PL193397B1

PL193397B1 - Kompozycja do pielęgnacji skóry

Info

Publication number: PL193397B1
Application number: PL98338451A
Authority: PL
Inventors: Robert George Carson; Krupa Patel; Marieann Barratt; Carol Annette Bosko; Sreekumar Pillai
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 1997-07-25
Filing date: 1998-07-07
Publication date: 2007-02-28
Also published as: HK1024417A1; PL338451A1; JP2001510777A; ES2200362T3; BR9810810A; ID23932A; TW480178B; WO1999004747A2; AU8858498A; CZ295608B6; AU730825B2; CA2299458C; BR9810810B1; CZ2000283A3; EP0980235B1; WO1999004747A3; RU2203036C2; KR20010022170A; DE69815099T2; EP0980235A2

Abstract

1. Kompozycja do pielegnacji skóry, znamienna tym, ze zawiera: (a) resweratrol w ilosci od 0,00002 do 10% wagowych; (b) hydroksykwas wybrany sposród alfa-hydroksykwasów, beta-hydroksykwasów, zwlaszcza kwas salicylowy, innych kwasów hydroksykarboksylowych, zwlaszcza kwasów dihydroksykarbo- ksylowych, hydroksydikarboksylowych, hydroksytrikarboksylowych, ich mieszanin lub kombinacji ich stereoizomerów DL, D lub L, w ilosci od 0,01 do 20% wagowych; i (c) kosmetycznie dopuszczalne podloze. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy kompozycji kosmetycznej zawierającej resweratrol, naturalny estrogen pochodzący z roślin, kompozycji mającej zastosowanie w kosmetycznym sposobie kondycjonowania skóry polegającym na nakładaniu takich kompozycji na skórę.

Podstawa wynalazku

Skóra ludzka składa się z dwóch głównych warstw, grubszej warstwy dolnej - skóry właściwej, i cieńszej warstwy górnej - naskórka. Skóra właściwa jest warstwą nadającą warstwie skóry wytrzymałość, elastyczność i grubość. W wiekiem grubość warstwy skóry właściwej zmniejsza się i uważa się, że to częściowo przyczynia się do tworzenia się zmarszczek na starzejącej się skórze. Górna warstwa skóry ludzkiej lub naskórek, który zapewnia sprężystość i własności barierowe, składa się z wielu różnych typów komórek. Keratynocyty stanowią główny typ komórek naskórka (75-80% całkowitej ilości komórek ludzkiego naskórka). W naskórku keratynocyty występują w czterech różnych etapach zróżnicowania. Różnicowanie naskórka jest ważne dla zapewnienia zasadniczych funkcji skóry, mianowicie zapewniania bariery ochronnej w stosunku do otaczającego środowiska, oraz zapobiegania traceniu wody z ciała. Tworzenie zrogowaciałej otoczki jest końcowym etapem różnicowania keratynocytów. Enzym odpowiedzialny za tworzenie zrogowaciałej otoczki, transglutaminaza, jest markerem różnicowania naskórka. Dlatego czynniki, które zwiększają grubość warstwy skóry właściwej i zwiększają różnicowanie keratynocytów w warstwie naskórka powinny być idealnymi związkami zapewniającymi skórze korzyści w postaci kondycjonowania oraz zapobiegania starzeniu.

Estrogeny i syntetyczne związki działające podobnie jak estrogeny są znane jako związki powodujące zwiększanie grubości warstwy skóry właściwej i zmniejszenie tworzenia zmarszczek w postarzałej skórze. Takie zmiany w skórze jak suchość, utrata elastyczności i pulchności, zachodzące po menopauzie są związane z brakiem wytwarzania estrogenów. Leczenie estrogenami zapobiega lub spowalnia wiele zmian związanych ze starzeniem się skóry (Creidi i in., Effect of a conjugated oestrogen cream (Premarin^®) on aging facial skin [Działanie skoniugowanego kremu estrogenowego (Premarin^®) na starzenie się skóry twarzy], Maturitias, 19, str. 211-223, 1994). Syntetyczny estrogen, dietylostilbestrol, ma wzór:

Ta budowa jest bardzo różna od budowy naturalnego estrogenu, estradiolu:

W ostatnich latach, w zwiększającym się zakresie stosuje się fitoestrogeny (tj. naturalne związki o aktywności podobnej do estrogenów występujące w roślinach) stosuje się w celach terapeutycznych. Niektóre ze stosowanych związków opisano jako środki zmniejszające zawartość cholesterolu (hypocholesterolemiczne) i przeciw miażdżycowe (antyaterogenne) w leczeniu chorób sercowonaczyniowych, szczególnie u kobiet po menopauzie, do leczenia osteoporozy u starszych osób i jako środek przeciwrakowy, zwłaszcza przeciw rakowi piersi, rakowi śluzówki i szyjki macicy u kobiet (Knight i in. Phytoestrogens - a short review [Fitoestrogeny-krótki przegląd], Maturitias, 22: 167-175, 1995).

W ostatnich latach rosną żądania konsumentów dotyczące stosowania „naturalnej” bazy produktów. Konsumenci postrzegają syntezę chemiczną proces niebezpieczny dla środowiska. Składniki syntetyzowane chemicznie mogą zawierać ostre chemikalia. Naturalne produkty są odbierane jako

PL 193 397 B1 czyste i łagodne oraz lepsze niż produkty syntetyzowane chemicznie. Jednak dostarczanie korzyści kosmetycznych z roślinnych źródeł nie jest bez znaczenia. Aby faktycznie uzyskać korzyść ze źródła „naturalnego” należy zidentyfikować szczególną substancję aktywną w roślinie, dostarczającą korzyści w kosmetyce.

Jednym ze znanych fitoestrogenów jest fotoanetol:

Fotoanetol nie został opisany w odniesieniu do miejscowego lub kosmetycznego zastosowania.

Wynalazek przynajmniej w części bazuje na stwierdzeniu, że resweratrol jest fitoestrogenem, który hamuje proliferację keratynocytów, zwiększa różnicowanie keratynocytów i łagodzi stany zapalne lub pieczenie potencjalnie związane ze stosowaniem alfa-hydroksy kwasów.

Resweratrol jest związkiem występującym w różnych roślinach. Opisano wyodrębnianie i właściwości resweratrolu z różnych roślin, takich jak korzenie japońskiego rdestu ptasiego (Powell i in., Phytochemistry 35, str. 335, 1994), z wina i winogron (Goldberg i in., J. Agric. Food Chem., 43, str. 1820, 1995 oraz Cellotti i in., Resveratrol content of some wines obtained from dried Valpolicella grapes [Zawartość resweratrolu z pewnych win otrzymanych z suszonych winogron Valpolicella], Recioto i Amarone., J. Chromatogr. A. (Holandia) 730: 47-52, 1996), oraz z upraw orzeszków ziemnych (Kindl i in., opis patentowy US-5391724). Winogrona czerwone i czerwone wino zawierają duże ilości resweratrolu, i twierdzi się, że jest on jednym z powodów zdrowego układu naczyniowo-sercowego u pijących wino. Dodatkowo, resweratrol okazał się być potencjalnym czynnikiem zapobiegającym nowotworom i środkiem przeciwzapalnym. Opisano także, że resweratrol wywołuje różnicowanie ludzkich komórek białaczki promielocytowej (Jang i in. Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a natural product derived from grapes [Aktywność przeciwrakowa resweratrolu, naturalnego produktu pochodzącego z winogron], Science 275: 218-220, 1997). Jang i in. opisują stosowanie resweratrolu jako czynnika przeciwrakowego dla komórek skóry myszy traktowanych środkami kancerogennymi w hodowlach.

