JPH09165325A - トリコリンシトレートを含有する化粧品組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 トリコリンシトレート（ＴＣＣ）を含有
する化粧品組成物。 【効果】 ケラチノサイトの成長を刺激し、ケラチノサ
イト分化を阻害せず、またケラチノサイト中のリン脂質
レベルを増大する。かくして、改善された状態調整、改
善された若々しい外観、潤い付与並びに光損傷皮膚の外
観の改善を与える。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトの皮膚の処置
および状態調整のための並びにヒトの皮膚に対するＵＶ
光の損傷作用を低減するためのヒトの皮膚への局所施用
に適した、効果量のトリコリンシトレートを含有する組
成物に関する。

【０００２】

【従来の技術及び本発明の解決すべき課題】トリコリン
シトレート（以後、“ＴＣＣ”）は、クエン酸と３個の
コリン分子とのエステルである。

【０００３】クエン酸は、ヒドロキシトリカルボン酸で
ある。ヒドロキシ酸が皮膚の過角質化疾患の処置のため
に効果があるというヴァン・スコット等の発見（「“α
−ヒドロキシ酸および関連化合物での角質化の制御”，
アーク・ダーマトル（Ａｒｃｈ． Ｄｅｒｍａｔｏ
ｌ．），第１１０巻，１９７４年１０月号，第５８６〜
５９０頁」）以来、数種のヒドロキシ酸および関連化合
物が皮膚科学的製剤および化粧用製剤において広範に用
いられてきた。ヒドロキシ酸の報告された化粧的性質
は、改善された皮膚のキメ、改善された皮膚の艶および
堅牢性、低減されたシワ化並びに低減された色素沈着を
含む。例えば、「ベラーデスカ等，“ＡＨＡの作用メカ
ニズム”，コスメチックス・アンド・トイレトリーズ
（Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ ＆ Ｔｏｉｌｅｔｒｉｅｓ），
第１１０巻，１９９５年６月号，第３０〜３１頁」参
照。

【０００４】クエン酸とアルキルまたはアリール基との
トリエステルが、抗老化およびＵＶ保護の効果を有する
と主張されている。例えば、ナトラジ等の米国特許第
５，２４４，６６５号参照。クエン酸のトリエチルおよ
びトリブチルエステルが、光保護作用に加えて、光損傷
されたおよび／または色素過剰症の皮膚の処置において
並びに老化過程を減速させることにおいて効果があると
示されている。しかしながら、皮膚処置用組成物におけ
る使用について、ＴＣＣの使用は教示または示唆されて
いない。ナトラジ等がＴＣＣもしくはいかなる窒素また
はアミン含有のシトレートエステルを教示または示唆し
ているとは思えない。

【０００５】コリンは、すべての細胞におけるリン脂
質、スフィンゴ脂質およびスフィンゴミエリンの生合成
にとって必須栄養素である。加えて、コリンは、正常な
脂肪酸ターンオーバーに必要とされるカルニチン生合成
に対してメチル供与体として作用する。コリン欠乏は、
低減されたリポ蛋白質生合成、低減された膜ターンオー
バーおよび増大されたトリグリセリド蓄積をもたらす。
表皮におけるコリン欠乏は、異常な水バリヤーおよび不
良な皮膚状態をもたらす低いバリヤー脂質の形成をもた
らし得る。ホスファチジルコリンまたはホスホリルコリ
ンおよびそれらの誘導体の形態のコリンが、化粧品組成
物において用いられておりそして抗カビ効果、傷治癒増
進剤、乾性皮膚に対する有益性、経表皮の水の喪失の改
善、潤い付与効果、抗痙瘡効果、ＵＶ保護効果、状態調
整の有益性、保湿効果および抗炎症効果のような多数の
有益性効果を有すると主張されている。米国特許第５，
３９１，５５０号、米国特許第５、３７６、６４６号、
独国特許出願第４ ３１００１５号のアブストラクト、
日本国特許明細書第６１７９６１３号のアブストラク
ト、ソビエト連邦特許明細書第１８１１４０３号のアブ
ストラクト、欧州特許出願第０ ４７９ １２１号のア
ブストラクト、米国特許第５，１６６，１３９号参照。
特許された化合物は、ホスファチジルコリン、ホスホリ
ルコリン、アシル化コリン、スフィンゴミエリンまたは
それらの誘導体を含む。

【０００６】コリンサリチレートは、局所使用用の抗炎
症性かつ鎮痛性の薬剤として用いられている。例えば、
米国特許第４，２７５，０５９号（フロラ等）参照。

【０００７】ＴＣＣは、過去において効果的な鉄キレー
ト化剤として用いられた常用の安価な化学薬品である。
ロゼンフェルダーの米国特許第２，８６５，９３８号参
照。ＴＣＣは、動物成長ホルモン製剤を安定化するため
に（ハミルトン等の米国特許第４，８１６，５６８号参
照）並びに鉄欠乏性貧血を処置するために（フェイフ等
の米国特許第３，３９５，２２９号参照）用いられてい
る。毒性効果即ち不利益効果はこの分子に関連しておら
ず、何故ならその個々の成分即ちクエン酸およびコリン
は細胞中における天然に存在する代謝産物であるからで
ある。

【０００８】トリコリンシトレートを含有する皮膚処置
用または化粧品組成物は、開示されていない。上記に記
載された当該技術のいずれも、皮膚細胞または皮膚細胞
培養物の成長のためのＴＣＣの使用を教示しない。更
に、該技術が、皮膚細胞にとっての必須栄養素として働
くいずれかの化合物でクエン酸がエステル化されている
いかなるシトレートエステルの、化粧品組成物における
使用を教示または示唆しているとは思えない。

