WO2011024942A1 - マトリックスメタロプロテアーゼ－２（ｍｍｐ－２）阻害剤 - Google Patents

マトリックスメタロプロテアーゼ－２（ｍｍｐ－２）阻害剤 Download PDF

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太一 村口
牧子 相見
利昭 久保
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富士フイルム株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) inhibitor containing resveratrol as an active ingredient, which can be used as an external preparation for skin, particularly as an anti-wrinkle agent.
  • MMP-2 matrix metalloproteinase-2
  • Resveratrol also called 5-parahydroxystyryl resorcinol or 3,4 ', 5-stilbenetriol
  • Resveratrol is a polyphenolic flavonoid found in red wine and its grape grape skin and seeds, as well as in mulberry, peanut, and yellow
  • Non-patent Document 1 the effect of controlling the activity of longevity gene SRIT1 and the like to make cells anti-life is known.
  • Patent Document 1 describes the effect of resveratrol on epidermal cell proliferation
  • Patent Document 2 describes an anti-wrinkle agent using a combination composition with a retinoid compound having a high anti-wrinkle effect.
  • the desired effect cannot be obtained unless the drug passes through the stratum corneum (20 ⁇ m) and reaches the dermis layer composed of living cells.
  • Patent Document 3 describes a nanoparticle anti-aging skin external preparation using a polymer material.
  • Patent Document 4 describes crosslinked polymer nanoparticles containing a skin care component. These are emulsions using surfactants, polymers of monomers or macromers (synthetic polymers with polymerizable groups), and halogenated alkanes (chloromethane, dichloromethane, chloroform, tetra Chloromethane, etc.) may be used, and there are concerns about safety. Although these dosage forms show a certain effect, they have not been effective enough to prevent skin aging due to problems with skin permeability and safety, and there are concerns about the safety of the skin due to excessive application. Improvement was desired.
  • Matrix metalloproteases also referred to as MMPs
  • MMPs matrix metalloproteases
  • Matrix metalloprotease-2 (MMP-2), a type of MMP (matrix metallopeptidase 2, gelatinase A, 72kDa gelatinase, 72kDa type IV collagenase) is the extracellular matrix gelatin, type 4 which is the main component of skin basement membrane It is known to cleave various substrates such as various collagens including collagen, laminin, fibronectin, proteoglycan and elastin and participate in skin aging. Therefore, inhibition of MMP-2 activity is considered important for preventing and improving skin aging.
  • the present invention finds a matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) inhibitory action as a new use of resveratrol, and a formulation for effectively exhibiting the matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) inhibitory action. It was set as a problem to be solved. That is, the present invention has high safety, high transparency due to the small particle size of resveratrol, good permeability to the skin, and MMP-2 causes degradation of type 4 collagen. It was an issue to be solved to provide a resveratrol-containing preparation capable of transmitting resveratrol to a layer.
  • MMP-2 matrix metalloproteinase-2
  • resveratrol has an action of inhibiting the activity of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2). Furthermore, the present inventors prepared a protein nanoparticle encapsulating resveratrol and applied it to the skin. As a result, safety and transparency are high, and good skin permeability up to the dermis layer is shown. Proved. The present invention has been completed based on these findings.
  • a matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) inhibitor containing resveratrol as an active ingredient is provided.
  • MMP-2 matrix metalloproteinase-2
  • resveratrol is encapsulated in protein particles.
  • the average particle size of the protein particles is 10 to 1000 nm.
  • the protein is at least one selected from the group consisting of collagen, gelatin, acid-treated gelatin, albumin, ovalbumin, ovalbumin, casein, transferrin, globulin, fibroin, fibrin, laminin, fibronectin, or vitronectin.
  • the MMP-2 inhibitor of the present invention is used as a skin external preparation.
  • the MMP-2 inhibitor of the present invention is used as an anti-wrinkle agent.
  • the present invention further provides a method of inhibiting matrix metalloprotease-2 (MMP-2) comprising administering resveratrol to a subject.
  • MMP-2 matrix metalloprotease-2
  • the present invention further provides the use of resveratrol for the manufacture of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) inhibitors.
  • the matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) inhibitor of the present invention exhibits an effective matrix metalloprotease-2 (MMP-2) inhibitory action and can exert an effect of preventing wrinkles on the skin.
  • MMP-2 matrix metalloprotease-2
  • the matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) inhibitor of the present invention in which resveratrol is encapsulated in protein particles has better skin permeability than a preparation based on a solubilization technique using a conventional surfactant.
  • Matrix metalloproteinase-2 which is considered as one of the causes of wrinkles, can be inhibited in the dermis layer, and a higher wrinkle-preventing effect can be expected.
  • FIG. 1 shows the results of measuring changes in MMP2 enzyme residual activity using resveratrol.
  • FIG. 2 shows the results of measuring changes in MMP2 enzyme residual activity using resveratrol-containing raw materials.
  • FIG. 3 shows the results of measuring hairless rat skin permeation using resveratrol.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the skin permeability coefficient.
  • the matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) inhibitor of the present invention contains resveratrol as an active ingredient.
  • Resveratrol is a compound also known as 5-parahydroxystyrylresorcinol or 3,4 ', 5-stilbenetriol and has the following structure:
  • Pure resveratrol can be obtained commercially from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. and Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Actichem SA, ACT International, DNP International, Pharma Science (Pharma Science) or other raw material manufacturers such as Madis Botanicals, Sunbright Co., Ltd., Oriza Yuka Co., Ltd., can be obtained in crude form.
  • resveratrol is preferably encapsulated in protein particles.
