HU222434B1 - D-pantolakton hidroláz és azt kódoló gén - Google Patents

D-pantolakton hidroláz és azt kódoló gén Download PDF

Info

Publication number
HU222434B1
HU222434B1 HU9701904A HUP9701904A HU222434B1 HU 222434 B1 HU222434 B1 HU 222434B1 HU 9701904 A HU9701904 A HU 9701904A HU P9701904 A HUP9701904 A HU P9701904A HU 222434 B1 HU222434 B1 HU 222434B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
pantolactone
protein
pantolactone hydrolase
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
HU9701904A
Other languages
English (en)
Inventor
Tatsuhiko Kobayashi
Keiji Sakamoto
Sakayu Shimizu
Hideaki Yamada
Original Assignee
Daiichi Fine Chemical Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daiichi Fine Chemical Co., Ltd. filed Critical Daiichi Fine Chemical Co., Ltd.
Publication of HUP9701904A2 publication Critical patent/HUP9701904A2/hu
Publication of HUP9701904A3 publication Critical patent/HUP9701904A3/hu
Publication of HU222434B1 publication Critical patent/HU222434B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/001—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by metabolizing one of the enantiomers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
    • C12P41/005—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of carboxylic acid groups in the enantiomers or the inverse reaction

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát közelebbről izolált, D-pantolakton-hidroláz-aktivitású, nem glikozilált, rekombináns fehérjék képezik, amelyekaminosavszekvenciája az 1. azonosító számon bemutatottaminosavszekvenciával azonos, vagy azzal legalább 80%-os homológiátmutat, valamint a fehérjék sói. A találmány tárgyát képezik továbbá azemlített proteineket kódoló nukleotidszekvenciákat tartalmazónukleinsavak, az azokat hordozó vektorok, a vektorokat tartal- mazótranszformánsok, valamint eljárások a találmány szerinti fehérje vagyrészpeptidje, például D-pantolakton-hid- roláz, vagy sójaelőállítására, továbbá eljárások D-pantolakton és származékai (D-pantoténsav és pantetin) előállítására a találmány szerinti fehérjékvagy transzformánsok alkalmazásával. A találmány szerinti megoldásalkalmas D-pantolakton előállítására, valamint D,L-pantolakton – D-szelektív aszimmetrikus hidrolízis útján történő – optikaiforgatóképesség szerinti szétválasztására. ŕ