【０００９】ヒトの皮膚の上層即ち表皮は、ケラチノサ
イト、メラノサイトおよびランゲルハウス細胞を含めて
多くの異なる細胞タイプから構成されている。ケラチノ
サイトは、表皮の主要な細胞タイプ（ヒトの表皮におけ
る総細胞数の７５〜８０％）である。表皮内において、
ケラチノサイトは４つの異なる分化段階にて存する。基
底層は、真皮から表皮を分離する基底膜上に存する。こ
れらの細胞は、大きな円柱状の高速増殖性細胞である。
これらの基底細胞は表皮内で上方に移行し、しかしてこ
れは分化過程により開始される。基底細胞の上の層は有
棘層である。有棘層における細胞は、分化表皮の特徴的
な蛋白質の生成を開始する。有棘層の上にある顆粒層
は、電子の密な顆粒により特徴づけられる。この層は、
皮膚の水不浸透性バリヤーの形成に必要とされる脂質分
子の合成を担う。皮膚の最上層即ち角質層は、細胞小器
官の破壊により顆粒層から形成される。角質層における
細胞即ちコルネオサイトは、高抵抗性の細胞包膜により
包囲された高度に架橋された蛋白質を含有する。コルネ
オサイトは特定の脂質構造体の床中に埋められており
（モルタルの床上の煉瓦に類似している。）、そしてこ
の構造体は皮膚にとっての保護バリヤーを与える。コル
ネオサイトの最外層は、正常な落屑過程中皮膚から剥脱
される。表皮のケラチノサイトの分化は、正常な落屑過
程が起こるための駆動力である。表皮の分化は、皮膚の
必須機能を与えるために、即ち、外部環境に対する保護
バリヤーを与えるために並びに体からの水の喪失を防ぐ
ために重要である。放射性標識された基質［³ Ｈ］チミ
ジンの取込みにより決定される、ＤＮＡの合成速度は、
ケラチノサイト増殖の指標となるものである。角質化包
膜並びに角質化包膜の形成を担う酵素トランスグルタミ
ナーゼの増加は、ケラチノサイト分化の増大を指摘す
る。最高の成長速度を有する基底細胞は、最も低く分化
されるものである。角質層の最大に分化される細胞は、
増殖する能力を有さない。基底細胞の増大された増殖
は、コルネオサイトを形成するための上層細胞の分化の
駆動力である。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は部分的には、Ｔ
ＣＣが細胞増殖を誘発しかつ皮膚中の細胞脂質レベルを
増大し、しかしてこれらの両方共、改善された状態調
整、改善された若々しい外観、シワの出現の減少、潤い
付与および光損傷皮膚の外観の改善のような、皮膚に対
して増大された有益性をもたらすという発見に基づいて
いる。

【００１１】本発明は、ヒトの皮膚への局所施用のため
に適した組成物であって、必須成分として０．０００１
〜５０重量％のトリコリンシトレート、およびトリコリ
ンシトレートのための化粧上受容され得る賦形剤を含有
する上記組成物を提供する。

【００１２】賦形剤は、トリコリンシトレート（ＴＣ
Ｃ）が皮膚上に分散されそしてその中に分配されること
を可能にする。本発明によれば、ＴＣＣは、皮膚の外観
を改善するために、ケラチノサイト増殖を増大するため
並びにケラチノサイト中のリン脂質レベルを増大するた
め用いられる。

【００１３】本発明はまた、シワになった、乾燥した、
鱗状の、老化した、光損傷した皮膚の外観を改善しまた
は防ぎ並びに皮膚疾患（例えば、痙瘡または乾癬）を処
置する方法であって、ＴＣＣを含有する組成物を皮膚に
施用することを含む方法を含む。

【００１４】本発明はまた、シワになった、乾燥した、
鱗状の、老化した、光損傷した皮膚の処置のための並び
に皮膚疾患（例えば、痙瘡または乾癬）を処置するため
の薬剤の製造のための、ＴＣＣの使用を含む。

【００１５】本発明の組成物は、既に乾燥した、鱗状
の、シワになった、老化した、光損傷した状態にあるも
しくは皮膚疾患に病む哺乳類の皮膚への局所施用のため
に意図されており、あるいは本発明の組成物は、悪化を
防ぎまたは低減するために正常な健康的皮膚に予防的に
施用され得る。

【００１６】本発明はまた、シワになった、乾燥した、
鱗状の、老化した皮膚の処置並びに皮膚疾患（例えば、
痙瘡または乾癬）の処置のための薬剤の製造における、
トリコリンシトレートの使用を含む。

【００１７】

【発明の実施の形態】トリコリンシトレートは、本発明
の組成物の必須成分である。トリコリンシトレートは、
次の構造を有する。即ち、

【００１８】

【化１】

【００１９】ここで、Ｒは、構造

【００２０】

【化２】

【００２１】を有するコリン分子を表す。

【００２２】一般に、本発明の組成物中のＴＣＣの量
は、該組成物の約０．０００１重量％ないし約５０重量
％の範囲にある。好ましくは、コストを低減しかつ効果
を最大にするために、ＴＣＣの量は約０．０１％ないし
約１０％の範囲最も好ましくは０．１％ないし５％の範
囲にある。

【００２３】化粧上受容され得る賦形剤 本発明による組成物はまた、該組成物が皮膚に施用され
るとき分配を容易にするよう該組成物中のＴＣＣのため
の希釈剤、分散剤または担体として作用すべき化粧上受
容され得る賦形剤を含む。

【００２４】水以外の賦形剤は、液体または固体のエモ
リエント剤、溶媒、保湿剤、増粘剤および粉末を含み得
る。特に好ましい非水性の担体は、ポリジメチルシロキ
サンおよび／またはポリジメチルフェニルシロキサンで
ある。本発明のシリコーンは、２５℃において約１０〜
１０，０００，０００センチストークスの範囲にある粘
度を有するものであり得る。特に望ましいものは、低粘
度および高粘度のシリコーンの混合物である。これらの
シリコーンは、ジェネラル・エレクトリック・カンパニ
ー社から商標ヴィカシル（Ｖｉｃａｓｉｌ）ＳＥおよび
ＳＦ下で並びにダウ・コーニング・カンパニー社から２
００および５５０シリーズ下で入手できる。本発明の組
成物において利用され得るシリコーンの量は、該組成物
の５重量％ないし９５重量％好ましくは２５重量％ない
し９０重量％の範囲にある。

