WO1995016460A1

WO1995016460A1 - Dispositif a semi-conducteur

Info

Publication number: WO1995016460A1
Application number: PCT/JP1994/002128
Authority: WO
Inventors: Yasuyuki Kunihiro; Ryo Tanaka; Seishichi Hata; Shigeharu Suzuki; Yumio Kudoh
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 1993-12-17
Filing date: 1994-12-16
Publication date: 1995-06-22
Also published as: JP3537440B2; ATE249234T1; DE69433133T2; EP0689843B1; CA2156255C; DE69433133D1; AU1200995A; CA2156255A1; EP0689843A1; AU692497B2; EP0689843A4; US5834028A

Description

明細書発明の名称

可溶性トロンボモジュリン含有組成物

技術分野

本発明は、 1種または 2種以上の可溶性トロンボモジュリンと、マルトース、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる 1種あるいは 2種以上を必須成分として含有することを特徴とする組成物およびその組成物の製法に関する。

また、本発明は、 1種または 2種以上の可溶性トロンボモジュリンと、非ィォン性界面活性剤を必須成分として含有することを特徴とする組成物およ：その組成物の製法に関する。

た、本発明は、 1種または 2種以上の可溶性トロンボモジュリンと、マルト一ス、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる 1種あるいは 2種以上と、非ィォン性界面活性剤を必須成分として含有することを特徴とする組成物およびその組成物の製法に関する。

また、本発明は、マルト一ス、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる 1種あるいは 2種以上を含有することを特徴とする可溶性トロンボモジュリンの安定化剤に関する。

また、本発明は、マルト一ス、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる 1種あるいは 2種以上を添加することを特徴とする可溶性トロンボモジュリンの安定化方法に関する。

また、本発明は、非イオン性界面活性剤を含有することを特徴とする可溶性ト口ンボモジュリンの吸着防止剤に関する。

また、本発明は、非イオン性界面活性剤を添加することを特徴とする可溶性ト口ンボモジュリンの吸着防止方法に関する。背景技術

トロンボモジュリンはトロンビンを向凝固酵素から抗凝固酵素へと変換せしめるユニークな性質を持つ血管内皮表面に存在する蛋白質として、 1 9 8 1年エスモン（E smon) ら（プロシーデイングズ ·ォブ ·ザ · ナショナル · ァ力デミ一 ·ォブ ·サイェンシズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エスェ一（P r o c e e d i n g s o f t h e Na t i o n a l Ac a d emy o f S c i e n c e s o f t h e USA) 7 8、 224 9— 2254、 1 98 1) により報告された。続く論文において、ゥサギ肺組織よりの単離精製に成功し、これを報告した (ザ · ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル · ケミストリ一（Th e J o u r n a 1 o f B i o l o g i c a l Ch emi s t r y) 2 57 (2) , 8 5 9一 864， 1 982) 。さらに、ヒトトロンボモジュリンの全 DN A配列およびァミノ酸配列が報告され（ェンボ · ジャーナル（EMBO J o u r n a l ) 6, 1 8 9 1 - 1 89 7, 1 987 ;ノくィオケミストリー（B i o c h em i s t r y) 2 6 ( 1 4 ) , 4 3 5 0 - 4 3 5 7, 1 98 7 ) 、各ドメインの役割が明らかにされつつある。トロンボモジュリンはトロンビンと結合し、トロンビンの持つ血液凝固作用を失わせしめ、トロンビン一トロンボモジュリン複合体はプ口ティン cを活性化することにより抗凝固作用を示すとされている。すなわち、卜口ンボモジュリンは血液凝固阻害作用と線溶促進作用の両方の作用を発揮する可能性があり、臨床応用が期待されている。

従来、血液凝固能異常に係わる疾患の治療剤としては、抗血液凝固作用をもつたアンチトロンビン I I Iやへパリンが、一方、血栓溶解作用をもったゥロキナ

—ゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノ一ゲンァクチべ一ター等が使用されている。しかしながら、これらの物質は、出血傾向等の副作用を有し、作用が抗血液凝固あるいは血栓溶解のいずれかに偏っている。従って、この両方の作用を発揮する可能性があるトロンボモジュリンあるいは基本的にトロンビンと親和性を有しプロテイン Cの活性化を促進するというトロンボモジユリン活性を有したトロンボモジュリン様物質の臨床応用に期待が高まっている。

ヒトトロンボモジユリンは、溶解性が低く、特に医薬品として利用する場合、精製や製剤化等で問題を生じていた。すなわち、ト口ンボモジュリンは膜結合性であり、ァミノ末端領域、 E G F様構造領域、 0—グリコシル化部位領域、細胞膜貫通領域および細胞質内領域の 5つからなる完全長のァミノ酸配列を持つものは精製過程ある、は製剤化等に際して溶解補助剤を添加する必要がある。このため溶解性の高いトロンボモジュリン様物質（以下可溶性トロンボモジュリンと呼ぶ）が望まれていた。抗原性等の安全性のことを考慮すると、天然型であるヒト尿由来可溶性トロンボモジュリンなどがより望まれている。このような可溶性トロンボモジュリンの例のうち、遺伝子工学的手法によるものとして、細胞膜貫通領域および細胞質内領域を除去した可溶性ト口ンボモジュリン（特開平 1 一 6 2 1 9号公報、特開平 2— 2 5 5 6 9 9号公報、特開平 3— 1 3 3 3 8 0号公報、特開平 3— 2 5 9 0 8 4号公報、特開平 4一 2 1 0 7 0 0号公報、特表平 3 - 5 0 3 7 5 7号公報、特表平 4一 5 0 5 5 5 4号公報、 EP 4 7 4 2 7 3号公報、 WO 9 1 / 0 4 2 7 6号公報、 WO 9 1 / 0 5 8 0 3号公報、 WO 9 1 / 1 5 5 1 4号公報、 W09 2Z 0 0 3 2 5号公報、 WO 9 2 / 0 3 1 4 9号公報、 WO 9 3 / 1 5 7 5 5号公報、土肥ら，日本薬学会，第 1 1 3年会，講演要旨集 3，演題番号 3 0 EM 1 4— 1， 1 9 9 3年）等が挙げられる。あるいは天然型としてヒト尿由来の可溶性トロンボモジュリン（特開昭 6 3— 3 0 4 2 3号公報、特開昭 6 3— 1 4 6 8 9 8号公報、特開平 3— 8 6 9 0 0号公報、特開平 3— 2 1 8 3 9 9号公報、イシイ（ I s h i i ) ら，ザ ' ジャーナル ·ォブ · クリニカル • インべスティゲ一シヨン（Th e J o u r n a l o f C l i n i c a l I n v e s t i g a t i o n) 7 6， 2 1 7 8 - 2 1 8 1, 1 9 8 5、平本ら，日本薬学会，第 1 0 8年会，講演要旨集，演題番号 6 F 0 5 1 1 - 1, 1 9

8 8年、矢谷ら，血液と脈管， 2 0， 1 9 7 - 2 0 0, 1 9 8 9、ャマモト（Y amamo t o) ら，ザ · ジャーナル ·ォブ ·バイオケミストリー（Th e J o u r n a 1 o f B i o c h em i s t r y) 1 1 3， 4 3 3— 4 4 0， 1

