TW480178B

TW480178B - Cosmetic compositions containing resveratrol

Info

Publication number: TW480178B
Application number: TW087115185A
Authority: TW
Inventors: Robert George Carson; Krupa Patel; Marieann Carlomusto; Carol Annette Bosko; Sreekumar Pillai
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 1997-07-25
Filing date: 1998-09-11
Publication date: 2002-03-21
Also published as: DE69815099D1; WO1999004747A2; DE69815099T2; EP0980235A2; CN1327380A; AU8858498A; RU2203036C2; PL338451A1; ES2200362T3; KR20010022170A; CN1162145C; CZ295608B6; BR9810810B1; KR100514271B1; CZ2000283A3; JP2001510777A; HK1024417A1; EP0980235B1; WO1999004747A3; AU730825B2

Description

480178 五、發明說明（1) 詳細說明發明範圍本發明係關於含有白藜蘆醇種雌激素1粧品組合物，及-經由施二;直生之天然而調理皮膚之化粧方法。寻 σ物至皮膚上發明背景人類皮膚係由兩個主要層所組成：下面較而：上較：之層是表皮。真皮是提供強度，彈性7真凌，之該層。f遺著老化，減少了真皮層：厚=厚度予疋促成形成敏糟在老化皮中之部分原因。人^皮声=:這或表皮（其提供皮膚之彈性和障耸/之項層型式所組成。角蛋白细胞是Λ /士質）係由终多不同細胞人類表皮中細胞總數）。在生式C 7 5 — 8 0% 锸X - π Μ八/ 在表皮以内，角蛋白細胞在於四 &二I又ρ刀，。表皮之分化對於提供皮膚的基本功能為重要，P :提供保護性障壁對抗外部環境及防止身體 2失Ϊ ί t ·形成角化之被膜是角蛋白細胞分化的最後階

#又·成為角化之被膜开$志；§ ^ .. L 饥朕A风原因之酶，轉谷胺醯胺酶是表皮分化的標記’因此’增加真皮層厚度及增加表皮層中角蛋白細胞之分化的化學劑應是提供皮膚調理和抗老化利益之理想化合物· =雌激素和作用像雌激素之合成化合物可增加真皮層 ::又和滅V老化皮膚中之皺褶形成。在經絕期後發生之 ^膚的改變例如’皮膚乾燥’失去皮膚彈性和膨脹性歸因於缺乏激素產生。激Γ 、敗、4> 座玍雌激言療法防止或延緩與老化皮膚相

480178 五、發明說明（2) 關聯之許多此項改變（Creidi等，共軛之雌激素乳脂對於老化之面部皮膚的效果，Mat ur it as出版，19， p.211-23 ’1994)。一種合成之雌激素，正烯雌酚具有下列結構式：

此構造與天然雌激素，雌二醇的結構式極不相同。

近年來，植物雌激素（即：天然化合物，其具有雌激素狀活性且在植物中發現）日漸增加使用於治療目的。所敘述之某些用途是作為血膽固醇過少劑和抗動脈粥樣硬化症背J。治療心臟血管疾病（尤其斷經後婦人身體中者），治療老年人之骨髓疏鬆症及作為抗癌劑，尤其抗乳癌，婦人之子宮内膜癌和頸癌（Knight等，植物雌激素，略論，係由 }^1：111^七33公司出版，22:167-75;1995)。近年來，消費者要求含有π天然π之產物曰增。消費者洞悉化學合成物係環境上不安全。化學合成之成分可能含有

C:\Program Files\Patent\53976.ptd 第7頁 480178 五、發明說明（3) : - 粗糖化學劑。天然產物被認為係純而溫和而優於化學合成之產物、。然而，自植物源供應化糙品利益並不平凡。為了自π天然’’來源衍生真正利益，必須鑑定，，天然"源植物中之特定活性物，其真正供應化粧利益。一種熟知之植物雌激素是光茴香腦：

光菌香腦未經敘述供局部或化粧使用。 :白藜蘆醇是，增加角蛋白之刺激或刺本發明至少部分係以該項結論為基準，即一種植物雌激素，它能抑制角蛋白細胞增殖細胞分化及緩解與使用α _羥基酸潛在相關聯疼。、，白藜蘆醇是在各種植物中所發現之一種化合物。業已敘述來自各種植物之白藜蘆醇的離析和特性例如，日本軟花植物之根（P0weU等，植物化學，35，ρ·3 3 5，1 9 9 4 )，來自酒和葡萄（Goldberg等，農業食品化學期刊，43， P 二 1 8 2 0 ’> 1 9 9 5 )及 Cellotti 等，自乾燥之 Valp〇liceUa 葡萄中所獲得之某些酒的白藜蘆醇含量：Reci〇t〇和Amar〇ne， J· Chromafgr，A(荷蘭）73〇; 4 7 — 5 2，1 9 9 6 );及自花生植物培養物（K 1 nd 1等，美國專利案5 3 9丨7 2 4 )。紅葡萄和紅酒含有高量@自i蘆醇而此化合物據稱係飲酒人心'臟血管健

