PL188574B1

PL188574B1 - Kompozycja do pielęgnacji skóry

Info

Publication number: PL188574B1
Application number: PL97332430A
Authority: PL
Inventors: Stewart Paton Granger; Anthony Vincent Rawlings; Ian Richard Scott; Allan Robert Burger; Koichi Iwata; Kelly Hua Zhang
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 2005-02-28
Also published as: WO1998013020A1; AU4775897A; ES2193357T3; CZ108999A3; PL332430A1; EP0932387B1; CA2265635C; ID21932A; TW503112B; DE69719528D1; CN1253493A; CA2265635A1; DE69719528T2; CN1105554C; AU714271B2; KR100330678B1; KR20000048705A; JP2000503031A; EP0932387A1; ZA978660B

Abstract

1. Kompozycja do pielegnacji skóry, znamienna tym, ze zawiera: a) od 0,001% do 10% zwiazku wybranego z grupy skladajacej sie z retinolu, estru re- tinolu i ich mieszanin, b) 0,0001% do 50% zwiazku, który w stezeniu 100 µM hamuje co najmniej 20% LRAT lub ARAT katalizowana reakcje estryfikacji retinolu mierzone mikrosomalnym te- stem in vitro; przy czym zwiazek ten jest wybrany z grupy skladajacej sie z cyklicznych alifatycznych nienasyconych weglowodorów, diterpenów, tluszczowych hydroksyetyloimi- dazolinowych srodków powierzchniowo czynnych o wzorze: w którym R oznacza alifatyczny nasycony lub nienasycony prosty lub rozgaleziony lancuch weglowodorowy zawierajacy od 8 do 20 atomów wegla, oraz c) kosmetycznie dopuszczalny nosnik. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są kompozycje do pielęgnacji skóry zawierające pewne związki w kombinacji z retinolem i/lub estrem retinylu.

Tło wynalazku

Retinol (witamina A) jest endogennym związkiem, który występuje naturalnie w ludzkim ciele i jest niezbędny do normalnego różnicowania komórek naskórkowych. Naturalne i syntetyczne pochodne witaminy A były szeroko stosowane do leczenia różnych chorób skóry, a także były stosowane jako środki regenerujące i rewitalizujące. Kwas retinowy był stosowany do traktowania różnych stanów skóry, na przykład trądzika, zmarszczek, łuszczyc, starczych plam i przebarwień. Patrz na przykład publikacje Vahlquist, A i in. J. Invesl. Dermatol., tom 94, Holland D. B. and Cunliffe, W. J. (1990), strony 496-498; Ellis, C. N. i in., „Pharmacology of Retinols in Skin”, Vasel, Karger, tom 3 (1989), strony 249-252; Lowe, N. J. i in., „Pharmacology of Retinols in Skin”, tom 3 (1989), strony 240-248; zgłoszenie patentowe PCT WO 93/19743.

Uważa się, że stosowanie retinolu lub estrów retinolu powinno być korzystniejsze niż kwasu retinowego. Retinol występuje naturalnie w ludzkiej skórze i jest uważany za dużo

188 574 bardziej bezpieczny niż kwas retinowy. Estry retinolu hydrolizują in vivo wytwarzając retinol. Uważa się, że estry retinylu i retinol są metabolicznie przekształcane w skórze w kwas retinowy zgodnie z następującym mechanizmem:

Ester retinylu re retinol Φ kwas retinowy

Jednak, większość wewnętrznie podawanego retinolu jest szybko przekształcana w nieaktywne estry tłuszczowe przechowywane w komórkach naskórka (keratynocytach). Estryfikacja retinolu w nieaktywne estry retinylu jest osiągana w komórkach przez przeniesienie tłuszczowej grupy acylowej z acylo-CoA, katalizowane przez enzym transferaza acylo CoA retinol (ARAT) albo przez przeniesienie grupy acylowej z fOsfotydylocholiny, katalizowane przez enzym acylotransferaza lecytyna retinol (LRAT). Te reakcje estryfikacji są bardzo wydajne, w keratynocytach większość (95%) komórkowych retinoidów występuje w postaci tłuszczowych estrów retinylu. Niestety dlatego, chociaż retinol i estry retinylu są bezpieczniejsze do stosowania niż kwas retinowy, to są one mniej skuteczne niż kwas retinowy w korzystnym działaniu na skórę.

Niniejszy wynalazek jest częściowo oparty na stwierdzeniu, że pewne związki hamują reakcje estryfikacji i przez to zwiększają działanie retinolu przez zwiększenie ilości dostępnego retinolu do przekształcania w kwas retinowy. Zatem mieszanina tych związków z retinolem lub estrami retinylu naśladuje działanie kwasu retinowego, a jest bezpieczniejsza do stosowania niż kwas retinowy.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja do pielęgnacji skóry zawierająca:

a) od 0,001% do 10% związku wybranego z grupy składającej się z retinolu, estru retinolu i ich mieszanin,

b) 0,0001% do 50% związku, który w stężeniu 100 μΜ hamuje co najmniej 20% LRAT lub ARAT katalizowaną reakcję estryfikacji retinolu mierzone mikrosomalnym testem in vitro; przy czym związek ten jest wybrany z grupy składającej się z cyklicznych alifatycznych nienasyconych węglowodorów, diterpenów, tłuszczowych hydroksyetyloimidazolinowych środków powierzchniowo czynnych o wzorze:

R

Y-N—CąCHjOH w którym R oznacza alifatyczny nasycony lub nienasycony prosty lub rozgałęziony łańcuch węglowodorowy zawierający od 8 do 20 atomów węgla, oraz

c) kosmetycznie dopuszczalny nośnik.

Korzystnie kompozycja zawiera cykliczny alifatyczny nienasycony związek wybrany z grupy składającej się z alfa-damaskonu, beta-damaskonu, delta-damaskonu, izodamaskonu, damascenonu. alfa-jononu, beta-jononu, alliloalfa-jononu, izobutylojononu, alfa-metylojononu, gamma-metylojononu, brahmanolu, sandanolu, alfa-terpineolu, liralu, safrantanianu etylu i ich mieszanin.

Korzystnie kompozycja jako diterpen zawiera geranylogeraniol.

Korzystnie kompozycja zawiera ester retinylu wybrany z grupy składającej się z palmitynianu retinylu, octanu retinylu, propionianu retinylu, linoleanianu retinylu i ich mieszanin.

Korzystne związki do stosowania w niniejszym wynalazku są cyklicznymi alifatycznymi nienasyconymi węglowodorami, diterpenami, flavononami, flavonolami, tłuszczowymi hyroksyetyloimidazolinowymi środkami powierzchniowo czynnymi i ich mieszaninami. Te związki włączone w niniejszym wynalazku w kombinacje z retinolem i/lub estrem retinylu są dobrane

188 574 w oparciu o zdolność takiej kombinacji do naśladowania działania kwasu retinowego na skórę. Jeżeli związek przechodzi mikrosomalny test in vitro opisany poniżej to jest objęty wynalazkiem, nawet jeżeli nie jest eksplicite wymieniony. Innymi słowy jeżeli związek wpływa wystarczająco na LRAT lub ARAT katalizowaną reakcję estryfikacji retinolu mierzoną mikrosomalnym testem in vitro, to będzie on działał w połączeniu z retinolem lub estrem retinylu naśladując działanie kwasu retinowego na keratynocyty (komórki skóry).

Kompozycje według wynalazku mają zastosowanie w kosmetycznym sposobie traktowania skóry polegającym na zewnętrznym stosowaniu kompozycji na skórę. Kompozycje według wynalazku maja zastosowanie w kosmetycznym sposobie naśladowania działania kwasu retinowego na skórę, polegającym na zewnętrznym stosowaniu kompozycji na skórę.

Stosowane określenie „traktowanie” oznacza prewencyjne i lecznicze działanie na jeden lub więcej niż jeden z następujących stanów: przy suchości skóry, oparzeniach słonecznych skóry, występowaniu zmarszczek, starczych plam, starzeniu się skóry. Kompozycje są również użyteczne przy zwiększaniu giętkości warstwy rogowej naskórka, rozjaśnianiu barwy skóry, regulowaniu wydzielania łoju oraz ogólnej poprawie jakości skóry. Kompozycja może być stosowana dla poprawy złuszczania skóry i różnicowania naskórka.

Obecność wybranych związków w kompozycji według wynalazku zasadniczo poprawia działanie retinolu lub estru retinylu.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem włączenie skutecznej ilości związku, który w stężeniu 100 μΜ, hamuje co najmniej 20% LRAT lub ARAT katalizowaną reakcję estryfikacji retinolu mierzone testem mikrosomalnym in vitro, do kompozycji zawierających retinol lub ester retinylu, daje znaczną poprawę działania tych kompozycji.