Description

A találmány tárgyát D,L-pantolakton - D-szelektív aszimmetrikus hidrolízis útján történő - optikai forgatóképesség szerinti szétválasztására alkalmas új enzimek, valamint az azokat kódoló gének képezik.
A találmány tárgyát közelebbről izolált, D-pantolakton-hidroláz-aktivitású, nem glikozilált, rekombináns fehéijék képezik, amelyek aminosavszekvenciája az 1. azonosító számon bemutatott aminosavszekvenciával azonos, vagy azzal legalább 80%-os homológiát mutat, valamint a fehérjék sói. A találmány tárgyát képezik továbbá az említett proteineket kódoló nukleotidszekvenciákat tartalmazó nukleinsavak, az azokat hordozó vektorok, a vektorokat tartalmazó transzformánsok, valamint eljárások a találmány szerinti fehérje vagy részpeptidje, például D-pantolakton-hidroláz, vagy sója előállítására, továbbá eljárások D-pantolakton és származékai előállítására a találmány szerinti fehéijék vagy transzformánsok alkalmazásával.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható D-pantolakton ipari méretű előállítására.
A D-pantolakton a D-pantoténsav és pantetin előállításának köztitermékeként ismert, mely utóbbiak orvosi és élettani szempontból jelentőséggel bíró vitaminok. A D-pantolaktont kémiai úton szintetizált D,L-pantolakton optikai forgatóképesség szerinti szétválasztásával állítják elő. Ez az eljárás azonban több hátránnyal jár, amennyiben költséges, optikai forgatóképesség szerinti szétválasztást lehetővé tevő vegyületek, például kinin vagy brucin alkalmazását teszi szükségessé; ezenfelül a D-pantolakton kinyerése nem egyszerű. A fenti problémák megoldására a korábbiakban már kifejlesztettünk egy, optikai forgatóképesség szerinti szétválasztást lehetővé tevő eljárást, amely a D,L-pantolakton aszimmetrikus enzimatikus hidrolízisén alapul [Hei 03-65 198 és Hei 04-144 681 számú vizsgálat nélkül közzétett japán szabadalmi bejelentések; „KOKAI, TOKKYO”).
A fenti eljárás szerint, a D-pantolaktont úgy állítjuk elő, hogy a D,L-pantolakton-elegyben található Dpantolaktont egy laktonhidrolizáló aktivitással rendelkező mikroorganizmus alkalmazásával, szelektív módon aszimmetrikus hidrolízisnek vetjük alá, hogy D-pantoinsavat kapjunk, amelyet azután különválasztunk, és Dpantolaktonná alakítunk; a fenti eljárásban a felsorolt nemzetségekhez tartozó mikroorganizmusok valamelyikét alkalmazhatjuk: Fusarium, Cylindrocarpon, Gibberella, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Volutella, Gliocladium, Eurotium, Nectoria, Schizophyllum, Myrothecium, Neurospora, Acremonium, Tuberculina, Absidia, Sporothrix, Verticillium vagy Arthroderma. A fenti leírásban D-pantolakton-hidroláz előállítására szolgáló eljárásokat is ismertetünk, amely eljárásokban a fent említett nemzetségek valamelyikéhez tartozó mikroorganizmusokat alkalmazhatjuk.
Nem mondható ki azonban általánosságban, hogy a fent felsorolt mikroorganizmusok közül sok rendelkezne olyan mértékű hidrolizálóaktivitással, amely alkalmassá tenné azt közvetlen ipari felhasználásra. Továbbá, az említett mikroorganizmusok enzimatikus aktivitásának ipari alkalmazhatóságot lehetővé tevő szintre történő növelése hosszú időt igénybe vevő, fáradságos és bonyolult vizsgálatok elvégzését teszi szükségessé, hogy a sejtek szaporodása és az enzimatikus aktivitás indukciója szempontjából megfelelő körülményeket kidolgozzuk. További problémát jelent, hogy mivel az említett mikroorganizmusok valódi gombák, azok sejtjei változatos alakú hyphakat alkotnak, és az egyszerű formákat felvevő baktériumokhoz képest, azokból lényegesen nehezebb ipari alkalmazás szempontjából előnyös, immobilizált sejteket előállítani. További problémát jelent, hogy az enzimnek a sejtekből történő tisztítása során, a D-pantolakton-hidroláz vonatkozásában, az enzim kinyerésének hatásfoka igen gyenge.
A találmány célját a fenti problémák megoldása, valamint az enzimatikus aktivitás jelentős mértékű fokozásának, például az eredetileg meglevő D-pantolaktonhidroláz-aktivitás módosításának és fokozásának módja képezi.
A találmány tárgyát képezik új gének, amelyek a természetben előforduló D-pantolakton-hidroláz-enzimnek megfelelő aktivitással (például Fusarium oxysporum D-pantolakton-hidroláz-aktivitással), vagy azzal lényegében ekvivalens aktivitással rendelkeznek; az említett proteineket kódoló nukleotidszekvenciát kódoló DNS-sel transzformált gazdasejtek; az említett proteinek előállítására szolgáló eljárások, az említett gazdasejtek alkalmazásával; valamint az említett proteinek és gazdasejtek alkalmazása.
A találmány tárgyához tartoznak továbbá, a fenti, laktonhidrolizáló képességgel rendelkező mikroorganizmusokból izolált D-pantolakton-hidrolázt kódoló gének; ezenfelül olyan, az izolált D-pantolakton-hidrolázgén alkalmazásán alapuló, D-pantolakton előállítására szolgáló, nagy hatékonysággal és termelékenységgel jellemezhető rendszereket sikerült kifejlesztenünk, amelyek nemcsak a fent említett problémák megoldását szolgálják, hanem nagyban hozzájárulnak - új funkciókon felül - laktonhidrolizáló képességgel rendelkező enzimek kifejlesztéséhez; a találmány tárgyát képezi továbbá az új enzimek alkalmazásán alapuló technikák kifejlesztése. Közelebbről, D-pantolakton-hidrolázt termelő Fusarium mikroorganizmusokból (például Fusarium oxysporumbóY) származó, D-pantolakton-hidrolizáló aktivitással rendelkező hidrolázt kódoló új gént sikerült izolálnunk, miáltal sikerült a találmány alapját képező célkitűzésünket megvalósítanunk.
A találmány tárgyát képezik az alábbiakban felsoroltak:
(i) természetes D-pantolakton-hidroláz-aktivitással, vagy azzal lényegében ekvivalens aktivitással rendelkező proteinek, valamint azok sói;
(ii) az említett proteinekkel lényegében ekvivalens elsődleges strukturális konformációval rendelkező proteinek, vagy azok sói;
(iii) az említett proteinek jellegzetes peptidrészletei, vagy azok sói;
(iv) az említett proteineket kódoló gének, például DNS-ek vagy RNS-ek;
(v) génrekombinációs technikával előállított, az említett géneket funkcionálisan kapcsoltan tartalmazó vektorok vagy plazmidok,
HU 222 434 Bl (vi) a fenti vektorokkal stb. transzformált gazdasejtek;
(vii) az említett proteinek vagy sóik előállítására szolgáló eljárások, amely eljárások magukban foglalják az említett gazdasejtek tenyésztését;
(viii) D-pantolakton előállítására szolgáló eljárások, mely eljárások szerint, D,L-pantolakton optikai forgatóképesség szerinti szétválasztását végezzük, az említett, géntechnológiai úton módosított gazdasejtek (transzformánsok), vagy az említett rekombináns proteinek vagy azok sói stb. alkalmazásával; és (ix) D-pantolakton előállítására alkalmazható rendszerek, például immobilizált enzimek.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, előnyös rekombináns proteinek az 1. azonosító számú aminosavszekvenciával, vagy annak lényegében megfelelő aminosavszekvenciával rendelkező D-pantolakton-hidrolázok, vagy azok sói.
Az említettek szerint, a találmány tárgyát képezik:
1. a természetben előforduló D-pantolakton-hidroláz-enzimnek megfelelő aktivitással, vagy azzal lényegében ekvivalens aktivitással rendelkező proteinek, vagy az említett proteinekkel lényegében ekvivalens elsődleges strukturális konformációval rendelkező proteinek, valamint azok sói;
2. az 1. pont szerinti proteinek, amennyiben az említett, természetben előforduló D-pantolakton-hidrolázaktivitással rendelkező proteinek a felsorolt nemzetségekhez tartozó mikroorganizmusok valamelyikéből származnak: Fusarium, Cylindrocarpon, Gibberella, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Volutella, Gliocladium, Eurotium, Nectoria, Schizophyllutn, Myrothecium, Neurospora, Acremonium, Tuberculina, Absidia, Sporothrix, Verticillium vagy Arthroderma;
3. az 1. pont szerinti proteinek, amennyiben az említett, természetben előforduló D-pantolakton-hidrolázaktivitással rendelkező proteinek a Fusarium nemzetséghez tartozó mikroorganizmusból származnak;
4. az 1-3. pontok bármelyike szerinti proteinek, amelyek D-pantolakton-hidroláz-enzimek vagy azok sói, és az 1. azonosító számú aminosavszekvenciával, vagy azzal lényegében ekvivalens aminosavszekvenciával rendelkeznek;
5. az 1-4. pontok bármelyike szerinti proteinek, amelyek exogén DNS-szekvencia prokarióta-gazdasejtekben történő expresszálásával lettek előállítva;
6. az 1-5. pontok bármelyike szerinti proteinek, amelyek az 1. azonosító számú aminosavszekvenciával, vagy azzal lényegében ekvivalens aminosavszekvenciával rendelkeznek;
7. az 1-6. pontok bármelyike szerinti proteinekből származó parciális peptidek vagy azok sói;
8. az 1-7. pontok bármelyike szerinti proteineket vagy azokból származó parciális peptideket kódoló nukleotidszekvenciával rendelkező nukleinsavak;
9. a 8. pont szerinti nukleinsavak, amelyek a 2. azonosító számú nukleotidszekvenciában található nyitott leolvasási fázisnak megfelelő részt tartalmazó nukleotidszekvenciával rendelkeznek, vagy azzal lényegében ekvivalens aktivitású proteint kódoló nukleotidszekvenciával rendelkeznek;
10. a 8-9. pontok bármelyike szerinti nukleinsavat hordozó vektorok;
11. a 10. pont szerinti vektorok valamelyikét hordozó transzformánsok;
12. eljárások, az 1-7. pontok bármelyike szerinti, D-pantolakton-hidrolázt vagy annak sóját tartalmazó proteinek, vagy azokból származó parciális peptidek előállítására, amely eljárások szerint:
all. pont szerinti transzformánsokat az említett transzformánsok tenyésztésére alkalmas tápfolyadékban tenyésztjük, hogy rekombináns proteinként előállítsuk az 1-7. pontok bármelyike szerinti proteineket vagy azokból származó parciális peptideket, ezen belül az említett D-pantolakton-hidrolázt vagy annak sóját; és
13. eljárás, D-pantolakton előállítására, amely eljárás szerint, D,L-pantolakton optikai forgatóképesség szerinti szétválasztását végezzük, a következők valamelyikének jelenlétében :
(i) az 1-7. pontok bármelyike szerinti proteinek vagy azokból származó parciális peptidek; vagy (ii) all. pont szerinti transzformánsok.
Még közelebbről, a találmány tárgyát képezi az 1. azonosító számú aminosavszekvenciával rendelkező D-pantolakton-hidroláz vagy annak sói.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.
Az 1. ábrán a D-pantolakton-hidroláz emésztésével kapott peptidek szekvenálásával kapott aminosavszekvenciákat ábrázoltuk.
A 2. ábrán az izolált cDNS által kódolt aminosavszekvencián, a D-pantolakton-hidroláz emésztésével kapott peptideknek megfelelő helyeket jelöltük.
A 3. ábrán PCR-eljárásban alkalmazott láncindító oligonukleotidok struktúráját ábrázoltuk, amely eljárás során, templátként D-pantolakton-hidrolázt kódoló genomi eredetű DNS-t alkalmaztunk.
A 4. ábrán a rekombináns D-pantolakton-hidroláz expresszálására alkalmazott vektor előállítására szolgáló PCR-eljárás során alkalmazott láncindító oligonukleotidok struktúráját ábrázoltuk.
Az 5. ábrán a D-pantolakton-hidroláz aminosavszekvenciáját és nukleotidszekvenciáját ábrázoltuk.
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.
A találmány tárgyát képezik eljárások, például a természetben előforduló D-pantolakton-hidrolázt [például Fusarium oxysporumbói származó (vagy abban található) természetes D-pantolakton-hidrolázt], vagy azzal lényegében ekvivalens aktivitással rendelkező proteineket kódoló gének klónozása, az említett gének azonosítása, és az említett gének jellegzetes szekvenciájának meghatározása (szekvenálása), valamint a fenti gének, rekombináns technikák alkalmazásával történő bejuttatása expressziós vektorokba; a találmány tárgyát képezik továbbá a fenti proteineket kódoló nukleotidszek3
HU 222 434 Bl venciákat tartalmazó DNS-ekkel transzformált gazdasejtek (transzformánsok) előállítása és tenyésztése/szaporítása; az említett proteinek előállítása a fenti gazdasejtek alkalmazásával; valamint az említett proteinek és gazdasejtek alkalmazása.
Az alábbiakban, a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint alkalmazott technikákat és eljárásokat ismertetünk részletesen.
A találmány tárgyához tartoznak ezenfelül a fent említett D-pantolakton-hidrolázt kódoló gének különböző alkalmazási lehetőségei, valamint D-pantolaktonhidroláz előállítására szolgáló, nagy hatékonysággal és kiváló termelékenységgel jellemzett rendszerek, amelyekben az említett, izolált D-pantolakton-hidroláz-géneket alkalmazzuk.