Opisano pewne kosmetyczne kompozycje zawierające ekstrakt z winogron. Patrz, na przykład skrót japońskie zgłoszenie patentowe 06336421 („JP'421”), ujawniające stosowanie 0,5% ekstraktu z winogron w kompozycjach kosmetycznych. Publikacje Scafildi i in. (patent US-5683683) oraz Zabotto i in. (patent US-5439672) ujawniają kompozycje kosmetyczne zawierające olej z nasion winogron. Griat i in. (patent US-5171577) ujawnia pianki kosmetyczne zawierające kosmetyczne pestki. Żadne z tych ujawnień, z wyjątkiem JP'421, nie wymienia ilości stosowanych winogron. Japoński opis podaje obecność 0,5% ekstraktu z winogron. Według Agricultural Research Service of the United States Department of Agriculture [Rolnicza Służba Badawcza Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych] stężenie resweratrolu w całych jagodach wynosi około 15 ppm. Zatem, stężenie resweratrolu w 0,5% ekstrakcie z nasion winogron wynosi 0,33 mikromoli lub 0,0000075% wagowych.

Omówiony wyżej stan techniki nie opisuje stosowania resweratrolu do pielęgnacji skóry albo jego stosowania w kosmetyce, nie ujawnia, że resweratrol jest fitoestrogenem, ani że hamuje proliferację keratynocytów, albo że przyspiesza różnicowanie keratynocytów, albo że hamuje podrażnienia skóry wywołane przez alfa-hydroksykwasy.

Krótki opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja do pielęgnacji skóry charakteryzująca się tym, że zawiera (a) resweratrol w ilości od 0,00002 do 10% wagowych;

(b) hydroksykwas wybrany spośród alfa-hydroksykwasów, beta-hydroksykwasów, zwłaszcza kwasu salicylowego, innych kwasów hydroksykarboksylowych, zwłaszcza kwasów dihydroksykarboksylowych, hydroksydikarboksylowych, hydroksytrikarboksylowych, ich mieszanin lub kombinacji ich stereoizomerów DL, D lub L, w ilości od 0,01 do 20% wagowych;

(c) kosmetycznie dopuszczalne podłoże.

Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera hydroksykwas w ilości od2%do12%wagowych.

PL 193 397 B1

Także korzystnie wartość pH kompozycji wynosi od 3 do 5.

Taka kompozycja ma zastosowanie w sposobie zmniejszania lub zapobiegania powstawaniu zmarszczek, kresek (drobnych zmarszczek), suchości i łuszczenia się postarzałej lub zniszczonej działaniem światła słonecznego skóry, oraz polepszania grubości, elastyczności, sprężystości, blasku, połysku i pulchności skóry, sposobie polegającym na nakładaniu na skórę opisanej kompozycji. Kompozycje według wynalazku są przeznaczone do miejscowego nakładania na skórę ssaków, która jest już sucha, łuszczy się, jest pomarszczona, ze zmarszczkami, postarzała, uszkodzona przez działanie światła słonecznego, albo kompozycje według wynalazku można stosować zapobiegawczo na zdrową, normalną skórę, w celu zapobiegania lub zmniejszania niszczącym zmian.

Wynalazek ma zastosowanie w kosmetycznych sposobach wprowadzenia estrogenowych substancji aktywnych do skóry, zapobiegających rozrostowi keratynocytów w ludzkiej skórze oraz zwiększających różnicowanie keratynocytów. Wynalazek ma także zastosowanie w kosmetycznym sposobie zwalczania podrażnień, pieczenia lub stanów zapalnych skóry, spowodowanych alfa-hydroksykwasami.

Szczegółowy opis wynalazku

Resweratrol (znany także jako 5-parahydroksy-styrylo-rezorcynol, albo 3,4',5-stilbenotriol) stanowi niezbędny składnik kompozycji według wynalazku. Resweratrol ma wzór:

OH

Resweratrol jest dostępny handlowo z firmy Sigma.

Ilość resweratrolu w kompozycjach według wynalazku wynosi od 0,00002 do 10% wagowych, liczone na kompozycję. Korzystnie, w celu obniżania kosztów i maksymalizowania działania, zawartość resweratrolu wynosi od 0,0001% do 5%, a najbardziej korzystnie od 0,1% do 5%.

Kompozycja według wynalazku zawiera także kosmetycznie dopuszczalne podłoże, spełniające rolę rozcieńczalnika, środka dyspergującego lub nośnika dla resweratrolu w kompozycji, ułatwiającego jego rozprowadzanie po naniesieniu kompozycji na skórę.

Podłoża inne niż woda, lub stosowane obok wody, mogą zawierać ciekłe lub stałe środki zmiękczające skórę (emolienty), rozpuszczalniki, środki utrzymujące wilgoć (humektanty), środki zagęszczające i proszki. Szczególnie zalecanym niewodnym nośnikiem jest polidimetylosiloksan i/lub polidimetylofenylosiloksan. Siloksany stosowane w wynalazku mogą stanowić substancje o lepkości w zakresie od około 10 do 10000000 mm²/s (cSt) w temperaturze 25°C. Szczególnie pożądane są mieszaniny silikonów o małej i dużej lepkości. Takie silikony są dostępne z firmy General Electric Company pod handlowymi nazwami Vicasil SE i SF, oraz z firmy Dow Corning Company w serii 200 i 550. Ilości silikonu, które można stosować w kompozycji według wynalazku mieszczą się w zakresie od 5% do 95%, korzystnie od 25% do 90% wagowych kompozycji.

Kosmetycznie dopuszczalne podłoże stanowi zwykle od 5% do 99,9%, korzystnie od 25 do 80% wagowych kompozycji, i przy braku innych kosmetycznych dodatków może stanowić uzupełnienie kompozycji. Korzystnie podłoże zawiera, co najmniej 80% wody, w stosunku do masy podłoża. Korzystnie woda stanowi co najmniej 50% wagowych kompozycji, bardziej korzystnie od 60 do 80% wagowych kompozycji.

Kompozycja według wynalazku zawiera także alfa-hydroksykwas. Hydroksykwasy zwiększają rozrost i zwiększają biosyntezę ceramidów w keratynocytach, zwiększają grubość naskórka i zwiększają naturalne złuszczanie skóry, sprawiając, że skóra staje się gładsza i wygląda młodziej.

Hydroksykwasy mogą być wybrane spośród alfa-hydroksykwasów, beta-hydroksykwasów (np. kwas salicylowy), innych kwasów hydroksykarboksylowych (np. kwasów dihydroksykarboksylowych, hydroksydikarboksylowych, hydroksytrikarboksylowych) i ich mieszanin lub kombinacji ich stereoizomerów (DL, D lub L).

