TWI329019B - Anti-il-6 antibodies, compositions, methods and uses - Google Patents

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TWI329019B TW091133208A TW91133208A TWI329019B TW I329019 B TWI329019 B TW I329019B TW 091133208 A TW091133208 A TW 091133208A TW 91133208 A TW91133208 A TW 91133208A TW I329019 B TWI329019 B TW I329019B
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Description

1329019 λ 3 玉、發明說明（1、 發明背景 發明範疇 本發明係關於抗體，包括特定部分或變異體，特別係對 於至少一種介白素-6 (IL-6，亦已知為干擾素β2)蛋白質或其 5片段，以及編碼該抗-Κ抗體的核酸、互補核酸、載體、宿 主細胞’以及製造及其使用方法，包括治療配方'投藥和裝 置。 相關技藝 10 介白素-6 (IL-6)係一前發炎細胞激素，可由許多不同的 細胞種類產生。活體内，受刺激的單核球細胞'纖維母細胞 和内皮細胞代表IL-6的主要來源，其他的細胞像是巨噬細 胞、T和B淋巴球、顆粒性細胞、角質細胞、肥大細胞、成 骨細胞、原漿細胞'神經膠細胞和平滑肌細胞在刺激後亦可 15 產生1L-6(Kishimoto, T.，Blood 74: 1-10( 1989)和 Kurihara，N. :!令部智慧財產局員工消資合作.社印s 等人’免疫學雜誌144: 4226-4230 ( 1990))。多種腫瘤細胞亦 可產生IL-6 (Smithy P. C.等人，細胞激素和生長因子回顧12: 33-40 (2001 ))，且最近指出il-6係前列腺癌進行的預後因子 (Nakashima，J.等人，臨床癌症研究 6: 2702-2706 (2000))。 20 IL~6的產生可為IL-6本身所調控，且取決於細胞種類，il-6 可刺激或抑制其本身合成。 IL-6可連結於促細胞分裂劑-活化b細胞、τ細胞、週邊 單核球細胞和特定腫瘤表現的IL-6受體上（Ishimi，Y.等人， 免疫學雜誌145: 3297-3303 (1990))。IL-6受體具有至少二個 ___3_ » 3 3 ^f^^(CNS)A4 ·. ：Ι0 χ ：97 'ύϊ , 1329019 Λ: 3" ...... — ____ ψ 三、發明说』u 不同的成分’且由稱作gp80且負責IL-6連結的α鍵和命名為 gpl30且訊息傳導必需的β鍵所組成（Adebanjo, Ο.等人，細胞 生物學雜誌 142: 1347-1356( 1998)和 P〇li，V.等人，EMBO 13: 1189-1196(1994))。包括 IL_6、LIF、抑瘤素 M(OncostatinM)、 5 IL-U、CNTF和CT-1的細胞激素家族所有的訊息在連結至其 關聯受體後皆係經由gpl30，此外，IL-6細胞激素家族所有的 成員皆可誘發肝臟表現急性期蛋白質（Bellido, T.等人，J. Clin.
Investigation 97: 431-437 (1996)) 87908790。 IL-6具有至少二種主要的生物功能：媒介急性期蛋白質 10以及作為分化和活化因子（Awisti，G.等人，Baillieres Clinical
Hematology 8: 815-829 (1995)和 P〇li，ν·等人，EMBO 13: 118^-1196 (1994))。急性期蛋白質已知可調控免疫反應、媒 介發炎，以及在組織再造中扮演角色。作為分化和活化因子， 11：-6可誘發B細胞分化並分泌抗體、誘發τ細胞分化為毒殺 15性Τ細胞、活化細胞訊息因子，以及促進造血（Ishimi, γ等 人’免疫學雜t志145: 3297-3303 (1990))。IL-6可顯著地參與 涇;3-部智慧財產马3工消5合作让印戈 許多重要的身體功能和過程，因此’在活體内之生理過程包 括骨骼代謝、贅瘤轉形，以及免疫和發炎反應可藉由抗體運 用IL-ό生物活性來增進、抑制或防止（Adebanj〇, 〇等人，細 20 胞生物学雜钱 142: 1347-1356 (1998))。 雖然IL-6參與許多途徑，但刪除小鼠具有正常的表 型，其係可生存且可生育的，且該等動物顯示τ細胞數目輕 微地降低’以及對組織損傷之降低的急性期蛋白質反應（K〇pf Μ·等人，在介白素-6缺失小鼠中損傷的免疫和急性期反應， _*____4 本纸張Λ冱in ? 3 3 ?f«^(CNS)A4 . 210 X 297 " 1329019 三 '發明戈明、》' 自然雜諸、’ 368 (6469) : 339*42，1994) ’相反地，過度表現 IL-ό的轉殖小鼠會發育為神經疾病像是神經退化、星形細胞 增多症、腦脈管發生，且該等小鼠不會發育出血腦障礙 (Campbell等人，轉殖小鼠中腦部過度表現介白素6誘發的 5 神經疾病 ’ PNAS 90 : 10061-1005，1993)。 最近的研究顯示IL-6單株抗體在活體内可抑制前列腺腫 瘤（Smithy P.C.和 Keller, E.T·，The Prostate in press 和 Okamoto, M.等人，Cancer Research 57 : 141-146 ( 1997))和腎癌 (Weissglas，M.等人，The Journal of Urology 153 : 554.557 10 (1995))的生長。除了對腫瘤生長的直接作用外，阻斷IL-6 :现:ΛΤ部智豸財產局員工消费合作社印11 產生亦可化學致敏和增進毒殺功效（Smith? PC等人，細胞激 素和生長因子回顧12 : 33-40 (2001 ))，文獻共同地教導我們 阻斷IL-ό活性可抑制骨骼變性、腫瘤生長和癌症惡病質。 使用非人類多株抗體（例如抗血清）或單株抗體（Mabs) 15及其片段（例如其蛋白分解消化產物）之被動免疫治療係具 有潛力的治療劑’其可發展為用於多種疾病的治療。然而， 由非人類部分組成的抗體已知當投藥於人類時會引起免疫反' 應，該免疫反應使得重複抗體投藥時常不適用於治療，且可 能導致免疫複合物媒介抗體由循環中清除，因而降低對病患 20的治療功效，可能促進重複投藥非人類部分組成抗體之徵狀 實例係血清病症和過敏病症。 為了嘗試避免該等和其他問題，許多方法包括嵌合和，，人 化已進行來降低其抗體/片段之免疫性，該等方法製造出具降 低免疫性之抗體，該等抗體實質上係人類來源，僅具有互補 5 本 3 7 M(CNS)A4 X 297 公; 1329019 Λ： _ 3： 三、發明說明（ο 的決定區域（CDR’s)和特定骨架殘基而影響非人類來源之 CDR構造，因此，新穎的人類或人化單株抗體可特別單獨使 用或合併已存在分子用於免疫治療用途。 因此’必須提供對IL-6或其片段高度親和性，中和性嵌 5合或人類抗體以克服更多該等問題，以及改良已知抗體或其 片段用於IL-6相關徵狀之預防、治療、改善或診斷。 由融合瘤細胞株產生之IL-6鼠類單株抗體係於例如美國 專利案第5,618,700號中已知。美國專利案第5 856 135號中 揭示衍生自小鼠單株抗體SK2之人類IL_6改造人類抗體，其 10中來自小鼠抗體SK2變異區域之互補決定區域（CDR，s)係 移植至人類抗體的變異區域内，且與人類抗體的不變區域連 結。.. 其他的氣類單株抗體已經描述且分類為中和性（其可避 免’受體連結）或非中和性（Brakenh〇ff等人，免疫學雜誌 15 ( 199〇))(丨45 : 561)。在該組抗體中，IL-6的中和性單株抗
"-部智慧財產局具工消Ϊ合作钍印X 體可分為二群，且一般認定IL_6分子上的抗原決定位命名為 第I區和第II區。第I區可避免與卽80 (IL6R)連結，且因 此避免gpl30活化’第丨區抗原決定位之其他特性為包含亿_6 分子之胺端和羧端部位區域。第π區連結物可避免即13〇活 20化，且因此可辨識參與訊息之結構抗原決定位。 一鼠類IL-6單株抗體稱作cLB^6/8或CLB-8，其已知具 有對IL-6的高度親和性且可與第I區抗原決定位連結（上述 Brakenhoff等人）’但該抗體的抗原連結區（CDR區域）係未 知。然而如上述，鼠類抗體在人類體内係高度免疫性的， 6 1329019 λ： 3" 五、發玥說明（Γ 因此其治療價值受限，因此持續需要具有高度親和性和合適 醫藥性之IL-6抗體。 發明概要 5 本發明提供分離嵌合、人化和/或CDR-移植抗-IL_6抗 體’其具有至少一個衍生自高親和性CLB-8抗IL-6抗體之抗 原連結區域，以及抗-IL-6抗體組合物、其相關的編碼或互補 核酸、載體、宿主細胞'組合物、配方、裝置'轉殖動物、 10轉殖植物，以及其製造和使用方法，如同敛述且在此可愈技 藝中已知者合併。本發明之抗體可以高度親和性特定中和人 類 IL-6。 如同此處所描述的，本發明提供至少一個分離人類小鼠 欣合、人化或CDR-移植抗_il-6 CLB-8抗體（"cCLB-8抗體 15 ")。根據本發明，CLB-8抗體包括任何含有至少一個衍生自 逸-部智葸財產局員工消费合作社印" 鼠類CLB-8單株抗體重或輕鏈互補決定區域（CDR)或其配 位體連結部位之蛋白質或胜肽分子，合併可嵌入本發明抗體 之重鏈或輕鏈不變區域、支架區域或其任何部位。本發明之 一具體實施例係針對包含二個輕鏈和二個重鏈之抗_IL_6嵌合 2〇抗體’各鏈皆包含至少一個人類不變區域部位和至少一個衍 生自具有人類IL_6特異性之鼠㈣⑽單株抗體變異區域 (v)部位’該抗體可高度親和性地與人類IL 6抑制和/或中 和抗原決定位連結，像是cCLB_8抗體。本發明亦包括該抗體 之片段或衍生物’像是一或多個抗體鏈部位，像是重鏈不變、
1329019 發明說明（石 連W樣賴異區域，或輕鏈㈣、連結讀異區域β 含至卜靖生自鼠類CLB8 決定區域（CDR)(例如重或輕鏈變異區域CDiu、c贈或 CDR3)至少—個特定部分，和/或至少—個不變或變異支架 5區域或其任何部位。如同此處描述或如同技藝中已知，本抗 體之胺基酸序列可另選擇性包含至少一個特定取代插入或 刪除。 . •本㈣讀佳抗體包括料核體啊絲性抑制抗 -IL-6鼠類CLB_8、嵌合性抗_IL_6CLB 8或本質上具有相同連 10結特性之抗體及其片段和區域與人類IL-6連結之嵌合、人化 和/或CDR移植抗體。 經濟部智葸財產局員工消费合作社印衮 ”本發明之較佳抗體係該等可連結至CLB_8和cCLB 8辨 識抗原決定位者，其係包括於Brackenh〇ff等人描述之 Ie>itope中（上述）’以競爭性抑制決定單株抗體特異性和親 15和性之較佳方法可在Harlow等人的抗體：實驗室手冊（冷泉 港實驗室印刷’冷泉港，紐約，觸）（在此以引用的方式併 入本申請案中）中找到。本發明至少之一抗體可與CLB 8單 株抗體連結之人類IL-6蛋白質、副單位、片段、部位或其任 何組合至少一特異性抗原決定位連結，抗原決定位可包含至 20少—個CLB-8抗體連結之抗體連結區域，該抗原決定位包含 其至少一個部位（像是但不限於至少一個人類IL_6蛋白質功 能性、細胞外、可溶性、親水性、外部或細胞質内區域，或 其任何部位）至少1-5個胺基酸係較佳。 在一態樣中，本發明提供至少一個分離哺乳類抗_IL 6 __8 本紙張尺.1通;3中；3 3孓漂淳(CNS)A4規洛v 210 X 297公沒; ' 1329019 λ： 37 五、發明說明<7、 cCLB-8抗體，其包含至少一個含有序列辨識號碼：7或8以 及其編碼核酸序列（序列辨識號碼：15或16)之變異區域。 在另一態樣中’本發明提供至少一個分離哺乳類抗—Κ cCLB-8抗體’其包含⑴所有重鏈互補決定區域（CDR)序 5列辨識號碼：1、2和3胺基酸序列，以及其編碼核酸序列（序 列辨識號碼：9-11);或（丨丨）所有輕鏈(：1)11序列辨識號碼‘ 4、5和6胺基酸序列，以及其編碼核酸序列（序列辨識號碼： 12-14)。 在另一態樣中’本發明提供至少一個分離哺乳類抗-IL-6 10 cCLB_8抗體，其包含至少一個具有序列辨識號碼：丨、2、3、 4 5或6至少一胺基酸序列以及其編碼核酸序列（序列辨識 號碼：9-14)之重鏈或輕鏈CDR。 本發明之其他態樣中提供至少一個分離哺乳類嵌合人 化或CDR移植抗4L-6 cCLB-8抗體，其包含至少一個人類 丨5 CDR ’其中抗體可特異性地與包含CLB_8抗體連結之人類 IL-6抗原蚊錄彡丨_3個絲酸之至少—個歸、決定位連 結。 經濟部智.^.財產局|*工消5合作社印？.0. 至少-抗體可再選擇性地以至少1〇-9莫耳濃度之親和性 (心）與IL-6連結，至少1〇-H>莫耳濃度係較佳，和/或本質 2〇上可令和至少-種IL_6至少一種活性。在一較佳具體實施例 令’抗體可以至少lx 10-u莫耳濃度之親和性⑻）與il_6 連結，以5χ l〇-丨丨中和人類IL 6係較佳。 在二態樣_，本發明提供包含與上述抗-IL-6抗體特異性 編碼么核芽酸互補或雜交，包含至少一個特異性序列、區 9 1329019 五、發明說明（没' 部位或其變異體之分離核酸分子。本發明另提供包含該抗 -IL-6抗體核酸分子之重組載體、包含該核酸和/或重組載體之 宿主細胞，以及製造和/或使用該抗體核酸、載體和/或宿主細 胞之方法。因此’本發明包含編碼至少一個分離哺乳類抗_IL6 5 cCLB-8抗體之分離核酸、含有分離核酸之分離核酸載體和/ 或包含分綠核酸之原核或真核宿主細胞。宿主細胞可選擇性 地至少一選自 COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、 ，BSC]、HeP G2、653 ' SP2/0、293、HeLa、骨騎瘤或淋巴瘤 細胞，或其任何衍生物、不死或轉形細胞。亦提供製造至少 10 -種抗·Ιί-6 cCLB-8抗體之方法，包含於活體外、活體内或 原位條件下轉澤抗體編碼核酸，如此几_6抗體係以可偵測或 可写收量表現。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印茨 本發明另提供至少-種本發明eCLB_8抗4L 6抗體之至 少一種IL-6抗個體型變異抗體，抗個體型變異抗體包括任何 15含有至少-個免疫球蛋白分子部位之分子之蛋的或胜肽， 像疋但不限於至少-個重或輕鏈之互補決定區域（cdr)或 其配位體連結部位，重鏈或輕鏈變異區域、重鍵或輕鍵不變 區域、支架區域或其任何部料可嵌人本拥抗體之抗個體 型變異抗體中。本發明之抗個體型變異抗體可包括或街生自 2〇任何哺乳類，像是但不限於人類、小鼠、兔子、無類、靈 長類等。 在-態樹’本翻提供包含與至少—種U抗個體型 變異抗體編碼聚《酸互補或雜交，包含至少一個特異性序 列、區域、部位或其變異體之分離核酸分子。本發明另提供 1329019 五、發明說明（y 15 缦活部智逑財產局員工消*<合作?1.印製 20 ===::碼㈣分子―'包 %室，錢體之伟主細胞，以及觀和 個體型變異抗體核駿、载體和/或宿主細胞之方法 持明亦提供至少一種用於在宿主細胞内表現至少—種 述抗-IL-6抗體或iL_6抗個體型變異抗體 述撕下爾塊，其 係以可偵測和/或可回收量表現。 饥® 亦提供用於產生至少一種本發明分離抗孔·6抗體之方 法，其包含提供表現可回收#抗體之轉_物或轉殖植物或 植物細胞。本發明另提健少一種以上述方法產生之抗似 抗體。 本發明亦提供至少-種包含（a)分離抗_IL 6cClb_8抗 體編碼核酸和/或此處描述抗體’以及⑻合麵細或稀釋 液之組合物，載織稀可選雜地如同仏細或稀釋 液係醫藥可接受的，組合物可選擇性地另包含至少一種其他 化合物、蛋白質或組合物。 本發明另提供至少-種用於投藥有效治療量在細胞組 織、器官、動物或病患中以調控或治療至少—種IL 6相關徵 狀和/或技藝中已知和/或此處描述相關徵狀之前、同時或期間 之抗-IL-6 cCLB-8抗體之方法或組合物。因此，本發明提供 在細胞、組織、器官或動物中用於診斷或治療α·6相關徵狀 之方法’包含接觸或投藥含有有效量至少—種分離發明抗 -IL-6 cCLB-8抗體至細胞、組織、器官或動物中之組合物。 本方法可選擇性地另包含使用有效量0.001-50毫克/公斤細 裝 線 本蚨張Λ.Ϊ通用* 3 3孓j*^(CNS)A4規洛二10 X H97公；i ; 1329019 λ： __ _______ , 五、發明說明（|0、 胞、組織、器官或動物。本方法可選擇性地另包含使用至少 一種選自非經腸胃、皮下、肌肉内、靜脈内、動脈内、支氣 管内、腹腔内、被膜内、軟骨内、腔内、體腔内、小腦内、 腦室内、結腸内'頸管内、胃内、肝内、心肌内 '骨内、骨 5 盆内、心包内、腹腔内、胸膜内、前列腺内、肺内、直腸内、 腎内、視網膜内、椎管内、滑膜内、胸内、子宮内、膀胱内、 大丸劑、陰道、直腸、頰的、舌下、鼻内或經皮之方式來接 ‘ 觸或投藥。本方法可選擇性地另包含在抗體接觸或投藥至少 一種包含有效量至少一種選自可偵測標記物或報告物、TNP 10拮抗劑、抗風濕劑、肌肉鬆弛劑、麻醉劑、非類固醇抗發炎 藥（NSAID)、止痛藥、麻醉藥、鎮定藥、局部麻醉藥、神經 肌,阻斷劑、抗微生物劑、抗牛皮癖藥、皮質類固醇、合成 '代謝類固醇、紅血球生成素、免疫劑、免疫球蛋白、免疫抑 制劑、生長激素、荷爾蒙取代性藥物、放射性藥物'抗憂鬱 15藥、抗精神病藥、刺激劑、氣喘藥' β刺激劑、吸入性類固醇、 腎上腺素或其類似物、毒殺性或其他抗癌劑、抗代謝藥像是 胺甲喋呤（methotrexate)、抗增殖劑、細胞激素或細胞激素拮 速-部智慧財產局0^工消货合作社印焚 抗劑至少一種化合物或蛋白質之組合物之前、同時或之後投 藥。 20 本發明另提供至少一種用於診斷在細胞、組織、器官、 動物或病患t至少一種IL-6相關，徵狀和/或如同技藝中和/或 此處描述已知糊徵狀之前、啊或細之抗IL6 cClb8 抗體方法。 本發明亦提供至少-種驗診斷至少—種如本發明之抗 12 1329019 三、發明說明。；） -IL-6抗體之組合物、裝置和/或運送方法。 亦提供包含至少一種分離联合、人類或人化抗·il_6 cCLB-8抗體以及至少—種醫藥可接受細或娜液之組合 物。組合物可選擇性地另包含有效量至少一種選自可偵測標 5 §己物歧告物 '毒紐或其藏蘭、域_像是胺〒嗓 吟、抗增_、細胞激素或細胞激素拮抗劑、聊拮抗劑、 抗風濕劑、肌肉鬆弛劑、麻醉劑、非類固醇抗發炎藥（nthe)、 止痛藥、麻醉藥、鎮定藥、局部麻醉藥、神經肌肉阻斷劑、 抗微生物劑 '抗牛皮_、皮質_醇、合成代謝類固醇、 10紅血球生成素、免疫劑、免疫球蛋白、免疫抑·、生長激 素、荷爾蒙取代性藥物、放射性藥物、抗憂鬱藥、抗精神病 藥、刺激劑、氣喘藥、β刺激劑、吸入性類固醇、腎上腺素或 其類似物至少一種化合物或蛋白質。 铿令部智慧財產局3工消费合作钍印^. 亦提供-種醫學裝置，其包含至少一種本發明分離哺乳 15類抗-IL-6抗體，其中裝置係適於使用至少一種選自非經腸 胃、皮下、肌肉内、靜脈内、動脈内、支氣管内、腹腔内、 被膜内、軟骨内、腔内、體腔内、小腦内、腦室内、結腸内、 頸管内、胃内、肝内 '心肌内、骨内、骨盆内、心包内 '腹 腔内、胸膜内、前列腺内、肺内、直腸内、腎内、視網膜内、 20椎管内、滑膜内、胸内、子宮内、膀胱内、大丸劑、陰道、 直腸、頰的、舌下、鼻内或經皮之:方式來接觸或投藥至少一 種抗-IL-6抗體。 亦提供用於人類醫藥或診斷用途之製造物，其包含含有 至少一種本發明分離哺乳類抗-IL-6抗體溶液或冷凍乾燥型之 1329019 3 7 五、發明說明 包裝物或内容物。製造物可選擇性地包含具有用作非經腸 胃、皮下、肌肉内、靜脈内、動脈内、支氣管内、腹腔内、 被膜内、軟骨内、腔内、體腔内、小腦内、腦室内、結腸内、 頸管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹 5 腔内、胸膜内、前列腺内、肺内、直腸内'腎内'視網膜内、 椎管内、滑膜内、胸内'子宮内、膀胱内'大丸劑、陰道、 直腸'頰的、舌下、鼻内或經皮運送裝置或系統成分之内容 物。 本發明另提供此處描述之任何發明。 10 圓式描述 圖1,:圖示cCLB>8與人類重组IL~6之連結。 圓' 2 :圓示cCLB-8藉由SKW6.4細胞分泌igM mu對IL-6 15 之抑制。 圖3 :圖示cCLB-8藉由產生MCP-1對1L_6之抑制。 毯呀部智慧財產局員工消费合作社印^ 圓4 :西方點墨法影像顯示在THP-1人類單核血癌細胞内 20 cCLB>8對IL_6訊息之抑制。 圓5:圏示cCLB~8抑制IL~6誘發HepG2細跑產生血清激:粉 質蛋白A.。 _14___ 士 3 3 飞漂 ACNSU4 戍洛·. 210 +x 297 公; 1329019 三、發明說明p' 函6 .圓示cCLB-8中和rhIL~6誘發細跑增瘦之能力。 圏7 :圖示以抗人類和抗小鼠丨l_6抗體治療具有人類腫瘤之 小鼠在宿主體重減少之相對降低量。 5圈8A-G .圖示7種抗個體型變異抗體之血清抑制研究圓。 圖9:圖示以抗個體型變異單株抗體抑制cCLB_8與人類 之連結❶ 10圖10·圖示cCLB-8與人類IL-6連結前之抗個趙型變異連結。 發明詳述 引述 痤令部智葸財產局員工消^合作钍印it 此處引用所有的發表或專利皆以顯示本發明同時的技蔽 15狀態和/或提供描述及促成本發明之引用方式完整併入。發表 係指任何科學或專利發表，或任何媒體型中可得之任何訊 息，包括所有紀錄、電子或印刷型。以下的參考文獻在此係 以引用的方式完整併入：Ausubel等人編輯的分子生物學現今 方法 ’ John Wiley & Sons，Inc”紐約，紐約（ 1987-2001 ). 20 Sambrook等人的分子選殖：實驗室手冊第二版，冷泉港，紐 約（1989) ; Harlow and Lane，抗體^實驗室手冊，冷泉港， 紐約（1989);C〇lligan等人編輯的免疫學現今方法，J〇hn粘㈣ &Sons, Inc.,紐約，紐約（1994-200” ； Colligan $人#f 科學現今方法，John Wiley&Sons，紐約，紐約（1997-2001)。 1329019 A7 B7 五、發明說明（ik) 胺基酸密碼 構成本發明抗-IL-6抗體之胺基酸時常縮寫，胺基酸之命 名可以技藝中所熟知其單一字母密碼、其三字母密碼、名字 5或三個核苷酸密碼子命名胺基酸來表示（參考Alberts, B.等 人、，用胞刀子生物學，第二版，GWand pubushing，ine.，紐約， 1994): 定義 1〇 此處使用的，，抗介白素-6 cCLB-8抗體"、"抗-IL-6 cCLB-8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 抗體、"抗-IL-6 cCLB-8抗體部位，，或"抗·IL_6 cCLB_8抗體片 段"$/或"抗-IL-6 cCLB-8抗ft變異體"及其相似物包括任何包 3至J-種免疫球蛋白分子部位、包含至少—種重或輕鍵互 補決定區域（CDR)或其触自鼠類CLB_8單株抗體之配位 I5體連結部位合併重鏈或輕鍵變異區域、重鏈或輕鍵不變區 域、支架區域或其非氣類來源（人類來源較佳）任何部位之 刀子之蛋白質或職’其可欽本發明之抗體巾。該抗體可 在活體外、原位和/或活體内調控、降低、括抗、減輕、提升、 阻斷、抑制、廢除和/或干擾至少—種K活性或連結或U 2〇又體雖或連結。作為非限制性實例，本發日月之合適抗孔6 抗體、特定部分錢異體可高舰和性軸clb 8單株抗體 辨識之人類IL_6抑制和/或作抗原決定位連結，合適的抗 IL 6抗體、特定部分或變異體亦可選擇性地影響至少一種 IL"6 '舌性或功能，像是但不限於RNA、DNA或蛋白質合成、 16 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1329019 A7
L6釋放、IL_6受體訊息、膜^ _、il起性' κ產 生和/或合成。 "抗體另職包含抗體、消化胳、狀部分和其變 異體’包括抗體模擬或包含模擬抗體或特定 …或功能之抗體部位，包括單鍵抗體及其片== 含至少-個來自CLB-8單株抗體之CDR。功能性片段包括可 與哺乳類IL-6連結之抗原連結片段，例如，可與il_6連結之 抗體片段或其部位包括但不限於Fab (例如以番瓜酵素消 化）、Fab’（例如以胃液素消化及部分還原）和F(ab，)2 (例如 1〇以胃液素消化）、facb (例如以胞漿素消化）、pFc，(例如以胃 液素和胞聚素消化）、Fd (例如以胃液素消化、部分還原及再 凝集）、Fv或scFv (例如利用分子生物學技術）片段皆為本 發明所包含（參考例如上述C〇mgan的免疫學）。 該等片段可以技藝中已知和/或此處描述之酵素裂解、合 15成或重組技術來產生，抗體亦可使用其中一或多個終止密碼 子已導入自然終止位置上游之抗體基因以多種截頭型產生。 例如，編碼F(ab’)2重鏈部位之組合基因可設計使包括編碼重 鏈CHi區和/或鉸鍵區域之DNA序列，抗體之不同部位可以 傳統技術化學連結’或使用遺傳工程技術以鄰近蛋白質製備。 20 在此所使用之"嵌合"抗體或"人化〃抗體或"CDR-移植"包 括任何此處描述之氣類CDR’s與一或多種來自非鼠類（人類 抗體較佳）蛋白質或胜肽之組合物。根據本發明提供拔合或 人化抗體’其中CDR，s係來自可與人類IL-6連結之鼠類 CLB-8抗體，且抗體至少一個部位或殘餘物係來自一或多種 17 本紙張尺度過用中回固家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）