  • the MMP-2 inhibitor of the present invention preferably contains 0.01 to 50% by weight of protein nanoparticles, more preferably 0.1 to 10% by weight of protein nanoparticles.
  • the MMP-2 inhibitor of the present invention preferably contains 0.1 to 100% by weight of resveratrol based on the weight of the protein, and 0.1 to 50% by weight of the protein More preferably, it contains resveratrol.
  • resveratrol may be added at the time of forming the protein nanoparticles, or may be added after the production of the nanoparticles.
  • the average particle size of the protein nanoparticles used in the present invention is usually 1 to 1000 nm, preferably 10 to 1000 nm, more preferably 10 to 500 nm, more preferably 10 to 250 nm, still more preferably.
  • the thickness is 10 to 100 nm, and particularly preferably 20 to 40 nm.
  • the type of protein used in the present invention is not particularly limited, but a protein having a lysine residue and a glutamine residue is preferable, and a protein having a molecular weight of about 10,000 to 1,000,000 is preferably used.
  • the origin of the protein is not particularly limited, but it is preferable to use a naturally occurring protein, particularly a human-derived protein. Specific examples are listed as proteins, but the present invention is not limited to these compounds. At least one selected from the group consisting of collagen, gelatin, acid-treated gelatin, albumin, ovalbumin, casein, transferrin, globulin, fibroin, fibrin, laminin, fibronectin, or vitronectin can be used.
  • the origin of the protein is not particularly limited, and any of cows, pigs, fish, plants and genetically modified organisms can be used.
  • the genetically modified gelatin for example, those described in EP1014176A2 and US Pat. No. 6,992,172 can be used, but are not limited thereto.
  • casein, acid-treated gelatin, collagen, or albumin is preferable, and casein or acid-treated gelatin is most preferable.
  • the origin of casein is not particularly limited, and it may be derived from milk or bean.
  • ⁇ -casein, ⁇ -casein, ⁇ -casein, ⁇ -casein and their Mixtures can be used. Casein can be used alone or in combination of two or more.
  • the proteins used in the present invention may be used alone or in combination of two or more.
  • the protein can be crosslinked during and / or after the formation of the nanoparticles.
  • An enzyme can be used for the above-described crosslinking treatment.
  • the enzyme is not particularly limited as long as it has a known protein cross-linking effect, and transglutaminase is preferable among them.
  • Transglutaminase may be derived from a mammal or a microorganism, and a genetic recombinant can be used. Specifically, Activa series manufactured by Ajinomoto Co., Inc., mammal-derived transglutaminase released as a reagent, for example, guinea pig liver-derived trans from Oriental Yeast Co., Ltd., Upstate USA Inc., Biodesign International, etc. Examples include glutaminase, goat-derived transglutaminase, rabbit-derived transglutaminase, and human-derived recombinant transglutaminase.
  • the amount of the enzyme used for the cross-linking treatment in the present invention can be appropriately set according to the type of protein, but is typically about 0.1 to 100% by weight based on the weight of the protein. Preferably, about 1 to 50% by weight can be added.
  • the time for the cross-linking reaction by the enzyme can be appropriately set according to the kind of protein and the size of the nanoparticle, but it can be reacted normally for 1 hour to 72 hours, preferably 2 hours to 24 hours. Can react.
  • the temperature of the cross-linking reaction by the enzyme can be appropriately set according to the type of protein and the size of the nanoparticle, but it can be reacted normally at 0 to 80 ° C., preferably 25 to 60 ° C. Can react at °C.
  • the enzymes used in the present invention can be used alone or in combination of two or more.
  • the nanoparticles used in the present invention are prepared according to the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-79168 or by C. Coester, Journal Microcapsulation, 2000, Vol. 17, p. 187-193. However, it is preferable to use an enzyme instead of glutaraldehyde as a crosslinking method.
  • an enzyme crosslinking process in an organic solvent.
  • the organic solvent used here is preferably a water-soluble organic solvent such as ethanol, isopropanol, butylene glycol, or glycerol, which is added to a general skin external preparation.
  • One or more components selected from lipids (phospholipids, etc.), anionic polysaccharides, cationic polysaccharides, anionic proteins, cationic proteins, or cyclodextrins may be added to the MMP-2 inhibitor of the present invention. It can.
  • the amount of lipid (such as phospholipid), anionic polysaccharide, cationic polysaccharide, anionic protein, cationic protein, and cyclodextrin is not particularly limited, but is generally 0.1 to 100 weight based on the weight of the protein. % Can be added.
  • the sustained release rate can be adjusted by changing the ratio of the above components to the protein.
  • phospholipids that can be used in the present invention, but the present invention is not limited to these compounds.
  • examples include phosphatidylcholine (lecithin), phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, diphosphatidylglycerol, sphingomyelin and the like.
  • the anionic polysaccharide that can be used in the present invention is a polysaccharide having an acidic polar group such as a carboxyl group, a sulfate group, or a phosphate group. Specific examples are listed below, but the present invention is not limited to these compounds. Examples thereof include chondroitin sulfate, dextran sulfate, carboxymethylcellulose, carboxymethyldextran, alginic acid, pectin, carrageenan, fucoidan, agaropectin, porphyran, caraya gum, gellan gum, xanthan gum, and hyaluronic acid.
  • an acidic polar group such as a carboxyl group, a sulfate group, or a phosphate group. Specific examples are listed below, but the present invention is not limited to these compounds. Examples thereof include chondroitin sulfate, dextran sulfate, carboxymethylcellulose, carboxymethyldextran, alginic
  • the cationic polysaccharide that can be used in the present invention is a polysaccharide having a basic polar group such as an amino group. Specific examples are listed below, but the present invention is not limited to these compounds. Examples thereof include glucosamine such as chitin and chitosan and galactosamine as a constituent monosaccharide.