A találmány tárgyát képezik a természetben előforduló D-pantolakton-hidroláz aktivitásának megfelelő, vagy azzal lényegében ekvivalens aktivitással rendelkező proteinek vagy azok sói, vagy az említett proteinekkel lényegében ekvivalens elsődleges strukturális konformációval rendelkező proteinek, valamint azok sói; az említett proteinek jellegzetes peptidrészletei vagy azok sói; az említett proteineket vagy peptideket kódoló gének, például DNS-ek vagy RNS-ek; az említett géneket funkcionálisan kapcsoltan tartalmazó, génrekombinációs technikával előállított vektorok vagy plazmidok (vagy egyéb génhordozók), a fenti vektorokkal stb. transzformált gazdasejtek; az említett proteinek vagy sóik előállítására szolgáló eljárások, amely eljárások magukban foglalják az említett gazdasejtek tenyésztését; D-pantolakton előállítására szolgáló eljárások, amely eljárások szerint, D,L-pantolakton optikai forgatóképesség szerinti szétválasztását végezzük; az említett, géntechnológiai úton módosított gazdasejtek, vagy rekombináns proteinek vagy azok sói stb. alkalmazásával; valamint D-pantolakton előállítására alkalmazható rendszerek és eszközök, például immobilizált enzimek.
A találmány szerinti megoldást, a szemléltetés kedvéért előnyösen, az 1. azonosító számú aminosavszekvenciával, vagy azzal lényegében ekvivalens aminosavszekvenciával rendelkező D-pantolakton-hidroláz-enzimen vagy annak sóin keresztül szemléltetjük, de a találmány tárgyát képezi bármely, D-pantolakton-hidrolizáló képességgel bíró enzim, amennyiben új aminosavszekvenciával rendelkezik. D-pantolakton-hidrolizáló képességen bármely olyan képességet értünk, amely D-pantolaktonhidrolizálás vonatkozásában az említett enzimmel azonos minőségű. Előnyösebben, a találmány szerinti Dpantolakton-hidroláz bármely, az 1. azonosító számú aminosavszekvenciával rendelkező anyag, vagy azzal lényegében ekvivalens aminosavszekvenciával rendelkező anyag, és/vagy azzal lényegében azonos aminosavszekvenciával rendelkező anyag.
A találmány szerinti D-pantolakton-hidroláz-gént klónozhatjuk, például a következő eljárások alkalmazásával:
Megjegyzendő, hogy a génrekombinációs technikákat, például az alábbi szakirodalmi helyeken ismertetettek szerint végezhetjük: T. Maniatis és munkatársai: „Molecular Cloning”, 2. kiadás, „Cold Spring Harbor
Laboratory”, „Cold Spring Harbor”, Ν. Y. (1989); „Nippon Seikagaku Kai” („Biochemical Society of Japan”, Japán Biokémiai Társaság) (szerk.): „Zoku-Seikagaku Jikken Kouza 1”, „Idensi Kenkyuho II” [Biokémiai Kísérletek, (második sorozat, 1), (Génvizsgálati Módszerek II)], „Tokyo Kagaku Dojin”, Japán (1986); „Nippon Sikagaku Kai” (Japán Biokémiai Társaság) (szerk.): „ShinSeikagaku Jikken Kouza 2”, „Kakusan III”, („Kumikae DNA Gijutsu”); [Új Biokémiai Kísérletek, Nukleinsavak III, (Rekombináns DNS Technikák)], „Tokyo Kagaku Dojin”, Japán (1992); R. Wu (szerk.): „Methods in Enzymology” 68, ,Academic Pess”, New York (1980); R. Wu és munkatársai (szerk.): „Methods in Enzymology” 100 és 101, .Academic Pess”, New York (1983); R. Wu és munkatársai (szerk.): „Methods in Enzymology” 153, 154 és 155, .Academic Pess”, New York (1987); stb., lásd továbbá az azokban idézett hivatkozásokban ismertetett technikákat, amelyek teljes teijedelmükben a kitanítás részét képezik, valamint a fenti leírásokban ismertetett technikáknak lényegében megfelelő technikákat, és az azok módosításával nyert technikákat. Alkalmazhatók továbbá, az ismert technikák alapján, a találmány céljától függően egyedileg módosított/javított technikák és eszközök.
1. D-Pantolakton-hidrolázt kódoló, genomi eredetű
DNS egy részének klónozása
Tenyésztett Fusarium oxysporum-se')téket kromoszomális DNS izolálása céljából roncsoltunk és centrifugáltunk, majd az RNS-t ismert eljárásokkal lebontottuk és eltávolítottuk. A DNS-összetevőt a protein eltávolításával tisztítottuk. A leírásban alkalmazott anyagok előállítására vonatkozó további információk megtalálhatók például az alábbi szakirodalmi helyen: „Shokubutsu Biotechnology-Jikken Manual” (Növény Biotechnológiai Kísérleti Kézikönyv), „Noson Bunkasha”, 252. oldal, amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi.
DNS-t bármely, a Fusarium nemzetséghez tartozó és D-pantolakton-hidroláz-termelő képességgel rendelkező mikroorganizmusból nyerhetünk. Alkalmazható mikroorganizmusok például a Fusarium nemzetséghez tartozó Fusarium oxysporum IFO-5942 törzs, a Fusarium semitectam IFO-30 200 törzs stb.
Hasonlóképp, DNS-forrásként alkalmazhatók Dpantolakton-hidroláz-termelő képességgel rendelkező, és a felsorolt nemzetségekhez tartozó egyéb mikroorganizmusok is: Cylindrocarpon, Gibberella, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Volutella, Gliocladium, Eurotium, Nectoria, Schizophyllum, Myrothecium, Neurospora, Acremonium, Tuberculina, Absidia, Sporothrix, Verticillium vagy Arthroderma. Ilyen mikroorganizmusok például a felsorolt törzsek: (lásd például US 5.275.949 számú szabadalmi irat) Cylindrocarpon tonkinense IFO-30 561, Gibberella fujikuroi IFO-6349, Aspergillus awamori IFO-4033, Penicillium chrysogenum IFO-4626, Rhizopus oryzae IFO-4706, Volutella buxi IFO-6003, Gliocladium catenulatum IFO-6121, Eurotium chevalieri IFO-4334, Nectria elegáns IFO-7187, Schizophyllum commune IFO-4928, Myrothecium
HU 222 434 Β1 roridum ΠΌ-9531, Neurospora crassa ΠΌ-6067, Acremonium fusidioides IFO-6813, Tuberculinapersicina IFO-6464, Absidia lichteimi IFO-4009, Sporothrix schenckii IFO-5983, Verticillium malthousei IFO-6624, Arthroderma uncinatum IFO-7865 stb.; ahol az „IFO” rövidítés a „Zaidan-Hojin Hakko Kenkyusho” („Institute of Fermentation”, Oszaka, 17-85, „Juso-honmachi 2-chome”, Yodogawaku, Oszaka 532, Japán) intézetet jelöli, és az azt követő számok az IFO által kiadott katalógusban szereplő számoknak vagy az IFO által megadott nyilvántartási számoknak felelnek meg.
2. Hibridizációs próba előállítása
Szintetikus láncindító oligonukleotidokat a D-pantolakton-hidroláz belső peptidjének aminosavszekvenciájára vonatkozó információ alapján állítottunk elő. Szintetikus láncindító oligonukleotidokat előállíthatunk például a fent felsorolt, D-pantolakton-hidroláztermelő képességgel rendelkező mikroorganizmusokból nyert, tisztított D-pantolakton-hidroláz belső peptidjének aminosavszekvenciájára vonatkozó információk alapján. Tipikus esetben, degenerált láncindító oligonukleotidokat stb. tervezünk és állítunk elő, a természetben előforduló D-pantolakton-hidroláz-fragmensek aminosavszekvenciájára vonatkozó információk alapján. A láncindító oligonukleotidok előállítását a technika állása szerint ismert technikákkal végezhetjük. Például, a láncindító oligonukleotidokat előállíthatjuk foszfodiészter-eljárással, foszfotriészter-eljárással, foszfoamidit-eljárással stb., automatizált DNS-szintetizáló készülék alkalmazásával. Közelebbről, D-pantolakton-hidrolázt tápfolyadékban tenyésztett Fusarium oxysporum IFO-5942-törzs-eredetű sejtekből tisztítottunk, és szükség szerint, peptidázzal stb. fragmentáltunk, majd az enzim belső peptidjének aminosavszekvenciájára vonatkozó információkat összegyűjtöttük. Az ily módon kapott aminosavszekvenciára vonatkozó információk alapján, előnyös szintetikus láncindító oligonukleotidokat terveztünk és állítottunk elő. Az említett láncindító oligonukleotidpár alkalmazásával polimeráz-láncreakciót (PCR) végzünk, amelyben templátként D-pantolakton-hidrolázt kódoló, genomi eredetű DNS-t használunk fel. A PCR-reakciót a technika állása szerint ismert technikákkal, vagy annak lényegében megfelelő technikákkal vagy az említett technikák módosított változatával végezhetjük. A reakciókat végezhetjük például a következő szakirodalmi helyeken ismertetett eljárásokkal: R. Saiki és munkatársai: Science 230, 1350 (1985);: R. Saiki és munkatársai: Science 239, 487 (1988); valamint Henry A. Erlich: „PCR Technology”, „Stockton Press”. A reakciókat végezhetjük továbbá, a kereskedelemben hozzáférhető reagenskészletek vagy reagensek alkalmazásával.
Az így kapott, amplifikált DNS-fragmenseket szekvenáljuk, majd - miután igazoltuk, hogy azok a tisztított enzim belső peptidjének aminosavszekvenciáját kódoló szekvenciával homológ szekvenciát tartalmaznak -, azokat izotóppal jelöljük, és további kísérletekben vagy hasonló célra alkalmazzuk. A nukleotidszekvenciák szekvenálását didezoxitechnikával (például az M13-didezoxi-eljárással), a Maxam-Gilbert-féle eljárással stb. végezhetjük, vagy a kereskedelemben hozzáférhető szekvenáló reagenskészlet, például „Taq-dyeprimer” ciklikus szekvenáló reagenskészlet vagy automatizált nukleotidszekvenáló készülék, például fluoreszcens DNS-szekvenáló készülék alkalmazásával végezhetjük. A próbák stb. radioizotóppal stb. történő jelölését a kereskedelemben hozzáférhető jelölő reagenskészlettel, például véletlenszerű láncindító oligonukleotidokat tartalmazó DNS-jelölő reagenskészlettel (Boehringer Mannheim) végezhetjük.
3. D-Pantolakton-hidrolázt kódoló cDNS klónozása
a) mRNS előállítása és cDNS-génkönyvtár előállítása
Tenyésztett Fusarium oxysporum-sepeket roncsoltunk, és össz-RNS izolálása céljából, AGPC-eljárással extraháltunk. Ezt követően, alkalmas eljárással, például oligo(dT)-cellulóz-oszlop alkalmazásával, az összRNS-frakcióból mRNS-t izoláltunk és tisztítottunk. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, mRNS-t a technika állása szerint ismert eljárásokkal, vagy azoknak lényegében megfelelő eljárásokkal vagy azok módosításával tisztíthatunk; az mRNS izolálását és tisztítását végezhetjük például az alábbi szakirodalmi helyeken ismertetett eljárások valamelyikével: Maniatis és munkatársai: „Molecular Cloning”, 2. kiadás, 7. fejezet, „Cold Spring Harbor Laboratory”, „Cold Spring Harbor”, N. Y. (1989); L. Grossman és munkatársai (szerk.): „Methods in Enzymology” 12, A&B rész, „Academic Press”, New York (1968); S. L. Berger és munkatársai „Methods in Enzymology” 152, 33. oldal és 215. oldal, „Academic Press”, New York (1987); Biochemistry 18, 5294 (1979); stb., amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik. mRNS izolálásra és tisztítására alkalmazható technikák például a guanidin-cézium-klorid-eljárás, a guanidin-tiocianát-eljárás, a fenoleljárás stb. Amennyiben szükséges, a kapott össz-RNS-t oligo(dT)-cellulóz-oszlop stb. alkalmazásával tisztítási eljárásnak vethetjük alá, hogy poly(A)+mRNS-t nyeljünk. Az mRNS előállítására bármely, a Fusarium nemzetséghez tartozó és D-pantolakton-hidroláz-termelő képességgel rendelkező mikroorganizmus alkalmas. Alkalmazható mikroorganizmusok például a Fusarium nemzetséghez tartozó Fusarium oxysporum IFO-5942 törzs, a Fusarium semitectam IFO-30 200 törzs stb. Hasonlóképp, mRNS-forrásként alkalmazhatók D-pantolakton-hidroláz-termelő képességgel rendelkező, és a felsorolt nemzetségekhez tartozó egyéb mikroorganizmusok is: Cylindrocarpon, Gibberella, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Volutella, Gliocladium, Eurotium, Nectoria, Schizophyllum, Myrothecium, Neurospora, Acremonium, Tuberculina, Absidia, Sporothrix, Verticillium vagy Arthroderma. Ilyen mikroorganizmusok például a felsorolt törzsek: Cylindrocarpon tonkinense IFO-30 561, Gibberella fujikuroi IFO-6349, Aspergillus awamori IFO-4033, Penicillium chrysogenum IFO-4626, Rhizopus oryzae IFO-4706, Volutella buxi IFO-6003, Gliocladium ca5
HU 222 434 Bl tenulatum IFO-6121, Eurotium chevalieri IFO-4334, Nectria elegáns IFO-7187, Schizophyllum commune IFO-4928, Myrothecium roridum IFO-9531, Neurospora crassa IFO-6067, Acremonium fusidioides IFO-6813, Tuberculina persicina IFO-6464, Absidia lichteimi IFO-4009, Sporothrix schenckii IFO-5983, Verticillium malthousei IFO-6624, Arthroderma uncinatum IFO-7865 stb.
A kapott mRNS templátként történő felhasználásával és reverz transzkriptáz stb. alkalmazásával cDNS-t állítottunk elő. A cDNS reverz transzkriptáz-enzimmel történő szintézisét végezhetjük a technika állása szerint ismert eljárásokkal, vagy azoknak lényegében megfelelő technikákkal vagy azok módosított változatával. Ilyen technikákat ismertetnek részletesen, például a következő szakirodalmi helyeken: H. Land és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 9, 2251 (1981); U. Gubler és munkatársai: Gene 25, 263 (1983); S. L. Berger és munkatársai (szerk.): ,,Methods in Enzymology” 152, 307, , Academic Press”, New York (1987); amelyek teljes teijedelmükben a kitanítás részét képezik. Az így kapott cDNS-t a kereskedelemben hozzáférhető fágvektorba inszertáltuk; más eljárás szerint, azokat a technika állása szerint ismert technikákkal, fágfejekbe „csomagolhatjuk”. Ezt követően, az így nyert cDNS alapján cDNSgénkönyvtárat állítottunk elő.