1329019 A7 _______B7___ 五、發明說明（丨6) 人類抗體，因此抗體之人類部分可能包括支架、Cl ' Ch區（例 如ChI、CH2、Ch3)、絞鏈、（VL、Vh)區，其在人類本質上 係無免疫性的’來自人類抗體之抗體區域不需與人類抗體具 有100%之同一性。在一較佳具體實施例令，盡可能地保留人 5類胺基酸殘基以忽略免疫性，但人類殘基可能改良以支持抗 體同時極大人化時CDR，s形成抗原連結位置所需。該等改變 或變異可選擇性且較佳地保留或降低在人類或其他種類中相 • 對於非改良抗體之免疫性，已指出人化抗體以可功能性表現 重新排列人類免疫球蛋白（例如重鏈和/或輕鍵）基因之非人 10類動物或原核或真核細胞產生。再者，當抗體係單鏈抗體時， 其可包含在自然人類抗體中未見之連結胜肽，例如Fv可包含 連、气胜肽像是2至大約8個甘胺酸或其他胺基酸殘基，其可 蓮結重鏈的變異區和輕鏈的變異區，該等連結胜狀係視作人 類來源。 15 本發明抗體 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 根據本發明，抗_IL-6 cCLB-8抗體包含其中變異區或 CDRs來自可與人類il-6連結或抑制其功能之鼠類CLB_8抗 體’且抗體之支紐;麵來自—衫種人敏體之择體。 雖…:任何及所有@改良包括取代、插入和刪除只要鼓合抗體 保留連結和抑制1L_6之能力皆係預期，但來自鼠類CLB-8抗 體之變異喊CDRs航類CLB4⑽之變異區或CDRs具 有約90%至約職同__性係較佳，來自人類抗體之嵌合、 人化或CDR移植抗體區不需與人類抗體具有1峨同一性。 18 本纸"^尺度適用t國國家標準(CNs)A4規格（2丨撕公爱$--_ 1329019 A 7 _________B7 五、發明說明（θ) 在一較佳具體實施例中，盡可能地保曾人類胺基酸殘基以忽 略免疫性’但人類殘基（特別係支架區域殘基）係如所需和 根據本發明以下教導而取代，該等如此處揭示之改良係支持 抗體同時極大人化時CDRs形成抗原連結位置所需。 5 抗人類IL·6之CLB-8鼠類單株抗體係技藝中已知 (Brakenhoff等人，上述）’但至今該抗體之CDR區仍未揭 示’本發明係第一次揭示來自CLB-8鼠類單株抗體CDR區 之嵌合、人化或CDR移植抗體，以及製備該等抗體之方法。 根據本發明’鼠類CLB-8重鏈之重鏈cdNA (序列辨識號碼： 10 15)和胺基酸序列（序列辨識號碼：7)係於實例2中提供， 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 鼠類CLB-8輕鏈之cDNA和推論胺基酸序列（序列辨識號 碼：8)亦於實例2中提供（序列辨識號碼：16)，各個重和 輕鏈變異區皆包含3個CDRs合併以形成抗原連結位置。3個 CDRs係為4個FR區圍繞，其主要的功能係支持CDRs。重 15和輕鏈變異區序列内CDRs序列可根據Kabat等人（1987) 在免疫學重要蛋白質序列（第4版，美國健康及人類服務部 門，美國政府印刷局，華盛頓，D.C.)中以電腦支援結盟或 如 Levitt (1983 )在 J. Mol. Biol. 168 : 595 t 描述利用 ENCAD 程式以變異區分子造型來辨識。 20 在一較佳具體實施例中，CDRs係來自鼠類單株抗體 CLB-8，較佳的重鏈CDRs具有以下序列： CDR1 SFAMS (序列辨識號碼 1) CDR2 EISSGGSYTYYPDTVTG (序列辨識號碼 2) CDR3 GLWGYYALDY (序列辨識號碼 3) 19 本纸張尺度適用中國國家棵準(CNS)A4規格（210x297公;S) 1329019 A7 B7 五、發明說明（丨？) 較佳的輕鍵CDRs具有以下序列： CDR1 SASSSVSYMY (序列辨識號碼 •4) CDR2 DTSNLAS (序列辨識號碼 :5) CDR3 QQWSGYPYT (序列辨識號碼 :6) 鼠類CLB-8抗體之CDRs序列可能以插入、取代和刪除 .5 至CDR-移植抗體維持連結與抑制人類IL-6能力之含量來改 良。原熟習技藝者可進行以下描述之功能性試驗確定該活性 之維持，例如CDRs可具有與序列辨識號碼：1-6 CDRs約50 %至約100%之同一性。在一較佳具體實施例中，CDRs具有 與峰列辨識號碼：1-6 CDRs約80%至约100%之同一性。在 1〇 一更佳具體實施例中，CDRs具有與序列辨識號碼：1-6 CDRs 的90%至約100%之同一性。在一最佳具體實施例中，CDRs 具有與序列辨識號碼：1-6 CDRs約100%之同一性。 或者，實例2中描述之鼠類CLB-8抗體完整的重鏈變異 區和輕鏈變異區（序列辨識號碼·· 7和8)可能與人類不變和 15 支架區合併以形成本發明之嵌合cCLB-8抗體。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 編碼嵌合抗體不變區（C)、片段和本發明區域之人類基 因可利用已知方法來自人類胎兒肝臟庫，人類C區基因可來 自任何人類細胞包括該等表現及產生人類免疫球蛋白者。人 類CH區可來自任何已知種類或同型人類η鍵，包括γ、μ、α、 2〇 δ、ε及其亞型，像是G1、G2、G3和G4。由於Η鏈同型係負 責抗體之多種作用功能’因此CH區之選擇會受到預期作用功 20 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1329019 A7 '_____ 五、發明說明（/?) 能之引導，像是補體固定或抗體決定細胞毒殺（ADCC)能力， Ch區來自γΐ (IgGl)係較佳。 人類CL區可來自人類L鏈同型，κ或λ，κ係較佳。 編碼人類免疫球蛋白C區之基因係由人類細胞以標準選 5殖技術得到（Sambrook等人（分子選殖：實驗室手冊，第2 版，冷泉港印刷，冷泉港，紐約（1989))和Ausubd等人編 輯的分子生物學現今方法（1987_1993))。人類c區基因可直 接由包含表示二種L鏈、5種Η鏈及其亞種基因之已知株落 得到。嵌合抗體片段像是F(ab’)2和Fab可利用設計適當載頭 10之嵌合Η鍵基因而製備，例如編碼F(ab，)2 #段η鍵部位之 嵌合基因可包括Η鏈CH1區和鉸鏈區之編碼DNA序列，之 後係轉譯終止密碼子而產生截頭分子。 一般在貫例中，本發明之嵌合抗體、片段和區域可利用 選殖編碼CLB-8抗IL-6特異性抗體η和L鏈抗原連結區之 I5 DNA片段產生，且將該等DNA片段分別與和&區編碼 DNA片段連結而產生嵌合免疫球蛋白編碼基因。 經濟部智慧財產局負工消费合作社印製 因此，在一較佳具體實施例中製造出包含編碼至少一種 非人類來源抗原連結區第一 DNA片段之融合敌合基因（像是 功能性重新排列V區連結⑴片段）與編碼至少一部分人類 20 C區之第二DNA片段連結。 乳類CLB-8抗體之變異區序列可能以插入、取代和刪除 至嵌合抗體維持連結與抑制人類IL_6能力之含量來改良。原 熟習技藝者可進行以下描述之功能性試驗確定該活性之維 持’例如變異區具有與序列辨識號碼：7_8變異區約5〇%至 本紙張尺度適用中因因家標準(CNS)A4規格（2丨0x297公龙） 1329019 A7 B7 五、發明說明（， 約100%之同一性。在一較佳具體實施例變異區具有與序 列辨識號碼：7-8變異區約80%至約100%之同一性。在一更 佳具體實施例t，變異區具有與序列辨識號碼：7-8變異區約 90%至約100%之同一性。在一最佳具體實施例中，變異區具 5 有與序列辨識號碼：1 -6 CDRs約100%之同一性。 為了方便起見’在此採用Kabat等人的編號設計，殘基係 如所需地以較低數字或連字號命名以使本序列符合標準 . Kabat編號序列。 根據本發明之CDR-移植或人化抗體，其中CLB-8抗體 10 之CDR區係與人類區域組合，殘基可能於fr區中保留，其 係親代抗體（例如CLB-8)特異性的，亦可能保留已證實在 人φ或其他抗體中重要的殘基。遵循前述概要以支持抗體同 時極大人化時CDRs形成抗原連結位置所需量。 來自鼠類單株抗體CLB-8和人類抗體之個別重鏈變異區 15 胺基酸序列係示於以下實例2。 來自鼠類單株抗體CLB-8和人類抗體之個別嵌合輕鍵變 異區胺基酸序列亦示於實例2。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 包含來自鼠類CLB-8抗體變異區之嵌合抗體根據本發明 已證實在IL-6連結上係與鼠類單株抗體Clb-8同樣专用。 20 用於遺傳工程或人化非人類或人類抗體之方法係可在技 藝中使用且熟知’一般而言，人化或遺傳工程抗體具有一或 多個非人類來源（例如但不限於小鼠、大鼠'兔子、非人類 靈長類或其他哺乳類）之胺基酸殘基，該等人類胺基酸時常 稱作"引入（import)"殘基，其一般係由已知人類序列"引入" 22 1329019 A7 B7 五、發明說明（/) 的變異、不變或其他區域取得，已知的人類Ig序列係揭示於 例如 www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi ' www.atcc.org/phage/hdb_html www.abcam.com/ ' onlinecomp.html 、 /researchtools.html 、 de/SDAT/IT.html 、 immunology/CH05/kuby05.htm 12429/1mmune/Antibody.html、 10 1996/vlab/ 、www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html 、 www.antibodyrsource.com/ 、 mcb. Harvard.edu/BioLinks/ Immunology.html.www.immunologylink.com/、pathbox.wustl. edu/~hcenter/index.html 'www.biotech.ufl.edu/~hclAwww.pebio. com/pa/340913/340913.html 、 www.nal.usda.gov/awic/ 15 pubs/antibody/、www.rn.ehime-u.acjp/~yasuhito/Elisa.html、 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 www.sciquest.com/ 、 ww.antibodyresource.com/ v. public.Iastate.edu/~pedro www.mgen. uniheidelberg. www.whfreeman.com/ ^ww.library.thinkquest.org/ w. hhmi.org/ grants/lectures/ www.biodesign.com/table.asp 、 www.icnet.uk/axp/facs/ davies/links.html、www.biotech.ufl.edu/~fccl/protocol.html、 www.isac-net.org/sites—geo.htm 卜 aximt. imt.uni-marburg.de/〜rek / AEPStart.html 、 baserv.uci.kun.nl/~jraats/linksl .html 、
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Dept.Health (1983))在此係以引用的方式完整併入。 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 該等引入序列可用於降低免疫性或降低、增強或改良技 10藝中已知的連結、親和性 '上速、下速 '抗體親抗原性、特 異性、半生期或任何其他合適的特性。一般而言，當變異和 不彎區之非人類序列以人類或其他胺基酸置換時，部分或所 肴的非人類或人類CDR序列可以維持。抗體亦可選擇性地保 曾對抗原高度親和性及其他有利生物特性地人化，為了達到 15該目標，人化抗體可選擇性地利用親帶和人化序列三度空間 模式分析親代序列及多種概念人化產物之方法來製備，三度 空間免疫球蛋白模式係一般常用，且為熟習技藝者所熟悉。 可使用描述及顯示篩選候選免疫球蛋白序列可能三度空間構 形結構之電腦程式，觀察該等顯示可分析殘基在候選—免疫球 2〇蛋白序列功能中可能的角色，亦即分析會影響候選免疫球蛋 自與其抗原連結能力之殘基，以此方式可由—致且重要的序 幻中篩選並合併FR殘基，如此可達到預期抗體特性，像是增 加對目她权親和性。—般而言，CDR殘基係直接且最充 | /7地參與辟抗料結。本發軌體之人域料工程可利 _____ 24 ΐ紙張尺度適財家棵準(_CNS)A4規格（加χ297公^------ 1329019 A7 B7 五、發明說明（β) 10 15 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 20 用任何已知方法來進行，像是但不限於該等Winter (Jones等 人，自然雜諸321 : 522 (1986) ; Riechmann等人，自然雜誌、 332 : 323 ( 1988) ; Verhoeyen 等人，科學雜誌 239 : 1534 (1988))、Sims 等人，免疫學雜誌 151 :2296(1993)、Chothia 和Lesk，分子生物學雜誌196 :901 (1987)'Carter等人，卩|*〇〇· Natl. Acad. Sci. U.S.A· 89 : 4285 (1992)、Presta 等人，免疫學 雜誌 151 : 2623 (1993)、美國專利案第 5723323、5976862、 5824514、5817483、5814476、5763192、5723323、5766886、 5714352、6204023、6180370、5693762、5530101、5585089 ' 5225539、4816567 號、PCT/ : US98/16280、US96/18978、 US91/09630、US91/05939、US94/01234、GB89/01334、 GB91/01134、GB92/01755、WO90/14443 ' WO90/14424、 W090/14430、EP 229246中描述者’在此係分別完整地以引 用的方式併入，包括其中引用的參考文獻。 本發明嵌合抗體之人類不變區可以係任何種類（IgG、 IgA ' IgM、IgE、IgD等）或同型，且可包含<或人輕鏈。在一 具體實施例中’人類不變區可包含IgG重鏈或限定片段，例 如IgGl、IgG2、Ig〇3或IgG4至少一種同型。在另一具體實 施例中，抗人類IL-6人類抗體包含IgGl重鍵和igGi κ輕鏈。 本發明之分離抗IL-6抗體包含此處揭示任何同樣適當聚核苷 酸編碼之抗體胺基酸序列，抗體或抗原連結片段與人類几_6 連結且藉此部份或充分中和蛋白質至少一種生物活性係較 佳。cCLp-8抗體或其特定部分或變異體可部份或充分（較佳） 中和至少一種IL-6蛋白質或片段之至少一種生物活性，且藉 25 本紙張尺度適用中國國家標準(CMS)A4規格（210x297公釐） I Φ i 計 線 1329019 A7 B7 五、發明說明（7¾ 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 此抑制經由IL-6與IL-6受體連結或經由其他IL_6取決或媒 介機制之活性。在此所使用的"中和抗體"一詞係指可抑制大約 20-120% IL-6取決活性之抗體，取決於試驗至少約1〇、2〇、30、40、50、55 ' 60'65、70、75、80、85、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100% 或更高較佳。抗 IL_6 抗體抑制1L-6取決活性之能力利用至少一種此處描述和/或技 藝中已知之適當IL-6蛋白質或受體試驗來評估係較佳。 本發明至少一種抗體可與CLB-8抗體連結之至少一種 IL-ό蛋白質、副單位 '片段 '部位或其任何組合至少一種特 異性特定抗原決定位連結，該至少一種抗原決定位可包含至 少一種含有至少一種蛋白質部位之抗體連結區域，該抗原決 定位，，包含至少一種蛋白質細胞外、可溶、親水性、外部或細 皰質部位係較佳。一般而言，本發明之人類抗體或抗原連結 片段會包含含有至少一種序列辨識號碼1、2和3人類互補決 定區域（CDR1、CDR2和CDR3)或至少一種重鏈變異區變 異體以及至少一種人類互補決定區域（CDR4、CDR5和 CDR6)(序列辨識號碼4、5和6)或至少一種輕鏈變異區變 異體之抗原連結區域。作為非限制性的實例，抗體或抗原連 結部位或變異體可包含至少一種具有序列辨識號碼：3胺基酸 序列之重鏈CDR3和/或具有序列辨識號碼：6胺基酸序列之 輕鏈CDR3。在一特定具體實施例中，抗體或抗原連結片段可 具有包含至少一種重鏈CDR(亦即CDIU、CDR2和/或CDR3 ) 至少一個部位具有相對的CDR 1、2和/或3胺基酸序列（例 如序列辨識號碼：1、2和/或3)之抗原連結區域。在另一特 26 裝 計 線 本紙張尺度適用t國國家標準(CNS)A4規格（210x297公;*) 1329019 A7 五 '發明說明（?r) 定具體實施例中，抗體或抗原連結部位或變異體可具有包含 至少一種輕鏈CDR (亦即CDR4、CDR5和/或CDR6)至少 一個部位具有相當的CDR 4'5和/或6胺基酸序列（例如序 列辨識號碼：4、5和/或6)之抗原連結區域。在一較佳具體 5實施例中’抗體或抗原連結片段之三個重鏈CDR和三個輕鏈 CDR具有至少一種如此處描述之cCLB_8單株抗體、嵌合抗 IL-6單株抗體相對CDR胺基酸序列。該等抗體可利用傳統技 術化學連結抗體之不同部位(例如CDR支架）、利用重組DNa 技術之傳統技術製備及表現一或多種抗體編碼核酸分子，或 10利用任何其他適當方法和利用任何會導致發明聚胜肽（例如 序列辨識號碼：15或16)表現之可能多餘密碼子來製備。 可與人類IL-6連結且包含限定重或輕鏈變異區或CDR區 之抗體可利用適當方法像是噬菌體表現（Katsube，Y·等人，int J Mol. Med，1 (5) : 863-868 (1998))或使用技藝中已知和/ 15或此處描述之轉殖動物方法來製備，例如，抗體、特定部分 或變異體可在適當宿主細胞中利用編碼核酸或其部位來表 現。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 如同陳述’本發明亦關於包含序列與此處描述胺基酸序 列充分相同胺基酸之抗體、抗原連結片段、免疫球蛋白鏈和 20 CDR ’該等抗IL_6抗體可包括來自天然突變或人類操縱此處 特定之一或多個胺基酸取代'刪除或加入。該等抗體或抗原 連結片段和包含該鏈或CDR之抗體可以高度親和性（例如 KD低於或等於約ΗΓ9莫耳濃度）與人類IL_6連結係較佳。與 此處描述序列充分相同之胺基酸序列包括含有保守胺基酸取 27 本紙張尺度適用中國固家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 五、發明說明（/) 代、以及胺基酸刪除和/或插入之序列。保守胺基酸取代係指 以具有與第一個胺基酸相似化學和/或物理特性（例如電荷、 結構、極性、疏水性/親水性）之第二個胺基酸置換第一個胺 基酸。保守取代包括在以下族群内以另一者置換一胺基酸： 5離胺酸（*〇、精胺酸（R)和組織胺酸（H);天冬胺酸（D) 和穀胺酸（E);天冬醯胺（N)、榖胺醯胺（Q)、絲胺酸（S)、 棘胺8夂（7')、赂胺酸（丫）、{^、尺、{*1、0和丑；丙胺酸（八）、 織胺酸（V)、亮胺酸（L)、異亮胺酸（[)、脯胺酸（p)、苯 丙胺酸（F)、白胺酸（w)、甲硫胺酸（M)、半胱胺酸（C) 10 和甘胺酸（G) ; F、W和Y ; C、S和T。 當然’熟習技藝者對胺基酸取代之數目會取決於許多因 ，子’包括該等上述者。一般而言，任何已知抗IL_6抗體、片 段或變異體胺基酸取代、插入或刪除之數目不會多於4〇、3〇、 20、19、18 ' 17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、 15 6'5'4、3、2、卜像是丨-3〇或如此處特定其中任何範圍或 值。 本發明抗IL-6抗體中對功能必須之胺基酸可以技藝中已 知之方法來辨識’像是針對位置突變生成或丙胺酸掃描突變 生成（例如Ausube卜上述，第8、15章；Cunningham和~Wdls， 20科學雜遠' 244 : 1081-〗〇85 (1989))。後者步驟會在分子内每 個殘基處導入單一丙胺酸突變，之後測試最終突變分子之生 物活性，像是但不限於至少一種IL-6中和活性。抗體連結之 重要位置亦可利用結構分析像是結晶法、核磁共振或光親和 性標記來辨識（Smith等人，分子生物學雜誌224 : 899-904 1329019 A7 B7 五、發明說明（4) (1992)和 deVos 等人，科學雜誌 255 : 3〇6·3ι2 (1992乃。 本發明之抗IL-6抗體可包括但不限於選自序列辨識號 碼：卜2、3、4、5、6至少-種之5至所有鄰近胺基酸至少 一個部位、序列或組合物。 5 一抗1L-6抗體可再選擇性地包含序列辨識號碼：7、8至 少一種之至少一種70-100%鄰近胺基酸之聚胜狀。 在一具體實施例中，免疫球蛋白鍵或其部位（例如變異 區’ CDR)之胺基酸序列具有與序列辨識號碼：7、8至少一 種相對鏈胺基酸序列大約70-100%同一性（例如7〇、71、72、 10 73、74、75、76、77、78、79、80'81、82、83、84、85、 86、87、88、89、90、91 ' 92、93、94、95、96、97、98、 99、1〇〇或其中任何範圍或值）’例如，輕鏈變異區胺基酸序 列可與序列辨識號碼：8序列比較，或重鍵CDR3胺基酸序列 可與序列辨識號碼.7比較’利用技藝中已知之適當電腦，;當算 15 法確定之70-100%胺基酸同一性（亦即90'9卜92、93、94、 95、96'97、98、99、100或其中任何範圍或值）係較佳。 經濟部智慧財產局貝工消费合作社印製 典型的重鏈和輕鏈變異區序列係於序列辨識號碼：7、8 中提供，本發明之抗體或其特定變異體可包含任何數目來自 本發明抗體之鄰近胺基酸殘基，其中該數目係選自抗汜_6抗 20體中1〇_1〇〇%鄰近殘基數目組成整數之群。該隨後之鄰近胺 基酸長度係選擇性地至少約10、20、30、40、50、60、70、 80 ' 90、1〇〇、11〇、120、130、140、150、160、170、18〇、 190、200'210、220、230'240、250 或更多胺基酸，或其中 任何範圍或值。此外，該等隨後者之數目可以係選自1至2〇 29 本纸張尺度適用令國國家株準(CNS)A4規格（2丨Οχ297公釐） 1329019 三、發明說明'·’ 組成之群之任何整數’像是至少2、3、4或5。 正如該等熟習者同意的，本發明包括至少一種本發明之 生物活性抗體，生物活性抗體具有原始（非合成）、内源性或 相關且已知抗體至少20% ' 30%或40%之特定活性，且至少 5 50%、60% 或 70% 較佳，且至少 80%、90% 或 95% -1000% 最佳。分析及定量測量酵素活性及受質特異性之方法係為熟 習技藝者所熟知。 在另一態樣中，本發明係關於如此處描述之人類抗體及 抗原連結片段，其係以共價連結有機分子部位來改良，該等 ίο改良可產生具有增加藥物動力特性（例如增加活體内血清半 生期）之抗體或抗原連結片段。有機分子部位可以係直鍵或 支碑親水性聚合基、脂肪酸基或脂肪酸酷基。在一特定具體 '實施例中’親水性聚合基可具有約800至約120,000道耳吞之 分子量’且可係聚鏈烷二醇（例如聚乙二醇（PEG)、聚丙二 15醇（PPG)) '碳水聚合物、胺基酸聚合物或聚乙烯吡咯酮， 且脂肪酸或脂肪酸醋基可包含約8至約40個碳原子。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印焚 本發明之改良的抗體和抗原連結片段可包含一或多個與 抗體直接或間接共價連結之有機分子部位，與本發明抗體或 抗原連結片段連結之各個有機分子部位可分別係親水性聚合 20基、脂肪酸基或脂肪酸酯基。