JP2016124804A - 天然物由来成分を基材とするナノ粒子の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】スチルベン誘導体混合物を安定に含有し、且つ、平均粒子径が1〜200nmであり、生体利用性の高いナノ粒子の製造方法を提供すること。
【解決手段】ガレート型カテキンを固形分として0.1重量%以上、(i)ゼラチン、コラーゲン、及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも1種の動物性タンパク質、(ii)ホエイタンパク、卵白タンパク質及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも1種の動物性タンパク質、又は(i)(ii)の混合物を固形分として0.1重量%以上含有し、前記ガレート型カテキンの固形分と前記動物性タンパク質の固形分の重量比(動物性タンパク質/ガレート型カテキン)が0.05〜8.0であり、且つ、スチルベン誘導体を含有し、平均粒子径が1〜200nmであるナノ粒子を、(a)加温条件下で前記動物性タンパク質と水、含水溶媒又は有機溶媒とを混合する工程、(b)加温条件下にて前記(a)工程で得られる混合物に前記スチルベン誘導体を混合する工程、(c)加温条件下にて前記(b)工程で得られる混合物にガレート型カテキンを混合し、溶液のpHを4.2以下にする工程、(d)前記(c)工程で得られる混合物を80℃以上100℃未満に加温した後、15℃以下に冷却する工程を得て製造する。
【選択図】なし
【解決手段】ガレート型カテキンを固形分として0.1重量%以上、(i)ゼラチン、コラーゲン、及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも1種の動物性タンパク質、(ii)ホエイタンパク、卵白タンパク質及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも1種の動物性タンパク質、又は(i)(ii)の混合物を固形分として0.1重量%以上含有し、前記ガレート型カテキンの固形分と前記動物性タンパク質の固形分の重量比(動物性タンパク質/ガレート型カテキン)が0.05〜8.0であり、且つ、スチルベン誘導体を含有し、平均粒子径が1〜200nmであるナノ粒子を、(a)加温条件下で前記動物性タンパク質と水、含水溶媒又は有機溶媒とを混合する工程、(b)加温条件下にて前記(a)工程で得られる混合物に前記スチルベン誘導体を混合する工程、(c)加温条件下にて前記(b)工程で得られる混合物にガレート型カテキンを混合し、溶液のpHを4.2以下にする工程、(d)前記(c)工程で得られる混合物を80℃以上100℃未満に加温した後、15℃以下に冷却する工程を得て製造する。
【選択図】なし
Description
本発明は、ガレート型カテキン及び動物性タンパク質という天然物由来の基材からなり、且つスチルベン誘導体を含有するナノ粒子の製造方法に関する。
天然物由来のゼラチンは、豚や牛、魚の軟骨成分より抽出したタンパク質であり、食品のゲル化剤、増粘剤、安定剤等としての利用のほかにカプセル等の基材として止血剤等の医療分野でも利用されている。また、前記ゼラチンに臭化カリウムと硝酸銀とを加えた乳化コロイドは感光物質の保護コロイドとして用いられている。また、ゼラチンが水溶性であるという性質を利用し、有機溶媒に滴下することでマイクロカプセルを作製する技術も知られている。
更に、近年ゼラチンをナノ粒子化することにより、医薬品成分を目的の臓器や組織に提供するためのドラッグデリバリーシステム(DDS)に利用する技術開発が進んでいる。ゼラチンのような食品由来の成分を用いたナノ粒子は安全性の観点から優位性が高いと考えられる。例として、キトサンと併用したナノ粒子の製造方法が挙げられる(特許文献1,2,3)。
本発明者らも、製造の簡便性及び原料コストでの優位性を見出したゼラチンとガレート型カテキンを組み合わせたナノ粒子の製造方法を提案してきた(特許文献4)。本発明者らの方法はガレート型カテキンをゼラチン等の動物性タンパク質に対するコアセルベーターとして働かせる方法である。これはそれ自体が生理活性を有する物質をナノ粒子形成物質として用いた初めての方法である。即ち、機能性で最も幅広く研究されているのがエピガロカテキンガレートに代表されるガレート型カテキンは、抗肥満作用や循環器系疾患予防作用、抗癌作用等幅広い生理機能を有していることが知られている。また、ガレート型カテキンには脂肪分解酵素であるリパーゼを阻害する作用を有する為、植物性油脂の効率的な抽出に用いる技術が報告されている(特許文献5)。また、本発明者らはガレート型カテキンとゼラチンの複合化によりリパーゼ阻害剤を報告しており(特許文献6)、ナノ粒子形成物質としてのガレート型カテキンの用途のみならず、タンパク質との組み合わせによる生理活性の向上という優位性も見出されている。加えて、本発明者らはガレート型カテキンを組み合わせたナノ粒子により、生理活性物質の安定性を向上させたことも報告している(特許文献7)。