【００２５】化粧上受容され得る賦形剤は、エマルジョ
ンの通常５重量％ないし９９．９重量％好ましくは２５
重量％ないし８０重量％を形成し、そして他の化粧品用
添加剤の不存在下では該組成物の残余を形成し得る。

【００２６】随意的な皮膚有益物質および化粧用添加剤 油または油状物質が乳化剤と一緒に存在し得、しかして
用いられる乳化剤の平均親水性−親油性バランス（ＨＬ
Ｂ）に主として依存して油中水型エマルジョンまたは水
中油型エマルジョンのいずれかが与えられる。

【００２７】本発明の好ましい具体的態様において、本
発明の組成物は更に、ＴＣＣとの組合わせにおいて特に
効果がある次の成分の少なくとも１種を含む。

【００２８】セラミドおよび／または他のスフィンゴ脂
質が、本発明の組成物中に含まれ得る。適当なセラミド
およびそれらの合成類似体は、欧州特許出願５３４ ２
８６、欧州特許出願２２７ ９９４、米国特許第５，１
７５，３２１号、米国特許第４，９８５，５４７号、米
国特許第５，０２８，４１６号、米国特許第５，０７
１，９７１号、日本国特許出願第６３１９２７０３号、
米国特許第４，４６８，５１９号および米国特許第４，
９５０，６８８号に開示されており、しかしてそれらは
すべてここにおいて参照により組み込まれる。セラミド
またはそれらの合成類似体を含めたスフィンゴ脂質は、
本発明の組成物中に約０．００００１〜約５％好ましく
は約０．００００１〜約１％最適には約０．０１〜０．
５％のレベルにて存在する。

【００２９】ヒドロキシ酸は、増殖を高めるために並び
にケラチノサイトにおけるセラミド生合成を増大し、表
皮の厚さを増大し、また正常な皮膚の落屑を増大してよ
り滑らかでより若く見える皮膚をもたらすために、本発
明の組成物中に好ましくは含められる。

【００３０】ヒドロキシ酸は、α−ヒドロキシ酸、β−
ヒドロキシ酸、他のヒドロキシカルボン酸（例えば、ジ
ヒドロキシカルボン酸、ヒドロキシジカルボン酸、ヒド
ロキシトリカルボン酸）並びにそれらの混合物もしくは
それらの立体異性体（ＤＬ、ＤまたはＬ）の組合わせか
ら選ばれ得る。

【００３１】好ましくは、ヒドロキシ酸（ｉｉ）は、一
般構造

【００３２】

【化３】

【００３３】〔ここで、Ｍは、Ｈ−またはＣＨ₃ （Ｃ_f
Ｈ_g ）_h −であり、ｆは、１〜２７の整数であり、ｇ
は、２〜５４の整数であり、そしてｈは、０または１で
ある。〕を有するα−ヒドロキシ酸から選ばれる。

【００３４】更に一層好ましくは、ヒドロキシ酸は、２
−ヒドロキシオクタン酸、ヒドロキシラウリン酸、乳酸
およびグリコール酸並びにそれらの混合物から選ばれ
る。立体異性体が存在する場合、Ｌ−異性体が最も好ま
しい。

【００３５】ケト酸は、α−ケト酸、β−ケト酸および
それらの混合物から選ばれ得る。

【００３６】特に好ましいα−ケト酸は、２−ケトオク
タン酸である。

【００３７】好ましくは、本発明による組成物中に存在
するヒドロキシ酸の量は、０．０１重量％ないし２０重
量％一層好ましくは０．０５重量％ないし１０重量％最
も好ましくは０．１重量％ないし３重量％である。

【００３８】エモリエント剤は、しばしば、本発明の化
粧品用組成物中に混入される。かかるエモリエント剤の
レベルは、総組成物の約０．５重量％ないし約５０重量
％好ましくは約５重量％と３０重量％の間の範囲にあり
得る。エモリエント剤は、エステル、脂肪酸およびアル
コール、ポリオール並びに炭化水素のような一般的な化
学的範疇下で分類され得る。

【００３９】エステルは、モノまたはジエステルであり
得る。脂肪酸ジエステルの受容され得る例は、ジブチル
アジペート、ジエチルセバケート、ジイソプロピルジメ
レート（ｄｉｍｅｒａｔｅ）およびジオクチルスクシネ
ートを含む。受容され得る分枝鎖脂肪酸エステルは、２
−エチル−ヘキシルミリステート、イソプロピルステア
レートおよびイソステアリルパルミテートを含む。受容
され得る三塩基酸エステルは、トリイソプロピルトリリ
ノレエートおよびトリラウリルシトレートを含む。受容
され得る直鎖脂肪酸エステルは、ラウリルパルミテー
ト、ミリスチルラクテート、オレイルユーケート（ｅｕ
ｒｃａｔｅ）およびステアリルオレエートを含む。好ま
しいエステルは、ココ−カプリレート／カプレート（コ
コ−カプリレートおよびココ−カプレートの混合物）、
プロピレングリコールミリスチルエーテルアセテート、
ジイソプロピルアジペートおよびセチルオクタノエート
を含む。

【００４０】適当な脂肪アルコールおよび酸は、１０〜
２０個の炭素原子を有する化合物を含む。特に好ましい
ものは、セチル、ミリスチル、パルミチルおよびステア
リルアルコールおよび酸のような化合物である。

【００４１】エモリエント剤として働き得るポリオール
の中には、線状および分枝鎖のアルキルポリヒドロキシ
ル化合物がある。例えば、プロピレングリコール、ソル
ビットおよびグリセリンが好ましい。ポリプロピレング
リコールおよびポリエチレングリコールのようなポリマ
ー状ポリオールもまた、有用であり得る。

【００４２】エモリエント剤として働き得る例示的な炭
化水素は、１２〜３０個の炭素原子の炭化水素鎖を有す
るものである。特定の例は、鉱油、石油ジェリー、スク
アレンおよびイソパラフィンを含む。