PL 193 397 B1

Najbardziej korzystne kompozycje według wynalazku zawierające resweratrol zawiera środek przeciw podrażnieniom wywoływanym przez kwas glikolowy i/lub mlekowy, ponieważ stwierdzono, że te składniki mają skłonność do powodowania podrażnień, chociaż są szczególnie skuteczne w uzyskiwaniu korzyści kosmetycznych.

Korzystnie hydroksykwasy są wybrane spośród hydroksykwasów o wzorze ogólnym (1):

OH |

MCHCOOH Π) w którym M oznacza wodór albo nasycony lub nienasycony, prosty lub rozgałęziony łańcuch węglowodorowy o 1 do 27 atomach węgla.

Jeszcze bardziej korzystnie, hydroksykwas wybrany jest z kwasu mlekowego, 2-hydroksyoktanowego, hydroksylaurylowego, glikolowego, oraz ich mieszanin. Gdy stosuje się stereoizomery to najbardziej zalecany jest stereoizomer L.

Szczególną korzyść przedstawionych kompozycji stanowi fakt, że można stosować większe ilości hydroksykwasów bez powodowania drażnienia skóry. Korzystnie ilość składnika będącego hydroksykwasem w kompozycji według wynalazku wynosi od 0,01 do 20%, bardziej korzystnie od 2 do 12%, a najbardziej korzystnie od 4 do 12% wagowych.

Należy rozumieć, że zależnie od pH kompozycji, hydroksykwas może występować jako sól, np. sól amonowa lub potasowa albo sodowa.

Chociaż kompozycje według wynalazku mogą mieć dowolne pH ogólnym zakresie 2,5 do 10, to szczególnie użyteczne są gdy mają pH w zakresie kwaśnym, korzystnie pH 3-5, a najbardziej korzystnie pH 3-4, ponieważ takie kompozycje są szczególnie podrażniające.

Ewentualne materiały korzystne dla skóry i kosmetyczne środki pomocnicze (adiunkty)

Można zastosować olej lub materiał oleisty z emulgatorem dla wytworzenia emulsji albo typu woda w oleju, albo olej w wodzie, głównie w zależności od równowagi hydrofilowo-lipofilowej (HLB) zastosowanego emulgatora.

Kompozycje według wynalazku korzystnie zawierają filtry słoneczne. Filtry słoneczne obejmują materiały zwykle stosowane do blokowania światła ultrafioletowego. Przykładowe takie związki to pochodne kwasu para-aminobenzoesowego PABA, cynamonian i salicylan. Można stosować, na przykład metoksycynamonian oktylu, 2-hydroksy-4-metoksybenzofenon (znany także jako oksybenzon). Metoksycynamonian oktylu, 2-hydroksy-4-metoksybenzofenon są dostępne handlowo odpowiednio pod znakami towarowymi Parsol MCX i Benzofenone-3. Dokładna ilość filtru słonecznego stosowanego w emulsjach może zmieniać się zależnie od stopnia pożądanej ochrony przed promieniowaniem UV światła słonecznego.

Do kompozycji kosmetycznych według wynalazku często wprowadza się środki zmiękczające skórę (emolienty). Ilość takich środków może mieścić się w zakresie od 0,5% do 50%, korzystnie między 5% a 30% wagowych całej kompozycji. Środki zmiękczające skórę można ogólnie klasyfikować w takich chemicznych kategoriach jak estry, kwasy i alkohole tłuszczowe, poliole i węglowodory.

Estry mogą stanowić mono- lub diestry. Akceptowalne przykłady diestrów tłuszczowych obejmują adypinian dibutylu, sebacynian dietylu, dimeran diizopropylu i bursztynian dietylowy. Akceptowalne rozgałęzione estry tłuszczowe obejmują mirystynian 2-etyloheksylowy, stearynian izopropylowy i palmitynian izostearylowy. Akceptowalne estry kwasów trójzasadowych obejmują trilinolan triizopropylu i cytrynian trilaurylowy. Akceptowalne prostołańcuchowe estry tłuszczowe obejmują palmitynian laurylowy, mleczan mirystylowy i oleinian starylowy. Zalecane estry obejmują kokokaprylan/kaprynian (mieszanina kokokaprylanu i kokokaprynianu), ester kwasu octowego i eteru alkoholu mirystylowego z glikolem propylenowym, adypinian diizopropylu i kaprylan cetylowy.

Odpowiednie alkohole i kwasy tłuszczowe obejmują związki o 10 do 20 atomach węgla. Szczególnie zalecane są związki takie jak alkohole i kwasy cetylowe, mirystylowe, palmitylowe i stearylowe.

Wśród polioli, które mogą służyć jako środki zmiękczające skórę występują związki polihydroksylowe o liniowym i rozgałęzionym łańcuchu alkilowym. Na przykład, korzystne są glikol propylenowy, sorbit i gliceryna. Użyteczne mogą być także polimerowe poliole, takie jak glikol polipropylenowy) i glikol polietylenowy. Także zalecane są glikole propylenowy i butylenowy, zwłaszcza jako polepszające penetrację.

PL 193 397 B1

Przykładowe węglowodory, które mogą służyć jako środki zmiękczające skórę to związki mające łańcuchy węglowodorowe o 12 do 30 atomach węgla. Szczególne przykłady obejmują olej mineralny, wazelinę, skwalen i izoparafiny.

Inną kategorię składników funkcyjnych w kompozycjach według wynalazku stanowią środki zagęszczające. Stosuje się je zwykle w ilości od 0,1 do 20% wagowych, korzystnie od około 0,5 do 10% wagowych kompozycji. Przykłady środków zagęszczających stanowią usieciowane poliakrylany dostępne pod znakiem towarowym Carbopol z firmy B.F. Goodrich Company. Mogą być stosowane żywice, takie jak ksantan, karagenina, żelatyna, guma karaya, pektyna i guma locust beans (żywica z owoców drzew chleba świętojańskiego). W pewnych przypadkach funkcje zagęszczania może spełniać materiał służący także jako silikon lub środek zmiękczający skórę. Na przykład, żywice silikonowe o lepkości wyższej niż 10x10^-6 m²/s (10 centystoksów) i estry, takie jak stearynian gliceryny spełniają dwie funkcje.

W kompozycji kosmetycznej według wynalazku mogą występować proszki. Takie proszki obejmują kredę, talk, kaolin, skrobię, smektyczne glinki, chemicznie modyfikowany krzemian magnezowoglinowy, modyfikowane organicznie glinki montmorylonitowe, uwodniony krzemian glinu, zmatowioną krzemionkę koloidalną, sól glinową oktenylobursztynianu skrobi, oraz ich mieszaniny.

W kompozycji kosmetycznej mogą występować także inne mniejszościowe składniki pomocnicze (adiunkty). Składniki te mogą obejmować środki barwiące, środki zmętniające i zapachowe. Ilości takich mniejszościowych środków pomocniczych mogą wynosić od 0,001% do 20% wagowych kompozycji.