Opis korzystnych wykonań

Kompozycje według wynalazku zawierają jako pierwszy niezbędny składnik związek wybrany z grupy składającej się z retinolu i estrów retinylu. Określenie „retinol” obejmuje między innymi następujące izomery retinolu: wszystkie izomery trans, 13-cis-retinol, 11-cis-retinol, 9-cis-retinol, 3,4-didehydroretinol. Korzystne są wszystkie izomery trans-retinolu, 13-cis-retinol, 3,4-didehydroretinol, 9-cis-retinol. Najbardziej korzystne są wszystkie izomery trans-retinolu z powodu ich szerokiej dostępności na rynku.

Ester retinylu jest estrem retinolu. Określenie „retinol” zostało zdefiniowane powyżej. Estry retinylu odpowiednie do stosowania w niniejszym wynalazku to C^-estry retinylu, korzystnie estry C2-20, a najbardziej korzystne C2, C3 i Ci6-estry z powodu ich powszechnej dostępności.

Przykłady estrów retinylu obejmują, ale nie są do nich ograniczone: palmitynian retinylu, mrówczan retinylu, octan retinylu, propionian retinylu, maślan retinylu, walerian retinylu, izowalerian retinylu, heksanonian retinylu, heptanonian retinylu, oktanonian retinylu, nonanonian retinylu, dekanonian retinylu, undekanonian retinylu, laurynian retinylu, tridekanonian retinylu, mirystynian retinylu, pentadekanonian retinylu, heptadekononian retinylu, stearynian retinylu, izostearynian retinylu, nonadekanonian retinylu, arachidonian retinylu, behenian retinylu, linoleinian retinylu, oleinian retinylu, mleczan retinylu, glikolan retinylu, hydroksykaprylan retinylu, hydroksylaurynian retinylu, winian retinylu.

Korzystne estry do stosowania w niniejszym wynalazku są wybrane z palmitynianu retinylu, octanu retinylu i propionianu retinylu z tego powodu, że są handlowo dostępne i dlatego, że są najtańsze. Linoleinian retinylu jest również korzystny z powodu jego skuteczności.

Retinoid i/lub ester retinylu jest stosowany w kompozycjach według wynalazku w ilości od 0,001% do 10%, korzystnie w ilości od 0,01% do 1%o, a najbardziej korzystnie w ilości od 0,01% do 0,5%.

Drugim niezbędnym składnikiem kompozycji według wynalazku jest związek przechodzący mikrosomalny test in vitro. Związek odpowiedni do stosowania w niniejszym wynalazku hamuje, w stężeniu 100 μΜ, co najmniej 20% LRAT lub ARAT katalizowaną reakcję estryfikacji retinolu mierzone testem mikrosomalnym in vitro. Test mikrosomalny in vitro wykorzystywano do określania czy dany związek jest odpowiedni do stosowania w niniejszym wynalazku, następująco.

188 574

W korzystnym wykonaniu wynalazku wybierany jest związek, który w stężeniu 100 μΜ hamuje co najmniej 40%, a bardziej korzystnie co najmniej 50% LRAT lub ARAT katalizowaną reakcję estryfikacji retinolu.

Test mikrosomalny in vitro

Mikrosomy otrzymano sposobem opisanym w publikacji: J. C. Saari i D. L. Bredberg, „CoA i Non-CoA Depandent Retinol Esteryfication in Retinal Figment Epithelium”: J. Biol. Chem. 263,8084-90(1988).

Roztwór zawierający 0,1 M fosforanu sodu bufor pH 7, 5 mM ditiotreitolu, 2 mg/ml albimuny surowicy bydlęcej, 40 mikromoli palmitoilu-CoA, 40 mikromoli dilauroilofosfatydylocholiny, 10 mikromoli retinolu i badany związek lub ślepy rozpuszczalnik, inkubowano przez jedną godzinę w 37°C z mikrosomalną frakcją izolowaną z pigmentowanymi retinalem bydlęcymi komórkami naskórka. Po inkubacji reakcję gwałtownie przerwano przez dodanie równej objętości etanolu, a utworzone estry retinylu (palmitynian retinylu z reakcji katalizowanej ARAT i laurynian z reakcji katalizowanej LRAT) ekstrahowano heksanem. Warstwę heksanową usuwano, odparowywano w atmosferze azotu, a pozostałość analizowano HPLC na kolumnie z odwróconą fazą 3,9 x 300 mm C18 stosując jako fazę ruchomą 80% metanol w tetrahydrofuranie, a ilość estrów określano fluorescencyjnie (naświetlanie 325 nm, emisja 480 nm). Ilość estrów utworzonych w obecności ślepego rozpuszczalnika przyjmowano jako 100% i stosowano do obliczania procentowego zahamowania tworzenia estrów dla badanych związków. Jako kontrolną próbkę podwielokrotność mikrosomów inaktywowano przez gotowanie przez 5 minut, co dawało co najmniej 95% zahamowanie tworzenia estrów?.

Cykliczne alifatyczne nienasycone węglowodory, diterpeny, flayonony, flavonole i pewne tłuszczowe hydroksyetyloimidazolinowe środki powierzchniowo czynne są przykładami związków, które spełniają wyżej opisany mikrosomalny test in vitro. Poniżej opisano te związki indywidualnie. Oczywiście inne związki nie wymienione tu explicite są włączane do kompozycji według wynalazku jeżeli tylko przechodzą opisany mikrosomalny test in vitro.

Cykliczne alifatyczne nienasycone związki

Odpowiednie cykliczne alifatyczne nienasycone związki są wybrane przy pomocy wyżej opisanego mikrosomalnego testu in vitro.

Korzystnie cykliczny alifatyczny nienasycony związek jest wybrany z cyklicznych alifatycznych nienasyconych aldehydów, ketonów, alkoholi i estrów.

Korzystne cykliczne alifatyczne nienasycone aldehydy, ketony, alkohole i estry to: alfa-damaskon, beta-damaskon, delta-damaskon, izodamaskon, damascenon, alfa-jonon, beta-jonon, alliloalfa-jonon, izobutylojonon, alfametylojonon gammma-metylojonon, brahmanol, sandanol, alfa-terpineol, lyral, etylosaffranat i ich mieszaniny. Budowa tych związków jest następująca:

ch₃.

,CH₃9 \^ch₃ alfa-damaskon

CH₃.

,ch₃

-róCHj beta-damaskon,

CH;

CH₃O delta damaskon

188 574

daraascenon :h^ch₃ ćc alfa-jonon

gamrama-metyiojonon

eafrananian etylu

188 574

Korzystnie w celu zmaksymalizowania działania przy minimum kosztów, cykliczny alifatyczny nienasycony związek jest wybrany z grupy składającej się z damaskonów i jononów o wyżej opisanej budowie.

Najbardziej korzystnie cykliczny alifatyczny nienasycony związek jest alfa-damaskonem i/lub alfa-jononem.

Cykliczny alifatyczny nienasycony związek może występować w kompozycjach według wynalazku w ilości od 0,0001% do 50% wagowych, licząc na kompozycję, korzystnie jest stosowany w ilości od 0,01% do 10%, najbardziej korzystnie od 0,1% do 5%.

Diterpeny

Diterpeny odpowiednie do stosowania w niniejszym wynalazku są tymi, które przechodzą przez wyżej opisany mikrosomalny test in vitro. Korzystnym diterpenowym związkiem jest geranylogeraniol o następującej budowie:

CH₃ CH ch₃

Diterpen może występować w kompozycjach według wynalazku w ilości od 0,0001% do 50% wagowych, licząc na kompozycję, korzystnie jest stosowany w ilości od 0,01% do 10%, najbardziej korzystnie od 0,1% do 5%.

Flavonony i flavonole

Flavonony i flavonole odpowiednie do stosowania w kompozycjach według wynalazku są tymi, które przechodzą wyżej opisany mikrosomalny test in vitro. Korzystne flavonony i flavonole są wybrane z naringeniny, auercetyny i ich mieszanin.

Budowa naringeniny i auercetyny jest następująca:

Flavonon lub flavonol może występować w kompozycjach według wynalazku w ilości od 0,0001% do 50% wagowych, licząc na kompozycję, korzystnie jest stosowany w ilości od 0,01% do 10%, najbardziej korzystnie od 0,1% do 5%.

Ouercetynę i/lub naringeninę można otrzymać z Sigma. Ekstrakty roślinne zawierające auercetynę i/lub naringeninę są również odpowiednie do stosowania w niniejszym wynalazku, na przykład z rutyna, wiesiołka, cebuli, cytryn.

