACAAGGGCAACATCATCTTCGCTGGTGAGGGC 480
5-10
ACCACCCTTCTCAACAACTACTTCCGTCGCCAGTTCAACTCCCTCAACGACGTCGGTATC 600
Figure imgf000036_0001
CCCGCTTCTGTTTACTCTTTCGACGTGAACCAGGACGGTACTCTTCAGAACCGCAAGACC 900
960
TATGCTGGCTGCGGTGATGGTGTCCATGTCTGGAACCCCTCTGGCAAGCTCATCGGCAAG 1020
1080

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 天然の D—パントラク トン加水分解酵素またはそれと実質的に同 等な活性を有する力、、 あるいは実質的に同等の一次コンフォメ一シヨン を持つものであることを特徴とするタンパク質またはその塩 c
2 . 該天然の D—パントラク トン加水分解酵素がフサリウム属、 シリ ンドロカルポン属、 ジべレラ属、 ァスペルジラス属、 ぺニシリウ厶属、 リゾプス属、 ボルテラ属、 ダリオクラディウム属、 ュ一ロティゥム厲、 ネク 卜リア属、 シゾフィラム属、 ミロセシウム属、 ノィロスボラ属、 ァ クリモニゥム属、 ッベルクリナ属、 アブシジァ属、 スポロスリクス属、 バーティシリゥム属またはァルスロダーマ属に属する微生物由来のもの であることを特徴とする請求項 1記載のタンパク質
3 . 該天然の D—パントラク トン加水分解酵素がフサリゥム属由来のも のであることを特徴とする請求項 1記載のタンパク質：
4 . 配列表の配列番号： 1で表されるアミ ノ酸配列またはそれと実質 的に同等のァミノ酸配列を有する D—パン トラク トン加水分解酵素また はその塩であることを特徴とする請求項 1 〜 3の L、ずれか一記載の夕ン パク質 =
5 . 外因性 D N A配列を原核生物において発現して得たものであるこ とを特徴とする請求項 1 〜 4のいずれか一記載のタンパク質 c
6 . 配列表の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列またはそれと実質 的に同一のァミノ酸配列を有することを特徴とする請求項 1 〜 5のいず れか一記載のタンパク質。
7 . 請求項 1 〜 6のいずれか一記載のタンパク質の部分べプチドまた はその塩：
8 . 請求項 1 〜 Ίのいずれか一記載のタンパク質またはその部分ぺプ チドをコ一ドする塩基配列を有することを特徴とする核酸。
9 . 配列表の配列番号： 2で表される塩基配列のうちオープンリーデ ィ ングフレーム部分またはそれと実質的に同等な活性を有する塩基配列 を有することを特徴とする請求項 8記載の核酸。
1 0 . 請求項 8又は 9記載の核酸を含有することを特徴とするベクタ一
1 1 . 請求項 1 0記載のベクタ一を保有することを特徴とする形質転 換体 c
1 2 . 請求項 1 1記載の形質転換体を増殖可能な栄養培地中で培養し、 組換えタンパク質として D—パントラク トン加水分解酵素またはその塩 を包含する請求項 1〜 7のいずれか一記載の夕ンパク質又はその部分べ プチドを生成せしめることを特徴とする D—パントラク トン加水分解酵 素またはその塩を包含する請求項 1 〜 7のいずれか一記載のタンパク質 又はその部分べプチドの製造方法。
1 3 . 請求項 1 〜7のいずれか一記載のタンパク質またはその部分べ プチドまたは請求項 1 1記載の形質転換体を用いての D、 L パン トラ ク 卜ンの光学分割による D—パントラク 卜ンの製造法：
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