一方、本発明者らはレスベラトロールやピセアタンノール、プテロスチルベンに代表されるスチルベン類より、様々な生理活性を有する新規スチルベン誘導体、及び新規スチルベン誘導体混合物を発明し、報告している。例えば、抗癌活性(特許文献8〜13)をはじめ、アディポネクチンやサーチュイン賛成促進効果(特許文献14、15)、摂食抑制効果(特許文献16、17)、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞化効果(特許文献18〜21)、代謝活性化効果(特許文献22〜27)遅筋形成や、自発活動向上効果(特許文献28〜30)循環器系疾患予防効果(特許文献31〜35)、その他、抗肥満や抗炎症効果(特許文献36〜38)など多彩な効果が確認されている。しかしながら、これら新規スチルベン誘導体、及び新規スチルベン誘導体混合物の多くは水に難溶性であり、加えてコーン油やオリーブ油等の高級脂肪酸への溶解性も悪いことから、生体への吸収性が低い点が課題であった。
したがって、本発明は、従来では有用ではあるが体内への吸収性が低かったスチルベン誘導体の吸収性を向上する技術を提供することを目的とし、詳細には、スチルベン誘導体混合物を安定に含有し、且つ、平均粒子径が1〜200nmであり、生体利用性の高いナノ粒子を提供することを目的とする。
本発明者らは、食品にも利用可能なナノ粒子について鋭意検討した結果、ガレート型カテキン、特定の動物性タンパク質及びスチルベン誘導体を適切な条件下で混合するという非常に簡便な方法で、ガレート型カテキンと前記動物性タンパク質という生体利用性の高い天然物由来機能性成分のコアセルベートを形成させ、これにスチルベン誘導体を安定して含有させて、平均粒子径1〜200nmのナノ粒子を作製することに成功し、本発明を完成させた。
本発明の要旨は、
ガレート型カテキンを固形分として0.1重量%以上、
(i)ゼラチン、コラーゲン、及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも1種の動物性タンパク質、(ii)ホエイタンパク、卵白タンパク質及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも1種の動物性タンパク質、又は(i)(ii)の混合物を固形分として0.1重量%以上
含有し、前記ガレート型カテキンの固形分と前記動物性タンパク質の固形分の重量比(動物性タンパク質/ガレート型カテキン)が0.05〜8.0であり、且つ、
スチルベン誘導体を含有し、
平均粒子径が1〜200nmであるナノ粒子の製造方法であって、以下の(a)〜(d)の工程:
(a)加温条件下で前記動物性タンパク質と水、含水溶媒又は有機溶媒とを混合する工程
(b)加温条件下にて前記(a)工程で得られる混合物に前記スチルベン誘導体を混合する工程
(c)加温条件下にて前記(b)工程で得られる混合物にガレート型カテキンを混合し、溶液のpHを4.2以下にする工程
(d)前記(c)工程で得られる混合物を80℃以上100℃未満に加温した後、15℃以下に冷却する工程
を有するナノ粒子の製造方法、
に関する。
ガレート型カテキンを固形分として0.1重量%以上、
(i)ゼラチン、コラーゲン、及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも1種の動物性タンパク質、(ii)ホエイタンパク、卵白タンパク質及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも1種の動物性タンパク質、又は(i)(ii)の混合物を固形分として0.1重量%以上
含有し、前記ガレート型カテキンの固形分と前記動物性タンパク質の固形分の重量比(動物性タンパク質/ガレート型カテキン)が0.05〜8.0であり、且つ、
スチルベン誘導体を含有し、
平均粒子径が1〜200nmであるナノ粒子の製造方法であって、以下の(a)〜(d)の工程:
(a)加温条件下で前記動物性タンパク質と水、含水溶媒又は有機溶媒とを混合する工程
(b)加温条件下にて前記(a)工程で得られる混合物に前記スチルベン誘導体を混合する工程
(c)加温条件下にて前記(b)工程で得られる混合物にガレート型カテキンを混合し、溶液のpHを4.2以下にする工程
(d)前記(c)工程で得られる混合物を80℃以上100℃未満に加温した後、15℃以下に冷却する工程
を有するナノ粒子の製造方法、
に関する。
本発明により、平均粒子径1〜200nmであるうえに、スチルベン誘導体を含有していることから、スチルベン誘導体の体内への吸収性に優れ、しかもガレート型カテキン及び動物性タンパク質という天然物由来の機能性成分の生体利用性がより向上したナノ粒子を効率よく製造することができる。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のナノ粒子の製造方法は、
ガレート型カテキンを固形分として0.1重量%以上、
(i)ゼラチン、コラーゲン、及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも1種の動物性タンパク質、(ii)ホエイタンパク、卵白タンパク質及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも1種の動物性タンパク質、又は(i)(ii)の混合物を固形分として0.1重量%以上
含有し、前記ガレート型カテキンの固形分と前記動物性タンパク質の固形分の重量比(動物性タンパク質/ガレート型カテキン)が0.05〜8.0であり、且つ、
スチルベン誘導体を含有し、
平均粒子径が1〜200nmであるナノ粒子の製造方法であって、以下の(a)〜(d)の工程を有することを特徴とする。
(a)加温条件下で前記動物性タンパク質と水、含水溶媒又は有機溶媒とを混合する工程
(b)加温条件下にて前記(a)工程で得られる混合物に前記スチルベン誘導体を混合する工程
(c)加温条件下にて前記(b)工程で得られる混合物にガレート型カテキンを混合し、溶液のpHを4.2以下にする工程