此處使用之"脂肪酸"一詞係包含 單羧酸和二羧酸，此處使用之"親水牲聚合基〃一詞係指可溶於 水甚於辛烷之有機聚合物，例如聚離胺酸係可溶於水甚於辛 烷，因此以共價連結離胺酸改良抗體係為本發明所包含。適 用於改良本發明抗體之親水性聚合物可以係直鏈或支鍵，且 _________30 _ 夂紙;Ή Ή用·? 33¾¾ ^(CNS)A4 .¾ *& ·. ： I 〇 χ ：97 ^ « ) ---- 1329019 Λ7 B7 五、發明說明（巧） 包括例如聚鏈烷二醇（例如pEG、單甲氧基_聚乙二醇 (mPEG)、PPG及其相似物）、碳水化合物（例如糊精、纖維 素、寡醣、聚醣及其相似物）' 親水性胺基酸聚合物（例如聚 離胺酸、聚精胺酸、聚天冬胺酸及其相似物）、聚鏈烷氧化物 5 (例如聚氧乙烯、聚氧丙烯及其相似物）和聚乙烯吡咯酮。 改良本發明抗體之親水性聚合物具有約8〇〇至約15〇 〇〇〇道耳 吞之分子量作為分離分子實體係較佳，例如可使用pEG5〇〇〇 和PEG^ooo，其中下標係聚合物平均分子量道耳吞，親和性 聚合基可以1至大約6個烷基'脂肪酸或脂肪酸酯基取代使 10用適當方法來製備，例如包含胺基之聚合物可與脂肪酸或脂 肪酸酯的羧酸鹽偶合，且脂肪酸或脂肪酸酯上活化的羧酸鹽 (例如以N，N-羰基二咪唑）可與聚合物上的羥基偶合。 適用於改良本發明抗體之脂肪酸和脂肪酸酯可以係飽和 或可包含一或多個未飽和單位，適用於改良本發明抗體之脂 15肪酸包括例如n_十二_ ( Ci2，月桂酸醋）、时四酸醋（， 肉蓋謹酸醋）、η-十八酸醋（Ci8，硬脂酸酯）、^二十酸醋（C2〇， 花生酸酯）' n-二十二酸酯（C22，蘿酸酯）' 〇_三十酸酯（C3〇)、 η-四十酸g旨（C4Q)、順式_Δ9·十人(Ci8，油酸醋）、所有 經濟部智慧財產局員工消f合作社印製 順式-△5,8，11，14-二十酸酯（(：2()，花生四烯酸酯）、栓酸、十 20四酸二酸、十八酸二酸、二十二酸二酸及其相似物。合適的 脂肪酸酯包括含有直鏈或支鏈較低烷基之二羧酸單酯 ，較低 烧基可包含1至大約12個碳原子，丨至大約6個較佳。 改良的人類抗體和抗原連結片段可利用適當方法像是以 一或多種改良劑反應來製備，此處使用的”改良劑"一詞係指包 本紙張尺度適用中a國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） 1329019 A7 B7 五、發明說明（？e) 含活化基之適當有機基（例如親水性聚合物、脂肪酸、脂肪 酸酯）’"活化基"係可在適當條件下與第二化學基反應藉以在 改良劑和第二化學基間形成共價鍵之化學分子部位或官能 基，例如胺類反應活化基包括親電子基像是甲苯績酸鹽、甲 5 基績酸鹽、鹵素（氯、溴、氟'蛾）、N-羥基破珀醯亞胺酯（NHS ) 及其相似物。可與硫醇反應之活化基包括例如順-丁烯二酸亞 胺' 碘乙基、丙烯醇基、吡啶二硫化物、5-硫醇-2-硝基苯甲 酸硫醇（TNB-硫醇）及其相似物。醛類官能基可與胺類或醯 肼包含分子偶合，且疊氮化物基可與三價亞磷基反應而形成 10磷酸胺鹽或磷酸亞胺連結。將活化基導入分子内之合適方法 係技藝中已知（參考例如Hermanson，G. T.，历occwywgee 糾es·，Academic Press: San Diego, CA (1996)) ’ 活化基 可直接與有機基（例如親水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯）， 或藉由連結分子部位例如二價CrC〗2基連結，其中一或多個 15碳原子可以異原子像是氧 '氮或硫取代。合適的連結分子部 位包括例如四乙二醇、_(ch2)3-、-nh-(ch2)6-nh-、-(ch2)2-nh- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 和-CH2-aCH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH-NH-。包含連結分子部 位之改良劑可例如以單_8〇(>烷基二胺（例如單_B〇c·乙烯二 胺、單-Boc•二胺基己胺）與脂肪酸在1·乙基-3-(3-二甲基胺基 20丙基)碳二酿胺（EDC)存在下反應而產生游離胺類和脂肪酸 缓酸鹽間的胺鏈來製造。8沉保護基可利用三氟乙酸（TFA) 處理由產物上移除而暴露一級胺類，其可如所述與另一羧酸 鹽偶合或可與順-丁烯二酸針反應，且可環化最終產物而產 生脂肪酸活性順·丁烯二酸亞胺衍生物（參考例如 32 本紙張尺度適用中國國象樣準(CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） 1329019 A7 經濟部智慧財產局員工消费合作社印裝 五、發明說明0丨） 等人的WO 92/16221 ’其完整的教導在此係以引用的方式併 入）。 本發明之改良抗體可以人類抗體或抗原連結片段與改良 劑反應而產生’例如有機分子部位可以非位置特定方式使用 胺類反應改良劑（例如PEG NHS酯）與抗體連結，改良的人 類抗體或抗原連結片段亦可以還原抗體或抗原連結片段之雙 硫鍵（例如鏈内雙硫鍵）來製備’之後’還原的抗體或抗原 連結片段可與硫醇反應改良劑反應而產生本發明之改良抗 體。包含與本發明抗體特定位置連結有機分子部位之改良人 類抗體和抗原連結片段可使用適當方法來製備，像是逆向蛋 白分解（Fisch 等人，历C/ze/77·, 3: 147-153 ( 1992); Werlen 等人，历5:411417 (1994) ; Kumaran 等人，Pr她m 6( 10 ): 2233-2241 (1997 ); Itoh 等人，历0听· 24( 1》59·68( 1996);CaPellas 等人，肠攸/2磁所卿g.， 56(4):456_463( 1997))’ 以及 Hermanson, G. T.在 Bioconjugate Techniques (Academic Press: San Diego, CA (1996))中描述 之方法。 本發明之抗體可以廣泛範圍之親和性（KD)與人類丨l-6 連結，在一較佳具體實施例_，本發明至少一種人類單株抗 體可選擇性地與人類IL-6以高度親和性連結，例如單株抗體 可與人類IL-6以KD相等或低於約1〇·7莫耳濃度連結，像是但 不限制為0.1-9.9 (或其中任何範圍或值）χ 1〇-7、1〇·8、1〇-9 ' 1〇-10、ΙΟ·11、1〇12、1〇-ι3或其中任何範圍或值。 抗體對抗原之親和性或抗體親抗原性可使用任何適當方 15 20 i 計 線 33 五、發明說明（p) 法來實驗性確定（參考例如Berzofsky等人在基礎免疫學中的 抗體-抗原交互作用，，（Paul，W. E.編輯，Raven Press :紐約， 紐約（1984)) ; Kuby，《/awi /麵麵/卿，W. H. Freeman and
Company :紐約，紐約（1992)，以及此處描述之方法）。若 5在不同條件下（例如鹽類濃度、St驗值）測量，特定抗體·抗 原交互作用測量出的親和性會不同，因此，親和性和其他抗 原連結參數（例如KD、Ka、Kd)之測量係以抗體和抗原標準 •彡谷液以及標準緩衝液像是此處描述之緩衝液來操作較佳。 可用於本發明方法及組合物中抗IL-6 cCLB-8抗體之特 10性為可高度親和性地與IL-6連結，選擇性且較佳地具有低毒 性。特疋而§，其中單獨成分像是變異區、不變區和支架單 獨_/或共同，選擇性且較佳地具有低免疫性之本發明抗體、 特疋片#又或變異體可用於本發明中。可用於發明中之抗體儀 選擇性地具有可測量減輕症狀與低和/或可接受毒性可長期治 15療病患能力之特性。低或可接受免疫性和/或高度親和性以及 其他合適特性可促進達到的治療結果，"低免疫性"在此係定義 為接受治療病患提升顯著的HAHA'HACA或HAMA反應低 於大約75%，或低於大約50%較佳’和/或在接受治療病患中 k升低力價（以雙重抗原酵素免疫試驗測量係低於約3〇〇，低 2〇 於约 100 較佳）（Elliott 等人，: 1125-1127 ( 1994 )， 在此係以引用的方式完整併入）。 當cCLB-8與其他il-6特定抗體CLB.IL-6/14和 CLB.IL-6/16相比較時，可看出抗體親和性和抗原決定位特異 性之不同特性。可與IL-6連結且一般可阻斷IL_6及其受體間 34 Λ7 五、發明說明（衫) ' 交互作用之抗體cCLB-8如同IL-6決定7TD1細胞增殖生物 性試驗和IL-6與IL_6受體連結Luminex基礎試驗中描述可抑 制將近100% IL-6的功能。相反地，可與IL_6連結但以立體 阻礙IL-6/IL-6R複合物間交互作用及即13〇訊息成分而中和 5之抗體CLB.丨L-6/16僅可抑制62%連結生物素-IL-6。最後， 與1L-6連結但不干擾其生物活性之抗體如CLB.IL-6/14不具 有生物素-IL>6與固相siL_6R/gp80連結之抑制。 雙重特異性、相異特異性、相異接合性或相似抗體（其 係具有至少二種不同抗原連結特異性之單株人化抗體）亦可 10使用’在本例子中，連結特異性之一係針對至少一種IL-6蛋 白質，另一係針對任何其他抗原。產生雙重特異性抗體之方 法係技藝中已知，傳統上，重組產生雙重特異性抗體係以共 同表現二個免疫球蛋白重鍵_輕鍵對為基礎，其中二個重鏈具 有不同的特異性（Milstein和Cuello，自然雜誌、305 : 537 15 ( 1983 ))。由於免疫球蛋白重和輕鏈之隨機組合，其融合瘤 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 (四合瘤）可能產生10種不同抗體分子之混合物，其中僅有 一個具有正確的雙重結構。正確分子之純化通常以親和性層 析步驟來完成，其係較為不便且產物產量低，相似的步驟係
揭示於例如WO 93/08829、美國專利案第6210668、6193967、 20 6132992、6106833、6060285、6037453、6010902、5989530、 5959084、5959083、5932448、5833985、5821333、5807706、 5643759、5601819、5582996、5496549、4676980 號、WO 91/00360、WO 92/00373、EP 03089、Traunecker 等人的 EMBO J. 10:3655(1991)、SureSh 等人的酵素學方法 121:2i〇(1986) 35 1329019 A7 五、發明說明 中，其在此係分別以引用的方式完整併入。 核酸分子 70-100%鄰近胺基 8至少一種之核苷 使用此處h供之資料’像是編碼至少 酸序列辨識號碼：1、2、3、4、5、6、7、 5 酸序列、特定片段、變異體或其—致序列，或包含至少一種 該等序列之放置載體，編碼至少—種eCLB_8抗IL_6抗體之 本發明核酸分子可利用此處描述或技藝中已知之方法來得 到。 本發明之核酸分子可係RNA型，像是mRNA、、 10 tRNA或任何其他型’或DNA型，包括但不限於以選殖得到 或合成或其任何組合產生之cDNA和基因體DNA。DNA可 係5股、雙股或單股或其任何組合。DNA或RNA至少一股 之任何部位可係編碼股，亦已知為意義股，或其可係非編碼 股，亦稱作反義股。 15 本發明之分離核酸分子可包括含有開啟讀碼框（ORF) 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 -5 社 印 製 選擇性地具有一或多個插入序列例如但不限於至少一種重鏈 (例如序列辨識號碼：1_3)或輕鏈（例如序列辨識號碼：4·6) 至少一種CDR (如CDIU、CDR2和/或CDR3)至少一個特 定部分之核酸分子、包含抗IL-6抗體或變異區編碼序fj (例 20如序列辨識號碼或16)之核酸分子，以及包含本質上不 同於該等上述但由於遺傳密碼簡併性且仍可編碼至少一種此 處描述和/或技藝中已知抗丨L-6抗體之核苷酸序列核酸分子， 當然’遺傳密碼係技藝中熟知。因此，熟習技藝者會常規地 產生該等編碼本發明特定抗几_6抗體之簡併核酸變異體（參
1329019 A7 五、發明說明（3。 考例如上述Ausube丨等人），且該等核酸變異體係包含於本發 明t。本發明分離核酸分子之非限制性實例包括序列辨識號 碼：9-16 ’其分別相當於非限制性實例HC CDR卜HC CDR2、 HC CDR3、LC CDR卜 LC CDR2、LC CDR3、HC 變異區和 5 LC變異區之編碼核酸。 在此表示之本發明包含抗IL-6抗體編碼核酸之核酸分子 可包括但不限於該等編碼本身抗體片段之胺基酸序列者；完 整抗體或其部位之編碼序列；抗體、片段或部位之編碼序列， 以及其他序列像是至少一種訊息引導物或融合胜肽之編碼序 10列，其具有或不具上述之其他編碼序列像是至少一種插入序 列’以及其他非編碼序列包括但不限於非編碼5,和3,序列像 是在轉錄、mRNA處理（包括粘接和聚腺苷酸化作用訊息例 如核糖體連結和mRNA穩定性）中扮演重要角色的轉錄非轉 譯性序列；可編碼其他胺基酸（像是提供其他功能性者）之 15其他編碼序列。因此，編碼抗體之序列可與標記序列（像是 可增進包含抗體片段或部位之融合抗體純化之胜肽編碼序 列）融合。 經濟部智慧財產局具工消費合作社印製 如此處描述可選擇性地與聚核芽酸雜交之聚核苷酸 20 本發明係提供可在選擇雜交條件下與此處揭示之聚核穿 酸雜交之分離核酸，因此，該具體實施例中的聚核芽酸可用 於分離 '偵測和/或定量包含該等聚核苷酸之核酸。例如，本 發明之聚核Ϊ酸可用於在貯存庫中辨識、分離或增量部份或 全長株落。在某些具體實施例中，聚核苷酸係分離或者互補 37 本紙張尺度適用中固國家標準(CNS)A4規格（2丨0x297公釐） ^329019 A7 五、發明說明（此） 於來自人類或哺乳類核酸庫cDNA之基因體或cDNA序列。 cDNA庫包含至少80%全長序列較佳，至少85%或90% 全長序列較佳，且至少95%全長序列更佳。cdNA庫可標準 化以增加表現稀少序列，低或中度嚴格雜交條件係典型但非 5 唯一的使用具有相對於互補序列降低序列同一性之序列，中 度和高度嚴格條件可選擇性地用於較高同一*f生之序列，低嚴 格條件可讓具有約70%序列同一性之序列選擇性地雜交，且 可用於辨識同源（orthologous)或形似（paralogous)序列。 本發明之聚核；酸可選擇性地以此處描述之聚核甘酸編 10 碼至少一個抗體部位，本發明之聚核苷酸包含可用於選擇性 地與本發明抗體編碼聚核苷g复雜交之核酸序列，參考例如上 述^usube卜上述Colligan ’其在此係分別完整地以引用的方 ’式併入。 15構築核酸 本發明之分離核酸可利用技藝中熟知之（a)重組方法、 (b)合成技術、（c)純化技術或其組合產生。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 核酸可便利地包含本發明聚核苷酸以外之序列，例如核 酸可插入包含一或多個内切核酸酶限制位置之多個選瘦位置 20以輔助聚核芽酸之分離，可轉譯的序詢亦可插入以辅助本發 明之轉譯聚核芬酸的分離，例如，6個組織胺酸標記序列可提 供便利之方法以純化本發明之蛋白質。除編碼序列外之本發 明核酸係選擇性地用於選殖和/或表現本發明聚核甘酸之載 體、接合體或連結體。 38 1329019 Λ 7 Β7 五、發明說明（❸ 其他序列可加入該等選殖和/或表現序列以在選殖和/或 表現中極佳化其功能、辅助分離聚核苷酸或增進聚核苷酸導 入細胞。選殖載體、表現載體、接合體和連結體之用途係技 藝中所熟知（參考例如上述Ausubel或上述Sambrook)。 5 用於構築核酸之重组方法 本發明之分離核酸組合物像是RNA、cDNA、基因體DNA 或其任何組合可由生物來源使用幾個熟習技藝者已知之選殖 方法得到。在某些具體實施例中，可在嚴格條件下與本發明 10聚核苷酸選擇性地雜交之寡核苷酸探針係用於在cDNA或基 因體DNA庫中辨識預期序列。rnA的分離以及cDNA與基 因體庫之構築係原熟習技藝者所熟知（參考例如上述Ausubd 或上述 Sambrook)。 15 核酸篩選與分離方法 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 cDNA或基因體庫可根據本發明之聚核苷酸序列像是此 處揭示者使用探針來篩選，探針可用於與基因體DNA或 cDNA序列雜交於相同或不同的有機體内分離同源基因，熟 習技藝者會同意試驗中可使用不同程度嚴格的雜交，且雜交 20或清洗液皆可係嚴格的。當雜交條件變的更嚴格時，探針和 目標間的互補程度必須更高以用於產生雙重形成。嚴格程度 係以一或多種溫度、離子強度、酸鹼值和部分變性溶劑像是 甲醯胺之存在來控制，例如，雜交之嚴格性可便利地藉由例 如在0%至50%範圍内控制甲醯胺濃度以改變反應溶液之極 39 本纸張尺度適用中囤國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） 1329019 A7 B7 五、發明說明（3¾ 性而有所不同。偵測性連結所需之互補程度（序列同一性） 可依據雜交液和/或清洗液之嚴格性而不同，互補程度最好係 100% ’或70-100%或其中任何範圍或值。然而應了解的是 在探針和引子中輕微的序列變異性可利用降低雜交和/或清洗 5 液之嚴格性來補償。 增量RNA或DNA之方法係技藝中所熟知，且可根據本 發明而不需過度實驗且依據此處呈現之教導和指導來使用。 DNA或RNA增量之已知方法包括但不限於聚合酶連鎖 反應（PCR)和相關增量方法（參考例如美國專利案Mums 10 等人的第 4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965，188 號、Tabor 等人的第 4,795,699 和 4,921,794 號、Innis 的第 5,142,033 號、 Wil^jn 等人的第 5，122,464 號、Innis 的第 5,091，310 號、 Gyllensten 等人的第 5,〇66,584 號、Gelfand 等人的第 4,889,818 號.、Silver 等人的第 4,994,37〇 號、Biswas 的 4,766,067 號、 15幻叩〇1(1的4,656，134號）’以及使用目標序列反義RNA作為 雙股DNA合成模板之RNA媒介增量法（美國專利案第 5，130,238號’ Malek等人’商標名NASBA)，參考文獻之完 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 内谷在此係以引用的方式併入（參考例如上述Augube丨或 上述 Sambrook)。 20 舉例而言’聚合酶連鎖反應（PCR)技術可用於增量本發 明之聚核苷酸序列以及直接來自基因體DNA或cDNA庫之相 關基因。PCR及其他活體外增量方法亦可用於例如選殖編碼 表現蛋白質之核酸序列、產生在檢體中用於偵測預期mRNA 存在作為探針之核酸、用於核酸定序，或用於其他目的。藉 40 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公楚） 1329019 A7 B7 五、發明說明（β) 由活體外增量方法足以引導熟習者之技術實例可在上述 Berger、上述Sambrook和上述Ausubel以及Mullis等人的美 國專利案第 4,683,202 號（1987)和 Innis 等人的 PCRProcotols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., 5 San Diego, CA ( 1990)中發現。用於基因體PCR增量之市售 可得套組係技藝中已知（參考例如Advantage-GC Genomic PCR Kit(Clontech ))，此外，例如 T4 基因 32 蛋白質（Boehringer Mannheim)可用於增加長PCR產物之產量。 10用於構築核睃之合成方法 本發明之分離核酸亦可以已知方法直接化學合成來製備 (參考例如上述Ausubel等人）’化學合成一般可產生單股寡 核苷酸，其可以互補序列利用雜交，或使用單股作為模板以 DNA聚合酶聚合化轉換為雙股DNAe熟習技藝者將理解的 15是當DNA化學合成限制於大約1〇〇或更多鹼基之序列，可利 用連接較短序列而得到較長的序列。 重组表現卡帶 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 本發明另提供包含本發明核酸之重組表現卡帶本發明 2〇之核酸序列例如編碼本發明抗體之cDNA或基因體序列可用 於構築重絲現娜，其可導人至少—_触主細胞。重 且表現卡0JT-般包含可與職宿主細胞㈣導雜讀轉錄 之轉錄起始靖相連結之本發㈣酸麟和非異源 (例如内源性）啟動子皆可麟引導本發明核酸 。 41 1329019 A7 87 五、發明說明（約 在某些具體實施例中’用作啟動子、強化子或其他元素 之分離核酸可導入本發明非異源型聚核苷酸之適當位置（上 游、下游或插入序列），如此正或負調節本發明聚核苷酸之表 現，例如，内源性啟動子可在活體内或活體外以突變、刪除 5 和/或取代來改變。 15 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 费 合 作 社 印 製 20 載體和宿主細胞 本發明亦關於包括本發明分離核酸分子之載體、以重組 載體遺傳工程產生之宿主細胞，以及以技藝中熟知之重組技 術產生至少一種抗IL-6抗體（參考例如上述以响⑺冰等人， 上述Ausubel等人，其在此係分別以引用的方式完整併入）。 聚核Ϊ酸可選擇性地與包含篩選標記之載體連結以在宿 主中繁殖’一般而言，質體載體可於沉澱物像是磷酸转沉殿 物中或於帶電荷脂質複合物中導入。若載體係病毒，其可於 活體外使Μ當包裝細胞株包裝，且之後料至宿主細胞卜 DNA插入子應有效地與適當啟動子連結，表現構築另可 包含轉錄起始、終止位置，以及在轉錄區中用於轉譯之核糖 體連結位置。構絲現之成祕親碼雜絲適當位於欲 轉# mRNA尾端之起始和终止密碼子（例如UAA、UGA或 UAG)處包括轉譯起始較佳’且UAA和UA(}用於喝乳類或 真核細胞表現係較佳。 表現載體可較佳但選擇性地包括至少一種筛選標記，該 等標圯年括但不限於例如用於真核細胞培養之胺曱喋呤 (MTX) '二氫葉酸鹽還原酶（DHFR，美國專利案第 42 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公 .裝— 4Φ..... 1329019 A7 B7