480178 五、發明說明（4) 康原因之一。另外，業已顯示··白藜蘆醇是強力之癌症化學預防劑和消炎劑，亦報導：白藜蘆醇能誘導人類前骨髓細胞白血病細胞之分化（Jang等，白藜蘆醇（自葡萄所衍生之天然產物）的癌症化學預防活性，科學2 7 5 : 2 1 8 - 2 2 0， 1 9 9 7 )。Jang等記述：白藜蘆醇之使用作為抗癌劑對抗培養物中致癌物處理之鼠皮膚細胞。業已敘述含有葡萄萃取物之化粧品組合物。例如，參閱：曰本專利申請案0 6 3 3 64 2 1的摘要（n JP 421”）中揭示：使用0. 5%葡萄萃取物在化粧品組合物中。Scaf i ldi等（美國專利案5, 6 8 3, 6 8 3 )和Zabotto等（美國專利案5, 4 3 9, 6 7 2 ) 中揭示··含有葡萄種子油之化粧品組合物。Gri at等（美國專利案5，1 7 1，5 7 7 )中揭示含有化粧果仁之化粧品泡沫。除去JP’ 421外，沒有一份文獻述及：欲使用之葡萄的任何數量。JP’ 421中教導0. 5%葡萄萃取物的存在。根據美國農業部之農業研究局，整個漿果中之白藜蘆醇濃度是大約1 5 ppm。因此，0. 5%葡萄萃取物中，白藜蘆醇濃度是0. 33微莫耳濃度或0, 0 0 0 0 0 7 5 wt%。上述之技藝並未記述使用白藜蘆醇於護膚或化粧使用，也未教導：白藜蘆醇是植物雌激素，或它抑制角蛋白細胞增殖，或它促進角蛋白細胞之分化，或它可控制經由α -羥基酸所造成之皮膚刺激。發明概述本發明包括護膚組合物其中包含：白藜蘆醇其數量自 0 . 0 0 0 0 2至1 0 WT%及一種化粧品界可接受之賦形劑。

C:\Program Files\Patent\53976. ptd 第9頁 480178 五、發明說明（5) 本發明亦包括改良或預防皺褶，起皺紋，乾燥，易剝落，老化或受光損害之皮膚狀況並改良皮膚厚度，彈性，伸縮性和膨脹性之方法，此方法包括對皮膚施加本發明之組合物。意欲將本發明的組合物供局部施加至已經乾燥，易薄落，起皺紋，皺褶，老化，受光損害之哺乳動物皮膚上，或可.將本發明組合物預防式施加至正常健康皮膚上來防止或減少惡化改變。本發明亦包括：供應雌激素活性至皮膚上之化粧方法，抑制人類皮膚中之角蛋白細胞增殖及增加角蛋白細胞分化。本發明另外包括控制皮膚刺激，刺疼或發炎（改善可經由α -烴基酸所造成）之化粧方法。關於此點，本發明亦包括含有白藜蘆醇連合以α-烴基酸之化粧品組合物。本發明之詳述白藜蘆醇（亦稱為5 -對羥基苯乙烯基間苯二酚，或3，4 ’ 5 -茂三醇）是本發明組合物之主要成分。白藜蘆醇具有下式

白藜蘆醇商業上可自Sigma公司獲得。就大體而論，本發明組合物中，白藜蘆醇的含量是在該組合物的以重量計0 . 0 0 0 0 2至1 0 %範圍内。為了降低成本及使效果達極大，較佳之白藜蘆醇數量是在0. 001%至5%之範

C:\Program Files\Patent\53976. ptd 第10頁 480178 五、發明說明⑹ "' 圍内’而最佳者是在0，1 %至5 %之範圍内。根據本發明之組合物亦包含一種化|庄品界可接受之賦带 f而充作組合物中白藜蘆醇的稀釋劑，分散劑或載體以便當將該組合物施加至皮膚上時，使利其分佈。係非或·除去水以外之賦形劑可包括液體或固體軟化劑，溶劑’保濕劑，增稠劑和粉末。一種特佳之非水載體是聚一甲基矽氧烷及/或聚二曱基，笨基矽氧烷。此發明之矽綱可能是具有範圍大致自大約1〇至1 〇，<〇〇〇, 〇〇〇mm2/s(厘斯托克斯）（c e n t i s t 〇 k e s )粘度（在2 5 °C下）之矽酮。特別需要者是低和高粘度矽酮之混合物。此等矽酮自通·用電氣公司可供應其註冊商標是Vicasil，SE和SF及自道康寧公司可供應（在2 0 0與5 5 0系列下）。可利用於本發明組合物中之矽鋼數量範圍大致是該組合物以重量計自5%至95%，以25後至9 0 %較佳。化粧品界可接受之賦形劑通常可形成組合物的以重量計 5%至99· 9%而以25%至8 0%較佳且在無其他化粧輔料存在時，可形成該組合物之餘額。該賦形劑較佳是以重量計至少8 0 %的水。較佳者，水構成本發明組合物的至少5 〇 w ΐ %，最佳者是組合物的6 0至8 0 w t %。在本發明的一具體實施例中，本發明組合物亦包括一種 α -羥（基）酸。經（基）酸加強增殖及增加角蛋白細胞中，神經胺生物合成，增加表皮之厚度和增加正常皮膚之脫屑而導致較光滑，較年青外觀之皮膚。

C:\Program Files\Pateat\53976.ptd 第11頁 480178 五、發明說明（7) 羥（基）酸可選自α -烴（基）酸，/5 -羥（基）酸（例如，水楊酸），其他羥基羧酸（例如，二羥基羧酸，羥基-二緩酸，羥基三羧酸）及其混合物或其立體異構體（DL，d或l) 之聯合體。含有白藜蘆醇抗刺激劑之最佳之本發明組合物包括乙醇酸及/或乳酸’因為現已發現此等成份具有造成應激之潛在性’但發現在供應化粧利益上，彼等是特別有效率。#