(d)前記(c)工程で得られる混合物を80℃以上100℃未満に加温した後、15℃以下に冷却する工程
ガレート型カテキンを固形分として0.1重量%以上、
(i)ゼラチン、コラーゲン、及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも1種の動物性タンパク質、(ii)ホエイタンパク、卵白タンパク質及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも1種の動物性タンパク質、又は(i)(ii)の混合物を固形分として0.1重量%以上
含有し、前記ガレート型カテキンの固形分と前記動物性タンパク質の固形分の重量比(動物性タンパク質/ガレート型カテキン)が0.05〜8.0であり、且つ、
スチルベン誘導体を含有し、
平均粒子径が1〜200nmであるナノ粒子の製造方法であって、以下の(a)〜(d)の工程を有することを特徴とする。
(a)加温条件下で前記動物性タンパク質と水、含水溶媒又は有機溶媒とを混合する工程
(b)加温条件下にて前記(a)工程で得られる混合物に前記スチルベン誘導体を混合する工程
(c)加温条件下にて前記(b)工程で得られる混合物にガレート型カテキンを混合し、溶液のpHを4.2以下にする工程
(d)前記(c)工程で得られる混合物を80℃以上100℃未満に加温した後、15℃以下に冷却する工程
本発明で得られるナノ粒子の平均粒子径は、1〜200nmであり、体内への吸収性及び、製造性が良好である観点から、好ましくは10〜150nmであり、より好ましくは10〜100nmであり、特に好ましくは、10〜90nmである。
前記ナノ粒子の平均粒子径は、後述の実施例に記載のように、ゼータ電位・ナノ粒子径測定システム(ベックマン・コールター株式会社製、商品名「DelsaMax PRO」)にて測定することができる。
前記ナノ粒子の平均粒子径は、後述の実施例に記載のように、ゼータ電位・ナノ粒子径測定システム(ベックマン・コールター株式会社製、商品名「DelsaMax PRO」)にて測定することができる。
本発明でいう天然物由来の機能性成分とは、原料である、ガレート型カテキン及び動物性タンパク質がともに天然物を由来とする成分であることを示す。なお、前記原料として試薬等を使用する際にも、その試薬が天然物由来であればよい。
以下に、製造方法の各工程について説明する。
(a)工程
本工程では、加温条件下で(i)ゼラチン、コラーゲン、及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも1種の動物性タンパク質、(ii)ホエイタンパク、卵白タンパク質及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも1種の動物性タンパク質、又は(i)及び(ii)の混合物と、水又は含水溶媒又は有機溶媒とを混合する。具体的には、前記動物性タンパク質を前記溶媒に溶解、分散又は膨潤させて、動物性タンパク質含有液を作製する。
本工程では、加温条件下で(i)ゼラチン、コラーゲン、及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも1種の動物性タンパク質、(ii)ホエイタンパク、卵白タンパク質及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも1種の動物性タンパク質、又は(i)及び(ii)の混合物と、水又は含水溶媒又は有機溶媒とを混合する。具体的には、前記動物性タンパク質を前記溶媒に溶解、分散又は膨潤させて、動物性タンパク質含有液を作製する。
本工程において加温条件下とは20〜100℃に加温することをいう。
中でも、本工程では、前記動物性タンパク質を前記溶媒に溶解、分散又は膨潤させる観点から、前記溶媒の温度を20〜90℃に調整しておくことが好ましい。
加温手段としては、前記の温度範囲に加温できればよく、例えば、ヒーターなどの加温装置が接続した加温可能な容器に前記動物性タンパク質や溶媒を添加して加熱したり、前記動物性タンパク質や溶媒を容器に添加しておき、この容器を加熱装置で加温することが挙げられるが、特に限定はない。
中でも、本工程では、前記動物性タンパク質を前記溶媒に溶解、分散又は膨潤させる観点から、前記溶媒の温度を20〜90℃に調整しておくことが好ましい。
加温手段としては、前記の温度範囲に加温できればよく、例えば、ヒーターなどの加温装置が接続した加温可能な容器に前記動物性タンパク質や溶媒を添加して加熱したり、前記動物性タンパク質や溶媒を容器に添加しておき、この容器を加熱装置で加温することが挙げられるが、特に限定はない。
前記動物性タンパク質として用いるゼラチンの由来は、牛、豚、魚、ニワトリ等、及び遺伝子組み換え体のいずれかであればよい。なお、牛骨又は豚骨由来の動物性タンパク質は、500nm以下の粒子が一部形成されるものの、凝集及び沈殿が起こりやすいため、本発明では使用することが難しい。ただし、牛骨又は豚骨由来のタンパク質が含まれている動物性タンパク質であっても、平均粒子径1〜200nmのナノ粒子が作製できれば、特に限定はなく使用することができる。また、動物性タンパク質として、ゼラチンを分解したコラーゲンやさらに分解したコラーゲンペプチドであってもよい。
また、動物性タンパク質としては、牛乳を原料にしたホエイタンパク、卵を原料にした卵白タンパク及びこれらの分解物も使用できる。
これらの動物性タンパク質は、単独で使用しても、2種以上を組み合わせて使用してもよい。また、前記動物性タンパク質は、乳化されていてもよい。