Stosowanie kompozycji

Kompozycja według wynalazku w pierwszym rzędzie jest produktem do miejscowego stosowania na skórę ludzką, szczególnie jako środek kondycjonujący, nawilżający i wygładzający skórę, oraz dla zapobiegania marszczeniu, liniowaniu i zmarszczkom lub postarzeniu skóry.

Podczas stosowania, małą ilość kompozycji, na przykład od 1 do 100 ml, nanosi się na pielęgnowane powierzchnie skóry z odpowiedniego pojemnika lub aplikatora i, jeśli to potrzebne, rozsmarowuje się i/lub wciera w skórę ręką lub palcami albo odpowiednim przyrządem.

Postać produktu i opakowanie

Kompozycja do miejscowej pielęgnacji skóry według wynalazku może być przygotowana w postaci płynu do zmywania, kremu lub żelu. Kompozycja może być pakowana do odpowiedniego pojemnika dobranego pod kątem jej lepkości i przewidywanego stosowania przez użytkownika. Na przykład, płyn lub krem może być pakowany w butelki lub do aplikatora z kulką, albo areozolowego pojemnika z propellentem lub pojemnika z pompką uruchamianą palcem. Gdy kompozycja stanowi krem, może być przechowywana po prostu w nieodkształcalnej butelce lub wyciskanym pojemniku, takim jak tuba, albo w słoiku z pokrywką. Kompozycja może także stanowić zawartość kapsułek, takich jak to opisano w patencie US-5063507, włączonym jako odnośnik literaturowy.

Poniższe przykłady bliżej ilustrują wynalazek, lecz nie ograniczają go. We wszystkich przykładach stosowano resweratrol z firmy Sigma. Do określania wszystkich wartości p stosowano badawczy t-test Studenta („testy drzewka”).

P r zyk ł a d 1

Przykład ten ilustruje, że resweratrol jest fitoestrogenem.

Dla określenia czy resweratrol posiada aktywność podobną do estrogenu stosowano następujące badanie.

Linia komórek ZR75 stanowi linię komórek przewodowego nowotworu piersi, wyizolowanych początkowo ze złośliwego nabłonka sutka trzydziestosześcioletniej kobiety z Kaukazu (Engel i in. Human breast carcinoma cells in continuous culture: A review [Komórki raka piersi w ciągłej hodowli: przegląd], Cancer Res., 38: 4327-4339, 1978). Ta linia komórek zawiera receptory dla estrogenu, progesteronu i innych hormonów sterydowych, lecz odpowiada zwiększeniem rozrostu tylko na estrogen. Linia komórek zawiera receptory specyficzne dla estrogenu o wysokiej aktywności. Zatem stosuje się ją do badania aktywności estrogeno-podobnej (Markiewicz i in. In vitro bioassays of non-steroidal phytoestrogens [Testy biologiczne in vitro nie-sterydowych fitoestrogenów], J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 45: 399-405, 1993).

Metodologia stosowana do określenia szybkości syntezy DNA w komórkach.

Jako test biologiczny rozrostu komórek stosowano wbudowywanie ³H-tymidyny przez hodowane komórki (zarówno dla komórek ZR75 jak i dla keratynocytów). Tymidyna jest jednym z czterech deoksynukleozydów stanowiących monomeryczne jednostki DNA. Przed podziałem komórki somatycznej, replikuje się komplet genomu komórki podlegającej podziałowi. Wymaga to syntezy DNA w komórce

PL 193 397 B1 na dużą skalę i umożliwia to, że obie komórki pochodne otrzymują identyczne kopie materiału genetycznego. Gdy w pożywce hodowlanej komórek syntetyzujących DNA przed przygotowaniem do podziału komórki znajduje się ³H-tymidyna, to znakowana tymidyna wbudowuje się do nowosyntetyzowanego DNA. Ilość ³H-tymidyny wbudowywanej do populacji komórek jest proporcjonalna do szybkości syntezy DNA przez populację komórek a zatem stanowi wskaźnik ich rozrostu komórkowego.

Komórki ZR75 (z kolekcji hodowlanej American Type Culture Collection, Rockville, Maryland) hodowano na pożywce RPMI1640 (z firmy Gibco Life Technologies) z dodatkiem 10% surowicy płodu bydlęcego (FBS), 100 jednostek penicyliny na ml i 100 jednostek streptomycyny na ml. Wszystkie inkubacje prowadzono w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Pożywka nie zawierała czerwieni fenolowej (łagodny estrogen mimetyczny). Komórki posiewano z gęstością 1 milion na kolbę 75 cm². W doświadczeniu, komórki posiewano na płytki z 24 dołkami w ilości 100000 komórek na ml na dołek.

Po hodowli przez 24 godziny, usuwano pożywkę, komórki wymywano PBS (solanka buforowana fosforanem, 0,01 molowy fosforan sodowy, 0,138 molowy chlorek sodu, 0,0027 molowy chlorek potasu, pH 7,4) i dodawano 1ml RPMI 1640 bez surowicy (ale ze streptomycyną i penicyliną). Przygotowano wyjściowy roztwór reswatrolu w dimetylosulfotlenku (DSMO) i estradiolu w wodzie. Następnie do każdego dołka dodawano bezpośrednio różne stężenia resweratrolu i estradiolu podane w tabeli 1.

Po dalszych 24 godzinach do każdego dołka dodano 1 pCi [metylo-3H]-tymidyny. Po 24 godzinach usuwano pożywkę. Komórki przemywano raz PBS, zupełnie usuwano PBS i komórki pozostawiano przez 30 minut w kąpieli lodowej w celu inkubacji, traktując każdy dołek 1ml 10% TCA (kwas trichlorooctowy). Płytki przemywano trzykrotnie 5%TCA w celu usunięcia wszystkich śladów tymidyny niewbudowanej w komórki. Do każdego z dołków dodano 500 μΐ 0,1 molowego wodorotlenku sodowego i płytki inkubowano w temperaturze pokojowej przez przynajmniej 30 minut. 250 μΐ każdej próbki przeniesiono do probówki scyntylacyjnej i po dodaniu 5 ml cieczy liczącej, probówki zliczano przez 5 minut każdą, przy ustawieniu na tryt. Dane z poczwórnych dołków obliczano jako % wbudowywania tymidyny do DNA w stosunku do dołków kontrolnych, do których nie dodawano ani resweratrolu ani estradiolu. Wielkości wyrażono jako średnią z czterech dołków +/-średnie odchylenie. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1

Związek (pmol)	Test 1 syntezy DNA (% pr kontr.)	Test 1 wartość p	Test 2 syntezy DNA (% pr kontr.)	Test 2 wartość p
Kontrolna (woda)	100 ± 20,4	-	100 ± 1,9	-
Estradiol (1 nmol)	220 ± 11	0,00059	133,4 ± 29	0,062
10 nmol	210 ± 9,7	0,00079	152 ± 17,7	0,0011
100 nmol	205 ± 15,6	0,0016	156 ± 11,7	0,00008
1000 nmol	190 ± 24,5	0,0068	142 ± 18,3	0,0039
Kontrolna (DMSO)	100 ± 7,0	-	100 ± 0,08	-
Resweratrol (0,5 pmol)	69,7 ± 10		56,8 ± 4,2
1 pmol	58,8 ± 9,0		60,5 ± 3,6
5 pmol			158,8 ± 4,1	0,000008
10 pmol	207,8 ± 32,5	0,0026	163 ± 13,7	0,00029
15 pmol			119 ± 2,5	0,00009
20 pmol	134,8 ± 21,4	0,612	68 ± 3,9
40 pmol	60,8 ± 26,4
50 pmol	4,1 ± 1,4

₃

Kontrolna wielkość wbudowywania ³H tymidyny dla testu 1wynosiła 71513 pobudzeń na minutę [cpm], a dla testu 2 wynosiła 114958 cpm.