五、發明說明汉D 4,399,216、4,634,665、4,656，134、4,956,288、5，149,636、 5，179,017號）、安比西靈、新徽素（G418)、分枝酚酸或縠胺 酸合成酶（GS，美國專利案第 5,122,464、5,770,359、5,827,739 號）抗性’以及用於培養大腸桿菌和其他細菌或原核生物之 5四環黴素或安比西靈抗性基因（以上專利在此係以引用的方 式完整併入）。用於上述宿主細胞之適當培養基和條件係技藝 中已知，合適載體對熟習技藝者而言係顯而易見的。將載體 構築導入宿主細胞可以填酸妈轉染法、DEAE-糊精媒介轉 染、陽離子脂質媒介轉染、電衝法、轉導法、感染或其他已 10知方法來執行’該等方法係於技藝中描述，像是上述Sambrook 的 1-4 和 16-18 章、上述 Ausubel 的 1、9 ' 13、15、16 章。 發明至少一種抗體可以改良型像是融合蛋白質表現， 豆不僅包括分泌訊息，亦包括其他的異源功能區，例如，其 他胺基酸區（特別係帶電胺基酸）可加入抗體之N端以增加 15純化期間或之後處理和貯存期間在宿主細胞内的穩定性和持 久性。胜肽分子部位亦可加入本發明抗體中以幫助純化，該 等區域可在最終製備抗體或其至少一個片段之前移除，該等 方法係描述於多個標準實驗室手冊中，像是上述Sambr〇〇k的 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 17-29-17.42 和 18.1-18.74 章、上述 Ausubel 的 16、17_和 18 20 章。 原熟習技藝者在許多編碼本發明蛋白質之核酸表現可用 之表現系統中係有見識的。 或考’本發明之核酸可在宿主細胞内利用開啟（利用處 理）包含編碼本發明抗體内源性DNA之宿主細胞來表現，該 43 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1329019 Α7 Β7 五、發明說明（b) 等方法係技藝中熟知，例如美國專利案第5 580 734、 5,641，67G、5,733,746和5,733,761號中描述者，在此以引用的 方式完整併入。 可用於產生抗體、特定部分或其變異體之細胞培養實例 5係哺乳類細胞，哺乳類細胞系統時常係單層細胞型，雖然哺 乳類細胞懸浮液或生物反應器亦可使用。許多可用於表現完 整糖化蛋白質之適當宿主細胞株已在技藝中發展，且包括 COS-1 (例如 ATCC CRL 1650)、cos-7 (例如 ATCC CRL 1651)、HEK293、BHK21 (例如 ATCC CRL_10)、CHO (例 10 如 ATCC CRL 1610 )和 BSC-1 (例如 ATCC CRL-26 )細胞株、 Cos-7 細胞、CHO 細胞、hqj G2 細胞、P3X63Ag8.653、 SP2/0-Agl4、293細胞、HeLa細胞及其相似物，其可直接由 例如 American Type Culture Collecticm^ Manassas，Va (www.atcc.org)得到。較佳的宿主細胞包括淋巴來源細胞像 15 是骨髓瘤和淋巴瘤細胞’特佳的宿主細胞係P3X63Ag8.653 細胞（ATCC 取得號 CRL-1850)和 SP2/0-Agl4 細胞（ATCC 取得號CRL-1851) ’在一特佳具體實施例中，重組細胞係 P3X63Ag8.653 或 SP2/0-Agl4。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 該等細胞之表現載體可包括一或多種以下表現控制序 2〇 列，像是但不限於複製起點、啟動子（例如晚期或早期SV40 啟動子）、CMV啟動子（美國專利案第5，168,〇62、5,385,839 號）、HSV tk啟動子、pgk (碟酸甘油酸酯激酶）啟動子、EF-1 α啟動子_(美國專利案第5,266,491號）、至少一種人類免疫球 蛋白啟動子、增強子和/或處理訊息位置像是核糖體連結位 44 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 1329019 A7 B7 五、發明說明（〇) 置' RNA切割位置、聚腺苷酸化位置（例如δν40大T Ag 聚A添加位置），以及轉錄末端序列（參考例如上述八出此以 等人、上述Sambrook等人）。其他可用於產生本發明核酸或 蛋白質之細胞係可由例如American Type Culture Colleetion 5 Catalogue of Cell Lines and Hybridoms ( www.atcc.org )或其他 已知或市售來源得知和/或得到。 當使用真核宿主細胞時’聚腺苷酸化或轉錄終止序列一 般係導入載體中，終止序列之實例係來自牛生長荷爾蒙基因 之聚腺苷酸化序列。亦包括轉錄正蜂切割之序列，切割序列 10之實例係來自SV40之VP1插入序列（Sprague等人，J. Virol. 45 : 773-781 (1983))。此外如技藝中已知，可將在宿主細胞 内与制複製之基因序列導入載體中。 產生抗體 15 本發明至少一種抗IL-6抗體如同技藝中所熟知的可選擇 性地以細胞株、混合細胞株、不死細胞或不死細胞株落群產 生。參考例如Ausubel等人編輯的分子生物學現今方法，J〇hn
Wiley&Sons，Inc.，紐約，紐約（1987-2001); Sambrook 等人的 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 分子選殖：實驗室手冊第二版，冷泉港，紐約（1989); Harl〇w 2〇 and Lane，抗體’實驗室手冊，冷泉港，紐約（1989); c〇丨丨igan 等人編輯的免疫學現今方法，J〇hn WUey&s〇ns, Inc，紐約，紐 約（1994-2001); Colligan等人的蛋白質科學現今方法 ，John
Wiley&Sons，紐約，紐約（1997_2〇〇1)，在此係分別以引用的 方式完整併入。 45 本紙張尺度適用中Θ國家標準(CNS)A4規格（2丨〇 X 297公沒） 1329019 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五 '發明說明 在一方法中，融合瘤係以融合合適不死細胞株（例如骨 髓瘤細胞株像是但不限於Sp2/0、Sp2/0-AG14、NSO、NS1、 NS2、AE-卜 L.5、>243、P3X63Ag8.653、Sp2 SA3、Sp2 MAI、 Sp2 SSI、Sp2 SA5、U937、MLA 144、ACT IV、MOLT4、 5 DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH 3T3、 HLeO、MLA 144、NAMAIWA、NEURO 2A 或其相似物，或 異骨趙瘤、其融合產物，或其衍生之任何細胞或融合細胞， 或技藝中已知之任何合適細胞株（參考例如www.atcc.org、 www.lifetech.com)及其相似物）與抗體產生細胞（像是但不 10限於分離或選殖脾臟、週邊血液、淋巴，或其他免疫或B細 胞包含細胞，或表現重或輕鏈不變或變異或支架或CDR序列 如内源性或異源性核酸、如重組或異源性病毒、細菌 '藻類、 原核生物、兩棲類、昆蟲、爬蟲類、魚類、哺乳類、懷#類、 馬類、ovine、山羊、羊、靈長類、真核生物 '基因體DNA、 cDNA、rDNA、粒線體DNA或RNA、葉綠體DNA或抓八、 hnRNA、mRNA、tRNA、單股或三股、雜交及其相似物或其 任何組合之任何其他細胞）來產生（參考例如上述Ausubd 和上述Colligan的免疫學，第2章，在此以引用的方式完整 併入）。 任何其他合適的宿主細胞亦可用於表現異源性或内源性 本發明抗體、其特定片段或變異體之編碼核酸。融合細胞（融 合瘤）或重組細胞可使用篩選培養條件或其他合適已知方法 來分離，並以限制稀釋或細胞挑選或其他已知方法來選殖， 產生具預期特異性抗體之細胞可以適當試驗（例如e^sa) 15 20 46 本纸張尺度適用宁國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 計 線 1329019 Λ7 五、發明說明（么 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 來篩選。 本發明之抗體柯賴至少—種抗IL_6抗 提供轉殖動物或哺乳類像是山羊、牛 · ” 乂文 製備而產生料抗體於其綺巾，轉動物可_已知2 來提供，參相如但秘定於美國專利案第5 82769〇、 5,849,992 ' 4,873,316、5,849,992、5,994,6i6、5 565,362、 5,3〇M89鮮’其在此係分別以引用的方式完整併入。 本發明之抗體另可制至少—觀IL_6抗體編碼核酸以 k供轉瘦植物和培養植物細胞（例如但不限於於草和玉米） 來製備而產生該等抗體、特定部分或變異體於其植物部分或 細胞培養十。作為非限制性的實例，表現重組蛋白質之轉殖 菸菴葉已成功地用於提供大量的重組蛋白質，例如使用誘導 性啟動子（參考例如Cramer等人的Curr. T〇p Micr〇b〇1 Irfummol. 240 : 95-118 (1999)及此處引用的參考文獻）。轉 殖玉米亦已用於以商業製造產量表現具有與其他重組系統中 產生或由天然來源純化相當生物活性之哺乳類蛋白質（參考例如 Hood 等人的 Adv. Exp. Med. Biol. 464 : 127-147 ( 1999) 及此處引用的參考文獻）。抗體包括抗體片段像是單鏈抗體 (scFv’s)亦可由轉殖植物種子包括菸草種子和馬鈴箸塊莖大 量製造（參考例如 Conrad 等人的 Plant Mol. Biol. 38 : 101-109 (1998)及此處引用的參考文獻）。因此，本發明之抗體亦可 根據已知方法使用轉殖植物來產生（參考例如Fischer等人的 Biotechpol. Appl_ Biochem. 30 : 99-108 (1999 年，10 月）、Ma 等人的 Trends Biotechnol. 13 : 522-7 (1995 )' Ma 等人的 Plant 47 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 計 線 1329019 A7 B7 五 '發明說明（4)
Physiol. 109 : 341-6 (1995)、Whitelam 等人的 Bi0Chem. s〇c Trans. 22 : 940-944 (1994)及此處引用的參考文獻，一般亦 可參考但不限定於用於植物表現抗體者，以上參考文獻在此 係分別以引用的方式完整併入）。 5 抗逋純化 抗IL-6抗體可由重組細胞培養利用熟知方法包括但不限 於蛋白質A純化、硫酸録鹽或乙醇沉澱、酸萃取、陰離子或 陽離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水性交互作用層 1〇析法、親和性層析法、羥基磷灰石（hydr〇xylapatite)層析法 和外源凝集素層析法來回收及純化。高效能液相層析法 (H^LC )亦可用於純化（參考例如Coiijg^的免疫學現今 方法或John Wiley&S〇ns的蛋白質科學現今方法，紐約，紐 約（1997-2001)，例如第卜4、6、8、9、1〇章在此係分 15別以引用的方式完整併入）。 本發明之抗體包括天然純化抗體、化學合成步驟產物， 經濟部智慧財產局員工消f合作社印製 以及以重組技術由真核宿主包括例如酵賴、高等植物昆 蟲和哺乳類細胞製造之產物。本發明之抗體取決於使用在重 組製造步驟中之宿主可係酿化或非聽化的，糖化的係較佳。 2〇該等方法係描述於許多標準實驗室手冊中像是上述Sambr〇〇k 的 17.37-17.42 部分、上述 Ausubel 的第 1〇、12、π、16、18 和20章、上述c〇lligan的蛋白質科學第12_14章，其在此皆 以引用的方式完整併入。 48 ^ " — - 871329019 Λ7 五、發明說明内） 在哺乳類細胞中選殖及表現IL>6 典型的嗔乳類表現載體包含至少一種啟動子元素（其可 媒介mRNA轉錄的起始）、抗體編碼序列，以及用於轉錄終 止所需之訊息和聚腺芽酸化作用轉錄，其他的元素包括增強 子、Kozak序列和用於RNA粘接之提供子和接受子位置周圍 之插入序列。高效率轉錄可以來自SV40之早期和晚期啟動 子、來自反轉錄病毒例如RSV、HTLV1、HIV1之長末端重複 (LTRS) ’以及巨細胞病毒（CMV)的早期啟動子來達成， 然而，亦可使用細胞元素（例如人類肌動蛋白啟動子）。用於 執行本發明之合適表現載體包括例如載體像是pIRESlneo、
pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN 或 pLNCX (Clonetech Labs, Palg Alto, CA)、pcDNA3.1 (+/-)、pCDNA/Zeo (+/-)或 pcDNA3. l/Hygro( +/-)(Invitrogen )、PSVL 和 PMSG( Pharmacia， Uppsala，瑞典）、pRSVcat (ATCC 37152)、pSV2dhfr (ATCC 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 37146)和PBC12MI (ATCC67109)。可使用之哺乳類宿主細 胞包括人類Hela、293 ' H9和Jurkat細胞、小鼠NXH3T3和 C127細胞、Cos卜Cos 7和CV 1、鵪鶴QC1-3細胞、小鼠l 細胞和中國朝鮮鼠卵巢（CHO)細胞。 或者’基因可在包含基因嵌入染色體之穩定細胞株中表 現，與篩選標記像是dhfr、gpt、新徽素或海格徽素共同轉染 可辨識及分離轉染細胞。 轉染基因亦可增量以表現大量的編碼抗體，DHFR (二氮 葉酸鹽還原酶）標記可用於發展帶有數百或甚至數千拷貝重 要基因之細胞株。另一可用的篩選標記係酵素榖胺醯胺合成
、發明說明（钧） 酶（GS) (Murphy 等人，Biochem* J. 227 : 27-279 (1991)、 Bebbington 4人，Bio/Technology 1〇 : 169-175 (1992))。哺 乳類細胞係利用該等標記生長於篩選液中，且可篩選出具有 最高抗性之細胞，該等細胞株包含嵌入染色體之增量基因， 5中國朝鮮鼠卵巢（CHO)和NSO細胞時常用於抗體製造。 pCl和pC4表現載體包括R〇us肉瘤病毒強啟動子(LTR) (Cullen 等人 ’ Molec. Cell. Biol. 5 : 438-447 (1985))加上 CMV-增強子片段（Boshart 等人，Cell 41 : 521-530 (1985))， 多個選殖位置（例如限制酵素切割位置Ba_ 和 0 Asp718)可増進重要基因之選殖，載體可另包含3,插入序列、 大鼠前胰島素原基因聚腺苷酸化作用和終止訊息。 在CHO細胞内選殖和表現 載體pC4係用於表現il-6抗體，質體pc4係質體 pSV2-dhfi之衍生物（ATCC取得號37丨46)，質體包含在SV40 早期啟動子控制下的小鼠DHFR基因，以該等質體轉染之中 國朝鮮鼠卵巢或其他缺少二氫葉酸鹽活性之細胞可讓細胞生 長於篩選液（例如α減少 MEM，Life Techn〇丨〇gies，Gaithersburgj MD)中補充化學治療劑胺曱嗓吟來筛選。在細胞中抵抗胺甲 嗓吟（MTX)之DHFR基因增量已廣為引證（參考例如F w
Alt 等人，J. Biol. Chem. 253 : 1357-1370 ( 1978)、J. L. Hamlin 和 C. Ma^ Biochem. Et Biophys. Acta 1097 : 107-143 ( 1990)和 M. J_ Page 和 M. A. Sydenham^ Biotechnology 9 : 64-68 (1991 ))。生長於增加濃度Μτχ之細胞可利用過度產生目 1329019 A7 ______Β7_____ 五、發明說明（的） 酵素DHFR (其係DHFR基因增量的結果）而發展出對藥物 之抗性，若有第二個基因與DHFr基因連結，其通常可共同 增量且過度表現，技藝中已知該方法可用於發展帶有多於 1000個拷貝增置基因之細胞株。因此，當除去胺甲嗓吟時可 5得到包含嵌入宿主細胞一或多個染色體之增量基因之細胞 株。 質體pC4包含用於表現重要基因之r〇us肉瘤病毒長末端 重複（LTR)強啟動子（Cullen 等人 ’ Molec. Cell. Biol. 5 : 438-447 (1985))加上分離自人類巨細胞病毒（CMV)鄰近 10早期基因增強子之片段（Boshart等人，Cell 41 : 521_53〇 (1985)) ’啟動子之下游係Bamm、xba!和限制酵 素切割位置，其可讓基因嵌入。在該等選殖位置之後，質體 包含3插入序列和大鼠前胰島素原基因聚腺芬酸化作用位 置。其他的尚效率啟動子例如人類β_肌動蛋白啟動子、sv4〇 15早期或晚期啟動子或來自其他反轉錄病毒（例却HIV和 HTLV1)之長終端重複亦可用於表現。c丨〇ntech的丁过〇汗和 Tet-On基因表現系統和類似系統可用於在哺乳類細胞令以調 控方式表現IL-6(M. Gossen和 H. Bujard，Proc. Natl. Acad. Sci. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 USA89:5547_555i (i992))。在„^八的聚腺苷酸化诈用， 20亦可使用其他訊息例如來自人類生長荷爾蒙或血球蛋白基 因。帶有重要基因嵌入染色體之合適細胞株亦可利用與筛選 標記像是gpt、G418或海格黴素共同轉染來篩選，在開始時 使用多於一種之篩選標記例如G418加上胺甲喋呤係較佳的。 將質體pC4以限制酵素消化，且之後利用小牛腸磷酸酶 51 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） 1329019 A7 五、發明說明⑼） 以技藝中已知步驟去磷酸化，之後由1%瓊脂膠中分離載體。 根據方法步驟中已知’可使用編碼完整IL_6抗體之DNA 序列，例如序列辨識號碼第7和8號表示者，其相當於本發 明丨L-6抗體之HC和LC變異區，在該構築中亦可使用編碼 5適當人類不變區（亦即HC和LC區）之分離核酸。 之後以T4 DNA連接酶連接分離變異及不變區編碼DNA 和去罐酸化載體’之後轉形至大腸桿菌或见_1 Blue 細胞中，且使用例如限制酵素分析法來辨識包含插入質體pC4 之片段之細菌。 10 缺少活性01^基因之中國朝鮮鼠卵巢（CHO)細胞係 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 用於轉染，將5微克表現質體pC4與〇 5微克pSV2_ne〇質體 使用hpofectin共同轉染，psv2neo質體包含一主要篩選標 記’來自Tn5之neo基因可編碼提供對一群抗生素包括G418 抗性之酵素。將細胞種於α減少MEM補充i微克/毫升G418 15中’ 2天後，將細胞胰蛋白酶化並種於内含α減少MEM補充 1〇、25或50奈克/毫升胺曱喋呤加i微克/毫升G418之融合 瘤選殖盤（Greiner，德國）中。大約1〇_14天後，將單一株 落胰蛋白酶化且之後使用不同濃度的胺曱喋呤（5〇奈莫耳濃 度、100奈莫耳濃度、200奈莫耳濃度、4〇〇奈莫耳濃度、8〇〇 2〇奈莫耳濃度）種於6孔平皿或1〇毫升燒瓶中。之後將生長於 取南濃度胺曱喋呤之株落轉移至甚至包含更高濃度胺曱喋呤 (1毫莫耳濃度、2毫莫耳濃度、5毫莫耳濃度、1〇毫莫耳濃 度20毫莫耳/辰度）之新的6孔盤中，重複相同步驟直至得 到可生長於濃度係100-200毫莫耳濃度之株落。使用例如 52 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（2i〇X297公爱） 1329019 Α7 Β7 五、發明說明σι) SDS-PAGE和西方點墨法或反相HPLC分析法來分析預期基 因產物之表現。 抗II-6抗體之抗個體型變異抗體组合物 5 除了單株或嵌合抗1L·6抗體，本發明亦針對該等發明抗 體特異性抗個體型變異（抗Id)抗體。抗1({抗體係可辨認一 般相關於另一抗體抗原連結區獨特抗原決定位之抗體，抗Id 可以抗體或其CDR包含區免疫與Id抗體來源相同種類和基 因型之動物（例如小鼠品系）來製備，免疫動物可辨認且對 10免疫抗體之個體型變異抗原決定位反應，並產生抗Id抗體， 抗Id抗體亦可能用作"免疫原"而在另一動物體内引起免疫反 應而，库生所謂的抗-抗Id抗體。 抗ΊΚ抗體組合物 15 本發明亦提供至少一種包含至少一種、至少二種、至少 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 三種、至少四種、至少五種、至少六種或更多種抗_IL 6抗體 之抗-IL-6抗體組合物，如同此處描述和/或技藝中已知的其 係以非天然產生的組合物、混合物或型來提供。該等組合物 包3 3有至少一種或二種全長、C-和/或N-端刪除變異體、區 20域、片段或選自序列辨識號碼1、2、3、4、5、6、7'8之70-100 %鄰近胺基酸組成之群抗IL-6抗體胺基酸序列之特定變異體 或特定片段、d域或其變異體之非天然產生組合物。較佳的 抗孔-6抗體組合物包括至少一種或二種全長片段、區域或 與序列辨識號碼1、2小4、5、6之抗體序 53 1329019 A7 B7 五、發明說明（A) 一種CDR或LBR包含部位70-100%相同之變異體或特定片 段、區域或其變異體’其他較佳的組合物包含4〇_99%至少一 種70-100%序列辨識號碼1、2、3、4'5、6或特定片段、區 域或其變異體。該等組合物百分比如同技藝中已知或此處描 5述的係液體或乾燥溶液、混合物、懸浮液、乳液或膠體之重 量、體積、濃度、莫耳濃度或重量莫耳濃度。 經濟部智慧財產局貝工消费合作社印製 本發明之抗IL-6抗體組合物可另包含至少一種任何對需 要該等調控、處置或治療之細胞、組織、器官、動物或病患 係適當且有效量包含至少一種抗IL-6抗體之組合物或醫藥組 合物，其可再選擇性地包含至少一種選自至少一種TNF拮抗 劑（例如但不限於TNF抗體或片段、可溶性xnf受體或片段、 其融合蛋白質或小分子TNF拮抗劑）、抗風濕劑（例如胺甲 喋呤、金諾芬（auranofm)、亞金硫代葡萄糖、咪唑硫嘌呤、 依他西脫（etanercept)、硫代蘋果酸納金、羥基氣醌硫酸鹽' 15 艾炎寧（leflunomide)、磺胺匹林（sulfasalazine))、肌肉鬆弛 劑、麻醉藥、非類固醇抗發炎藥（NSAID)、止痛藥、麻醉劑、 鎮靜藥、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、殺菌劑（例如胺基 .糖"V 抗徽痛劑、抗寄生蟲劑 '抗病毒劑、卡巴盤尼 (carbapenem )、頭孢子黴素（c_absp〇rin )氟峻琳 2〇 (fluor〇qumolone)、大環内酯（macro丨ide )、盤尼西靈、續胺' 四環黴素、其他殺菌劑）、抗牛皮癬藥 '皮質類固醇、促蛋白 合成類固醇、糖尿病相關藥劑、礦物質'營養劑、甲狀腺劑、 維他命、.鈣相關荷爾蒙 '止瀉劑、止咳劑 '止吐劑、抗潰瘍 藥乾^寫藥、抗凝劑、紅血球生成素（例如epoet^a)、顆粒 54 本紙張尺度適用中國困家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） 1329019 A7 B7 五、發明說明（π) 細胞株落刺激因子（filgrastim)(例如G-CSF、Neupogen)、 沙葛莫斯汀（sargramostim) (GM-CSF、Leukine)、免疫劑、 免疫球蛋白、免疫抑制劑（例如貝斯里斯美（basiliximab)、 環孢靈（cyclosporine)、代克林蘇美（daciizumab))、生長荷 5爾蒙、荷爾蒙取代性藥物、雌激素受體調控劑、散曈藥、睫 狀肌麻痺劑、烷化劑、抗代謝劑、有絲分裂抑制劑、放射性 藥物、抗憂鬱劑、抗躁症劑、抗精神病藥、抗焦慮藥、安眠 藥、擬交感劑、刺激劑、東尼培唑（d〇nepezii)、塔克寧 (tacrine)、氣喘藥、β激動劑、吸入性類固醇、白三烯素抑制 10劑、甲基黃嘌呤、克莫林（cromo丨yn)、正腎上腺素或相似物、 脫氧核醣核酸酶a (Pulmozyme)、細胞激素或細胞激素拮抗 劑考，該等細胞激素之非限制性實例包括但不限於IL_i至 iL-23任一。適當劑量係技藝中所熟知（參考例如等人 嫣輯的藥物治療手冊第2版’ App丨eton和。哪，Stamford， 15 CT (2000) ; PDR 藥典，Tarascon Pocket 藥典 2000，Deluxe 編輯，Tarascon 發表，L〇ma Linda，CA (2000)，該等參考文 獻在此係分別以引用的方式完整併入）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 該等抗癌或抗感染藥亦包括與至少一種本發明抗體相 關、相連、共同配方或共同投藥之毒素分子，毒素可遷擇性 2〇地作用以選擇性殺死病原細胞或組織，病原細胞可以係癌症 或其他細胞，該等毒素可係但不限於純化或重組毒素或包含 毒素至少一種功能性細胞毒性區之毒素片段，例如選自至少 一種篦麻毒素、白喉毒素、蟲毒或細菌性毒素。毒素一詞亦 包括以任何聽產生、突變或重組細g或病毒（其可能在人 55 本紙張尺度適用甲固國家標準(CNS)A4規格（2|〇;<297公度-了 A7
A B7 五、發明說明⑼）----- 類和魏魏__何麵錄包括雜休克而導致死 I造之内毒姊外毒素，該等毒素可能包括但不限於腸 :性大腸桿菌鮮變性腸毒素（LT)、熱穩定性腸毒素⑽、 心賀氏g細祕素、需氧單㈣腸毒素 '雜休植候群毒 素（TSST-1)、葡萄球菌腸毒素A (SEA)、B (Seb)或c 、SEC)、鐽球菌腸毒素及類似物。該等細自包括但不限於腸 毒性大腸翻種（ETEC)、腸出錄大腸·(例如血清型 7 H7株）、葡萄球菌種（例如金黃色葡萄球菌、化腹性 葡萄球菌）、志貝氏菌種（例如病疾桿自 ' 弗雷奈里桿菌、保 1〇地氏桿菌和宋納氏桿菌）、沙門氏菌種（例如傷寒沙門氏菌、 豬霍亂桿g、腸炎桿g)、梭狀芽胞桿雜（例如產氣炎膜桿 菌、難治梭菌、蠟腸毒桿菌）、曲菌種（例如結腸曲菌、胎兒 曲菌）、幽門桿菌種（例如胃幽門桿菌）、需養單胞菌種（例 如索柏為養單胞鹵、好水需養單胞菌、caviae需養單胞菌）、 15布雷氏似志贺氏菌'腸結腸炎耶耳辛氏菌、弧形菌種（例如 霍亂弧菌、副溶血性弧菌）、克雷白氏菌種、綠腹桿菌和鏈球 菌（參考例如Stein編輯的INTERNAL MEDICINE第3版， 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製
第 1-13 頁，Little, Brown and Co.，波士頓（1990) ; Evans 等 人編輯的 Bacterial Infections of Humans : Epidemiology and 20 Control，第 2 版’第 239-254 頁，Plenum Medical Book Co.， 紐約（1991 ) ; Mandell 等人的 Principles and Practice of Infectious Diseases，第 3 版，Churchill Livingstone，紐約 (1990) ·; Berkow 等人編輯的 The Merck Manual，第 16 版， Merck and Co.，Rahway, N.J.，1992 ; Wood 等人的 FEMS 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 1329019 A7 發明說明（灼
