JP2011046660A

JP2011046660A - マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ｍｍｐ−２）阻害剤

Info

Publication number: JP2011046660A
Application number: JP2009197544A
Authority: JP
Inventors: Taichi Muraguchi; 太一村口; Makiko Aimi; 牧子相見; Toshiaki Kubo; 利昭久保
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2009-08-28
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2011-03-10
Also published as: WO2011024942A1

Abstract

【課題】レスベラトロールの新たな用途としてマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害作用を見出すとともに、該マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害作用を有効に発揮させるための製剤を提供すること。
【解決手段】レスベラトロールを有効成分として含有する、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、皮膚外用剤、特には抗しわ剤として使用できる、レスベラトロールを有効成分として含有するマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害剤に関する。

レスベラトロール（５−パラヒドロキシスチリルレゾルシノール、又は３，４’，５−スチルベントリオールとも称する）は、赤ワインおよびその原料であるブドウの皮・種子、またマルベリー、ピーナッツ、大黄から見出されるポリフェノール系フラボノイドであり、近年の分子生物学的な研究において長寿遺伝子SRIT１などの活性を制御して細胞を抗寿命化する効能が知られている（非特許文献１）。

上記の抗寿命化効果に基づいて、レスベラトロールは皮膚用の製剤に対しても抗老化の観点から配合され始めている。例えば、特許文献１にはレスベラトロールの表皮細胞増殖効果が記載されており、また特許文献２においては抗しわ効果の高いレチノイド系化合物との併用組成物による抗しわ剤が記載されている。しかし、経口投与と異なり、皮膚の抗老化を期待する場合は、角層（20μｍ）を通過し、生細胞で構成される真皮層に薬剤を届けなければ目的の効果が得られない。

さらに、経皮吸収薬剤に関しては、例えば、特許文献３には、高分子材料を用いたナノ粒子抗老化皮膚外用剤が記載されている。また特許文献４には、スキンケア成分を含む架橋高分子ナノ粒子が記載されている。これらは界面活性剤を使用した乳化物や、モノマーもしくはマクロマー（重合性基を持つ合成高分子）の重合物であり、また剤形作成時においてハロゲン化アルカン類（クロロメタン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラクロロメタン等）の使用する場合があり、安全性に懸念がある。これら剤形は一定の効果を示すものの、皮膚透過性および安全性の問題から皮膚老化防止に十分な効果を示すには至っていなかったり、過度の適用により経皮の安全性に懸念がありその改善が望まれていた。

皮膚の老化の原因は多様であり、紫外線、乾燥、外的因子、加齢などが挙げられる。近年、皮膚の老化を誘導する因子として、マトリックスメタロプロテアーゼの関与が指摘されている。マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰとも称する）はタンパク質分解酵素であり、細胞外マトリックスの構成タンパク質の分解及び再構築に関与している。ＭＭＰの１種であるマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）(matrix metallopeptidase 2 ,gelatinase A, 72kDa gelatinase, 72kDa type IV collagenase)は、細胞外マトリックスのゼラチン、皮膚基底膜の主成分である４型コラーゲンを含む各種コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン及びエラスチンなどの多様な基質を切断し、皮膚の老化に関与することが知られている。従って、ＭＭＰ−２活性の阻害は、皮膚の老化を防止・改善するために重要であると考えられる。

Clinical Interventions in Aging. 第3(2)巻、第331-339頁、2008年

特表２００１−５１０７７７号公報特表２００３−５１２４１２号公報特開２００２−３０８７２８号公報特開２００４−２４４４２０号公報

本発明は、レスベラトロールの新たな用途としてマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害作用を見出すとともに、該マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害作用を有効に発揮させるための製剤を提供することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、安全性が高く、レスベラトロール含有粒子径が小さいことにより透明性が高く、皮膚への浸透性が良く、ＭＭＰ−２が４型コラーゲンの分解を引き起こす基底膜以下の真皮層までレスベラトロールを伝達させることが可能である、レスベラトロール含有製剤を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、レスベラトロールがマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）の活性を阻害する作用を有することを見出した。さらに、本発明者らは、レスベラトロールを内包したタンパク質ナノ粒子を調製し、皮膚に適用した結果、安全性、透明性が高く、且つ、真皮層までの良好な皮膚浸透性が示されることを実証した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。