【００４３】本発明の化粧品用組成物内の機能成分の別
の範疇は、増粘剤である。増粘剤は、通常、組成物の
０．１重量％ないし２０重量％好ましくは約０．５重量
％ないし１０重量％の量にて存在しよう。例示的な増粘
剤は、ビー・エフ・グッドリッチ・カンパニー社から商
標カーボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（登録商標）下で
入手できる架橋ポリアクリレート物質である。キサンタ
ン、カラジーナン，ゼラチン、カラヤ、ペクチンおよび
ローカストビーンガムのようなガムが、用いられ得る。
或る状況下では、増粘機能は、シリコーンまたはエモリ
エント剤としても働く物質により達成され得る。例え
ば、１０センチストークスを越えるシリコーンガム並び
にグリセロールステアレートのようなエステルは、二重
の機能を有する。

【００４４】種々のタイプの活性成分が、本発明の化粧
品用組成物中に存在し得る。活性物は、エモリエント剤
以外の並びに該組成物の物理的特性を単に改善する成分
以外の、皮膚または頭髪の有益剤として定義される。一
般的な例は、この範疇に制限されないけれども、サンス
クリーン剤、日焼け用剤、皮膚用抗シワ化剤、抗フケ
剤、抗痙瘡剤および毛髪成長刺激剤を含む。

【００４５】サンスクリーン剤は、紫外線を遮断するた
めに普通に用いられている物質を含む。例示的な化合物
は、ＰＡＢＡの誘導体即ちシンナメートおよびサリチレ
ートである。例えばオクチルメトキシシンナメートおよ
び２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（オキ
シベンゾンとしても知られている。）が、用いられ得
る。オクチルメトキシシンナメートおよび２−ヒドロキ
シ−４−メトキシベンゾフェノンは、それぞれ商標パー
ソール（Ｐａｒｓｏｌ）ＭＣＸおよびベンゾフェノン
（Ｂｅｎｚｏｐｈｅｎｏｎｅ）−３下で商業的に入手で
きる。エマルジョン中で用いられるサンスクリーン剤の
正確な量は、太陽ＵＶ光からの所望保護度に依存して変
えられ得る。

【００４６】多くの化粧品用組成物特に水を含有するも
のは、潜在的に有害な微生物の成長から保護されねばな
らない。それ故、保存剤が必要である。適当な保存剤
は、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル、ヒダ
ントイン誘導体、プロピオネート塩並びに種々の第４級
アンモニウム化合物を含む。

【００４７】粉末は、本発明の化粧品用組成物中に混入
され得る。これらの粉末は、白亜、タルク、フラー土、
カオリン、デンプン、スメクタイト粘土、化学変性され
た珪酸マグネシウムアルミニウム、有機変性されたモン
モリロナイト粘土、水和珪酸アルミニウム、フュームド
シリカ、アルミニウムデンプンオクテニルスクシネート
およびそれらの混合物を含む。

【００４８】他の添加剤副成分もまた、本化粧品用組成
物中に混入され得る。これらの成分は、着色剤、不透明
剤および香料を含み得る。これらの物質の量は、該組成
物の０．００１重量％から２０重量％までの範囲にあり
得る。

【００４９】本組成物の使用 本発明による組成物は、第一にヒトの皮膚への局所施用
用製品として、特に、水分喪失を低減するために並びに
一般に皮膚の質および可撓性を高めるためにおよび光損
傷皮膚の外観を改善するために特に皮膚が乾燥または損
傷している場合に皮膚の水透過性を低減するための薬剤
として意図されている。

【００５０】使用において、少量の本組成物例えば１〜
５ｍｌが皮膚の暴露域に適当な容器またはアプリケータ
ーから施用され、そして必要ならそれは次いで手または
指もしくは適当な装置を用いて皮膚に広げられおよび／
または皮膚に擦り込まれる。

【００５１】製品形態および包装 本発明の局所皮膚および／または頭髪処置用組成物は、
４，０００〜１０，０００ｍＰａｓの粘度を有するロー
ション、１０，０００〜２０，０００ｍＰａｓの粘度を
有する流動性クリームもしくは２０，０００〜１００，
０００ｍＰａｓまたはそれ以上の粘度を有するクリーム
として処方され得る。該組成物は、その粘度並びに消費
者による予定使用法に適合するよう適当な容器中に包装
され得る。例えば、ローションまたは流動性クリーム
は、ボトルもしくはロールボールアプリケーターもしく
は噴射剤駆動エアゾール装置もしくは指操作に適したポ
ンプを備えた容器中に包装され得る。該組成物がクリー
ムである場合、それは、単にチューブまたは蓋付きジャ
ーのような非変形性ボトルまたはスクィーズ容器中に貯
蔵され得る。従って本発明はまた、ここにおいて定めら
れたような化粧上受容され得る組成物を含有する閉鎖容
器を提供する。

【００５２】本発明はまた、ここにおいて参照により組
み込まれる米国特許第５，０６３，５０７号に記載され
ているもののようなカプセル中に含められ得る。

【００５３】

【実施例】次の特定の例は本発明を更に例示するが、し
かし本発明はそれらに制限されない。

【００５４】方法： 細胞培養： トリプシン処理により新生児の包皮から単離
されたヒトケラチノサイトを、分裂性ケラチノサイトコ
ロニーを確立させるため、マイトマイシンＣで処理され
た３Ｔ３マウス繊維芽細胞の存在下でダルベッコ改良イ
ーグル（ＤｕｌｂｅｃｃｏＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｅａｇｌｅ）（ＤＭＥ）ハムズ（Ｈａｍｓ）Ｆ１２
（３：１）培地／５％胎児子ウシ血清中で成長させた。
細胞は、上記の条件下でそれらの第２継代（ｐａｓｓａ
ｇｅ）まで成長されそして将来の使用のために凍結され
たままにされた。凍結された第２継代ケラチノサイトを
解凍し、そして上記の培地中に平板培養して５日間成長
させた。細胞が７０〜８０％密集していた日数５におい
て、それらをトリプシン処理しそして種々の実験のため
に血清不含培地において平板培養した。