  • Anionic proteins that can be used in the present invention are proteins and lipoproteins whose isoelectric point is on the basic side of physiological pH. Specific examples are listed, but the present invention is not limited to these compounds. Examples include polyglutamic acid, polyaspartic acid, lysozyme, cytochrome C, ribonuclease, trypsinogen, chymotrypsinogen, ⁇ -chymotrypsin and the like.
  • the cationic protein used in the present invention is a protein or lipoprotein whose isoelectric point is on the acidic side of physiological pH. Specific examples are listed, but the present invention is not limited to these compounds. Examples include polylysine, polyarginine, histone, protamine, and ovalbumin.
  • casein nanoparticles prepared by the following steps (a) to (d) can be used.
  • casein nanoparticles prepared by the following steps (a) to (d) can be used.
  • resveratrol may be dispersed in a system that does not contain water, or can be dispersed by adding an aqueous medium after dispersion. That is, in the above, step (c) may be performed before step (b).
  • casein nanoparticles of a desired size can be produced.
  • the active ingredient can be included in the casein nanoparticles by utilizing the interaction between the hydrophobic active ingredient and the casein hydrophobic portion.
  • these particles exist stably in an aqueous solution.
  • ionic active ingredients are encapsulated by mixed particles of casein and ionic polysaccharides or other types of ionic proteins.
  • the method for producing casein nanoparticles of the present invention includes a casein mixed with a basic aqueous medium solution, and a casein mixed with an acidic aqueous medium, a casein mixed with a basic aqueous medium solution, and the pH lowered while stirring. The method of letting it be mentioned.
  • the injection rate can be from 1 mL / min to 100 mL / min.
  • the temperature of the basic aqueous medium can be set as appropriate, but can be normally 0 ° C. to 80 ° C., and preferably 25 ° C. to 70 ° C.
  • the temperature of the acidic aqueous medium can be appropriately set, but can be normally 0 ° C. to 80 ° C., preferably 25 ° C. to 60 ° C.
  • the stirring speed can be set as appropriate, but it can be normally set to 100 rpm to 3000 rpm, and preferably 200 rpm to 2000 rpm.
  • the temperature of the basic aqueous medium can be appropriately set, but can be normally 0 ° C. to 80 ° C., and preferably 25 ° C. to 70 ° C.
  • the stirring speed can be set as appropriate, but it can be normally set to 100 rpm to 3000 rpm, and preferably 200 rpm to 2000 rpm.
  • an organic acid or base an aqueous solution of an inorganic acid or inorganic base, or a buffer solution can be used.
  • citric acid ascorbic acid, gluconic acid, carboxylic acid, tartaric acid, succinic acid, acetic acid or phthalic acid, trifluoroacetic acid, morpholinoethanesulfonic acid, 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1- Piperazinyl] organic acids such as ethanesulfonic acid; organic bases such as tris (hydroxymethyl), aminomethane, ammonia; inorganic acids such as hydrochloric acid, perchloric acid, carbonic acid; sodium phosphate, potassium phosphate, calcium hydroxide, Although the aqueous solution using inorganic bases, such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, and magnesium hydroxide, is mentioned, It is not limited to these.
  • the concentration of the aqueous medium used in the present invention is preferably about 10 mM to about 1M. More preferably, it is about 20 mM to about 200 mM.
  • the pH of the basic aqueous medium used in the present invention is preferably 8 or more, and preferably 8 to 12. More preferably, the pH is 9 to 11. If the pH is too high, there is a concern about hydrolysis and danger in handling, so the above range is preferable.
  • the temperature at which casein is mixed with a basic aqueous medium having a pH of 8 or higher is preferably from 0 to 80 ° C, more preferably from 10 to 60 ° C. More preferably, it is 20 to 40 ° C.
  • the pH of the acidic aqueous medium used in the present invention is preferably 3.5 to 7.5. More preferably the pH is from 5 to 6.
  • the MMP-2 inhibitor of the present invention can prevent or improve skin aging. Since the MMP-2 inhibitor of the present invention is excellent in safety and permeability when applied to the skin, it can be used as an external preparation for skin, for example, as an anti-wrinkle agent. For example, the MMP-2 inhibitor of the present invention can also be used by blending into skin cosmetics. In the skin cosmetic, only the MMP-2 inhibitor of the present invention may be blended, or other active ingredients may be blended in combination.
  • the MMP-2 inhibitor of the present invention can further contain an additive.
  • an additive an antioxidant component, an active oxygen remover, an anti-inflammatory agent, an anti-aging agent, a collagen synthesis promoter, an anti-wrinkle agent, a vitamin agent, a mineral, an amino acid, an antibacterial agent, an ultraviolet ray
  • an antioxidant component an active oxygen remover, an anti-inflammatory agent, an anti-aging agent, a collagen synthesis promoter, an anti-wrinkle agent, a vitamin agent, a mineral, an amino acid, an antibacterial agent, an ultraviolet ray
  • absorbents moisturizers, softeners, transdermal absorption enhancers, soothing agents, preservatives, antioxidants, pigments, thickeners, fragrances, or pH adjusters can do.
  • the dosage form of the MMP-2 inhibitor of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include liquids, poultices, coating agents, gels, creams, aerosols, lotions, powders, foams, lotions, body soaps, Examples include soaps and cosmetics.