即ち、本発明によれば、レスベラトロールを有効成分として含有する、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害剤が提供される。
好ましくは、レスベラトロールはタンパク質粒子に内包されている。
好ましくは、タンパク質粒子の平均粒子サイズは10〜1000ｎｍである。

好ましくは、タンパク質の重量に対して０.１〜１００重量％のレスベラトロールを含有する。
好ましくは、タンパク質はコラーゲン、ゼラチン、酸処理ゼラチン、アルブミン、オバルブミン、オバルブミン、カゼイン、トランスフェリン、グロブリン、フィブロイン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、又はビトロネクチンからなる群より選ばれる少なくとも一種である。

好ましくは、本発明のＭＭＰ−２阻害剤は、皮膚外用剤として使用する。
好ましくは、本発明のＭＭＰ−２阻害剤は、抗しわ剤として使用する。

本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害剤は、効果的なマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害作用を示し、皮膚に対してしわ予防効果を発揮できる。特に、レスベラトロールがタンパク質粒子に内包されている本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害剤は、従来の界面活性剤を利用した可溶化技術による製剤よりも皮膚透過性が優れ、しわの原因の１つとして考えられているマトリックスメタロプロテアーゼ−２を真皮層で阻害することができ、より高いしわ予防効果が期待できる。

図１は、レスベラトロールを用いてＭＭＰ２酵素残活性の変化を測定した結果を示す。図２は、レスベラトロール含有原料を用いてＭＭＰ２酵素残活性の変化を測定した結果を示す。図３は、レスベラトロールを用いてヘアレスラット皮膚透過量を測定した結果を示す。図４は、皮膚透過係数を測定した結果を示す。

以下、本発明の実施の形態についてさらに具体的に説明する。
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害剤は、レスベラトロールを有効成分として含有する。レスベラトロールは、５−パラヒドロキシスチリルレゾルシノール又は３，４’，５−スチルベントリオールとしても知られる化合物であり、下記の構造を有する。

純粋のレスベラトロールは、和光純薬工業株式会社、東京化成工業株式会社から商業的に得ることができ、アクチケムS.A社（ACTICHEM社）、ディーエヌピー・インターナショナル社（ＤＮＰＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ファルマ・サイエンス社（ＰｈａｒｍａＳｃｉｅｎｃｅ）、又はマディス・ボタニカルス社（ＭａｄｉｓＢｏｔａｎｉｃａｌｓ）、サンブライト株式会社、オリザ油化株式会社のような他の原材料メーカーから粗製形で得ることができる。

本発明のＭＭＰ−２阻害剤においては、レスベラトロールはタンパク質粒子に内包されていることが好ましい。
本発明のＭＭＰ−２阻害剤は、０．０１〜５０重量％のタンパク質ナノ粒子を含有することが好ましく、０．１〜１０重量％のタンパク質ナノ粒子を含有することがさらに好ましい。本発明のＭＭＰ−２阻害剤は、タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％のレスベラトロールを含有することが好ましく、タンパク質の重量に対して、０.１〜５０重量％のレスベラトロールを含有することがさらに好ましい。

本発明において、レスベラトロールは、タンパク質ナノ粒子の形成時に添加してもよいし、ナノ粒子の作成後に添加してもよい。

本発明で用いるタンパク質ナノ粒子の平均粒子サイズは、通常は１〜1000ｎｍであり、好ましくは10〜1000ｎｍであり、より好ましくは10〜500ｎｍであり、より好ましくは10〜250ｎｍであり、さらに好ましくは10〜100ｎｍであり、特に好ましくは20〜40ｎｍである。