PL 193 397 B1

Wyniki z tabeli 1 pokazują, że estradiol, jako znany estrogen stymuluje rozrost komórek ZR75, jak oczekiwano. Resweratrol zwiększa rozrost komórek ZR75 przy stężeniach od 5 do 20 μmoli.

Przykła d 2

Ten przykład pokazuje, że resweratrol hamuje rozrost keratynocytów.

1. Normalne ludzkie keratynocyty pobrane z napletka noworodka działaniem trypsyny hodowano w pożywce Eagle modyfikowanej metodą Dulbecco (DME)/5% surowica płodowa cieląt w obecności mitomycyny C traktowanej fibroblastami myszy 3T3 w celu określenia podziału kolonii keratynocytów. Keratynocyty hodowano w powyższych warunkach aż do trzeciego pasażu.

2. W doświadczeniu, trzeci pasaż keratynocytów umieszczano w pożywce hodowlanej dla keratynocytów nie zawierającej surowicy (KGM; z firmy Colonetics, San Diego, Kalifornia), zawierającej 0,09 mmoli wapnia. W każdym dołku 6 dołkowej płytki hodowlanej umieszczano około 30000 komórek i hodowano przez 5 dni, aż komórki osiągnęły około 40% zlania się.

3. Pożywkę zmieniono na świeżą (KBM; otrzymywaną z Colonetics)i do pożywki dodawano resweratrol z wyjściowego roztworu w DMSO (dimetylosulfotlenek) w różnych stężeniach jak przedstawiono w tabeli 2. Końcowe stężenie DMSO w hodowli wynosiło 0,1%. Do kontrolnych hodowli nie dodawano resweratrolu, ale dodawano 0,1% DSMO. Każde stężenie badano w trzech oddzielnych doł₃ kach. Po czterech godzinach do 1 ml pożywki w każdym dołku dodano 1 μφ H-tymidyny (Amersham Corp., aktywność Sp 40 Ci/mmol).Komórki inkubowano przez 2 godziny. Ilość ³H-tymidynywbudowanej dokomórkowegoDNAkeratynocytówocenianojaktoopisanoponiżej.

4. Pożywkę usuwano przez odsysanie i komórki przemywano 1 ml PBS. Wytrącano DNA i białka komórkowe z płytki przez dodawanie 1 ml 10%TCA (kwas trichlorooctowy) o temperaturze lodu. Płytki pozostawiano na lodzie przez 30 minut w celu zakończenia procesu wytrącania. Następnie odsysano TCA i każdy dołek przemywano czterokrotnie 5% TCA. Komórki w dołkach rozpuszczano w 0,5 ml 0,1N wodorotlenku sodu. 200 μΐ każdej próbki przeniesiono do probówki scyntylacyjnej w celu oznaczenia wbudowywania tymidyny i 25 μl stosowano do oznaczenia białka stosując reagent do oznaczania białek BCA jaktoopisano niżej. Do reszty roztworu w probówce dodawano 5 ml cieczy liczącej (Scintiverse), probówki zliczano w liczniku scyntylacyjnym określając ilość radioaktywności w każdej z probówek.

Oznaczanie białekza pomocąBCA(kwasbicinchoninikowy) μl zawiesiny komórek umieszczano w płytce 96 dołkowej. Standardy BSA (albumina surowicy bydlęcej) w 0,1N wodorotlenku sodowym pipetowano potrójnie do tej samej 96-dołkowej płytki. Z przedziurawionego probierczego reagenta białek BCA dodano do każdego dołka 200 μl/dołek i płytkę inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Absorbancję odczytywano przy długości fali 570nm na aparacie do odczytywania płytek Dynatech MR7000.

₃

Obliczano następnie szybkość syntezy DNA jako cpm wbudowywania ³H-tymidyny do całkowitego komórkowego DNA^g białek komórkowych dla każdego pojedynczego dołka. Obliczano także średnią i standardowe odchylenie dla każdej z grup. Te wielkości wyrażano także w procentach w stosunku do dołków kontrolnych. Każda wielkość stanowi średnią z potrójnych dołków ± standardowe odchylenie.

Otrzymanewynikizestawionowtabeli 2.

Wartości p mniejsze niż 0,5 były uważane za wyniki wskazujące na posiadające znaczenie statystyczne.

PL 193 397 B1

Tabel a 2

Resweratrol (pmol)	Synteza DNA (cpm/pg białka)	% hamowania	Wartość p
Doświadczenie 1
0	29,52 ± 4,44	0	-
50	0,62 ± 0,09	98	0,012
Doświadczenie 2
0	17,17 ± 1,21	0	-
0,78	11,57 ± 1,7	33	0,053
1,56	8,89 ± 1,12	48	0,016
3,12	5,11 ± 0,27	70	0,0074
6,25	2,45 ± 0,56	86	0,0053
12,5	1,07 ± 0,11	94	0,003
25	0,58 ± 0,05	97	0,0029
50	0,44 ± 0,12	97	0,0028

Jak widać na podstawie wyników z tabeli 2 stężenia resweratrolu już tak niskie jak 1,56 μmoli znacznie zmniejszają syntezę DNA keratynocytów. Resweratrol w stężeniu 1,56 μmoli zmniejsza rozrost keratynocytów aż o 50%. W obu doświadczeniach resweratrol w stężeniu 50 μmola zupełnie hamuje syntezę DNA.

Przykład 3

Powtórzono przykład 2 z różnymi dodatkowymi stężeniami resweratrolu. Otrzymane wyniki zestawiono w tabeli 3.

Tabel a 3

Wpływ resweratrolu w niskich stężeniach na pobieranie tymidyny przez keratynocyty

Stężenie resweratrolu	Synteza DNA (cpm/pg białka)	% hamowania	Wartość p	Znaczenie statystyczne (dla p mniejszego niż 0,5)
0,0 pmola	63,4 ± 5,2	-	-	-
0,1 pmola	60,4 ± 4,1	5	0,502	brak
0,2 pmola	56,3 ± 3,0	12	0,079	brak
0,3 pmola	58,8 ± 0,4	7	0,254	brak
0,4 pmola	54,2 ± 1,2	14	0,051	brak
0,6 pmola	59,3 ± 5,5	6	0,310	brak
0,8 pmola	44,4 ± 2,6	30	0,00013	tak
1,0 pmola	37,7 ± 4,0	40	<0,0001	tak
2,0 pmola	25,7 ± 2,4	59	<0,0001	tak

Na podstawie wyników z tabeli 3, można stwierdzić że resweratrol nie był skuteczny w zmniejszaniu rozrostu keratynocytów przy stężeniu niższym niż 0,8 μmola (lub 0,000018% wagowych) obejmującym bardzo niskie stężenie 0,33 pmola, które powinno stanowić maksymalne stężenie znajdujące się w 0,5% ekstrakcie z winogron ujawnionym w publikacjiJP 6336421.