また、動物性タンパク質としては、牛乳を原料にしたホエイタンパク、卵を原料にした卵白タンパク及びこれらの分解物も使用できる。
これらの動物性タンパク質は、単独で使用しても、2種以上を組み合わせて使用してもよい。また、前記動物性タンパク質は、乳化されていてもよい。
前記溶媒として使用する水としては、蒸留水、イオン交換水、水道水、ミネラルウォーターなどが挙げられるが、特に限定はない。
前記含水溶媒とは、水と混合する有機溶媒をいう。また、有機溶媒としては水と混合するものであれば特に限定はされないが、得られたナノ粒子の使用用途に適した溶媒を選択することが好ましく、例えば、食品用途に適した溶媒としてはグリセリン、プロピレングリコール、エタノール等が上げられ、医薬品用途に適した溶媒としては上記に加えてメタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
前記含水溶媒とは、水と混合する有機溶媒をいう。また、有機溶媒としては水と混合するものであれば特に限定はされないが、得られたナノ粒子の使用用途に適した溶媒を選択することが好ましく、例えば、食品用途に適した溶媒としてはグリセリン、プロピレングリコール、エタノール等が上げられ、医薬品用途に適した溶媒としては上記に加えてメタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
前記溶媒と前記動物性タンパク質とを混合し、前記動物性タンパク質を前記溶媒に溶解、分散又は膨潤させる手段としては、公知の手段であれば特に限定はない。例えば、前記動物性タンパク質を、前記溶媒に混合することで、溶解、分散又は膨潤させることができる。なお、膨潤とは、動物性タンパク質に水、含水溶媒もしくは有機溶媒を添加してゲル状にすることをいう。
前記動物性タンパク質含有液中の動物性タンパク質の固形分値は、平均粒子径1〜200nmのナノ粒子を効率的に作製する観点から、0.1〜19重量%であることが好ましく、0.1〜10重量%であることがより好ましいが、所望のナノ粒子が作製できれば、特に限定されることはない。
なお、ゼラチンを使用する場合、前記固形分値が20重量%以上であれば液の粘度の上昇により扱いにくくなる。
なお、ゼラチンを使用する場合、前記固形分値が20重量%以上であれば液の粘度の上昇により扱いにくくなる。
(b)工程
本工程では、加温条件下で、前記(a)工程で得られる混合物にスチルベン誘導体を混合する。
本工程では、加温条件下で、前記(a)工程で得られる混合物にスチルベン誘導体を混合する。
本工程において加温条件下とは20〜100℃に加温することをいう。
中でも、本工程では、前記(a)工程で得られる混合物にスチルベン誘導体を効率よく混合する観点から、前記混合物の温度を20〜90℃に調整しておくことが好ましい。
加温手段としては、前記の温度範囲に加温できればよく、例えば、ヒーターなどの加温装置が接続した加温可能な容器に前記(a)工程で得られる混合物やスチルベン誘導体を添加して加熱したり、前記(a)工程で得られる混合物やスチルベン誘導体を容器に添加しておき、この容器を加熱装置で加温することが挙げられるが、特に限定はない。
中でも、本工程では、前記(a)工程で得られる混合物にスチルベン誘導体を効率よく混合する観点から、前記混合物の温度を20〜90℃に調整しておくことが好ましい。
加温手段としては、前記の温度範囲に加温できればよく、例えば、ヒーターなどの加温装置が接続した加温可能な容器に前記(a)工程で得られる混合物やスチルベン誘導体を添加して加熱したり、前記(a)工程で得られる混合物やスチルベン誘導体を容器に添加しておき、この容器を加熱装置で加温することが挙げられるが、特に限定はない。
本発明に用いられるスチルベン誘導体とは、スチルベンを基本骨格とする化合物であり、スチルベンを構成する炭素原子に結合する水素原子が別の基に置換されている化合物をいう。
例えば、スチルベン誘導体としては、レスベラトロール、プテロスチルベン、ピセアタンノール、及び、これらの化合物より発明者が以前に提案した誘導体類(特許文献8〜12)などが挙げられる。また、特許文献13、20、21、27に記載されるように、例えば、以下の式(1)〜(4):
例えば、スチルベン誘導体としては、レスベラトロール、プテロスチルベン、ピセアタンノール、及び、これらの化合物より発明者が以前に提案した誘導体類(特許文献8〜12)などが挙げられる。また、特許文献13、20、21、27に記載されるように、例えば、以下の式(1)〜(4):
に示される化合物や、これらの化合物を2種以上含む混合物も前記スチルベン誘導体に含まれる。また、前記スチルベン誘導体を含有する組成物もスチルベン誘導体として使用することができる。また、前記スチルベン誘導体は市販品を用いてもよく、例えば、ピセアタンノールを含有する丸善製薬社製のノブドウエキスやレスベラトロールを含有するビーエイチエヌ社製のビネアトロールなどが挙げられる。
前記スチルベン誘導体は、単独で用いてもよいし、2種以上を混合して用いてもよい。
前記スチルベン誘導体は、固体状のものを前記(a)工程で得られる混合物に混合してもよいが、前記混合を効率よく行う観点から、スチルベン誘導体を、水又は含水溶媒又は有機溶媒に溶解又は分散させて、スチルベン誘導体含有液を作製し、このスチルベン誘導体含有液を前記(a)工程で得られる混合物に混合するのが好ましい。
前記溶媒としては、前記(a)工程で使用される溶媒であればよく、特に限定はない。なお、前記(a)工程で使用した溶媒とは同一の溶媒でもよいし、異なっていてもよい。