【００５５】ケラチノサイトにおけるＤＮＡ合成速度を
決定するために用いられた方法論 培養されたケラチノサイトによる ³Ｈ−チミジンの取込
みを、ケラチノサイト増殖の検定として用いた。チミジ
ンは、動物界の遺伝情報の普遍的ライブラリーであるＤ
ＮＡのモノマーユニットである４種のデオキシヌクレオ
シドの一つである。ケラチノサイトのような体細胞の細
胞分裂に先立って、細胞分裂を受ける該細胞の完全なゲ
ノムが複製される。これは該細胞による大規模なＤＮＡ
合成を伴い、そして両娘細胞が遺伝物質の同一のコピー
を受け取ることを可能にする。細胞分裂のためにＤＮＡ
を合成しつつあるケラチノサイトの培養培地中に ³Ｈ−
チミジンが含められる場合、この標識ヌクレオシドは新
たに合成されるＤＮＡ中に取り込められる。細胞の母集
団中への³ Ｈ−チミジンの取込みの程度は、この細胞の
母集団によるＤＮＡ合成の速度に比例し、それ故それら
の細胞増殖の指標である。

【００５６】１． トリプシン処理により新生児の包皮
から単離された正常なヒトケラチノサイトを、分裂性ケ
ラチノサイトコロニーを確立させるため、マイトマイシ
ンＣで処理された３Ｔ３マウス繊維芽細胞の存在下でＤ
ＭＥ培地／５％胎児子ウシ血清中で成長させた。ケラチ
ノサイトは、上記の条件下でそれらの第３継代まで成長
された。

【００５７】２． 当該実験について、第３継代ケラチ
ノサイトを、０．０９ｍＭカルシウムを含有する、血清
不含のケラチノサイト生育培地（ＫＧＭ，カリフォルニ
ア州サンディエゴのクロネチックス社から得た。）中に
平板培養した。２０，０００〜３０，０００個の細胞が
２４穴型細胞培養平板の各小孔（穴）中に平板培養さ
れ、そして細胞が約８０％密集度に達するまで５日間成
長された。

【００５８】３． 培地を新鮮な培地に換え、そして種
々の試験物質を該培地にエタノール性原液から添加し
た。培養物中の最終エタノール濃度は、０．２％未満に
保たれた。対照培養物は試験物質を受けなかったが、し
かし０．２％エタノールが投与された。各化合物または
組合わせが、３個の別々の小孔において試験された。４
時間して、１ｕＣｉの ³Ｈ−チミジン（アメーシャム・
コープ社，Ｓｐ活性４０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を、各小孔中
の１ｍｌ培地に添加した。細胞を一夜インキュベーショ
ンし、そして２４時間の後ケラチノサイトの細胞ＤＮＡ
と関連づけられる³Ｈ−チミジンの量を下記に記載され
ているように評価した。

【００５９】４． 培地を吸引し、そして小孔を１ｍｌ
のリン酸塩緩衝食塩水で洗浄した。次いで、平板中の細
胞のＤＮＡおよび蛋白質を、１ｍｌの氷冷１０％トリク
ロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加することにより沈殿させた。
平板を氷上に３０分間放置して、沈殿過程を完了させ
た。次いでＴＣＡを吸引し、そして次いで各小孔を５％
ＴＣＡで４回洗浄した。次いで平板をフィルターパッド
上で乾燥し、そして小孔中の細胞を０．５ｍｌの０．１
Ｎ水酸化ナトリウム中に溶解した。次いでこの水酸化ナ
トリウムを、０．１Ｎ塩酸を用いて中和し、そして次い
でこの溶液（１ｍｌ総容量）をシンチレーションバイア
ルに移した。各バイアルからの５０μｌのサンプルを、
ピアス・ケミカル・カンパニー社から得たＢＣＡ蛋白質
検定試薬を用いる蛋白質検定のために用いた。８ｍｌの
シンチレーション流体（エコルーム（Ｅｃｏｌｕｍ
ｅ））をバイアル中の溶液の残部に添加し、そしてバイ
アルをシンチレーションカウンターにて計数して各バイ
アル中の放射能の量を決定した。次いで、ＤＮＡ合成速
度を、個々の小孔の各々についての細胞蛋白質１マイク
ログラム当たりの総細胞ＤＮＡ中に取り込まれた ³Ｈ−
チミジンのｃｐｍとして計算した。各グループについて
の平均および標準偏差もまた計算した。これらの数値は
また、いかなる試験化合物も受けなかった対照小孔に対
するパーセントとして表された。

【００６０】５． ＴＣＣは、シグマ・ケミカル・カン
パニー社から得られた。

【００６１】トランスグルタミナーゼ測定についての方
法論：表皮における末期分化の過程中、角質化包膜（Ｃ
Ｅ）として知られている１５ｎｍ厚の蛋白質層が、細胞
周辺の内表面上に形成される。ＣＥは、表皮において発
現された少なくとも２種の異なるトランスグルタミナー
ゼの作用により触媒されたＮ^ε −（γ−グルタミル）
リシンイソジペプチド結合の形成により一緒に架橋され
ている数多くの別個の蛋白質から構成される。トランス
グルタミナーゼ（ＴＧ−１）は表皮の分化層特に顆粒層
において豊富に発現されるが、しかし未分化の基底表皮
においては不存在である。かくしてＴＧ−１は表皮のケ
ラチノサイト分化の有用なマーカーであり、しかして高
ＴＧ−１レベルはより分化された状態を示す。ＴＧ−１
抗体を用いるＥＬＩＳＡに基づくＴＧ−１検定を、後記
の例における培養されたケラチノサイトの分化状態を評
価するために用いた。

【００６２】ＴＧ−１のレベルは、次のように測定され
た。９６穴型平板において成長されたケラチノサイトを
試験化合物で７２時間処理し、そしてそれらの細胞をＴ
Ｇ−１検定のために−２０℃にて凍結した。小孔中の細
胞のＤＮＡ含有量を、ＴＧ−１検定の前に最初に決定し
た。