  • the administration method of the MMP-2 inhibitor of the present invention includes transdermal and transmucosal administration.
  • the dose of the MMP-2 inhibitor of the present invention can be appropriately set according to the weight of the user, the state of the disease, etc., but in general, the resvera that is an active ingredient per administration
  • a dosage of trol about 1 ⁇ g to 50 mg / cm 2 can be administered, and preferably about 2.5 ⁇ g to 10 mg / cm 2 can be administered.
  • Example 1 Resveratrol inhibition test of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) enzyme activity Resveratrol and grapevine extract containing it were tested for inhibitory activity against MMP-2.
  • the test method used was MMP-2 Fluorimetric Drug Discovery Kit-AK-409 (BIOMOL). The preparation and test method were carried out by the methods described in the kit. The calculation of the inhibition rate was compared with the case where the activity per unit time in the negative control test (solvent only) was 100.
  • N-isobutyl-N- (4-methoxyphenylsulfonyl) -glycylhydroxamic acid (NNGH: final concentration in the system 130 ⁇ M), which has a known inhibitory activity for MMP-2, was used as a positive compound in this test.
  • NGH final concentration in the system 130 ⁇ M
  • the results of the activity inhibition rate are shown in FIG. 1 and FIG.
  • FIG. 1 is an experiment of adding transresveratrol (Wako Pure Chemical Industries). From the test results, inhibition of the enzyme activity of MMP-2 was observed in a concentration-dependent manner.
  • FIG. 2 shows the results of an addition test by REVERATROX (Kaei Kogyo Co., Ltd.), which is a raw material containing 5% or more of total resveratrol. The concentration in the graph is the amount of transresveratrol in the system. From the above results, resveratrol was shown to inhibit MMP-2 activity alone and in raw materials.
  • Example 2 Preparation of protein nanoparticles Grape vine extract containing resveratrol in a solid content of 6% was dissolved in 1,3 butylene glycol so as to be 5% (w / w).
  • Resveratrol solution hereinafter
  • Casein or acid-treated gelatin was dispersed in the same amount of 1,3-butylene glycol, and 50 mM Na citrate adjusted to pH 11 so that the concentration was 1% (w / w) was added. 1/10 amount of resveratrol solution was added thereto and well stirred and dispersed with a magnetic stirrer.
  • Example 3 Transdermal absorption effect A skin permeation test of casein particles encapsulating resveratrol was performed by the following method.
  • the subject skin was a hairless rat (8 weeks old).
  • a 27 mm diameter biopsy punched out of the abdomen of a hairless rat in a circle was fixed to Franz Cell (Hanson Research).
  • the receptor solution was replaced with 7 ml of 30% ethanol-containing PBS, and the casein particles encapsulating resveratrol in the donor (prepared in Example 2) were used to increase the salt strength between the donor and the receptor with PBS.
  • 1 ml of the prepared sample was provided. While stirring the receptor liquid, it was kept at 32 ° C.
  • FIG. 3 shows the permeation result of resveratrol in the receptor solution over time. As shown in FIG. 3, the casein nanoparticles were highly permeable after a lag time of about 3 hours.

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Abstract