9 9 3 ) 等の公知のものがある。

具体的には、遺伝子工学的手法によるものとして、特開平 1一 6 2 1 9号公報には少なくともアミノ末端から 3 4 5— 4 6 2番目のアミノ酸配列を含む可溶性卜口ンボモジュリン力く、特開平 2— 2 5 5 6 9 9号公報には 1 1 5のアミノ酸残基からなる可溶性ト口ンボモジュリンが、特開平 3— 1 3 3 3 8 0号公報には少なくともアミノ末端から 1— 4 9 7番目のアミノ酸残基を含む可溶性トロンボモジュリン力く、特開平 3— 2 5 9 0 8 4号公報には 4 6 8のァミノ酸残基からなる可溶性トロンボモジュリンカ《、特開平 4一 2 1 0 7 0 0号公報には硫酸化グリコサミノグリカンで修飾されない可溶性トロンボモジュリン力く、特表平 3— 5 0 3 7 5 7号公報にはヒト組織プラスミノーゲンァクチべ一ターのァミノ酸配列の一部を含んでいてもよい可溶性トロンボモジユリン力く、特表平 4一 5 0 5 5 5 4号公報にはヒト組織プラスミノーゲンァクチべ一ター等のアミノ酸配列の一部を含んでいてもよい可溶性ト口ンボモジュリン力く、 E P 4 7 4 2 7 3号公報には 1 9 残基からなるトロンビン結合部位とプロテイン C活性化部位とを含んでなる可溶性トロンボモジュリン力く、 WO 9 1 / 0 4 2 7 6号公報にはコンドロイチン及び Z又はコンドロイチン硫酸を含む糖鎖を有する可溶性トロンボモジユリンカ \ W 0 9 1 / 0 5 8 0 3号公報には硫酸化グリコサミノグリカンで修飾された可溶性トロンボモジュリンカく、 WO 9 1 / 1 5 5 1 4号公報にはメチォニンを他のアミノ酸に置換することによつて酸化を防止した可溶性トロンボモジュリン力く、 WO 9 2 X 0 0 3 2 5号公報には組換ヒ卜尿由来可溶性トロンボモジユリンおよびその変異型物質が、 W0 9 2 / 0 3 1 4 9号公報には 0—グリコシル化部位領域の糖鎖を修飾あるいは 0—グリコシル化部位領域を欠失させた可溶性トロンボモジュリンカ <、 WO 9 3 X 1 5 7 5 5号公報にはァミノ酸配列を修飾することによつて蛋白分解酵素による分解を防止した可溶性トロンボモジュリンカく、 WO 9 3 / 2 5 6 7 5号公報にはアミノ酸配列を修飾することによってコファクタ一活性を修飾した可溶性トロンボモジュリンカ \ 各々開示されている。さらに、土肥らはゥシトロンボモジュリン由来の酸性ァミノ酸配列を含む配列を付加した可溶性トロンボモジュリンを報告している（日本薬学会，第 1 1 3年会，講演要旨集 3，演題番号 3 0 E M 1 4 - 1 , 1 2 8頁， 1 9 9 3年）。また、ヒト尿由来の該物質として、特開昭 6 3 - 3 0 4 2 3号公報には非還元状態での分子量が 2 0 0, 0 0 0、 4 8， 0 0 0および 4 0， 0 0 0からなる可溶性ト口ンボモジュリンの混合物が、特開昭 6 3— 1 4 6 8 9 8号公報には非還元状態での分子量が 3 9， 0 0 0 ± 1 0， 0 0 0および 3 1， 0 0 0 ± 1 0， 0 0 0の可溶性トロンボモジュリン力く、特開平 3— 8 6 9 0 0号公報には非還元状態での分子量が 5 5， 0 0 0 - 5 8, 0 0 0および 6 0, 0 0 0〜 6 5， 0 0 0 の可溶性ト口ンボモジュリンが、特開平 3— 2 1 8 3 9 9号公報には非還元状態での分子量が 7 2, 0 0 0 ± 3, 0 0 0および 7 9， 0 0 0 ±3， 0 0 0の可溶性トロンボモジュリンカく、各々開示されている。さらに、イシイ（I s h i i ) らは血漿中および尿中の可溶性トロンボモジュリンを（ザ · ジャーナル 'ォブ' クリニカル · インべスティゲ一シヨン（Th e J o u r n a l o f C l i n i c a 1 I n v e s t i g a t i o n) 7 6， 2 1 7 8 - 2 1 8 1, 1 9 8 5) 、平本らは血中あるいは尿中の数種の可溶性卜ロンボモジュリンを（日本薬学会，第 1 0 8年会，講演要旨集，演題番号 6 F 0 5 1 1 - 1, 1 9 8 8年）、矢谷らは尿中の還元状態での分子量が 6 3， 0 0 0の可溶性トロンボモジュリンを（血液と脈管， 2 0， 1 9 7— 2 0 0， 1 9 8 9 ) 、ャマモト（Y a mam o t o) らは 4 6 8のアミノ酸残基からなる可溶性トロンボモジュリンを（ザ · ジャーナル'ォブ'ノくィオケミストリ一（Th e J o u r n a l o f B i o c h em i s t r y) 1 1 3， 4 3 3 - 4 4 0, 1 9 9 3 ) 、各々報告している。

し力、しな力〈ら、可溶性トロンボモジュリンは化学的に十分安定とはいえず、例えば凍結乾燥下の状態でも、数ケ月から数年に渡る長期間室温に放置すると、活性の低下、凝集物の出現等が起こり問題となっている。また、凍結乾燥工程の条件によっては、微量ではあるが変性することがあり問題となっている。可溶性トロンボモジュリンが変性して凝集体を生じ、凝集体が混在したままヒト血中に投与された場合、その凝集体は変性した蛋白質であるため、過敏症等の免疫反応を惹起する、あるいは塞栓症を誘発する危険性がある。従って、医薬品として使用するにあたっては、医療現場で強く求められている品質を長期間に渡り保証できる製剤を調製することは困難な現状である。

特定の糖類が特定の蛋白質を安定化することがこれまでにいくつか報告されている。しかしながら特定の蛋白質を不安定化する、あるいは安定化しないといつた報告もいくつかある。例えば、蔗糖はチューブリンを不安定化する（バイオキミカ · iト ·バイオフイジ力 ·ァクタ（B i o c h i m i c a e t B i o p h y s i c a A c t a ) 5 3 2 , 1 5 5 - 1 6 0 , 1 9 7 8 ) 、また、グルコース等の糖類はガン壊死因子の活性を安定化するが、ラクトース、マルト一ス、蔗糖等の糖類は全く安定化効果を示さない（特開昭 5 9 - 5 9 6 2 5号公報）ことなどが報告されている。

トロンボモジュリンあるいはトロンボモジユリン様物質の製剤化について、これまでに報告がほとんどない。限られた情報であるが、例えば、特開平 1 _ 6 2 1 9号公報、特開平 2— 2 5 5 6 9 9号公報および WO 9 1 / 0 4 2 7 6号公報中の発明の詳細な説明において、注射剤の添加剤として、蔗糖、グリセリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースの記載がある。これらの物質は増粘剤として添加されており、安定化効果についての記載はおろか具体的な効果の実証がない。また、特開平 1 一 6 2 1 9号公報、特開平 2— 2 5 5 6 9 9号公報、特開平 3 - 2 1 8 3 9 9号公報および W O 9 2 / 0 0 3 2 5号公報中の発明の詳細な説明において、処方例にアルブミン、精製ゼラチン、あるいはマンニトールを添加した例が記述されているが、その製剤の安定性等、特徴、すなわち添加したことによる効果についての開示がまったくない。

そこで、ヒト尿由来可溶性トロンボモジュリンについて、アルブミン、精製ゼラチン、グリシン、グルコースおよびマンニトールとの組成物を調製し、さらなる試験を行ったところ、いずれも長期に渡る安定性が不十分であることが判つた。このように、可溶性トロンボモジユリンを製剤化するにあたり、長期のしかも室温での保存に耐え得る技術の開示は未だなされていない。

また、可溶性トロンボモジユリンは比活性が非常に高いため、臨床使用時は 1 回の投与蛋白量が微量であり、更に輸液で非常に低濃度に希釈して持続投与する場合が多い。可溶性トロンボモジュリンについて輸液で低濃度に希釈したときにはガラス容器、プラスチック製容器あるいは輸液セッ卜への吸着が起こり、特にプラスチック製容器および輸液セッ卜への吸着が著しいことが判った。従って、実際に投与をするときに、有効投与量が減少してしまうおそれが生じることが判つた。吸着を防止する手段として、塩基性アミノ酸によるセクレチンの吸着防止 (特開昭 5 7 - 1 6 9 4 2 5号公報）、セルロース誘導体や非イオン性界面活性剤、メチルシクロデキストリンによるセクレチン、インシュリン、主に低分子べプタイドの吸着防止（特開昭 5 8— 2 0 6 5 1 3号公報、特開昭 5 9— 7 6 0 2 4号公報、特開昭 6 0 - 1 0 0 5 2 4号公報）の例が報告されているが、可溶性トロンボモジュリンにおいて吸着を防止する技術についての開示は未だされていない。発明の開示

本発明の目的は、長期保存時でも安定性に優れた可溶性ト口ンボモジュリン含有組成物を提供することにある。更に低濃度に希釈したときも容器への吸着が起こらな、可溶性トロンボモジユリン含有組成物を提供することにある。更に詳しくは、長期の室温保存時でも安全で安定性に優れた医薬品として使用可能な可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥組成物を提供することにある。更に、低濃度水溶液においても容器への吸着による配合量低下を起こさない医薬品として使用可能な可溶性ト口ンボモジュリン含有凍結乾燥組成物を提供することにある。また、本発明の目的は、可溶性トロンボモジュリンの安定化剤および安定化方法を提供することにある。

また、本発明の目的は、可溶性トロンボモジュリンの吸着防止剤および吸着防止方法を提供することにある。

本発明者らは可溶性ト口ンボモジュリンの安定性に関する問題点を解消すべく

、特に凍結乾燥した組成物について鋭意研究を行い、マルト一ス形、 5形、または形と /3形の任意比率混合物であっても良く、以下、特に記載のない場合は、マルトースというときにはこれら全てを包含する）、ラクト一ス（形、 β 形、または α形と形の任意比率混合物であっても良く、以下、特に記載のない場合は、ラクトースというときにはこれら全てを包含する）、蔗糖、あるいはァルギニン（D体、 L体またはラセミ体のいずれであっても良く、以下、特に記載のない場合は、アルギニンというときはこれら全てを包含する）およびその塩に優れた安定化効果、特に長期間に渡る安定化効果、を見いだした。更に、非ィォン性界面活性剤に可溶性ト口ンボモジユリンを低濃度に希釈した場合の容器への吸着防止効果を見いだして本発明を完成した。

従って、本発明は、可溶性トロンボモジュリンと、マルト一ス、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる 1種あるいは 2種以上を必須成分とする可溶性トロンボモジュリン含有組成物、並びに同組成物において非イオン性界面活性剤が添加された可溶性トロンボモジュリン含有組成物、および、可溶性トロンボモジュリンと非ィォン性界面活性剤を必須成分とする可溶性卜ロンボモジュリン含有組成物を提供する。

可溶性トロンボモジユリンは、ヒト尿由来可溶性トロンボモジユリンであることが好ましい。また、可溶性トロンボモジュリンは、組換えヒト可溶性トロンボモジユリンであることも好ましい。従って、本発明の可溶性トロンボモジュリンは、前: の背景技術で引用された公知文献中の可溶性トロンボモジユリンを含有し、これらの文献中の記載を引用し本発明の可溶性ト口ンボモジュリンの内容とする。