PL 193 397 B1

P r zyk ł a d 4

Przykład pokazuje, że resweratrol wywołuje różnicowanie keratynocytów.

Metodologia pomiaru transglutaminazy

Podczas procesu końcowego różnicowania naskórka, na wewnętrznej powierzchni obwodu komórek tworzy się warstwa białek o grubości 15 nm, znana jako warstwa zrogowaciała (CE). Warstwa CE składa się z wielu różnych białek, usieciowanych ze sobą tworzącymi się wiązaniami izopeptydowymi N'-(glutamylo)lizynowymi, których powstanie katalizowane jest przez działanie przynajmniej dwu różnych transglutaminaz w naskórku. Transglutaminaza (TG-1) działa w rozproszeniu w różnicujących się warstwach naskórka, szczególnie w warstwie ziarnistej, lecz jest nieobecna w nieróżnicującej się warstwie podstawowej naskórka. Zatem TG-1 stanowi użyteczny znacznik różnicowania keratynocytów naskórka, przy czym wysoka zawartość TG-1 wskazuje na stan bardziej różnicujący się. Test ELISA oparty na TG-1 z zastosowaniem przeciwciał TG-1 stosowano dla oznaczenia stanu różnicowania hodowanych keratynocytów w przykładzie jak niżej.

Zawartość TG-1 mierzono następująco. Keratynocyty otrzymywano jak to opisano w przykładzie 2. Dla celów doświadczalnych umieszczano około 30000 komórek w każdym dołku płytki 6 dołkowej i hodowano przez 5 dni, aż komórki osiągnęły 20-30% zlania. Dziennie dodawano 2 ml/dołek świeżej

KGM wraz z 2 μΐ 2-50 mmolowego resweratrolu w DSMO, przez 3 dni. Do kontrolnych dołków także dodawano 2 μl DSMO. Po trzech dniach obróbki komórki myto dwukrotnie PBS i umieszczano w zamrażarce na 2 godziny. Następnie komórki odmrażano przez 2 godziny. Oznaczano ilościowo zawartość DNA komórek stosując fluorofor wiążący DNA, bis-benzimidazol (Hoechst 33258) i mierząc fluorescencję właściwą fluoroforu związanego z DNA w 450 nm (wzbudzanie przy 360 nm).

Zawartość. TG-1 komórek w dołkach oznaczano z zastosowaniem monoklonalnego przeciwciała specyficznego wobec TG-1 (BC1) (pierwsze przeciwciało) (otrzymywanego z firmy Amersham Life Sciences) i używając znaczonego peroksydazą przeciwmyszowego fragmentu króliczego IgG (drugie przeciwciało). Płytki blokowano 5% odtłuszczonym mlekiem w TBS (solanka buforowana TRIS, 0,01 molowy TRIS, 0,150 molowy chlorek sodu, pH 8,0) przez 1 godzinę z następującą dalej 2 godzinną inkubacją z pierwszym przeciwciałem (1:4000 krotne rozcieńczenie) w 1% roztworze mleko/TBS w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym przepłukaniu płytek 1% roztworem mleko/TBS, zawierającym 0,05% Tween 20, płytki inkubowano z rozcieńczeniem 1:4000 z drugim przeciwciałem w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Płytki płukano trzykrotnie 1% roztworem mleko/TBS/Tween i trzykrotnie TBS. Rozwijano barwę przez inkubowanie z o-fenylenodiaminą i nadtlenkiem wodoru. Absorbancję odczytywano przy 492 nm na spektrofotometrze Ultrospec 3000 (Pharmacia Biotech) i obliczano zawartość TG-1 jako fluorescencję Abs/DNA. Dla obliczeń i analizy statystycznej danych stosowano średnią ± standardowe odchylenie z przynajmniej trzech oddzielnych dołków. Wartości wyrażano jako absorbancja TG-1 na pomocniczą jednostkę fluorescencji DNA z potrójnych dołków ± standardowe odchylenie. Wyniki wyrażano także jako % kontrolnych. Wyniki zestawiono w tabeli 4.

Tabel a 4

Resweratrol (pmol)	Zawartość TG-1/pg DNA	% wartości kontrolnej	Wartość p
Doświadczenie 1
0 pmol	6,74 ± 0,79	-	-
10 pmol	8,49 ± 1,77	126	0,1195
25 pmol	10,92 ± 2,29	162	0,0008
50 pmol	22,2 ± 1,50	329	0,0001
Doświadczenie 2
0 pmol	1,91 ± 0,003	-	-
2 pmol	3,42 ± 0,42	179	<0,0001
5 pmol	3,51 ± 0,41	184	<0,0001
10 pmol	3,61 ± 0,17	189	<0,0001
25 pmol	4,69 ± 0,21	246	<0,0001
50 pmol	4,65 ± 0,46	243	<0,0001

PL 193 397 B1

Resweratrol w stężeniu 10 μmoli nie różnił się znacznie od kontrolnej próbki z doświadczenia 1, co spowodowane było normalnymi odchyłkami doświadczalnymi dla układów biologicznych, lecz wszystkie inne stężenia znacznie zwiększały ekspresję transglutamiaz keratynocytów potwierdzając, że resweratrol zwiększa różnicowanie keratynocytów. W doświadczeniu 2 wszystkie stężenia resweratrolu 2 μmole i więcej, znacznie zwiększały różnicowanie keratynocytów.

Przykład 5

Ten przykład pokazuje, że resweratrol łagodzi stany zapalne skóry, które mogą być spowodowane alfa-hydroksykwasami.

Resweratrol stanowi znany inhibitor cyklooksygenazy. Hamowanie cyklooksygenazy zmniejsza konwersję kwasu arachidonowego do substancji prozapalnych, takich jak prostaglandyny, włącznie z PGE2. Należałoby oczekiwać, że hamowanie cyklooksygenazy zmniejszy zapalenie, ale nie wszystkie inhibitory cyklooksygenazy zmniejszają podrażnienie potencjalnie związane ze składnikami kosmetycznymi,takimijakalfa-hydroksykwasy.

Przykład 5A

Sposób prowadzenia badań na test zapalny

Test plastrowy z czterema narażeniami: celem było porównanie podrażnienia wywołanego przez różne badane materiały przy powtarzalnym nakładaniu plastra. Badane materiały utrzymywano w kontakcie ze skórą w warunkach zamkniętych (opatrunek okluzyjny). Zewnętrzną część ramienia badanego osobnika przeznaczono jako powierzchnię do nakładania. Do mocowania plastrów (25 mm, Hill Top Chamber z górną nakładką, z krążkiem o średnicy 18 mm z wyściółki z Webrilu) na miejscu badanym używano opatrunku typu bandaża (taśma Scanpor). Wykorzystywano oba ramiona badanego. Plastry nakładano w zrównoważonej statystycznie kolejności.