　本発明の課題は、レスベラトロールの新たな用途としてマトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）阻害作用を見出すとともに、該マトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）阻害作用を有効に発揮させるための製剤を提供することである。本発明によれば、レスベラトロールを有効成分として含有する、マトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）阻害剤が提供される。

Description

マトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）阻害剤
　本発明は、皮膚外用剤、特には抗しわ剤として使用できる、レスベラトロールを有効成分として含有するマトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）阻害剤に関する。
　レスベラトロール（５－パラヒドロキシスチリルレゾルシノール、又は３，４’，５－スチルベントリオールとも称する）は、赤ワインおよびその原料であるブドウの皮・種子、またマルベリー、ピーナッツ、大黄から見出されるポリフェノール系フラボノイドであり、近年の分子生物学的な研究において長寿遺伝子SRIT１などの活性を制御して細胞を抗寿命化する効能が知られている（非特許文献１）。
　上記の抗寿命化効果に基づいて、レスベラトロールは皮膚用の製剤に対しても抗老化の観点から配合され始めている。例えば、特許文献１にはレスベラトロールの表皮細胞増殖効果が記載されており、また特許文献２においては抗しわ効果の高いレチノイド系化合物との併用組成物による抗しわ剤が記載されている。しかし、経口投与と異なり、皮膚の抗老化を期待する場合は、角層（20μｍ）を通過し、生細胞で構成される真皮層に薬剤を届けなければ目的の効果が得られない。
　さらに、経皮吸収薬剤に関しては、例えば、特許文献３には、高分子材料を用いたナノ粒子抗老化皮膚外用剤が記載されている。また特許文献４には、スキンケア成分を含む架橋高分子ナノ粒子が記載されている。これらは界面活性剤を使用した乳化物や、モノマーもしくはマクロマー（重合性基を持つ合成高分子）の重合物であり、また剤形作成時においてハロゲン化アルカン類（クロロメタン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラクロロメタン等）の使用する場合があり、安全性に懸念がある。これら剤形は一定の効果を示すものの、皮膚透過性および安全性の問題から皮膚老化防止に十分な効果を示すには至っていなかったり、過度の適用により経皮の安全性に懸念がありその改善が望まれていた。
　皮膚の老化の原因は多様であり、紫外線、乾燥、外的因子、加齢などが挙げられる。近年、皮膚の老化を誘導する因子として、マトリックスメタロプロテアーゼの関与が指摘されている。マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰとも称する）はタンパク質分解酵素であり、細胞外マトリックスの構成タンパク質の分解及び再構築に関与している。ＭＭＰの１種であるマトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）(matrix metallopeptidase 2 ,gelatinase A, 72kDa gelatinase, 72kDa type IV collagenase)は、細胞外マトリックスのゼラチン、皮膚基底膜の主成分である４型コラーゲンを含む各種コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン及びエラスチンなどの多様な基質を切断し、皮膚の老化に関与することが知られている。従って、ＭＭＰ－２活性の阻害は、皮膚の老化を防止・改善するために重要であると考えられる。
Clinical Interventions in Aging. 第3(2)巻、第331-339頁、2008年
特表２００１－５１０７７７号公報 特表２００３－５１２４１２号公報 特開２００２－３０８７２８号公報 特開２００４－２４４４２０号公報
　本発明は、レスベラトロールの新たな用途としてマトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）阻害作用を見出すとともに、該マトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）阻害作用を有効に発揮させるための製剤を提供することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、安全性が高く、レスベラトロール含有粒子径が小さいことにより透明性が高く、皮膚への浸透性が良く、ＭＭＰ－２が４型コラーゲンの分解を引き起こす基底膜以下の真皮層までレスベラトロールを伝達させることが可能である、レスベラトロール含有製剤を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、レスベラトロールがマトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）の活性を阻害する作用を有することを見出した。さらに、本発明者らは、レスベラトロールを内包したタンパク質ナノ粒子を調製し、皮膚に適用した結果、安全性、透明性が高く、且つ、真皮層までの良好な皮膚浸透性が示されることを実証した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
　即ち、本発明によれば、レスベラトロールを有効成分として含有する、マトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）阻害剤が提供される。
　好ましくは、レスベラトロールはタンパク質粒子に内包されている。
　好ましくは、タンパク質粒子の平均粒子サイズは10～1000ｎｍである。
　好ましくは、タンパク質の重量に対して０.１～１００重量％のレスベラトロールを含有する。
　好ましくは、タンパク質はコラーゲン、ゼラチン、酸処理ゼラチン、アルブミン、オバルブミン、オバルブミン、カゼイン、トランスフェリン、グロブリン、フィブロイン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、又はビトロネクチンからなる群より選ばれる少なくとも一種である。
　好ましくは、本発明のＭＭＰ－２阻害剤は、皮膚外用剤として使用する。
　好ましくは、本発明のＭＭＰ－２阻害剤は、抗しわ剤として使用する。
　本発明によればさらに、レスベラトロールを対象に投与することを含む、マトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）を阻害する方法が提供される。
　本発明によればさらに、マトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）阻害剤の製造のためのレスベラトロールの使用が提供される。
　本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）阻害剤は、効果的なマトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）阻害作用を示し、皮膚に対してしわ予防効果を発揮できる。特に、レスベラトロールがタンパク質粒子に内包されている本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）阻害剤は、従来の界面活性剤を利用した可溶化技術による製剤よりも皮膚透過性が優れ、しわの原因の１つとして考えられているマトリックスメタロプロテアーゼ－２を真皮層で阻害することができ、より高いしわ予防効果が期待できる。