そして、ヒト尿由来可溶性トロンボモジュリンが以下の部分構造及び性質を有する物質であることがさらに好ましい。

ィ）分子量 72, 000±3, 000

[非還元状態でのドデシル硫酸ナトリウム（ S D S ) —ポリアクリルァミドゲル電気泳動法（PAGE) により測定]

口）等電点 3. 9 ± 0. 2

ハ）末端ァミノ酸配列

N末端：

A 1 a - P r o - A 1 a— G l u— P r o— G i n— P r o— G l y

1 o 一 G l y— S e r— G l n— Cy s— Va 1— G 1 u -H i s— A s p -Cy s -Ph e-A l a— : L e u— Ty r— P r o— G l y— P r o -A 1 a-Th r-Ph e-L e u- C末端：

— L e u— A l a— Ar g、または一 L e u— Va l— A r g 二）糖含量（重量％)

中性糖： 5. 5 ± 1. 0 %

[フヱノール硫酸法で測定]

アミノ糖： 2. 2± 1. 0%

[E 1 s 0 n— Mo r g a n法（B 1 i x変法）で測定]

シアル酸： 2. 8 ± 1. 5 %

[W a r r e n法で測定]

また、ヒト尿由来可溶性ト口ンボモジュリンが以下の部分構造及び性質を有する物質であることがさらに好ましい。

ィ）分子量 79， 000±3， 0 00

[非還元状態での SDS— PAGEにより測定]

口）等電点 3. 8 ± 0. 2

ハ）末端アミノ酸配列

N末端：

A 1 a— P r o— A l a— G l u— P r o— G l n— P r o— G l y 一 G l y— S e r— G l n— Cy s— Va 1— G l u— H i s— A s p 一 Cy s— Ph e— A l a— L e u— Ty r— P r o— G l y— P r o -A 1 a-Th r-Ph e-L e u- C末端：

一 L e u— A l a— A r g、または一 L e u— Va l— A r g 二）糖含量（重量％)

中性糖： 6. 2 ± 1. 0 %

[フニノール硫酸法で測定]

アミノ糖： 3. 1 ± 1. 0%

[E 1 s o n— Mo r g a n法（B】 i x変法）で測定]

シアル酸： 3. 8 ± 1. 5 %

[W a r r e n法で測定]

また、 2種あるいは 3種以上の分子種の可溶性トロンボモジュリンと、マルト —ス、ラクト一ス、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる 1種あるいは 2 種以上を必須成分とする可溶性卜口ンボモジュリン含有組成物、並びに同組成物において非イオン性界面活性剤が添加された可溶性トロンボモジュリン含有組成物、および、可溶性トロンボモジュリンと非イオン性界面活性剤を必須成分とする可溶性トロンボモジュリン含有組成物を提供する。このときの可溶性トロンボモジュリンの好ましい態様は前記と同様である。

また、前記のいずれの組成物も凍結乾燥処理されているのが好ましい。

また、可溶性トロンボモジュリンと、マルトース、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる 1種あるいは 2種以上を必須成分とする可溶性トロンボモジュ^ ン含有組成物と、非イオン性界面活性剤を、それぞれ別々に用意し、用時両者を混合する組成物形態を提供する。このときの可溶性トロンボモジュリンの好ましい態様は前記と同様である。

また、可溶性卜ロンボモジュリンと、マルトース、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩、および非イオン性界面活性剤から選ばれる 1種あるいは 2種以上とを溶解混合する工程を含む可溶性ト口ンボモジュリン含有組成物の製法を提供する。

そして、可溶性トロンボモジュリンと、マルト一ス、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩、および非イオン性界面活性剤から選ばれる 1種あるいは 2 種以上との溶液状態の組成物を凍結乾燥する工程を含む上述の可溶性ト口ンボモジュリン含有組成物の製法を提供する。

また、 2種あるいは 3種以上の分子種の可溶性トロンボモジュリンと、マルトース、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩、および非イオン性界面活性剤から選ばれる 1種あるいは 2種以上とを溶解混合する工程を含む上述の可溶性ト口ンボモジュリン含有組成物の製法を提供する。

そして、 2種あるいは 3種以上の分子種の可溶性トロンボモジュリンと、マルトース、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩、および非イオン性界面活性剤から選ばれる 1種あるいは 2種以上との溶液状態の組成物を凍結乾燥するェ程を含む上述の可溶性ト口ンボモジュリン含有組成物の製法を提供する。

そして、可溶性トロンボモジュリンに、マルト一ス、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる 1種あるいは 2種以上を添加する可溶性トロンボモジュリンの安定化方法を提供する。また、マルトース、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる 1種あるいは 2種以上からなる可溶性ト口ンボモジュリンの安定化剤を提供する。そして非イオン性界面活性剤を添加する可溶性トロンボモジュリンの吸着防止方法および非ィォン性界面活性剤からなる可溶性トロンボモジュリンの吸着防止剤を提供する。

また、 2種あるいは 3種以上の分子種の可溶性トロンボモジュリンにマルト一ス、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる 1種あるいは 2種以上を添加する可溶性トロンボモジユリンの安定化方法と、 2種あるいは 3種以上の分子種の可溶性トロンボモジュリンに非ィォン性界面活性剤を添加する可溶性ト口ンボモジュリンの吸着防止方法を提供する。

また、本発明は、医薬として有効な量の可溶性トロンボモジュリンと、マノレトース、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる 1種あるいは 2種以上を必須成分とする可溶性トロンボモジュリン含有医薬組成物、並びに同組成物において医薬添加可能な非ィォン性界面活性剤が添加された可溶性ト口ンボモジュリン含有医薬組成物、および、医薬として有効な量の可溶性卜口ンボモジュリンと、医薬添加可能な非イオン性界面活性剤が添加された可溶性トロンボモジュリン含有医薬組成物を提供し、長期保存時でも安定性に優れ、低濃度に希釈したときも容器への吸着が起こらない血液凝固疾患に係わる疾病の予防治療薬を提供する。このときの可溶性トロンボモジュリンの好ましい態様は前記と同様である。発明を実施するための最良の形態

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明において用いられる可溶性トロンボモジュリンは、天然型あるいは遺伝子工学的に生産されたものいずれでもよい。また、遺伝子工学的手法により得られる改変型あるいはキメラ型の可溶性トロンボモジュリンであってもよい。例として、従来の技術に記載した可溶性トロンボモジュリンが挙げられる。医薬品とする場合、好ましくはヒトの可溶性トロンボモジュリンが望まれる。さらに好ましくは、天然型のヒト尿由来の可溶性トロンボモジュリンがよい。

また、具体例としては、特開平 3— 2 1 8 3 9 9号公報に記載の非還元状態での分子量が 7 2， 0 0 0 ± 3， 0 0 0 (以下、 U T M 1とする。）または Zおよび 7 9 , 0 0 0 ± 3， 0 0 0 (以下、 U T M 2とする。）の可溶性トロンボモジュリンカ \ また、遺伝子工学的に生産されたものとして、 W0 9 2 / 0 0 3 2 5 号公報に記載の組換ヒト尿由来可溶性ト口ンボモジュリン、あるいは特開平 1 一 6 2 1 9号公報において取得されている、ァミノ末端のアミノ酸配列が A 1 a - P r 0— A 1 a—であるアミノ酸 4 9 8残基よりなる可溶性トロンボモジュリンなどがあげられる。医薬品として用いる場合、可溶性トロンボモジュリンは医薬品として適用可能な程度まで精製されていればよい。

また、可溶性トロンボモジュリンは、上述のような可溶性トロンボモジュリンを単独で用いても、あるいは、 2種あるいは 3種以上の分子種の可溶性トロンボモジュリン混合物であってもよく、その混合比率は任意である。例えば、特開平 3 - 2 1 8 3 9 9号公報に開示される 2種類のヒト尿中の可溶性トロンボモジュリンの混合物であってもよい。また、 WO 9 1 / 0 4 2 7 6号公報に示されるような糖鎖構造の異なる可溶性トロンボモジュリンの混合物であつてもよい。このような可溶性トロンボモジュリンは、例えば、天然型については特開平 3

- 2 1 8 3 9 9号公報あるいは特開平 3 - 8 6 9 0 0号公報等に記載の方法で、遺伝子組み換え型については WO 9 2 / 0 0 3 2 5号公報、特開平 1 一 6 2 1 9 号公報あるいは WO 9 1 / 04276号公報等に記載の方法で製造する事ができる。

本発明で用いられる安定化剤は、還元性のある二糖類、蔗糖またはアミノ酸である。好ましい、本発明で用いられる安定化のための必須成分としては、マルト —ス、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる 1種あるいは 2 種以上が用いられる。アルギニンの塩の場合、無機酸、有機酸との塩があるがその種類としては医薬品として利用可能なものであればよい。好ましい例として塩酸塩、クェン酸塩、硫酸塩等が挙げられ、さらに塩酸塩が好ましい。安定化剤の添加量としては、特に限定されるものではないが、可溶性トロンボモジュリン 1 mg力価あたり 0. 1 mg~ 1 00 Omg程度が例示される。より好ましくは可溶性ト口ンボモジュリン 1 mg力価あたり 0. 5 mg〜 50 0 mg程度である。さらに好ましくは可溶性ト口ンボモジュリン 1 mg力価あたり 0. 5 mg〜 1 0 Omg程度である。蔗糖に関しては、凍結乾燥体とした場合、可溶性トロンボモジュリンに対する蔗糖の比率が高いと保存中に崩壊しやすいため、可溶性卜ロンボモジュリン 1 mg力価あたり 0. 5mg〜5 Omg程度にするのが好ましい。また、蔗糖を用いた場合、崩壊を抑制する目的でデキストラン等の高分子を適宜添加してもよい。