Plastry nakładano o godzinie 9,00 w poniedziałek rano i usuwano o godzinie 9,00 we wtorek rano (ekspozycja 24 godziny). Wewtorek o godzinie 3,00 po południu nakładano nową serię plastrów i usuwano we środę rano o godzinie 9,00 (ekspozycja 18 godzin). Trzecią serię plastrów nakładano we środę o 3,00 po południu i usuwano we czwartek o 9,00 (ekspozycja 18 godzin). Ostatnią serię plastrów nakładano we czwartek o 3,00 po południu i zdejmowano w piątek o godzinie 9,00 rano (ekspozycja 18 godzin).

Za każdym razem, gdy usuwano plaster, miejsce spłukiwano ciepłą wodą i osuszano bibułą. Następnie miejsce badane oznaczano markerem chirurgicznym do znakowania skóry dla wyznaczenia miejsca do oceny i zastosowania następnego plastra. Miejsca badane porównywano o 3 po południu we wtorek, środę, czwartek i piątek, w dniach prowadzenia badania przed ponownym nałożeniem plastra.

Oczekiwano stanu zapalnego skóry, takiego jak umiarkowane zaczerwienienie, suchość i swędzenie. Możliwe było opuchnięcie badanych miejsc. Jeśli jakieś miejsce wykazało umiarkowane zaczerwienienie lub opuchliznę,to na to miejsce ponownie nie nakładano plastra.

Miejsca badane na każdym ramieniu były sprawdzane przez dwóch wykwalifikowanych badaczy przy jednakowym oświetleniu. Miejsca badane ustawiano kolejno pod względem ciężkości objawów. Badający oceniał odpowiedzi przy pierwszej ocenie i kontynuował ocenę każdego dnia podczas prowadzenia badań.

Podczas oceny, miejsce z najcięższą odpowiedzią uzyskiwało najniższą ocenę. Miejsce z drugą najcięższą odpowiedzią uzyskiwało drugą najniższą ocenę. Nie był to uciążliwy proces oceniania. Jeśli dwa lub więcej miejsc nie dawało odpowiedzi lub dawało taką samą (nie było różnicy), przyporządkowano im ocenę średnią. Jeśli jakieś miejsce opuszczano ze względu na stopień podrażnienia, to miejsce utrzymywało ocenę jaką uzyskało wczasie przerwania dozowania.

Analiza statystyczna

Wyniki z traktowania plastrami były porównywane statystycznie nieparametrycznymi metodami statystycznymi. Materiały badane zawierające środki zapobiegające podrażnieniom były porównywane do odpowiednich próbek kontrolnych zawierających tylko hydroksykwasy, z zastosowaniem sumy ocen rankingowych Friedman'a dla każdego porównywanego punktu z osobami badanymi przedstawianymi jako blok (tj. każdy badany był badany w każdym teście). Wartości p mniejsze niż 0,1 były uznawaneza mające znaczenie statystyczne.

Badano kompozycje zawierające składniki podanewtabeli 5A z zastosowaniem opisanej metodybadaniapodrażnienia. Badano dwadzieścia (20) osób. Otrzymanewyniki przedstawiono w tabeli 5A. Im wyższa suma ocen tym mniejsze podrażnianie.

PL 193 397 B1

Kompozycja bazowa

Pełna nazwa chemiczna lub nazwa CFTA	Nazwa handlowa i % aktywności	% wagowy
Woda, dejonizowana		46,54
EDTA disodowy	Sequestrene Na2	0,05
Krzemian magnezowo-glinowy	Veegum Ultra	0,6
Metyloparaben	Methyl Paraben	0,15
Simetikon	DC Antifoam Emulsion	0,01
Glikol butylenowy-1,3	Butylene glycol 1,3	3,0
Hydroksyetyloceluloza	Natrosol 250HHR	0,5
Gliceryna wg farmakopei	Glycerine USP	2,0
Żywica ksantanowa	Keltrol 1000	0,2
Trietanoloamina	Triethanoloamine 99(%)	1,2
Kwas stearynowy	Pristerene 4911	3,0
Propyloparaben NF	Propyloparaben NF	0,1
Stearynian hydroksygliceryny	Naturechem GMHS	1,5
Alkohol stearylowy	Lanette 18DEO	1,5
Palmitynian izostearylowy	Protachem ISP	6,0
Kaprylan alkoholi C12-15	Hetester FAO	3,0
Dimetikon	Silicone Fluid 200 50x10'⁶ m²/s (50 cSt)	1,0
Cholesterol NF	Cholesterol NF	0,5
Stearynian sorbitu	Sorbitan stearate	1,0
Eter butylowy hydroksytoluenu	Embanox BHT	0,05
Octan tokoferolu	Vitamin E acetate	0,1
Stearynian PEG-100	MYRJ 59	2,0
Mleczan stearylo-sodowy	Pationic SSL	0,5
Palmitynian retynylu	Vit.A Palmitate 84%	0,06
Kwas hydroksykaprylowy	Hydroksy caprylic Acid	0,1
Woda, dejonizowana		qs do 99,80
Alfa-bisabolol	Alpha-bisabolol	0,2
pH		7-8

Metyloparaben - 4-hydroksybenzoesan metylu

Propyloparaben - 4-hydroksybenzoesan propylu

Simetikon - dimetylo-bis(trimetylosililoksy)silan) nr CAS 8050-81-5

Dimetikon - trimetylo-trimetylosililoksysilan nr CAS 9006-65-9

Alfa-bisabolol - 6-metylo-2-(4-metylo-1-cykloheksyl-3-enylo)-hept-5-en-2-ol nrCAS 67375-41-1

PL 193 397 B1

T ab el a 5A

Kompozycja	Składniki	Suma ocen (dzień 1)	Suma ocen (dzień 4)
1	Receptura podstawowa	65,5	79,5
2	Receptura podstawowa + 8% kwasu glikolowego	63	72
3	Kompozycja 2 + 0,1% resweratrolu	85^a	66

^a: znacznie mniejsze podrażnienia niż dla kompozycji 2.

Z wyników zamieszczonych w tabeli 5A widać, że resweratrol (kompozycja 3) znacznie zmniejsza podrażnienie wywołane kompozycją 2 (zawierającą 8% wagowych kwasu glikolowego), po pierwszej ekspozycji na działanie kompozycji 2.

Porównawczy przykład 5B

Badano kompozycje zawierające składniki podane w tabeli 5B z zastosowaniem metody podrażnienia opisanej w przykładzie 5A. Badano dwadzieścia dwie (22) osoby. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 5B. Im wyższa suma ocen tym mniejsze podrażnianie.