本発明で用いるタンパク質の種類は特に限定されないが、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパクが好ましく、分子量１万から１００万程度のタンパク質を用いることが好ましい。タンパク質の由来は特に限定されないが、天然に存在するタンパク質、特にヒト由来のタンパク質を用いることが好ましい。タンパク質として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。コラーゲン、ゼラチン、酸処理ゼラチン、アルブミン、オバルブミン、カゼイン、トランスフェリン、グロブリン、フィブロイン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、又はビトロネクチンからなる群より選ばれる少なくとも一種を使用することができる。また、タンパク質の由来は特に限定するものではなく、牛、豚、魚、植物および遺伝子組み換え体のいずれも用いることができる。遺伝子組み換えゼラチンとしては、例えばEP1014176Ａ２号、米国特許6,992,172号に記載のものを用いることができるがこれらに限定されるものではない。その中で好ましいものは、カゼイン、酸処理ゼラチン、コラーゲン、又はアルブミンであり、最も好ましいものはカゼイン、又は酸処理ゼラチンである。本発明でカゼインを用いる場合、カゼインの由来は特に限定されず、乳由来であっても、豆由来であってもよく、α−カゼイン、β−カゼイン、γ−カゼイン、κ−カゼインおよびそれらの混合物を使用することができる。カゼインは、単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。

本発明に用いられるタンパク質は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

本発明では、ナノ粒子の形成中および／又は形成後にタンパク質を架橋処理することができる。上記した架橋処理は、酵素を用いることができる。酵素としては、タンパクの架橋作用が知られているものであれば特に制限されず、その中で好ましいものはトランスグルタミナーゼである。

トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、遺伝子組み換え体を用いることができる。具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼ、ヒト由来リコンビナントトランスグルタミナーゼなどが挙げられる。

本発明において架橋処理のために用いられる酵素の量は、タンパク質の種類に応じて適宜設定することが出来るが、標準的には、タンパク質の重量に対して、０.１〜１００重量％程度を添加することができ、好ましくは、１〜５０重量％程度を添加することができる。

酵素による架橋反応の時間は、タンパク質の種類、ナノ粒子サイズに応じて適宜設定することができるが、標準的には、１時間から７２時間反応することができ、好ましくは、２時間から２４時間反応することができる。

酵素による架橋反応の温度は、タンパク質の種類、ナノ粒子サイズに応じて適宜設定することができるが、標準的には、０℃から８０℃で反応することができ、好ましくは、２５℃から６０℃で反応することができる。

本発明に用いられる酵素は単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。

本発明で用いるナノ粒子は、特許文献特開平６−７９１６８号公報、又はC.Coester著、ジャーナル・ミクロカプスレーション、２０００年、１７巻、p.１８７−１９３に記載の方法に準じて作製することができるが、架橋方法としてグルタルアルデヒドの代わりに酵素を用いることが好ましい。

また、本発明においては、酵素架橋処理を有機溶媒中で行うことが好ましい。ここで用いる有機溶媒は一般的な皮膚外用剤に添加される溶媒、例えばエタノール、イソプロパノール、ブチレングリコール、グリセロールなどの水溶性有機溶媒が好ましい。
さらに、本発明においては、架橋処理後に有機溶媒を留去し、水分散することが好ましい。有機溶媒を留去前に水を加えてもよく、留去後に水を加えても良い。

本発明のＭＭＰ−２阻害剤には、脂質（リン脂質など）、アニオン性多糖、カチオン性多糖、アニオン性タンパク質、カチオンタンパク質、又はシクロデキストリンから選択される１種以上の成分を添加することもできる。脂質（リン脂質など）、アニオン性多糖、カチオン性多糖、アニオン性タンパク質、カチオンタンパク質、及びシクロデキストリンの添加量は特に限定されないが、一般的にはタンパク質の重量に対して０.１〜１００重量％の量で添加することができる。本発明のＭＭＰ−２阻害剤においては、上記成分とタンパク質の比を変えることよって、徐放速度を調整することができる。

本発明に用いることができるリン脂質として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。

本発明に用いることができるアニオン性多糖とはカルボキシル基、硫酸基又はリン酸基等の酸性極性基を有する多糖類である。以下に具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、アルギン酸、ペクチン、カラギーナン、フコイダン、アガロペクチン、ポルフィラン、カラヤガム、ジェランガム、キサンタンガム、ヒアルロン酸類等が挙げられる。