(基）酸較佳選自具有下列一般結構式（1)ia-羥（基）酸f 0H I (1) MCHC00H ' 其中M是H或含有1至27個壤原子之飽和或不飽和，直或烴鏈。一甚至更佳者’經（基）酸係選自乳酸，α—羥基辛酸，經 |基月桂酸，乙醇酸及其混合物。當立體異構體存在時，以 I L -異構體最佳。本發明組合物的特別優點即：可採用較高數量之羥基酸而不會造成皮膚刺激。存在於根據本發明之組合物中的羥丨（基）酸組份之數量較佳是以重量計0 Q1至20%，以2至12% 丨較佳，4至12%最佳。應了解者·以組合物的ρ Η值為基準，經（基）酸可以鹽類而存在’例如，錄鹽，舒或納鹽。雖然本發明組合物可具有2 · 5至1 〇的一般範圍内之任何 ρ Η值，但疋當彼寺在酸性ρ Η值時，本發明組合物係特別有

C:\Program Files\Patent\53976. ptd 第 12 頁

Γ/S 五、發明說明（8) 〜二（尤其如彼等含有一種羥（基）酸以3_5 值較 -、4 pH為最# ’以此等组合物是特別錢。 3 視情況選用之皮膚利益物料和化粧品輔料 -種油或油狀物料可連同乳化劑而存在，，乳化劑的平均親水/親油平衡( 以水乳液或水包油乳液。叩座生油包本發明組合物較佳包括防晒劑。防晒劑包括一般接田物，肉桂酸鹽和水揚酸醋。舉例而言，可^:生酸辛醋和Hi基_4_甲氧基乳基肉桂供應，其註冊商標各自是Parsol MCX和二笨=業上可用於乳液中之防晒劑的正確數量可能以對於日朵。經採射所需要之保護程度為基準而變更。、先中之uv輻時常將軟化劑摻合入本發明之化粧品組合化劑之含量其範圍可能是經組合物的以重。此等軟 50%，較❻是5%至3 0%間。卩將軟化劑在如此甬= 類下分類為酯類，脂肪酸和醇類，多元醇與烴吊化予分酯類可能是單酯或二酯。脂肪族二酯的可^反二己二酸二丁酯，癸二酸二乙酯，二又κ例包括二辛醋。可接受之支鏈脂肪(族）二括T由，，酸基一己酯，硬脂酸異丙酯和棕櫚酸異硬脂基酯α:乙三兀酸酯包括：三亞油酸三異丙酯和檸檬酸三文之接受之直鏈脂肪（族）酯包括：棕櫚酸月桂了 4酯。可孔酸十四烷

C:\Program Files\Patent\53976.ptd 第13頁五、發明說明（9) 酯和油酸硬脂基酯。較佳之 (椰子辛酸醋和椰子癸酸自旨二乙酸己二酸二異丙酯和適當脂肪醇與酸包括具有物。特佳者是此等化合物例和硬脂醇及酸。在可充作軟化劑之多元醇化合物。舉例而言，以丙一用者可此疋聚合之多元醇例二醇和丙二醇作為滲透加強可充作軟化劑之例示煙類烴鏈者。特定實例包括礦油烴。本發明的化粧品組合物内增稠劑通常係以組合物的大在，較佳係以重量計約0· 5% 古得異公司可供應之經交聯是Carbopol。可採用各種膠膠，明膠，刺梧桐樹膠，果下，增稠之官能可經由亦充現。例如，超過1 0厘米之矽酸酶具有雙官能度。可將粉末摻合入本發明的括：白堊，滑石，高嶺土，酷包括：椰子辛酸酯/癸酸酯匕摻合物），丙二醇十四烷基醚辛酸鯨蠟酯。 1 〇至2 0個唉原子之那些化合如錄蠟醇，十四烷醇，棕櫚醇中者是直鏈和支鏈烷基聚羥基醇’彳匕楸醇和甘油較佳。亦有如’聚丙二醇和聚乙二醇。丁劑亦特佳。是具有大致12至30個碳原子之 ’石油凍，角鯊烯和異鏈稀之另類的官能成份是增稠劑。致，以重量計0. 1至20%數量存至1 〇 %。例示之增稠劑是自之聚丙烯酸酯物料其註冊商根、例如，合成生物聚合膠，鹿^ 膠和刺槐豆膠。在某些環境作石夕酮或軟化劑之物料予以^ _膠和各種酯例如，甘油硬月匕化粧品組合物中。此等粉末勺殿粉，綠土黏土，化學改質t

480178 五、發明說明（10) 石f，紹鎮’有機改質之蒙脫土黏土，水合之矽酸鋁，煅製一氧T % ’殿粉辛烯基琥珀酸鋁及其混合物。 A fI將其他較少之輔料組份摻合入化粧品組合物中。此等組可包括著色劑，遮光劑和香料。此類其他較少之輔料組份的數量範圍可能大致是組合物的以重量計0，0 01 %至至多20% 〇組合物的用途根據本發明之組合物主要意欲作為局部施用至人類皮膚之產物’特別作為調理劑，使皮膚潤濕和光滑，防止或減少皺褶，起皺紋或老化皮膚之出現。於使用時’將少量的組合物，例如1至1 0 Om 1，自適當容器或施加器施加至皮膚的暴露區域上，若必須，使用手或手指或適當設備將它展佈及/或揉擦入皮膚中。產物形式和包裝可將本發明之局部皮膚處理組合物調配成洗液，乳液或凝膠。可將組合物包裝入適當容器中而適合其粘度和消費者之所思欲用途。例如，可將洗液或乳液裝入瓶中或滾球式施加器中，或推進劑驅動之氣溶膠設備中或配置適合手指操作之泵的容器。當組合物是乳液時，可將它簡單儲存入不變形之瓶中或擠壓容器例如管或有蓋之瓶中。亦可將組合物包括入膠囊中，例如美國專利案5，0 6 3，5 0 7中所述。將它併入本文以供參考。因此之故，本發明亦提供如本文中所界定之含有化粧界可接受之組合物的閉合容器。下列特定實例更進一步舉例說明本發明。但是本發明並非