b) D-Pantolakton-hidrolázt kódoló cDNS klónozása
A fenti, rekombináns fágot gazdasejtekbe transzfektáltuk, majd plakkhibridizációt végeztünk, pozitív plakkok (kiónok) szelektálása céljából. A kapott kiónokból származó DNS-ffagmenseket szekvenáltuk. Az így nyert nukleotidszekvenciák kódját megfejtettük, és azokat a kódolt aminosavszekvenciákra nézve analizáltuk. A fenti analízisek és vizsgálatok eredményeképp igazoltuk, hogy valóban a célzott D-pantolakton-hidrolázgént klónoztuk.
Fágvektorok alkalmazásán alapuló technikákon felül gazdasejteket, például Escherichia coli-sejteket transzformálhatunk, a technika állása szerint ismert eljárásokkal, például kalciumtechnikával vagy rubídium/kalcium technikával, vagy azoknak lényegében megfelelő technikákkal [D. Hanahan: J. Mól. Bioi. 166, 557 (1983) stb.].
A kapott cDNS templátként történő felhasználásával PCR-reakciót végezhetünk. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az eljárásban a fenti, 2. pont szerint nyert láncindító oligonukleotidokat alkalmazhatjuk.
A D-pantolakton-hidroláz-gén beépítésére bármely plazmid alkalmazható, azzal a kikötéssel, hogy az említett DNS a technika állása szerint ismert géntechnológiai eljárásokkal, gazdasejtekben expresszálható (például prokarióta-gazdasejtekben, mint például Escherichia co/z-sejtekben, Bacillus .swóZzfc-sejtekben stb., vagy eukarióta-gazdasejtekben, például élesztősejtekben). A plazmidot kódoló szekvenciába beépíthetünk például a klónozott DNS-nek a választott gazdasejtben történő expresszálását lehetővé tevő kodonokat vagy restrikciósenzim-hasítási helyeket létrehozó kodonokat. Beépíthetünk továbbá szabályozószekvenciákat, az expressziót elősegítő szekvenciákat stb., a célzott gén expressziójának előmozdítása céljából; kapcsoló nukleotidszekvenciákat és adaptorszekvenciákat stb., a célzott gén ligálásának elősegítése céljából; antibiotikumrezisztenciát létrehozó szekvenciákat, anyagcsere-szabályozó szekvenciákat vagy más, szelekciót elősegítő szekvenciákat; és hasonlókat.
Előnyösen, megfelelő promotert alkalmazunk. Escherichia co/z'-gazdasejtekbe juttatott plazmidok esetén, alkalmazhatjuk például a triptofán (trp)-promotert, a laktóz (lác)-promotert, a triptofán-laktóz (tac)-promotert, a lipoprotein (lpp)-promotert, λ-fág PL-promotert stb.; élesztő-gazdasejtekbe juttatott plazmidok esetén, alkalmazhatjuk a GÁLI, GAL10 promotereket stb.
Escherichia co/z'-gazdasejtekben alkalmazható plazmidok például a pBR322, a pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pSP64, pSP65, pTZ-18R/-18U, pTZ-19R/19U, pGEM-3, pGEM-4, PGEM-3Z, pGEM-4Z, pGEM-5Zf(-), pBluescript-KS™ (Stratagene) stb. plazmidok. Escherichia co/z'-gazdasejtekben történő expresszió esetében alkalmazható plazmidvektorok például a pAS-, pKK223 (Pharmacia), pMC1403, pMC931, pKC30 stb. plazmidvektorok. Élesztő-gazdasejtben alkalmazható plazmidok például a következők: Ylp-vektor, YEp-vektor, YRp-vektor, YCp-vektor stb., ezen belül a pGPD-2 vektor. Escherichia co/z'-gazdasejtekként alkalmazhatjuk az Escherichia coli KI 2 törzsekből származó sejteket, például az NM533, XLl-Blue, C600, DH1, HB101 és JM109 törzseket.
A találmány szerinti géntechnológiai eljárásokban alkalmazhatunk a technika állása szerint ismert vagy általánosan használt, különböző restrikciós enzimeket, reverz transzkriptázokat, DNS-módosításra és -lebontásra szolgáló enzimeket, amelyek felhasználásával a DNS-fragmenseket úgy módosíthatjuk vagy alakíthatjuk át, hogy azok struktúrája klónozásra alkalmassá váljon; valamint DNS-polimerázokat, terminális nukleotidtranszferázokat, DNS-ligázokat stb. Alkalmazhatók például a felsorolt szakirodalmi helyeken ismertetett restrikciós enzimek: R. J. Roberts: Nucleic Acids Rés. 13, 165 (1985); S. Linn és munkatársai (szerk.): „Nucleases” 109. oldal, „Cold Spring Harbor Láb.”, „Cold Spring Harbor”, New York (1982); stb. Reverz transzkriptázként alkalmazható például a Moloney-féle leukémiavírusból (MMLV), a madár-mieloblasztózisvírusból (AMV) származó enzim stb. Különösen előnyösen alkalmazhatók az RNáz-H-deficiens reverz transzferáz vagy hasonlók. DNS-polimerázként alkalmazható például az Escherichia co/z'-DNSpolimeráz, az Escherichia co/z'-DNS-polimerázból származó Klenow-fragmens, az E. coli T4-fág DNS-polimeráz, az E. coli T7-fág DNS-polimeráz, hőstabil bakteriális DNS-polimerázok stb.
Terminális nukleotidtranszferázként alkalmazható például a TdTáz, amely a 3’-OH véghez képes dezoxinukleotidokat (dNMP-t) hozzáadni [R. Wu (szerk.): „Methods in Enzymology” 100, 96. oldal, , Academic Pess”, New York (1983)]. A DNS módosítására és lebontására alkalmazhatunk exonukleázokat, endonukleázokat stb. Ilyen enzimek például a kígyóméreg-fosz6
HU 222 434 Bl fodiészteráz, a lép-foszfodiészteráz, azE. co/z'-DNS-exonukleáz I, E. co/z-DNS-exonukleáz III, E. coli-TSUSexonukleáz VII, λ-exonukleáz, DNáz I, SÍ nukleáz, Micrococcus-nukleáz stb. Alkalmazható DNS ligázok például az E. co/i'-DNS-ligáz, a T4 DNS-ligáz stb.
A DNS-gének klónozására és DNS-génkönyvtárak létesítésére alkalmazható vektorok (génhordozók) például a következők: plazmidok, λ-fág, kozmidok, Pl fág, F-faktor, YAC stb. Előnyösen alkalmazható vektorok például a felsoroltakból származó vektorok: λ-fág, például Charon-21A, XgtlO, Xgtll, XDASHII, XFIXII, ÁEMBL3 és λΖΑΡΙΙ™ (Stratagene) stb.
Továbbá, a találmány szerinti D-pantolakton-hidroláz nukleotidszekvenciáját kódoló gén alapján, géntechnológiai eljárások során általánosan alkalmazott módszerek és eszközök lehetővé teszik olyan proteinek, például variánsok és mutánsok előállítását, amelyek esetében, a D-pantolakton-hidroláz aminosavszekvenciáját úgy módosítjuk, hogy abban egy vagy több aminosavat helyettesítünk, deletálunk, inszertálunk, transzlokálunk vagy a szekvenciához hozzáadunk.
Ilyen variációk, helyettesítések és módosítások létrehozására szolgáló eljárásokat és eszközöket ismertetnek például a felsorolt szakirodalmi helyeken: „Nippon Seikagaku Kai” (Japán Biokémiai Társaság) (szerk.): „Zoku-Seikagaku Jikken Kouza l” „Idensi Kenkyuho II” [Biokémiai Kísérletek (második sorozat; 1), Génvizsgálati Módszerek 2], 105. oldal, („Susumu Hírőse”) „Tokyo Kagaku Dojin”, Japán (1986); „Nippon Sikagaku Kai” (Japán Biokémiai Társaság) (szerk.): „ShinSeikagaku Jikken Kouza 2”, Kakusan III („Kumikae DNA Gijutsu”) [Új Biokémiai Kísérletek 2, Nukleinsavak III, (Rekombináns DNS Technikák)], 233. oldal, („Susumu Hírőse”), „Tokyo Kagaku Dojin”, Japán (1992); R. Wu és L. Grossman (szerk.): „Methods in Enzymology” 154, 350. oldal, „Academic Pess”, New York (1987); R. Wu és L. Grossman (szerk.): „Methods in Enzymology” 100, 457. oldal, „Academic Pess”, New York (1983); J. A. Wells és munkatársai: „Gene”, 34, 315 (1985); T. Grundstroem és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 13, 3305 (1985); J. Taylor és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 13, 8765 (1985); R. Wu (szerk.): „Methods in Enzymology” 155, 568. oldal, „Academic Pess”, New York (1987); A. R. Oliphan és munkatársai: Gene 44, 177 (1986); stb., amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik. Ilyen eljárások és módszerek például a következők: meghatározott helyen, szintetikus oligonukleotidok bejuttatásával mutációkat vagy variációkat létrehozó technikák (helyspecifikus mutagenezist létrehozó technikák), Kunkelféle technikák, dNTP[aS]-technikák (Eckstein-féle módszer), vagy meghatározott doménban vagy régióban, kénsav (vagy hidrogénszulfit), salétromossav (vagy nitrit) alkalmazásával mutációkat vagy variációkat létrehozó technikák stb.
Ezenfelül az így kapott, találmány szerinti proteint kémiai technikákkal úgy módosíthatjuk, hogy abban egy aminosavat (vagy több aminosavat) megváltoztatunk, vagy előállíthatjuk a protein származékát oly módon, hogy azt egy enzim, például egy peptidáz (például pepszin, kimotripszin, papain, bromelain, endopeptidáz, exopeptidáz stb.) alkalmazásával részlegesen lebontjuk vagy módosítjuk. Továbbá, a találmány szerinti rekombináns proteineket előállíthatjuk úgy, hogy azokat génrekombinációs technikák alkalmazásával, fúziós proteinekként expresszáltatjuk, majd a fúziós proteineket in vivő vagy in vitro, a természetben előforduló D-pantolakton-hidroláz biológiai aktivitásával lényegében ekvivalens aktivitással rendelkező termékekké alakítjuk/feldolgozzuk. Alkalmazhatók továbbá, a géntechnológiai eljárások során fúziós termékek előállítására általánosan alkalmazott eljárások is. Az ilyen fúziós proteineket - azok fúziós részének felhasználásával - affinitásos kromatográfiával stb. tisztíthatjuk. Proteinstruktúrák módosítására, megváltoztatására stb. szolgáló eljárásokat ismertetnek például a következő szakirodalmi helyen: „Nippon Sikagaku Kai” (Japán Biokémiai Társaság) (szerk.): „Shin-Seikagaku Jikken Kouza 1”, „Tanpakushitsu VII”, „Tanpakushitsu Kogaku” (Új Biokémiai Kísérletek 1”, Protein VII, Proteintechnológiai Eljárások), „Tokyo Kagaku Dojin”, Japán (1993); amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi. Ilyen módosításokat, változtatásokat stb. végezhetünk a leírásban ismertetett technikák szerint, az idézett szakirodalmi hivatkozásokban ismertetett technikákkal vagy azokhoz lényegében hasonló technikákkal.
A találmány szerinti termékek lehetnek olyan proteinek, amelyekben egy vagy több aminosav, azonosságát tekintve különbözik a természetben előforduló proteinben találhatótól, vagy olyan proteinek, amelyekben egy vagy több aminosav, a természetben előforduló proteinben elfoglalt pozíciójához képest eltolódott helyen található. A találmány tárgyát képező termékek lehetnek deléciós analógok, amelyekben egy vagy több, a természetben előforduló D-pantolakton-hidrolázban található aminosav hiányzik (például, a természetben előforduló D-pantolakton-hidrolázban található 1-80., előnyösen 1-60., előnyösebben 1-40., még előnyösebben 1-20. és legelőnyösebben 1-10. aminosav hiányzik); szubsztitúciós analógok, amelyekben a természetben előforduló D-pantolakton-hidrolázban található egy vagy több aminosavat egy vagy több, eltérő aminosavval helyettesítettünk (például, a természetben előforduló D-pantolakton-hidrolázban található 1-80., előnyösen 1-60., előnyösebben 1-40., még előnyösebben 1-20. és legelőnyösebben 1-10. aminosavat eltérő aminosawal helyettesítettük); valamint addíciós analógok, amelyekben a természetben előforduló D-pantolakton-hidroláz szekvenciájához egy vagy több aminosavat hozzáadtunk (például, amelyekben a természetben előforduló D-pantolakton-hidroláz szekvenciájához 1-80., előnyösen 1-60., előnyösebben 1-40., még előnyösebben 1-20. és legelőnyösebben 1-10. aminosavat hozzáadtunk). A találmány tárgyát képezik olyan proteinek, amelyek a természetben előforduló D-pantolakton-hidrolázra jellemző doménstruktúrát tartalmazzák, vagy amelyekben a természetben előforduló Dpantolakton-hidrolázra jellemző doménstruktúra megtartott. Továbbá, a találmány tárgyát képezik olyan pro7
HU 222 434 Β1 teinek, amelyek D-pantolakton-hidroláz-aktivitás vonatkozásában, a természetben előforduló D-pantolaktonhidroláz-enzimmel megegyező aktivitással rendelkeznek.
A találmány tárgyát képezik a fent említett analógok és variánsok, azzal a kikötéssel, hogy azok a természetben előforduló D-pantolakton-hidrolázra jellemző doménstruktúrát tartalmazzák. A találmány tárgyát képezik továbbá, a találmány szerinti, természetben előforduló D-pantolakton-hidroláz elsődleges strukturális konformációjával lényegében ekvivalens konformációval rendelkező proteinek, valamint a találmány szerinti, természetben előforduló D-pantolakton-hidroláz elsődleges strukturális konformációjának egy részével rendelkező proteinek.
A találmány tárgyához tartoznak ezenfelül a természetben előforduló D-pantolakton-hidroláz biológiai sajátságaival vagy annak egy részével rendelkező proteinek, vagy a természetben előforduló D-pantolaktonhidroláz biológiai sajátságaival lényegében ekvivalens biológiai aktivitással rendelkező proteinek. Továbbá, a találmány tárgyát képezik a természetben előforduló variánsok. A találmány szerinti D-pantolakton-hidroláz a leírásban ismertetett módon különválasztható, izolálható és/vagy tisztítható.