本発明に用いることができるカチオン性多糖とは、アミノ基等の塩基性極性基を有する多糖類である。以下に具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。キチン、キトサンなどのグルコサミンやガラクトサミンを構成単糖として含むものなどが挙げられる。

本発明に用いることができるアニオン性タンパク質とは等電点が生理的ｐＨよりも塩基性側にあるタンパク質およびリポタンパク質である。具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、リゾチーム、チトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、α−キモトリプシンなどが挙げられる。

本発明に用いられるカチオンタンパク質とは等電点が生理的ｐＨよりも酸性側にあるタンパク質およびリポタンパク質である。具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ポリリジン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、オバルブミンなどが挙げられる。

本発明の一例としては、下記の工程（ａ）から（ｄ）によって作製されるカゼインナノ粒子を用いることができる。
（ａ）多価アルコールにカゼインを懸濁させる工程；
（ｂ）カゼインをpH８以上１１未満の塩基性水性媒体に混合する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得た溶液にレスベラトロールを添加する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で得た溶液をpH3.5〜7.5の水性媒体に注入する工程；

本発明の別の例としては、下記の工程（ａ）から（ｄ）によって作製されるカゼインナノ粒子を用いることができる。
（ａ）多価アルコールにカゼインを懸濁させる工程；
（ｂ）カゼインをpH８以上１１未満の塩基性水性媒体に混合する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得た溶液にレスベラトロールを添加する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で得た溶液のpH を等電点からpH1以上離れたpHまで下降させる工程；

上記において、レスベラトロールは水を含まない系で分散してもよく、分散後に水性媒体を添加しても分散できる。即ち、上記において、工程（ｃ）を工程（ｂ）の前に行ってもよい。

本発明においては、所望のサイズのカゼインナノ粒子を作製できる。また、疎水性の活性成分とカゼイン疎水性部分の相互作用を利用して、カゼインナノ粒子内に活性成分を内包できる。さらに、これらの粒子は水溶液中で安定に存在することが見出された。
また、カゼインとイオン性多糖または別種のイオン性タンパク質との混合粒子により、イオン性活性成分を内包することも見出された。

本発明のカゼインナノ粒子の作製方法は、カゼインを塩基性水性媒体液に混合し、酸性水性媒体中に注入する方法と、カゼインを塩基性水性媒体液に混合し、攪拌しながら、pHを下降させる方法が挙げられる。

カゼインを塩基性水性媒体液に混合し、酸性水性媒体中に注入する方法としては、シリンジによるのが簡便で好ましいが、注入速度、溶解性、温度、撹拌状態を満足する方法であれば特に限定しない。一般的には、注入速度は、1mL/minから100mL/minで注入することができる。塩基性水性媒体の温度は、適宜設定することができるが、標準的には、０℃から８０℃にすることができ、好ましくは、２５℃から７０℃にすることができる。酸性水性媒体の温度は、適宜設定することができるが、標準的には、０℃から８０℃にすることができ、好ましくは、２５℃から６０℃ですることができる。攪拌速度は、適宜設定することができるが、標準的には、100rpmから3000rpmにすることができ、好ましくは、200rpmから2000rpmである。

カゼインを塩基性水性媒体液に混合し、攪拌しながら、pHを下降させる方法としては、酸を滴下するのが簡便で好ましいが、溶解性、温度、撹拌状態を満足する方法であれば特に限定しない。塩基性水性媒体の温度は、適宜設定することができるが、標準的には、０℃から８０℃にすることができ、好ましくは、２５℃から７０℃にすることができる。攪拌速度は、適宜設定することができるが、標準的には、100rpmから3000rpmにすることができ、好ましくは、200rpmから2000rpmである。

本発明に用いる水性媒体は、有機酸または塩基、無機酸または無機塩基の水溶液、又は緩衝液を用いることができる。

具体的には、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、カルボン酸、酒石酸、コハク酸、酢酸またはフタル酸、トリフルオロ酢酸、モルホリノエタンスルホン酸、2-〔4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル〕エタンスルホン酸のような有機酸；トリス（ヒドロキシメチル）、アミノメタン、アンモニアのような有機塩基；塩酸、過塩素酸、炭酸のような無機酸；燐酸ナトリウム、燐酸カリウム、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウムのような無機塩基を用いた水溶液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明に用いる水性媒体の濃度は、約10mMから約１Mが好ましい。より好ましくは、約20mMから約200mMである。