C:\Program Files\Patent\53976. ptd 第15頁 480178 五、發明說明（11) 受限為此。在各實例中，白藜蘆醇係自s i gma公司獲得。使用學生t -檢驗來計算所有之p-值々實例1 此實例舉例說明：白藜蘆醇是一種植物雌激素。採用下列試驗以測定··是否白藜董醇具有雌激素狀活性： ZR75細胞線是管狀胸癌細胞線，源自63歲白種婦女的惡性乳上皮中離析出（Enge 1等，連續培養基中，人類胸癌= 胞：A reirew， Cancer Res.，38:4327-4339，1978)。此細胞線含有雌激素，黃體酮和其他類固醇激素之受體，但是僅對雌激素有反應（係通過增殖之增加）。該細胞線含有高親和力雌激素-指定受體。因此，使用此細胞線以試驗雌激素狀活性（Mark i ew i cz等，活體外生物測定非類固醇之植物雌激素類固醇生物化學期刊，M〇i ec. Bi〇i.，45 : 399 -405 1993)。 ’ 測定細胞中D N A合成速率所使用之方法論：使用經由培養之細胞摻合3h —胸腺嘧啶脫氧核苷作為檢疋細胞繁殖（ZR75細胞和角蛋白細胞兩者）。胸腺，咬脫氧核苷是四種脫氧核苷（其為!)!^之單體單位）之一。在生長細胞之細胞分裂前，重複歷經細胞分裂之細胞的完全基因組。此包括··經由該細胞大規模DNA合成並使兩個子細胞接收相同拷貝的遺傳物料。當將胸腺嘧啶脫氧核曾包括入細胞的培養基中時（其正合成DNA在製備細胞分裂），然後將標記之胸腺嘧啶脫氧核苷摻合入新合成之DNA中。

C:\Program Files\Patent\53976.ptd 第 16 頁 480178 五、發明說明（12) 摻合3H-胸腺嘧啶脫氧核苷入細胞種群中的程度與經由此細胞種群，合成DNA速率成比例而因此，顯示其細胞之增殖。使用10%胎兒牛血清（FBS)，使ZR75細胞（得自馬利蘭州 ’Rockville 市 ’American Type culture Collection) 生長在 RPMI 1 6 4 0 培養基（來自 Gibco Life Technologies) 中，每ml，1 〇〇單位之青黴素及每ml，loo單位之鏈黴素，所有培育在37 °C下，於5%C02中實施。此培養基不含酚紅 (一種弱雌激素擬態）。將細胞晶種（以每75 cm2燒瓶，一百萬的密度）。為個實驗，將此等細胞晶種在2 4個井平孤中，每井，每ml，含1 〇〇，〇〇〇細胞。在生長歷2 4小時後，移去培養基，將細胞用p bs (磷酸鹽缓衝之鹽水 ’ 〇· 01M 磷酸鈉，〇· 1 38M，NaCl 及0· 0 0 2 7M KC1 pH7. 4)洗滌並添加無血清之lmi，PRMI164〇(但具有鏈黴素和青黴素）。製備二曱亞砚（DMS0)中及水中之雌二醇中之白藜蘆醇備用溶液。然後，如表1中所示之各種濃度的白藜蘆醇和雌二醇直接投入每一井中。在另外2 4小時後，將 1//Ci之（曱基- 3H)胸腺嘧啶脫氧核苷加至每一井中。在24 小時後，移去培養基。將細胞在PBS中洗滌一次，將PBS完全移去並將細胞留置在冰上，使用（每井）丨m丨的丨〇 % TC A (三氯醋酸）培育歷30分鐘。將各平i用5%TCA洗滌3次，移去所有微量的未經摻合入細胞中之胸腺嘧啶脫氧核甘。將 500//1，0·1Μ，NaOH添加至每一井中。并將各平jni在室溫下培育歷至少3 0分鐘。將2 5 0 // 1之每種樣品轉移至閃爍小

C:\Program Files\Patent\53976.ptd 第17頁 480178 丨五 '發明說明（13) ;瓶中，並在添加5 m 1之計數流體後，計數各小瓶歷5分鐘， i每一小瓶在氚之裝置上。將來自四份井之數據計算成為摻 !合入DNA中之胸腺嘧啶脫氧核苷％，與未接受任何白藜蘆醇或雌二醇之對照井者比較。數值以四份井的平均值加減標 I準偏差表示之。 | 所獲得之各結果列入表1中。 I 表1 化合物（//Μ) 實驗1 DM合成 (對照之％) 實驗1 ρ值實驗2 DNA合成 (對照之％) 實驗2 ρ值對照（水） 100±20.4 一一 100±1·9 一- 雌二醇（1 ηΜ) 220±11 0.00059 133.4±29 0.062 10 ηΜ 210±9·7 0. 00079 152土17.7 0.0011 100 ηΜ 205±15·6 0.0016 156±11·7 0.00008 1000 ηΜ 190±24. 5 0.0068 142±18. 3 0. 0039 對照（DMSO) 100±7·0 一一 100±0·8 —— 白藜蘆醇 (0.5 //Μ) 69.7±10.0 56.8±4.2 1 //Μ 58·8±9·0 60·5±3·6 5 //Μ 158.8±4.1 0.000008 10 //Μ 207. 8士32. 5 0.0026 163 土 13·7 0. 00029 15 /ζΜ 119±2.5 0.00009 20 //Μ 134.8±21.4 0.612 68±3·9 40 //Μ 60.8±26.4 50 /ζΜ 4·1±1·4 實驗1之對照3H胸腺嘧啶脫氧核苷摻合值是71 5 13c pm而