図１は、レスベラトロールを用いてＭＭＰ２酵素残活性の変化を測定した結果を示す。 図２は、レスベラトロール含有原料を用いてＭＭＰ２酵素残活性の変化を測定した結果を示す。 図３は、レスベラトロールを用いてヘアレスラット皮膚透過量を測定した結果を示す。 図４は、皮膚透過係数を測定した結果を示す。
　以下、本発明の実施の形態についてさらに具体的に説明する。
　本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）阻害剤は、レスベラトロールを有効成分として含有する。レスベラトロールは、５－パラヒドロキシスチリルレゾルシノール又は３，４’，５－スチルベントリオールとしても知られる化合物であり、下記の構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  純粋のレスベラトロールは、和光純薬工業株式会社、東京化成工業株式会社から商業的に得ることができ、アクチケムS.A社（ACTICHEM社）、ディーエヌピー・インターナショナル社（ＤＮＰ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ファルマ・サイエンス社（Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、又はマディス・ボタニカルス社（Ｍａｄｉｓ  Ｂｏｔａｎｉｃａｌｓ）、サンブライト株式会社、オリザ油化株式会社のような他の原材料メーカーから粗製形で得ることができる。
　本発明のＭＭＰ－２阻害剤においては、レスベラトロールはタンパク質粒子に内包されていることが好ましい。
　本発明のＭＭＰ－２阻害剤は、０．０１～５０重量％のタンパク質ナノ粒子を含有することが好ましく、０．１～１０重量％のタンパク質ナノ粒子を含有することがさらに好ましい。本発明のＭＭＰ－２阻害剤は、タンパク質の重量に対して、０.１～１００重量％のレスベラトロールを含有することが好ましく、タンパク質の重量に対して、０.１～５０重量％のレスベラトロールを含有することがさらに好ましい。
　本発明において、レスベラトロールは、タンパク質ナノ粒子の形成時に添加してもよいし、ナノ粒子の作成後に添加してもよい。
　本発明で用いるタンパク質ナノ粒子の平均粒子サイズは、通常は１～1000ｎｍであり、好ましくは10～1000ｎｍであり、より好ましくは10～500ｎｍであり、より好ましくは10～250ｎｍであり、さらに好ましくは10～100ｎｍであり、特に好ましくは20～40ｎｍである。
　本発明で用いるタンパク質の種類は特に限定されないが、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパクが好ましく、分子量１万から１００万程度のタンパク質を用いることが好ましい。タンパク質の由来は特に限定されないが、天然に存在するタンパク質、特にヒト由来のタンパク質を用いることが好ましい。タンパク質として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。コラーゲン、ゼラチン、酸処理ゼラチン、アルブミン、オバルブミン、カゼイン、トランスフェリン、グロブリン、フィブロイン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、又はビトロネクチンからなる群より選ばれる少なくとも一種を使用することができる。また、タンパク質の由来は特に限定するものではなく、牛、豚、魚、植物および遺伝子組み換え体のいずれも用いることができる。遺伝子組み換えゼラチンとしては、例えばEP1014176Ａ２号、米国特許6,992,172号に記載のものを用いることができるがこれらに限定されるものではない。その中で好ましいものは、カゼイン、酸処理ゼラチン、コラーゲン、又はアルブミンであり、最も好ましいものはカゼイン、又は酸処理ゼラチンである。本発明でカゼインを用いる場合、カゼインの由来は特に限定されず、乳由来であっても、豆由来であってもよく、α－カゼイン、β－カゼイン、γ－カゼイン、κ－カゼインおよびそれらの混合物を使用することができる。カゼインは、単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
　本発明に用いられるタンパク質は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
　本発明では、ナノ粒子の形成中および／又は形成後にタンパク質を架橋処理することができる。上記した架橋処理は、酵素を用いることができる。酵素としては、タンパクの架橋作用が知られているものであれば特に制限されず、その中で好ましいものはトランスグルタミナーゼである。
　トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、遺伝子組み換え体を用いることができる。具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼ、ヒト由来リコンビナントトランスグルタミナーゼなどが挙げられる。
　本発明において架橋処理のために用いられる酵素の量は、タンパク質の種類に応じて適宜設定することが出来るが、標準的には、タンパク質の重量に対して、０.１～１００重量％程度を添加することができ、好ましくは、１～５０重量％程度を添加することができる。
　酵素による架橋反応の時間は、タンパク質の種類、ナノ粒子サイズに応じて適宜設定することができるが、標準的には、１時間から７２時間反応することができ、好ましくは、２時間から２４時間反応することができる。
　酵素による架橋反応の温度は、タンパク質の種類、ナノ粒子サイズに応じて適宜設定することができるが、標準的には、０℃から８０℃で反応することができ、好ましくは、２５℃から６０℃で反応することができる。
　本発明に用いられる酵素は単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
　本発明で用いるナノ粒子は、特許文献特開平６－７９１６８号公報、又はC.Coester著、ジャーナル・ミクロカプスレーション、２０００年、１７巻、p.１８７－１９３に記載の方法に準じて作製することができるが、架橋方法としてグルタルアルデヒドの代わりに酵素を用いることが好ましい。
　また、本発明においては、酵素架橋処理を有機溶媒中で行うことが好ましい。ここで用いる有機溶媒は一般的な皮膚外用剤に添加される溶媒、例えばエタノール、イソプロパノール、ブチレングリコール、グリセロールなどの水溶性有機溶媒が好ましい。
　さらに、本発明においては、架橋処理後に有機溶媒を留去し、水分散することが好ましい。有機溶媒を留去前に水を加えてもよく、留去後に水を加えても良い。
　本発明のＭＭＰ－２阻害剤には、脂質（リン脂質など）、アニオン性多糖、カチオン性多糖、アニオン性タンパク質、カチオンタンパク質、又はシクロデキストリンから選択される１種以上の成分を添加することもできる。脂質（リン脂質など）、アニオン性多糖、カチオン性多糖、アニオン性タンパク質、カチオンタンパク質、及びシクロデキストリンの添加量は特に限定されないが、一般的にはタンパク質の重量に対して０.１～１００重量％の量で添加することができる。本発明のＭＭＰ－２阻害剤においては、上記成分とタンパク質の比を変えることよって、徐放速度を調整することができる。