Microbiology Immunology，76 : 121-134 ( 1991); Marrack 等人 的Science，248 :服-爪（1990)，該等參考文獻之内容在此 係以引用的方式完整併入）。 本發明之抗IL-6抗體化合物、組合物或合併物可另包含 至少一種任何合適的辅助劑，像是但不限於稀釋液 '連結劑' 穩定劑、緩衝液、鹽類、親脂性溶劑'保存劑、佐劑或類似 物，醫藥可接受性輔助劑係較佳。該等無菌溶液之非限制性 實例及製備方法係為技藝中所熟知，像是但不限於Gennar〇 編輯的 Remington ’ s Pharmaceutical Sciences，第 18 版，Mack 10 PublishingC〇. (Easton^ PA) (1990)。如同技藝中熟知或此處 之描述，醫藥可接受性載劑可常規選擇適用於抗IL_6抗體、 片段声變異體組合物之投藥方式、溶解性和/或穩定性。 經 濟 部 智 慈 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 可用於本組合物之醫藥賦形劑和添加物包括但不限於蛋 白質、胜肽、胺基酸、脂質和碳水化合物（例如糖類包括單 15醣、二_ '三_、四-和寡醣、衍生性糖類像是醛醇、醛糖酸、 酯化糖及類似物，以及多醣或糖類聚合物），其可獨自或合併 存在’且包含單一或以重量或體積W9.99%合併β典型的蛋 白質賦形劑包括血清白蛋白像是人類血清白蛋白（HSA)、重 組人類白蛋白（ΓΗΑ)、明膠 '酪蛋白及相似物。亦可迮用於 20緩衝容積中之代表性胺基酸/抗體成分包括丙胺酸、甘胺酸' 精胺酸、内銨鹽、組織胺酸、縠胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、 離胺酸、白胺酸 '異白胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、 天冬酿胺及類似物，一較佳胺基酸係甘胺酸。 適用於本發明之碳水化合物賦形劑包括例如單醣像是果 57 本紙張尺度適用中國國家標準(〇^)八4規格（2[0 X297公爱〕 一 " 1329019 A7 發明說明（θ) 糖、麥芽糖、半乳糖、果糖、D_甘露糖、山梨糖和類似物、 :醣像是乳糖、餘、海藻糖、纖維二糖和類似物多聽像 :植物讀、騎松糖、麥鋪，糖 =Γ像是甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木 糖醇山木购（__)、崎補⑽。祕本發明之較 佳碳水化合物賦形劑係甘露醇、海藻糖和植物蜜糖。 抗K抗體組合物亦可包括緩衝液或酸驗值調整劑一 般上，緩衝液係由有機醆或鹼製備之鹽類。典型的緩衝液包 括有機酸鶴像是檸檬酸、抗壞錢、㈣_、碳酸、酒 1酸、_酸、乙酸或耿酸、加、三f醇胺基甲燒氣氯酸或 魏鹽緩驗細。•轉狀難猶㈣有機酸鹽像 是擰檬酸鹽。 15 經濟部智慧財產局貝工消费合作社印製 20 脂 此外，本發明之抗IL_6抗體組合物可包括聚合賦形劑/ 添加劑像是聚乙烯如細、聚蔗糖（聚⑹ '糊精（例如環糊 精像是2-經基丙基_β·環糊精）、聚乙二醇、調味劑、抗菌劑、 甜味劑、抗氧化劑'抗靜電劑、界面活性劑（例如聚山梨酸 酯像是"TWEEN20 〃和"TWEEN 80 〃)、脂質(例如磷脂、 肪酸）、類固醇（例如膽固醇），以及整合劑（例如edta)。 根據本發明適用於抗IL_6抗體、部份或變異體組合物之 該等及其他已知醫賊糊和/絲加麵㈣巾已知例如"
Remington: The Science & Practice of Pharmacy "(第 19 版， 画iams & Wimams(1995))和"Physidan.sDeskReference (第 52.版 ’ Medical Economics，Montvale，NJ (1998 ))中所 列者，其揭示在此係以引用的方式完整併入。較佳的載劑或 58 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公爱） 1329019 A7 B7 五、發明說明（θ) 賦形劑物質係碳水化合物（例如醣類和醛醇）和緩衝液（例 如擰檬酸鹽）或聚合劑。 5 如上提及’本發明係提供磷酸鹽緩衝液食鹽水或選擇鹽 類（較佳），以及保存溶液用於穩定配方，以及包含防腐劑之 配方，以及適用於醫藥或獸醫用途之多次使用保存配方其 .在醫藥可接受配方中包含至少一種抗IL-6抗體。較佳的配方 係在稀釋水溶液中包含至少一種已知防腐劑或者選自至少一 10種酚類、m-甲酚、ρ-甲酚、〇-甲酚、氣甲酚、苯甲醇' 亞硝酸 苯采、苯氧基乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化鎖（例如六水合物）、 烧基声苯（曱基、乙基、丙基'丁基及類似物）、殺藻胺、氣 化苄乙氧胺（benzethoniumchloride)、去氫乙酸鈉和硫柳汞或 其混合物組成之群。技藝中已知之任何合適濃度或混合物皆 15可使用，像是0·001-5%，或其中任何範圍或值像是但不限於 0.001、0.003'0.005、0.009、〇·〇ι、0 02、0.03、0.05、0.09、 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 X 消 费 合 作 社 印 製 〇]、0.2'0.3、0.4、0.5'0.6、0.7'0.8、0.9、1.0 ' U ' i 2 ' 1.3、1.4、1.5、1.6、1.7 ' 1.8、1.9、2.0、2.卜 2.2'2.3 ' 2.4 ' 2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4'3.5 二3.6、 20 3.7、3.8'3.9'4.0、4.3、4.5 ' 4_6'4.7、4.8、4.9 或其中任何 範圍或值。非限制性實例包括無防腐劑、〇1_2% m•甲盼（例 如 〇·2、0·3、0·4、0.5、0·9、1.0% )、0.1-3% 苯甲醇（例如 0.5、 0.9、1.1’、1.5、1·9、2.0、2.5% )' 0.001-0.5% 硫柳汞（例如 0.005、〇·〇ι )、〇 001_2 收酚類（例如 〇 仍、〇 25、〇 28、〇 $、 本纸張尺度適用中國固家標準(CNS)A4規 59 1329019 A7 B7 五、發明說明（奶 0.9、1.0% )、0.0005-1.0% 烷基對苯（例如 〇 〇〇〇75、〇 〇〇〇9、 0·0(η ' 0·002、0_005、0.0075'0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、 0·09、（U、0.2'0.3、0.5、0.75、0.9、1.0% )，以及相似物。 如上提及，本發明係提供一製造物’其包含包裝物質以 5及至少一管含有至少一種抗IL-6抗體以及前述緩衝液和/或防 腐劑之溶液（選擇性地於稀釋水溶液中），其中該包裝性物質 包含一標記指示該溶液可維持1、2、3、4、5、6、9、12、18、 20、24、30、36、40、48'54、60、66、72 小時或更長之期 間。本發明另包含一製造物，其包含包裝物質、第一管包含 10 冷凍乾燥之至少一種抗IL-6抗體，且第二管包含上述緩衝液 或防腐劑之稀釋水溶液，其中該包裝物質包含一標記，其可 指示病患將至少一種抗IL-6抗體重組於稀釋水溶液中而形成 可使用24小時或更長期間之溶液。 根據本發明使用之至少一種抗IL-6抗體可以重組方法製 15 造’包括來自哺乳類細胞或轉殖製備物，或可由此處描述或 技藝中已知之其他生物來源純化而來。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明產物中至少一種抗IL-6抗體之範圍包括取決於重 組而改變之量，若在重量/乾重系統中，濃度係由大約1 〇微 克/¾升至大約1000毫克/毫升，雖然較低和較高之濃度皆可 20 使用且取決於預期運送賦形藥，例如溶液之配方會隨經皮 斑、經由肺部、經由黏膜或滲透或微量幫浦方法而不同。 稀釋水溶液選擇性地另包含醫藥可接受防腐劑係較佳， 較佳的防腐劑包括該等選自酚類、m-甲酚、P-曱酚、〇-曱酚' 氣甲酚、苯甲醇、烷基對苯（甲基、乙基、丙基、丁基及類 60 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） A7
1329019 A7 B7 五、發明說明和) 几-6抗體與選自紛類、m甲紛'p_曱紛、〇_甲紛、氣甲酚笨 甲醇、烧基對笨（曱基、乙基、丙基、丁基及類似物）' 殺藻 胺'氣化苄乙氧胺'去氫乙酸鈉和硫柳汞或其混合物組成之 群之防腐劑於稀釋水溶液中混合，將至少一種抗IL_6抗體與 5防腐劑於稀釋水溶液中混合係使用傳統溶解及混合步驟來進 行。例如為了配製合適配方，緩衝溶液中已測定含量至少一 種抗IL-6抗體係與緩衝溶液中預期防腐劑以足夠提供預期濃 度之蛋白質和防腐劑之含量合併。該等方法中之變異可為原 热習技藝者了解’例如成分加人之順序、是否另外使用添加 10物配方製備時之溫度和酸鹼值皆係可極佳化濃度和使用投 藥方法之因素。 申請專利之配方可以澄清溶液或包含一管冷凍乾燥至少 種k IL-6抗體與第二管包含水、防腐劑和/或賦形劑（磷酸 鹽緩衝液和/或生理食鹽水以及選擇鹽類之稀釋水溶液較佳） 15 ^奴之二管提供於錢，無論是單-溶液管或需重組之二管 ^可重複使用多次，且足_於病患治療之單次或多次循 % ’因此γ提供較时使収讀之練攝生法。 經 +本申請專利製造物可用於立即至24小時或更長期間之投 | 因此’本巾請專利製造物可提供病患顯著之優點。本發 g 20明之配方可選擇性地安全貯存於大約2至大約40〇c之溫度， | 且，延長期間可保持蛋白質的生物活性’因此讓包裝標二 | 不洛液可維持和/或使用6、12、18、24'36、48、72或96 害 或吏長之期間’若使用保存稀職，該等標記可包括使 | 用间達1-12個月、半年 '一年半和/或二年。 62
計 線
1329019 A7 五、發明說明（6f) — 發明中至少一種抗IL-6抗體溶液可以包含將至少一種抗 體於稀釋水溶液中混合之枝賴備，混合係使⑽統溶解 和犯合步驟進行。例如為了配製合適稀釋液，水或緩衝溶液 中已測疋含置至少一種抗體係以足夠提供蛋白質之含量且選 5擇性地與預期濃度之防腐劑或緩衝溶液合併。該等方法中之 變異可為《習轉者了解，例如成分加人之鱗、是否另 外使用添加物、配方製備時之溫度和酸鹼值皆係可極佳化濃 度和使用投藥方法之因素。 申凊專利之產品可以澄清溶液或包含一管冷凍乾燥至少 10 一種抗IL_6抗體與第二管包含稀釋水溶液重組之二管提供於 病患，無論是單一溶液管或需重組之二管皆可重複使用多 次’，且足夠用於病患治療之單次或多次循環，因此可提供較 自前使用更方便之治療攝生法。 經濟部智慧財產局員工消f合作社印製 .申凊專利之產品可以澄清溶液或包含一管冷束乾燥至少 15 一種抗IL_6抗體與第二管包含稀釋水溶液重組之二管提供於 藥局、診所或其他該等機構和設施間接提供於病患。在該例 子申澄清浴液可以南達1公升或甚至更大量提供大的儲存， 車父刀之至J/ 一種抗體溶液可由此取出·一或多次以轉移至 較小管子，而由藥局或診所提供於其顧客和/或病患。— 20 已知包含該等單管系統之裝置包括該等用於運送溶液之 筆形注射裝置像是 Becton Dickenson (Franklin Lakes，NJ， www.bectondickenson.com)' Disetronic ( Burgdorf, Switzerland, www.disetronic.com ) ' Bioject ( Porland, Oregon (www.bioject.com ) ' National Medical Products, Weston 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（2丨Ox297公釐） 1329019 A7 B7 五、發明說明（&)
Medical ( Peterborough, UK, www.weston-medical.com ) ' Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www.mediject.com)製造或 發展的 BD Pens、BD Autojector®、Humaject®、NovoPen® ' BD®Pen、AutoPen®和 OptiPen®、GenotropinPen®、Genotronorm 5 Pen®、Humatro Pen®、RecoPen®、Roferon Pen®、Biojector®、 iject®、J-tip Needle-Free Injector®、Intraject®、Medi-Ject® 〇 包 含雙管系統之已知裝置包括該等用於匣中重組冷凍乾燥藥物 用於運送重組溶液之筆形注射系統像是HumatroPen®。 本申請專利產品包括包裝物質，包裝物質除管理機構所 10需資料外可提供產品使用之條件。本發明之包裝物質可提供 病患將至少一種抗IL-6抗體於稀釋水溶液中重組而產生溶液 以及於2-24小時或更長期間使用二管重量/乾重產品溶液之 指示。在單管溶液產品，標記指示該等溶液可使用2·24小時 或更長之期間。本申請專利產品可用於人類醫藥產品之用途。 15 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 费 合 作 社 印 製 20 本發明之配方可以包含將至少一種抗Κ抗體與選擇緩 衝液（包含生理食鹽水或選擇鹽類之磷酸鹽緩衝液係較佳） 混合之方法製備。紅少—種抗酸_祕鱗水溶液中 混合係使用傳統溶解及混合步驟來進行。例如為了配製合適 配方’水或緩衝液中已測定含量至少一種抗體係與水中麵 緩衝劑以足驗供職濃度之蛋自質和緩触之含量合併。 該等方法中之麵簡賴習娜者了解，例如成分加入之 順序、是W外使·加物、配讀料之溫度和酸驗值皆 係可極佳化濃度和使用投藥方法之因素。 本申睛專利之穩定或保存配方可以澄清溶液或包含一管 -------64 本纸張尺度適用中國画家標準(CNS)A4規格 五、發明說明 V、東乾燥至^ _衡几IL_6抗體與第二管於包含防腐劑或緩衝 液及賦糊之娜水雜魏之二雜做錢，無論是單 一溶液管或需重組之二管皆可重複制多次，且足夠用於病 患治療之料❹讀環，因此可提健目驗収方便之 5 治療攝生法。 穩疋或保存配方或此處描述溶液中至少一種抗IL-6抗體 可根據本發明經由多種運送方法包括SC或IM注射、經皮、 經由肺、經由黏膜、植入、渗透幫浦、厘内、微量幫浦或 技藝中熟知且為熟習技藝者了解之其他方法投藥於病患。 10 治療應用 jL-6由於其增殖能力而可用於多種疾病之病理學上因 此’问度親和性、中和性嵌合或人類IL_6抗體可預期用於IL 6 侧疾病毅m㈣、SLE、類風紐瓣炎、骨質疏 15露症 '腦部損傷 '腦水腫、憂鬱症和CHF上。CCLB8或任何 該等單株抗體之衍生物包括嵌合或人化或片段皆可用於減▲ 骨頭疼痛、抑制腫瘤（像是黑色素瘤、腎臟、前列腺、乳房、 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 肺、大腸癌及多發性骨髓瘤）生長、淋巴增殖性疾病及其他 已使用IL-6之疾病。該等抗體可以單劑或與其他治療劑合併 20使用’此外，該單株抗體可用作化學致敏劑，藉此增加細胞 毒殺劑之治療功效。該抗體可用作放射致敏劑，藉此增加放 射法之功效’其亦可與其他腫瘤免疫調節劑像是IL_2、IL_12 和/或IFNa合併使用。 因此，本發明亦提供在細胞、組織、器官、動物或病患 65 本纸張尺度適用中固國家標準(CNs)A4規格（210x297公釐） 1329019 Λ 7 _________Β7 五、發明說明（6Α 中如同技藝中已知或此處描述使用至少一種本發明抗抗 體來調控或治療至少一種IL-6相關疾病之方法。 IL-6已知可在多發性骨髓瘤（mm)中藉由自體分泌或鄰 近分泌機制增進惡性褒細胞之增殖、分化和存活，其包括抑 5制惡性細胞之細胞凋亡^ _係一無法醫治的惡性漿細胞疾 病’其中阻斷IL-6被認為係一有效的治療（Anders〇n等人， 户發性骨趙瘤.新的見識及治療方法，血液學雜諸：， 2000) 〇lL-6在基底細胞癌瘤中亦具有腫瘤新生作用，其中几_6 轉染細胞顯示可藉由抑制細胞凋亡和主動促進而增加腫瘤生 10 長速率（Jee荨人，在人類基底細胞癌瘤細胞株中過度表現介 白素-6可增進抗細胞凋亡能力及腫瘤生成潛力，〇nc〇gen，第 2〇卷，第2號，第198-208頁，2001)。IL-6亦可藉由誘發 mdrl基因表現來增進乳癌細胞對化學治療之抗性（mdr 1和 金屬硫狀途徑）（Conze等人’在乳癌細胞中自行分泌產生的 15介白素6可導致多種藥物抗性，癌症研究雜諸61:8851 -8858， 2001) 。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 IL-6媒介腫瘤細胞存活和疾病進行之能力係以活體外和 活體内抗IL-6單株抗體對腫瘤生長之抑制作用來確定。根據 報導，阻斷IL-6可在活體外抑制人類腦部腫瘤（神經母細胞 20 瘤）之生長（Goswami等人’人類神經母細胞瘤多形細胞株 U87MG中介白素-6媒介的自行分泌生長促進，j. Neurochem. 71 : 1837-1845 ’ 1998)。使用相同的方法顯示注射鼠類CLB8 抗IL-6抗體可延長具有人類腫瘤小鼠之存活（Mauray等人， Epstein-Barr病毒依賴淋巴增殖性疾病：丨L-6的重要角色，Eur. 66 本纸張尺度適用中囷®家標準(CNS)A4規格（2丨0 x 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1329019 A7 B7 五、發明說明你） J. Immunol; 30 (7 ): 2065-73, 2000 )〇 亦有報導 mCLB8 抗 IL-6 抗體可逆行人類腎癌腫瘤之生長，並降低裸鼠中血清約之濃 度（Weisglass等人，於腎臟細胞癌瘤移植裸鼠中介白素_6於 誘發高血妈之角色，Endocrinology 138 (5) : 1879-8，1995 )。 5 CLB-8抗體亦可逆行小鼠中已形成的人類荷爾蒙復發前列腺 腫瘤異體移植（Smith等人’ 2001 )，抗介白素-6單株抗體可 誘發裸鼠中人類前列腺癌異體移植之逆行（Smith和Keller， Prostate; 48 (1) : 47-53 ) » IL-6亦係惡性病症之預後因子及標記。在腎細胞癌瘤 10 (RCC) .中，根據報導高量的IL-6係與腫瘤轉移及最後較差 的預後和較短存活率相關（Jean-Yves Blay等人，1992)。此 外夸RCC中’提升血清中的IL-6係與IL-2治療較差的反應 ’相關（Fumagalli等人，1999)(治療前血清標記和對介白素_2 治療之淋巴球反應 ’ Br_ J. Cancer 80 ( 3-4 ): 407-11)，且與 IL-2 15 相關毒性程度相關（Capuron等人，2001 )(免疫活化和早期 抑制症狀在以介白素-2基礎療法治療之癌症病患體内之相關 性，Psychoneuroendocrinology; 26 ( 8 ) : 797-808 )。 提升IL-6含量亦與乳癌中較差的預後和轉移疾病之存在 相關（Kurebayashi 2000和Benoy 2002 )(調節介白素-6由乳 20 癌細胞之分泌及其臨床應用，Breast Cancer; 7 (2) : 124-9 ; 血清介白素-6、血漿VEGF、血清VEGF和VEGF血小板加 至乳癌病患中，Clin. Breast Cancer; 2 (4): 311-5)。 IL-6亦假設係癌症相關病症像是無力衰弱/惡病質和骨骼 耗損之起因，在IL-6去除小鼠中可見腫瘤誘發之惡病質 67 本纸張尺度適用+國S家標準(CNS)A4規格（210x297公爱) '
1329019 A7 B7 五、發明說明（64) (Cahlin等人，2000)和骨骼耗損（隨後的高血每）（Sandhu 等人’ 1999)之降低，癌症相關之憂營症和次於腦部腫瘤之 腦部水腫亦與高量的IL-6相關（Musselman等人，2001)，本 發明之CCLB8抗IL-6抗體亦可抑制人類黑色素瘤及人類前列 5腺癌瘤在裸鼠中誘發的惡病質。 抗1劑之臨床經驗 多個使用IL-6單株抗體之臨床試驗已在多種疾病包括漿 細胞血癌、多發性骨髓瘤、B-淋巴球增殖疾病、類風濕性關 10節炎、腎癌瘤和AIDS相關淋巴瘤中執行。 經濟部智慧財產局員工消t合作社印製 以本發明之抗IL-6 cCLB-8抗體治療前進期多發性骨髓 瘤復發病患之第一期劑量增強試驗（N=丨2)證實某些病患的 疾病穩定，在不連續的治療後，Μ蛋白質含量的增加加速， 顯示疾病在治療撤回後回復。抗IL-6 cCLB-8抗體可抑制游離 15循環的IL_6 ’最重要的是並無觀察到毒性（除了二個治療前 嚴重病患的暫時性血小板減少症）或過敏反應，孓反應蛋白 質（CRP )的降低在所有病患中皆低於偵測範圍。抗亿_6 cCLB-8抗體證實具有長循環半生期17 8天，且無觀察到人類 4几攸合抗體（HACA)免疫反應（van Zaanen等人，1998)。 20 CNTO 328的投藥並不會導致血壓、脈搏、體溫、血紅素、肝 功能和腎功能的改變，除了二個治療前嚴重病患的暫時性血 小板減少症’並無觀察到毒性或過敏反應，且無觀察到人類 抗敌合抗體（HACA)免疫反應。有三個病患在治療期間發 展出感染相關併發症，然而並不可能係抗IL_6 cCLB_8抗體之 68 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） 1329019 Λ7 37 五、發明說明（θ) 可能相關性，因感染併發症在末期多發性骨髓瘤令係常見且 為主要的死因。此外’即使在抗IL_6 cCLB-8抗體存在下三個 病患皆可對其感染產生反應，顯示抗丨L_6治療在感染期間無 法阻斷IL-6 〇無治療相關之死亡報導，總之’該試驗之結果 5顯示抗IL_6cCLB-8抗體在多發性骨髓瘤病患係安全的。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 因此，本發明係提供在細胞、組織、器官、動物或病患 中用於調控或治療至少一種惡性疾病（包括但不限於至少一 種：多發性骨髓瘤、血癌、急性血癌、急性淋巴母細胞性血 癌（ALL)、B-細胞、T-細胞或FAB ALL、急性骨髓性血癌 10 (AML)、慢性骨髓細胞性血癌（CML)、慢性淋巴細胞性血 癌（CLL)、髮細胞性血癌、脊髓發育不良徵候群（mds)、 淋$瘤、何杰金氏病、惡性淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、Burkitt ，氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、卡波西氏肉瘤、結腸癌、腎細胞 癌 '胰臟癌'前列腺癌'鼻咽癌 '惡性組織細胞症、副贅瘤 15徵候群7惡性血弼過多症、固體腫瘤、腺癌瘤、肉瘤、惡性黑 色素瘤 '血管瘤、轉移疾病、癌症相關的骨骼耗損'癌症相 關的骨頭疼痛）、抑制癌症轉移、減輕癌症惡病質以及治療發 炎性疾病（像是腎間隔增殖性血管球性腎炎及相似物）之方 法。該等方法可選擇性地於該等IL-6抗體投藥之前、同時或 20之後與放射治療、抗血管新生劑、化學治療劑、法呢基轉移 酶抑制物或相似物合併使用。 本發明亦提供在細胞、組織、器官、動物或病患中用於 調控或治療至少一種IL-6媒介免疫相關疾病（包括但不限於 至少一種類風濕性關節炎、幼年類風濕性關節炎系統性起 _ 69 各紙張尺度通用中3囷家棉準(〇^)八4規格（2丨(^297公爱、 ------ 1329019