なお、マルト一ス、ラクト一ス、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる安定化剤は可溶性トロンボモジュリンを含有する溶液（組成物） l mL当たり 1 0 Omg以下であることがより好ましい。これらの安定化剤はその量により安定化効果ばかりでなく賦形効果、緩衝効果、等張化効果あるいは分散効果等さまざまな効果を発揮するので、その組成物の使用目的に応じて添加量が決定される。

本発明で用いられる吸着防止剤は、界面活性剤であり、好ましい成分としては、非イオン性界面活性剤であり、それは医薬品として利用可能なものが好ましい力 \ 特に限定されるものではない。エチレンォキサイドプロピレンォキサイド共重合体、ポリ（ォキシアルキレン）モノ一及びトリ一ソルビ夕ンエステル（ソルビトールの脂肪酸エステル及び様々のモル数のエチレンォキサイドと共重合したその無水物）、ポリオキンエチレン硬化ヒマシ油等が好ましい。エチレンォキサイドプロピレンオキサイド共重合体としては、プル口ニック F 6 8、ポロクサマ一 1 8 8等、ポリ（ォキシアルキレン）モノ一及びトリーソルビタンエステルとしては、ポリソルベート 8 0 (ォレートエステル）、ポリソルベート 2 0 (ラウレートエステル）、ポリソルベート 4 0 (パノレミテートエステル）、ポリソルべート 6 9 (ステアレートエステル）等、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油としては、 H C O 4 0、 H C O 6 0等が挙げられる。これらの非イオン性界面活性剤から選ばれる 1種あるいは 2種以上を用いることができる。 1種を用いる場合は、エチレンオキサイドプロピレンオキサイド共重合体、あるいはポリ（ォキシアルキレン）モノ一及びトリーソルビタンエステルが好ましく、プル口ニック F 6 8 、ポリソルベート 8 0、あるいはポリソルべ一ト 2 0が好ましく、さらにプル口ニック F 6 8が好ましい。

吸着防止剤としての非イオン性界面活性剤の添加量は特に限定されるものではないが、可溶性トロンボモジュリン含有組成物を水溶液とした場合に、当該水溶液中において 0 . 0 0 0 0 5 wt %以上であることが望ましい。また、これらの物質が生体内に投与された場合に、それ自体が薬理作用を呈しなレ、程度の低し、量であることが望ましく、かかる意味で可溶性トロンボモジュリン水溶液中で 1 wt % 以下の濃度であることが望ましい。これらの吸着防止成分は効果が濃度に依存じ、また容器の材質や表面積にも影響を受けるため、組成物の臨床使用時における希釈倍率や希釈に用し、る容器の材質や大きさなどによつて添加量を調節することができる。好ましくは、当該水溶液中において上記濃度範囲すなわち 0 . 0 0 0 0 5〜l wt %となる量であれば、本発明の目的を達成する上で適当である。さらに、生体内に投与される際は、 0 . 0 0 0 1〜0 . 0 1 wt %となる量が好ましい。

本発明で用いられる安定化剤および吸着防止剤の必須成分のマルト一ス、ラクト一ス、蔗糖、アルギニンおよびその塩、および非イオン性界面活性剤はそれぞれ単独で用いてもよいし、これらから選ばれる 2種以上を組み合わせて用いることもできる。組み合わせの例としては、マルト一スおよび非イオン性界面活性剤、ラクトースおよび非イオン性界面活性剤、蔗糖および非イオン性界面活性剤、アルギニンおよび非イオン性界面活性剤、マルトースおよびアルギニン、ラクトースおよびアルギニン、蔗糖およびアルギニン、マルト一スおよびラクト一ス、マルトースおよび蔗糖、ラクト一スおよび蔗糖、マルトース .ラクトースぉよび蔗糖、マルト一ス 'アルギニンおよび非イオン性界面活性剤、ラクト一ス . アルギニンおよび非イオン性界面活性剤、あるいは、蔗糖 'アルギニンおよび非イオン性界面活性剤等が挙げられ、混合比率は任意である。また、上記のうち、非ィォン性界面活性剤は 1種あるいは 2種以上を組み合わせて用いることができる。

このうち、マルト一ス、ラクト一ス、蔗糖あるいはアルギニンから選ばれる 1 種と、非イオン性界面活性剤の組み合わせが好ましく、組み合わせる非イオン性界面活性剤としては、プル口ニック F 6 8、ポリソルべ一ト 8 0、あるいはポリソルベート 2 0が好ましく、さらにプル口ニック F 6 8が好ましい。すなわち、マルト一スおよびプルロニック F 6 8、ラクトースおよびプルロニック F 6 8、蔗糖およびプル口ニック F 6 8あるいはアルギニンおよびプル口ニック F 6 8の組み合わせが好ましく、混合比率は任意である。

本発明の可溶性トロンボモジュリン含有組成物は、可溶性トロンボモジュリンおよびマルトース、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる 1 種あるいは 2種以上の必須成分に加えて、その使用目的に応じた保存剤、防腐剤、緩衝剤、増粘剤、界面活性剤等の任意の添加剤を含有していてもよい。また、本発明の可溶性トロンボモジュリン含有組成物は、可溶性トロンボモジュリンおよびマルトース、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる 1種あるいは 2種以上の必須成分、および非イオン性界面活性剤に加えて、その使用目的に応じた安定化剤、保存剤、防腐剤、緩衝剤、増粘剤、界面活性剤等の任意の添加剤を含有していてもよい。また、本発明の可溶性トロンボモジュリン含有組成物は、可溶性トロンボモジユリンおよび非イオン性界面活性剤に加えて、その使用目的に応じた安定化剤、保存剤、防腐剤、緩衝剤、増粘剤、界面活性剤等の任意の添加剤を含有していてもよい。医薬として用いる凍結乾燥製剤は、その製剤化の目的に応じて、医薬製造上許容できる、保存剤、安定化剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、湿潤剤、滑沢剤、着色剤、芳香剤、矯味剤、懸濁化剤、乳化剤、溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、界面活性剤、吸着防止剤、無痛化剤等を含有させることは任意である。特に、 p H調節の為の緩衝剤、浸透圧調節の為の等張化剤の含有は好ましい。本発明はこれらの物質の影響を受けるものではないが、塩濃度が高いと、凍結乾燥を行う際にケーキの形成に害を及ぼすため好ましくない。

本発明の可溶性ト口ンボモジュリン含有組成物の製造方法は、前記の方法で得られる可溶性トロンボモジュリンを含有する溶液にマルトース、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩、および非イオン性界面活性剤から選ばれる 1種あるいは 2種以上を加えて溶解し、溶液を得ることにより行われる。

可溶性卜ロンボモジュリンの凍結乾燥物にマルトース、ラクトース、蔗糖、ァルギニンおよびその塩、および非イオン性界面活性剤から選ばれる 1種あるいは 2種以上を加えて蒸留水や生理食塩水に溶解してもよい。また、適当な緩衝液に溶解しもよい。すなわち、可溶性ト口ンボモジュリンとマルトース、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩、および非イオン性界面活性剤から選ばれる 1種あるいは 2種以上を溶解混合し溶液状態の組成物とすればよい。また、いずれの方法においてもマルト一ス、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩、および非イオン性界面活性剤から選ばれる 1種あるいは 2種以上はその溶液として加えてもよい。医薬品として使用する場合にはこれらの添加剤は医薬品に使える規格を満たすものが好ましい。

さらにこれらの溶液を通常の方法により凍結乾燥を行い、ケーキ状のあるいは粉末状に変換された組成物とすることができる。医薬品として使用する場合には、上記の溶液を無菌濾過した後、アンプル、バイアル等に投与量単位で分注することが望ましく、さらに所望により通常の方法で凍結乾燥してもよい。

また、医薬として使用する場合、本発明の可溶性トロンボモジュリン含有組成物は、一般に使用されている投与方法、すなわち、非経口投与方法、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等によって投与することが好ましい。凍結乾燥製剤とした場合は、用時、注射用水等に溶解して、患者に投与することができる。経口投与した場合には、消化管内で分解を受けるため、該投与方法は効果的ではないが、消化管内での分解を受けにくい製剤、例えばリボソームやマイクロスフエア一、ナノスフエア一に内包した形態で経口投与することも可能である。また、直腸、鼻腔内、舌下等の粘膜から吸収せしめる投与方法も可能である。

1 日投与量としては、例えば特開平 3 _ 2 1 8 3 9 9号公報に記載されるように 0 . 0 0 5〜5 0 O m g力価、好ましくは 0 . 1〜 1 0 m g力価が例示されるが、患者の年齢、体重、症状等に応じて適宜増減することができる。

このようにして得られた本発明の組成物は、凍結 ·乾燥 ·保存 ·加熱および再溶解の過程いずれにおいても安定であり、室温において長期の保存性に優れる。今回見いだされた安定化の為の必須成分および吸着防止剤の成分はいずれも極めて高い安全性を有しており、本発明の組成物を医薬品として用いる場合に、長期間に渡り活性の低下や凝集塊等の心配がなく、極めて高い品質を維持する事ができる。また、本発明の組成物は低濃度の水溶液としたときも容器への吸着が防止され、医療現場において輸液にて希釈して投与する場合も吸着により有効量を減ずることなく投与が可能となる。以上のように、安全でかつ室温における長期の保存性に優れた血液凝固疾患に係わる疾病の予防治療薬を提供するとが可能となつた。更に、臨床使用時の容器への吸着が防止された血液凝固疾患に係わる疾病の予防治療薬を提供することが可能となった。また、本発明の組成物、製法、安定化剤、安定化方法、吸着防止剤あるいは吸着防止方法は可溶性トロンボモジュリンの精製工程でも利用でき、さらに各種用途に用いるための可溶性トロンボモジユリンの原体の保存にも利用できる。実施例