A találmány tárgyát képezik a fent említett polipeptidet kódoló DNS-szekvenciák, valamint a természetben előforduló D-pantolakton-hidroláz eredeti sajátságaival vagy annak részével rendelkező D-pantolaktonhidroláz-polipeptideket (például analógjait vagy származékait) kódoló DNS-szekvenciák. Az említett, Dpantolakton-hidrolázt kódoló nukleotidszekvenciát módosíthatjuk is (például inszertálással, addícióval, delécióval és szubsztitúcióval). A találmány tárgyát képezik tehát ilyen módosított nukleotidszekvenciák is.
Mivel a találmány szerinti DNS-szekvenciák olyan, a D-pantolakton-hidroláz-protein aminosavszekvenciájára vonatkozó információkat szolgáltatnak, amelyek a korábbiakban nem álltak rendelkezésünkre, a találmány tárgyát képezi az említett információk alkalmazása is.
Az alkalmazási lehetőségek közé tartozik például hibridizációs próbák tervezése D-pantoIakton-hidrolázt, vagy azzal rokonságban álló proteineket kódoló, genomi eredetű DNS és cDNS izolálására és kimutatására, mikroorganizmusokból, előnyösen D-pantolakton-hidrolázt termelő mikroorganizmusokból, például a felsorolt nemzetségekhez tartozó, D-pantolakton-hidroláz-termelő képességgel rendelkező mikroorganizmusokból: Fusarium, Cylindrocarpon, Gibberella, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Volutella, Gliocladium, Eurotium, Nectoria, Schizophyllum, Myrothecium, Neurospora, Acremonium, Tuberculina, Absidia, Sporothrix, Verticillium vagy Arthroderma.
A találmány szerinti DNS-szekvenciák alkalmazhatók például hibridizációs próbákként, D-pantolaktonhidrolázt vagy azzal rokonságban álló proteineket kódoló, genomi eredetű DNS és cDNS izolálására és kimutatására, D-pantolakton-hidroláz-termelő képességgel rendelkező mikroorganizmusokból, előnyösen, a fent felsorolt nemzetségekhez, ezen belül a Fusarium nemzetséghez stb. tartozó mikroorganizmusokból. A gént izolálhatjuk például PCR-technikával, vagy RT-PCRtechnikával [reverz transzkriptáz (RT) alkalmazásán alapuló PCR-technikával], D-pantolakton-hidrolázt kódoló DNS, és azzal rokonságban álló DNS-ek alkalmazhatók D-pantolakton-hidrolázzal rokonságban álló gének PCR-technikával, RT-PCR-technikával vagy más technikával történő izolálására, kimutatására stb., kémiai szintézissel előállított DNS láncindító oligonukleotidok felhasználásával, amelyeket a klónozott és szekvenált D-pantolakton-hidroláz cDNS-szekvencia alapján következtetett aminosavszekvenciából, jellemző doménok (vagy azok részének) kiválasztásával, és a kiválasztott doménok (vagy azok része) alapján történő tervezéssel kaphatunk.
A fent említettek szerint, a találmány tárgyát képezik eljárások, a kívánt D-pantolakton-hidroláz előállítására, amely eljárások szerint, rekombináns D-pantolakton-hidroláz-DNS-molekulát és/vagy gént gazdasejtekbe juttatunk, majd azokban a D-pantolakton-hidrolázt expresszáltatjuk.
A találmány tárgyát képezik tehát a fenti protein expresszálására képes rekombinánsok (transzformánsok) vagy transzfektánsok, valamint azok alkalmazása.
A találmány tárgyát képezik ezenfelül nukleinsavak, például DNS-ek és RNS-ek, amelyek lehetővé teszik eukarióta- vagy prokarióta-gazdasejtekben, például Escherichia co/z'-gazdasejtekben a felsoroltak expresszióját:
1. D-pantolakton-hidroláz-aktivitással rendelkező proteinek vagy azok sói;
2. D-pantolakton-hidrolázzal lényegében ekvivalens aktivitással rendelkező proteinek és azok sói;
3. a D-pantolakton-hidroláz-proteint vagy annak egy részét tartalmazó (előnyösen, Fusarium oxysporumból származó D-pantolakton-hidroláz-protein), és azzal lényegében ekvivalens aktivitással vagy annak elsődleges strukturális konformációjával lényegében ekvivalens konformációval rendelkező polipeptidek vagy azok sói.
Továbbá, az említett nukleinsavak - előnyösen DNS-ek a következők:
a) az 1. azonosító számú aminosavszekvenciát kódoló szekvencia vagy azzal komplementer szekvencia;
b) az a) pont szerinti DNS-szekvenciával hibridizálódni képes szekvencia vagy annak ffagmense; és
c) az a) vagy b) pontok szerinti szekvenciával hibridizálódni képes, degenerált kóddal rendelkező szekvencia.
A találmány tárgyát képezik ilyen nukleinsavakkal transzformált vagy transzfektált eukarióta- vagy prokarióta-gazdasejtek, például Escherichia co/z-gazdasejtek, amelyek képesek a találmány szerinti polipeptidek expresszálására.
A találmány tárgyához tartoznak ezenfelül mikroorganizmusok, amelyekben a D-pantolakton-hidroláztermelő képességet úgy módosítottuk, hogy az említett mikroorganizmusba expresszálható módon, a következőket juttattuk be:
(i) D-pantolakton-hidroláz-aktivitással rendelkező proteint, vagy azzal lényegében ekvivalens aktivitással rendelkező proteint kódoló DNS-t; vagy
HU 222 434 BI (ii) az említett DNS-t tartalmazó DNS-t, például vektort.
Ilyen, D-pantolakton-hidroláz-termelő képességgel rendelkező mikroorganizmusok például a felsorolt nemzetségekhez tartozó mikroorganizmusok: Ftisarium, Cylindrocarpon, Gibberella, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Volutella, Gliocladium, Eurotium, Nectoria, Schizophyllum, Myrothecium, Neurospora, Acremonium, Tuberculina, Absidia, Sporothrix, Verticillium vagy Arthroderma. Ilyen mikroorganizmusok például a felsorolt törzsek: Fusarium oxysporum IFO-5942, Fusarium semitectam IFO-30 200, Cylindrocarpon tonkinense IFO-30 561, Gibberella fujikuroi IFO-6349, Aspergillus awamori IFO-4033, Penicillium chrysogenum IFO-4626, Rhizopus oryzae IFO-4706, Volutella buxi IFO-6003, Gliocladium catenulatum IFO-6121, Eurotium chevalieri IFO-4334, Nectria elegáns IFO-7187, Schizophyllum commune IFO-4928, Myrothecium roridum IFO-9531, Neurospora crassa IFO-6067, Acremonium fusidioides IFO-6813, Tuberculina persicina IFO-6464, Absidia lichteimi IFO-4009, Sporothrix schenckii IFO-5983, Verticillium malthousei IFO-6624, Arthroderma uncinatum IFO-7865 stb. A transzformációt végezhetjük olyan technikák szerint, amelyekben megfelelő sejtfallizáló enzimek segítségével előállított protoplasztokat érintkeztetünk DNS-sel, kalcium-klorid, polietilénglikol stb. jelenlétében; vagy végezhetjük elektroporációs technikával [lásd például E. Neumann és munkatársai: EMBO J.: 1, 841 (1982); stb.]; mikroinjektálásos technikával; ,,shot gun”-eljárással (a génnek belövéssel történő bejuttatásával) stb.
Az enzimeket tisztítási technikák alkalmazásával izolálhatjuk és állíthatjuk elő, különböző kiindulási anyagokból, például enzimtartalmú készítményekből, ezen belül sejttenyésztő folyadékból, roncsolt tenyésztett sejtekből, transzformált sejtekből stb. A tisztítást végezhetjük a technika állása szerint ismert technikákkal, például kisózással, ezen belül ammónium-szulfáttal történő precipitációval; gélszűréssel, Sephadex vagy hasonló gél alkalmazásával; ioncserélő kromatográfiás technikával, például dietil-amino-etil-csoportokkal vagy karboxi-metil-csoportokkal rendelkező hordozó alkalmazásával; hidrofób kromatográfiás technikával, például hidrofób csoportokkal, ezen belül butil-, oktilvagy fenilcsoportokkal rendelkező hordozók alkalmazásával; pigment-gélkromatográfiás technikával; elektroforézistechnikával; dialízissel; ultraszűréssel; affinitásos kromatográfiás technikával; nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás technikával stb.
Amennyiben az enzimet zárványtestekként kaptuk meg, azt szolubilizálókezelésnek vethetjük alá, például denaturálóvegyület, mint például guanidin-hidroklorid és karbamid, és - szükség szerint - redukálóvegyület, például 2-merkapto-etanol és dithiothreitol alkalmazásával, miáltal az enzim aktivált formáját állíthatjuk elő.
Enzimtartalmú anyagként, a fentiek helyett, természetesen enzimtermelő sejteket is alkalmazhatunk. Immobilizált enzimeket nyerhetünk az enzim immobilizálásával vagy enzimtermelő sejtek immobilizálásával, a technika állása szerint ismert eljárásokkal. Az immobilizációt végezhetjük hordozóhoz történő kötéssel, például kovalens eljárással és adszorbciós eljárással, keresztkötések létrehozásán alapuló technikával és kapszulázással stb. Az immobilizációt - szükség szerint végezhetjük kondenzációt előidéző vegyületek, például glutáraldehid, hexametilén-diizocianát és hexametiléndiizotiocianát alkalmazásával. Alkalmazhatunk továbbá monomertechnikákat, például amelyek szerint monomereket polimerizációs folyamat során géllé alakítunk; prepolimertechnikákat, amelyekben a szokásos monomereknél nagyobb méretű molekulákat polimerizálunk; polimertechnikákat, amelyek szerint polimereket alakítunk géllé stb. Az ilyen immobilizációt végezhetjük poliakrilamid alkalmazásával, vagy természetes polimerek, például alginsav, kollagén, zselatin, agar és κ-carrageenan (izlandi moha) alkalmazásával, vagy szintetikus polimerek, például fényre szilárduló gyanták és uretán-polimerek stb. alkalmazásával. A laktonvegyületek optikai forgatóképesség szerinti szétválasztását végezhetjük aszimmetrikus enzimatikus hidrolízissel, lakton-hidroláz alkalmazásával (például mikroorganizmus-tenyészetek és enzimek alkalmazásával történő D-pantolakton-hidrolízissel), valamint a kapott termékeknek a Hei 3-65 198 (megfelel: EP 0436730 BI számú szabadalom, közzététel napja: 1991. 07. 17.) és Hei 4-144 681 számú (megfelel: EP 0504421 BI számú szabadalom, közzététel napja: 1992. 09. 23.) számú vizsgálat nélkül közzétett japán szabadalmi bejelentésekben („KOKAI TOKKYO”) ismertetett módon történő kezelésével.
Az így kapott, transzformált mikroorganizmusokat (transzformánsokat) például folyékony tápfolyadékban rázatva tenyészthetjük. Az így nyert, tenyésztett sejteket összegyűjtjük, majd azokhoz D,L-pantolakton vizes oldatát adjuk (2-60%-os koncentrációban). Az elegyet 10-40 °C-on, több órától egy napig teqedő ideig reagáltatjuk, közben a pH-t 6-ról 8-ra módosítjuk. A reakció befejeződését követően, a sejteket eltávolítjuk, és a reakcióelegyben található, nem reagált L-pantolaktont szerves oldószerrel (előnyösen észterrel, például etil-acetáttal, aromás szénhidrogénnel, például benzollal, vagy halogénezett szénhidrogénnel, például kloroformmal) történő extrahálással különválasztjuk. A vizes fázisban maradó D-pantoiksavat, a laktonizációs folyamat végbemenetelét elősegítő savas körülmények mellett, sósav jelenlétében hevítjük, majd a fent említett szerves oldószerrel extraháljuk, ezáltal D-pantolaktont nyerünk. A fentihez hasonló módon alkalmazhatók a transzformáit mikroorganizmusok feldolgozott sejtjei (szárított sejtek, immobilizált sejtek stb.), vagy a transzformált sejtekből nyert enzimek vagy immobilizált enzimek.
A találmány fent említett, különböző megvalósítási módjainak alkalmazása által különböző technikai eszközök állnak rendelkezésünkre, például laktonvegyületek lakton-hidrolázzal (például D-pantolakton-hidrolázzal) végzett aszimmetrikus enzimatikus hidrolízisével, azok optikai forgatóképesség szerinti szétválasztására szolgáló, szintetikus vizsgálatokban alkalmazható eljárások, valamint egyéb alkalmazási célokra szolgáló eljárá9
HU 222 434 Β1 sok. A találmány szerinti megoldást a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk. Szakember számára nyilvánvaló, hogy az oltalmi igény számos egyéb lehetséges megvalósítási módra is kiteljed.
A leírásban és az ábrákon, a nukleotidok (bázisok) és aminosavak jelölésére alkalmazott rövidítések a „UPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature” által elfogadott rövidítéseken alapulnak, vagy a fogalmak technika állása szerint általánosan alkalmazott jelentésén alapulnak. Az aminosavak optikai izomeijei vonatkozásában - amennyiben másképp nem kötjük ki - L-izomereket kell érteni.
Az alábbi, 1. példában ismertettek szerint kapott, D-pantolakton-hidroláz-enzimet kódoló gént tartalmazó rekombináns vektorral (PFLC40E) transzformáit, JM109-(EJM-ESE-l) jelű Escherichia coli törzset 1995. augusztus 30-án (a letétbe helyezés eredeti napja), FERM P-15 141 nyilvántartási szám alatt letétbe helyeztük a „National Institute of Bioscience and Humán Technology” intézetében [„Ministry of International Trade and Industry”, Japán; 1-3, Higashi 1chome, Tsukuba-shi, IBARAKI (Zip-kód: 305), Japán]. A JM109-(EJM-ESE-l) jelű, eredetileg letétbe helyezett Escherichia co/z'-transzformánst 1996. augusztus 28-án kelt kérelmünkre ugyanabban az intézetben (az „NIBH” intézetében) ismételten letétbe helyezték, most már a Budapesti Szerződés rendelkezései szerint, és azóta FERM-BP-5638 nyilvántartási szám alatt van nyilvántartva.