經濟部智慧財產局8工消費合作社印发 始幼年類風濕性關節炎、牛皮癖關節炎、黏連性脊椎炎、胃 溃瘍、灰清陰性關節病、骨關節炎、發炎性腸疾病、潰瘍性 結腸炎、系統性紅斑性狼瘡、抗磷脂徵候群、虹膜睫狀體炎/ 葡萄膜炎/視神經炎、自發性肺纖維變性、系統性脈管炎/韋格 5納氏肉芽腫、結節病、睪丸炎/輸精管戴除逆轉術、過敏/異位 I1 生疾病、氣嚼、過敏性鼻炎、渔療、過敏性接觸性皮膚炎、 過敏性結膜炎、過敏性肺炎、移植、器官移植排斥、移植物 對宿主疾病、系統性發炎反應徵候群、敗血病徵候群革蘭 氏陽性敗血病、革蘭氏陰性敗血病、培養陰性敗血病、真菌 10敗血病、嗜中性白血球減少熱、尿性敗血病、腦膜炎球菌血 症、外傷/出血、燒傷、離子性輻射暴露、急性胰臟炎、成人 呼吸窘迫徵候群'類風濕性關節炎、酒精引發性肝炎、慢性 發炎病、結節病、克隆氏病、鐮形細胞貧血'糖尿病、腎病、 異位性疾病'過敏反應、過敏性鼻炎、花粉熱、常年性鼻炎、 15結臈炎、子宮内膜組織異位形成、氣喘、蓴痲疹、系統性過 敏反應、皮膚炎、惡性貧血、溶血性疾病、血小板減少症、 任何器官或組織的移植物排斥、腎臟移植排斥、心臟移植排 斥、肝臟移植排斥、姨臟移植排斥、肺臟移植排斥'骨髓移 植（BMT)排斥、皮膚異體移植物排斥、軟骨移植排斥骨 20骼移植物排斥 '小腸移植排斥、胎兒胸腺植入排斥、副甲狀 腺移植排斥 '任何器官或組織的異體移植排斥、異體移植排 斥、抗受體過敏反應'格雷武司氏病、雷諾氏病、B型胰島 素抗性糖尿病、氣喘、重症肌無力、抗體媒介細胞性毒殺' 第三型過敏反應、系統性紅斑性狼瘡' POEMS徵候群（多神 70 本紙張尺度適用申gg家標準(CNS)A4規格（2|〇 -< 297 公 ) 丄 五、發明說明（贫） 二:内分泌疾病、單株免疫球蛋白增高和皮膚 、、〜夕物病、臟辦大、内分泌疾病、單株免疫 白:阿、皮膚改變徵候群 '抗碟月旨徵候群、天❿瘡、硬 皮病此合性結締組織疾病、自發性艾迪孫氏病 、糖尿病、 5慢性活性肝炎、原發性膽硬化、白斑病、脈管炎' Μ心切開 術後徵候群 魏敏症、接雛皮敍、職性肺炎、 異體移植排斥、細胞内有機體起因肉芽腫、藥物過敏、代謝/ .，、發I疾病、威爾遜氏病、血色素沉著病、α1抗騰蛋白酶缺 少症、糖尿病性視網膜病、橋本氏甲狀腺炎、骨質疏鬆症' 丘月a下腺-腎上腺軸評估、原發性膽硬化、甲狀腺炎 '腦 脊1乂病貝、纖維性囊腫 '新生紐性肺病、慢性阻塞 !·生崎病（CQPD)、家;j紐嗜紅血球峨此喊細胞症、皮 膚病症狀、牛皮癬'禿髮'腎病徵候群、腎炎、血管球性腎 炎、急性腎衰蝎'血液透析、血尿'中毒'初期子痛、_ 15 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 20 /口療抗cd3治療 ' 細胞激素治療、化學治療、放射治療（例 如包括但不限於無力衰弱、貧血、惡病質及類似物）、慢性柳 S交鹽中毒、睡眠呼吸暫停、肥胖、心'臟衰竭、竇炎、發炎性 腸炎及類似物）之方法（參考例如Merck手冊，第1217版， Merck&Company, Rahway, NJ ( 1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999)、藥物治療手冊，髓s等人編輯，第2版，Appiet〇n 和 Lange，Stamford，Conn. (1998-2000)，皆以引用的方式完整 併入）。 本發明亦提供在細胞、組織、||官、動物或病患中用於 調控或治療至少一種感染疾病（包括但不限於至少一種急性 71 本紙張尺度適用中困团家標準(CNS)A4規格（21〇 x 297公龙） 1^29019 Λ 7 --------- Β7 __ 五、發明說明（产） ~ '—" 或慢性細菌感染、急性和慢性寄生蟲或感染過程包括細菌、 病母和黴菌感染、HIV感染/Ηΐν神經病變、腦膜炎'肝炎（Α、 Β或C或類似物）' 敗血性關節炎、腹膜炎、肺炎、會厭炎、 大腸桿菌0157 : h7、溶血性血尿徵候群/血检溶解灰小板減少 5紫斑病、癔疾、登革熱出血、萊什曼病、痲瘋、中毒性休克 徵候群、鏈球菌肌炎、氣壞疽、肺結核、細胞内烏分枝桿菌、 卡氏肺囊胞子蟲肺炎、骨盆感染疾病、睪丸炎/附睪炎、退伍 軍人桿菌、萊姆病、流行性感冒A、EB病毒、病毒相關性嗜 血徵候群、生命腦炎/無菌性腦膜炎及類似物）之方法。 10 該等方法之任一可選擇性地包含投藥有效量包含至少一 種抗IL-6抗體之至少一種組合物或醫藥組合物至需要該等調 控、處置或治療之細胞、組織、器官、動物或病患體内。用 於以抗IL-6療法治療之指示係揭示於以下參考文獻中，在此 以引用的方式併入本申請專利：Van Snick的"介白素-6 :回顧 15 "她.Rev. Immunol” 8 : 253-278 (1990) ; Campbell 等人的" 經濟部智慧財產局3工消费合作社印製 干擾素·γ和介白素-6在NOD/Wehi小鼠自體免疫胰島素依賴 性糖尿病中的重要角色"J· Clin. Invest.，87 : 739-742 ( 1991); Heinrich等人的"介白素-6單株抗體治療用於漿細胞血癌病患" Blood, 78 (5 ) : 1198-1204 (1991); Starnes 等人的"抗 IL-6 單 20 株抗體保護小鼠避免致命大腸桿菌感染以及致命腫瘤壞死因 子α挑戰"J. Immunol·, 145 ( 12) : 4185-4191 (1990); Strassman 等人的"介白素6參與試驗癌症惡病質之證據"J. Clin. Invest·, 89 ： 1681-1684 (1992) ° 本發明之任何方法可包含投藥有效量包含至少一種抗 72 本纸張尺度適用中a a家標準(CNS)A4规格（210 X 297公釐） 1329019 A 7 五、發明說明（W) [L-6抗體之組合物或醫藥組合物至需要該等調控、處置或人 療之細胞、組織、器官、動物或病患體内。該等方法可選擇 性地另包含用於治療該等免疫疾病或惡性疾病之共同投藥或 合併治療’其中該等至少一種抗IL-6抗體 '特定部分或其變 5異體之投藥可另包含之前、同時和/或之後的至少一種選自至 少一種TNF拮抗劑（例如但不限於tnf抗體或片段、可溶性 TNF受體或片段、其融合蛋白質或小分子_拮抗劑 . 抗體或片段' 小分子IL-18拮抗劑或IL-18受體連結蛋白質、 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 X. 消 費 合 作 社 印 製 IL-1抗體（包括IL-la和IL-Ιβ)或片段、可溶性几1受體拮 10抗劑、抗風濕劑（例如胺曱喋呤、金諾芬、亞金硫代葡萄糖、 咪唑硫嘌呤、依他西脫、硫代蘋果酸鈉金、羥基氣醌硫酸鹽' 艾$寧、續胺匹林）、放射治療、抗血管新生劑' 化學治療劑、 ，沙利竇邁（Thalidomide)、肌肉鬆弛劑、麻醉藥、非類固醇抗 發炎藥（NSAID)、止痛藥、麻醉劑、鎮靜藥、局部麻醉劑、 15神經肌肉阻斷劑' 殺菌劑（例如胺基糖芬、抗徽菌劑、抗寄 生蟲劑、抗病毒劑、卡巴盤尼、頭孢子黴素、氟喳啉、大環 内酯、盤尼西靈、續胺、四環黴素、其他殺菌劑）、抗牛皮癖 藥、皮質細醇、促蛋白合成_醇、糖尿病相關藥劑、礦 物質營養劑、甲狀腺劑、維他命、舞相關荷爾蒙、紅血球 2〇生成素（例如epoetin α)、顆粒細胞株落刺激因子（例如 G_CSF、Ne叩0gen)、沙葛莫斯汀（GM-CSF、Leukine)、免 疫劑、免疫球蛋白、免疫抑制劑（例如貝斯里斯美環孢靈、 代克林蘇美）' 生長荷爾蒙、荷爾蒙取代性藥物 '雖激素受體 調控劑、散曈藥、睫狀肌麟劑、餘劑 '抗代謝劑、有絲 本纸張尺度適用令固团家揉準(CNS)A4規格_(2丨〇 χ297 4^---- k 1329019 Λ 7 Β7 五、發明說明ο) 分裂抑制劑、放射性藥物、抗憂鬱劑、抗躁症劑、抗精神病 藥、抗焦慮藥、安眠藥、擬交感劑、刺激劑、東尼培唾、塔 克寧、氣喘藥、β激動劑、吸入性類固醇、白三烯素抑制劑、 甲基黃嘌呤、克莫林、正腎上腺素或相似物、脫氧核醣核酸 5 酶a (Pulmozyme) '細胞激素或細胞激素拮抗劑投藥。適當 劑量係技藝中所熟知（參考例如Wells等人編輯的藥物治療手 冊第 2 版，Appleton 和 Lange，Stamford，CT (2000) ; PDR 藥典，Tarascon Pocket 藥典 2000，Deluxe 編輯，Tai^scon 出 版，Loma Linda，CA (2000) ’該等參考文獻在此係分別以引 10 用的方式完整併入）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 適用於本發明組合物、合併治療、共同投藥裝置和/或方 法之TNF拮抗劑（另包含本發明至少一種抗體、特定部分或 其變異體）包括但不限於抗TNF抗體、其抗原連結片段和TNF 特定連結之受體分子。可預防和/或抑制TNF合成、TNF釋放 15 或其作用於目標細胞之化合物像是沙利竇邁、坦尼丹 (tenidap )、麟酸二醋酶抑制物（例如己酿|可可驗 (pentoxifylline)和若里潘（rolipram))、A2b腺苷受體激動 劑和A2b腺苷受體增強劑。可預防和/或抑制TNF受體訊息 之化合物像是促細胞分裂劑活化蛋白質（MAP)激酶抑制物。 20 可阻斷和/或抑制膜TNF分解之化合物像是金屬蛋白酶抑制 物。可阻斷和/或抑制TNF活性之化合物像是血管緊縮素轉換 酵素（ACE)抑制物（例如卡普托賓（captopril))，以及可阻 斷和/或抑制TNF產生和/或合成之化合物像是MAP激酶抑制 物。 74 1329019 五、發明說明（73) 治療性處置 本發明之任-方法可包细於治療IL6齡疾病之方 法’其包含㈣有效量包含至少—種抗IL6抗體之組合物或 醫樂組合物至需要該等調控、處置或治療之細胞、組織、器 5官、動物或病患體…該等方法可選擇性地另包含用於治療 該等免疫疾病之共同贿或合併治療，其中料至少—種抗 IL·:抗體、狀部分或其變異體之投射另包含至少—種上 .述藥劑之前、同時和/或之後投藥。 典型上，治療病理徵狀係以投藥有效含量或劑量至少— 10種抗IL-6抗體組合物來作用，一般而言，其總量範圍係至少 病患每公斤每次劑量約讀至5〇〇毫克至少一種抗iL 0抗 體；，且至少約0.1至100毫克抗體/病患每公斤單次或多次投 ’藥2，其取決於組合物中包含的特定活性。或者，有效的 此月 >辰度可包含每單次或多次投藥〇 M〇〇〇微克/毫升之血清 15濃度’合適的劑量係醫師已知，且當然取決於特定疾病狀態' 投藥組合物之特定活性以及進行治療之特定病患。在某些例 子中為了達到預期治療量必須提供重複投藥亦即重複分 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 別投藥特定監控或計量，其巾分職_重複直至達到 預期的每曰劑量或功效。 20 較佳的劑量可選擇性地包括〇.卜0.2、0.3、0.4、、〇.6、 0 7、0.8、0.9 小 2、3、4、5、6、7、8、9、1〇、u、i2、 13、14、15、16、17、18 ' 19、20'21、22、23、24、25 ' 26、27’ ’ 28、29、30、31、32 ' 33、34、35、36、37、38、 39'40'41 > . /1¾ 本纸張尺度適用 規格（2丨0 x297公釐） 1329019 . A / B7 五、發明說明（;?θ 52、53 ' 54、55、56、57、58、59、60、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、 79、80'81、82、83 ' 84、85、86、87、88 ' 89、90、91、 92、93、94、95、96、97、98、99 和/或 100-500 毫克/公斤/ 5 投藥，或其任何範圍、數值或部分，或達到每單次或多次投 藥血清濃度 0.卜 0.5、0.9、1.0、U、1.2、1.5、1.9、2.0'2-5、 2.9、 3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、 6.9、 7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、 10.9、 11 ' 11.5、11.9、20、12.5、12.9、13.0、13.5、Π.9 ' 10 14.0、14.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、 8.0、8.5'8.9、9.0'9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、 12、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14、14.5、15、15.5、15.9、 16、16.5、16.9、17、17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、 19.9、 20、20.5、20.9、21、22、23 ' 24、25、26。27、28、 15 29、30、35、40、45。50、55、60、65、70'75、80、85、 90、96、100、200、300、400、500、600、700、800、900、 1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500 和/或 5000 微克/毫升血清濃度，或其任何範圍、數值或部分。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 或者，投藥劑量可取決於已知因素而有所差異，像是特 2〇定藥劑之藥物動力學特性以及其投藥方式和途徑、接受者年 齡、健康和體重、症狀特性和程度、目前治療種類、治療頻 率以及預期功效。通常活性成分之劑量係每公斤體重大約Q i 至100毫克，通常每公斤每次投藥係0丨至5〇毫克（〇丨至 10毫克較佳）或以持續釋放型而有效得到預期結果。 76 本纸張尺度通用tss家標準(cnsma ^·7^χ297公嘍^--------- 五 15 20 發明說明（抑 作為非限制性的實例，人類或動物之治療提供可係本發 至少一種抗體-次或期間劑量0」至1〇〇毫克/公斤 母日 + = 12 13 14、15、16、17、18、19、20、2 卜 22 ' 23、 24、25、26、27、28、29、3〇、4〇、45 5〇、6〇、7〇'肋、 9〇或1〇〇毫克/公斤，於第卜2、3、4、5、6、7 8 9、1〇、 U、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2卜 22、23、 24、25、26'27、28、29、30、3卜32、33、34、35、36、 37、38'39或40日至少1日，或者或另外於第b2、3、4、 5>6^7v8>9^〇.11.12.13，14.15.16M7^18 i9^ 2〇、2卜 22、23、24、25 ' 26、27、28、29、30、3 卜 32、 33'，34、35'36、37、38、39、40、41、42、43 44 45、 46、47、48、49、50、51或52週至少—週’或者或另外於第 1、2、3、4、5、6'7、8、9、10、U、12、13、14、15、16、 Π、18、19或20年至少一年，或其任何組合，使用單次注入 或重複劑量。 適用於内服投藥之劑型（組合物）每單位或容器—般包 含大約0.1 *克至大約500 ί克活性成分，在該醫藥組2 中’活性成分根據組合物總重量一般係以大約〇 5 99 999%重 量之含量存在。 ~ 非經腸胃配方和投藥 用.殄非經腸胃投藥’抗體可以溶液、懸浮液、乳液或冷 凍乾燥粉末與醫藥可接受的非經腸胃賦形藥結合或分別提供 77 本纸張尺度適用tsa家標準(CNS)A4規格（210x297公龙） 五、發明說明（w) 製成配方。鱗賦賴之實_水、生理食鹽水、林格氏溶 液、葡萄糖溶液以及1-10%人類血清白蛋白，亦可使用微脂 粒和非水性賦形藥像是固定油類。賦形藥或冷凌乾燥粉末可 包含維持等張性（例如氣化鈉、甘露醇）和化學穩定性（例 5如緩衝液和防腐劑）之添加物。使用已知或合適技術使配方 無菌。 合適的醫藥載劑係描述於最新版的Remingt〇n，s
Pharmaceutical Sciences (A. 〇so丨）（該領域之標準參考文獻本 文）中。 10 非經腸胃投藥之配方可包含無菌水或生理食鹽水、聚烯 經濟部智慧財產局員工消費合作社印焚 經基二醇（像是聚乙二醇）、植物來源油類、氫化荼及類似物 作令一般賦形劑。用於注射之水性或油性懸浮液可使用適當 乳化劑或保濕劑和懸浮劑根據已知方法來製備，用於注射之 藥劑可係無毒性之非口服投藥稀釋劑像是水溶液或無菌注射 15液或溶劑懸浮液，可使用水、林格氏溶液、等張食鹽水等作 為可用的賦形劑或溶劑。可使用無菌不揮發油類作為普通溶 劑或懸浮溶劑，為了該等目的，任一種類之不揮發油類和脂 肪酸（包括天然或合成或半合成之脂肪油類或脂肪酸、天然 或合成或半合成之單-或二_或三·甘油酯）皆可使用。—非經腸 20月投藥係技藝f已知且包括但不限於傳統注射方法、如美國 專利案第5,851，198號中描述之氣壓無針注射裝置，以及美國 專利案第5,839,446號中描述之雷射穿孔裝置（在此皆以引用 的方式完整併入）。 78 1329019 AT B7 五、發明說明（刀） 取代運送 本發明另關於以非經腸胃、皮下、肌肉内、靜脈内、動 脈内、支氣管内、腹内、被膜内、軟骨内、腔内、小腦内、 腦至内、結腸内、子宮頸内、胃内'肝臟内、心肌内骨内' 5骨盆内、心包内、腹腔内、胸膜内、前列腺内、肺内'直腸 内、腎内'視網膜内、脊椎内、滑膜内、胸廓内、子宮内、 膀胱内大丸劑、陰道、直腸、頻、舌下、鼻内或經皮方式 • 投藥至少—種抗1L·6抗體。至少一種抗IL-6抗體組合物可製 備特定以液體溶液或懸浮液型用於非經腸胃（皮下、肌肉内 10或靜脈内）或任何其他投藥，特定以半固體型（像是但不限 於乳液和栓劑）用於陰道或直腸投藥，以像是但不限於錠劑 或學囊型用於頰或舌下投藥，鼻内像是但不限於粉末、鼻滴 液或喷霧或特定劑型，或經皮像是但不限於凝膠、軟膏、洗 劑.、懸浮液或以化學增強劑像是二甲亞珮在經皮斑内改良皮 15膚結構或增加藥物濃度之斑運送系統（Junginger等人，"藥物 渗透增強"；Hsi汍 D. S.編輯’第 59-% 頁（Marcd Dekker，Inc 經濟部智慧財產局—工消費合作社印製 紐約，在此係以引用的方式完整併入）），或以氧化劑讓包含 蛋白質和胜狀之配方使用於皮膚上（w〇 98/53847)，或使用 電場產生暫時運送途徑像是電衝法，或增加帶電藥物輕由皮 20膚增加移動像是離子載體，或使用超音波像是超音波導入術 (sonophoresis )(美國專利案第 4 3〇9 989 和 4 767 4〇2 號)（上 述發表和專利在此係以引用的方式完整併入）。 肺/鼻投藥 79 本纸張尺度通用中33家標準(CNS)A4規格（210x297公g ) ~~ 1329019 五、發明說明（开） 用於肺投藥，至少一種抗IL-6抗體組合物係以可有效到 達肺部或竇最低氣道之顆粒大小運送較佳。根據本發明，至 少一種抗IL-6抗體可以技藝中已知多種吸入或鼻裝置之任— 運送且以吸入用於治療劑之投藥’該等裝置可將噴霧化配方 5 放置於病患的竇腔或肺泡内，包括計量吸入器、噴霧器、乾 粉產生器、霧化器及相似物，其他適用於引導肺或鼻投藥抗 體之裝置亦係技藝中已知，所有的該等裝置可使用適用於噴 . 霧中抗體分散投藥之配方，該等喷霧可由溶液（水性和非水 性）或固體顆粒組成。計量吸入器像是Ventolin®計量吸入器 10 一般係在呼吸期間使用推進氣體和所需發動（參考例如w〇 94/16970、W0 98/35888 )’ 乾粉吸入器像是 Inhale Therapeutics 出，的 Turbuhaler™ (Astra)、Rotahaler® (Glaxo)、Diskus® (Glaxo) ' Spiros™吸入器（Dura)裝置，以及 Spinhaler®粉 末吸入器（Fisons)使用呼吸發動混合粉末（us 4668218 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印货 15 Astra、EP 237507 Astra、WO 97/25086 Glaxo ' WO 94/08552 Dum、US 5458135 Inhale、WO 94/06498 Fisons，在此係以引 用的方式完整併入）。噴霧器像是AERx™ Aradigm、Ultravent® 噴霧 Is( Mallmckrodt)以及 Acom II®噴霧器（Marquest Medical Products) (US 5404871 Aradigm^ WO 97/22376)(上i4參考文 2〇獻在此係以引用的方式完整併入）係由溶液產生喷霧，而計 里吸入器、乾粉吸入器等產生小顆粒喷霧。該等市售可得吸 入裝置之特定實例預期係適用於本發明操作之特定裝置代 表，而非預期限制本發明之範疇《包含至少一種抗IL_6抗體 之組合物係以乾粉吸入器或喷霧器運送較佳，用於至少一種 五 '發明說明d) 本發明抗體投藥之狀裝置具有多種職概，例如以吸入 裝置運送係較可信賴、可再現且準雄的。吸入裝置可選擇性 地運送小的絲雛，例如胁良科韻小於約10微米， 約1-5微米較佳。 5 以噴霧投藥丨L-6抗體组合物 包括IL-6抗體組合物蛋白質之噴霧可在壓力下利用加壓 至y種抗11>-6 4几體懸浮液或溶液通過喷氣孔而產生，喷氣 孔的大小和構形、使用壓力以及液體供給速率可選擇以達到 10預期輸出和驗大小，例如電子儒可_電場連結毛細管 或噴氣孔供給而產生。至少—種抗IL_6紐組合物蛋白質顆 粒4具有小於約um米之顆粒大小喷霧器運送係較佳約1 微米至約5微紐圍係錄，且約2微米至約3鮮係最佳。 適合以儒使用之至少—輸IL6抗體組合物蛋白質配 方典型上包括濃度約每毫升溶液G1毫克至約_毫克至少一 種抗IL-6抗體組合物蛋白質之抗體組合物$白質水溶液或毫 克/克重，或其中任何範圍或值，例如但不限 經货部智慧財產局—工消费合作社印裂 於.1 ' .2、.3 ' .4、.5 ' .6 '7、.8、.9、1、2、3、4、5'6、7、 8、9、1〇、11、12、13、14'15、16、η、18、19、21、21、 20 22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、 7〇 ' 80'90或100毫克/毫升或毫克/克重。配方可包括藥劑像 是賦形劑、緩衝液、等張劑、防腐劑、界面活性劑以及鋅（較 佳），配方亦可包括用於穩定抗體組合物蛋白質之賦形劑或藥 劑，像是緩衝液、還原劑、巨大蛋白質或碳水化合物。可用 ------81 本我張疋度適用中gg玄標辛(CNS)M規格（2丨〇χ297公---' 1329019 五、發明說明（扣） 裝 於配方抗體組合物蛋白質之巨大蛋白質包括白蛋白魚精蛋 白或類似物’可用於配方抗體組合物蛋白質之典型碳水化合 物包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藤糖、葡萄糖或類似物。抗 體、、.&物蛋白質配方亦可包括界面活性劑，其可降低或預防 5抗體組合物蛋白質因形成噴霧中原子化溶液導致的表面引起 凝集。多轉統的界面活性猶可使用，像是聚氧乙烯脂肪 酸醋和醇類’以及聚氧乙稀山梨糖醇脂肪酸醋，含量範圍一 •般係介於0細和14%配方重量。用於本發明之特佳界面活 性劑聚氧乙烯山躲單油麟、聚山__ 8()、聚山梨酸醋 10 20或類似物。其他技藝中已知用於蛋白質絲IL 6抗體或斗; 定部分或變異體之配方亦可包括於配方中。 15 經濟部智慧財產局wr工消f合作社印製 20 以噴霧器投藥IL_6抗體組合物 抗體組合物蛋自質可利时霧H像是喷射噴霧器或超 波噴霧器投藥.，-般而言，在·噴額中，壓縮氣體來源 係用於減產生高速氣H物，當髓㈣至魏孔外即產 生低壓區，其可將抗體組合物蛋白質溶液經由與液體貯存處 連結之毛細管拉出，來自毛細管之㈣流#其離開管子時係 斷成不穩㈣細絲和賴而產生擁，不同獅、喊和阻 隔板類型皆可使賴賴已知噴射傭n之職性能特性。 在超音波儒St，高鮮電祕服產生震_機械能， -般係使用壓電式賴ϋ，雜量健接或經由偶合液體傳 遞至抗體組合物蛋白質配方而產生包括抗體組合物蛋白質之 喷霧。較佳的是抗體組合物蛋白質顆粒具有小於約10微米之 立 計 線 t!Sa^#^(CNS)A4 ^ (210x297 公龙） 五、發明說明¢1) 顆粒大小以儒|g運送’約丨絲至約5微絲圍係較佳， 且約2微米至約3微米係最佳。 適口以噴霧器（噴射或超音波）使用之至少一種抗 抗體配方-般包括濃度約每毫升溶液巾g i毫克至約⑽毫克 5至》一種抗Μ抗體蛋白質。酉己方可包括藥劑像是賦形劑、 緩衝液 '等張劑、防細、界面活性劑以及鋅（較佳），配方 亦可包_於穩定至少—種抗α·6抗合物蛋白質之賦形 劑或樂劑’像是緩衝液、還原劑、巨大蛋白質或碳水化合物。 可用於配方至少—種抗1L·6抗體組合物蛋白質之巨大蛋白質 1〇包括白蛋白 '魚精蛋白或類似物，可用於酉己方至少-種抗IL_6 ㈣之典型&水化合物包域糖、甘露醇、乳糖、海藻糖' 葡<糖或類似物。至少-種抗IL_6抗體配方亦可包括界面活 性劑’其可降低或預防至少一種抗IL_6抗體因形成喷霧中原 字化溶液導致的表面引起凝集。多種傳統的界面活性劑皆可 15使用’像是聚氧乙稀脂肪酸醋和醇類，以及聚氧乙稀山梨糖 醇脂肪_ ’含量範圍一般係介於〇 〇〇1和4%酉己方重量。用 於本發明之特佳界面活性劑聚氧乙晞山梨糖單油酸醋、聚山 梨酸醋80、聚山梨酸醋20或類似物。其他技藝令已知用於蛋 白質像是抗體蛋白質之配方亦可包括於配方中。 20 以計量吸入器投藥IL-6抗體组合物 在計量吸入器（MDI)中，推進劑、至少一種抗IL 6抗 體’以及任何賦形劑或其他添加物係以包括雜壓縮氣體之 混合物包含於金屬小罐令 ’發動計量閥以噴霧釋放混合物， 83 1329019