　本発明に用いることができるリン脂質として具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。
　本発明に用いることができるアニオン性多糖とはカルボキシル基、硫酸基又はリン酸基等の酸性極性基を有する多糖類である。以下に具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、アルギン酸、ペクチン、カラギーナン、フコイダン、アガロペクチン、ポルフィラン、カラヤガム、ジェランガム、キサンタンガム、ヒアルロン酸類等が挙げられる。
　本発明に用いることができるカチオン性多糖とは、アミノ基等の塩基性極性基を有する多糖類である。以下に具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。キチン、キトサンなどのグルコサミンやガラクトサミンを構成単糖として含むものなどが挙げられる。
　本発明に用いることができるアニオン性タンパク質とは等電点が生理的ｐＨよりも塩基性側にあるタンパク質およびリポタンパク質である。具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、リゾチーム、チトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、α－キモトリプシンなどが挙げられる。
　本発明に用いられるカチオンタンパク質とは等電点が生理的ｐＨよりも酸性側にあるタンパク質およびリポタンパク質である。具体例を列挙するが、本発明においてはこれらの化合物に限定されるものではない。ポリリジン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、オバルブミンなどが挙げられる。
　本発明の一例としては、下記の工程（ａ）から（ｄ）によって作製されるカゼインナノ粒子を用いることができる。
（ａ）多価アルコールにカゼインを懸濁させる工程；
（ｂ）カゼインをpH８以上１１未満の塩基性水性媒体に混合する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得た溶液にレスベラトロールを添加する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で得た溶液をpH3.5～7.5の水性媒体に注入する工程；
　本発明の別の例としては、下記の工程（ａ）から（ｄ）によって作製されるカゼインナノ粒子を用いることができる。
（ａ）多価アルコールにカゼインを懸濁させる工程；
（ｂ）カゼインをpH８以上１１未満の塩基性水性媒体に混合する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得た溶液にレスベラトロールを添加する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で得た溶液のpH を等電点からpH1以上離れたpHまで下降させる工程；
　上記において、レスベラトロールは水を含まない系で分散してもよく、分散後に水性媒体を添加しても分散できる。即ち、上記において、工程（ｃ）を工程（ｂ）の前に行ってもよい。
本発明においては、所望のサイズのカゼインナノ粒子を作製できる。また、疎水性の活性成分とカゼイン疎水性部分の相互作用を利用して、カゼインナノ粒子内に活性成分を内包できる。さらに、これらの粒子は水溶液中で安定に存在することが見出された。
また、カゼインとイオン性多糖または別種のイオン性タンパク質との混合粒子により、イオン性活性成分を内包することも見出された。
本発明のカゼインナノ粒子の作製方法は、カゼインを塩基性水性媒体液に混合し、酸性水性媒体中に注入する方法と、カゼインを塩基性水性媒体液に混合し、攪拌しながら、pHを下降させる方法が挙げられる。
　カゼインを塩基性水性媒体液に混合し、酸性水性媒体中に注入する方法としては、シリンジによるのが簡便で好ましいが、注入速度、溶解性、温度、撹拌状態を満足する方法であれば特に限定しない。一般的には、注入速度は、1mL/minから100mL/minで注入することができる。塩基性水性媒体の温度は、適宜設定することができるが、標準的には、０℃から８０℃にすることができ、好ましくは、２５℃から７０℃にすることができる。酸性水性媒体の温度は、適宜設定することができるが、標準的には、０℃から８０℃にすることができ、好ましくは、２５℃から６０℃ですることができる。攪拌速度は、適宜設定することができるが、標準的には、100rpmから3000rpmにすることができ、好ましくは、200rpmから2000rpmである。
　カゼインを塩基性水性媒体液に混合し、攪拌しながら、pHを下降させる方法としては、酸を滴下するのが簡便で好ましいが、溶解性、温度、撹拌状態を満足する方法であれば特に限定しない。塩基性水性媒体の温度は、適宜設定することができるが、標準的には、０℃から８０℃にすることができ、好ましくは、２５℃から７０℃にすることができる。攪拌速度は、適宜設定することができるが、標準的には、100rpmから3000rpmにすることができ、好ましくは、200rpmから2000rpmである。
　本発明に用いる水性媒体は、有機酸または塩基、無機酸または無機塩基の水溶液、又は緩衝液を用いることができる。
　具体的には、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、カルボン酸、酒石酸、コハク酸、酢酸またはフタル酸、トリフルオロ酢酸、モルホリノエタンスルホン酸、2-〔4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル〕エタンスルホン酸のような有機酸；トリス（ヒドロキシメチル）、アミノメタン、アンモニアのような有機塩基；塩酸、過塩素酸、炭酸のような無機酸；燐酸ナトリウム、燐酸カリウム、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウムのような無機塩基を用いた水溶液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　本発明に用いる水性媒体の濃度は、約10mMから約１Mが好ましい。より好ましくは、約20mMから約200mMである。
　本発明に用いる塩基性水性媒体のpHは、８以上が好ましく、８から１２が好ましい。より好ましくはpH９から１１である。pHが高すぎると加水分解の懸念や取り扱い上の危険性があるため、上述の範囲が好ましい。
　本発明において、カゼインをpH８以上の塩基性水性媒体に混合させる温度は、０～80℃が好ましく、10～60℃が好ましい。より好ましくは、20～40℃である。
　本発明に用いる酸性水性媒体のpHは、好ましいpHは3.5～7.5である。より好ましくはpHは５から６である。
　本発明のＭＭＰ－２阻害剤は、皮膚の老化を防止又は改善することができる。本発明のＭＭＰ－２阻害剤は、皮膚に適用した場合の安全性・浸透性に優れているため、皮膚外用剤として使用することができ、例えば、抗しわ剤として使用することができる。例えば、本発明のＭＭＰ－２阻害剤は、皮膚化粧料に配合して用いることもできる。皮膚化粧料には、本発明のＭＭＰ－２阻害剤のみを配合してもよいし、その他の有効成分を組み合わせて配合してもよい。