188 574

Tłuszczowy hydroksyetyloimidazolinowy środek powierzchniowo czynny Tłuszczowe hydroksyetyloimidazolinowe środki powierzchniowo czynne stosowane w niniejszym wynalazku przechodzą wyżej opisany mikrosomalny test in vitro. Korzystne tłuszczowe hydroksyetyloimidazoliny mają następującą ogólną strukturę:

R

N— CHjCHjOH w której R oznacza alifatyczny nasycony lub nienasycony, prosty lub rozgałęziony wodorowęglowy łańcuch zawierający od 8 do 20 atomów węgla.

Przykłady odpowiednich tłuszczowych hydiOksyetyloimidazolin obejmują, ale nie są do nich ograniczone, kokoilohydroksyetyloimidazolinę (R pochodzi z olejowych kwasów tłuszczowych orzecha kokosowego, głównie C12 i trochę dłuższych łańcuchów), laurylohydroksyetyloimodazolinę (R = CH3(CH2)kj), mirystylohydroksyetyloimidazolinę (R = CHa(CH2)i6) i oleilohydroksyetyloimidazolinę (R = CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7).

Korzystnie R oznacza tłuszczową hydroksyetyloimidazolinę zawierająca od 8 do 18 atomów węgla, bardziej korzystnie od 11 do 18 atomów węgla. Najbardziej korzystnie tłuszczowa hydroksyetyloimidazolina jest oleilohydroksyetyloimidazoliną, ze względu na rynkową dostępność i skuteczność.

Tłuszczowa hydroksyetyloimidazolina może występować w kompozycjach według wynalazku w ilości od 0,0001% do 50% wagowych, licząc na kompozycję, korzystnie jest stosowany w ilości od 0,01% do 10%, najbardziej korzystnie od 0,1% do 5%.

Kosmetycznie dopuszczalny nośnik

Kompozycje według wynalazku zawierają również kosmetycznie dopuszczalny nośnik działający jako rozcieńczalnik, środek dyspergujący lub nośnik retinolu i/lub estru retinylu oraz N-podstawionego amidu kwasu tłuszczowego w kompozycji, w celu ułatwienia rozprowadzania gdy kompozycja jest nakładana na skórę.

Nośniki inne niż woda lub stanowiące uzupełnienie wody mogą zawierać ciekłe lub stale substancje zmiękczające skórę, rozpuszczalniki, środki nawilżające skórę, środki zagęszczające i proszki. Szczególnie korzystnym niewodnym nośnikiem jest polidimetylosiloksan i/lub polidimetylofenylosiloksan. Silikonami w wynalazku mogą być te, których lepkość mieści się w zakresie od 10 do 10000000 mm2/s (centystoksa) w 25°C. Szczególnie pożądane są mieszaniny silikonów o niskiej i wysokiej lepkości. Te silikony są dostępne z General Electric Company pod nazwami handlowymi Vicasil, SE i SF oraz z Dow Corning Company w serii 200 i 550. Ilość silikonu, który może być stosowany w kompozycjach według wynalazku mieści się w zakresie od 5% do 95%, korzystnie od 25% do 90% wagowych kompozycji.

Kosmetycznie dopuszczalny nośnik zazwyczaj stanowi od 5% do 99,9%, korzystnie od 25% do 80% wagowych kompozycji i może, w nieobecności innych kosmetycznych dodatków, tworzyć uzupełnienie składu kompozycji. Korzystnie nośnik jest co najmniej w 50%, bardziej korzystnie co najmniej 80% wagowych wodą, licząc na wagę nośnika. Korzystnie, woda stanowi co najmniej 50% wagowych kompozycji według wynalazku, najbardziej korzystnie od 60 do 80% wagowych, licząc na wagę kompozycji.

Ewentualne materiały korzystne dla skóry i dodatki kosmetyczne

Mogą występować oleje lub materiały oleiste, razem z emulgatorami w celu wytworzenia emulsji woda-w-oleju lub emulsji olej-w-wodzie, w większości w zależności od średniej równowagi hydrofilowo-lipofilowej (HLB) zastosowanego emulgatora.

Kompozycje według wynalazku korzystnie zawierają środki chroniące przed światłem słonecznym. Środki chroniące przed światłem słonecznym obejmują materiały powszechnie stosowane do blokowania światła ultrafioletowego. Przykładowymi związkami są pochodne PABA cynamoniany i salicylany. Na przykład mogą być stosowane oktylometoksycynamonian i 2-hydroksy-4-metoksybenzofenon (znany też jako oksybenzon). Oktylometoksycynamonian

188 574 i 2-hydroksy-4-metoksybenzofenon są handlowo dostępne pod nazwami handlowymi, odpowiednio, Parsol MCX i Benzophenon-3. Dokładna ilość środka chroniącego przed światłem słonecznym może się zmieniać w zależności od pożądanego stopnia ochrony przed słonecznym promieniowaniem UV.

Inny korzystny ewentualny składnik jest wybrany z niezbędnych kwasów tłuszczowych (EFAs), tj. tych kwasów tłuszczowych, które są niezbędne dla tworzenia membrany plazmatycznej wszystkich komórek. W keratynocytach brak EFA powoduje, że komórki stają się hyperproliferatywne. Uzupełnianie EFA to reguluje. EFA również zwiększają biosyntezę lipidów w epidermie i dostarczają lipidów dla tworzenia granicy naskórka. Niezbędne kwasy tłuszczowe są korzystnie wybrane z kwasu linoleinowego, kwasu γ-linolenowego, kwasu homo-γ-linolenowego, kwasu kolumbinowego, kwasu eikoza-(n-6,9,13)-trienowego, kwasu arachidonowego, kwasu timnodonowego, kwasu heksanowego i ich mieszanin.

Jeszcze inny korzystny składnik jest wybrany z azoli, np. klimbazolu, bifonazolu, klotrimazolu, ketokonazolu, mikonazolu, ekonazolu, itrakonazolu, flukonazolu, terkonazolu, butokonazolu, sulkonazolu, lionazolu i ich mieszanin. Azol może być włączany w kompozycje według wynalazku w ilości od 0,001 do 50% wagowych, korzystnie od 0,001 do 10% wagowych, najbardziej korzystnie od 0,1 do 5%.

Środki zmiękczające skórę są często włączane w kompozycje według wynalazku. Ilość takich środków zmiękczających skórę mieści się w zakresie od 0,5% do 50%, korzystnie między 5% a 30% wagowych całej kompozycji. Środki zmiękczające skórę mogą być klasyfikowane na takie ogólne chemiczne kategorie jak estry, kwasy tłuszczowe i alkohole, poliole i węglowodory.

Estry mogą być mono- i diestrami. Dopuszczalne przykłady diestrów tłuszczowych obejmują dibutyloadypinian, dietylosebacynian, diizopropylodimeranian i dioktylobursztynian. Dopuszczalne estry kwasów tłuszczowych o rozgałęzionych łańcuchach obejmują 2-etyloheksylomirystynian, izopropylostearynian i izostearylopalmitynian. Dopuszczalne trizasadowe kwaśne estry obejmują triizopropylotrilinoleinian i trilaurylocytrynian. Dopuszczalne prostołańcuchowe estry tłuszczowe obejmują palmitynian laurylu, mleczan mirystylu, eurkanian oleilu i oleinian stearylu. Korzystne estry obejmują kokokaprylanian/kapranian (mieszanka koko-kaprylanianu i koko-kapranianu), propylenoglikolomirystyloeterooctan, diizopropyloadypinian i cetylooktanian.

Odpowiednie alkohole tłuszczowe i kwasy tłuszczowe obejmują związki mające od 10 do 20 atomów węgla. Szczególnie korzystne są takie związki jak alkohole i kwasy cetylowe, mirystylowe, palmitynowe i stearylowe.

Poliole, które mogą być stosowane jako środki zmiękczające skórę to liniowe i rozgałęzione alkilopolihydroksylowe związki. Na przykład korzystne są propylenoglikol, sorbitol i gliceryna. Również użyteczne są polimeryczne poliole takie jak polipropylenoglikol i polietylenoglikol. Również szczególnie korzystne jako środki zwiększające penetrację są butyleno- i propylenoglikol.

Przykładami węglowodorów, które mogą służyć jako środki zmiękczające skórę są węglowodory o łańcuchach od 12 do 30 atomów węgla. Specyficzne przykłady obejmują olej mineralny, wazelinę, skwalen i izoparafiny.