前記溶媒に前記スチルベン誘導体を混合させる手段としては、公知の混合手段であれば特に限定はない。例えば、前記スチルベン誘導体を、前記溶媒に添加して、混合させることができる。
前記スチルベン誘導体含有液中のスチルベン誘導体の固形分値は、平均粒子径1〜200nmのナノ粒子を効率的に作製する観点から、0.001〜25重量%であることが好ましいが、所望のナノ粒子が作製できればよく、特に限定されることはない。
また、本工程で得られる混合物中のスチルベン誘導体の固形分値は、平均粒子径1〜200nmのナノ粒子を効率的に作製する観点から、0.001〜10重量%であることが好ましく、0.01〜1重量%であることがより好ましい。
(c)工程
本工程では、加温条件下にて前記(b)工程で得られる混合物にガレート型カテキンを混合し、溶液のpHを4.2以下にする。
本工程では、加温条件下にて前記(b)工程で得られる混合物にガレート型カテキンを混合し、溶液のpHを4.2以下にする。
本工程において加温条件下とは20〜100℃に加温することをいう。また、前記溶解又は分散させる際には、ガレート型カテキンの溶解性の観点から、前記混合物の温度を20〜90℃に調整しておくことが好ましい。
加温手段としては、例えば、ヒーターなどの加温装置が接続した加温可能な容器に前記(b)工程で得られる混合物やガレート型カテキンを添加して加熱したり、前記前記(b)工程で得られる混合物やガレート型カテキンを容器に添加しておき、この容器を加熱装置で加温することが挙げられるが、特に限定はない。
加温手段としては、例えば、ヒーターなどの加温装置が接続した加温可能な容器に前記(b)工程で得られる混合物やガレート型カテキンを添加して加熱したり、前記前記(b)工程で得られる混合物やガレート型カテキンを容器に添加しておき、この容器を加熱装置で加温することが挙げられるが、特に限定はない。
本発明で用いるガレート型カテキンとしては、エピガロカテキンガレート(EGCg)、エピカテキンガレート(ECg)、ガロカテキンガレート(GCg)、カテキンガレート(Cg)等が挙げられる。前記ガレート型カテキンは、非重合体でも重合体でもよく、それらを混合しても、単独で使用してもよい。効率的な粒子形成の観点よりEGCg及び/又はECgを含有することが好ましい。また、ガレート型カテキンを含む組成物も使用することができ、例えば、前記ガレート型カテキンを含む茶抽出物やコーヒー抽出物等が挙げられる。また、ナノ粒子の作製を効率よく行う面から、ガレート型カテキンを含む組成物中のガレート型カテキン量が20重量%以上のものが好ましく、30重量%以上のものがより好ましく、60重量%以上のものがさらに好ましい。
前記ガレート型カテキンは、固体状のものを前記(b)工程で得られる混合物に混合してもよいが、前記混合を効率よく行う観点から、前記ガレート型カテキンを、水又は含水溶媒又は有機溶媒に溶解又は分散させて、ガレート型カテキン含有液を作製し、このガレート型カテキン含有液を前記(b)工程で得られる混合物に混合するのが好ましい。
前記溶媒としては、前記(a)又は(b)工程で使用される溶媒であればよく、特に限定はない。なお、前記(a)又は(b)工程で使用した溶媒とは同一の溶媒でもよいし、異なっていてもよい。
前記溶媒にガレート型カテキンを溶解又は分散させる手段としては、公知の手段であれば特に限定はない。例えば、ガレート型カテキン又はガレート型カテキンを含む組成物を、前記溶媒に添加・混合することで、溶解又は分散させることができる。
前記ガレート型カテキン含有液中のガレート型カテキンの固形分値は、平均粒子径1〜200nmのナノ粒子を効率的に作製する観点から、0.1〜24重量%であることが好ましく、0.1〜20重量%であることがより好ましい。
また、本工程で得られる混合物中のガレート型カテキンの固形分値は、平均粒子径1〜200nmのナノ粒子を効率的に作製する観点から、0.01〜10重量%であることが好ましく、0.1〜5重量%であることがより好ましい。
また、本工程では、得られる混合物中のガレート型カテキンの固形分と動物性タンパク質の固形分の重量比(動物性タンパク質/ガレート型カテキン)が0.05〜8.0となるように調整することで、後述の(d)工程において、平均粒子径1〜200nmのナノ粒子を効率よく得ることができる。
また、本工程で得られる混合物のpHは、4.2以下に調整する。
前記pHが4.2を超えると、一時的にナノ粒子を形成するが、凝集、沈殿が生じやすくなる。
前記pHが4.2を超えると、一時的にナノ粒子を形成するが、凝集、沈殿が生じやすくなる。
前記混合物のpHの調整には、ナノ粒子の使用用途に応じて、使用可能な酸であれば特に制限はない。例えば、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、カルボン酸、酒石酸、コハク酸、酢酸又はフタル酸、トリフルオロ酢酸のような有機酸、塩酸、過塩素酸、炭酸のような無機酸、又は緩衝液、などで調整することが挙げられるが、これらに限定されるものではない。得られたナノ粒子を医薬品、化粧品、食品等に利用する場合は、それぞれの使用用途に適した酸を選択することが好ましい。
なお、前記混合物のpHを調整するには、動物性タンパク質含有液、ガレート型カテキン含有液と、スチルベン誘導体含有液のpHを予め調整してもよい。このように予めpHを調整することで、これらの3種類の液を混合するだけで、混合液のpHを4.2以下に調整することができる。
(d)工程