以下に実施例を挙げて本発明を説明する。

(可溶性トロンボモジュリンの取得例 1 )

ヒト尿中可溶性トロンボモジユリンの精製

特開平 3— 2 1 8 3 9 9号公報の方法に準じてヒト尿中可溶性卜ロンボモジュリンを調製した。すなわち、原尿 1 0 0 Lを 1 0 % NaOHでpH 8. 5に調整し、析出した沈澱物を除去した。次いで、尿の pHを 4M HC 1で pH 5. 5に調整後、アタリロニトリル繊維で濾過し尿中のゥロキナーゼを吸着除去し、通過尿を分画分子量 4万の限外濾過膜を使用して脱塩濃縮した。

pHを 7. 3に調整後、 6 0°Cで 1 5分間処理した。 0. 0 6 8 M N a C 1 を含有する 0. 0 5M 燐酸緩衝液（pH 6. 5) で予めコンディショニングしておいた DEAEセルロース（ヮットマン社製）の 3 0 OmLカラムに濃縮尿を通過させて活性画分を吸着させ、コンディショニングに使用したと同じ緩衝液 7 5 OmLで洗浄後、 0. 0 5M N a C 1を含む酢酸緩衝液（ p H 4. 0 ) で活性画分を溶出した。

溶出液は、分画分子量 3万の限外濾過膜で濃縮し、 2M NaOHでpH 7. 5に調整し、 0. 1 M N a C K 1 mM ベンザミジン塩酸塩および 0. 5 m M 〇 & (： 1₂を含む0. 0 2M 卜リス塩酸緩衝液（pH 7. 5) で予めコンディショニングした D I P—トロンビンーァガロースの 2. 5 mLカラムを通過させて活性画分を吸着させた。

次いで、コンディショニングに使用したと同じ緩衝液 2 5mLで洗浄後、 1 M N a C 1 mM ベンザミジン塩酸塩および 0. 5 mM £0丁八を含む0 . 02M トリス塩酸緩衝液（pH 7. 5) で溶出し、この溶出液をコンデイショニングに使用したと同じ緩衝液に対して透析後、再度前回と同様の条件にコンディショニングした D I P— トロンビン一ァガロースクロマトグラフィ一で精製した。 2回目の D I P-トロンビン一ァガロースクロマトグラフィ一においても同容のカラムを用い、コンディショニングで使用したと同じ緩衝液 1 OmLで洗浄後、 1 OmLの 0. 8M N a C 1 mM ベンザミジン塩酸塩および 0.

5 mM C a C 1₂を含む 0. 02 M トリス塩酸緩衝液（ p H 7. 5) で洗浄し、 1M N a C K 1 mM ベンザミジン塩酸塩および 0. 5 mM EDTA を含む 0. 0 2M トリス塩酸緩衝液（pH 7. 5) で活性画分を溶出した。溶出液は、分画分子量 3万の限外濾過膜で濃縮し、予め 0. 1 4M Na C 1 を含む 0. 0 1 M 燐酸緩衝液（pH7. 0) でコンディショニングしておいたセフアクリル S— 300 (フアルマシアファインケミカル社製）の 50 OmL力ラムでゲル濾過し、活性画分を採取した（UTM0) 。また、別の実験では非還元状態下での SDS— PAGEで分子量 72, 000 ± 3， 0 00に相当する活性画分を（UTM 1 ) 、あるいは、分子量 79， 000 ± 3, 000に相当する活性画分を採取した（UTM2) 。これらの画分は一晩蒸留水に対して透析した後凍結乾燥した。

このようにして得られた天然型のヒト尿中可溶性トロンボモジユリン UTM1 および UTM2はそれぞれ以下の部分構造および性質を有する。 ( 1 ) UTM 1

ィ）分子量 72， 0 00 ±3， 000

[非還元状態でのドデシル硫酸ナトリウム（ S D S ) —ポリアクリルァドゲル電気泳動法（PAGE) により測定]

口）等電点 3. 9 ± 0. 2

ハ）末端ァミノ酸配列（配列表の配列番号 1のァミノ酸配列）

N末端：

A 1 a— P r o— A l a— G l u— P r o— G l n— P r o— G l y - G 1 y— S e r— G i n— Cy s— Va 1— G l u— H i s— As p— Cy s -Ph e-A l a— : L e u— Ty r— P r o— G l y— P r o— A 1 a -Th r-Ph e-L e u- C末端：

— L e u— A l a— A r g、または一 L e u— Va l— A r g 二）糖含量（重量％)

中性糖： 5. 5 ± 1. 0 %

[フエノール硫酸法で測定]

アミノ糖： 2. 2 ± 1. 0 %

[E 1 s 0 n-Mo r g a n法（B 1 i x変法）で測定]

シアル酸： 2. 8 ± 1. 5 %

[Wa r r e n法で測定]

(2) UTM2

ィ）分子量 7 9， 00 0±3， 00 0 [非還元状態での SDS— PAGEにより測定]

口）等電点 3. 8 ± 0. 2

N末端：

A 1 a— P r o— A l a -G 1 u— P r o— G l n— P r o— G l y - G 1 y— S e r— G l n— Cy s— Va 1— G l u— H i s— A s p— Cy s -Ph e-A l a— : L e u— Ty r— P r o— G l y— P r o— A 1 a-Th r-Ph e-L e u- C末端：

一 L e u— A l a— Ar g、または一 L e u— Va 1— A r g

二）糖含量（重量％)

中性糖： 6. 2 ± 1. 0 %

[フエノール硫酸法で測定]

アミノ糖： 3. 1 ± 1. 0%

[E 1 s o n— Mo r g a n法（B 1 i x変法）で測定]

シアル酸： 3. 8 ± 1. 5 %

[W a r r e n法で測定]

(可溶性トロンボモジユリンの取得例 2 )

遺伝子組換え型ヒト可溶性トロンボモジュリンの製造（RTM 1 )

WO 9 2 / 003 2 5号公報の方法で製造した。すなわち、ヒト胎盤 cDNA ライブラリ一より釣り上げた DNAを利用してァミノ酸 4 5 6残基よりなる可溶性トロンボモジュリン（r u TM-A 1 a) を発現するべクタ一を調製し、これを C HO細胞に組み込んだ後、遺伝子増幅を行って高発現株を得た。この高発現株の培養液を D I P—トロンビンーァガロースカラムとゲル濾過により精製し目的物を得た（RTM1 ) 。

(可溶性トロンボモジユリンの取得例 3 )

遺伝子組換え型ヒト可溶性トロンボモジュリンの製造（RTM2)

WO 92 / 00 32 5号公報の方法に準じて製造した。すなわち、ヒト胎盤 c DNAライブラリ一より釣り上げた DN Aを利用してァミノ末端のァミノ酸配列が A 1 a-P r o-A 1 a—であるアミノ酸 4 9 8残基よりなる可溶性トロンボモジュリンを発現するベクターを調製し、これを CHO細胞に組み込んだ後、遺伝子増幅を行って高発現株を得た。この高発現株の培養液を D I P— トロンビンーァガロースカラムとゲル濾過により精製し目的物を得た（RTM2) 。

本発明を詳細に説明するために実験例により効果を具体的に説明するが、本発明はこれらによって、なんら限定されるものではない。

(実験例 1 )

前述の可溶性トロンボモジュリンの取得例 1で得られた UTM 0を用いて、下記に示した凍結乾燥された注射剤を調製した。これらを 50°Cの恒温槽に保存し、 3ヶ月目および 6ヶ月目に残存力価を、 6ヶ月目に該物質の凝集体生成率を測定した。測定方法は以下の方法により行った。結果を表 1および表 2に示す。尚、力価残存率は 4°Cにて同一時間保存した該物質の力価に対する％で表た。なお、本実験で用いた UTM0は UTM 1と UTM2とがそれぞれ 6 9 %、 3 1 % 含まれていた。

製剤例 1 UTM 0 7 5 mg力価とマルトース 3 0 Omgを加え、注射用蒸留水 3 OmLにて溶解した。この溶液を無菌ろ過後、無菌ガラスバイアルに l m Lずつ分注した後、凍結乾燥し、用時溶解型の注射剤を調製した。

以下同様に下記の成分を用いて製剤例 2から 9の製剤を調製した。

製剤例 2 UTMO 7 5 m g力価

ラクトース 300 mg

製剤例 3 UTMO 75 m g力価

3 0 0 mg

製剤例 4 UTMO 7 5 mg力価

塩酸アルギニン 600 mg

製剤例 5 UTMO 7 5mg力価

グルコース 300 mg

製剤例 6 UTMO 7 5 mg力価

マンニトーノレ 300 mg

製剤例 7 UTMO 7 5 mg力価

グリシン 6 0 0 mg

製剤例 8 UTMO 7 5 mg力価

精製ゼラチン 6 0 0 mg

製剤例 9 UTMO 7 5 mg力価

ヒト血清アルブミン 30 0 mg

(力価の測定方法）

トロンビン共存下でのプロテイン C活性化能を合成基質 G 1 u-P r o-A r g-p-NA (カビ社製）を用い、持田製薬（株）で精製したヒト尿中可溶性トロンボモジュリン（UTM0) を標準物質として使用した。