C:\Program Files\Patent\53976.ptd 第 18 頁 480178 五、發明說明（14) 實驗2之對照是1 I 4 958cpm。表1中結不_顯不·雖二醇，一種熟知之雖激素如所預期者，刺激ZR75細胞之增殖。白藜蘆醇，在5至20//M之濃度時，增加Z R 7 5細胞的增殖。實例2 此實例顯示：白藜蘆醇抑制角蛋白細胞之增殖。 1.將經由胰蛋白酶處理，自新生兒之包皮所隔離之人類角蛋白細胞，於有經絲裂鏈素C處理之3T3鼠纖維原細胞之存在下’生長在 D u 1 b e c c 〇 ’ s m 〇 d i f i e d E a g 1 e，s (D Μ E ) / 5 % 胎兒牛血清中以便建立分裂之角蛋白細胞菌落。角蛋白細胞係在上述條件下生長直至其第三轉種。 2·關於各實驗，將第三轉種角蛋白細胞置入平孤中之不含血清之角蛋白細胞生長培養基（KGm ;自加州，聖地牙哥’ Clonetics 公司獲得），其中含有〇, 〇9mM鈣。將大約 i 30，000細胞置入6井細胞培養皿的每一井中並生長歷5天，直至細胞達到大約40%融合。 3·將培養基更換為新鮮培養基（KBM;自ci〇net ics獲得）丨並將如表2中所示之各種濃度的白藜蘆醇加至來自dms〇 (二| |曱亞砠）儲備溶液之培養基中。各培養基中，最後DMS0濃 | I度是〇·1%，對照培養基不含白藜蘆醇但與〇1%1)}^〇摻合。i |將每一濃度在3分開井中試驗。4小時後，將1/^Ci之3Η-胸丨丨腺咕咬脫氧核哲（來自Amersham公司，SP活性40Ci/mmol) | |加至每一井中，lm丨培養基中。將各井培育歷2小時。以如丨丨下所建方式，評估與角蛋白細胞的細胞DMA相關聯之3H-胸丨

480178 五、發明說明（15) 腺嘧啶脫氧核苷的數量。 4 ·使培養基吸氣，將細胞用1 m 1 P B S洗滌。然後將平皿中細胞的DNA和蛋白質經由添加lml的冰冷l〇%TCA予以沉澱。將各平JHI留置在冰上歷3 0分鐘而完成沉澱過程。然後使TCA吸氣，然後將每一井使用5%TCA洗滌4次。將各井中之細胞溶入0·5πι1，0·1Ν之NaOH中。然後將200ml轉移至一閃燦小瓶以使評估胸腺嘧啶脫氧核苷摻合量及使用25m 1，供以如下方式，使用BC A蛋白質檢定劑而檢定蛋白質。將 5ml之閃爍流體（Scintiverse)加至小瓶中其餘溶液中，並將各小瓶在閃爍計數器上記數而側定每一小瓶中放射活性之數量。 BCA (二寧可寧酸）-蛋白質檢定將25ml二細胞懸浮液置入96井平盟中。亦將〇·ιν NaOH 中之標準的B S A (牛血清清蛋白）以三份，移液管移入相同 96井平皿中。添加貫穿BCA蛋白質檢定劑（2〇〇 # 1/井）并將該平孤在室溫下培育歷2小時。在一具”⑽悅讪服7 0 0 0 平冊$買出器上’在570nm波長下讀數吸光度。然後’將DNA合成速率計算成經摻合入總細胞卵“ # g的每一個別井之細胞蛋白質中之cpm 3H_胸腺嘧啶脫氧核苷。亦計算每組之平均和標準偏差。亦將此等數目表示成對照井的百分數。每一數據點以三份井的平均值加，減標準偏差示出。所獲得之結果綜述於表2中。經認為小於〇 5之？值指示統計學上重要性。

480178 五、發明說明（16) 表2 白藜蘆醇 (μΜ) DNA合成 (cpm/pg蛋白質）抑制％ ρ值實驗1 0 29.52±4.44 〇 — 50 0.62±0. 09 98 0.012 實驗2 〇 17.17土1.21 0 — 0.78 11.57±1·7 33 0.053 1.56 8.89±1.12 48 0.016 3.12 5·11±0·27 70 0.0074 6.25 2.45±0. 56 86 0.0053 12.5 1·〇7±0·11 94 〇·003 25 0.58土 0. 05 97 0.0029 50 〇.44±0.12 97 0.0028 如自表2中之結果可見··低至1 . .5 6 // Μ之白藜蘆醇濃度顯著降低角蛋白細胞的DNΑ合成。1 . 5 6 " Μ白藜蘆醇減少角蛋白增殖多達約5 0 %。在兩種實驗中5 0 // Μ白藜蘆醇完全抑制 DNA合成。實例3 以白藜蘆醇的不同之另外濃度，重複實例2所獲得之結果綜述於表3中。

C:\Program Files\Patent\53976.ptd 第21頁 480178 丨五、發明說明（17) I 表3 在低濃度時之白藜蘆醇對於吸收入角蛋白細胞中之胸腺嘧啶脫氧核哲的影響