本工程では、前記(c)工程で得られる混合物を80℃以上100℃未満に加温した後、15℃以下に冷却する。前記のように、一度80℃以上100℃未満まで加温した後に、15℃以下に冷却することで前記(c)工程で得られる混合物中でガレート型カテキンと動物性タンパク質とがコアセルベートを形成し、このコアセルベート中にスチルベン誘導体を含有する平均粒子径1〜200nmのナノ粒子が形成される。
本工程では、前記(c)工程で得られる混合物を80℃以上100℃未満に加温した後、15℃以下に冷却する。前記のように、一度80℃以上100℃未満まで加温した後に、15℃以下に冷却することで前記(c)工程で得られる混合物中でガレート型カテキンと動物性タンパク質とがコアセルベートを形成し、このコアセルベート中にスチルベン誘導体を含有する平均粒子径1〜200nmのナノ粒子が形成される。
前記(c)工程で得られる混合物を80℃以上100℃未満に加温する方法としては、前記(a)工程などと同様に公知の手段であればよく、特に限定はない。
また、加温しておく時間としては、その後の冷却によるナノ粒子形成の観点から、10〜30分であればよいが、特に限定はない。
なお、前記(c)工程での加温温度を80℃以上100℃未満に調整している場合、前記(c)工程でガレート型カテキンを混合してpHを調整した段階した後から(d)工程を同じ温度で続ければよい。また、前記(c)工程での加温温度を80℃未満に調整している場合、80℃以上100℃未満となるように加熱して温度を上昇させることで(d)工程を実施すればよい。
また、加温しておく時間としては、その後の冷却によるナノ粒子形成の観点から、10〜30分であればよいが、特に限定はない。
なお、前記(c)工程での加温温度を80℃以上100℃未満に調整している場合、前記(c)工程でガレート型カテキンを混合してpHを調整した段階した後から(d)工程を同じ温度で続ければよい。また、前記(c)工程での加温温度を80℃未満に調整している場合、80℃以上100℃未満となるように加熱して温度を上昇させることで(d)工程を実施すればよい。
また、冷却する方法としては、例えば、前記(c)工程で得られる混合物が収容された容器を氷水などに入れて、15℃以下に冷却する方法などが挙げられるが、特に限定はない。
前記のようにして作製されるナノ粒子は、前記ナノ粒子含有液の状態で使用することができる。また、前記ナノ粒子含有液に限外濾過、透析等を施してもよい。透析をすれば、粒子化していない成分を分離してより精製されたナノ粒子とすることができる。限外濾過膜としては例えばペンシル型UF膜(旭化成社製)、透析膜としてはSnakeSkin(ピアス社製)が挙げられる。これ以外にもナノ粒子を失わずに限外ろ過及び透析ができれば特に限定はない。
本発明の製造方法により得られるナノ粒子では、ガレート型カテキンの固形分と動物性タンパク質の固形分の重量比(動物性タンパク質/ガレート型カテキン)が0.05〜8.0となるように調整されていることで、平均粒子径が1〜200nmの範囲に調整され、しかもスチルベン誘導体がナノ粒子中に安定に含有されているため、体内への吸収性が優れるという優れた効果が奏される。
前記ナノ粒子は、食品に利用可能な条件で作製した場合は、飲食品に配合してもよい。飲食品としては特に限定されず、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子、機能性食品、健康食品、健康志向食品等が挙げられる。保存性、携帯性、摂取の容易さ等を考慮すると、菓子類が好ましく、菓子類の中でも、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット、チューイングガム等が好ましい。
前記ナノ粒子を飲食品に配合する場合、ナノ粒子の飲食品における含有量は、その生理活性効果が期待できる量であればよい。通常1日あたり1〜10000mg、より好ましくは10〜3000mg摂取できるように配合量を決定することが好ましい。例えば、固形状食品の場合には5〜50重量%、飲料等の液状食品の場合には0.01〜10重量%が好ましい。
また、前記ナノ粒子は、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤又は飼料に配合してもよい。飼料としては、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、イヌ、ネコ、小鳥、リス等に用いるペットフードが挙げられる。
前記ナノ粒子は、医薬品に配合してもよい。前記医薬品としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、ゲル剤等が挙げられる。錠剤、丸剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤の顆粒は、必要により、ショ糖等の糖類、マルチトール等の糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等でコーティングを施したりすることもできる。又は胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。また、製剤の溶解性を向上させるために、公知の可溶化処理を施すこともできる。常法に基づいて、注射剤、点滴剤に配合して使用してもよい。
本発明の製造方法により得られるナノ粒子を医薬用途で使用する場合、例えば、その摂取量は、所望の改善、治療又は予防効果が得られるような量であれば特に制限されず、通常その態様、患者の年齢、性別、体質その他の条件、疾患の種類並びにその程度等に応じて適宜選択される。1日当たり約0.1mg〜1,000mg程度とするのがよく、これを1日に1〜4回に分けて摂取することができる。