すなわち、 0. 0 5 %ポリソルベート 2 0Zトリス塩酸緩衝液（pH 8. 4) で適当濃度に希釈した標準物質もしくは本発明の可溶性トロンボモジュリン含有製剤 2 0 Lに 2 0 mM C a C 1₂/トリス塩酸緩衝液（ p H 8. 4 ) 6 0〃 L、さらに牛トロンビン（持田製薬製） 4 0 U/mL溶液を 2 0 iL添加し、室温で 2 0分間反応する。次いでヒトプロテイン C (アメリカンダイァグノスティ力社製） 1 2 UZmL溶液を 2 O ^L添加し、室温で 2 0分間反応後、反応液にヒトアンチトロンビン I I I (ミドリ十字製）とへパリン（持田製薬製）の混合液（終濃度はそれぞれ 0. 1 5 U/mL、 1 5 U/mL) 8 0 zLを添加し、室温で 2 0分間反応する。次いで、反応液を 1 2 5 L採取し、前記合成基質 3 m M溶液 1 2 5 を添加し、室温で経時的に 4 0 5 n mの波長における吸光度を測定し、反応初期速度を求める。標準溶液について得られた反応初期速度から検量線を作成し、試料の力価を算出した。力価は特開平 3— 2 1 8 3 9 9号公報の記載に従ってゥサギ肺トロンボモジユリンに換算した。

(凝集体生成率の測定法）

可溶性トロンボモジュリンの凝集体生成率を T S K - g e 1™ G 3 0 0 0 SWXL (東洋曹達製）を用いたゲル濾過法により測定した。

添加剤力価残存率（％)

種類里 (m g) 3 ヶ月 6 ヶ月実製剤例 1 マノレトース 3 0 0 Q Ω Q Q Q

0

施製剤例 2 ラク卜一ス 3 0 0 q q 0 Q Q Q 0 Q 例製剤例 3 蔗糖 3 0 0 9 8. 4 9 8. 7

製剤例 4 塩酸アルギニン 6 0 0 9 9. 6 9 9. 6 製制 ιΙ 5ι【

Mリ ¹ J 0 グルコース 3 0 0 9 6. 0 9 7. 6 比製剤例 6 マンニトール 3 0 0 9 1. 3 8 9. 3 較製剤例 7 グリシン 6 0 0 9 2. 9 8 2. 2 例製剤例 8 精製ゼラチン 6 0 0 8 9. 0 9 5. 6

製剤例 9 HS A 3 0 0 8 7. 7 8 4. 8

表 1および表 2に示すように、マルト一ス、ラクトース、蔗糖および塩酸アルギニンを添加した場合、グルコース、マンニトール、グリシン、精製ゼラチン、ヒト血清アルブミン（HSA) 等の他の一般的な添加剤を添加した場合に比較してヒト尿中可溶性卜ロンボモジュリンが有意に安定化された。すなわち、ヒト可溶性トロンボモジュリンの保存安定性が有意に増大した。その効果は、ラクトースおよび塩酸アルギニンでより顕著であった。

(実験例 2 )

前述の可溶性トロンボモジュリンの取得例 1で得られた UTM 1あるいは UT M 2を用いて、下記に示した凍結乾燥された組成物を調製した。これらを 4 0°C 湿度 7 5%の恒温槽に保存し、 6ヶ月目に残存力価と該物質の凝集体生成率を測定した。測定方法は上記実験例 1の方法により行った。結果を表 3および表 4に示す。尚、力価残存率は実験開始時の力価に対する％で表した。

組成物例 1 UTM2 2. 5 mg力価とマルトース 1 0 mgを加え、精製水 l mLにて溶解した。この溶液を凍結乾燥した。

以下同様に下記の成分で構成されている組成物例 2力、ら 8の組成物を調製した

組成物例 2 UTM 1 2. 5mg力価

ラクトース 1 0 mg

組成物例 3 UTM2 2. 5mg力価

塩酸アルギニン 20 mg

組成物例 4 UTM 1 2. 5mg力価

1 0 mg

組成物例 5 UTM 1 2. 5mg力価

マンニトール 1 0 mg

組成物例 6 UTM 1 2. 5mg力価グリシン 2 0 mg 組成物例 7 UTM 1 2. 5mg力価精製ゼラチン 2 0 mg 組成物例 8 UTM 1 2. 5mg力価 HS A 1 0 mg

表 3 組可溶性ト口ンボモ添カロ剤力価残存率（％) 成ジユリン

物凍結車乙探

例 mg力価量（mg) 直後 6ヶ月

1 UTM2 2. 5 マルトース 1 0 1 00. 2 99. 1 施 2 UTM1 2. 5 ラクトース 1 0 1 02. 3 例 3 UTM2 2. 5 ァルギニン 20 1 00. 9 4 UTM1 2. 5 糖 1 0 99. 6 比 5 UTM1 2. 5 マンニトーノレ 1 0 99. 8 96. 5

6 UTM1 2. 5 グリシン 20 96. 2 例 7 UTM1 2. 5 精製ゼラチン 20 1 02. 3 87， 3

8 UTM1 2. 5 HSA 1 0 90. 9

表 4

表 3および表 4に示すように、マルトース、ラクト一ス、蔗糖および塩酸アルギニンを添加した場合、他の一般的な添加剤を添加した場合に比較してヒト尿中可溶性ト口ンボモジュリンが顕著に安定化された。特に長期間に渡る安定化効果が顕著であった。

(実験例 3 )

溶液安定性試験

前述の可溶性卜口ンボモジュリンの取得例 1で得られた U T M 0を用いて、マルトース、ラクト一ス、蔗糖あるいは塩酸アルギニンを 0 . 5ないし 5 m g Zm L含有する 0 . 0 5 m g力価 Zm Lの可溶性トロンボモジュリン溶液を調製した。これらを室温に保存し、 2 4時間後に残存力価を測定した。測定方法は前記実験例 1の方法により行った。いずれの組成物においても顕著な活性の低下は認められなかった。

可溶性トロンボモジュリンが変性して凝集体を生じ、凝集体が混在したままヒト血中に投与された場合、その凝集体は変性した蛋白質であるため、過敏症等の免疫反応を惹起する、あるいは塞栓症を誘発する危険性がある。従って、凝集体生成率が低いことは、注射用医薬製剤において重要な利点である。さらに、製剤を開発する場合、室温で長期間保存可能かどうかは、一般に 4 0°C、 6ヶ月間保存での安定性を目安として判断するが、本発明で得られる可溶性トロンボモジュリン含有製剤は前述の実験例で示されるように、より過酷な条件である 5 0°C、 6ヶ月間の保存でも極めて安定であった。また、溶液状態での保存性もよく、凍結乾燥型の組成物を医薬として用いる場合にも再溶解後に安心して使えることが確認された。

(実験例 4 )

前述の可溶性トロンボモジュリンの取得例 1で得られた U T M 0を用いて、下記に示した溶液状の組成物を調製し、力価を測定した。他に、対照として UTM 0 2. 5 mg力価を生理食塩液 2 m 1にて溶解した溶液を用意し、力価を測定した。これら 24m 1をシリンジを用いてプラスチック製容器に入った生理食塩液（1 0 0m l) に混注し、可溶性トロンボモジュリンの理論終濃度を約 0 . 0 0 3 mg力価 Zm 1とした。混注後 3時間目に液を採取し、残存力価を測定した。力価測定方法は前記実験例 1の方法により行った。

組成物例 9 UTM0 2. 5 mg力価とポリソルベート 8 0 5 mgを加え、生理食塩液 2 m 1にて溶解した。

組成物例 1 0 UTM0 2. 5mg力価と精製ゼラチン 1 0mgを加え、生理食塩液 2 m 1にて溶解した。組添加剤容器内保存後の成残存率（％) 物

例種類終濃度（％) プラボトル夹施^¹ J 9 ポリソルべ一ト 8 0 0. 0 0 0 6 y D . y 比較例 1 0 精製ゼラチン 0. 0 0 1 2 8 7， 5 対照例 7 9. 6

表 5に示すように、ヒト尿中可溶性トロンボモジユリンはプラスチック製容器に対して著しい吸着を示した。ポリソルベー卜 8 0を添加するとゼラチン添加に比べて、顕著に吸着が防止された。 (実験例 5 ) 前述の可溶性ト口ンボモジュリンの取得例 1で得られた UTM 0を用いて、下記に示した溶液状の組成物を調製し、力価を測定した。他に対照として UTM0

2. 5 mg力価を生理食塩液 2 m lにて溶解した溶液を用意し、力価を測定した。これら 1 m 1を輸液セット（テルフユ一ジョン⑥ TS— A 2 0 0 CK、テルモ製）を装着した生理食塩液（大塚生食注、 5 0 0 m l、プラスチック製容器 ) に混注し、可溶性卜ロンボモジュリンの理論終濃度を約 0. 0 0 2 5 mg力価 /m 1 とした。混注直後に輸液セットを通して得られた液、また、 3時間後にプラボトルから直接採取して得られた液について残存力価を測定した。力価測定方法は前記実験例 1の方法により行った。組成物例 1 1 UTM0 2. 5 mg力価とポリソルベー卜 8 0 l mgを加え、生理食塩液 2 m 1にて溶解した。

以下同様に下記の成分で構成されている組成物例 2力、ら 6の組成物を調製した組成物例 1 2 UTM0 2 5 mg力価

ポリソルベート 8 0 0 5 m g 組成物例 1 3 UTM0 2 5 mg力価

ポリソルべ一ト 2 0 1 m g 組成物例 1 4 UTM0 2 5 m g力価

ポリソルベート 2 0 0 5 m g 組成物例 1 5 UTM0 2 5 mg力価

プルロニック F 6 8 5 m g 組成物例 1 6 UTM0 5 m g力価

プルロニック F 6 8 1 m g

表 6 添加剤輸液セットプラボトル対施例例照通過後の内保存後の残存率残存率終濃度（％) ( )