Inną kategorią funkcjonalnych składników w kompozycjach według wynalazku są środki zagęszczające. Środek zagęszczający zazwyczaj występuje w ilościach od 0,1 do 20% wagowych, korzystnie od 0,5% do 10% wagowych kompozycji. Przykładami środków zagęszczających są sieciowane poliakrylanowe materiały dostępne pod nazwami handlowymi Carbopol z B. F. Goodrich Company. Mogą być stosowane żywice takie jak ksantan, karagenian, żelatyna, karaja, pektyna i żywica locust bean. W pewnych warunkach funkcja środka zagęszczającego może być spełniana przez materiał służący również jako silikon lub środek zmiękczający skórę. Na przykład żywice silikonowe o lepkości powyżej 10 centyskoksów i estry takie jak stearynian glicerolu mogą być dwufunkcjonalne.

Do kompozycji według wynalazku mogą być włączane również proszki. Te proszki obejmują kredę, talk, kaolin, skrobię, glinki smektytowe, chemicznie modyfikowany krzemian glinowomagnezowy, organicznie modyfikowana glinka montmorilonitowa, uwadarniany krzemian glinu, strącana krzemionka, glinowoskrobiooktenylobursztynian i ich mieszaniny.

188 574

Również inne dodatkowe mniejszościowe składniki mogą być włączane do kosmetycznych kompozycji. Te składniki obejmują środki barwiące, środki zmętniające i zapachy. Ilość tych innych dodatkowych mniejszościowych składników może zmieniać się od 0,001% aż do 20% wagowych kompozycji.

Stosowanie kompozycji

Kompozycją według wynalazku jest w pierwszym rzędzie pomyślana jako produkt do zewnętrznego stosowania na ludzką skórę, szczególnie jako środek do pielęgnacji i wygładzania skóry oraz zapobiegający lub zmniejszający widoczne zmarszczki lub starość skóry.

Przy stosowaniu mała ilość kompozycji, na przykład od 1 do 100 ml, jest nakładana na odsłonięty obszar skóry, z odpowiedniego pojemnika lub aplikatora i jeżeli to konieczne jest ona następnie rozprowadzana i/lub wcierana w skórę przy użyciu dłoni lub palców albo odpowiedniego urządzenia.

Postać produktu i opakowanie

Kompozycje do zewnętrznego traktowania skóry według wynalazku mogą być formułowane w postaci lotionu, kremu lub żelu. Kompozycja może być pakowana w odpowiedni pojemnik dopasowany do jej lepkości i przeznaczony do stosowania przez konsumenta. Na przykład lotion lub krem mogą być pakowane do butelek lub aplikatorów typu roll-on albo do urządzenia rozpylającego aerozol z propelentem lub pojemnika wyposażonego w pompkę obsługiwaną palcem. Gdy kompozycja ma postać kremu może być przechowywana w nie ulegającej deformacji butelce lub zakręcanym pojemniku, takim jak tuba lub słoik.

Kompozycja może być również zawarta w kapsułkach takich jak opisane w patencie US 5 063 057.

Korzystnie kompozycja ma postać zamykanego pojemnika zawierającego kosmetycznie dopuszczalną tutaj określoną kompozycję.

Następujące przykłady bliżej ilustrują wynalazek.

Materiały i metody

Hodowla komórkowa

Ludzkie keratynocyty, izolowane z noworodkowego naskórka przez traktowanie trypsyną wzrastały w środowisku Dulbecco Modification Eagle (DME) Hams FI2 (1:1)/10% surowica płodowa bydlęca w obecności napromieniowanych 3T3 mysich fibroplastów dla wytworzenia podzielonych kolonii keratynocytu. Komórki wzrastały w wyżej podanych warunkach do drugiego pasażu i były utrzymywane zamrożone przed dalszym użyciem. Zamrożony drugi pasaż keratynocytu odmrażano, matrycowano w powyższym medium i wzrastały przez pięć dni przed skierowaniem do bez-surowiczego medium MCDB 153 - zasadowego medium wzrostu keratynocytu (KGM) z Clonetics Corporation, San Diego, CA, zawierającego 0,15 mM Ca albo bez-surowiczego medium keratynocytu (KSFM) z GIBCO, zawierającego 0,09 mM Ca). Siódmego dnia gdy komórki były w 80-90% zlane zostały poddane działaniu trypsyny i zmatrycowane w bez-surowiczym medium dla dalszych doświadczeń.

Test tymidyny

Wprowadzanie ³H-tymidyny i proliferacja keratocytu

Wprowadzanie ³H-tymidyny do hodowanego keratynocytu było stosowane jako test proliferacji keratocytu. Tymidyna jest jednym z czterech deoksynukleozydów, które sąmonomerycznymi jednostkami DNA, uniwersalnego zbioru genetycznych informacji w świecie zwierząt. Przed podziałem komórkowym komórki somatycznej, takiej jak keratynocyt, kompletny genom komórki podczas podziału jest replikowany. Obejmuje to ogromną liczbę syntez DNA w komórce i umożliwia to obu siostrzanym komórkom otrzymanie identycznych kopii materiału genetycznego. Gdy 3H-tymidyna jest wprowadzana w hodowlanym medium keratynocytów, które syntetyzują DNA podczas przygotowywania się do podziału komórki, to znaczony nukleozyd jest wprowadzany do nowo zsyntetyzowanego DNA. Ilość wprowadzonej ³H-tymidyny do populacji komórek jest proporcjonalna do szybkości syntezy DNA przez tę populację komórek i dzięki temu wskazuje ich komórkową proliferację.

Keratynocyty (hodowane jako opisano powyżej) matrycowano w 24 otworkowych płytach stosując gęstość 20000 na otwór w 1 ml medium. Po inkubacji trwającej cztery dni albo dopóki komórki nie osiągnęły 60-70% zlania, zmieniano medium. Dodawano badany związek (potrójnie) do otworków w 24 godziny po zmianie medium i cztery godziny później dodawano

188 574 •ł aCi H-tymidyny w Z0 al medium na otwór. Komórki inkubowano przez następne 24 godziny. Medium usuwano z komórek, dodawano 10% lodowatego kwasu trichlorooctowego (TCA) i inkubowano na lodzie przez 30 minut. Komórki przemyto pięciokrotnie Z% TCA i rozpuszczono w Z00 al 0,1 M NaOH na co najmniej jedną godzinę (zazwyczaj w ciągu nocy). Preparaty neutralizowano 0,1 M HCl; Z0 al preparatu komórkowego używano do określenia całkowitej zawartości białka. Określano dezintegrację na minutę DNA znaczonego ³H przez zliczanie scyntylacyjne 900 al preparatu komórek. Wyniki wprowadzania tymidyny wyrażano jako DPM/pg białka.

Test transglutaminazy

Test.transglutaminazy i różnicowania keratynocytu

Podczas procesu końcowego różnicowania naskórka tworzona jest na wewnętrznym obwodzie komórki warstwa białka o grubości 1Z nm, znana jako zrogowaciała otoczka (CE). CE składa się z wielu oddzielnych białek, które zostały usieciowane razem przez tworzenie wiązań N^c-(γ-glutamylo)lizynoizodipeptydouyjh katalizowane przez działanie co najmniej dwóch różnych transglutaminaz wytwarzanych metodą ekspresji w naskórku. Transglutaminaza I (TGase I) jest w dostatecznej ilości wyrażana w zróżnicowanych warstwach naskórka, zwłaszcza w warstwie granularnej, ale nie występuje w ninzróżnicmwanym podstawowym naskórku. Zatem TGase I jest użytecznym znacznikiem różnicowania keratynocytu naskórka, ponieważ wysoki poziom TGase I wskazuje na bardziej zróżnicowany stan. Do oceny stanu zróżnicowania hodowlanych keratynocytów w poniższych przykładach stosowano test ELISA oparty na TGase I wykorzystujący przeciwciało TGase I.

Dla przykładu 1 stosowano następującą procedurę.