本発明の製造方法により得られるナノ粒子を医薬用途で使用する場合、例えば、その摂取量は、所望の改善、治療又は予防効果が得られるような量であれば特に制限されず、通常その態様、患者の年齢、性別、体質その他の条件、疾患の種類並びにその程度等に応じて適宜選択される。1日当たり約0.1mg〜1,000mg程度とするのがよく、これを1日に1〜4回に分けて摂取することができる。
前記ナノ粒子は、医薬部外品に配合してもよい。前記医薬部外品としては、口腔に用いられる医薬部外品、例えば、歯磨き、マウスウオッシュ、マウスリンスや、感染症予防等を目的とした滋養強壮系ドリンク剤等が挙げられる。
前記ナノ粒子を医薬部外品に添加する場合には、該医薬部外品中に、通常0.001〜30重量%添加するのが好ましい。
前記ナノ粒子を医薬部外品に添加する場合には、該医薬部外品中に、通常0.001〜30重量%添加するのが好ましい。
前記ナノ粒子は、化粧品に配合してもよい。前記化粧品としては、ローション、乳液、クリーム、パック剤、仕上げ化粧品、頭髪用化粧品、洗顔剤、浴剤、制汗剤等が挙げられる。これらの化粧品では、抗酸化効果から美容効果が期待され、抗菌効果から防菌の目的で利用することができる。
また、前記ナノ粒子を化粧品として使用する場合には、化粧品中に0.1ppm〜2000ppmの濃度となるようにするのが好ましい。
また、前記ナノ粒子を化粧品として使用する場合には、化粧品中に0.1ppm〜2000ppmの濃度となるようにするのが好ましい。
次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。
(実施例1)スチルベン誘導体混合物を含有するナノ粒子の作製
ゼラチン(商品名:G微粉、新田ゼラチン社製)1g、ホエイタンパク質(商品名:エンラクトSAT、日本新薬社製)9gを粉体で混合し、これに蒸留水840gを添加して55℃で加温しながら攪拌、溶解させ、動物性タンパク質含有液を得た。
ゼラチン(商品名:G微粉、新田ゼラチン社製)1g、ホエイタンパク質(商品名:エンラクトSAT、日本新薬社製)9gを粉体で混合し、これに蒸留水840gを添加して55℃で加温しながら攪拌、溶解させ、動物性タンパク質含有液を得た。
続いて、特許文献21の方法でスチルベン誘導体混合物を得た。すなわち、トランス−レスベラトロール((株)TECNO SCIENCE社製)40gに、10%炭酸ナトリウム(和光純薬工業(株)社製)水溶液を400mL加えて、レスベラトロール含有水溶液(pH9.9)を得た。このレスベラトロール含有溶液を圧力鍋(ゼロ活力なべ、アサヒ軽金属工業株式会社製)にて128℃、120分間加熱し、レスベラトロール重合化合物含有溶液を作製した(比較品1)。
次いで、比較品1を、4.0kgの合成吸着剤ダイヤイオン(登録商標)HP−20(三菱化学株式会社製)に全量供した。蒸留水24Lで洗浄後、100%エタノール16Lで溶出させた。減圧乾燥にて溶媒を除去し、スチルベン誘導体混合物22gを得た。
得られたスチルベン誘導体混合物中には、式(1):
次いで、比較品1を、4.0kgの合成吸着剤ダイヤイオン(登録商標)HP−20(三菱化学株式会社製)に全量供した。蒸留水24Lで洗浄後、100%エタノール16Lで溶出させた。減圧乾燥にて溶媒を除去し、スチルベン誘導体混合物22gを得た。
得られたスチルベン誘導体混合物中には、式(1):
で表される化合物(以下、UHA4002という。)、式(2):
で表される化合物(以下、UHA4003という。)、式(3):
で表される化合物(以下UHA4022という。)であることを、特開2011−251914号公報の実施例2に記載の方法に従って、高分解能Negative−FAB−MS(高速原子衝撃質量分析)にて測定し、核磁気共鳴(NMR)測定を行うことで確認した。
得られたスチルベン誘導体混合物1g、プロピレングリコール5g、蒸留水44gを攪拌、混合し、スチルベン誘導体混合物含有溶液を得た。
緑茶抽出物(ガレート型カテキン64%)18g、蒸留水82gを攪拌、混合し、ガレート型カテキン含有溶液を得た。
次いで、得られた動物性タンパク質含有液に対し、55℃で加温、攪拌しながら前記スチルベン誘導体混合物含有溶液を全量混合した後、55℃で加温、撹拌しながらガレート型カテキン含有溶液を全量混合した。
次いで、得られた動物性タンパク質、スチルベン誘導体、ガレート型カテキン含有溶液に対し、クエン酸50gを粉体で混合したのち、90℃で加温しながら攪拌して均一化させて、20分間90℃で維持した。この時の混合液のpHは1.2であった。
次いで、得られた混合物1000gを、攪拌を続けながら氷水にて10℃になるまで冷却を行い、前記混合物中でナノ粒子を形成させて、ナノ粒子溶液(重量比率:動物性タンパク質/ガレート型カテキン/スチルベン誘導体:1/1.8/0.1)を作製した。得られたナノ粒子溶液の平均粒子径をゼータ電位・ナノ粒子径測定システム(ベックマン・コールター株式会社製、「DelsaMax PRO」)にて測定した結果、その平均粒子径は120nmであった。
次いで、前記ナノ粒子溶液を透析膜(ピアス社製、商品名「SnakeSkin」)に供し、透析をかけたのち、限外濾過(ミリポア社製「Centriprep Ultracel YM−3」により濃縮を行った。得られたナノ粒子溶液の平均粒子径をDelsaMax PROにて測定した結果、その平均粒子径は82nmであった。