1 1 ポリソルベー卜 8 0 0 0 0 0 1 8 7. 4 1 0 3. 3 1 2 ポリソルべ一ト 8 0 0 0 0 0 0 5 8 6. 2 8 7. 0 1 3 ポリソルベート 2 0 0 0 0 0 1 8 4. 2 9 1. 3 1 4 ポリソルべ一ト 2 0 0 0 0 0 0 5 8 3. 6 8 3. 4 1 5 プルロニック F 6 8 0 0 0 0 5 9 4. 8 9 2. 2 1 6 プルロニック F 6 8 0 0 0 0 1 9 2. 7 8 7. 5

6 3. 3 7 9. 1

表 6に示すように、ポリソルベート 8 0、ポリソルベート 2 0、プルロニック F 6 8を添加した場合、その濃度が 0. 0 0 0 0 5wt%以上でヒト尿中可溶性ト口ンボモジユリン希薄水溶液の輸液セット並びにプラスチック製容器中での活性が維持されることが判明した。 (実験例 6 ) 前述の可溶性トロンボモジュリンの取得例 1で得られた UTM 0を用いて、下記に示した凍結乾燥された注射剤を調製した。これらを 5 0°Cの恒温槽に保存し、 3力月および 6力月目に力価残存率を測定した。測定方法は上記実験例 1の方法により行った。結果を表 7に示す。尚、力価残存率は凍結乾燥直後の力価に対する％で表した。製剤例 1 0 UTM0 1 5 0 mg力価、塩酸アルギニン 1 2 0 0 mgおよびプル口ニック F 6 8 6 Omgを加え、注射用蒸留水 6 OmLにて溶解した。この溶液を無菌ろ過後、無菌ガラスバイアルに 2 mLずつ分注した後、凍結乾燥し、用時溶解型の注射剤を調製した。

以下同様に下記の成分を用いて製剤 1 1から 1 3の製剤を調製した。

製剤例 1 1 UTMO 1 5 0 mg力価

塩酸アルギニン 1 2 0 0 mg

ポリソルベート 8 0 6 0 mg

精製ゼラチン 3 0 0 mg

製剤例 1 2 UTMO 1 5 0 mg力価

マルトース 6 0 0 mg

プルロニック F 6 8 6 0 mg

製剤例 1 3 UTMO 1 5 0 mg力価

マルトース 6 0 0 mg

プルロニック F 6 8 6 0 mg

精製ゼラチン 3 0 0 mg

添加剤力価残存率（％) 種類量 (m g) 3力月 6力月製剤例 1 0 塩酸アルキニン 1 2 0 0 1 0 0. 4 1 0 1. 0 プルロニック F 6 8 6 0 製剤例 1 1 塩酸ァノレキニン 1 2 0 0 9 9. 3 1 0 0. 2 ポリソルベート 8 0 6 0

精製ゼラチン 3 0 0 製剤例 1 2 マノレトース 6 0 0 1 0 0. 4 1 0 0. 1 プルロニック F 6 8 6 0 製剤例 1 3 マルトース 6 0 0 9 9 2 9 9. 7 プルロニック F 6 8 6 0

精製ゼラチン 3 0 0

表 7に示すように、アルギニンあるいはマルトースと非ィォン性界面活性剤を組み合わせて添加した場合、ヒト尿中可溶性ト口ンボモジュリンの長期間に渡る保存安定性が有意に増大した。従って、長期保存時でも安定性に優れ、低濃度に希釈したときも容器への吸着が起こらな、可溶性トロンボモジュリン含有組成物が得られることが確認できた。 (製剤実施例）次に実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によってなんら限定されるものではない。 (実施例 1 )

UTM 0 1 O mg力価ラクトース l O O mg 精製ゼラチン 1 0 0 mg 上記成分を注射用蒸留水に溶解し全量を 1 0 mLとし、無菌濾過した後 1. 0 mLずつ無菌バイアルに充塡し、凍結乾燥して、可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥組成物を調製した。

(実施例 2 )

UTM0 25 mg力価

ラクト一ス 1 0 0 mg

プル口ニック F 6 8 1 0 mg

リン酸水素ニナトリウム ' 1 2水和物 0. 7 7 m g

リン酸ニ水素ナトリウム ' 2水和物 0. 1 8 mg

塩化ナトリウム 2. 7 3 mg

上記成分を注射用蒸留水に溶解し全量を 1 0 mLとし、無菌濾過した後 1. 0 mLずつ無菌バイアルに充塡し、凍結乾燥して、可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥組成物を調製した。

(実施例 3 )

UTM0 25 mg力価

L—アルギニン塩酸塩 20 0 mg

ポリソルべ一ト 8 0 1 0 mg

リン酸水素ニナトリウム ' 1 2水和物 J . 7 7 mg

リン酸ニ水素ナトリウム . 2水和物 0. 1 8 mg

塩化ナトリウム 2. 7 3 mg

上記成分を注射用蒸留水に溶解し全量を 1 OmLとし、無菌濾過した後 1. 0 mLずつ無菌バイアルに充塡し、凍結乾燥して、可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥組成物を調製した。

(実施例 4 )

UTM0 2 5 mg力価

L—アルギニン塩酸塩 200 mg

プルロニック F 6 8 1 0 mg

(実施例 5 )

UTMO 50 mg力価

マルトース 1 0 0 mg

精製ゼラチン 1 0 0 mg

リン酸水素ニナトリウム ' 1 2水和物 23. 2mg

リン酸ニ水素ナトリウム · 2水和物 5. 5 m g

塩化ナトリウム 8 1. 8 mg

(実施例 6 )

実施例 5と同成分の可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥組成物を調製した。別に、 0. 1 %ポリソルべ一ト 8 0水溶液を無菌的に調製し、 1. Om lずつ分注して熔閉し、溶解用溶液アンプルとした

(実施例 7 )

UTM0 2 5 mg力価

1 0 0 mg

精製ゼラチン 1 0 0 mg

(実施例 8 )

実施例 7と同成分の可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥組成物を調製した。別に、 0. 1 %ポリソルベート 8 0水溶液を無菌的に調製し、 1. Om lずつ分注して熔閉し、溶解用溶液アンプルとした。

(実施例 9 )

UTM 1 2 5 mg力価

ラクトース 8 0 0 mg

精製ゼラチン 1 0 0 mg

リン酸水素ニナトリウム · 1 2水和物 23. 2 mg

リン酸ニ水素ナトリウム . 2水和物 5. 5 m g

(実施例 1 0) UTM 2 5 0 mg力価

L一アルギニン塩酸塩 2 0 0 mg

精製ゼラチン 1 0 0 mg

(実施例 1 1 )

UTM 1 1 Omg力価

1 0 0 mg

ポリソルベート 8 0 5 0 m g

リン酸水素ニナトリウム · 1 2水和物 2 3. 2 mg

リン酸ニ水素ナトリウム ' 2水和物 5. 5 m g

(実施例 1 2 )

UTM2 5 0 mg力価

L一アルギニン塩酸塩 2 0 0 mg

精製ゼラチン 1 0 0 mg

ポリソルベート 8 0 1 0 m g

上記成分を注射用蒸留水に溶解し全量を 1 0 mLとし、無菌濾過した後 1. 0 mLずつ無菌バイアルに充填し、凍結乾燥して、可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥組成物を調製た c

(実施例 1 3 )

RTM 1 2 5 mg力価

ラクトース 2 0 0 mg

ポリソルべ一ト 8 0 1 0 mg

リン酸水素ニナトリウム ' 1 2水和物 0. 7 7 mg

リン酸ニ水素ナトリウム ' 2水和物 0. 1 8 mg

塩化ナトリウム 8 1. 8 mg

上記成分を注射用蒸留水に溶解し全量を 1 0 mLとし、無菌濾過した後 1 · 0 mLずつ無菌バイアルに充塡し、凍結乾燥して、可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥組成物を調製した。

(実施例 1 4 )

RTM 1 2 5 mg力価

ラクトース 2 0 0 mg

プルロニック F 6 8 1 0 mg

リン酸水素ニナトリウム ' 1 2水和物 0. 7 7 m g

リン酸ニ水素ナトリウム ' 2水和物 0. 1 8 mg

塩化ナトリウム 8 1. 8 mg

上記成分を注射用蒸留水に溶解し全量を 1 OmLとし、無菌濾過した後 1. 0 mLずつ無菌バイアルに充塡し、凍結乾燥して、可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥組成物を調製した。 (実施例 1 5 )

RTM2 2 5 mg力価

ラクトース 1 0 0 mg

精製ゼラチン 1 0 0 mg

上記成分を注射用蒸留水に溶解した全量を 1 OmLとし、無菌濾過した後 1 . 0 mLずつ無菌バイアルに充填し、凍結乾燥して、可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥組成物を調製した。

(実施例 1 6 )

実施例 1 5と同成分の可溶性卜口ンボモジュリン含有凍結乾燥組成物を調製した。別に、 0. 1 %ポリソルベート 8 0水溶液を無菌的に調製し、 1. Om lずつ分注して熔閉し、溶解用溶液アンプルとした

(実施例 1 7 )