【００６３】培地を吸引しそして平板をＰＢＳで１回洗
浄した後、平板のＤＮＡ含有量を、ＤＮＡ結合性発蛍光
団（ｆｌｕｒｏｐｈｏｒｅ）即ちビスベンゾイミダゾー
ル（ヘスキト３３２５８）によりかつＤＮＡに結合した
発蛍光団の４５０ｎｍにおける比蛍光を測定する（３６
０ｎｍにおいて励起）ことにより定量した。

【００６４】小孔中の細胞のＴＧ−１レベルを、ＴＧ−
１特異性モノクローナル抗体（ＢＣ１）（第１抗体）
（アメーシャム・ライフ・サイエンシズ社から得た。）
を用いてかつペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇ
Ｇ断片（第２抗体）を用いて決定した。平板をＴＢＳ
（Ｔｒｉｓ緩衝食塩水，ｐＨ８．０）中５％脱脂乳によ
り１時間塞ぎ、その後１％牛乳／ＴＢＳ中第１抗体
（１：２，０００倍希釈）で４℃にて一夜インキュベー
ションした。０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を
含有する１％牛乳／ＴＢＳで平板を３回すすいだ後、平
板を１：４０００希釈の第２抗体で室温にて２時間イン
キュベーションした。平板を、１％牛乳／ＴＢＳ／ツイ
ーン（Ｔｗｅｅｎ）で３回そしてＴＢＳで３回すすい
だ。ｏ−フェニレンジアミンおよび過酸化水素でもって
インキュベーションにより発色させた。光学密度を微量
定量平板読取機にて４１０ｎｍにて読み取り、そしてＴ
Ｇ−１レベルをＯＤ／ＤＮＡ蛍光として計算した。少な
くとも６個の別個の小孔の平均±標準偏差を、計算およ
びデータの統計的分析について用いた。結果は、対照に
対する％として表される。

【００６５】脂質レベルの分析についての方法論：試験
化合物での処理後の細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして
クロロホルム：メタノール（１：１）を用いる脂質抽出
のために１．８ｍＬの０．８８％ＫＣｌ中に当該皿から
機械的に掻き取った。クロロホルム相を分離し、窒素下
で乾燥し、そしてカラムクロマトグラフィーによる異な
る脂質クラスの分離のために２００μｌのクロロホルム
中に再懸濁させた。

【００６６】アミノプロピルカラム（ミリポア社のウォ
ーターズディビジョン）を３ｍＬのクロロホルム：イソ
プロパノール（２：１）でおよび次いで２ｍＬのヘキサ
ンで洗浄して、該カラムを状態調整した。脂質サンプル
を該カラム上に適用し、そして異なる脂質クラスを次の
溶媒系を用いて分離した。即ち、非極性脂質（コレステ
ロールおよびコレステロールエステル）を溶離するため
に２ｍｌのヘキサン：アセテート（８５：１５）、中性
脂質（セラミド、セレブロシドおよびモノグリセリド）
を溶離するために２ｍｌのクロロホルム：イソプロパノ
ール（２：１）並びに極性脂質（リン脂質および脂肪
酸）を抽出するために２ｍｌの、メタノール中２％酢
酸。

【００６７】総コレステロールをシグマ社から得たコレ
ステロール検定キットを用いて定量した。中性および極
性の脂質フラクションにおけるリン脂質の定量を、高性
能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）シリカゲル板
上に該脂質をスポットしそしてクロロホルム：メタノー
ル：酢酸（４７．５：２．２５：０．２５）中において
展開することにより行った。定量は、１０％硫酸銅およ
び８％リン酸を含有する溶液中に該ＨＰＴＬＣ板を浸し
そして１６５℃にて１５分間炭化することにより遂行さ
れた。抽出物中に当初に残存するリン脂質のマイクログ
ラム数を、反射デンシトメトリーおよびリン脂質標準物
との比較により決定した。

【００６８】ケラチノサイトのリン脂質中への ³Ｈコリ
ンの取込みの分析：コリンは、ケラチノサイトの細胞リ
ン脂質生合成にとっての必須栄養素として作用する。培
地中に存在するコリンは、リン脂質生合成のために細胞
により使い果たされる。ＴＣＣが細胞のためにコリンを
与える場合、それは、細胞リン脂質中への取込みについ
て培地中のコリンと競合しよう。細胞が ³Ｈ−標識コリ
ンでもってインキュベーションされる場合、リン脂質中
へのその取込みは、培地中の未標識コリンまたはＴＣＣ
の存在により低減されよう。かくして、リン脂質中への
³Ｈコリンの取込みの低減は、ＴＣＣがケラチノサイト
の脂質生合成のためにコリンを与えることを指摘する。

【００６９】８０％密集度まで成長されたケラチノサイ
トを、２４時間種々の薬剤（コリン、シトレート、ＴＥ
Ｃ、ＴＢＣまたはＴＣＣ）で処理しかつ１ｕＣｉ／ｍｌ
培地の ³Ｈ標識コリン（アメーシャム社から得た。）で
標識した。小孔を洗浄し、総脂質を上記に記載したよう
なブレイフ・ダイヤー（Ｂｌｅｉｇｈ Ｄｙｅｒ）法を
用いて抽出し、そしてクロロホルム相中の総計数を決定
した。それらの計数がリン脂質フラクション中にのみ存
在することを確認するために、異なる脂質フラクション
中に取り込まれた ³Ｈコリンの量を、これらのフラクシ
ョンのＴＬＣを上記の溶媒系中において展開することに
より定量し、そして当該リン脂質フラクション（当初）
中の放射能の量を、バイオスキャン（ＢｉｏＳｃａｎ）
平板読取機を用いて定量した。培地中の添加された冷た
い（ｃｏｌｄ）コリンまたはＴＣＣの量に対して ³Ｈコ
リンのｃｐｍをプロットして、ＴＣＣから供給されたコ
リンと³ Ｈコリンとの間の競合を評価した。