A találmány szerinti megoldást a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk. A leírás alapján szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány számos, oltalmi igény alá eső megvalósítási módja lehetséges.
1. példa
1. A tisztított enzim aminosavszekvenciájának meghatározása
A Hei 4-144 681 számú, vizsgálat nélkül közzétett japán szabadalmi bejelentés (KOKAI, TOKKYO) 1. példája szerint előállított, fagyasztva szárított D-pantolakton-hidroláz mintáját (14,3 nmol; alegységek molekulatömege: 60 000) 44 μΐ, 8 mol/1 ureát tartalmazó, 50 mmol/1 Tris-HCl-pufferben (pH=9,0) oldottuk, és 1 órán át, 37 °C-on denaturáltuk. Ehhez az oldathoz 44 μΐ, 50 mmol/1 Tris-HCl-puffert adtunk (pH=9,0), miáltal az urea koncentrációja 4 mol/l-ra csökkent. Ezt követően, az elegyhez 12 μΐ (0,144 nmol; E/S=1/100), 12 nmol/ml lizilendopeptidázt adtaik (Wako Pure Chemicals, Japán), és 12 órán át, 30 °C-on emésztést végeztünk. Az így kapott, emésztett peptidet reverz fázisú oszlop (Nakarai Tesuku, Japán) alkalmazásával összegyűjtöttük, és az aminosavszekvenciát „477A Protein Sequencer” (ABI, USA) készülék alkalmazásával analizáltuk.
A peptidek összegyűjtésénél a következő körülményeket alkalmaztuk:
Oszlop: „Cosmosil 5C18-AR” (4,6x250 mm);
átfolyási sebesség: 1 ml/perc;
hőmérséklet: 35 °C;
a kimutatásnál alkalmazott hullámhossz: 210 nm; eluálóoldat: A, 0,l%TFA (TFA: trifluor-ecetsav);
B, 0,l%TFA/80% CHjCN.
Az eluálást a következő gradiens alkalmazásával végeztük: A->B (0,15%/perc).
Az aminosavszekvenálás eredményét az 1. és 2. ábrákon összegeztük.
2. Genomi eredetű DNS előállítása
a) Eljárás, genomi eredetű D-pantolakton-hidrolázDNS extrahálására
A logaritmikus szaporodási fázis anafázisában levő tenyésztett sejteket vákuumos szűréssel összegyűjtöttük. A sejteket folyékony nitrogénbe helyeztük, és „Waring Blender” készülék alkalmazásával apró részecskékké roncsoltuk. A bizonyos mértékig már finomított sejtelegyet mozsárba tettük, és folyékony nitrogén hozzáadásával eldörzsöltük. Ezt a terméket 70 °C-on tartott 2xCTAB-oldatban [2% CTAB (CTAB: cetil-trimetilammónium-bromid; Sigma, USA); 0,1 mol/1 Tris-HCl (pH=8,0); 1,4 mol/1 NaCl; és 1% PVP [PVP=poli(vinil-pirrolidon), Sigma, USA] szuszpendáltuk, majd 3-4 órán át, 65 °C-on inkubáltuk. Ezt követően, a centrifugálással nyert felülúszó-folyadékot fenollal, fenol/kloroform eleggyel, majd kloroformmal extraháltuk, majd a kapott oldatot, a DNS precipitálása céljából, azzal megegyező térfogatú izopropanollal kezeltük. Ezt a DNS„pépet” ezután 70%-os etanollal mostuk, levegőn szárítottuk és TE-pufferben oldottuk (10 mmol/1 Tris és 1 mmol/1 EDTA; pH=7,8). Az RNS-t ribonukleáz-A és ribonukleáz-Tl enzimekkel lebontottuk. Az így kapott DNS-terméket, a protein eltávolítása céljából fenollal, fenol/kloroform eleggyel, majd kloroformmal kezeltük. A kapott terméket, a DNS precipitálása céljából, azzal megegyező térfogatú izopropanollal kezeltük. Ezt a DNS-t 70%-os etanollal mostuk, levegőn szárítottuk és TE-pufferben oldottuk, hogy genomi eredetű DNSmintát kapjunk.
b) D-pantolakton-hidroláz-gén amplifikációja
A D-pantolakton-hidroláz belső peptidjeinek aminosavszekvenciájára vonatkozó információk alapján (1. és 2. ábra), az N-terminális aminosavszekvenciát kódoló szensz szálnak megfelelő szensz láncindító oligonukleotidot, valamint a belső peptidszekvencia antiszensz szálának megfelelő antiszensz láncindító oligonukleotidot állítottunk elő (3. ábra).
PCR-reakciót végeztünk, templátként a D-pantolakton-hidroláz genomi eredetű DNS-mintájának felhasználásával, a következő körülmények alkalmazásával.
A PCR-reakciót a technika állása szerint ismert technikákkal, például a következő szakirodalmi helyeken ismertetett technikák alkalmazásával végeztük: R. Saiki és munkatársai: Science 230, 1350 (1985); R. Saiki és munkatársai: Science 239, 487 (1988); „PCR Technology”, Stockton Press (1989) stb.
HU 222 434 Bl
A PCR alapján, körülbelül 1 kilobázis nagyságú, amplifikált DNS-fragmenseket nyertünk.
A PCR-reakció során a következő körülményeket alkalmaztuk:
Genomi eredetű DNS: 2,5 pg;
szensz láncindító oligonukleotid: 250 pmol (lásd 3. ábra);
antiszensz láncindító oligonukleotid: 250 pmol (lásd 3. ábra);
dNTP (2 mmol/1): 5 μΐ;
Tth polimerázpuffer (χ 10): 5 μΐ;
Tth DNS-polimeráz (Toyobo, Japán): 3 egység;
H2O:
összesen: 50 μΐ.
A reakciót a következő amplifikációs ciklus 30 alkalommal történő ismétlésével végeztük: 92 °C-on, 1 perc; 55 °C-on, 1 perc; és 73 °C-on, 3 perc.
Az így nyert, amplifikált DNS-fragmenseket szekvenáltuk, és a szekvenálással kapott DNS-szekvenciák alapján, az általuk kódolt aminosavszekvenciákra következtettünk; a dekódolt aminosavszekvenciák között kimutatható volt a D-pantolakton-hidroláz belső peptidje részleges aminosavszekvenciájának megfelelő aminosavszekvencia.
3. cDNS előállítása
a) mRNS előállítása
Tenyésztett sejteket a logaritmikus szaporodási fázis profázisában összegyűjtöttünk, a sejteket folyékony nitrogén alkalmazásával azonnal lefagyasztottuk, roncsoltuk, és az össz-RNS extrahálása céljából AGPCeljárásnak vetettük alá [, Acid Guanidinium Thiocyanate Phenol Chloroform Method”, savas guanidin-tiocianát-fenol-kloroform-eljárás; lásd például: Jikken Igaku, 75, 99 (1991)]. Az így nyert össz-RNS-t, tisztítás céljából oligo(dT)-cellulózoszlopra (Pharmacia) vittük fel, hogy az mRNS-frakciót megkapjuk.
b) cDNS-génkönyvtár előállítása
A kapott mRNS templátként történő felhasználásával, „cDNA rapido adaptor ligation modulé” („cDNA synthesis modulé RPN 1256”, 1994; Amersham International PLC) alkalmazásával cDNS-t szintetizáltunk, és a cDNS alapján cDNS-génkönyvtárakat állítottunk elő.
c) D-pantolakton-hidroláz-cDNS klónozása
A cDNS-génkönyvtárakkal Escherichia coli-gazd&sejteket fertőztünk, és plakkhibridizációs módszerrel pozitív plakkokra szelektáltunk. A plakkhibridizációs eljárásban, hibridizációs próbaként Fusarium oxysporum D-pantolakton-hidroláz-génből származó, 1 kb (kilobázis) fragmenseket alkalmaztunk a szelekcióra; az 1 kb fragmenseket „multiprime”-eljárással (véletlenszerű láncindító oligonukleotidok alkalmazásával) jelöltük. A kapott, pozitív kiónokat szekvenáltuk, és a feltárt DNS-szekvencia alapján, az általa kódolt aminosavszekvenciára következtettünk; ennek alapján megállapítottuk, hogy a fent említett, teljes hosszúságú D-pantolakton-hidroláz-gént sikerült klónozni.
Az izolált és szekvenált DNS a 2. azonosító számú nukleotidszekvenciával rendelkezett. Az említett nukleotidszekvencia által kódolt, az 1. azonosító számú aminosavszekvenciával rendelkező szekvenciával homológiát mutató szekvencia az NBRF („National Biomedical Research Foundation”) „Protein Sequence Data Bank” adatbázisában nem volt. A fenti nukleotidszekvenciával rendelkező DNS tehát teljesen új szekvencia.
A cDNS nukleotidszekvenciájának meghatározása során azt találtuk, hogy az N-terminális régió egy része hiányzik, és abban kezdőkodon nincs jelen. Ezért, a cDNS-be mesterséges úton, PCR-technikával kezdőkodont iktattunk be, hogy a gén expresszálására alkalmas vektort (PFLC40E) állíthassunk elő.
A 4. ábra szerinti restrikciós hasítási helyekkel rendelkező, szensz és antiszensz láncindító oligonukleotidokat szintetizáltunk. PCR-reakciót végeztünk a fenti láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, az alábbiakban ismertetett körülmények mellett.
A PCR-reakciót a technika állása szerint ismert technikákkal, például a következő szakirodalmi helyeken ismertetett technikák alkalmazásával végeztük: R. Saiki és munkatársai: Science 230, 1350 (1985); R. Saiki és munkatársai: Science 239, 487 (1988); „PCR Technology”, Stockton Press (1989); stb.
A PCR-reakció során a következő körülményeket al-
kalmaztuk:
Össz-DNS (cDNS): 10 pg;
szensz láncindító oligonukleotid: 0,1 nmol
(lásd 4. ábra);
antiszensz láncindító oligonukleotid: 0,1 nmol
(lásd 4. ábra);
dNTP (2 mmol/1): 10 μΐ;
Tth polimerázpuffer (x 10): 10 μΐ;
Tth DNS-polimeráz: 4 egység;
H2O:
összesen: 100 μΐ.
A következő amplifikációs ciklust ismételtük 30szor: 94 °C-on, 1 perc; 55 °C-on, 1 perc; és 75 °C-on, 3 perc.
A fenti módon előállított PCR-termékek végeiken EcoRI és Xbal restrikciósenzim-hasítási helyeket tartalmaztak. Ezeket tehát EcoRI- (Takara Shuzo, Japán) és Xbal- (Takara Shuzo, Japán) enzimekkel kezeltük, majd pUC18 plazmiddal ligáltuk („Takara Ligation Kit”; Takara Shuzo, Japán), így kaptuk a PFLC40E jelű expressziós vektort.
Ezt követően, az említett vektort, transzformált gazdasejtek előállítása céljából kompetens E. coli JM109 sejtekbe juttattuk, a következő szakirodalmi helyen ismertetett technika alkalmazásával: Sambrook és munkatársai (szerk.): „Molecular Cloning”, 2. kiadás, „Cold Spring Harbor Laboratory Press”. A célzott transzformánsokat 50 mg/1 ampicillint tartalmazó, 2xYT-táptalajban (1,5% tripton; 1% élesztőkivonat; és 0,5% NaCl) szelektáltuk. A transzformációt kalcium-kloridos technikával végeztük.
A fenti módon kapott E. co//-transzformánsokból 50 mg/1 ampicillint tartalmazó, 2 χ YT-táptalajban előtenyészetet készítettünk, és az így kapott, előtenyésztett sejtekkel (összesen 100 μΐ) 100 ml, az előtenyésztő tápfolyadék összetételével megegyező összetételű tenyésztő tápfolyadékot oltottunk be, hogy a tenyésztést a te11
HU 222 434 Bl nyésztési idő, a tenyésztési hőmérséklet és az izopropilb-tiogalaktopiranozid (IPTG) hozzáadása időpontjainak ellenőrzése mellett végezzük.
A tenyésztés eredményét az 1. táblázatban összegeztük.
A tenyésztést követően, az összegyűjtött sejteket ultrahang-kezeléssel roncsoltuk, majd centrifugáltuk, hogy felülúszót kapjunk. Az így nyert felülúszót Dpantolakton-hidroláz-aktivitásra nézve teszteltük.
A specifikus aktivitás, optimális körülmények mellett 2,25 egység/mg volt. A rekombináns proteinek enzimatikus aktivitását, D-pantolakton-hidroláz-aktivitásra nézve, a következő körülmények mellett vizsgáltuk:
Egy egységnek (U) tekintettük azt az enzimatikus aktivitást, amely percenként, 1 pmol D-pantolakton hidrolizálására képes. 200 μΐ, 0,5 mol/1 PIPES-pufferben (pH=7,0) oldott, 10%-os D-pantolakton-oldathoz 50 μΐ, enzimet tartalmazó oldatot adtunk, és az elegyet 120 percig, 30 °C-on reagáltattuk, majd ahhoz 250 μΐ, metanolban oldott, 2 mmol/1 EDTA-t adtunk, hogy a reakciót leállítsuk. Miután a reakció végbement, a folyékony reakcióelegyet a hidrolízis százalékos arányának meghatározása céljából HPLC-nek vetettük alá („Nucleosil 5C18”, 4,6χ 150 mm; eluens: 10% metanol; átfolyási sebesség: 1 ml/perc; a kimutatás 230 nm hullámhosszon történt). Amennyiben például a hidrolízis aránya 1 az enzimtartalmú oldat enzimatikus aktivitása milliliterenként 1,6 χ IO2 U/ml.
A PFLC40E vektorral transzformált E. coli JM109 törzset 2xYT-táptalajban tenyésztettük. A tenyészethez 2 mmol/1 végkoncentrációig IPTG-t adtunk.
1. táblázat
Az IPTG hozzáadásának időpontja Tenyésztési idő (óra) Tenyésztési hőmérséklet (°C) Specifikus aktivitás (egység/mg)
0(a) 6 28 0,86
0(a) 12 28 1,94
4(b) 7 28 1,33
4(b) 12 28 2,25
0(a) 6 37 1,05
0(a) 12 37 1,73
4(b) 7 37 1,31
4(b) 12 37 1,67
(a) : az IPTG-t a tenyésztés kezdetekor adtuk a 2xYT-táptalajhoz.
(b) : az IPTG-t a tenyésztés kezdetétől számított 4 óra múlva adtuk a 2 χ YT-táptalajhoz.
SDS-PAGE szerint, a centrifugált precipitátum oldhatatlan frakciójában egy intenzív csík volt kimutatható. Ezért, ezt a csíkot biotoltuk, és a mintát, Edman-féle degradációs technikával N-terminális aminosavszekvenciára nézve analizáltuk; ez az N-terminális aminosavszekvencia azonosnak bizonyult a D-pantolakton-hidroláz szekvenciájával.
A fentiek szerint, valószínű, hogy bár az E. coli expressziós rendszerben a rekombináns D-pantolakton-hidroláz a D-pantolakton-hidroláz-cDNS expresszálása során részben oldható formában expresszálódott, a rekombináns D-pantolakton-hidroláz nagyobb része zárványtestek formájában képződött.