本発明に用いる塩基性水性媒体のpHは、８以上が好ましく、８から１２が好ましい。より好ましくはpH９から１１である。pHが高すぎると加水分解の懸念や取り扱い上の危険性があるため、上述の範囲が好ましい。

本発明において、カゼインをpH８以上の塩基性水性媒体に混合させる温度は、０〜80℃が好ましく、10〜60℃が好ましい。より好ましくは、20〜40℃である。

本発明に用いる酸性水性媒体のpHは、好ましいpHは3.5〜7.5である。より好ましくはpHは５から６である。

本発明のＭＭＰ−２阻害剤は、皮膚の老化を防止又は改善することができる。本発明のＭＭＰ−２阻害剤は、皮膚に適用した場合の安全性・浸透性に優れているため、皮膚外用剤として使用することができ、例えば、抗しわ剤として使用することができる。例えば、本発明のＭＭＰ−２阻害剤は、皮膚化粧料に配合して用いることもできる。皮膚化粧料には、本発明のＭＭＰ−２阻害剤のみを配合してもよいし、その他の有効成分を組み合わせて配合してもよい。

本発明のＭＭＰ−２阻害剤はさらに、添加物を含むことができる。添加物としては特に限定することはないが、抗酸化成分、活性酸素除去剤、抗炎症剤、アンチエイジング剤、コラーゲン合成促進剤、抗しわ剤、ビタミン剤、ミネラル、アミノ酸類、抗菌剤、紫外線吸収剤、保湿剤、柔軟剤、経皮吸収促進剤、無痛化剤、防腐剤、酸化防止剤、色素剤、増粘剤、香料、又はpH調整剤から選択される１種以上のものを使用することができる。

本発明のＭＭＰ−２阻害剤の剤型は特に限定されないが、例えば、液剤、湿布剤、塗布剤、ゲル剤、クリーム剤、エアゾール剤、ローション剤、粉剤、泡剤、化粧水、ボディーソープ、石鹸、粧料などを挙げることができる。

本発明のＭＭＰ−２阻害剤の投与方法としては、経皮・経粘膜投与が挙げられる。

本発明のＭＭＰ−２阻害剤の投与量は、使用者の体重、疾患の状態などに応じて適宜設定することができるが、一般的には、１回の投与につき、有効成分であるレスベラトロールの投与量として１μｇ〜５０ｍｇ／ｃｍ²程度を投与することができ、好ましくは２．５μｇ〜１０ｍｇ／ｃｍ²程度を投与することができる。

以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：レスベラトロールのマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）酵素活性阻害試験
レスベラトロール、並びにそれを含有するブドウつるエキスのＭＭＰ−２に対する阻害活性を試験した。試験方法は、MMP-2 Fluorimetric Drug Discovery Kit - AK-409(BIOMOL社)を使用した。調液および試験方法はキットに記載の方法で実施した。阻害率の計算はネガティブコントロール試験（溶媒のみ）の単位時間の活性を１００とした場合と比較した。また、本試験の陽性化合物としてＭＭＰ−２の阻害活性が既知であるN-イソブチル-N-(4-メトキシフェニルスルホニル)-グリシルヒドロキサム酸（NNGH：系中終濃度 130μＭ）を使用した。活性阻害率の結果を図１及び図２に示す。

図１は、トランスレスベラトロール（和光純薬）の添加実験である。試験結果から濃度依存的にＭＭＰ−２の酵素活性阻害が見られた。図２は、総レスベラトロールを５％以上含有する原材料であるRESVERATROX（香栄興業）による添加試験結果である。グラフ中の濃度は系中のトランスレスベラトロール量である。上記の結果から、レスベラトロールは単独および原材料においてもＭＭＰ−２活性の阻害活性が示された。