【００７０】例１ ケラチノサイト増殖に対するシトレートエステルの効果 ケラチノサイトＤＮＡ合成に対する、０．１μＭ〜１０
ｍＭのクエン酸、コリンまたは種々のシトレートエステ
ルへの２４時間の暴露の効果が、第１表に示されてい
る。細胞蛋白質１μｇ当たりの細胞ＤＮＡ中に取り込ま
れた ³Ｈ−チミジンのｃｐｍとして計算されたＤＮＡ合
成速度が、対照（無添加の対照）に対する％±ＳＤ（標
準偏差）として表されている。対照のｃｐｍ／μｇ蛋白
質の現実の量は、１１０３±８８であった。

【００７１】

【表１】

【００７２】これらの結果は、１０ｍＭレベルにおいて
コリンを除いてすべての薬剤がケラチノサイトのＤＮＡ
合成を阻害したことを指摘している。ＴＥＣおよびＴＢ
Ｃの両方共、１０μＭより上で阻害的であった。ＴＣＣ
は、１ｍｍまで成長阻害効果を有さなかった。ＴＣＣ
が、多分ＴＣＣ中に存在するコリンに因り、試験管内に
おいてケラチノサイトによって他のシトレートエステル
よりも許容される、ということをこの検討は指摘してい
る。１０ｍＭレベルにおいてさえコリンは、試験された
他の薬剤のすべてとは対照的に実際にわずかに成長刺激
性であった。ＴＢＣおよびＴＥＣはより低濃度において
クエン酸よりも阻害的であり、そして１ｍＭまたはそれ
以上のレベルにおいて細胞はＴＢＣまたはＴＥＣの存在
下で細胞毒性の徴候を示した。

【００７３】老化した表皮は、皮膚への低減された毛細
管循環に因り、コリン欠乏であり得る。コリン欠乏の試
験管内の系をシミュレーションするために、ケラチノサ
イトを完全培地において平板培養し、そして４８時間の
後コリン不含培地に切り換えた。次いで細胞を、該コリ
ン不含培地において種々の量のコリンまたはＴＣＣの添
加または無添加でもって５日間成長させた。ＴＣＣがこ
れらの条件下で日数５においてケラチノサイト増殖のた
めにコリンを与え得るかどうか決定するために、ＤＮＡ
中への ³Ｈチミジンの取込みの量を、前の実験において
のように決定した。小孔の蛋白質含有量もまた定量し
た。これらの因子の両方共、対照に対する％±ＳＤとし
て表した。対照についてのＤＮＡ合成および蛋白質含有
量の現実の量は、それぞれ、１４５８４±１７３７ｃｐ
ｍ／μｇ蛋白質および２１±４μｇ蛋白質／小孔であっ
た。

【００７４】

【表２】

【００７５】コリンおよびＴＣＣの両方共１μＭのよう
な低い濃度においてケラチノサイトの増殖（ＤＮＡ合成
および蛋白質含有量の両方共）を増大した、ということ
が表２から分かり得る。ＴＣＣの最高濃度（１０ｍＭ）
のみがＤＮＡ合成を阻害し、ＴＣＣのすべての他の濃度
はコリン不含培地においてケラチノサイトの成長を有意
に刺激した。このことは、ＴＣＣからのコリンが細胞膜
合成のために必要とされる必須リン脂質の合成のために
細胞に利用され得るようになることを指摘している。

【００７６】例２ ケラチノサイト分化に対するシトレートエステルの効
果： 適正な皮膚の状態調整は、表皮のケラチノサイトの
高められた増殖および分化を必要とする。種々のシトレ
ートエステルを、ケラチノサイトの末期の分化のマーカ
ーである角質化包膜（ＣＥ）の形成に対する効果につい
て試験した。シトレートエステルは、０．１５ｍＭ−Ｃ
ａを含有する培地において１ｍＭレベルにて試験され
た。レベルは、対照に対する％±ＳＤとして表される。
対照についてのＣＥ形成は、５４．４８±３１．８ｃｐ
ｍ／μｇ細胞蛋白質であった。

【００７７】

【表３】

【００７８】第３表中のデータは明らかに、コリンが角
質化包膜の形成を増大したのに対し、ＴＣＣは無効果で
あったことを指摘している。しかしながら、クエン酸お
よび他のシトレートエステルはすべて、角質化包膜の形
成を有意的に阻害した。かくして、このデータは、ＴＣ
Ｃがケラチノサイト分化に対する効果においてクエン酸
または他のシトレートエステルよりも明らかにの優れて
おり、即ちＴＣＣはケラチノサイト分化を阻害しないの
に対し、他のシトレートエステルは阻害することを示し
ている。増殖について例１において見られるように、Ｔ
ＣＣのコリン分がＴＣＣをクエン酸の分化阻害効果から
保護し得るのに対し、クエン酸の他のエステルは保護さ
れない。

【００７９】角質化包膜の形成は、包膜前駆体蛋白質の
すべてを架橋して包膜を形成させるトランスグルタミナ
ーゼ酵素の活性度により決定される。この酵素はカルシ
ウム依存性であり、そしてクエン酸およびクエン酸エス
テルのようなカルシウムキレート化剤により阻害され
る。しかしながら、角質化包膜の形成は、ＴＣＣにより
影響されなかった。これについての理由を理解するため
に、本発明者は、ケラチノサイト中のトランスグルタミ
ナーゼＩレベルに対する種々のシトレートエステルの、
これらの薬剤の種々の量での４８時間の処理後の効果を
決定した。

【００８０】

【表４】

【００８１】第４表において見られるように、コリンは
トランスグルタミナーゼを刺激したのに対し、ＴＢＣお
よびＴＥＣは該酵素を阻害した。ＴＣＣは、この酵素に
対して有意的な効果を有さなかった。それ故、トランス
グルタミナーゼに対するシトレートの負の効果はＴＣＣ
のコリンの刺激効果により中和される、と思われる。こ
のことが、ＴＢＣおよびＴＥＣが両方共分化を阻害した
のに対して、ケラチノサイト分化に対するＴＣＣの中性
効果についての理由であり得る。