白藜蘆醇濃度 DNA合成 (cpm/jig 蛋白質）抑制％ ρ值統計學上重要(小於0.5 之Ρ值時） 0.0 μΜ 63.4土5.2 — — 0.1 μΜ 60.4 ±4. 1 5 0.502 NO 0.2 μΜ 56.3±3.0 12 0.079 NO 0.3 μΜ 58.8±0. 4 7 0.254 NO 0.4 μΜ 54·2±1·2 14 0.051 NO 0.6 μΜ 59.3±5. 5 6 0.310 NO 0.8 μΜ 44.4±2. 6 30 0.00013 YES 1.0 μΜ 37.7±4. 0 40 <0.0001 YES 2.0 μΜ 25.7±2·4 59 <0.0001 YES 自表3中之結果可見：在低於0.8//M(或0· 0 0 0 0 1 8 WT%)之濃度時，白蘇蘆醇在減少白蛋白細胞增殖方面無效，包括 0. 3 3 // Μ之極低濃度，它可能是存在於經由日本專利案 6 3 3 6 4 2 1中所揭示之0. 5%葡萄萃取物之最大濃度。實例4 此實例顯示：白藜蘆醇誘生角蛋白細胞之分化。轉谷胺醯胺酶測量之方法論：在表皮中之末端分化的過程期間，將15nm厚層的蛋白

C:\Prograni Fi les\Patent\53976. ptd 第 22 頁 480178 五、發明說明（18) 質，稱為角化之被膜（CE )者形成在細胞周圍的内表面上。該CE係由甚多不同蛋白質所組成，其經由形成利用表皮中所表現之至少兩種不同轉谷胺醯胺酶的作用所催化之N_( — 谷胺驢基）賴胺酸異二肽鍵予以交聯在一起。轉谷胺醯胺酶（TG-1)大量表現在經分化之各層的表皮中，尤其在粒層中但不存在於未經分化之基礎表皮中。因此，丁G_1是具有指示較多經分化狀態的高TG-1含量之表皮角蛋白細胞分化的有用標記。使用一種以ELISA為基之TTG-1檢定（使用TG-1 抗體）來評估下列各實例中經培養之角蛋白細胞的分化狀態。 TG-1的含量之測量如下。角蛋白細胞如實例2中所述方式而獲得。關於該實驗，將大約3 〇，〇〇〇細胞置入6個井平孤的，一井中，並生長歷5天直至細胞到達大約2〇至3〇 %融合。每天添加21111/井的新鮮1^^1(具有2//1的〇1^〇中之2-5 0 mM白藜蘆醇）歷3天。對照井亦接受2 # 1之黯3〇。在3天之處理後，將細胞用p B S洗滌兩次並置入冷凍器中歷2小時。然後將細胞解凍歷2小時。細胞的DN a含量經由使用ΜΑ結合螢光團，雙笨駢咪唑（Hoechst公司3 3 2 5 8 )予以定量及°在 45 0ΠΠ1下，測量DNA結合之螢光團的特定螢光（性）（在36〇㈣下激勵）。各井:細胞的TG-1含量使用1(；—丨特定單無性繁殖系抗體 (BC1)(第抗體）（自 Amersham Life Sciences 獲得）及使用過氧物爾標記之免抗鼠IgG碎片（第二抗體）予以測定。將各平皿經由TBS中之5%脫脂牛乳予以封阻（三羥曱基胺基

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】:元:，'，、鹽水二〇. 〇1M Tris; 0. 1 5眼^ n⑽守’溫下，在1%牛乳/TBS中，以第一抗體（1 : H /ίκς :*、、广欠月、2小時。在使用含有〇· 05%Tween 20之1% 一^辟彳；平里三次後，將各平皿在室溫下，使用第了抗肢的1:4 0 0 0稀釋液培育歷兩小時。將各平瓜使用1%牛礼/TBS/Tween冲洗三次，及用TBS冲洗三次。顏色經由使用鄰-笨二胺和過氧化氫予以展開。吸光度在49 時在 Ultrospec 3000 分光光度計（pharmacia Biotech 公司）上讀取而TG-1含量被計算成Abs/DNA螢光（性）。關於計算和數據之統計學上分析，使用至少3分開井的平均值加減標準偏差。將數值表示成每任意單位的三份井的DNA螢光， TG- 1之吸光度加減標準偏差。結杲亦以對照的％示出。表4

白藜蘆醇(μΜ) TG-1含量/ DNA 對照之％ ----- .—^ Ρ值實驗1 --- 0 μΜ 6·74±0.79 ---—一 — 10 μΜ 8.49 ±1.77 126 〇ΙΪ95 ' 25 μΜ 10·92±2.29 162 υ.ϋ〇〇8 — 50 μΜ 22.2±1.50 329 αοοοΤ 一實驗2 —---- 0 μΜ 1·91±0, 03 — —— ····«» 2 μΜ 3.42±0.42 179 <〇ΌΟ〇ι — 5 μΜ 3.51±0·41 π 184 <υ.οο〇ι ^ 10 μΜ 3.61 ±0· 17 189 <〇.〇〇〇ι — 25 μΜ 4·69±0.21 246 <〇.00〇ι — 50 μΜ 4.65 ±0.46 243 <0.0001 — C:\Prograin Fi les\Patent\53976. ptd 第24頁 480178 五、發明說明（20) ~ -- 一由於生物學糸統中之通常實驗變更，1〇VM白藜蘆醇與貫驗1中之對照並無顯著不同，但是所有其他濃度顯著增加角蛋白細胞之轉谷胺醯胺酶表示，因此，證明：白藜斧醇增加角蛋白細胞分化。實驗2中，2/zM和更高之白藜蘆攻醇之所有濃度顯著增加了角蛋白細胞分化。實例5 此實例證明：白藜蘆醇減輕可能由α 一烴（基）酸所造成之皮膚發炎。、、白藜蘆醇是一種熟知之環氧化酶抑制劑。抑制環氧化酶減少花生四烯酸的轉化成促發炎物質例如，前列腺素，包括PGE2。雖然抑制環氧化酶可能期望減少發炎，❻是並非所有環氧化酶抑制劑減少與化輕品成分例如，α —煙基酸相關聯之潛在性刺激。