Keratynocyty (hodowane jak opisano powyżej) matrycowano w 96 otworkowych płytach, gęstość 3000 komórek na otwór w 200 pl medium. Po inkubacji przez cztery dni, zmieniano medium na medium zawierające badany związek (sześć powtórzeń na test). Komórki hodowano przez następne 72 godziny, po tym czasie medium odsysano, a matryce przechowywano w -70°C. Matryce usuwano z zamrażarki, a komórki przemywano PBS. Dodawano 100 al sterylnej wody, komórki frakcjonowano przez zamrażanie w -70°C, a następnie rozmrażanie. Komórki inkubowano przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej (R/T) w PBS/3% BSA (bufor przemywający, albumina surowicy bydlęcej), następnie płukano świeżą ilością buforu przemywającego. Komórki inkubmwanm z Z0 al pierwszego przeciwciała monoklonalnego anty-ludzka transglutaminaka mysiego przeciwciała (JgG) otrzymana z Biomedical Industries rozcieńczona 1:2000 w buforze przemywającym przez jedną godzinę, 37°C, następnie przepłukano dwukrotnie buforem przemywającym. Następnie komórki inkubowano z Z0 al drugiego przeciwciała (fragment Fab skoniugowanej peroksydazy przeciwciała mysiego IgG otrzymany z Amersham) rozcieńczonego 1:4000 w przemywającym buforze przez jedną godzinę w 37°C, następnie przepłukano dwukrotnie buforem przemywającym. Komórki inkubowano w roztworze substratu (4 mg o-fenylenodiamina i 3,3 al 30% H2O2 w 10 ml 0,1 M buforu cytrynianowego pH Z,0) przez pięć minut, R/T, w ciemności (pod folią aluminiową). Reakcje zatrzymywano przez dodanie Z0 al 4N H2SO4. Odczytywano absorbancję próbek przy 492 nm. Z sześciu powtórzeń cztery były traktowane oboma przeciwciałami, dwa były traktowane tylko drugim przeciwciałem (tj. aby określić tło wiązania enzymu skoniugowanego Ab). Ilość TGase I określano przez odejmowanie tła od odczytanych wartości dla każdego traktowania i określano średnią ± odchylenie standardowe (s.d.) dla powtórzeń poddanych działaniu obu przeciwciał.

Dla innych przykładów stosowano następującą procedurę.

Keratynocyty (hodowane jak opisano powyżej) matrycowano w 96 otworkowych płytach, gęstość 3000 komórek na otwór w 200 al medium hodowlanego. Po inkubacji przez cztery dni zmieniano medium na medium zawierające badany związek (sześć powtórzeń na test). Komórki hodowano przez następne 72 godziny, po tym czasie medium odsysano, a matryce przechowywano w -70°C. Matryce usuwano z zamrażarki, komórki frakcjonowano przez zamrażanie i rozmrażanie, a następnie komórki przemywano 3 x PBS. Komórki inkubowano przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej (R/T) w TBS/Z% buforu BSA. Komórki następnie inkubowano z 100 al monoklonalnego przeciwciała anty-ludzka transglutaminaza mysiego przeciwciała (IgG) (pierwsze przeciwciało) otrzymana z Biomedical Indu12

188 574 stries rozcieńczona 1:2000 w TBS/1% buforze BSA przez dwie godziny, 37°C, następnie przepłukano sześciokrotnie buforem (TBS/1% BSA/0,05% Tween-20). Następnie komórki inkubowano z 100 μΐ fragmentu Fab, skoniugowana peroksydaza przeciwciała mysiego IgG (drugie przeciwciało) otrzymanym z Amersham rozcieńczonym 1:-4000 w przemywającym buforze przez dwie godziny w 37°C, następnie przepłukano trzykrotnie buforem przemywającym i trzykrotnie PBS. Komórki inkubowano w roztworze substratu (4 mg o-fenylenodiamina i 3,3 ml 30% H2O2 w 10 ml 0,1 M buforu cytrynianowego, pH 5,0) przez pięć minut, w R/T, w ciemności (pod folią aluminiową). Reakcję zatrzymywano przez dodanie 50 μ l 4N H2SO4. Odczytywano absorbancję próbek przy 492 nm. Z sześciu powtórzeń cztery były traktowane oboma przeciwciałami, dwa były traktowane tylko drugim przeciwciałem (tj. aby określić tło wiązania enzymu skoniugowanego Ab). Poziom transglutaminazy I (TGase I) określano przez odejmowanie tła od odczytanych wartości dla każdego traktowania i określano średnią ± odchylenie standardowe (s.d.) dla powtórzeń poddanych działaniu obu przeciwciał.

Test DNA

Poziom TGase I stwierdzony po traktowaniu komórek powinien być zależny od ilości komórek, tj. im większa liczba komórek tym więcej stwierdzonej TGase I. Poziom TGase I był normalizowany do zawartości DNA w komórkach w tych samych otworkach aby wyeliminować różnice związane z różnicą w ilości komórek. Ilościowanie DNA jest szczególnie użytecznym wskaźnikiem dla wielu komórek, w tym komórek keratynosytu, ponieważ każda komórka ma co do zawartości i celu identyczny genom, a zatem identyczną ilość DNA. Całkowita zawartość DNA w komórkach w otworku jest wprost proporcjonalna do ilości komórek w otworku. Ilościowanie DNA było stosowane do normalizacji danych TGase I do ilości komórek.

Keratynocyty matrycowano w 96 otworkowych płytach, gęstość 3000 komórek na otwór w 200 μl medium. Po inkubacji przez cztery dni zmieniano medium na medium zawierające badany związek (sześć powtórzeń na test). Komórki hodowano przez następne 72 godziny, po tym czasie medium odsysano, a matryce przechowywano przez co najmniej 1,5 godziny w -70°C. Matryce usuwano z zamrażarki i rozmrażano przez 30 minut. Dodawano 100 μl/otwór barwnika Hoechst (1 μg/ml końcowego stężenia) i inkubowano przez 15 minut, pod przykryciem, następnie odczytywano na mierniku fluoroscencyjnym (naświetlanie 360 nm i emisja 460 nm). Roztwór barwnika usuwano, a otworki przepłukiwano PBS przygotowując do testu TGase.

Przykład 1

Kwas retinowy jest bardziej skuteczny niż retinol przy zmianie stanu różnicowania keratynocytu

Badano działanie na poziom transglutaminazy normalizowanej do zawartości DNA komórek po dodaniu kwasu retinowego (RA) i retinolu (ROH), wyniki przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1

Traktowanie	Średni TGase I/DNAx 10-⁴ ± s.d. (% kontroli)	Wartość p względem kontroli	Wartość p wzgl. 2,5 x 10-7 M ROH	Wartość p wzgl. 2,5 x 10'⁸ M ROH	Wartość p wzgl. 2,5 x 10'9M ROH
Kontrolna	2,44 ± 0,24 (100%)	-	0,001	0,001	0,001
2,5 x 10-⁷MRA	0,16 ±0,11 (7%)	0,001	0,001	0,001	0,001
2,5 x 10-7M ROH	1,14 ±0,22 (47%)	0,001	-	0,001	0,001
2,5 x 10'⁸M RA	1,34 ±0,40 (55%)	0,001	0,200	0,001	0,001
2,5 x 10·⁸ M ROH	1,89 ±0,30 (77%)	0,001	0,001	-	0,001
2,5 x 10’⁹M RA	1,87 ±0,49 (77%)	0,001	0,001	0,784	0,001
2,5 x 10’9M ROH	2,70 ±0,59 (>100%)	0,001	0,001	0,001	-

n = 3

188 574

Wszystkie badane stężenia kwasu retinowego czyli 2,5 x 10'⁷ M, 2,5 x 10'⁸ M i 2,5 x 10'⁹ M zmniejszają różnicowanie keratynocytu znacznie bardziej niż każde traktowanie retinolem, odpowiednio 2,5 x 10'7 M, 2,5 x 10‘⁸M i 2,5 x 10’⁹ M. Zmniejszenie ilości transglutaminazy było zależne zarówno od kwasu retinowego, jak i retinolu. Jest to zgodne z tym, że kwas retinowy daje większy efekt hamowania różnicowania nabłonka niż retinol.

Przykład 2

Mikrosomalna estryflkacja retinolu in vitro

Przygotowano mikrosomy jak opisano w: J. C. Saari i D. L. Bredberg, „CoA and Non-CoA Dependent Retinol Esterification in Retinal Pigment Epithelium” J. Biol. Chem. 23, 8084-90 (1988).

Roztwór zawierający 0,1 M fosforanu sodu bufor pH 7; 5 mM ditiotreitolu, 2 mg/ml albimuny surowicy bydlęcej, 40 mikromoli palmitoilu-CoA, 40 mikromoli dilauroilofosfatydylocholiny, 10 mikromoli retinolu i badany związek lub ślepy rozpuszczalnik, inkubowano przez jedną godzinę w 37°C z mikrosomalną frakcją izolowaną z pigmentowanymi retinalem bydlęcymi komórkami naskórka. Po inkubacji reakcję gwałtownie przerwano przez dodanie równej objętości etanolu, a utworzone estry retinylu (palmitynian retinylu z reakcji katalizowanej ARAT i laurynian z reakcji katalizowanej LRAT) ekstrahowano heksanem. Warstwę heksanową usuwano, odparowywano w atmosferze azotu, a pozostałość analizowano HPLC na kolumnie z odwróconą fazą 3,9 x 300 mm C18 stosując jako fazę ruchomą 80% metanol w tetrahydrofuranie, a ilość estrów określano fluorescencyjnie (naświetlanie 325 nm, emisja 480 nm). Ilość estrów utworzonych w obecności ślepego rozpuszczalnika przyjmowano jako 100% i stosowano do obliczania procentowego zahamowania tworzenia estrów dla badanych związków. Jako kontrolna próbkę podwielokrotność mikrosomów inaktywowano przez gotowanie przez 5 minut, co dawało co najmniej 95% zahamowanie tworzenia estrów. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 2.