A D-pantolakton-hidroláz-enzimet kódoló gént tartalmazó rekombináns vektorral (PFLC40E) transzformáit, JM109-(EJM-ESE-l) jelű Escherichia coli törzset 1995. augusztus 30-án (a letétbe helyezés eredeti napja), FERM P-15 141 nyilvántartási szám alatt letétbe helyeztük a „National Institute of Bioscience and Humán Technology” (NIBH) intézetében [„Agency of Industrial Science and Technology”, „Ministry of International Trade and Industry”, Japán; 1-3, Higashi 1chome, Tsukuba-shi, IBARAK1 (Zip-kód: 305), Japán] és ott tároljuk. A JM109-(EJM-ESE-l) jelű transzformáns a NIBH-intézetben a FERM-BP-5638 nyilvántartási számot kapta. Az eredetileg letétbe helyezett Escherichia co/z'-transzformáns (nyilvántartási szám: FERMP-15141; letétbe helyezés napja: 1995. augusztus 30.) Budapesti Szerződés értelmében történő átszállítására vonatkozó kérelem 1996. augusztus 28-án kelt.
Ipari alkalmazási lehetőségek
A találmány tárgyát képezik a természetben előforduló D-pantolakton-hidrolázt (például Fusarium oxysporumból származó D-pantolakton-hidrolázt), vagy azzal lényegében ekvivalens aktivitással rendelkező proteineket kódoló génstruktúrák. Ezek alkalmazásától jelentős előrelépés várható, például az említett proteint kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó DNS-sel transzformáit gazdasejtek alkalmazása terén; az említett proteinek, említett gazdasejtek alkalmazásával történő előállítására szolgáló eljárások terén; valamint a D-pantolakton, említett proteinek és gazdasejtek alkalmazásával történő előállítására szolgáló eljárások terén. Ezenfelül, az enzimatikus aktivitás, a D-pantolakton-hidroláz módosításával természetesen lényegesen növelhető is.
1. Expresszió A. oryzea-ban. a) A. oryzae/pNALC22
A már korábban E. coli-ba klónozott pFLC40E plazmidot izoláltuk és ZscoRI és Xbal restrikciós enzimekkel hasítottuk, hogy laktonáz-cDNS-t (azaz Dpantolakton-hidroláz-cDNS-t) tartalmazó DNS-fragmenst nyerjünk, amelyet tompa végűvé tettünk, majd PzwoCI-helyre inszertáltunk a P-No8142 promotertől 3’ irányban a pNAN8142 expressziós vektorban. Az így kapott vektort pNALC22-nek neveztük. Ezt a vektort E. coli-ban expresszáltattuk, miközben Amp-rezisztenciát hordozó tulajdonságát indikátorként alkalmazva tartottuk fenn.
Ezután A. oryzae-t transzformáltunk, a klónozott pNALC22 vektort bejuttatva. A transzformált sejteket Czapeck-tápközegben szelektáltuk.
A mycéliumokat és a spórákat begyűjtöttük az A. oryzac/pNALC22 tenyészetből, és enzimaktivitásra nézve teszteltük (2. és 3. táblázatok). Ezzel egyidejűleg különböző laktonázaktivitást mutató mikroorganizmusokat (F. oxysporum AKU3702, E. coli JM109/pFLC40E) teszteltünk.
HU 222 434 Β1
b) A. oryzae/pMELC252
A már korábban E. coli-ba klónozott pFLC40E plazmidot izoláltuk és PCR-templátként alkalmaztuk laktonáz-cDNS előállítására, amelynek mindkét végén Sa/I-helyet alakítottunk ki, majd όα/Ι-helyre inszertáltunk a melO-promotertől 3’ irányban a pMENB expressziós vektorban. Az így kapott vektort pMELC252nek neveztük. Ezt a vektort E. coli-bon expresszáltattuk, miközben Amp-rezisztenciát hordozó tulajdonságát indikátorként alkalmazva tartottuk fenn.
Ezután A. oryzae-t transzformáltunk, a klónozott pMELC252 vektort bejuttatva. A transzformált sejteket Czapeck-tápközegben szelektáltuk.
A mycéliumokat és a spórákat begyűjtöttük az A. oryzae/pMELC252 tenyészetből, és enzimaktivitásra nézve teszteltük (2. és 3. táblázatok). Eredményként megfigyeltük, hogy az A. oryzae/pMELC252 D-pantolaktont (D-PL) hidrolizáló tulajdonsággal bír.
2. Tápközegek
Minden egyes mikroorganizmust a következő tápközegben tenyésztettünk:
a) Tápközeg Fusariumhoz
Glükóz 1%
Polipepton 0,5%
Élesztőkivonat 0,5%
Gabonaáztató lé („Com Steep Liquor”) 0,5%
b) Tápközeg Aspergillus-micéliumhoz DP-tápközeg
Dextrin 2%
Polipepton 1%
1 KH2PO4 0,5%
1 NaNOj 0,1%
1 MgSO4.7H2O 0,05% (ρΗ-beállítás nélkül)
c) Tápközeg Aspergyllus-spórához Czapeck-tápközeg
Glükóz 2%
NaNO3 0,2%
KH2PO4 0,1%
KC1 0,05%
MgSO4.7H2O 0,05%
FeSO4.7H2O 0,001%
Agar 1,5% (pH 5,5)
d) Korpatápközeg
Ι Gabonakorpa 40 g
1 Glükóz 0,2 g
1 Élesztőkivonat 0,05 g
1 h2o 24 g
e) Tápközeg E. coli-hoz 2 χ YT-tápközeg LB-tápközeg
3. Tenyésztés
a) Fusarium
A Fusarium-sejteket kémcsőben tenyésztettük kis térfogatban (tápközeg: 5 ml) 28 °C-on két napig 300 rpm fordulatszámmal rázatva a tenyészetet. Ezután a sejteket 2 1-es Sakaguchi-féle edényben tenyésztettük (tápközeg: 500 ml) 28 °C-on 7 napig, 150 rpm fordulatszám mellett, majd begyűjtöttük azokat.
b) Aspergillus
Az Aspergillus-sejtéket kémcsőben tenyésztettük kis térfogatban (DP-tápközeg: 5 ml) 28 °C-on két napig 300 rpm fordulatszámmal rázatva a tenyészetet. Ezután a sejteket 2 1-es Sakaguchi-féle edényben tenyésztettük (tápközeg: 500 ml) 28 °C-on 7 napig, 150 rpm fordulatszám mellett, majd szívatva szűrtük azokat a micéliumok kinyerése érdekében.
Az Aspergillus-sejteket Czapek-féle lejtőn („slant”) is szaporítottuk. Ezután a tenyészethez vizet adtunk olyan mennyiségben, amely megközelítőleg megfelelt a tápközegnek, és az elegyet kevertettük, majd gézen átszűrtük. A kapott szűrletet centrifugáltuk, hogy a spórákhoz jussunk. A kapott spórákat steril vízben szuszpendáltuk, korpatápközeghez („bran médium”) adtuk, 28 °C-on 10 napig állni hagytuk a további szaporítás érdekében, gézen leszűrtük és a szűrletet a spórák kinyerése érdekében lecentrifugáltuk.
c) E. coli
Az E. coli-sejteket kémcsőben tenyésztettük kis térfogatban (40 pg/ml ampicillint tartalmazó 2xYT-tápközeg) 28 °C-on 12 órán át, majd 2 1-es Sakaguchi-féle edényben (40 pg/ml ampicillint tartalmazó, 500 ml LBtápközeg) tenyésztettük 28 °C-on 12 órán át, begyűjtöttük, amennyiben annyi IPTG-adtunk az elegyhez, hogy a végső IPTG-koncentráció 4 órával a második tenyésztési lépés kezdete után elérje az 1 mM-t.
Az eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be.
4. Vizsgálatok
Az enzimatikus aktivitást minden esetben a következőképpen teszteltük:
Egyenként IM Trisz-HCl-ot (pH 7,4), 2 vegyes% D- vagy L-PL-t és 50 mg mikroorganizmust tartalmazó reakcióelegyeket állítottunk elő, és mindegyiknek 1 ml-re állítottuk be a térfogatát. Az elegyeket 28 °Con 2 órán keresztül rázattuk. A reakciót 2 ml MeOH hozzáadásával állítottuk le. Minden mintát HPLC alkalmazásával mértünk meg.
A mikroorganizmus-sejteket, amelyek nedves tömegét előre megmértük, 100 °C-on egy éjszakán át szárítottuk. Minden egyes esetben kiszámítottuk a száraz tömeg/nedves tömeg arányt.
Az eredményeket a 2. és 3. táblázatban mutatjuk be.
1. táblázat
Mikroorganizmus Tápközeg Nedves sejtek tömege (g)
A. oryzae/pVSALC22 DP 38,7
A. oryzae/pMELC252 DP 40,9
HU 222 434 Bl
1. táblázat (folytatás) 5 Mikroorganizmus Tápközeg Nedves sejtek tömege (g)
Mikroorganizmus Tápközeg Nedves sejtek tömege (g)
A. oryz«e/pNAN8142 gabonakorpa 4,20
A. oryzae/pNAN8142 DP 34,6 A. oryzae/pMENB gabonakorpa 2,64
A. oryzaeföMEtTÖ DP 32,3 E. coli 2,84
A. oryzaelpbiALC22 gabonakorpa 8,73 E. coli 1,34
A. oryzoe/pMELC252 gabonakorpa 7,02 1Λ F. oxysporum 43,0
2. táblázat
Szubsztrát: D-pantolakton
Mikroorganizmus Hidrolízisarány (%) Hidrolízisarány (%/mg nedves tömeg) Hidrolízisarány (%/mg száraz tömeg)
A. oryzae/pNALC22 micélium 64,8 1,2 11,2
A. oryzae/pNAN8142 8,9 0,2 1,2
A. oryzae/pMELC252 84,6 1,7 12,7
A. ozyzae/pMENB 8,5 0,2 1,2
A. oryzae/pNALC22 spóra 76,0 1,5 7,1
A. oryzae/pNAN8142 2,1 0,0 0,2
A. ozyzae/pMELC252 79,9 1,6 7,7
A. ozyzae/pMENB 7,7 0,2 0,7
| E. coli JM109/pFLC40E 84,0 1,7 10,3
1 E. coli JM109/pUC18 0,0 0,0 0,0
F. oxysporum AKU3702 52,4 1,1 6,2
Kontroll 0 - -
Az E. coli JM109/pUC18 gazdasejt, azaz olyan sejt, amelyet nem transzformáltunk a D-pantolakton-hidroláz-génnel.
3. táblázat
Szubsztrát: L-pantolakton
Mikroorganizmus Hidrolízisaiány (%) Hidrolízisarány (%/mg nedves tömeg) Hidrolízisarány (%/mg száraz tömeg)
A. oryzae/pHALC22 micélium 13,0 0,27 2,38
A. oryzae/pNAN8142 3,9 0,08 0,56
A. o/yzae/pMELC252 0,0 0,00 0,00
A. oryzae/pMENB 0,0 0,00 0,00
A. 0fyzae/pNALC22 spóra 5,4 0,11 0,52
A. oryzoe/pNAN8142 6,3 0,13 0,62
A. oryzae/pMELC252 5,6 0,11 0,54
A. ozyzae/pMENB 4,2 0,08 0,38
E. coli JM109/pFLC40E 0,0 0,00 0,00
E. coli JM109/pUC18 2,2 0,04 0,23
F. oxysporum AKU3702 0,0 0,00 0,00
Kontroll 0 - -
HU 222 434 Bl
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 380
TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: peptid
AZ1. Al a 1 AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Gin Ly s Ser Phe 15 Asn
Ly s Leu Pro Ser 5 Thr Alá Gin Ile Ile 10 As p
Val Leu Lys Asp 20 Val Pro Pro Pro Al a 25 Va 1 Al a Asn As p Ser 30 Leu Val
Phe Thr Trp 35 Pro Gly Val Thr Glu 40 Glu Ser Leu Val Glu 45 Ly s Pro Phe
Hi s Val 50 Tyr Asp Glu Glu Phe Tyr 55 Asp Val Ile Gly 60 Ly s As p Pro Ser
Leu 65 Thr Leu Ile Al a Thr 70 Ser Asp Thr Asp Pro 75 Ile Phe Hi s Glu Al a 80
Val Val Trp Tyr Pro 85 Pro Thr Glu Glu Val 90 Phe Phe Val Gin Asn 95 Al a
Gly Al a Pro Al a 100 Al a Gly Thr Gly Leu 105 Asn Ly s Ser Ser Ile 110 Ile Gin
Lys Ile Ser 115 Leu Ly s Glu Alá Asp 120 Al a Val Arg Ly s Gly 125 Lys Gin Asp
Glu Val 130 Ly s Val Thr Val Val Asp 135 Ser Asn Pro Gin 140 Val Ile Asn Pro
Asn 145 Gly Gly Thr Tyr Tyr 150 Lys Gly Asn Ile Ile 155 Phe Al a Gly Glu Gly 160
Gin Gly Asp Asp Val 165 Pro Ser Alá Leu Tyr 170 Leu Me t Asn Pro Leu 175 Pro
Pro Tyr Asn Thr 180 Thr Thr Leu Leu Asn 185 Asn Tyr Phe Gly Arg 190 Gin Phe
Asn Ser Leu 195 Asn Asp Val Gly Ile 200 Asn Pro Arg Asn Gly 205 As p Leu Tyr
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (13)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Izolált, D-pantolakton-hidroláz-aktivitású, nem glikozilált, rekombináns fehérje, amelynek aminosavszekvenciája az 1. azonosító számon bemutatott aminosavszekvenciával azonos, vagy azzal legalább 80%-os homológiát mutat, valamint a fehéije bármelyik sója.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti fehérje, amelynek aminosavszekvenciája legalább 90%-ban homológ az 1. azonosító számon bemutatott aminosavszekvenciával.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti fehéije, amelynek amino savszekvenciája azonos az 1. azonosító számon bemuta tott aminosavszekvenciával.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti fehérje 55 amely exogén DNS-nek prokarióta-gazdasejtben törté nő expresszáltatásával előállított.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti fehéije amely eukarióta-mikroorganizmusból származik.
  6. 6. Nukleinsav vagy annak sója, amelynek nukleo 60 tidszekvenciája D-pantolakton-hidroláz-aktivitású fe
    HU 222 434 BI hérjét kódol, amely fehérje D-pantolakton-hidrolázaktivitást előállítani képes eukarióta-mikroorganizmusból származik.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti nukleinsav, amely nukleotidszekvenciájának egy része a 2. azonosító számon megadott nukleotidszekvencia egy nyílt leolvasási keretének felel meg, vagy azzal lényegében ekvivalens aktivitású nukleotidszekvenciának.
  8. 8. Vektor, amely 6. vagy 7. igénypont szerinti nukleinsavat hordoz.
  9. 9. Transzformáns, amely 8. igénypont szerinti vektort tartalmaz.
  10. 10. Eljárás 6. vagy 7. igénypont szerint definiált fehérje vagy részpeptidje, például D-pantolakton-hidroláz vagy sója előállítására, azzal jellemezve, hogy a 6. vagy 7. igénypont szerinti nukleinsavat hordozó vektort tartalmazó transzformánst szaporítására alkalmas tápközegben tenyésztjük, miáltal rekombináns fehérjeként előállítjuk a 6. vagy 7. igénypont szerint definiált fehérjét vagy részpeptidjét, például D-pantolakton-hidrolázt vagy sóját.
  11. 11. Eljárás D-pantolakton előállítására, azzal jelle5 mezve, hogy D,L-pantolakton optikai rezolválását valósítjuk meg (i) az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti, D-pantolakton-hidroláz-aktivitás előállítására képes eukarióta-mikroorganizmusból származó D-pantolakton-hidro10 láz-aktivitású fehérje vagy sója, vagy (ii) a 9. igénypont szerinti transzformáns jelenlétében.
  12. 12. Eljárás D-pantoténsav előállítására, azzaljellemezve, hogy a 11. igénypont szerinti eljárással D-pantolak15 tont állítunk elő, majd azt D-pantoténsawá alakítjuk át.
  13. 13. Eljárás pantetin előállítására, azzal jellemezve, hogy all. igénypont szerinti eljárással D-pantolaktont állítunk elő, majd azt pantetinné alakítjuk át.
HU9701904A 1995-09-13 1996-09-13 D-pantolakton hidroláz és azt kódoló gén HU222434B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP25945195 1995-09-13
PCT/JP1996/002620 WO1997010341A1 (fr) 1995-09-13 1996-09-13 D-pantolactone hydrolase et gene codant ladite substance