實例5 A 刺激試驗方法：四暴露皮膚接觸測驗：目的是比較：經由在重複之皮膚 |接觸應用後，各種試驗物料所產生之刺激程度。試驗物料 | 4在閉基狀況下’維持與皮膚接觸。將專門小組成員的外i

|上臂指定為應用的區域。使用繃帶型包紮用品（s c a n p 〇 r I 丨f)以固定綴片（25mm Hill Top Chamber配合以Webril填丨 I料的18匪直徑圓盤）在適當位置。使用專門小組成員的兩 I只上臂。綴片係以平衡之無規順序施加。 ! 綴片在週一，上午09:00施加，週二上午09:〇〇(24小時暴露）移下。新的一組綴片在週二下午3 ·· 〇〇施加，週三上

C:\ProgramFiles\Patent\53976.ptd 第 25 頁 480178 五、發明說明（21) 9 : 0 0移下（1 8小時暴露）。第二組的綴片在週三下午3:〇〇施加和週四上午^:⑽ (18小時暴露）。最後一组的給ΰ六、田们綴片在週四下午3 : 〇〇施加，週五上午9 : 0 0移下（1 8小時暴露）。每次取下綴片時’將各個位置用溫水沖洗並拍乾。铁後將各試驗位置用外科皮膚作記料作記號來保證位置'以便分級及隨後施加綴片。纟再敷綴片前’將試驗位置在研究的週二，週三，週四與週五下午3:00鑑定。預期皮膚刺激例如試驗位置的中度紅色，乾燥及/或發癢。試驗位置之膨脹有可能。如果在任何鑑定日寺，任何χ試驗位置具有中度紅色或任何膨脹則不將該特別試驗敷綴片。每臂上之試驗位置經由兩位受過訓練之檢驗人員在一致之照明下予以目視分級。各試驗位置係以嚴重的次序予以分級。檢驗人員分級，在第一鑑定期間反應，遍及研究間，每天將各個位置連續分級。於將反應分級時，給予具有最嚴重反應之位置最低分數。給予具有第二最嚴重反應之位置，第二最低分數等等。/又有強制之分級，如果兩個或數個位置沒有反應或具有相同反應（各位置間，無差別），則賦予等級之平均值。由於刺激^纟，如果-個位置已中斷，則該位置保持在中斷加劑ϊ時，它所接受之分級。將自綴片處理所產生之分級經由非參數之統計學方法以統計學上比較。使用Friedman氏秩和檢驗法，在每一鑑

C:\ProgramFiles\Patent\53976.ptd 第 26 頁 480178 五、發明說明（22) | 定點上，將含有抗刺激劑之試驗物料與僅含有羥（基）酸之丨 i 相對應對照比較，使專門小組成員充作封阻（即：每一專 | 門小組成員使用每一試驗處理予以試驗）。少於〇.1〇之p- |

值被認為指示：該統計學上重要性。 I 含有各成份之組合物（如表5 A中所示）使用「刺激試驗方法」予以試驗。試驗廿（2 0 )位主體。所獲得之結果綜述於表5 A中。分級的總和愈高，刺激性愈小。基本配方完全化學名稱或 CFTA 名商標名稱及活性％重量％水，去離子 46.54 E1DTA 二納 Sequesterene Na2 0.05 矽酸鋁鎂 Veegum Ultra 0.6 甲基對氧苯甲酸酯 Methyl Paraben 0.15 甲基矽酮 DC防洙乳液 0.01 丁二醇 1，3 丁二醇 1，3 3.0 經乙基纖維素 Natrosol 250HHR 0.5 甘油，USP 甘油，USP 2.0 合成生物聚合膠 Keltrol 1000 0.2 三乙醇胺三乙醇胺99(%) 1.2 硬脂酸 Pristerene 4911 3.0 對氧苯甲酸酯NF 0.1 鼠化鎮脂酸甘油基§旨 1.5 硬脂醇 Lanette 18DE0 1.5 棕櫚酸異硬脂基酯 6.0 C12-15 alcohols octanoate 酸酯 3.0

第27頁 480178 五'發明說明（23) 聚二苯基矽氧烷 Silicone Fluid 200 (50cts) 1.0 膽固醇NF Cholesterol NF 0.5 花楸糖醇硬脂酸酯 1.0 丁基化羥基甲笨 0.05 生育基乙維生素E酸鹽 0.1 PEG-100硬脂酸酯 MYRJ 59 2.0 sodium stearoyl lactylate 硬脂酸乳醯酸鈉 0.5 棕櫚酸視黃醋84% 0. 06 羥基二辛酸羥基二辛酸 0.1 水(去離子）適量至99. 80 α-甜沒藥醇 α-甜沒藥醇 0.2 值 7-8

表5A 組合物成份分級之總和 (1天）分級之總和 (4天） 1 基本配方 65.5 79.5 2 基本配方+8%乙醇酸 63 72 〇組合物#2+0.1% 白藜蘆醇 85a 66 a.較組合物2.顯著減少刺激。第28頁 C:\Program Files\Patent\53976.ptd 480178

7 Q ¾ ! 月^ 年年正修濟請委員明示，本案修正後是否變更原實質兩气五、發明說明（24) 自表5A中之結果可見：白藜蘆醇（組合物3)顯著減少在起始暴露於組合物# 2後’第1天上經由組合物# 2 (含有8 %乙醇酸）所誘發之刺激。

比較性實例5 B 使用如實例5 A中所述之’’刺激試驗方法” ’試驗含有各成份（如表5 Β中所示）之組合物。試驗廿二（2 2 )位主體’所獲得之結果綜述於表5 Β中，分級之總和愈高’刺激性愈小。表5Β 組合物成份分級之總和 (1天）分級之總和 (4天） 1 基本配方 81 905 ~ 2 基本配方+8%乙醇酸 75 73.5 ' ~ 4 組合物#2+5% Ibupr〇fen 71.5 6^5 — ~ 自表5Β中之結果可見：ibuprof en，一種已知之消炎成分（組合物# 4 )不能減少含有8 %乙醇酸（組合物# 2 )之調配物的刺激。