Tabela 2

Związek	Stęż. ^M)	% hamowania ARAT	% hamowania LRAT
Oleilohydroksyetyloimidazolina	100	90	95
Oleilohydroksyetyloimidazolina	10	14	28
Kaprylohydroksyetyloimidazolina	100	-	8
Diazolidynylomocznik	100	0	0
Tiamina	100	0	0
Kafeina	100	0	0
Adenina	100	0	0
Kwas fenylobenzimidazolosulfonowy	100	0	0
Uracyl	100	0	0
Tryptofan	100	0	0
Kokoglutaminian	100	0	0
Tlenek dimetylokokoamidu	100	0	0
Kokoamfodioctan dwusodowy	100	0	0
Oleamidopropylobetaina	100	0	0
Tlenek oleoaminy	100	0	0
Sarkozynian lauroilu	100	20	0

188 574

Jak widać hydroksyetyloimidazolinowy środek powierzchniowo czynny silnie hamuje reakcję estryfikacji, podczas gdy inne środki powierzchniowo czynne i inne związki heterocykliczne były zasadniczo nieaktywne. Kaprylohydroksyetyloimidazolina (R=CH3(CH,)6) niewystarczająco hamuje LRAT.

Przykład 3

Powtórzono przykład 2 z różnymi hydroksyetyloimidazolinowymi środkami powierzchniowo czynnymi o grupach R wskazanych w tabeli 3. Otrzymane wyniki przedstawiono również w tabeli 3.

Tabela 3

Grupa R	Stężenie (mikromole)	% hamowania ARAT	% hamowania LRAT
Oleil	100	90	90
Oleil	10	15	12
Lauryl	100	53	47
Lauryl	10	0	0
Koko	100	68	65
Koko	10	0	0

Wyniki z tabeli 3 pokazują względną aktywność oleil > koko > lauryl. Grupa koko jest prawdopodobnie lepsza, ponieważ nie jest czystą grupą C12, ale zawiera również trochę dłuższych łańcuchów alkilowych.

Dane z tabeli 2 dla kaprylohydroksyetyloimidazoliny pokazują tylko 8% hamowanie przy 100 mikromolach. Te dane razem wzięte wyraźnie pokazują względną aktywność oleil > koko > lauryl > kapryl.

Przykład 4

Przeprowadzono test translutaminazy stosując oleilohydroksyetyloimidazolinę (OHI), kwas retinowy (RA), retinol (ROH) i palmitynian retinylu (RP).

Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 4.

Tabela 4

Przykład	Związek(ki)	Stężenie (mikromole)	% kontroli
1	RA	0,25	35,1
1	ROH	0,25	76,2
1	OHI	1	80,7
1	ROH + OHI	0,25 + 1	45,1
2	RA	0,25	43,4
2	ROH	0,025	91,6
2	OHI	1	78,2
2	ROH + OHI	0,025 + 1	57,9
3	RA	0,25	45,9
3	RP	0,25	91,6
3	OHI	1	91,1
3	RP + OHI	0,25 + 1	71,6

188 574

Widać z wyników zamieszczonych w tabeli 4, że kwas retinowy zasadniczo zmniejsza różnicowanie keratynocytu podczas gdy retinol, oleilohydroksyetyloimidazol i palmitynian retinylu nie działają na różnicowanie keratynocytu gdy są stosowane pojedynczo albo działają w znacznie mniejszym stopniu niż kwas retinowy.

W doświadczeniach 1 i 2 gdy retinol był połączony z oleilohydroksyetyloimidazoliną, wynik różnicowania keratynocytu był synergistyczne zmniejszony, do poziomu działania kwasu retinowego.

W doświadczeniu 3, gdy oleilohydroksyetyloimidazoliną była połączona z palmitynianem retinylu, wynik nie był tak dramatyczny jak w doświadczeniu 1 i 2, ale jednak zaobserwowano synergistyczne zmniejszenie.

Ten przykład również potwierdza, że związek, który przechodzi opisany tutaj mikrosomalny test in vitro ma działanie na keratynocyty w połączeniu z retinolem w ilości podobnej do działania kwasu retinowego.

Przykład 5

Prowadzono mikrosomalny test in vitro dla związków określonych w tabelach 5A i 5B. Związki z Tabeli 5A były badane w stężeniu 100 pM. Związki z Tabeli 5B były badane w stężeniu 10 pM.

Tabela 5A

Związek	% zahamowania, ARAT	% zahamowania, LRAT
Alfa-damaskon	83	98
Beta-damaskon	84	92
Delta-damaskon	87	95
Izodamaskon	80	92
Damascenon	70	79
Alfa-jonon	45	49
Beta-jonon	22	24
Allilo-alfa-jonon	22	36
Izobutylojonon	8	45
Alfa-metylojonon	67	77
Gamma-metyloj onon	21	38
Brahmanol	70	75
Sandanol	15	43
Alfa-terpineol	26	25
Timberol	34	33
Lyral	76	71
Tonalid	50	33
Etylosfflranian	51	49
Traseolid	41	21
Sandalon	23	12

188 574

Tabela 5B

Związek	% zahamowania, ARAT	% zahamowania, LRAT
Alfa-damaskon	67	87
Beta-damaskon	45	52
Delta-damaskon	58	64
Damascenon	23	29
Allil-alfa-jonon	16	17

Jak widać z wyników podanych w tabelach 5A i 5B określone cykliczne alifatyczne nienasycone związki są silnymi inhibitorami estryfikacji retinolu katalizowanej LRAT i ARAT.

Przykład porównawczy 6

Przeprowadzono mikrosomalny test in vitro dla dalszych cyklicznych nienasyconych związków. Wyniki przedstawiono w tabeli 6. Związki z tabeli 6 były badane w stężeniu 100 pM.

Tabela 6

Związek	% zahamowania, ARAT	% zahamowania, LRAT
Dihydro-alfa-jonon	13	18
Alfa-jonol	0	0
Beta-jonol	0	0
Cynamaldehyd	0	0
Vanilina	0	0
Eukaliptol	0	0
Mentol	0	0
Tymol	0	0
Karvon	0	0
Kamfor	0	0
Menton	0	0
Alkohol fenchylowy	12	4
Izocyklogeraniol	18	16
Dimetylojonon	0	9
Delta-metyloj onon	0	10

Jak widać z wyników tabeli 6 nie wszystkie cykliczne alifatyczne nienasycone związki hamują lub znacznie hamują L.RAT lub ARAT katalizowaną reakcję estryfikacji retinolu.

Przykład 7

Badano działanie na różnicowanie keratynocytu związków i kombinacji przedstawionych w tabeli 7. Wyniki wyrażono jako % kontroli. Ilość transglutaminazy była normalizowana do DNA. Dane pochodzą z dwóch eksperymentów, w których zmieniano stężenie retinolu. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 7.

188 574

Tabela 7

Przykład	Traktowanie	Stężenie mM	% kontroli
1	Kwas retinowy	0,00025	24
k	Retinol	0,001	67
1	α-damaskon	1	92
k	Retinol + α-damaskon	0,001 + k	34
2	Kwas retinowy	0,00025	8
2	Retinol	0,00025	63,5
2	α-damaskon	1	86
2	Retinol + α-damaskon	0,00025 + 1	30

Wynikł z tabeli 7 pokazują, że sam α-damaskon i sam retinol nie są bardzo skuteczne, ale ich kombinacja daje synergistyczne zmniejszenie transglutaminazy naśladując działanie kwasu retinowego na różnicowanie keratynocytu. Ten przykład również obrazuje dobrą korelację między mikrosomalnym testem a danymi z hodowli komórek.

Przykład 8

Przeprowadzono mikrosomalny test in vitro z diterpenowymi związkami: geranylogeraniolem i farnezolem. Wyniki przedstawiono w tabeli 8.