包含顆粒大小範圍小於約10微米較佳，約i微米至約5微米 係較佳’且約2微米至約3微米係最佳。預期喷霧之顆粒大 小可以熱習技藝者已知多種方法產生之抗體組合物蛋白質配 方知到，包括噴射製粉、喷霧乾燥、臨界點濃縮或類似物。 5較佳的計量吸入器包括3M或Glax〇製造且使用氫氟碳推進 劑者。 以計量吸入器裝置使用之至少一種抗IL 6抗體配方一般 • 包括在非水性液中含有至少一種抗IL-6抗體懸浮液之良好分 裂粉末，例如以界面活性劑輔助懸浮於推進劑中。推進劑可 1〇以係用於該目的之任何傳統物質，像是氣氟碳、氫氣氟碳、 氫氟碳或氫碳’包括三氣氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氣四氟 乙警和U，U-四氟乙烷、HFA]34a (氫氟烷烴·〗34a)、 tiFA-227 (氫氟垸烴_227)或類似物，推進劑係氫氟碳較佳。 界面活性劑可選擇以穩定推進劑中至少一種抗IL_6抗體懸浮 15液、保護活性劑對抗化學分解，以及類似物。合適的界面活 性劑包括山梨糖三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸或類似物。在 某些例子中，溶液喷霧使用溶劑像是乙醇係較佳。技藝中已 經濟部智慧財產局員工消f合作社印製 知用於配方蛋白質像是蛋白質之其他藥劑亦可包括於配方 中。 20 原熟習技藝者將了解本發明之方法可藉由非此處描述之 裝置以肺部投藥至少一種抗IL_6抗體組合物來達成。 口服配方及投藥 用於口服投藥之配方係依賴共同投藥佐劑（例如間_苯二 -----------84 本珠張尺Μ用tss雜準(CNS)A4規‘（2mx297公笼--- 紛和非離子祕面活_像是聚氧乙稀油乙謎和 η-十六基聚 乙稀乙謎）以增加小腸壁人造的，性以及制投藥酵素 抑制物（例如联蛋白酶抑、二異丙基氣雜鹽（def) 和trasy⑻抑制酵素分解。用於口服投藥固觀侧型之活 —種添力响包括胁、雛纖維素、 甘露醇 '海藻糖 '植物蜜糖、轉醇、糊精、澱粉、續脂、 精胺酸鹽、幾丁質、脫乙醯殼錄、果膠 '山羊刺卿、阿 拉伯膠、_、膠原、妓白、白私、合成辭合成聚合 物和甘混合。該等_純含其他_添加物，例如去 活性稀釋劑、麟舰是硬脂_、對苯、保存劑像是山梨 酸、抗壞血酸、α·生細、抗氧化鎌是半胱麟、分解劑、 連轉劑、增厚劑、緩衝劑、甜味劑'調味劑、芳香劑等。 錠劑和丸劑可另處理為腸衣製備物。用於口服投藥之液 ϋ製備物包括可驗醫學用途之乳劑、姆、萬賴 '懸浮 液和溶液製，料製·可包含㈣賊之去活性 稀釋劑，例如水。微脂粒亦已描述作為用於騰島素和肝素之 藥物運送系統（美國專利案第4,239,754號），最近混合胺 基酸之人造聚合物中心、體（瞻白f)已用於運送藥物（美 國專利案第4,925,673號）’此外，美國專利案第5 879 681號 和美國專趣第5,871，753號巾贿的鋪化合物可麟運送 技藝中已知口服的生物活性劑。 黏膜配方和投藥 用於經由黏膜表面之吸收，投藥至少一種抗几6抗體之 1329019 A7 B7 五、發明說明（沙） 組合物及方法包括含有多數微小顆粒、黏膜附著大分子、生 物活性胜狀以及水性連續相之乳劑，其可藉由達到乳劑顆粒 黏膜附著而促進經由黏膜表面之吸收（美國專利案第 5,514,670號）。適用於使用本發明乳劑之黏膜表面可包括角 膜、結膜、頻、舌下、鼻、陰道、肺、胃、小腸和直腸投藥 途徑。用於陰道或直腸投藥之配方（例如栓劑）可包含例如 聚婦烴基二醇、凡士林、椰子油和類似物作為賦形劑；用於 鼻内投藥之配方可為固體且包含例如乳糖作為賦形劑，或可 為鼻滴液之水溶液或油類溶液；用於頰投藥之賦形劑包括糖 類、硬脂酸妈、硬脂酸錯、預凝膠化澱粉和類似物（美國專 利案第5,849,695號）。 經皮配方和投藥 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 '用於經皮投藥，至少一種抗IL-6抗體係包被於運送裝置 像是微脂粒或聚合奈顆粒、微顆粒、微膠囊或中心體（統稱 為微顆粒’除非另外陳述）中。許多合適的裝置係已知，包 括由合成聚合物像是聚經酸如聚乳酸、聚乙二酸及其共聚 物、聚鄰酯、聚酐和聚填氮稀（phosphazenes)，以及天然聚 合物像是膠原、聚胺基酸、白蛋白和其他蛋白質、藻酸鹽和 其他聚酿及其組合物組成的微顆粒（美國專利案第5,814 599 號）〇 延長投藥和配方 有時必須延長時間將本發明化合物運送至病患體内例 86 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公龙） ^29019 Λ7 五 -—— 經 濟 部 智 慧 財 產 局 X 消 費 合 作 社 印 如單次_ —粗—年之_。可使用乡魏慢釋放、儲存 4植人_ ’例如_可包含在體液巾具魏度溶解性之醫 討較無雜化合物麵，例如⑷絲合基礎酸像是碟 酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、丹寧酸、雙經祭酸、藻酸、聚 权胺S文萘單·或二·續酸、聚半乳糖搭酸和類似物之酸添加鹽 類’（b)具多價金屬陽離子像是鋅、妈、叙、鋇、鎂、|呂、 銅 '鈷、鎳、鎘和類似物或具由例如N，N，_二苄基乙二胺或 .乙二胺產生有機陽離子之鹽類；或（c)係（a)和（b)之組 合物，例如丹寧酸辞鹽類。此外，本發明之化合物或如先前 10描述之相對不溶性鹽類（較佳）可配方於凝膠中，例如單硬 脂酸铭凝膠與例如芝麻油適用於注射。特佳的鹽類係鋅鹽、 丹$酸鋅鹽'雙經萘酸鹽和類似物。用於注射之另一類型緩 陵釋放儲存配方可包含分散化合物或鹽類用於包被於緩慢分 蘇、無毋性、無抗原性聚合物中，例如美國專利案第3,773,919 15號令描述之聚乳酸/聚乙二酸聚合物。本化合物或如上述之相 對不溶性鹽類（較佳）亦可配方於膽固醇基質矽質小片中， 特別係用於動物。其他的緩慢釋放、儲存或植入配方例如氣 體或液體微脂粒係文獻中已知（美國專利案第5,77〇,222號和 "持續及控制釋放藥物運送系統”，j· R Robins〇n編輯，Marcd 20 Dekker, Inc., N.Y·，1978)。 I 缩寫 BSA-胎牛血清白蛋白 EIA-酵素免疫試驗 ____ _ 87 本纸張尺度边用中囷a家標準(CNS)A4規格__(2丨〇χ297公a)—------- 1329019 A 7 Q7 五 '發明說明⑦ίΛ FBS-胎牛血清 H2〇r過氧化氫 HRP-嫜菜過氧化酶 Ig-免疫球蛋白 5 IL-6-介白素_6 IP-腹腔内 IV·靜脈内 Mab-單株抗體 OD-光學密度 10 OPD-o-笨二胺二氣化氮 PEG-聚乙二醇 PS4-盤尼西靈、鏈黴素、amphotericin ’RT·室溫 SQ-皮下 I5 v/v-體積/體積 w/v-重量/體積 經濟部智慧財產局員工消货合作社印製
實例1產生鼠類CLB8 MAB 免疫 20 產生鼠類CLB-IL6-8抗體之融合瘤係來自如發表 (brackenhoff 等人，免疫學雜誌（1990) 145 : 561-568 )Lucien Aarden 博士實驗室（Central Laboratory of the Netherlands Red Cross Transflision Service ( CLB ))中執行的融合。 得自CLB無特定病源菌繁殖庫之8週大Baib/C母鼠係以 88
10微克純化重組介白素_6 (rlL_6) (CLB)乳化comp丨ete Freund’s佐劑肌肉内（IM)免疫，在4_8週間隔時分別以 Imcomplete Freund’s佐劑中1〇微克rIL_6進行之後3次的IM 注射。 5 細胞融合 最後一次IM刺激注射後4天，犧牲一隻小鼠，取出脾臟 並元全剪碎’單一細胞懸浮液係於周圍Earle氏平衡鹽類溶液 中得到’清洗細胞並計數’以存活脾臟細胞對鼠類骨髓瘤細 月包（SP2/0-Agl 4 )係1 :3之比例在42% ( w/v)聚乙二醇Iscove 10 氏改良Dulbecco氏培養液（iMDM)存在下進行融合，非Ig 分泌融合夥伴SP2/0係由CLB維持的細胞庫建立。融合後， 將乡f胞重新懸浮於IMDM中，補充5%胎牛血清，50微莫耳 r. 绝濟部智慧財產局員x消费合作社印龙 濃度盤尼西靈/鏈黴素，5χ ΙΟ·5莫耳濃度2-氫硫基乙醇(2-ME) 和HAT (6x 10'4莫耳濃度次黃嘌呤、6.5χ 1〇-7莫耳濃度胺基 15蝶吟、6·4χ 105莫耳濃度胸腺鳴咬）。該等融合瘤在融合後之 增殖係依賴【L-6，因此將ιοου/毫升純化的屬類il~6 (Van Smick，Brussels)加至篩選培養液中，之後將融合細胞以ιχ 1〇5細胞/100微升孔分至96孔盤中。 20 鼠類抗IL-6融合瘤之主要定性 抗IL-6分泌融合體係以酵素連結免疫吸附試驗（ELISA) 和放射免疫試驗（RIA)篩選（Brckenhoff等人（1990) 145 : 561-568)。固相ELISA係使用於篩選人類16特異性單株抗 體’將純化的rIL-6 (0.5微克/毫升）在室溫下磷酸鹽緩衝食 ___89 本紙張尺度通用標準(CNS)A4規格（210x297公' -- 1329019 五、發明說明（紗） 鹽水（PBS )中於平底盤（Dynatech )上被覆（1 〇〇微升/孔) 隔夜，將盤子以 PBS/0.02% (v/v) Tween 20 (PBSmveen) 清洗，並以培養上清液與PBS/Tween補充0.2%明膠（PTG) 1 : 2稀釋培養於周圍環境溫度下2小時。清洗後，將盤子培 5養於蘚菜過氧化酶連結單株大鼠抗小鼠κ輕鏈226 (愛因斯坦 大學’紐約）於PTG (2微克/毫升）中1小時，清洗盤子並 以100微升/孔3,5,3,5-四甲基聯苯胺/0.003%過氧化氫於〇.1 . 莫耳遭度乙酸納（酸驗值5.5)中偵測連結的過氧化酶。以2 莫耳漠度硫酸終止呈色反應，並於Titertek( Multiscan讀值機） 10上在450奈米下讀盤，選擇產生陽性〇D的孔。 固相RIA亦用於篩選抗il-6融合瘤。將山羊抗鼠類ig 抗輝與演化氰活化的瓊脂糖CL-4B (Pharmacia)偶合，清洗 瓊脂糖’並以10毫克/毫升重新懸浮於PBS/〇 Tween2〇/〇j a %疊氮化鈉t。將融合瘤上清液於大約20,000計數/分鐘碘 125 15 -rIL-6(CLB)存在下加至瓊脂糖珠中6小時，並持續攪拌。 將珠子於PBS/Tween中大量清洗並以γ計數器計數，選擇產生 最高特異活性的孔。 經濟部智慧財產局員工消f合作社印製 建立在二個試驗系統中皆為陽性的融合瘤，並以限制稀 釋於IMDM補充2χ 1〇_5莫耳濃度2-ΜΕ和5% FBS (完全 20 IMDM)中再選殖二次，篩選IL-έ不依賴株落CLB-IL6-8並 維持於完全IMDM中’儲存培養物係於培養在Vero76目標細 胞上4天後以間接Hoescht染色測試黴漿菌陰性。藉由
Innogei>etics Line ImmunoAssay (INNO-LIA)小鼠單株抗體同 型套組進行上清液之同型確而產生單一鼠類同型IgG1 κ，同 90
本纸張尺度適用中困國家標準(CNS)A4規格(2l〇x297TjT 1329019 A7 B7 五、發明說明（对） 型之破定係利用捕捉EIA來確認。 鼠類融合瘤和細胞株係如此產生，CLBIL-6/8係稱作 CLB8，其係喪合並另如下所述定性。 5 實例2:嵌合化和定序 選殖並表現cCLB8變異區基因 基因體DNA係由可分泌人類IL-6特異性鼠類單株抗體 , 之鼠類融合瘤C143A中分離。 在輕鏈’以限制内切酶Hind III消化DNA，並經由0.8 10 %瓊脂膠電泳’切除包含大約3.4仟鹼基長度DNA片段之膠 體部分’並洗滌出DNA。將片段連結至vector8charon27，並 包笔至噬菌體顆粒_。在重鏈，以限制内切酶Eco rj消化 DNA，並經由0.8%瓊脂膠電泳，切除包含大約3 6仟鹼基長 度DNA~片段之膠體部分，並洗滌出DNAi將片段連結至 15 vect〇r8gtl0，並包裝至嗔顏體顆粒中。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 將重和輕鏈噬菌體庫覆蓋於大腸桿菌上並生長隔夜，將 嗔菌斑轉移至頌基纖維素遽紙上，且以3中_標記相對於鼠類^ (輕鏈）或鼠類JH序列之DNA片段偵測。確定陽性噬菌斑 並純化噬菌斑。分離噬菌體DNA，且分離Hind III (輕鏈） 20或反〇 111 (重鏈）插入物，並選殖至免疫球蛋白表現載體。 重和輕鏈表現質體係用於共同轉染SP2/〇細胞，並使用黴 酚酸篩選，辨識產生嵌合抗體之個別株落並再選殖以確定單 株性且產生更高的製造者。 由個別細胞株純化的抗體係於IL_6依賴B9細胞增殖試 91 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS>A4規格（210 X 297公釐） 1329019 A7
五、發明說明（和） 驗中測試其中和能力’在本專利申請案中抗體係稱作嵌合 CLB8 或 cCLB8。 cCLB8重鏈變異區 5
Ξ ν 〇 I- v E s G G K L L K P G G S L ：< L
GAG GTG CAA CTG GTG GAA TCT GGA GGA AAA TTA CTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AAA CTC
SCAA-SGFTFS S F A M S W F R Q S
TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TTT GCC ATG TCT TGG TTT CGC CAG TCT 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 92 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（2丨0X297 公¾) 1329019 A7 B7 五、發明說明ff1) CEN 270 CDR 1
PEKRLEWVA EISSGGSYTYY CCA GAG AAG AGG CTG GAG TGG GTC GCA GAA ATT AGT AGT GGT GGG AGT TAC ACC TAC TAT CDR 2
P D T V~ T G RFTISRDNAKNTLY CCT GAC ACT GTG ACG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTG TAC
LEMSSLRSEDTAMYYCAR G_L
CTG GAA ATC AGC AGT CTG AGG TCT GAG GAC ACG GCC ATG TAT TAT TGT GCA AGG GGT TTA WGYYALDY WGQGT S V T V S S TGG GGG TAC TAT GCT CTT GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA CDR 3 cCLB8 Light Chain Variable Region 經濟部智慧財產局員工消货合作社印製
QIVLIQSPAIMSASP G一 E K V T CAA ATT GTT CTC ATA CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC 93 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1329019 A7B7 五、發明說明CP)
S Υ Μ Y w
Y
Q Q Κ Ρ G Μ τ C S A s s s V___ ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTA AGT TAC ATG TAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CDR 1
S S P R
L I Y D T S
L A S G
P V CEN-270
TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GTT CGC CDR 2 fsgsgsgtsysltisrmeae
TTC AGT QQC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAG
DAAT YYCQQ
W
S G Y P Y T GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT GGT TAC CCA TAC ACG CDR 3
GGG GGA GGG GGG 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 T K L E I K ACC AAG CTG GAA ΑΤΑ AA/ 20 實例3 :利用固相EIA測量cCLB8與人類il«6之連結固相EIA係用於分析CCLB8 Mab與人類il-6之連結特 性。簡言之，4°C下以PBS中1微克/毫升重組人類IL-6(RDI) 被覆盤子隔夜，以包含0.02% (v/v) Tween 20之0.15莫耳濃 94 本紙張尺度適用中國困家揉準(CNS)A4規格（2丨〇 X 297公爱） 1329019 A7 B7 五、發明說明⑼） 度生理食鹽水清洗後，以PBS中1% (w/v) BSA，200微升/ 孔於室溫下阻隔孔1小時，由起始濃度5微克/毫升以2倍序 列稀釋的純化抗體於37°C下培養1小時，清洗盤子且之後以 1 : 20,000倍稀釋1% BSA-PBS中50微升/孔的HRP-標記山 5 羊抗人類IgG (Tago)於室溫下偵測1小時，再清洗盤子，並 在室溫下加入100微升/孔的檸檬酸鹽-磷酸鹽受質溶液（0.1 莫耳濃度檸檬酸和〇·2莫耳濃度磷酸鈉，0.01% h2o2和1毫克_ '/亳升OPD) 15分鐘’之後加入25微升/孔的終止溶液（4N 硫酸）’並使用自動盤式光度計定量490奈米下的吸光值。圖 10 1所示係490奈米下cCLB8與IL-6連結之測量，其證明CCLB8 係以濃度依賴方式與重組人類IL-6連結。 贯》 實例4:活體外中和試驗 ά CCLB8阻斷IL-6可抑制IgM和MCP-1的分泌 15 嵌合單株抗體cCLB8係於2個簡單的生物試驗型中分析 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 以確定其對IL-6誘發人類IgM和化學激素MCP-1分泌之中 和生物活性。二種人類細胞株係使用於該試驗中，SKW6.4 細胞株原始係來自EBV轉形Burkitt氏B細胞淋巴瘤，且可 對IL6反應而分泌可溶性IgM ; U937細胞株係單核母細胞且 20負責單核球細胞之分化’且原始係分離自具有分散組織細胞 淋巴瘤之病患’ U937細胞可對IL6反應而分泌]viCP-1 〇由於 其可輕易地使用EIA型監控’因此評估cclB8抑制該等特定 之生物活性。在試驗前’將細胞血_清饥餓隔夜，且之後隔天 以單獨IL6或預先與不同濃度抗體或陰性對照抗體培養之 95 1329019 A7 B7 五、發明說明（％)---〜- 培養’總共72小時的培養後，收集上清液並用於IgM特異性 和MCIM特異性EIA。如圖2和3所示之結果證實cc咖 可在活體外顯著抑制IL6媒介IgM和MCiM的分泌。 在圖2表示的實驗中，EIA盤係於4°C以10毫莫耳濃度 5碳酸鹽緩衝液（g复驗值9.6)中山羊抗人類柳此化特異性片 段被覆隔夜，盤子係以具有〇 〇2% v/v Tween 2〇之〇 15莫耳 /農度生理食鹽水清洗’並以pBS/1% w/vBSA阻隔丨小時以 ,2倍序列稀釋加入細胞培養上清液，培養及之後以〇 〇2% Tween/〇.15莫耳濃度生理食鹽水清洗後，以HRP-標記特異性 10山羊抗人類1gMg鏈偵測盤子，之後加入OPD受質且隨後發 展呈色’於490奈米下讀取吸光值，資料顯示冗乙別而非同 型喂對陰性對照嵌合mAb可抑制igMp分泌。 户. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在圖3表示的實驗中，EIA盤係於4°C以10毫莫耳濃度 複酸鹽緩衝液（酸驗值9.6)中山羊抗人類MCP-1被覆隔夜， 15 盤子係以具有0.02% v/v Tween 20之0.15莫耳漠度生理食鹽 水清洗，並以PBS/1% w/v BSA阻隔1小時，以2倍序列稀釋 加入細胞培養上清液’在2小時培養及之後以0.02% Tween/0.15莫耳濃度生理食鹽水清洗後，依個別製造商指示 以生物素化抗人類MCP-1偵測盤子，再次清洗盤子，_並加入 20 HRP-標記鏈抗生物素1小時，以TMB受質進行呈色發展， 於450奈米下讀取吸光值，資料顯示cCLB8而非cK931可抑 制11^6媒介MCP-1產生。 中和IL-6媒介的STAT3磷酸化 96 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） A7 ____B7___ 五、發明⑹ ~~~--- [L6受體係由8〇仟道耳吞連結副單位IL6Ra和訊息傳遞 副單位gpl30組成，IL6可與IL6Ra副單位連結，起始IL6Ra 和gpl30的連結而導致高親和性的受體及訊息傳遞 亦可以可溶型存在，IL6可與可溶型IL6R (sIL6R)連結，且 5該複合物可作用於表現卽130的細胞上。IL6已顯示可活化 STAT3 ’人類急性單核球細胞血癌細胞株ΤΗρ_ι係用於證實 以 cCLB8 抑制 STAT3 磷酸化，以（IL6+ SIL6R) +/_cclB8 • 或不相關抗體（K931)刺激細胞作為陰性對照。以抗staT3 免疫沉殿細胞溶解液’將樣品於7.5% SDS-PAGE上分析並轉 10 移至Hybond-P膜上’接著使用抗磷酸酪胺酸-hrp進行西方 點墨法，ECLplus係用於伯測。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 r圖4代表之資料顯示當（a)在加入sil6R前使其與rhiL6 連結，（b)在加入rhIL6前使其與sIL6R連結，或（c)在加 又cCLB8和細胞前使rhIL6與sIL6R連結時，cCLB8可抑制 15 STAT3峨酸化《將THP-1細胞培養於無血清之培養液中16 小時’由燒瓶上刮下並重新懸浮於0.5毫升培養液中，將IL6+/-，抗體培養15分鐘’之後加入sIL6R並培養15分鐘，加入細 胞且再培養15分鐘（第2-6列）。將IL6與sIL6R培養15分 鐘’之後加入CLB-IL6並培養15分鐘，加入細胞且再培養 20 15分鐘（第7列）。以抗STAT3 ( 1微克/毫升）免疫沉澱樣 品，重新懸浮於Laemmli樣品緩衝液中，且於7.5% SDS-PAGE 上分析並轉移至Hybond-P，以抗麟酸酪胺酸-HRP與膜培養。 cCLB8抑制血清澱粉狀蛋白A產生 97 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（2丨0x297公釐） 1329019 A7 B7 五 '發明說明（％) IL-Ιβ係人類IL-6存在下HepG2人類肝癌細胞產生血清 殺粉狀蛋白A(SAA)具有潛力之誘導物（Smith和McD〇nald，