比較性實例5 C 使用如實例5 A中所述之「刺激試驗方法」成份（如表5 C中所示）之組合物。試驗十九（1 獲得之結果綜述於表5 C中。分級之總和愈高 /J、〇，試驗含有各 9 )位主體。所 ’刺激性愈

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五、發明說明（25)

表5C 組合物成份分級之總和分级之總和 ----- (1 天）一 (4^}——- 2 —~^ 基本配方+8%乙 70 62.5 醇酸 --—-- ~- L^ 組合物#2+1 % Indomethacin 53.5 52.5 ----- 自表5C中之結果可見：Indomethacin，一種已知之衰乳化酶抑制劑和消炎成份（組合物# 5 )不能減少含有8 %乙醇酸 (組合物# 2 )之調配物的刺激。實例6- 11舉例說明：根據本發明之護膚組合物。可將^ 等組合物以習用之方式處理。彼等適合於化粧品用途 ~ 別，此類組合物適合於施加至皺褶，起皺紋，粗韃’乾燥，易剝落，老化及/或受UV光損害之皮膚而改良其外觀和觸覺以及施加至健康皮膚上而防止或阻滯其惡化。該組合物亦特別適合於減少可能與使用α -烴（基）酸相關聯之刺激，刺疼或發炎。實例6

此實例舉例說明：摻合本發明組合物之高内相油包水礼I 液0 丨

C:\Program Files\Patent\53976. ptd 第 30 頁 480178 五、發明說明（26) % w/w 白藜蘆醇 0.5 1，3-二甲基-2-咪唑烷酮 0.2 Bnj 92* 5 膨潤土 0.5 MgS〇47H2〇 0.3 丁基化之羥基甲苯 ‘ 0.01 香料適量水至100 * Brij 92是聚氧化乙烯(二)油醚。實例7 此實例舉例說明：摻合本發明組合物之水包油乳液。 % w/w 白藜蘆醇 2 乙醇酸 8 礦油 4 1，3-二甲基-2-咪唑烷酮 1 Bnj 56* 4 Alfol 16RD* 4 三乙醇胺 0.75 丁二醇-1,3 3 合成生物聚合膠 0.3 香料適量丁基化之羥基甲笨 0.01 水至100 *Βη」56是鯨蠟醇POE (1〇) Alfol 16RD是鯨蠟醇画·» C:\Program Files\Patent\53976.ptd 第31頁 480178 五、發明說明（27) ；實例8 | 此實例舉例說明：摻合根據本發明之組合物的醇中之洗| 務。丨 % w/w 白藜蘆醇 5 1，3-二曱基-2-咪唑烷酮 0.1 乙醇 40 香料適量丁基化之羥基甲苯 \om 水至100 實例9 此實例舉例說明：含有本發明組合物之另種醇中之洗液。 % w/w 白藜蘆醇 10 1，3-二甲基-2-咪唑烷酮 0.01 乙醇 40 抗氧化劑 0.1 香料適量水至100 實例1 0 此實例舉例說明：摻合本發明組合物的防晒乳液。

C:\Program Files\Patent\53976. ptd 第 32 頁 480178 五、發明說明（28) % w/w 白藜蘆醇 2 1，3-二甲基-2-咪唑烷酮 0.2 矽酮油 7.5 甘油基單硬脂酸酯 3 鯨蠟硬脂醇 1.6 聚氧化乙烯-(20)-鯨蠟醇 1.4 合成生物聚合膠 0.5 Parsol 1789 1.5 甲氧基肉桂酸辛酯 7 香料適量顏色適量水至100 實例11 此實例舉例說明：摻合本發明聯合體之非水性護膏組合物。 1ΒΪ C:\Program Files\Patent\53976. ptd 第33頁 480178 五、發明說明（29) % w/w 白藜蘆醇 5 1，3-二甲基-2-咪唑烷酮 1 矽酮膠SE-301 10 矽酮流體3452 20 矽酮流體3443 50.26 角鯊烯 10 亞油酸 0.01 膽固醇 0.03 2-羥基-η-正辛酸 0.7 維生素Ε亞油酸酉旨〇·5 草藥油 0.5 乙醇 2 自GEC可供應之二曱基矽酮聚合物具有至少5 0, 0 0 0分子量和（在2 5 °C下）至少1 0，0 0 0厘米之粘度。自道康寧公司可供應之二曱基矽氧烷環狀五聚物。自道康寧公司可供應之二曱基矽氧烷四聚物。

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Claims

480178 修正玄案號 87115185 六、申請專利範圍 1 . 一種護膚組合物包括： (a)白藜蘆醇，其數量為0.00002至10 wt· %; (b )羥基酸，其數量為0 · 0 1 %至2 0 % ;及 (c ) 一種化粒品界可接受之賦形劑。 2 .根據申請專利範圍第1項之組合物，其係用於供應植物雌激素至人類皮膚上。 3 .根據申請專利範圍第1項之組合物，其係用於改良皺褶，起皺紋，乾燥，易剝落，老化或受光損害之皮膚的外觀及改良皮膚厚度，彈性，伸縮性和膨脹性。 4.根據申請專利範圍第1項之組合物，其係用於增強人類皮膚中角蛋白細胞分化。 5 .根據申請專利範圍第1項之組合物，其係用於抑制人類皮膚中角蛋白細胞增殖。 6 .根據申請專利範圍第1項之組合物，其中，羥基酸之數量是自2%至1 2%。

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