Tabela 8

Związek	Stężenie (μΜ)	% hamowania ARAT	% hamowania LRAT
Geranylogeraniof	K00	81	77
Geranylogeraniol	10	38	K6
FarnezoP	100	43	43
Farnezol	10	20	10

otrzymany z TCI America (Portland. Oregon). Dostępny również z Sigma i CTC Organics (Atlanta, Georgia) dostępny z Givaudan Co., Bedoukian Co. lub Dragoco Co.

Jak widać z wyników tabeli 8 oba związki, geranylogerąniol i farnezol, hamują estryfikacje retinolu. Geranylogeraniol znacznie silniej hamuje estryfikacje niż farnezol, którego struktur jest następująca:

Przykład 9

Badano wprowadzanie ³H-tymidyny zgodnie ze sposobem opisanym w części dotyczącej materiałów i metod, powyżej. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 9A i 9B.

188 574

Tabela 9A

Doświadczenie 1
Traktowanie	DPM/mikrogram białka	% kontroli
	Średnia	(s.d.)
Kontrola		(278)	100
250 nM retinol	2082	(146)	108
250 nM kwas retinowy	3013	(226)	156
250 nM retinol + 10 nM geranylogeraniol	2970	(308)	154

Tabela 9B

Doświadczenie 2
Traktowanie	DPM/mikrogram białka	% kontroli
	Średnia	(s.d.)
Kontrola		(322)	100
250 nM retinol	974	(148)	107
250 nM kwas retinowy	1494	(45)	163
250 nM retinol + 10 nM geranylogeraniol	1450	(318)	159

Jak widać z powyższych wyników geranylogeraniol jest zdolny do znacznego zmniejszenia proliferacji zwiększając działanie retinolu do poziomu podobnego do tego, który można osiągnąć z porównywalną ilością kwasu retinowego. Znowu widać dobrą korelację wyników między mikrosomalnym testem in vitro a działaniem związku na hodowlę komórek.

Przykład 10

Przeprowadzono mikrosomalny test in vitro na związkach przedstawionych w tabeli 10. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 10. Związki z tabeli 10 badano w stężeniu 100 μM.

Tabela 10

Związek	% hamowania ARAT	% hamowania LRAT
Kontrolna	0	0
Naringenina	33	14
Quercetyna	25	14

Przykład 11

Naringenina i retinol synergistycznie hamują różnicowanie keratynocytu

Badano działanie na poziom TGase I normalizowanej do zawartości DNA w komórkach jako odpowiedź po 72 godzinach od traktowania badanymi związkami. Wyniki przedstawiono w tabeli 11. Naringeninę otrzymano z Sigma.

188 574

Tabela 11

Działanie retinolu i naringeniny na TGase I/DNA keratynocytu

Traktowanie	Średni TGase/DNA x 10Z ± s.d. (% kontroli)	Wartość p wzgl. kontroli	Wartość p wzgl. 2,Z x 10’9 M ROH	Wartość p wzgl. 2,Z x 10-7MRA	Wartość p wzgl. 2,Z x 10-7 M naringenina
Kontrolna	Z2,78 ± Z,69 (100%)	-	0,23Z	0,001	0,329
2,Z x 10’7mRA	22,47 ±2,31 (42%)	0,001	0,001	-	0,001
2,Z x 10’⁷M Retinol	48,31 ±5,31 (92%)	0,23Z	-	0,001	0,Z8Z
10’7m naringenina	49,84 ± 2,76 (94%)	0,329	0,Z8Z	0,001	-
2,Z x 10'9mROH + 10’7m naringenina	27,61 ± 10,79 (Z3%)	0,002	0,00Z	0,328	0,002

n= 3

Jak widać z danych z tabeli 11 2,Z x 10‘⁷ M kwas retinolowy był bardzo skuteczny przy zmniejszaniu poziomu TGase I keratynocytu (do 42% ilości kontrolnej). 2,Z x 1W⁹ M retinol był nieskuteczny (91%) i 10’7 M naringeniny nie miało efektu hamowania ilości TGase I keratynocytu gdy były stosowane pojedynczo. Jednak kombinacja 2,Z x 10⁹ M retinolu +107 M naringeniny zmniejszały poziom TGase I keratynocytu do Z3% ilości kontrolnej. Zatem naringenina i retinol działają synergistycznie zmniejszając różnicowanie keratynocytu w sposób analogiczny do działania kwasu retinowego.

Przykład 12

Naringenina i palmitynian retinylu synergistycznie hamują różnicowanie keratynocytu

Badano działanie na poziom TGase I normalizowanej do zawartości DNA w komórkach jako odpowiedź po 72 godzinach od traktowania badanymi związkami. Wyniki przedstawiono w tabeli 12.

Tabela 12

Działanie palmitynianu retinylu i naringeniny na Tgase/DNA keratynocytu

Traktowanie	Średni TGase/DNA x 10Z ± s.d. (% kontroli)	Wartość p wzgl. kontroli	Wartość p wzgl. 2,Z x 10-8 M RP	Wartość p wzgl. 2,Z xę10-7M RA	Wartość p wzgl. 2,Z x 10'8M naringenina
Kontrolna	Z0,64 ± 1,74 (100%)	-	0,143	0,001	0,001
2,Z x 10’7mRA	16,31 ±5,28 (32%)	0,001	0,001	-	0,001
2,Z x 10’⁸M Palmitynian Retinylu	47,32 ± 4,22 (93%)	0 143		0,001	0,Z29
10’⁸ M naringenina	4Z,01 ± 1,90 (89%)	0,001	0,296	0,001	-
2,Z x 10'⁸ M RP + 10'⁸ M naringenina	43,12 ± 13,01 (8Z%)	0,00Z	0,036	0,001	0,06Z

n = 3

188 574

Jak widać z danych z tabeli 12 2,5 x 10-7 M kwas retinolowy był bardzo skuteczny przy zmniejszaniu poziomu TGase I keratynocytu (do 32% ilości kontrolnej). 2,5 x 10'⁹ M palmitynian retinylu był nieskuteczny (93%) i 10 M’⁸ naringeniny miało mały efekt hamowania poziomu TGase I kratynocytu gdy były stosowane pojedynczo. Jednak kombinacja 2,5 x 10’8m retinolu +10’⁸ M naringeniny zmniejszały poziom TGase I keratynocytu do 85% ilości kontrolnej. Zatem naringenina i palmitynian retinylu działają synergistycznie zmniejszając różnicowanie keratynocytu w sposób analogiczny do działania kwasu retinowego.

Przykład 13

Quercetyna i retinol synergistycznie hamują różnicowanie keratynocytu

Badano działanie na poziom TGase I normalizowanej do zawartości DNA w komórkach jako odpowiedź po 72 godzinach od traktowania badanymi związkami. Wyniki przedstawiono w tabeli 13. Quercetynę otrzymano z Sigma.

Tabela 13

Działanie retinolu i quercetyny na Tgase/DNA keratynocytu

Traktowanie	Średni TGase/DNA x 10⁵ ± s.d. (% kontroli)	Wartość p wzgl. kontroli	Wartość p wzgl. 2,5 x 10’7 M ROH	Wartość p wzgl. 2,5 x 10'⁷M RA	Wartość p wzgl. 2,5 x 10’7 M naringenina
Kontrolna	69,16 ±4,26 (100%)	-	0,042	0, 001	0,003
2,5 x 10’⁷MRA	35,91 ±3,01 (52%)	0,001	0,001	-	0,001
2,5 x 10’⁷M Retinol	61,93 ±5,18 (90%)	0,042	-	0,001	0,328
10'6 M quercetyna	59,04 ±3,38 (85%)	0,003	0,328	0,001	-
2,5 x 10’⁷MROH +	48,45 ± 8,60	0,001	0,017	0,015	0,034
10'6 M quercetyna	(70%)

n = 3

Jak widać z danych z tabeli 13 2,5 xi0’7 M kwas retinolowy był skuteczny przy zmniejszaniu poziomu TGase I keratynocytu (do 52% ilości kontrolnej). 2,5 x 10’⁷ M retinol był nieskuteczny (90%) i 10’⁶ M guercetyny miały tylko mały efekt hamowania ilości TGase I kratynocytu gdy były stosowane pojedynczo. Jednak kombinacja 2,5 x 10’7 M retinolu +10-6 M naringeniny zmniejszała ilość TGase I keratynocytu do 70% ilości kontrolnej. Zatem quercetyna i retinol działają synergistycznie zmniejszając różnicowanie keratynocytu w sposób analogiczny do działania kwasu retinowego.

Podczas tych badań kwas retinowy był stosowany jako wzorzec pozytywny poziom odniesienia, do którego były porównywane inne związki. Kwas retinowy w dawce zmniejszającej poziom transglutaminazy I w keratynocytach skóry. Innymi słowy kwas retinowy zmniejsza różnicowanie keratynocytu. Retinol i palmitynian retinylu były znacznie mniej skuteczne niż kwas retinowy w hamowaniu różnicowania keratynocytu.