実施例２：タンパク質ナノ粒子の作成
レスベラトロールを固形分中６％含有するブドウつるエキスを１，３ブチレングリコールで５％(w/w)となるように溶解した。（以下レスベラトロール溶液）また、カゼイン又は酸処理ゼラチンは同量の１，３ブチレングリコールに分散し１％（w/w）濃度となるようにpH11に調整した50mMクエン酸Naを添加した。そこにレスベラトロール溶液を1/10量添加して、マグネティックスターラーでよく攪拌・分散した。（タンパク質0.9％、レスベラトロール約0.03％溶液である）この溶液をｐＨ7.4に調整してレスベラトロール-カゼイン内包物及びレスベラトロール-酸処理ゼラチン内包物を得た。
また必要に応じて0.22μｍ程度のフィルターに供し、より透明で均一なカゼインナノ粒子を得た。表１に作製直後および２週間後の外観および平均粒子径を示す。なお平均粒子径は大塚電子の粒径アナライザー（ＦＰＡＲ１０００）を用いて測定した。タンパク質ナノ粒子化した場合は可溶性が付与され白濁、沈殿を起こさず安定に水溶化できた。

実施例３：経皮吸収効果
レスベラトロールを内包したカゼイン粒子の皮膚透過試験を下記方法で実施した。対象の皮膚はヘアレスラット（8週齢）を使用した。27mm径のバイオプシーでヘアレスラット腹部を円形に打ち抜いたものをフランツセル（Hanson Research）に固定した。PBSで1時間還流した後、レセプター液を30％エタノール配合PBS７ｍｌに置換し、ドナーにレスベラトロールを内包したカゼイン粒子（実施例２で作製したもの）をPBSでドナーとレセプター側の塩強度を調整したサンプル１ｍｌを供した。レセプター液を攪拌しながら、ウォータージャケットを用いて32℃に保ち、経時的にレセプター液を回収した。このレセプター液を下記条件で高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析し透過したレスベラトロールを定量した。試験時においてネガティブコントロールとしてPBS液、対象として一般的な可溶化剤であるPEG40硬化ひまし油（HCO-40；ニッコーケミカル）可溶化物、エタノール溶解したものと比較した。カゼインナノ粒子、エタノール溶解液、HCO-40可溶化物にはすべて、約0.03％のレスベラトロールを含むように調整した。

HPLC条件
カラム：C18 5μm
流量：１ｍｌ/min
カラム温度：４０℃
検出波長：３１０nm
展開液：アセトニトリル/水＝20/80（酢酸0.1％、トリエタノールアミン0.1％を含む）

レセプター液中のレスベラトロールの経時による浸透結果を図３に示す。図３に示す通り、カゼインナノ粒子は約３時間のラグタイムの後に高い浸透性を示した。

また、フレグランスジャーナル２００８年１０月号P38-41において杉林らが提唱する皮膚透過係数を定量することで浸透結果を考察した。結果を図４に示す。図４に示す通り、本発明のカゼインナノ粒子の透過係数は２．３×１０^-7（ｃｍ/ｓ）であり、この透過係数では上記文献から2.4時間で角層全層（20μm）を透過すると予想でき、従来の技術である可溶化物や一般的に皮膚透過促進効果のあるといわれているエタノールと比べても１０倍程度の浸透速度の向上効果が優れている結果であった。

Claims

レスベラトロールを有効成分として含有する、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害剤。
レスベラトロールがタンパク質粒子に内包されている、請求項１に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害剤。
タンパク質粒子の平均粒子サイズが10〜1000ｎｍである、請求項２に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害剤。
タンパク質の重量に対して０.１〜１００重量％のレスベラトロールを含有する、請求項２又は３に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害剤。
タンパク質がコラーゲン、ゼラチン、酸処理ゼラチン、アルブミン、オバルブミン、オバルブミン、カゼイン、トランスフェリン、グロブリン、フィブロイン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、又はビトロネクチンからなる群より選ばれる少なくとも一種である、請求項２から４の何れかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害剤。
皮膚外用剤として使用する、請求項１から５の何れかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害剤。
抗しわ剤として使用する、請求項１から６の何れかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）阻害剤。