次いで、得られた動物性タンパク質、スチルベン誘導体、ガレート型カテキン含有溶液に対し、クエン酸50gを粉体で混合したのち、90℃で加温しながら攪拌して均一化させて、20分間90℃で維持した。この時の混合液のpHは1.2であった。
次いで、得られた混合物1000gを、攪拌を続けながら氷水にて10℃になるまで冷却を行い、前記混合物中でナノ粒子を形成させて、ナノ粒子溶液(重量比率:動物性タンパク質/ガレート型カテキン/スチルベン誘導体:1/1.8/0.1)を作製した。得られたナノ粒子溶液の平均粒子径をゼータ電位・ナノ粒子径測定システム(ベックマン・コールター株式会社製、「DelsaMax PRO」)にて測定した結果、その平均粒子径は120nmであった。
次いで、前記ナノ粒子溶液を透析膜(ピアス社製、商品名「SnakeSkin」)に供し、透析をかけたのち、限外濾過(ミリポア社製「Centriprep Ultracel YM−3」により濃縮を行った。得られたナノ粒子溶液の平均粒子径をDelsaMax PROにて測定した結果、その平均粒子径は82nmであった。
(実施例2)スチルベン誘導体混合物の吸収性評価
スチルベン誘導体の吸収性はラットに対する経口投与試験により検討した。検討には、実施例1で得られたナノ粒子溶液(本発明品)、スチルベン誘導体を0.5%カルボキシメチルセルロース水溶液で分散させたスチルベン誘導体分散液(比較品1)、スチルベン誘導体を乳化剤で分散させたスチルベン誘導体分散液(比較品2)を用いて実施した。比較品1及び比較品2の平均粒子径をDelsaMax PROにて測定した結果、比較品1は10μm以上、比較品2は2000nmであった。作製した各試料を、ラット3匹に対しスチルベン誘導体混合物として15mg/kgとなるように経口投与した。血中に移行したスチルベン誘導体混合物濃度は3種類のスチルベン誘導体(UHA4002、UHA4003、UHA4022)のうち血中UHA4003濃度を測定することで、スチルベン誘導体混合物の血中濃度の経時変化を比較した。結果を図1に示す。
スチルベン誘導体の吸収性はラットに対する経口投与試験により検討した。検討には、実施例1で得られたナノ粒子溶液(本発明品)、スチルベン誘導体を0.5%カルボキシメチルセルロース水溶液で分散させたスチルベン誘導体分散液(比較品1)、スチルベン誘導体を乳化剤で分散させたスチルベン誘導体分散液(比較品2)を用いて実施した。比較品1及び比較品2の平均粒子径をDelsaMax PROにて測定した結果、比較品1は10μm以上、比較品2は2000nmであった。作製した各試料を、ラット3匹に対しスチルベン誘導体混合物として15mg/kgとなるように経口投与した。血中に移行したスチルベン誘導体混合物濃度は3種類のスチルベン誘導体(UHA4002、UHA4003、UHA4022)のうち血中UHA4003濃度を測定することで、スチルベン誘導体混合物の血中濃度の経時変化を比較した。結果を図1に示す。
図1に示すように、本発明品では、比較品1、2と比べると、スチルベン誘導体混合物中のUHA4003が投与から2時間以内に速やかに吸収され、投与から7時間の間、高い血中濃度を維持していることがわかる。
したがって、本発明の製造方法で得られるナノ粒子は、担持しているスチルベン誘導体混合物の体内吸収性が顕著に向上されたものであることがわかる。
なお、7時間後に本発明品の血中UHA4003濃度が低下しているのは、吸収されたスチルベン誘導体混合物が体内で代謝されたことが原因であると考える。
したがって、本発明の製造方法で得られるナノ粒子は、担持しているスチルベン誘導体混合物の体内吸収性が顕著に向上されたものであることがわかる。
なお、7時間後に本発明品の血中UHA4003濃度が低下しているのは、吸収されたスチルベン誘導体混合物が体内で代謝されたことが原因であると考える。
Claims (1)
- ガレート型カテキンを固形分として0.1重量%以上、
(i)ゼラチン、コラーゲン、及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも1種の動物性タンパク質、(ii)ホエイタンパク、卵白タンパク質及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも1種の動物性タンパク質、又は(i)(ii)の混合物を固形分として0.1重量%以上
含有し、前記ガレート型カテキンの固形分と前記動物性タンパク質の固形分の重量比(動物性タンパク質/ガレート型カテキン)が0.05〜8.0であり、且つ、
スチルベン誘導体を含有し、
平均粒子径が1〜200nmであるナノ粒子の製造方法であって、以下の(a)〜(d)の工程を有するナノ粒子の製造方法。
(a)加温条件下で前記動物性タンパク質と水、含水溶媒又は有機溶媒とを混合する工程
(b)加温条件下にて前記(a)工程で得られる混合物に前記スチルベン誘導体を混合する工程
(c)加温条件下にて前記(b)工程で得られる混合物にガレート型カテキンを混合し、溶液のpHを4.2以下にする工程
(d)前記(c)工程で得られる混合物を80℃以上100℃未満に加温した後、15℃以下に冷却する工程
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-
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- 2014-12-26 JP JP2014265415A patent/JP2016124804A/ja active Pending
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