T ab el a 5B

Kompozycja	Składniki	Suma ocen (dzień 1)	Suma ocen (dzień 4)
1	Receptura podstawowa	81	90,5
2	Receptura podstawowa + 8% kwasu glikolowego	75	73,5
4	Kompozycja 2 + 5% ibuprofenu	71,5	65,5

Ibuprofen - kwas 2-[4-(2-metylopropylo)fenylo]propanowy

Na podstawie wyników z tabeli 5B można zauważyć, że ibuprofen, znany środek przeciwzapalny (kompozycja 4) nie zmniejsza podrażnienia spowodowanego nakładaniem preparatów zawierających 8% kwasu glikolowego (kompozycja 2).

Porównawczy przykład 5C

Badano kompozycje zawierające składniki podane w tabeli 5C z zastosowaniem metody badania podrażnienia opisanej w przykładzie 5A. Badano dziewiętnaście (19) osób. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 5C.Im wyższa suma ocen tym mniejsze podrażnianie.

T ab el a 5C

Kompozycja	Składniki	Suma ocen (dzień 1)	Suma ocen (dzień 4)
2	Receptura podstawowa + 8% kwasu glikolowego	70	62,5
5	Kompozycja 2 + 1% indometacyna	53,5	52,5

Indometacyna - kwas 2-[1-(4-chlorobenzoilo)-5-metoksy-2-metylo-indol-3-ylo]-octowy

Na podstawie wyników z tabeli 5C można zauważyć, że indometacyna, znany inhibitor cyklooksygenazy i składnik przeciwzapalny (kompozycja 5) nie zmniejsza podrażnienia spowodowanego nakładaniem preparatów zawierających 8% kwasu glikolowego (kompozycja 2).

PL 193 397 B1

Przykłady 6-11 przedstawiają kompozycje do pielęgnacji skóry według wynalazku. Kompozycje można wytwarzać w konwencjonalny sposób. Są odpowiednie do stosowania w kosmetyce. W szczególności kompozycje są odpowiednie do nakładania na skórę ze zmarszczkami, pomarszczoną, szorstką, suchą, łuszczącą się, postarzałą i/lub uszkodzoną przez promieniowanie UV, wcelu polepszenia jej wyglądu i odczuwania, oraz do nakładania na skórę zdrową dla zapobiegania jej uszkadzaniu lub opóźnieniu jej niszczenia. Kompozycje są użyteczne w szczególności do zmniejszania podrażnień, pieczenia lub stanu zapalnego, które mogą towarzyszyć stosowaniu alfa-hydroksykwasów.

Przykład 6

Przykład przedstawia emulsję woda w oleju o dużej fazie wewnętrznej, zawierającą kompozycję według wynalazku

	% wagowy
Resweratrol	0,5
1,3-dimetylo-2-imidazolidinon	0,2
Brij 92*	5
Bentone 38**	0,5
MgSO4 x 7H2O	0,3
Eter butylowy hydroksytoluenu	0,01
Środek zapachowy	qs
Woda	do 100

* Brij 92 stanowi eter oleilowy polioksyetylenu (2)

Bentone 38 - glinka kaolinowa

Przykład 7

Przykładprzedstawiakremtypuolejwwodzie,zawierający kompozycję według wynalazku

	% wagowy
Resweratrol	2
Kwas glikolowy	8
Olej mineralny	4
1,3-dimetylo-2-imidazolidinon	1
Brij 56*	4
Alfol 16 RD**	4
Trietanoloamina	0,75
Butan-1,3-diol	3
Żywica ksantanowa	0,3
Środek zapachowy	qs
Eter butylowy hydroksytoluenu	0,01
Woda	do 100

* Brij 92 -eter POE(10) i alkoholu cetylowego

Alfol 16 RD - alkohol cetylowy

PL 193 397 B1

P rzykła d 8

Przykład przedstawia alkoholowy lotion (płyn do przemywania twarzy) zawierający kompozycję według wynalazku

	% wagowy
Resweratrol	5
1,3-dimetylo-2-imidazolidinon	0,1
Etanol	40
Środek zapachowy	qs
Eter butylowy hydroksytoluenu	0,01
Woda	do 100

P rzyk ła d 9

Przykładprzedstawiainnyalkoholowylotionzawierającykompozycjęwedług wynalazku

	% wagowy
Resweratrol	10
1,3-dimetylo-2-imidazolidinon	0,01
Etanol	40
Antyutleniacz	0,1
Środek zapachowy	qs
Woda	do 100

P rzykła d 10

Przykład przedstawia krem chroniący przed szkodliwym działaniem promieni słonecznych zawierającykompozycjęwedługwynalazku

	% wagowy
Resweratrol	2
1,3-dimetylo-2-imidazolidinon	0,2
Olej silikonowy 200x10'⁶ m²/s (200 cSt)	7,5
Monostearynian gliceryny	3
Alkohol cetostearylowy	1,6
Eter alkoholu cetylowego i polioksyetylenu (20)	1,4
Żywica ksantanowa	0,5
Parsol 1789*	1,5
Metoksycynamonian ortylu (Parsol MCX)	7
Środek zapachowy	qs
Barwnik	qs
Woda	do 100

* Parsol - avobenzon - 1-(4-metoksyfenylo)-3-(4-tert-butylofenylo)-propano-1,3-dion

PL 193 397 B1

Przykład 11

Przykład przedstawia niewodną kompozycję do pielęgnacji skóry zawierającą kombinację według wynalazku

	% wagowy
Resweratrol	5
1,3-dimetylo-2-imidazolidinon	1
Żywica silikonowa SE-30¹	10
Ciecz silikonowa/Silikone Fluid 345²	20
Ciecz silikonowa/Silikone Fluid 344³	50,26
Skwalen	10
Kwas linolenowy	0,01
Cholesterol	0,03
Kwas 2-hydroksywalerianowy	0,7
Linoleinian witaminy E	0,5
Olejek ziołowy	0,5
Etanol	2

¹ polimer dimetylosilikonowy o ciężarze cząsteczkowym przynajmniej 50,000 i lepkości przynajmniej 1x10^-2 m²/s (10000 centystoksów) w temperaturze 25°C, dostępny z firmy GEC ² cykliczny pentamer dimetylosiloksanowy, dostępny z firmy Dow Corning Corp.

³ cykliczny tetramer dimetylosiloksanowy, dostępny z firmy Dow Corning Corp.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja do pielęgnacji skóry, znamienna tym, że zawiera:

(a) resweratrol w ilości od 0,00002 do 10% wagowych;

(b) hydroksykwas wybrany spośród alfa-hydroksykwasów, beta-hydroksykwasów, zwłaszcza kwas salicylowy, innych kwasów hydroksykarboksylowych, zwłaszcza kwasów dihydroksykarboksylowych, hydroksydikarboksylowych, hydroksytrikarboksylowych, ich mieszanin lub kombinacji ich stereoizomerówDL, D lub L, w ilości od 0,01 do 20% wagowych; i (c) kosmetycznie dopuszczalne podłoże.
2. Kompozycja według zastrz. 1 , znamienna tym, że zawiera hydroksykwas w ilości od 2% do12% wagowych.
3. Kompozycjawedług zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że wartość pH kompozycji wynosi od 3 do 5.