RTM2 1 Omg力価

マルト一ス 1 0 0 mg

精製ゼラチン 1 0 0 mg

リン酸水素ニナトリウム ' 1 2水和物 0. 7 7 m g

リン酸ニ水素ナトリウム . 2水和物 0. 1 8 mg

塩化ナトリウム 8 1. 8 mg

上記成分を注射用蒸留水に溶解した全量を 1 OmLとし、無菌濾過した後 1 . 0 mLずつ無菌バイアルに充塡し、凍結乾燥して、可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥組成物を調製した。 (実施例 1 8 )

RTM2 1 Omg力価

マルトース 1 0 0 mg

精製ゼラチン 1 0 0 mg

プルロニック F 6 8 1 Omg

リン酸水素ニナトリウム ' 1 2水和物 0. 7 7 m g

リン酸ニ水素ナトリウム . 2水和物 0. 1 8 mg

塩化ナトリウム 8 1. 8 mg

上記成分を注射用蒸留水に溶解した全量を 1 OmLとし、無菌濾過した後 1 . OmLずつ無菌バイアルに充塡し、凍結乾燥して、可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥組成物を調製した。

(実施例 1 9 )

UTMO 2 5 mg力価

L一アルギニン塩酸塩 1 0 0 mg

ラクトース 1 0 0 mg

ポリソルベート 8 0 1 Omg

リン酸水素ニナトリウム ' 1 2水和物 0. 7 7 mg

リン酸ニ水素ナトリウム . 2水和物 0. 1 8 mg

塩化ナトリウム 2. 7 3 mg

上記成分を注射用蒸留水に溶解し全量を 1 0 mLとし、無菌濾過した後 1. 0 mLずつ無菌バイアルに充塡し、凍結乾燥して、可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥組成物を調製した。 (実施例 20 )

UTMO 2 5 mg力価

L一アルギニン塩酸塩 1 0 0 mg

マノレト一ス 1 00 mg

プルロニック F 68 1 0 mg

(実施例 2 1 )

UTM 1 1 Omg力価

ラクト一ス 1 0 0 mg

1 0 0 mg

ポリソルベート 80 50 m g

リン酸水素ニナトリウム ' 1 2水和物 23. 2 mg

リン酸ニ水素ナトリウム . 2水和物 5. 5 m g

上記成分を注射用蒸留水に溶解し全量を 1 OmLとし、無菌濾過した後 1. 0 mLずつ無菌バイアルに充塡し、凍結乾燥して、可溶性トロンボモジュリン含有凍結乾燥組成物を調製した。配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 2 8

配列の型：アミノ酸

配列の種類：タンパク質

起源生物名：ヒト

配列

A l a P r o A 1 a G l u P r o G i n P r o G 1 y

G 1 y S e r G i n C y s V a 1 G l u H i s A s p

1 0 1 5

Cy s Ph e A l a L e u Ty r P r o G l y P r o

2 0

A l a Th r Ph e L e u

2 5

産業上の利用可能性

以上のように、本発明の可溶性卜ロンボモジュリン含有組成物は、凍結 '乾燥，保存 ·加熱および再溶解の過程いずれにおいても安定であり、特に、凍結乾燥した本発明の可溶性トロンボモジュリン含有組成物については室温において長期間に渡る保存性に優れる。今回見いだされた安定化のための必須成分および吸着防止剤はいずれも極めて高い安全性を有しており、本発明の組成物を医薬品として用いる場合に、長期間に渡り活性の低下や凝集物の出現等の心配がなく、極めて高い品質を維持する事ができる。とくに凍結乾燥製剤は、 5 0 °Cで 6 ヶ月の保存でも十分に安定である。また、本発明の可溶性トロンボモジュリン含有組成物は低濃度の水溶液としたときも容器への吸着が防止され、医療現場において輸液にて希釈-して投与する場合も吸着により有効量を減ずることなく投与が可能となる。従って、安全でかつ室温における長期の保存性に優れた、血液凝固疾患に係わる疾病の予防治療薬を提供することが可能である。更に、臨床使用時の容器への吸着が防止された、血液凝固疾患に係わる疾病の予防治療薬を提供することが可能である。また、本発明の可溶性卜口ンボモジユリン含有組成物、その製法、可溶性トロンボモジュリンの安定化剤、安定化方法、吸着防止剤あるいは吸着防止方法は可溶性ト口ンボモジュリンの精製工程でも利用でき、さらに各種用途に用いるための可溶性ト口ンボモジユリンの原体の保存にも利用できる。

Claims

請求の範囲

1. 可溶性トロンボモジュリンと、マルトース、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる 1種あるいは 2種以上とを含有することを特徴とする可溶性トロンボモジュリン含有組成物。

2. 可溶性トロンボモジュリンと、非イオン性界面活性剤を含有することを特徴とする可溶性トロンボモジユリン含有組成物。

3. 可溶性トロンボモジュリンと、マルトース、ラクト一ス、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる 1種あるいは 2種以上と、非イオン性界面活性剤を含有することを特徴とする可溶性トロンボモジュリン含有組成物。

4. 前記可溶性トロンボモジュリンがヒト尿由来可溶性トロンボモジュリンである請求項 1〜 3のいずれかに記載の可溶性ト口ンボモジュリン含有組成物。

5. 前記ヒト尿由来可溶性ト口ンボモジユリンが以下の部分構造及び性質を有する物質である請求項 4記載の可溶性トロンボモジュリン含有組成物。

ィ）分子量 72， 000±3， 000

口）等電点 3. 9 ± 0. 2

ハ）末端ァミノ酸配列（配列表の配列番号 1のアミノ酸配列）

N末端：

A 1 a -P r 0 -A 1 a— G l u— P r o— G l n— P r o— G l y -G l y-S e r-G l n-Cy s -Va 1一 G l u— H i s— As p 一 Cy s— Ph e— A l a-L e u-Ty r— P r o-G l y— P r o 一 A l a-Th r-Ph e-L e u- C末端：

中性糖： 5. 5 ± 1. 0 %

[フエノール硫酸法で測定]

アミノ糖： 2. 2 ± 1. 0%

[E 1 s 0 n - Mo r g a n法（B 1 i x変法）で測定]

シアル酸： 2. 8 ± 1. 5 %

[W a r r e n法で測定]

6. 前記ヒ卜尿由来可溶性トロンボモジュリンが以下の部分構造及び性質を有する物質である請求項 4記載の可溶性トロンボモジュリン含有組成物。

ィ）分子量 79， 0 00±3， 00 0

[非還元状態での SDS— PAGEにより測定]

口）等電点 3. 8 ± 0. 2

N末端：

A 1 a— P r o— A l a— G l u— P r o— G l n— P r o— G l y -G 1 y - S e r一 G 1 n - C y s - V a 1一 G l u— H i s— As p -Cy s -Ph e-A l a— L e u— Ty r— P r o— G l y— P r o 一 A l a-Th r-Ph e-L e u-

C末端：一 L e u— A l a— A r g、または一 L e u— Va l— A r g 二）糖含量（重量％)

中性糖： 6. 2 ± 1. 0 %

[フユノール硫酸法で測定]

アミノ糖： 3. 1 ± 1. 0%

[E 1 s 0 n— Mo r g a n法（B 1 i x変法）で測定]

シアル酸： 3. 8 ± 1. 5 %

[W a r r e n法で測定]

7. 前記可溶性トロンボモジュリンが組換えヒト可溶性トロンボモジュリンである請求項 1〜 3のいずれかに記載の可溶性トロンボモジュリン含有組成物。

8. 2種あるいは 3種以上の分子種の可溶性トロンボモジュリンと、マルト一ス、ラクト一ス、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる 1種あるいは 2種以上とを含有することを特徴とする可溶性トロンボモジユリン含有組成物。

9. 2種あるいは 3種以上の分子種の可溶性トロンボモジュリンと、非イオン性界面活性剤を含有することを特徴とする可溶性トロンボモジュリン含有組成物。

1 0. 2種あるいは 3種以上の分子種の可溶性トロンボモジュリンと、マルトース、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる 1種あるいは 2 種以上と、非ィォン性界面活性剤を含有することを特徴とする可溶性トロンボモジュリン含有組成物。

1 1. 凍結乾燥処理されている請求項 1〜 1 0のいずれかに記載の可溶性ト口ンボモジユリン含有組成物。

1 2 . 少なくとも 1種の可溶性ト口ンボモジュリンと、マルト一ス、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩、および非イオン性界面活性剤から選ばれる

1種あるいは 2種以上とを溶解混合する工程を含む請求項〜 7および 1 1のいずれかに記載の可溶性トロンボモジュリン含有組成物の製法。

1 3 . 少なくとも 1種の可溶性卜ロンボモジュリンと、マルトース、ラクト一ス、蔗糖、アルギニンおよびその塩、および非イオン性界面活性剤から選ばれる 1種あるいは 2種以上との溶液状態の組成物を凍結乾燥する工程を含む請求項 1 2記載の可溶性トロンボモジュリン含有組成物の製法。

1 4 . マルトース、ラクト一ス、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる 1種あるいは 2種以上からなることを特徴とする可溶性トロンボモジュリンの安定化剤。

1 5 . 可溶性トロンボモジュリンにマルトース、ラクトース、蔗糖、アルギニンおよびその塩から選ばれる 1種あるいは 2種以上を添加することを特徴とする可溶性ト口ンボモジュリンの安定化方法。

1 6 . 非イオン性界面活性剤からなることを特徴とする可溶性トロンボモジュリンの吸着防止剤。

1 7 . 可溶性トロンボモジュリンに非ィォン性界面活性剤を添加することを特徴とする可溶性トロンボモジュリンの吸着防止方法。