　本発明のＭＭＰ－２阻害剤はさらに、添加物を含むことができる。添加物としては特に限定することはないが、抗酸化成分、活性酸素除去剤、抗炎症剤、アンチエイジング剤、コラーゲン合成促進剤、抗しわ剤、ビタミン剤、ミネラル、アミノ酸類、抗菌剤、紫外線吸収剤、保湿剤、柔軟剤、経皮吸収促進剤、無痛化剤、防腐剤、酸化防止剤、色素剤、増粘剤、香料、又はpH調整剤から選択される１種以上のものを使用することができる。
　本発明のＭＭＰ－２阻害剤の剤型は特に限定されないが、例えば、液剤、湿布剤、塗布剤、ゲル剤、クリーム剤、エアゾール剤、ローション剤、粉剤、泡剤、化粧水、ボディーソープ、石鹸、粧料などを挙げることができる。
　本発明のＭＭＰ－２阻害剤の投与方法としては、経皮・経粘膜投与が挙げられる。
　本発明のＭＭＰ－２阻害剤の投与量は、使用者の体重、疾患の状態などに応じて適宜設定することができるが、一般的には、１回の投与につき、有効成分であるレスベラトロールの投与量として１μｇ～５０ｍｇ／ｃｍ2程度を投与することができ、好ましくは２．５μｇ～１０ｍｇ／ｃｍ2程度を投与することができる。
　以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：レスベラトロールのマトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）酵素活性阻害試験
　レスベラトロール、並びにそれを含有するブドウつるエキスのＭＭＰ－２に対する阻害活性を試験した。試験方法は、MMP-2 Fluorimetric Drug Discovery Kit - AK-409(BIOMOL社)を使用した。調液および試験方法はキットに記載の方法で実施した。阻害率の計算はネガティブコントロール試験（溶媒のみ）の単位時間の活性を１００とした場合と比較した。また、本試験の陽性化合物としてＭＭＰ－２の阻害活性が既知であるN-イソブチル-N-(4-メトキシフェニルスルホニル)-グリシルヒドロキサム酸（NNGH：系中終濃度　130μＭ）を使用した。活性阻害率の結果を図１及び図２に示す。
　図１は、トランスレスベラトロール（和光純薬）の添加実験である。試験結果から濃度依存的にＭＭＰ－２の酵素活性阻害が見られた。図２は、総レスベラトロールを５％以上含有する原材料であるRESVERATROX（香栄興業）による添加試験結果である。グラフ中の濃度は系中のトランスレスベラトロール量である。上記の結果から、レスベラトロールは単独および原材料においてもＭＭＰ－２活性の阻害活性が示された。
実施例２：タンパク質ナノ粒子の作成
　レスベラトロールを固形分中６％含有するブドウつるエキスを１，３ブチレングリコールで５％(w/w)となるように溶解した。（以下レスベラトロール溶液）また、カゼイン又は酸処理ゼラチンは同量の１，３ブチレングリコールに分散し１％（w/w）濃度となるようにpH11に調整した50mMクエン酸Naを添加した。そこにレスベラトロール溶液を1/10量添加して、マグネティックスターラーでよく攪拌・分散した。（タンパク質0.9％、レスベラトロール約0.03％溶液である）　この溶液をｐＨ7.4に調整してレスベラトロール-カゼイン内包物及びレスベラトロール-酸処理ゼラチン内包物を得た。
　また必要に応じて0.22μｍ程度のフィルターに供し、より透明で均一なカゼインナノ粒子を得た。表１に作製直後および２週間後の外観および平均粒子径を示す。なお平均粒子径は大塚電子の粒径アナライザー（ＦＰＡＲ１０００）を用いて測定した。タンパク質ナノ粒子化した場合は可溶性が付与され白濁、沈殿を起こさず安定に水溶化できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例３：経皮吸収効果
　レスベラトロールを内包したカゼイン粒子の皮膚透過試験を下記方法で実施した。対象の皮膚はヘアレスラット（8週齢）を使用した。27mm径のバイオプシーでヘアレスラット腹部を円形に打ち抜いたものをフランツセル（Hanson　Research）に固定した。PBSで1時間還流した後、レセプター液を30％エタノール配合PBS７ｍｌに置換し、ドナーにレスベラトロールを内包したカゼイン粒子（実施例２で作製したもの）をPBSでドナーとレセプター側の塩強度を調整したサンプル１ｍｌを供した。レセプター液を攪拌しながら、ウォータージャケットを用いて32℃に保ち、経時的にレセプター液を回収した。このレセプター液を下記条件で高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析し透過したレスベラトロールを定量した。試験時においてネガティブコントロールとしてPBS液、対象として一般的な可溶化剤であるPEG40硬化ひまし油（HCO-40；ニッコーケミカル）可溶化物、エタノール溶解したものと比較した。カゼインナノ粒子、エタノール溶解液、HCO-40可溶化物にはすべて、約0.03％のレスベラトロールを含むように調整した。
HPLC条件
カラム：C18  5μm
流量：１ｍｌ/min
カラム温度：４０℃
検出波長：３１０nm
展開液：アセトニトリル/水＝20/80（酢酸0.1％、トリエタノールアミン0.1％を含む）
　レセプター液中のレスベラトロールの経時による浸透結果を図３に示す。図３に示す通り、カゼインナノ粒子は約３時間のラグタイムの後に高い浸透性を示した。
　また、　フレグランスジャーナル２００８年１０月号P38-41において杉林らが提唱する皮膚透過係数を定量することで浸透結果を考察した。結果を図４に示す。図４に示す通り、本発明のカゼインナノ粒子の透過係数は２．３×１０-7（ｃｍ/ｓ）であり、この透過係数では上記文献から2.4時間で角層全層（20μm）を透過すると予想でき、従来の技術である可溶化物や一般的に皮膚透過促進効果のあるといわれているエタノールと比べても１０倍程度の浸透速度の向上効果が優れている結果であった。

Claims (7)

  1. レスベラトロールを有効成分として含有する、マトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）阻害剤。
  2. レスベラトロールがタンパク質粒子に内包されている、請求項１に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）阻害剤。
  3. タンパク質粒子の平均粒子サイズが10～1000ｎｍである、請求項２に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）阻害剤。
  4. タンパク質の重量に対して０.１～１００重量％のレスベラトロールを含有する、請求項２又は３に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）阻害剤。
  5. タンパク質がコラーゲン、ゼラチン、酸処理ゼラチン、アルブミン、オバルブミン、オバルブミン、カゼイン、トランスフェリン、グロブリン、フィブロイン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、又はビトロネクチンからなる群より選ばれる少なくとも一種である、請求項２から４の何れかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）阻害剤。
  6. 皮膚外用剤として使用する、請求項１から５の何れかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）阻害剤。
  7. 抗しわ剤として使用する、請求項１から６の何れかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ－２（ＭＭＰ－２）阻害剤。
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