Clin，Exp· Immuno丨.90 : 293-9 ( 1992 ))，因此分析 cCLB8 Mab 抑制IL-_L-6誘發該等細胞產生saA之能力。簡言之，將 5 HePG2細胞以2.25χ 105/孔培養24小時’ IL-6 ( 100奈克/毫 升’ RDI)和IL-6sR (200奈克/毫升，s&D)預先培養30分 鐘’並與IL-Ιβ (1奈克/毫升，r&D)混合，將cCLB8 Mab . 與一陰性同型對照Mab (cSF25)序列稀釋’且之後與上述混 合物再預先培養30分鐘。 10 在圖5所示之實驗結果，將序列稀釋的cCLB8或cSF25 (同型配對不相關的Mab)與IL-6sR和IL-Ιβ預先培養，且 之嗥與HepG2細胞培養24小時，之後將細胞上清液利用 ELISA (人類SAA ELISA套組，Biosource，根據製造商指示 操作）分析血清澱粉狀蛋白A產生量’誤差線表示二重複樣 15品之SEM。圖5之資料顯示cCLB8可以劑量依賴方式抑制 IL-lp/IL-6 誘發 HepG2 細胞產生 SAA。 以cCLB8 Mab抑制IL-6誘發的細胞增殖 經濟部智慧財產局員工消f合作社印製 鼠類B骨髓瘤細胞株7TD1可在IL-6存在下誘發增殖， 20為了證實cCLB8 Mab中和IL-6活性之能力，將細胞與序列稀 釋的cCLB8 Mab或陰性對照Mab 17-1A培養於37°C下包含 10% FBS和0.5奈克/宅升重組人類il-6 (R&D Systems)之 IMDM· t 72小時’利用發光ATP試驗測量細胞增殖(ATPLite， Packard Bioscience)，其係直接與細胞數目相關。 98 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（2丨0\297公爱） 1329019 Λ7 87 五、發明說明C?7) 圖6所不之資料證實IL_6可顯著刺激7tdi細胞增瘦， 且cCLB8係以遭度依賴方式抑制該細胞增殖# Ε〇5〇為7 2 奈克/毫升。誤差線表示二重複樣品之SEM，*表示細胞在缺 少rIL-6時之增殖。 15 實例5 :抗原決定位圏譜 包括CLB8之數種中和性抗IL_6獅抗原*定位已使用 BraCkenh〇ff，J.等人（免疫學雜誌 145 : 561-568 ( 1990))描述 可與人類IL-6突變蛋白質連結之抗體定性，製備胺端和竣端 刪除犬I，並利用抗體競爭實驗分析IL_6抗體。根據競爭研 究將中和性Mab分為2組（I和π)，在該方法巾，包括於已 知yab抗原決定位中的殘基係以其無法辨識抗原蛋白質相對 位置特異性單一胺基酸取代變異體來描述，Clb.IL-6/8之圖 譜係在人類IL-6分子之位置I上，其係由接近分子羧端之胺 基酸Gln29-Leu34組成。其他的研究（Kalai，M等人，Eur jBiochem. 249, 690-700( 1997))顯示 CLB.IL-6/8 可辨識對 IL-6 與IL-6R (gp80)連結重要之胺基酸殘基。該等研究亦顯示其 抗原決疋位涵盖IL-6分子之ΑΒ套環和d螺旋區二端。 i 計 線 绠濟部智慧財產局員工消費合作社印¾ 20 實例6:活體内定性 以抗人類IL~6 (cCLB8)和抗小鼠IL_6小鼠Mab治療來延 緩癌症惡病質 將人類黑色素瘤細胞（A375S2)接種於母裸鼠，且Mab 治療係於同一天開始，將抗體以10毫克/公斤（每週2次）之 99 本緘張尺度適用t國a家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1329019 Λ 7 07 五、發明說明（許1 劑量腹腔内注射，且C57 (抗CMV)係用作對照單株抗體。 cCLB8 (抗人類IL-6 )和MP520F3 (小鼠IL-6單株抗體，R&〇 Systems)之合併係用於產生合併阻斷而顯著抑制具有人類黑 色素腫瘤之動物相較於對照抗體C57治療動物體重之減輕 5 (圖7)。抗體治療並不會影響腫瘤生長或最終腫瘤重量，該 等發現顯示IL6參與腫瘤誘發的動物重量減輕，且在該模式 中阻斷IL6可延緩癌症惡病質。 圖7.合併阻斷人類和小鼠IL6 (抗IL6cCLB8和 MP520F3)導致動物體重減輕之顯著抑制❶丫轴上校正之動 10物體重減輕係（試驗終了時動物體重-腫瘤重量）減去試驗開 始時的動物體重。各個柱狀圖係來自每組至少14隻動物之平 均声料，且誤差線代表標準差，二端卜試驗分析顯示抗IL6 組可顯著抑制體重減輕（p=〇 〇〇7)。 Λ 15 實例7 :親和性測量 經濟部智慧財產局員工消费合作社印货 BIAcore 2000、Sensor Chip CM-5 (晶片上金表面覆蓋叛 基曱基化糊精基質）、HBS (10毫莫耳濃度hepes具有〇 15 莫耳濃度NaCl、3.4毫莫耳濃度EDTA和0.05%界面活性劑 P20，酸鹼值7.4)、胺類偶合劑（N-經基琥珀醯亞胺（2^HS )、 2〇 N-乙基-Ν’- (3-甲基胺基丙基）_碳二醯胺（E〇c)和1莫耳 濃度乙醇胺HC丨）係由BIAcore得到，且依據製造商指示製 備，抗人類 Fc (Jackson AffmiPure 山羊抗人類 IgG Fcy，Cat# 109抓098，Lo_646)係購自 jacksonImmun〇Re臟h。 5毫升G.15莫耳濃度紐莫耳濃度4酸納（酸 ____ 100 本纸張尺度通用申3國：標利CNS)A4規格（210x297公爱） 1329019 Λ 7 Β7 五、發明說明（竹） 鹼值7.2)中嵌合CLB8 (Lot#PDlF03) IgG單株抗體係由 Centotor 製造，重組人類 IL6 (Lot#A1197111)係購自 r&d Systems ° 將抗人類Fc (1.8毫克/毫升）以50微克/毫升之濃度稀釋 5 MNaOAc緩衝液（1〇毫莫耳濃度，S楚驗值4.8)中，並使用 製造商的胺類偶合化學劑如BIAcore系統手冊之描述偶合至 CM-5感應器羧基甲基化糊精基質。使用目標係1〇〇〇〇RU之 • 表面製備專家，將感應器表面上的缓基先以NHS/EDC活化， 之後加入抗人類Fc，利用注射1莫耳濃度乙醇胺阻斷殘餘的 10活化基，各個流體細胞係分別偶合。使用該等條件製備4種 包含抗人類Fc 7554-9571共振單位（RU)之流體細胞表面。 在Γ先期實驗中’確定三次注射（30微升/分鐘，15微升）1〇〇 毫莫耳濃度H3P〇V〇.05% CHAPS可有效移除連結的免疫球蛋 白’並保存固定化抗人類Fc之連結能力。 15 二個實驗係於25°c BIAc〇re上執行，且流速係30微升/ 分鐘，將CCLB8以5微克/毫升溶解於中，分析物IL6 係以 0.25、0.125、0.062、0.031 和 0.015 微克/毫升溶解於 hbs 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 中，將設計量抗體加至其個別流體細胞，接著以3〇微升/分鐘 (連結相）注射30微升各個IL6濃度，以及不中斷咆800秒 20緩衝液流（分離相）。以3次同時注射15微升分別係100毫 莫耳濃度H3P〇4/0.05% CHAPS重新產生晶片表面。hbs之注 射係作為分析大量折射指標扣除之參考（空白感應圖）。使用 BIA分析3.0中1 : 1模式完成二分離之局部代入（kd，[s l] 和連結（ki [M-ls-1])和分解常數（助調）計算（kd/ka》。
__ 37 1329019 .Λ / 五、發明說明（w) 使用ΒΙΑ評估3.0版完成分析’動力常數係來自感應圖 資料利用代入衍生自交互作用機制模式速率方程式之實驗曲 線’以局部Rumax代入、ka、k£j、KD使用1 : 1連結模式確 定完整分析（表1)。 表1 :以Biacore進行cCLB8 Mab親和性測量 樣品 ka ( m V1) (x 106) kd (s'1) (x 10_5) k〇(M)(x ΙΟ·11) Chi2 cCLB8 1.1 6.2 5.7 0.111 cCLB8 0.37 5.2 14 0.236 V 實例8:抗個體型變異抗體 ，、 用於cCLB8有效試驗系統（免疫組織化學和血清偵測） 10之發展需使用抗個體型變異抗體，因此，以cCLB8免疫Balb/c 小鼠產生cCLB8抗個體型變異抗體可用作血清偵測和免疫組 織化學試驗之藥物動力學探針。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 免疫 15 6-7 週大 5 隻 Baib/C 小鼠（Charles River Laboratories )係
於 12 週期間以 CCLB8 (Centocor，PD1F03)給予 50 微克 IP 和25微克SC免疫，各個小鼠皆接受ιρ和sc注射，整個免 疫攝生法中注射係以2週間隔發生。注射物質投藥ιρ係以等 體積的.Freund氏佐劑（sigma)乳化’第一次注射係使用 20完全Freund氏佐劑（總體積係200微升），之後的IP注射包 102 規格（2丨Ox 297公釐） 衣紙張尺度適用中a困家楳準(CNS)A4 1329019 「 ______ 37 五、發明說明（>/') 含不完全Freund氏佐劑。注射物質投藥父係稀釋於哪令， 且分為2個注射位置（100微升/位置）。於第〇、η、47和77 天時將小鼠採血’於麻醉小鼠利用眼帛穿刺進行血液收集， 並收集血清以eCLB8 _ EIA進行力價確定1疫流程終了 5後3週小鼠接欠稀釋於125微升pBS巾loo微克別 的最終IV增強注射。 產生小鼠cCLB8抗個體型變異抗體單株抗體 -次使用cCLB8免疫Balb/c顿脾臟之融合可藉由EIA 10產生7個cCLB8特異性抗個體型變異抗體之辨識，此7個抗 個體型變異抗體顯示不會與其他小鼠/人類嵌合抗體像是 C20；7A ' C128A ' C168J、C116J、C300A 和 C301A 連結，7 個抗體中的6個係IgGlK同型物，且！抗體係收加。表】 總結融合之結果，應注意到的是47天後小鼠體内可達到1 : 15 8〇〇之最高血清力價，且在整個免疫期間維持穩定。 確定同型 經濟部智慧財產局員工消费合作枉印說 抗體之同型確定係使用量液棒型小鼠單株抗體確定同型 套組（Life Technologies)來完成，將稀釋緩衝液、融金瘤上 20清液和大鼠抗小鼠連結物之混合物於室溫下在包含預先被覆 多種捕捉鼠類抗體同型物之棒子之管内震盪培養隔夜，將棒 子由管内移除’在水中輕輕地清洗並確定同型。 -__103 本紙張尺庋適用t 3國玄標準(CNS)A4規格（210 χ297公《 ) 1329019 Λ7 —_____07 五、發明說明（/0 抗個體型變異故枋鞞夕拄枓
c密碼 同型物 C433A IgGlK C434A IgGlK C435A IgGlK C436A IgG2bK C437A IgGlK C438A IgGlK C439A IgGlK 血清抑制試驗 ，確定收集正常人類血清（NHS)對7種抗個體型變異抗 ，、 5體與cCLB8連結之影響，在〇%、0.5%、5%和50% NHS存 λ 在卞將起始於50微克/毫升2倍稀釋抗個體型變異單株抗體培 養於37°C 30分鐘，將混合物轉移至cclb8被覆盤上，並於 37°C培養30分鐘，清洗盤子後以山羊抗小鼠IgG Fc 偵 經濟部智慧財產局員工消f合作社印製 測。無抗個體型變異單株抗體可為0%和0.5% NHS抑制連 10 結。三種單株抗體（C433A、C435A和C437A)具有5% NHS 之部份連結抑制，除C434A和C436A外全部皆會為5〇% NHS 濃度顯著影響（圖8A-G)。 以抗個體型變異單株抗想抑制cCLB8與人類IL5連結 15 分析7種抗個體型變異抗體抑制cCLB8與人類IL6連結 之能力，之前的EIA研究顯示cCLB8可非常微弱地與人類亿6 104 本纸張尺度通用中囡國家標準(CNS)A4規格（210x297公龙） 1329019 A 7 B7 五、發明說明（的) 被覆盤連結’ 2種單株抗體(C435A和C437a)在超過6 25 倍濃度時證實可完全抑制cCLB8與人類亿6之連結，⑽八 僅在超過25倍時對CCLB8表現抑制作用，對cCLB8與人類 IL6抑制連結之2種最佳抗體係C436A和以胤，該2種抗 5體在超過3至25倍濃度範@時可完全抑制eCLB8連結， C433A和C438A顯示無抑制能力（圖9)，該試驗證實在先期 試驗中得到的結果》 抗個體型變異抗趙與預先連結人類IL6之cCLB8的連結 1〇 制7種抗個體型變異抗體與預先連結人類IL6之 cCLB8的連結能力。將1〇微克/毫升cCLB8培養於人類 'IL6盤上30分鐘，清洗盤子後與起始於1〇微克/毫升3倍稀 #之抗個體型變異單株抗體培養於3T>C 3〇分鐘，清洗盤子 後以山羊抗小鼠IgG Fc *HRP偵測。在先期研究中，C436A 15和C438A係唯一可與預先連結人類IL6之CCLB8連結之抗 體。圖10係描述7種抗個體型變異抗體對預先連結人類IL6 之CCLB8的連結能力。 _ 總之’7種單株抗個體型變異抗體係由鼠類骨髓瘤細胞和 20嵌合抗人類1L6抗體（CCLB8)免疫Balb/c小鼠的脾臟細胞 融合產·生’ 5種抗個體型變異抗體（C434A、C435A、C436A、 C437A和C439A)可阻斷CCLB8與人類IL6連結，2種抗體 105 本纸張尺度適用t國a家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） i 計 線 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 ______37 _ 1329019 A 7 五、發明說明（丨o(〇 (C436A和C438A)具有與預先連結人類IL6之cCLB8連結 之能力’且2種抗體（C434A和C436A)與cCLB8之連結完 全不受任何測試濃度NHS之影響’該等CCLB8抗個體型變 異抗體之廣泛連結圖使其某些係血清偵測和免疫組織化學試 5 驗中用作藥物動力學探針具潛力之候選物。 將了解的是發明可在之後描述或實例中執行，除非特別 描述。 . • 本發明之許多改良和變異根據以上技術係可能的， 皆在附加專利範圍之範疇中。 此、’因此 經濟部智慧財產局員工消t合作社印製 % 適 度 尺 張 紙 本 標 家 國 囡
格 規 4 )A 公 7 9 2

Claims (1)

  1. 專利申請案第91133208號 ROC Patent Appln. No. 91133208
    (氏國99年_j月10日送呈）- (Submitted on March 10,2010) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 •;=離=6二體序:_，其包含具有序列 A。 之胺土酸序列的重鏈變異區域、具有序 辨线戒碼.8之胺基酸序列的輕鏈變異區域及衍生 自一或多個人類抗體之不變區域。 5 2.-種經單離之IL_6抗體或抗體片段其包含具有選自 序列辨為號喝.！至6之胺基酸序列的互補決定區域 (CDRs)及衍生自—或多個人類抗體之不變區域。 3·如申請專利範圍第1項之IL-6抗體或抗體片段，其中 該抗體或片段在活體内可競爭性抑制抗IL-6鼠類抗體 10 CLB·8與人類IL-6之結合。 4.如申請專利範圍第1項之IL-6抗體或抗體片段，其中 該抗體或抗體片段與IL-6結合之親和性（Kd)為至少 莫耳濃度。 5·如申請專利範圍第1項之IL-6抗體或抗體片段，其申該抗 15 體或抗體片段與IL-6結合之親和性（Kd)為至少10-h>莫 耳濃度。 6_如申請專利範圍第1項之IL-6抗體或抗體片段，其中該抗 體或抗體片段與IL-6結合之親和性（Kd)為至少1〇-11莫 耳濃度。 20 7.如申請專利範圍第1項之IL-6抗體或抗體片段’其中該抗 體或抗體片段與IL-6結合之親和性（Kd)為至少1〇·12莫 耳遭度。 8.如申請專利範圍第1項之IL-6抗體或抗體片段，其中 該抗體或片段係本質上可中和至少一種1L-6蛋白質之 -1 - 家標規格(2丨'
    六、申請專利範圍 至少一種活性。 9.如申請專利範圍第i 該活性係至少— mu 10 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 A8 B8 C8 D8 項之IL-6抗體或抗體片段’其中 種選自抑制SKW"6.4細胞分泌IgM 、抑制IL_6媒介之MCP-i產生、抑制IL-6在THP-1人類單核血癌細胞中傳遞訊息、抑制il_6誘發 HepG2細胞產生血清殿粉樣蛋白八，以及抑制rhIL6 誘發之細胞增殖組成之群。 一種經單離之核酸分子，其包含編碼IL_6抗體或抗體 片，之核苷酸序列，該抗體或抗體片段含有具序列辨 5戠號碼：7之胺基酸序列的重鏈變異區域及具序列辨 識號碼.8之胺基酸序列的輕鏈變異區域及衍生自一 或多個人類抗體之不變區域。 Π'種經單離之編碼抗體或抗體片段之核酸分子，其包 含序列辨識號碼：9至14之互補決定區域（CDRs)的 編碼核苷酸序列及編碼衍生自一戒多個人類抗體之不 變區域的核苷酸序列。 12. 種經單離之編碼抗體或抗體片段之核酸分子，其包 含編碼序列辨識號碼：1至6之互補決定區域 (CDRs)胺基酸序列之核苷酸序列及編碼衍生自一或 多個人類抗體之不變區域的核苷酸序列。 13. —種抗體載體，其包含如申請專利範圍第10、11或 U項之核酸分子。 14·如申請專利範圍第13項之抗體載體，其中該載體包含 至少一個選自晚期或早期SV490啟動子、CMV啟動 -2 -
    六、申請專利範圍 % HS^/^ tic έΛ· Xt 敬動子、pgk (磷酸甘油酸酯激酶）啟動 子、人類免疫球蛋白啟動子或EF-1 α啟動子組成之群 之啟動子。 15.如^明專利範圍帛13項之抗體載體，其中該載體包含 、 心自至少一個胺甲蝶吟（methotrexate ) (MTX)、綠色螢光蛋白（GFp)、二氫葉酸鹽還原酶 (DHFR)、新黴素⑹⑴或穀胺酸合成酶（gs)之 篩選基因或其部分。 16’種估主細胞’其包含如申請專利範圍第12項之經單 10 離之核酸分子。 17.如申請專利16項之宿主細胞，其中該宿主細胞 係至 乂 種選自 COS]、c〇S-7、HEK293、BHK21、 CHO BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、骨 15 f瘤或淋巴瘤細胞，或其任何衍生物、不死或轉形細 I :種Μ抗體或抗體片段之方法，其包含在活體 二:Π内或原位條件下’使Μ抗體或抗體片段以 酸分==回收量表現將㈣請專利範圍第12項之核 ⑽，其㈣料糊第u項之 Μ二抗體編碼核酸組合物，其包含如申請專利範 21 一種經早離之核酸分子及载劑或稀釋劑。 A 一種以抗體組合物或抗體片段組合物，其包含如申 本紙張尺度適用中國國家標) 1329019 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α8 Β8 C8 D8 六、申請專利範圍 請專利範圍第2項之經單離之IL-6抗體或抗體片段以 及載劑或稀釋劑。 22. 如申請專利範圍第21項之組合物’其另包含至少—種 選自至少一種TNF拮抗劑、抗風濕劑、肌肉鬆弛劑、 5 麻醉劑、非類固酵抗發炎藥（NSAID)、止痛藥、麻醉 藥、鎮定藥、局部麻醉藥、神經肌肉阻斷劑、抗微生 物劑、抗牛皮癬藥、皮質類固醇、合成代謝類固醇、 糖尿病相關藥劑、礦物質、營養劑、甲狀腺劑、維他 命、鈣相關荷爾蒙、止瀉劑、止咳劑、止吐劑、抗潰 10 瘍藥' 輕瀉藥、抗凝劑、紅血球生成素、顆粒細胞株 落刺激因子（filgrastim )、沙葛莫斯汀 (sargramostim )、免疫劑、免疫球蛋白、免疫抑制 劑、生長激素、荷爾蒙取代性藥物、雌激素受體調於 劑、散瞳藥、睫狀肌麻痺劑、烷化劑、抗代謝劑、有 15 絲分裂抑制劑、放射性藥物、抗憂鬱藥、抗躁症劑、 抗精神病藥 '抗焦慮藥、安眠藥、擬交感劑 '刺激 劑、東尼培峻（donepezil)、塔克寧（tacrine)、氣喘 藥、β激動劑、吸入性類固醇、白三烯素抑制劑、甲= 黃。票吟、克莫林（cr_lyn)、正腎上腺素或相似物: 20 脫氧核醣核酸酶《、細胞激素或細胞激素拮抗劑之化人 物或蛋白質。 σ 23. -種使用免疫調控有效量之w請專利範圍第2項之 Κ抗體或抗體片段於製造治療動物中免疫障礙或疾 病之方法的醫藥品之用途。 、
    -4 · 1329019 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 24.如申請專利範圍第23項之用途，其中該免疫障礙或疾 病係至少一種選自類風濕性關節炎/血清陰性關節病、 骨關節炎、發炎性腸疾病、系統性紅斑性狼瘡、虹膜 睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經炎、自發性肺纖維變性、系 5 統性脈管炎/韋格納氏肉芽腫、結節病、睪丸炎/輸精管 截除逆轉術、過敏/異位性疾病、氣喘、過敏性鼻炎、 溼疹、過敏性接觸性皮膚炎、過敏性結膜炎、過敏性 肺炎、移植、器官移植排斥、移植物對宿主疾病、系 統性發炎反應徵候群、敗血病徵候群、革蘭氏陽性敗 10 血病、革蘭氏陰性敗血病、培養陰性敗血病、真菌敗 血病、嗜中性白血球減少熱、尿性敗血病、腦膜炎球 菌血症、外傷/出血、燒傷、離子性輻射暴露、急性胰 臟炎、成人呼吸窘迫徵候群、系統性紅斑性狼瘡和類 風濕性關節炎、酒精引發性肝炎、慢性發炎病、結節 15 病、克隆氏病、鐮形細胞貧血、糖尿病、腎病、異位 性疾病、過敏反應、過敏性鼻炎、花粉熱、常年性鼻 炎、結膜炎、氣喘、蓴麻疹、系統性過敏反應、皮膚 炎、惡性貧血、溶血性疾病、血小板減少症、任何器 官或組織的移植物排斥、腎臟移植排斥、心臟移植排 20 斥、肝臟移植排斥、胰臟移植排斥、肺臟移植排斥、 骨髓移植（BMT)排斥、皮膚異體移植物排斥、軟骨 移植排斥、骨骼移植物排斥、小腸移植排斥、胎兒胸 腺植入排斥、副曱狀腺移植排斥、任何器官或組織的 異體移植排斥、異體移植排斥、抗受體過敏反應、格 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）
    1329019 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 雷武司氏病、雷諾氏病、B型胰島素抗性糖尿病、氣 喘、重症肌無力、抗體媒介細胞性毒殺、第三型過敏 反應、系統性紅斑性狼瘡、天疮瘡、硬皮病、混合性 結締組織疾病、自發性艾迪孫氏病、糖尿病、慢性活 5 性肝炎、原發性膽硬化、白斑病、脈管炎、MI心切開 術後徵候群、第四型過敏症、接觸性皮膚炎、過敏性 肺炎、異體移植排斥、細胞内生物起因肉芽腫、藥物 過敏、代謝/自發性疾病、威爾遜氏病、血色素沉著 病、α 1抗胰蛋白酶缺少症、糖尿病性視網膜病、橋本 10 氏甲狀腺炎、骨質疏鬆症、下視丘-腦下腺-腎上腺軸評 估、原發性膽硬化、曱狀腺炎、腦脊髓炎、惡病質、 纖維性囊腫、家族性嗜紅血球細胞淋巴組織細胞症、 皮膚病症狀、牛皮癣、禿髮、腎病徵候群、腎炎、血 液透析、血尿、中毒、okt3治療 '抗cd3治療、細胞 15 激素治療、化學治療、放射治療（例如包括但不限於 無力衰弱、貧血、惡病質及類似物）、慢性柳酸鹽中 毒。 25.如申請專利範圍第23項之用途，其中該有效量係 0.001-50毫克/公斤該等動物。 20 26. —種使用有效量之如申請專利範圍第2項之IL-6抗體 或抗體片段於製造調控動物中至少一種癌性疾病或症 狀之醫藥品之用途。 27.如申請專利範圍第26項之用途，其中該癌性疾病或症 狀係至少一種選自血癌、急性血癌、急性淋巴母細胞 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）
    A8 B8 ^__C8 〃申凊專利範圍 性血癌（ALL)、B-細胞、Τ·細胞或FAB ALL、急性骨 趙性灰癌（AML)、慢性骨髓細胞性血癌（CML)、慢 性淋巴細胞性血癌（CLL)、髮細胞性血癌、脊髓發育 5 不良徵候群（MDS)、淋巴瘤、何杰金氏病、惡性淋巴 瘤非何杰金氏淋巴瘤、Burkitt氏淋巴瘤、多發性骨 髓瘤、卡波西氏肉瘤、結腸癌、胰臟癌、腎細胞癌、 胰臟癌、前列腺癌、鼻咽癌、惡性組織細胞症、副贅 瘤徵候群/惡性血鈣過多症、固體腫瘤、腺癌瘤、肉瘤 和惡性黑色素瘤。 28.如申凊專利範圍第％項之用途，其中該有效量係 0-01-100毫克/公斤該等動物。 29'種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第2項之IL-6抗體或抗體片段，以及至少一種無菌水、無菌緩衝 液及至少一種選自紛類、間-曱紛、對-甲酴、鄰-甲 15 酚、氣甲酚、苯甲醇、亞硝酸苯汞、苯氧基乙醇、甲 ^、氯丁醇、氯化鎮、烧基對苯、殺藻胺、氯化午乙 氧胺（benzethonium chloride)、去氫乙酸鈉和硫柳汞 或其混合物組成之群於水性稀釋劑之防腐劑。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 30. 如申請專利範圍帛2項之經單離之IL_6抗體或抗體片 20 段，其包含鼠類變異和人類不變區，其中該抗體或抗 體片段專一性地與包含至少丨_3之人類IL_6胺基酸 Gln29-Lev34之至少一個抗原決定位結合。 31. 如申請專利範圍第30項之IL-6抗體或抗體片段，其 中該抗體或抗體片段以至少1〇_9莫耳濃度之親和性與 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1329019 . as .， B8 C8 _D8_ 六、申請專利範圍 IL-6結合。 32.如申請專利範圍第30項之IL-6抗體或抗體片段，其中該 抗體或抗體片段以至少10_1G莫耳濃度之親和性與IL-6結 合。 5 33.如申請專利範圍第30項之IL-6抗體或抗體片段，其中該 抗體或抗體片段以至少10·11莫耳濃度之親和性與IL-6結 合0 34. 如申請專利範圍第30項之IL-6抗體或抗體片段，其中該 抗體或抗體片段以至少1〇_12莫耳濃度之親和性與IL-6結 10 合。 35. 如申請專利範圍第30項之IL-6抗體或抗體片段，其 中該抗體或抗體片段本質上可中和至少一種IL-6蛋白 質之至少一種活性。 36. 如申請專利範圍第35項之IL-6抗體或抗體片段，其 15 中該活性係至少一種選自抑制IL-6誘發IFNy分泌、 抑制LAK細胞毒性、抑制IFNy mRNA轉錄、抑制細 胞内IFNyCD3+細胞和CD95表現組成之群。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）
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