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP9701904A2 HUP9701904A2 (hu) 1998-03-02
HUP9701904A3 HUP9701904A3 (en) 1998-06-29
HU222434B1 true HU222434B1 (hu) 2003-07-28

Family

ID=17334256

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9701904A HU222434B1 (hu) 1995-09-13 1996-09-13 D-pantolakton hidroláz és azt kódoló gén

Country Status (12)

Country Link
US (2) US6406898B1 (hu)
EP (1) EP0794251B1 (hu)
JP (1) JP3830165B2 (hu)
CN (1) CN1121497C (hu)
AU (1) AU1810197A (hu)
CA (1) CA2204743C (hu)
DE (1) DE69634815T2 (hu)
ES (1) ES2242968T3 (hu)
HU (1) HU222434B1 (hu)
MX (1) MX221102B (hu)
RU (1) RU2218405C2 (hu)
WO (1) WO1997010341A1 (hu)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003512015A (ja) * 1998-11-10 2003-04-02 ノボザイムス バイオテック，インコーポレイティド ラクトノヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド及びそれをコードする核酸
US6395529B1 (en) 1998-11-10 2002-05-28 Novozymes Biotech, Inc. Polypeptides having lactonohydrolase activity and nucleic acids encoding same
AU3503800A (en) 1999-02-24 2001-05-30 Novozymes Biotech, Inc. Methods for using lactonohydrolases in baking
MXPA02003417A (es) * 1999-10-29 2002-08-20 Basf Ag L-pantolactona-hidrolasa y un procedimiento para la obtencion de d-pantolactona.
US7407746B2 (en) * 2001-02-08 2008-08-05 Ngk Insulators, Ltd. Biochip and method for producing the same
WO2004078951A1 (ja) 2003-03-03 2004-09-16 Daiichi Fine Chemical Co., Ltd. ラクトナーゼの製法およびその利用
KR101156882B1 (ko) * 2003-03-28 2012-07-05 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 판토락톤 하이드롤라제
EP1727830B1 (en) 2004-03-26 2011-01-05 Postech Foundation Mussel bioadhesive
UA110323C2 (en) * 2009-06-04 2015-12-25 Promedior Inc Derivative of serum amyloid p and their receipt and application
CN113046337B (zh) * 2021-03-18 2023-04-07 赤峰制药股份有限公司 一种泛解酸内酯水解酶突变体菌株及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5572182A (en) * 1978-11-28 1980-05-30 Sagami Chem Res Center Optical resolution of pantolactone
JPS62294094A (ja) 1986-06-12 1987-12-21 Sanaka Tsutomu モノクロ−ナル抗体
JPH0667320B2 (ja) * 1986-06-13 1994-08-31 三菱化成株式会社 Ｄ−パントラクトンの製造法
JPH0655156B2 (ja) * 1986-06-13 1994-07-27 三菱化成株式会社 Ｄｌ−パントラクトンの光学分割法
JP2844354B2 (ja) 1989-08-03 1999-01-06 富士薬品工業株式会社 Ｄ―パントラクトンの製造法
JP3011449B2 (ja) * 1990-10-05 2000-02-21 富士薬品工業株式会社 Ｄ―パントラクトン加水分解酵素およびその製造法

Also Published As

Publication number Publication date
EP0794251A1 (en) 1997-09-10
CA2204743C (en) 2008-09-02
EP0794251B1 (en) 2005-06-08
MX221102B (es) 2004-06-23
US6406898B1 (en) 2002-06-18
US6794171B2 (en) 2004-09-21
ES2242968T3 (es) 2005-11-16
HUP9701904A2 (hu) 1998-03-02
HUP9701904A3 (en) 1998-06-29
CN1121497C (zh) 2003-09-17
JP3830165B2 (ja) 2006-10-04
CN1166182A (zh) 1997-11-26
WO1997010341A1 (fr) 1997-03-20
US20030124697A1 (en) 2003-07-03
RU2218405C2 (ru) 2003-12-10
AU1810197A (en) 1997-04-01
CA2204743A1 (en) 1997-03-20
EP0794251A4 (en) 2000-01-12
MX9703475A (es) 1997-07-31
DE69634815D1 (de) 2005-07-14
DE69634815T2 (de) 2006-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU713699B2 (en) Alpha-galactosidase
AU723433B2 (en) Amidase
RU2103364C1 (ru) Последовательность днк, белок и способ получения белка
AU717156B2 (en) Novel DNA polymerase
JP2001505403A (ja) エステラーゼ
HU222434B1 (hu) D-pantolakton hidroláz és azt kódoló gén
JPH09173078A (ja) 分子シャペロンを用いる蛋白質の製造方法
EP1882740B1 (en) N-acetyl-(R,S)-B-amino acid acylase gene
US6531308B2 (en) Ketoreductase gene and protein from yeast
EP0897005A1 (en) Polyester synthase and a gene coding for the same
US6825018B1 (en) Sorbitol dehydrogenase, gene encoding the same and use thereof
EP1197557A1 (en) Gene encoding cyclic lipopeptide acylase and expression of the same
CN100379867C (zh) 丁炔醇ⅰ酯酶
US5314819A (en) Protein having nitrile hydratase activity obtained from rhizobium, gene encoding the same, and a method for producing amides from nitriles via a transformant containing the gene
AU751921B2 (en) D-pantolactone hydrolase and gene encoding the same
JP2009291158A (ja) ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼの変異酵素
JP3658323B2 (ja) トレハロースシンターゼ蛋白質、遺伝子、プラスミド、微生物、及びトレハロースの製造方法
CA2275443A1 (en) Monofunctional glycosyltransferase gene of staphylococcus aureus
US5968801A (en) Polyhydroxyalkanoate depolymerase and process for producing the same
KR20020056894A (ko) 신규 카르보닐 환원효소, 그의 유전자 및 그의 이용 방법
JP2003159079A (ja) アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ、その製造方法およびその用途
EP1543126B1 (en) A gene encoding vitamin b6-phosphate phosphatase and use thereof
US20030186410A1 (en) Novel (r)-2-hydroxy-3-phenylpropionate (d-phenyllactate) dehydrogenase and gene encoding the same
JP4171805B2 (ja) 糖転移酵素
JPH08205864A (ja) 新規セファロスポリンｃアシラーゼおよびその製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20030512

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees