JP2004522729A - 2区画パッケージにレチノイドとレチノイドブースター系とを含有する安定なスキンケア製品 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は、2区画パッケージにレチノイドとレチノイドブースター系とを含有する安定なスキンケア組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
レチノイド(例えばレチノールおよびレチニルエステル)は、化粧品に用いられる通常の成分である。レチノール(ビタミンA)は、人体に自然発生する内生化合物であり、正常な上皮細胞分化にとって必須である。天然および合成ビタミンA誘導体は、多様な皮膚障害の治療に広範囲に用いられており、皮膚の修復または再生剤として用いられてきた。レチノイン酸は、多様な皮膚の状態、例えばにきび、小じわ、乾癬、加齢斑、および変色を処理するために用いられて来た。例えばVahlquist,A.ら、J.Invest.Dermatol.第94巻、Holland D.B.およびCunliffe、W.J.(1990)、496〜498ページ、Ellis,C.N.ら、「皮膚におけるレチノールの薬理学(Pharmacology of Retinols in Skin)」、Basel、Karger、第3巻、(1989)、249〜252ページ、およびPCT特許出願第WO93/19743号参照。
【0003】
しかしながらレチノールは、化粧品配合物中では特に不安定であるが、その理由は、レチノールが、酸化、熱不安定性、およびUV誘発分解を含む多くの要因の結果として化学分解を受けることがあるからである。レチニルエステルも、レチノールよりも小さい程度であるが、これらの不安定性の影響を受けやすい。
【0004】
皮膚へのレチノイドの効果は、レチノイドブースター分子の同時使用によって向上させることができる。しかしながらレチノイドブースター分子の全部ではなくてもその多くは、レチノールの不安定性も増す。したがってレチノイドとレチノイドブースター分子との両方を含む効果的なスキンケア組成物を有するために、レチノイドを単独で含む配合物に必要とされる程度よりも高い程度まで、ブースターを含むレチノイド配合物を保護する必要がある。
【0005】
したがって単にレチノイドの安定性のみならず、レチノイド効果を高める活性物質の存在下におけるレチノイドの安定性についても問題がある。化粧品組成物におけるレチノイド安定性の問題を解決しようとするいくつかの方法が、先行技術に存在する。例えば組成物を供給するための多区画系は、本発明の譲受人に発行された米国特許第5,914,116号に記載されている。特にこの特許は、1つの区画にレチノイドが入っており、第二区画に第二効果を与える第二活性物質が入っている、二重皮膚効果を与えるための2つの異なる皮膚活性物質を分離するための2つの分かれた容器について記載している。
【0006】
ジョンソン・アンド・ジョンソン社(Johnson & Johnson)に譲渡された米国特許第5,976,555号は、レチノイド、乳化剤系、および共乳化剤を含む水中油型エマルジョンを含むスキンケア組成物を開示している。この特許は、この組成物が酸素と接触しないように組成物を保存するための容器の使用について記載している。この容器は、乳化剤系と共乳化剤のみを有するレチノイド組成物への使用のために記載されており、レチノイドブースターとの接触による分解からレチノイドを保護していない。
【0007】
ロレアル社(L’Oreal)に譲渡された米国特許第5,800,596号は、酸素またはUV光に対して不浸透性の障壁と酸素捕捉装置とを有する調剤装置におけるレチノールを含む油中水型エマルジョンを開示している。この特許は、ブースターの使用、およびブースターの存在下におけるレチノイド安定性に関連した問題について教示も示唆もしていない。
【0008】
上記の引例のいずれも、活性物質を強化するレチノイドの存在下におけるレチノイド組成物を安定化する必要性について、教示も示唆もしていない。したがって、二重目的の単一配合物化粧品が先行技術において開発されてはいるが、単独の、ならびにレチノイドブースターの存在下におけるレチノイド安定性の現存する問題を軽減する安定化粧品組成物に対するニーズが依然として存在する。
【0009】
本発明は、下記の:
約0.001%から約10%のレチノイドを含む第一組成物;
約0.0001%から約50%の少なくとも1つのレチノイドブースターを含む第二組成物;
第一組成物を収容する第一区画であって、第一組成物が酸素と接触しないようにしておく区画;および
第二組成物を収容する第二区画であって、第一区画と第二区画とが互いに接合されている区画、
から成る安定なスキンケア製品を提供する。
【0010】
本発明の組成物は、好ましい成分としてレチノイドを含んでいる。これは、レチニルエステル、レチノール、レチナール、およびレチノイン酸から選ばれ、好ましくはレチノールまたはレニチルエステルである。「レチノール」という用語には、レチノールの下記の異性体が含まれる。すなわち、オール−トランス−レチノール、13−シス−レチノール、11−シス−レチノール、9−シス−レチノール、3,4−ジデヒドロ−レチノール、3,4−ジデヒドロ−13−シス−レチノール、3,4−ジデヒドロ−11−シス−レチノール、3,4−ジデヒドロ−9−シス−レチノールである。好ましい異性体は、オール−トランス−レチノール、13−シス−レチノール、3,4−ジデヒドロ−レチノール、9−シス−レチノールである。最も好ましくは、その幅広い商業的入手性によってオール−トランス−レチノールである。
【0011】
レチニルエステルは、レチノールのエステルである。「レチノール」という用語は上に規定されている。本発明における使用に適しているレチニルエステルは、レチノールのC1〜C30エステル、好ましくはC2〜C20エステル、最も好ましくはC2、C3、およびC16エステルであるが、その理由は、これらがさらに普通に入手しうるからである。レチニルエステルの例には次のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、レチニルパルミテート、レチニルホルメート、レチニルアセテート、レチニルプロピオネート、レチニルブチレート、レチニルバレレート、レチニルイソバレレート、レチニルヘキサノエート、レチニルヘプタノエート、レチニルオクタノエート、レチニルノナノエート、レチニルデカノエート、レチニルウンデカノエート、レチニルラウレート、レチニルトリデカノエート、レチニルミリステート、レチニルペンタデカノエート、レチニルヘプタデカノエート、レチニルステアレート、レチニルイソステアレート、レチニルノナデカノエート、レチニルアラキドネート、レチニルベヘネート、レチニルリノレエート、レチニルオレエートである。
【0012】
本発明に用いるのに好ましいエステルは、レチニルパルミテート、レチニルアセテート、およびレチニルプロピオネートから選ばれるが、その理由は、これらが最も商業的入手性が高く、したがって最も安価だからである。レチニルリノレエートおよびレチニルオレエートも、これらの有効性によって好ましい。
【0013】
レチノールまたはレチニルエステルは、本発明の組成物において、第一組成物中に約0.001%から約10%、好ましくは約0.01%から約1%の量で、最も好ましくは約0.01%から約0.5%の量で用いられる。
【0014】
レチノイドは、下記チャート1に記載されたメカニズムにしたがって、皮膚中で酵素的にレチノイン酸に転換されると考えられる。
【0015】
【表1】
【0016】
驚くべきことに、あるいくつかの化合物は、ARAT/LRAT、レチナールレダクターゼ、CRABPII、およびレチノイン酸酸化(この後者のものは、シトクロムP450系によって触媒される)を阻害し、一方で、あるいくつかの他の化合物はレチノールデヒドロゲナーゼを増強することが発見された。これらの化合物は集合的に、本明細書において「ブースター」と呼ばれ、上のチャート1に見られるようにグループB1からグループB5として符号化される。これらのブースターは、単独で、または互いに組合わせて、レチノイン酸への転換に有効なレチノール量を増すことによって、およびレチノイン酸の分解を阻害することによって、レチノイドの作用を増強する。これらのブースターは、レチノイド(例えばレチノール、レチニルエステル、レチナール、レチノイン酸)とともに作用し、後者は皮膚中に内生的に存在する。しかしながらこれらの好ましい組成物は、性能を最適化するために、ブースターと共存してこの組成物中にレチノイドを含有している。
【0017】
本発明は部分的には、少なくとも1つのブースター化合物を組成物の約0.0001重量%から約50重量%、好ましくは約0.001重量%から10重量%、最も好ましくは0.001重量%から約5重量%含む第二組成物であって、この化合物が、10mMの単独または組合わされた濃度で、生体内トランスグルタミナーゼアッセイにおいて、トランスグルタミナーゼを50%以上まで阻害する組成物と、化粧品として許容しうるビヒクルとを含んでいる。
【0018】
本発明の組成物中に含まれているブースターは、下記のものから成る群から選ばれる:
(a)2つのブースターであって、どちらもB2;B3;B4から成る同じ群から選ばれるもの;
(b)下記のものから成る群から選ばれるブースターの二元的組合わせ:
B1/B2;B1/B3;B1/B4;B1/B5;B2/B3;B2/B4;B2/B5;B3/B4;B3/B5;B4/B5;
(c)下記のものから成る群から選ばれるブースターの三元的組合わせ:
B1/B2/B3;B1/B2/B4;B1/B2/B5;B1/B3/B4;B1/B3/B5;B1/B4/B5;B2/B3/B4;B2/B3/B5;B2/B4/B5;B3/B4/B5;
(d)下記のものから成る群から選ばれるブースターの四元的組合わせ:
B1/B2/B3/B4;B1/B2/B3/B5;B1/B2/B4/B5;B1/B3/B4/B5;B2/B3/B4/B5;および
(e)ブースターの5つのグループの組合わせ:B1/B2/B3/B4/B5。
【0019】
好ましい組成物は、異なる群(すなわち前記群(b)から(e))からの少なくとも1つのブースターを含む。しかしながら、異なる群から選ばれたブースターのあらゆる組合わせはまた、所望の増強効果のために本発明の組成物において用いられてもよい。
【0020】
本発明にブースターとして含まれる化合物はまず、下記のセクション2.1から2.7に記載されているような特異的酵素に対する試験管内ミクロソームアッセイを、このような化合物が表Aに挙げられているある濃度において合格する能力に基づいて選ばれる。ついでこの化合物は(単独または別のブースターと組合わせて)、10mMの個別濃度または組合わされた濃度において、下記の試験管内トランスグルタミナーゼアッセイに付される。このような組合わせが、トランスグルタミナーゼを50%以上まで阻害するならば、その場合には、これは本発明における使用に適している。ブースターが個別にテストされ、このトランスグルタミナーゼアッセイに合格するならば、その場合には、これはこのトランスグルタミナーゼアッセイに合格する別のブースターまたは組合わせと組合わされてもよい。
【0021】
本発明による好ましい組成物は、10mMの個別濃度において、トランスグルタミナーゼを50%以上まで阻害するブースターの組合わせを含んでいる。
【0022】
本明細書において用いられている「コンディショニング」という用語は、乾燥肌、にきび、光損傷肌、小じわの外見、加齢斑、老化肌の予防および処理、角質層の柔軟性の増加、肌の色を明るくすること、皮脂分泌の制御、および一般的な肌の品質の向上を意味する。この組成物は、皮膚の落屑および表皮分化を改良するために用いられてもよい。
【0023】
ブースターは、下記のセクション2.1から2.7に記載されている試験管内ミクロソームアッセイに合格する化合物である。本発明の化合物は、表Aに挙げられた濃度において阻害するかまたは向上させる。少なくとも表Aに上げられている幅広い%までの酵素である。
【0024】
【表2】
【0025】
本発明の組成物にこの化合物を含めることの適切さを決定するために用いられた試験管内ミクロソームアッセイは、次のとおりである。
【0026】
1.材料
オール−トランス−レチノール、オール−トランス−レチノイン酸、パルミトイル−CoA、ジラウロイルホスファチジルコリン、NAD、およびNADPHは、シグマケミカル社(Sigma Chemical Company)から購入された。これらのミクロソームアッセイのためのレチノイドの保存溶液は、HPLCグレードアセトニトリル中で調製された。HPLC分析用のオールレチノイド標準保存溶液は、エタノール中で調製され、−70℃においてN2雰囲気下に保存され、保存から取り出された時、暗室灯下に氷上に維持された。その他の薬品および阻害剤は、化粧品材料供給業者または化学会社、例えばアルドリッチ社(Aldrich)またはインターナショナル・フレーバーズ・アンド・フレグランシーズ(International Flavors and Fragrances)から商品として入手可能であった。
【0027】
2.方法
2.1 RPEミクロソームの単離(J.C.Saari & D.L.Bredberg、「レチナール色素上皮におけるCoAおよび非CoA依存性レチノールエステル化(CoA and Non−CoA Dependent Retinol Esterification in Retinal Pigment Epithelium)」、J.Bill.Chem.263、8084〜8090(1988)から修正された)。
【0028】
網膜および房水が除去されている50個の凍結された二等分ウシ眼球を、米国ネブラスカ州(NE,USA)、リンカーンのW.L.ローソン社(W.L.Lawson Co.,Lincoln)から入手した。これらの眼を一晩解凍し、着色された虹彩膜を、ピンセットで剥がして除去した。各々の眼球を、絵筆またはゴム冠ポリスマンを用いて、黒い色素細胞をこすって、2×0.5mLの冷たい緩衝液(0.1M PO4/1mM DTT/0.25Mスクロース、pH7)で洗浄した。この細胞懸濁液を虹彩膜に添加し、懸濁液を、テフロン攪拌棒を用いてビーカーで数分間攪拌した。懸濁液を、目の粗いフィルター(スペクトラ(Spectra)/Por 925μ細孔サイズポリエチレンメッシュ)を通して濾過して大きい粒子を除去し、その結果生じた黒く着色された懸濁液を、モーター駆動テフロンホモジナイザーを備えたグラス−コル(Glas−Col)を用いて均一化した。この細胞ホモジェネートを、20,000gで30分間遠心分離した(14,000RPMにおける2.5×10cm管にSS34ローターを有するソルバール(Sorvaal)モデルRC−5B遠心分離機)。その結果生じた上澄み液を、150,000gにおいて60分間、さらなる遠心分離に付した(40,000RPMにおける13×51mm管にSW50.1ローターを有するベックマン(Beckman)モデルL80超遠心分離機)。その結果生じたペレットを、ヒート・システムズ・ウルトラソニックス社(Heat Systems Ultrasonics,Inc.)モデルW185Dソニファイヤー・セル・ディスラプター(Sonifier Cell Disruptor)を用いて、約5mL 0.1M PO4/5mM DTT、pH7緩衝液中に分散し、その結果生じたミクロソーム分散液を、小さい管中にアリコートし、−70℃で保存した。これらのミクロソームのタンパク質濃度は、BSAを標準として用い、バイオラッド・ダイ(BioRad Dye)結合アッセイを用いて測定した。
【0029】
2.2 ラット肝臓ミクロソームの単離(R.Martini & M.Murray、「ラット肝臓ミクロソームレチノイン酸4−ヒドロキシル化へのP450 3A酵素の参加(Participation of P450 3A Enzymes in Rat Hepatic Microsomal Retinoic Acid 4−Hydroxylation)」、Archives Biochem.Biophys.303、57−66(1993))。
【0030】
約6グラムの凍結ラット肝臓(アキュリット・ケミカル・アンド・サイエンティフィック社(Accurate Chemical and Scientific Corp.)からのハーラン・スプラーグ・ドーリー(Harlan Sprague Dawley)ラットから入手したもの)を、ブリンクマン・ポリトロン(Brinkmann Polytron)を用いて、0.1Mトリス/0.1M KCl/1mM EDTA/0.25Mスクロース、pH7.4緩衝液3容積中に均一化した。その結果生じた組織懸濁液を、前記のモーター駆動テフロンホモジナイザーにおいてさらに均一化した。その結果生じたホモジェネートを、10,000gにおいて30分間、20,000gにおいて30分間、および30,000gにおいて15分間連続的に遠心分離し、その結果生じた上澄み液を、105,000gにおいて80分間超遠心分離した。このペレットを前記のように約5mLの0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2、pH7.4緩衝液中に超音波処理し、−70℃でアリコートとして保存した。タンパク質濃度は、前記のように測定した。
【0031】
2.3 ARATおよびLRAT活性についてのアッセイ(B1を認定するため)
下記手順は、J.C.Saari & D.L.Bredberg、「ウシレチナール色素上皮ミクロソームのARATおよびLRAT活性(ARAT & LRAT Activities of Bovine Retinal Pigment Epithelial Microsomes)」、Methods Enzymol.190、156−163(1990)に記載されている方法の修正方法である。下記緩衝液を調製し、4℃で保存した:0.1M PO4/5mM ジチオトレイトール、pH7.0(PO4/DTT)。アッセイ当日に、緩衝液1mLあたり2mgのBSAを添加して、PO4/DTT/BSA使用緩衝液を生じた。1mMレチノール基質を、アセトニトリル中で調製し、窒素ガス下−20℃でアンバービンに保存した。使用緩衝液(アリコートとして保存されているもの)中の4mMパルミトイル−CoAの溶液およびエタノール中の4mMジラウロイルホスファチジルコリンの溶液を調製し、−20℃で保存した。阻害剤は、H2O、エタノール、アセトニトリル、またはDMSO中の10mM保存溶液として調製した。急冷溶液は、50μg/mLブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)を含む純粋エタノールを用いて調製し、50μg/mL BHTを含むヘキサン溶液を、抽出のために用いた。
【0032】
2ドラムガラスビンに、下記のものを順序よく添加する。500μLの総容積を生じるためのPO4/DTT/BSA緩衝液、5μLアシルドナー(4mMパルミトイル−CoAおよび/またはジラウロイルホスファチジルコリン)、5μL阻害剤または溶媒ブランク(10mM保存溶液またはその他の希釈液)、ついで約15μgのRPEミクロソームタンパク質(約1mg/mLミクロソームタンパク質アリコート約15μL)。37℃で5分間インキュベートして、反応温度を平衡させ、ついで5μLの1mMレチノールを添加する。これらのビンに蓋をし、5秒間渦巻き攪拌し、37℃で30から90分間インキュベートする。0.5mLエタノール/BHTを添加して反応を急冷する。3mLヘキサン/BHTを添加してレチノイドを抽出し、これらの管を数秒間数回渦巻き攪拌し、これらの管を低速で5分間遠心分離して、これらの層を素早く分離する。上部ヘキサン層をきれいなビンの中に取り出し、前記のように別の3mLヘキサン/BHTでこの水性層を再抽出する。これらのヘキサン層を組合わせ、加熱されたアルミニウムブロック上で窒素ガス流下、37℃で乾燥することによってヘキサンを蒸発させる。HPLC分析まで、この乾燥残渣を−20℃で保存する。下記のようなHPLCシグナルの統合によって、それぞれARATおよびLRAT活性について、レチニルパルミテートおよびレチニルラウレートの量を定量化する。
【0033】
このインキュベーション溶液が40μMアシルドナー、100μMまたはそれ以下の阻害剤、10μMレチノール、約30μg/mLミクロソームタンパク質、および約0.1M PO4、pH7/5mM DTT/2mg/mL BSAを含むことに注目のこと。レチノールの添加後のすべての工程は、暗闇または暗室灯下で実施した。
【0034】
2.4 レチノールデヒドロゲナーゼ活性についてのアッセイ(B2を認定するため)
下記の保存溶液を調製した:
50mM KH2PO4、pH7.4緩衝液、滅菌濾過されたもの;
DMSO中10mMオールトランスレチノール(シグマR7632);
滅菌水中200mMニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート、ナトリウム塩(NADP)(シグマN0505);
適切な溶媒中40mMテスト化合物(水、緩衝液、エタノール、クロロホルム、またはDMSO);
50mM KH2PO4、pH7.4緩衝液(4μg/μl)中ラット肝臓ミクロソームの1:10希釈液。
【0035】
ネジ蓋を備えた2ドラムガラスビンに、下記のものを順序よく添加する:
400μlの最終容積を生じるための緩衝液;
25μl希釈ミクロソーム(最終=100μg)−対照のための煮沸したミクロソームを用い、テストサンプルのために通常のミクロソームを用いる;
200mM NADP 4μl(最終=2mM);
40mMテスト化合物1μl(最終=100μM);
10mMレチノール8μl(最終=200μM)。
【0036】
37℃振とう水浴中で45分間ガラスビンをインキュベートする。各ガラスビンに、500μlの氷冷エタノールを添加し、反応を急冷する。レチノイドを氷冷ヘキサンで2回抽出する(1抽出あたり2.7ml)。第一抽出の間、各サンプルにおける抽出効率を監視する手段として、各々のガラスビンにレチニルアセテート(900μM保存溶液5μl)を添加する。サンプルを10秒間渦巻き攪拌し、その後ベックマンGS−6R遠心分離機において、1000rpm、5℃で5分間静かに遠心分離した。レチノイドを含む上部ヘキサン層は、きれいな2ドラムガラスビンへの各々の抽出後、水性層から除去する。静かな窒素ガス流下、ヘキサンを蒸発除去する。HPLC分析まで乾燥残渣を−20℃で保存する。
【0037】
2.5 レチナールレダクターゼ活性についてのアッセイ(B3を認定するため)
すべての保存溶液は、下記のような置換えを行なって前記のように調製した:
DMSO中10mMオールトランスレチナルデヒド(シグマR2500)−レチノールの代わりに;
200mM、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート、還元形態、滅菌水中四ナトリウム塩(NADPH)(シグマN7505)−NADPの代わりに。
【0038】
ネジ蓋を備えた2ドラムガラスビンに、下記のものを順序よく添加する:
400μlの最終容積を生じるための緩衝液;
25μl希釈ミクロソーム(最終=100μg)−対照のための煮沸したミクロソームを用い、テストサンプルのために通常のミクロソームを用いる;
200mM NADPH 4μl(最終=2mM);
40mMテスト化合物1μl(最終=100μM);
10mMレチナルデヒド3μl(最終=75μM)。
【0039】
上に詳細に記載されたものと同じインキュベーションおよび抽出手順にしたがう。
【0040】
2.6 CRABPIIアンタゴニストについてのアッセイ(B4を認定するため)
2.6.1.CRABPIIの合成
a.発現系
遺伝子CRABPIIを、pET29a−c(+)プラスミド(ノバゲン社(Novagen))中でクローンした。このクローン遺伝子は、強力なバクテリオファージT7転写および翻訳シグナルの制御下にあった。T7ポリメラーゼ源は、ホスト細胞E.coli BLR(DE3)pLysS(ノバゲン社)によって供給された。この後者のものは、IPTGの存在によって誘発された、lacUV5制御下にあるT7ポリメラーゼの染色体コピーを有する。このプラスミドは、製造業者のプロトコル(ノバゲン社)にしたがった形質転換によって、E.Coli BLR(DE3)pLysS細胞に転移された。
【0041】
b.誘発
これらの形質転換細胞の一晩培養物を、50μg/mLカナマイシンおよび25μg/mLクロラムフェニコールを含む2xYT中に1:100希釈した。これらの細胞は、600nmにおけるODが0.6から0.8に達するまで、37℃において振とうしながら培養させた。ついでIPTGを、1mMの最終濃度まで添加し、この培養物を、さらに2時間インキュベートした。これらの細胞は、室温において10分間5000gで遠心分離によって採集した。このペレットを−20℃で保存した。
【0042】
2.6.2.精製
精製は、Norris and Li、1997に記載されている方法にしたがって実施した。
【0043】
a.溶解
この凍結ペレットを室温で解凍し、新たに調製された溶解緩衝液(50mM トリス−HCl、pH8、10%(w/v)スクロース、1mM EDTA、0.05%(w/v)ナトリウムアジド、0.5mM DTT、10mM MnCl2、2.5mMフッ化フェニルメチルスルホニル、2.5mMベンズアミジン、6μg/mL DNase)1〜2ペレット容積中に再懸濁した。溶解物を室温で30分間インキュベートした。それ以上の溶解は、音波処理によって実施した(10,000psiにおける6回の30秒バーストと、氷上の5回の30秒遅延を交互に)。この溶解物の不溶フラクションを、4℃で1時間15000rpmにおける遠心分離によって除去し、上澄み液を−20℃で保存する。
【0044】
b.セファクリル(Sephacryl)S300上のゲル濾過
工程aからの上澄み液を、室温においてセファクリルS−300(ファルマシア社(Pharmacia))の2.5×100cmカラム上に載せた。溶離緩衝液は、20mMトリス−HCl、pH8、0.5mM DTT、0.05%ナトリウムアジドであった(緩衝液A)。流量は2mL/分であった。回収された2−mLフラクションを、280nmにおける紫外線吸光度についてチェックした。ピークを示すフラクションを、SDS−PAGEによって、CRABPIIの存在について調べた。
【0045】
c.アニオン交換クロマトグラフィー
CRABPIIを含む2mLのゲル濾過フラクションを、第四アミンアニオン交換カラムFPLC(高速タンパク質液体クロマトグラフィー)型モノQ(ファルマシア社)上に載せた。CRABPIIは、100%緩衝液Aから30%緩衝液Bまでの勾配緩衝液(100%緩衝液B=緩衝液A+250mM NaCl)を用いて、室温で20分間にわたって溶離した。1mLフラクションを毎分回収した。もう一度、CRABPIIの存在をSDS−PAGEによってチェックした。CRABPIIを4℃で保存し、その後ガラスビンプラットホームアタッチメント(エドワーズ・ハイ・バキュアム・インターナショナル社(Edwards High Vacuum International))を備えたマイクロモデュリョ(Micromodulyo)1.5Kを用いて凍結乾燥した。これらの乾燥サンプルを、結合アッセイに用いるまで室温で保存した。
【0046】
d.CRABPIIの存在の検出
CRABPIIの発現および精製は、7%から15%ポリアクリルアミドゲル(バイオラッド社)上の変性SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS−PAGE)を用いて確認した。10μlのサンプルと、2×負荷緩衝液(100mMトリス−HCl、pH6.8、4%SDS、0.2%BPB、20%グリセロール、1mM DTT)10μlとを混合し、加熱(80℃で2分間)によって変性した。これらのサンプルを、1×トリス−グリシン緩衝液(バイオラッド社)中に浸漬されたゲル上に載せ、定電流(25mA)を室温で1時間加えた。クーマシーブルー染色後、タンパク質を、ベンチマーク予備染色タンパク質ラダー(ギブコ社(GibcoBRL))を用いて確認された分子量にしたがって同定した。
【0047】
ウエスタンブロットを用いて、CRABPIIの存在を確認した。SDS−PAGEで分離されたタンパク質を、バイオラッドカセットを用いて、イモビロン(Immobilon)−P転移膜(ミリポア社(Millipore))上に転移させた。この転移は、1×トリス−グリシン緩衝液(バイオラッド社)+10%メタノール中で行なわれた。電流(60mA)を3時間加えて、タンパク質をこの膜を通って移動させた。その後、この膜を、室温で1時間1×TBS中5%ドライミルクで遮断し、一晩4℃において同じ緩衝液中で、CRABPIIへの一次抗体(マウス抗クローン5−CRA−B3の1/1000希釈液)でプローブした。翌日、この膜をPBSで洗浄し(3×5分間)、ついで室温で1時間、二次抗体、ペルオキシダーゼ複合抗マウス抗体(ECLTM、アマーシャム社(Amersham))の1:2000希釈液でインキュベートした。この膜を1×PBSで洗浄し(3×5分間)、ECL検出キットを用いて、製造業者の指示(アマーシャム社)にしたがってタンパク質を検出した。
【0048】
精製CRABPIIの濃度は、BSAキット(ピアス社(Pierce))を用いて測定した。
【0049】
2.6.3.放射能結合アッセイ
220pモルのCRABPIIを、総容積70μL中に15pモルの放射性オールトランスレチノイン酸(NEN)を有する20mMトリス−HCl緩衝液pH7.4中でインキュベートした。競合アッセイのために、もう1つの過剰リガンド(6670:1、670:1、または70:1)を、このミックスに添加した。反応は、暗闇で室温において1時間行なわれた。結合オールトランスレチノイン酸から未結合オールトランスレチノイン酸を分離するために、6kDカットオフミニクロマトグラフィーカラム(バイオラッド社)を用いた。保存緩衝液を、マイクロプレックス(Microplex)マニホールドを用いて、製造業者の指示にしたがって(ファルマシア社)処分した。これらのサンプルをカラム上に載せ、分離は30分間にわたって重力によって行なわれた。CRABPIIに結合したレチノイン酸(「RA」)は、濾過物中に現われたが、一方、遊離RAはカラムに残留した。この濾過物の放射能を、シンチレーションカウンターによって測定した。
【0050】
2.7 NADPH依存性レチノイン酸酸化についてのアッセイ(B5を認定するため)
下記手順は、R.Martini & M.Murray、「ラット肝臓ミクロソームレチノイン酸4−ヒドロキシル化へのp450 3A酵素の参加(Participation of P450 3A Enzymes in Rat Hepatic Microsomal Retinoic Acid 4−Hydroxylation)」、Archives Biochem.Biophys.303、57−66(1993)に記載されている方法の修正方法である。
【0051】
下記のアッセイ緩衝液を調製し、4℃で保存する:0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2、pH7.4。アッセイ当日、緩衝液中60mM NADPH溶液を調製する。阻害剤保存溶液、酸性化エタノール/BHT急冷溶液、およびヘキサン/BHTを上記のように調製する。1mMレチノイン酸使用溶液を、エタノールで15mM保存溶液の(DMSO中)希釈によって調製した。
【0052】
2ドラムガラスビンに、次のものを順序正しく添加する:最終容積500μLを生じるためのアッセイ緩衝液、20μL 60mM NADPH、5μLの阻害剤または溶媒ブランク、ついで約2mgのラット肝臓ミクロソームタンパク質。
【0053】
37℃で5分間インキュベートし、ついで5μLの1mMレチノイン酸使用溶液を添加する。37℃で60分間インキュベーションを続行するが、ガラスビンに蓋をしない。その理由は、酸化プロセスには、NADPHに加えて分子O2が必要だからである。酸性化エタノール/BHTで急冷し、前記のようにヘキサン/BHTで抽出する。下記のようにHPLCシグナルの統合によって、急速に溶離する極性レチノイン酸代謝物を定量化する(4−オキソレチノイン酸であると推測される)。
【0054】
レチノイン酸の添加後のすべての工程は、暗闇あるいは暗室灯下で実施されることに注目のこと。最終インキュベーション溶液は、2.4mM NADPH、100μMまたはそれ以下の阻害剤、10μMレチノイン酸、約4mg/mLラット肝臓ミクロソームタンパク質、および約0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2を含んでいる。
【0055】
個々のレチノイドのHPLC分析
HPLCによるレチノイド定量化のためのサンプルは、100μLのメタノールを用いて残渣を各ガラスビン中に溶解して調製した。この溶液を、1mLのシェルガラスビンの中の150μLのガラスの円錐管に移し替え、きっちりと蓋をし、ウオーターズ(Waters)715オートサンプラー(Autosampler)の中に入れた。60μLのアリコートを直ちに注入し、レチノイド含量について分析した。
【0056】
クロマトグラフィー機器は、ウオーターズ600勾配制御器/ポンプ、ウオーターズ996光ダイオードアレイ検出器、およびウオーターズ474走査蛍光検出器から成っていた。2つのHPLCプロトコルを、レチノイド分析のために用いた。ARATおよびLRATアッセイの場合、レチノールとレチノールエステルとの分離は、ウオーターズ3.9×300mm C18ノバパック(NovaPak)逆相分析カラム、および10分間、流量1mL/分に調節された80:20(v/v)メタノール/THF無勾配移動相を有するウオーターズ・セントリー(Sentry)・ノバパックC18ガードカラムを用いて実施した。この溶出液を、325nmにおける吸光度および325ex/480emにおける蛍光について監視した。A.B.Barua、「水溶性化合物:グルクロニドの分析(Analysis of Water−Soluble Compounds:Glucuronides)」、Methods Enzymol.189、136−145(1990)によって記載された勾配系の修正例を用いて、レチノールおよびレチノイン酸酸化アッセイのためにレチノイド酸とアルコールとを分離するために、より短いウオーターズ3.9×150mm C18ノバパック逆相分析カラムおよびウオーターズ・セントリー・ノバパックC18ガードカラムを用いた。この系は、10mM酢酸アンモニウムを含む68:32(v/v)メタノール/水から4:1(v/v)メタノール:ジクロロメタンまでの20分間の直線状勾配、ついで流量1mL/分における5分間の維持から成っていた。このカラム溶出液を、300nmから400nmまで監視した。
【0057】
これらのプロトコルは、各アッセイにとって適切なレチノイド酸、アルコール、アルデヒド、および/またはエステルを明白に解明する能力、および分離の相対的迅速性に基づいて選ばれた。HPLCによる個々のレチノイドの同定は、未知のピークの保持時間と、有用な真正レチノイド標準の保持時間との正確なマッチ、および有用な真正レチノイドに対する未知のピークのUVスペクトル分析(300nmから400nm)に基づいていた。
【0058】
トランスグルタミナーゼアッセイにおけるさらなるテストに適したブースターには、下記表B1からB5に挙げられたブースターが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【0059】
【表3】
【0060】
【表4】
【0061】
【表5】
【0062】
【表6】
【0063】
【表7】
【0064】
ブースターまたはこれらの組合わせは、下記のトランスグルタミナーゼアッセイにおいてトランスグルタミナーゼ(以後「Tgase」)を、10mMの濃度において少なくとも50%まで阻害する。
【0065】
【表8】
【0066】
トランスグルタミナーゼアッセイおよびケラチン生成細胞分化
表皮中の末端分化プロセスの間、角質化包膜(CE)として知られているタンパク質の15nm厚さの層が、細胞周辺部の内側表面上に形成される。このCEは、多くの別個のタンパク質から構成されており、これらのタンパク質は、表皮中に発現された少なくとも2つの異なるトランスグルタミナーゼ(TGase)の作用によって触媒されたNε−(Y−グルタミル)リシンイソジペプチド結合の形成によって互いに架橋されている。TGase Iは、この表皮の分化層、特に顆粒層中に豊富に発現されるが、未分化基底表皮中には存在しない。したがってTGaseIは、さらに分化された状態を示す高いTGase Iレベルを有する表皮ケラチン生成細胞分化の有用なマーカーである。TGase I抗体を用いるELISAベースのTGase Iアッセイを用いて、下記実施例における培養ケラチン生成細胞の分化の状態を評価した。
【0067】
ケラチン生成細胞(前記のように培養されたもの)を、200μl培地中1ウエルあたり4,000から5,000細胞の密度で、96ウエルプレート中において培養した。2から3日間のインキュベーション後、または細胞が約50%密集成長するまで、この培地を、テスト化合物を含む培地に変えた(1テストあたり5つの複製)。これらの細胞をさらに96時間培養し、その後この培地を吸引し、これらのプレートを−70℃で保存した。プレートをフリーザーから取り出し、これらの細胞を200μlの1×PBSで2回洗浄した。これらの細胞を、室温(R/T)において1時間、TBS/5%BSA(洗浄緩衝液、ウシ血清アルブミン)でインキュベーションした。次に、TGase一次抗体を添加した:洗浄緩衝液中1:2000希釈した50μlのモノクローナル抗−TGaseIAb B.C.。この一次抗体を37℃で2時間インキュベートし、ついで洗浄緩衝液で6回濯ぎ洗いを行なった。ついで細胞を、37℃で2時間、洗浄緩衝液中に1:4,000希釈された50μlの二次抗体(Fab断片、アマーシャム社から得られるペルオキシダーゼ複合抗マウスIgG)でインキュベート、ついで洗浄緩衝液で3回濯ぎ洗いを行なった。洗浄緩衝液での濯ぎ洗いに続いて、これらの細胞をPBSで3回濯ぎ洗いした。比色展開のために、これらの細胞を、暗闇で(アルミニウムホイル下)、室温で正確に5分間、100μl基質溶液(4mgのo−フェニレンジアミンおよび10ml 0.1Mクエン酸塩緩衝液pH5.0中3.3μl 30% H2O2)でインキュベートした。反応は、50μlの4N H2SO4の添加によって停止した。サンプルの吸光度を、96ウエルプレートUV分光光度計で492nmにおいて読取った。5つの複製のうち4つを両方の抗体で処理し、5つ目の複製をTGaseバックグラウンド対照として用いた。TGaseレベルを測定し、パーセンテージ対照として表示した。
【0068】
トランスグルタミナーゼレベルを測定し、前記表のB1からB5において下記のどちらかとして表示した:
(i)%(ブースター+レチノール阻害/対照阻害)−%(ROH阻害/対照阻害)、これは、レチノール単独よりも優れた、ブースター+レチノール誘発TGase阻害の追加の効果を測定する;あるいは
(ii)多ブースター濃度の阻害効果が調べられた時のIC50値として。これは10−7Mの一定のレチノール濃度と組合わせた場合に、TGaseを50%阻害するブースターの濃度を提供する。
【0069】
本発明においてベンチマークとして用いられるのはIC50値である。
【0070】
【表9】
【0071】
2区画パッケージ
上で考察されているように、レチノイドを含む組成物は一般に不安定であり、化学分解を受けることがある。さらには、ブースターはレチノイド効果を向上させるのに有利であるが、驚くべきことに、同時にレチノイドの化学的不安定性にも寄与することが発見された。ブースター誘発のレチノール不安定化は、両方の成分が単一配合物に含まれている時に、高められたレチノイド組成物の全体の有効性を劇的に減少させる。
【0072】
したがってレチノイド崩壊に対して保護する一方で、なおもレチノイドブースターの有利な効果を与えるために、本発明は、第一区画にレチノイドを含んでいる第一組成物、および第二区画に少なくとも1つのレチノイドブースターを含んでいる第二組成物が入っている2区画パッケージを提供する。第一組成物は皮膚に第一効果を与えるが、一方、第二組成物は、第一効果の作用を高めるかまたは向上させる働きをする。
【0073】
この2区画パッケージは、2つの別々の容器において第一組成物と第二組成物とを供給するという目的が達成されるかぎり、当業者に知られた様々な方法で設計されていてもよい。1つの実施態様において、この2区画パッケージは、隣接して付着された2つのつぼまたはビンの形態にある。第二実施態様において、この2区画パッケージは、ビン/つぼの内部を第一区画と第二区画とに分けている区域を有する単一のビン/つぼの形態にある。これらの組成物が別々に保持されているかぎり、他の実施態様も本発明の範囲内にあると考えられる。
【0074】
最小限の酸素浸透性第一区画
上で考察されているように、レチノイド組成物は、酸素の存在下に分解を受けやすい。したがって本発明は、安定化第一組成物を維持するのを助けるために、最小限に酸素浸透性である2区画パッケージの第一区画を提供する。その場合レチノイドを含む第一組成物は、使用者による使用前は酸素と接触しないようにされている。
【0075】
最小限の酸素浸透性区画は、当業者に知られている多様な方法で構成することができる。具体的には本発明の組成物は、酸素または空気と直接接触状態にあってはならず、酸素がこの包装の外壁を通って漏れ出ないように防ぐべきである。光に対して不透明であり、酸素に対して不浸透性の包装が用いられてもよい。例えばこの包装の壁用として、またはこの包装の内側のライニングとして、アルミニウムが用いられてもよい。
【0076】
追加の実施態様において、第一区画と第二区画との両方は、第一組成物と第二組成物との両方の分解を軽減するために、最小限に酸素浸透性であるように構成される。
【0077】
化粧品として許容しうるビヒクル
本発明による製品はまた、この組成物が皮膚に付けられる時にその分配を促進するように、第一組成物と第二組成物とのどちらかまたはその両方において、活性成分用の希釈剤、分散剤、またはキャリヤーとして作用するための、化粧品として許容しうるビヒクルも含んでいる。
【0078】
水以外のビヒクル、または水に加えてのビヒクルには、液体または固体エモリエント、溶剤、湿潤剤、増粘剤、および粉末を含めることができる。特に好ましい非水性キャリヤーは、ポリジメチルシロキサンおよび/またはポリジメチルフェニルシロキサンである。この発明のシリコーンは、25℃において約10センチストークスから10,000,000センチストークスの粘度を有するものであってもよい。特に望ましくは、低粘度シリコーンと高粘度シリコーンとの混合物である。これらのシリコーンは、ジェネラル・エレクトリック社(General Electric Company)から商標ビカシル(Vicasil)、SE、およびSFとして、ダウ・コーニング社(Dow Corning Company)から200および550シリーズとして入手しうる。この発明の組成物に用いることができるシリコーンの量は、この組成物の5重量%から95重量%、好ましくは25重量%から90重量%の範囲にある。
【0079】
任意皮膚効果物質および化粧品添加剤
本発明の第一組成物および第二組成物のうちのどちらか1つまたは両方において、油中水型エマルジョンあるいは水中油型エマルジョンを供給するための乳化剤とともに、主として、用いられる乳化剤の平均親水性親油性比(HLB)に応じて、油または油性物質が存在してもよい。
【0080】
様々な種類の活性成分が、本発明の第一化粧品組成物および第二化粧品組成物のどちらか1つまたは両方に存在してもよく、これらは下に記載されている。活性物質は、エモリエント以外、および単にこの組成物の物理的特徴を改良する成分以外の、皮膚または毛髪効果剤として規定される。このカテゴリーに限定されるわけではないが、一般的な例には、日焼け止め剤、皮膚を明るくする作用物質、日焼け剤が含まれる。
【0081】
日焼け止め剤は、紫外線光を遮断するために通常用いられている物質を含む。化合物の例は、PABA誘導体、シンナメート、およびサリチレートである。例えばオクチルメトキシシンナメートおよび2−ヒドロキシ−4−メトキシベンゾフェノン(オキシベンゾンとしても知られている)を用いることができる。オクチルメトキシシンナメートおよび2−ヒドロキシ−4−メトキシベンゾフェノンは、それぞれ商標パーソル(Parsol)MCXおよびベンゾフェノン−3という商品として入手しうる。
【0082】
エマルジョンに用いられる日焼け止め剤の正確な量は、日光のUV放射線から望まれる保護の程度に応じて変えることができる。
【0083】
もう1つの好ましい任意成分は、必須脂肪酸(EFA)、すなわち、すべての細胞の原形質膜形成にとって必須である脂肪酸から選ばれる。ケラチン生成細胞において、EFA欠乏は細胞を超増殖性にする。EFAの補足がこれを補正する。EFAはまた、表皮の脂質生合成も向上させ、表皮のバリアー形成のための脂質を供給する。これらの必須脂肪酸は好ましくは、リノール酸、Y−リノレン酸、ホモ−Y−リノレン酸、コロンビン酸、エイコサ−(n−6,9,13)−トリエン酸、アラキドン酸、Y−リノレン酸、チムノドン酸、ヘキサエン酸、およびこれらの混合物から選ばれる。
【0084】
多くの場合、本発明の化粧品組成物中にエモリエントが組込まれる。このようなエモリエントのレベルは、総組成物の約0.5重量%から約50重量%、好ましくは約5重量%から30重量%であってもよい。エモリエントは、例えばエステル、脂肪酸、およびアルコール、ポリオール、および炭化水素などの一般的な化学カテゴリーに分類することができる。
【0085】
エステルは、モノ−またはジ−エステルであってもよい。脂肪ジ−エステルの許容しうる例には、ジブチルアジペート、ジエチルセバケート、ジイソプロピルジメレート、およびジオクチルスクシネートが含まれる。許容しうる分枝鎖脂肪エステルには、2−エチル−ヘキシルミリステート、イソプロピルステアレート、およびイソステアリルパルミテートが含まれる。許容しうる三塩基性酸エステルには、トリイソプロピルトリリノレエート、およびトリラウリルシトレートが含まれる。許容しうる直鎖脂肪エステルには、ラウリルパルミテート、ミリスチルラクテート、オレイルユルケート(eurcate)、およびステアリルオレエートが含まれる。好ましいエステルには、ココカプリレート/カプレート(ココ−カプリレートとココ−カプレートとのブレンド)、プロピレングリコールミリスチルエーテルアセテート、ジイソプロピルアジペート、およびセチルオクタノエートが含まれる。
【0086】
適切な脂肪アルコールおよび酸には、10個から20個の炭素原子を有する化合物が含まれる。特に好ましくは、例えばセチル、ミリスチル、パルミチンアルコールおよびステアリルアルコール、およびパルミチン酸およびステアリル酸である。
【0087】
エモリエントとしての役目を果たしうるポリアルコールには、直鎖状および分枝鎖状アルキルポリヒドロキシル化合物がある。例えばプロピレングリコール、ソルビトール、およびグリセリンが好ましい。同様に、ポリマーポリオール、例えばポリプロピレングリコールおよびポリエチレングリコールも有用であろう。ブチレンおよびプロピレングリコールも、浸透向上剤として特に好ましい。
【0088】
エモリエントとしての役目を果たしうる炭化水素の例は、12個から30個の炭素原子の炭化水素鎖を有するものである。具体例には、鉱油、石油ゼリー、スクアレン、およびイソパラフィンが含まれる。
【0089】
本発明の化粧品組成物中の機能成分のもう1つのカテゴリーは、増粘剤である。増粘剤は通常、この組成物の0.1重量%から20重量%、好ましくは約0.5重量%から10重量%の量で存在する。増粘剤の例は、B.F.グッドリッチ社(B.F.Goodrich Company)から商標カルボポル(Carbopol)として入手しうる架橋ポリアクリレート物質である。ガム、例えばキサンタン、カラゲーナン、ゼラチン、カラヤ、ペクチン、およびイナゴマメガムなどを用いることができる。ある一定の条件下、増粘機能はシリコーンまたはエモリエントとしても役立つ物質によって得ることができる。例えば10センチストークス以上のシリコーンガムおよび例えばグリセロールステアレートなどのエステルは、二重の機能を有する。
【0090】
本発明の化粧品の第一化粧品組成物および第二化粧品組成物のうちの1つまたは両方に、粉末を組込んでもよい。これらの粉末には、チョーク、タルク、フラー土、カオリン、デンプン、スメクタイト粘土、化学的に変性されたマグネシウムアルミニウムシリケート、有機的に変性されたモンモリロナイト粘土、水和アルミニウムシリケート、ヒュームドシリカ、アルミニウムデンプンオクテニルスクシネート、およびこれらの混合物が含まれる。
【0091】
その他の添加剤微量成分も同様に、本発明の化粧品の第一組成物および第二組成物のうちの1つまたは両方に組込まれてもよい。これらの成分には、着色剤、乳白剤、および香料が含まれてもよい。これらの物質の量は、この組成物の0.001重量%から20重量%までの範囲であってもよい。
【0092】
本発明の化粧品の第一組成物および第二組成物は主として、ヒトの皮膚への局所使用のための製品として、特に皮膚のコンディショニングおよび平滑化のため、および小じわの寄ったまたは老化した肌の外見を予防または減少させるための作用物質として意図されている。
【0093】
使用中、少量、例えば1mlから5mlの第一組成物を、適切な容器またはアプリケーターから皮膚の暴露区域に塗布し、ついで必要であればこれを、手または指または適切な器具を用いて皮膚の上に伸ばすか、および/または皮膚の中にすり込む。同時に、少量、例えば1mlから5mlの第二組成物を、適切な容器またはアプリケーターから皮膚の暴露区域に塗布し、必要であればこれも同様に、手または指または適切な器具を用いて皮膚の上に伸ばすか、および/または皮膚の中にすり込む。したがって望まれるトリートメント効果の強度に応じて、第一組成物および第二組成物は、単独で、または同時に、または連続的に用いられてもよい。
【0094】
製品形態および包装
本発明の外用皮膚トリートメント組成物は、ローション、流動クリーム、クリーム、またはジェルとして配合することができる。
【0095】
方法
レチノール(トウイーン80中50%)を、約50%水性エタノール中に溶解し、標準96ウエル分光光度計を用いて96ウエルプレート中200μl容積で測定された時に約0.6の360nmにおけるODを生じる溶液を生じた。
【0096】
約0.1%の濃度、および暗闇で室温において60時間の直後に上記のように測定されたOD360において、ブースター分子を添加した。プレートからの溶剤の蒸発により増加したレチノール濃度の原因を説明するために、60時間後にODに修正を加えた(0.85で割る)。
【0097】
【表10】
テストされたブースターは、レチノールの不安定性において顕著な増加を引起こした。
【0098】
このことによって、ブースターが用いられた時に、レチノール単独の場合に必要とされるものと比較して、かなり良好な安定性をレチノールに与える配合/包装の選択を用いる必要がある。
【実施例1】
【0099】
トランスグルタミナーゼ発現の相乗作用阻害が、B1およびB5活性化合物とレチノールとの組合わせによって発生したかどうかを立証するために、レチノールの存在下に個々にテストされた時に、これらの活性化合物の用量応答プロフィール(IC50値を含む)を決定することが肝要である。このデータは、レチノールの存在下における活性化合物の混合物の相乗作用を確認することを可能にするために、各活性化合物の適切な最大限以下の阻害濃度を決定するために用いられた。2つの化合物の相乗作用を証明するために、多くてもせいぜいIC20であるようなテストのための濃度、換言すればトランスグルタミナーゼ発現のレチノール阻害を個々に20%高める化合物濃度を選択することが肝要である。このような2つの化合物は、40%の付加的阻害を有すべきである。濃度を決定するためにこの戦略を用いることによって、試験中のこれら2つの化合物の相乗作用を検出するために、さらなるトランスグルタミナーゼ阻害のために40%から100%のウインドウを残す。さらに難しい濃度基準は、単独ではトランスグルタミナーゼの高められたレチノール阻害を示さない化合物の濃度を選択する。しかしながらこの研究において本発明者らは、さらに難しい基準を選んだ。本発明者らは、最小限に効果的なトランスグルタミナーゼの阻害的濃度よりも10倍および100倍も低い化合物の濃度を選んだ。このように非常に低い濃度を用いた相乗作用の組合わせの確認は、最も効果的な相乗作用の組合わせが確認されたことを意味する。
【0100】
下記表におけるデータは、最小限に阻害的な化合物の濃度よりも2対数低い化合物の濃度を表わす。これらは、B1/B5の組合わせの研究に用いられた濃度であった。
【0101】
【表11】
【0102】
B1およびB5活性化合物とレチノールとの組合わせによるトランスグルタミナーゼ発現の相乗作用阻害を調査するために、化合物の選択された組合わせを、上記表に示された濃度においてテストした。下記のデータが得られた。
【0103】
【表12】
【0104】
B1/B5の組合わせの有効性は、2つの種類に分けられる。すなわち、特に効果的な組合わせ(上の表中の太字)とほとんど効果的でない組合わせ(太字でない)である。あるいくつかのB1/B5の組合わせが他の組合わせよりも良好な作用を発揮することは、意外であった。ほとんど効果のない組合わせは、(i)脂肪酸アミド+アゾール、(ii)ヒドロキシ脂肪酸アミド+アゾール、および(iii)ナリンゲニン/ケルセチン+アゾールであった。効果的な組合わせは、下記の種類からのB5ブースターと組合わされたB1ブースターを含んでいた。すなわち、脂肪ヒドロキシエチルイミダゾリン界面活性剤、環式脂肪族不飽和化合物、多環式トリテルペン、n−置換脂肪酸アミドである。
【0105】
本発明は本明細書において、ある具体性をもって、およびこれらのあるいくつかの好ましい実施態様を参照して記載されてはいるが、当業者なら、本発明の範囲および精神の範囲内にあり、かつ実施することができる、記載されている発明の多くの変形例、修正例、および置換例が分かるであろう。これら全ての修正例および変形例は、本明細書に記載され、かつ特許請求されている本発明の範囲内にあり、これらの発明は、特許請求の範囲によってのみ限定され、かつこのような特許請求の範囲は合理的であるかぎり幅広く解釈されるものとする。この出願全体において、様々な出版物が引用されている。これらの出版物の各々の全体が、参照により本明細書に組込まれる。
Claims (10)
- 約0.001%から約10%のレチノイドを含む第一組成物;
約0.0001%から約50%の少なくとも1つのレチノイドブースターを含む第二組成物;
第一組成物を収容する第一区画;および
第二組成物を収容する第二区画
から成り、
第一区画が第一組成物を酸素と接触しないようにしており、
第一区画と第二区画とが互いに接合されている
ことを特徴とする安定なスキンケア製品。 - 第二組成物が、少なくとも2つのレチノイドブースターを、約0.0001%から約50%の量で含有することを特徴とする請求項1に記載の安定なスキンケア製品。
- レチノイドが第一効果を与え、レチノイドブースターが第一効果を高めることを特徴とする請求項1または2に記載の安定なスキンケア製品。
- 第一区画がアルミニウム層を含むことを特徴とする請求項1から3のいずれか一項に記載の安定なスキンケア製品。
- 第二区画が、第二組成物を酸素と接触しないようにしておくことを特徴とする請求項1から4のいずれか一項に記載の安定なスキンケア製品。
- 第二区画がアルミニウム層を含むことを特徴とする請求項5に記載の安定なスキンケア製品。
- 皮膚のコンディショニング方法であって、請求項1から6のいずれか一項に記載の製品を皮膚に局所的に塗布することを含む方法。
- 皮膚に対するレチノイン酸効果の模倣方法であって、請求項1から6のいずれか一項に記載の製品を皮膚に塗布することを含む方法。
- 皮膚のコンディショニングのための医薬品の製造における請求項1から6のいずれか一項に記載の安定なスキンケア製品の使用。
- 皮膚のコンディショニングのための請求項1から6のいずれか一項に記載の安定なスキンケア製品。
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