Nieoczekiwanym wynikiem zobrazowanym w powyższych przykładach było to, że skutek retinolu lub estru retunylu na hodowlane keratynocyty może być zwiększony do poziomu osiąganego przez kwas retinowy przez połączenie retinolu lub estru retinylu ze związkiem, który jest od 0,0001% do 50% związkiem hamującym w stężeniu 100 μΜ co najmniej 20% LRAT lub ARAT katalizowaną reakcję estryfikacji retinolu mierzone mikrosomalnym testem in vitro. Ten efekt jest nie tylko większy niż efekt retinolu lub estru lub związku stosowanych pojedynczo, ale dwa składniki działają synergistycznie zwiększając odpowiedź typu kwasu retinowego na keratynocytach.

Przedstawione wyżej wyniki pokazują, że związki, które przechodzą mikrosomalny test in vitro działają synergistycznie z retinolem i estrami retinylu zmniejszając różnicowanie ke188 574 ratynocytu i/lub zwiększając proliferacje keratynocytu, naśladując efekt działania na keratynocyty kwasu retinowego.

Przykłady 14-19 ilustrują kompozycje do stosowania zewnętrznego według wynalazku. Kompozycje mogą być wytwarzane w konwencjonalny sposób. Są one odpowiednie do stosowania kosmetycznego. W szczególności kompozycje są odpowiednie do nakładania na skórę ze zmarszczkami, szorstką, suchą, zwiotczałą, postarzałą i/lub zniszczoną promieniowaniem UV, aby poprawić wygląd skóry i odczucia, jak też do stosowania na zdrową skórę dla zapobiegania lub opóźniania jej niszczenia.

Przykład 14

Ten przykład ilustruje emulsje z wewnętrzną fazą woda-w-oleju zawierającą kompozycję według wynalazku.

Składnik	% wagowy
	A	B	C	D
Retinol	0,5	-	-	0,01
Palmitynian retinylu	-	0,15	0,15	-
W pełni uwodorniony olej kokosowy	3,9	3,9	3,9	3,9
Naringenina	-	5	0,1	5
Cjuercetyna	1	1	-	-
Brij 92*	5	5	5	5
Bentone 38	0,5	0,5	0,5	0,5
MgSO„ · 7H₂O	0,3	0,3	0,3	0,3
Butylowany hydroksytoluen	0,01	0,01	0,01	0,01
Zapach	qs	qs	qs	qs
Woda	do 100	do 100	do 100	do 100

*Brij 92 jest polioksyetylenowanym (2)oleiloeterem

Przykład 15

Ten przykład ilustruje krem typu olej-w-wodzie zawierający kompozycję według wynalazku.

Składnik	% wagowy
	A	B	C	D
1	2	3	4	5
Palmitynian retinylu	-	0,15	0,15	-
Retinol	0,15	-	0, 001	0,15
Olej mineralny	4	4	4	4
α-jonon	1	-	-	1
α-metylojonon	-	0,5	-	-
Lyral	-	-	-	0,2
Izodamaskon	-	-	0,3	-
Brij 56*	4	4	4	4

188 574 ciąg dalszy tabeli

1	2	3	4	5
Alfol 16RD**	4	4	4	4
Trietanoloamina	0,75	0,75	0,75	0,75
Butano-l,3-diol	3	3	3	3
Żywica ksantanowa	0,3	0,3	0,3	0,3
Zapach	qs	qs	qs	qs
Butylowany hydroksytoluen	0,01	0,01	0,10	0,01
Woda	do 100	do 100	do 100	do 100

* Brij 56 jest alkoholem cetylowym POE (10) **Alfol 16RD jest alkoholem cetylowym

Przykład 16

Ten przykład ilustruje alkoholowy lotion zawierający kompozycję według wynalazku.

Składnik	% wagowy
	A	B	c	D
Retinol	-	0,15	0,15	-
Palmitynian retinylu	0,15	-	-	0,15
α-damaskon	0,1	-	0,1	-
Geranylogeraniol	-	1	-	0,2
Etanol	40	40	40	40
Zapach	qs	qs	qs	q^s
Butylowany hydroksytoluen	0,01	0,01	0,01	0,01
Woda	do 100	do 100	do 100	do 100

Przykład 17

Ten przykład ilustruje inny alkoholowy lotion zawierający kompozycję według wynalazku.

Składnik	% wagowy
Retinol	0,15
O leilohydroksyetylo imidazolin	0,1
Etanol	40
Przeciwutleniacz	0.1
Zapach	qs
Woda	do 100

188 574

Przykład 18

Ten przykład ilustruje krem przeciwsłoneczny zawierający kompozycję według wynalazku.

Składnik	% wagowy
Palmitynian retinylu	0,01
Kokoilohydroksyetyloimidazolina	0,1
Olej silikonowy 200 cts	7,5
Glicerylomonostearynian	3
Alkohol cetostearylowy	1,6
Alkohol polioksyetyleno-(20)-cetylowy	1,4
Żywica ksantanowa	0,5
Parsol 1789	1,5
Oktylometoksycynamonian (PARSOL MCX)	7
Zapach	qs
Barwnik	qs
Woda	do 100

Przykład 19

Ten przykład ilustruje nie-wodną kompozycję do pielęgnacji skóry zawierająca kompozycję według wynalazku.

Składnik	% wagowy
Palmitynian retinylu	0,15
Lauroilohydroksyetyloimidazol	1
Żywica silikonowa SE-30¹	10
Płynny silikon 3452	20
Płynny silikon 344^{1 2 3}	55,79
Skwalen	10
Kwas linolenowy	0,01
Cholesterol	0,03
Kwas 2-hydroksy-n-oktanolowy	0,7
Linoleinian witaminy E	0,5
Olejek herbaciany	0,5
Etanol	2

¹ polimer dimetylosilikonowy o ciężarze cząsteczkowym co najmniej 50000 i lepkości co najmniej 10000 centystoksów, w 25°C dostępny z firmy GEC ² dimetylosiloksąn cykliczny pentamer, dostępny z firmy Dow Corning Corp.

³ dimetylosiloksan tetramer, dostępny z firmy Dow Corning Corp.

188 574

Jeżeli nie zaznaczono inaczej w przykładach, materiały stosowane w niniejszym wynalazku otrzymano z następujących źródeł:

- Palmitoil CoA, BSA, dilauroilofospatydylocholinę, retinol, ditriotreitol kwasu retinowego z Sigma.

Cykliczne alifatyczne nienasycone związki:

- damaskony z Firmenich;

- jonony z IFF;

- inne od dostawców „Flavor and Frangamce Materiale” 1991, Allured Pub. Co.

Imidazolinowe środki powierzchniowo czynne:

- oleiloimidazoliną była Schercozolina O z Scher Chemical Co.;

- inne z Mclntyre pod nazwą handlową Mackazoline, odpowiednio kaprylo-, koko- i laurylo Mackazoline CY, C i L.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja do pielęgnacji skóry, znamienna tym, że zawiera:

a) od 0,001% do 10% związku wybranego z grupy składającej się z retinolu, estru retinolu i ich mieszanin,

b) 0,0001% do 50% związku, który w stężeniu 100 μΜ hamuje co najmniej 20% LRAT lub ARAT katalizowaną reakcję estryfikacji retinolu mierzone mikrosomalnym testem in vitro; przy czym związek ten jest wybrany z grupy składającej się z cyklicznych alifatycznych nienasyconych węglowodorów, diterpenów, tłuszczowych hydroksyetyloimidazolinowych środków powierzchniowo czynnych o wzorze:

R

N—CHjCHjOH w którym R oznacza alifatyczny nasycony lub nienasycony prosty lub rozgałęziony łańcuch węglowodorowy zawierający od 8 do 20 atomów węgla, oraz

c) kosmetycznie dopuszczalny nośnik.
2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera cykliczny alifatyczny nienasycony związek wybrany z grupy składającej się z alfa-damaskonu, beta-damaskonu, delta-damaskonu, izodamaskonu, damascenonu, alfa-jononu, beta-jononu, alliloalfa-jononu, izobutylojononu, alfa-metylojononu, gamma-metylojononu, brahmanolu, sandanolu, alfa-terpineolu, liralu, safrantanianu etylu i ich mieszanin.
3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jako diterpen zawiera geranylogeraniol.
4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera ester retinylu wybrany z grupy składającej się z palmitynianu retinylu, octanu retinylu, propionianu retinylu, linoleanianu retinylu i ich mieszanin.