【００８２】かくして、ＴＣＣは増殖を増大しかつケラ
チノサイトの分化を阻害しないのに対し、クエン酸およ
び他のシトレートエステルは増殖およびケラチノサイト
の分化の両方共阻害する。更に、ＴＣＣの栄養素成分で
あるコリンは分化を高め、しかしてこのことは、ＴＣＣ
がケラチノサイト増殖および分化に対して他のシトレー
トエステルよりも明らかに優れていることを示唆する。

【００８３】例３ ケラチノサイト脂質合成に対するシトレートエステルの
効果： ＴＣＣからのコリンがケラチノサイトのリン脂質
中に取り込まれることを直接実証するために、種々の濃
度の種々のシトレートエステル、クエン酸またはコリン
の存在下で、細胞を１ｕＣｉの ³Ｈコリン／ｍｌ培地で
４８時間標識した。細胞リン脂質中に取り込まれた ³Ｈ
コリンの量を決定し、そして対照に対する％として表し
た。対照においてリン脂質フラクション中に取り込まれ
た ³Ｈコリンの量は、２５２±ｃｐｍ／μｇ蛋白質であ
った。

【００８４】

【表５】

【００８５】これらのデータは、コリンおよびＴＣＣの
両方共細胞リン脂質中への取込みについて ³Ｈコリンと
競合することを指摘している。コリンの競合は、コリン
が取込みについて同じ分子（唯一の相違は ³Ｈ標識にあ
る。）と競合しているので予期される。ＴＣＣがコリン
と同様に作用する事実は、ＴＣＣからのコリンが細胞リ
ン脂質合成について細胞に利用され得るようになるとい
う直接的実証である。クエン酸の他のエステルおよびク
エン酸それ自体は、リン脂質フラクション中へのコリン
の取込みに対して有意的効果を有さない。

【００８６】ＴＣＣで処理された細胞がより高い脂質レ
ベルを有するかどうかを決定するために、第６表に示さ
れた次の実験を行った。ケラチノサイトを種々の濃度の
ＴＣＣで４８時間処理し、そしてそれらの細胞の脂質レ
ベルを定量した。コレステロール、脂肪酸およびリン脂
質の量を定量し、そして対照に対する％として表した。
コレステロールの量は７．３４±０．１４であり、脂肪
酸は２１．４±２．５であり、そしてリン脂質は５．８
±１．２６ｎｇ／μｇ細胞蛋白質であった。

【００８７】

【表６】

【００８８】第６表中のデータは、ＴＣＣが他の脂質の
レベルを影響することなくケラチノサイトのリン脂質レ
ベルを増大したことを指摘している。このことは、細胞
リン脂質中に優先的に取り込まれるコリンをＴＣＣが与
えるので予期されるはずである。

【００８９】上記に記載された例はすべて、ケラチノサ
イトに対する成長、分化および脂質合成の有益性を与え
る際にＴＣＣがクエン酸の他のエステルよりも有益であ
ることを明らかに実証している。要約すると、ここに記
載された例は、トリコリンシトレートがクエン酸の他の
エステルよりも優れており、また優れた抗老化、皮膚の
状態調整およびＵＶ保護の有益性を与えるための潜在性
を有することを確認している。この化合物は、体により
必要とされる２種の必須代謝産物から構成されており、
皮膚細胞内でその個々の成分に速やかに分解され、その
２種の成分の個々の有益性を与え、また安全であって高
濃度においてさえ無毒であるという利点を有する。

【００９０】例４ この例は、本発明の組成物が混入されている高内相の油
中水型エマルジョンを例示する。

【００９１】

【表７】

【００９２】例５ この例は、本発明の組成物が混入されている水中油型ク
リームを例示する。

【００９３】

【表８】

【００９４】例６ この例は、本発明による組成物が混入されているアルコ
ール性ローションを例示する。

【００９５】

【表９】

【００９６】例７ この例は、本発明の組成物を含有する別のアルコール性
ローションを例示する。

【００９７】

【表１０】

【００９８】例８ この例は、本発明の組成物が混入されているサンケアク
リームを例示する。

【００９９】

【表１１】

【０１００】例９ この例は、本発明の組合わせが混入されている非水性ス
キンケア用組成物を例示する。

【０１０１】

【表１２】

【０１０２】ここにおいて例示および記載されている本
発明の特定の形態は代表的なもののみであると意図され
ている、と理解されるべきである。本明細書において示
唆されているものを含めてしかしそれらに制限されない
で、種々の変更が、開示の明確な教示から逸脱すること
なく、例示された具体的態様においてなされ得る。従っ
て、本発明の完全な範囲を決定する際請求項が参照され
るべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アンソニー・ビンセント・ローリングス イギリス国、ダブリユ・エイ・４・３・イ ー・アール・ウオリントン、グラツプンホ ール、ブロード・レーン・４、スプリング フイールド・コテージ

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ０．０００１〜５０重量％のトリコリン
   シトレート、および化粧上受容され得る賦形剤からなる
   局所用組成物。
2. 【請求項２】 トリコリンシトレートの量が０．０１〜
   １０重量％である、請求項１に記載の組成物。
3. 【請求項３】 アルファヒドロキシ酸を更に含む、請求
   項１または２に記載の組成物。
4. 【請求項４】 皮膚におけるケラチノサイト増殖を高め
   る方法であって、請求項１から３のいずれか一項に記載
   の組成物を皮膚に施用することからなる上記方法。
5. 【請求項５】 シワになった、乾燥した、鱗状の、老化
   したまたは光損傷した皮膚の外観を処置する方法であっ
   て、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物を皮
   膚に施用することからなる上記方法。
6. 【請求項６】 皮膚のケラチノサイト中のリン脂質レベ
   ルを高める方法であって、請求項１から３のいずれか一
   項に記載の組成物を皮膚に施用することからなる上記方
   法。