JP3792651B2 - 二重区画包装においてレチノイド、レチノイドブースター、およびフィトエストロゲンを含んでいるスキンケア製品 - Google Patents

Description

本発明は、二重区画包装の第一区画においてレチノイドを含み、第二区画においてレチノイドブースター系とフィトエストロゲンとを含んでいる安定スキンケア組成物に関する。

レチノイド（例えばレチノールおよびレチニルエステル）は、化粧品に用いられる通常の成分である。レチノール（ビタミンＡ）は、人体で自然発生する内因性化合物であり、正常な上皮細胞分化にとって必須である。天然および合成ビタミンＡ誘導体は、多様な皮膚障害の治療に広範囲に用いられており、皮膚の修復または再生剤として用いられてきた。レチノイン酸は、多様な皮膚の状態、例えばにきび、小じわ、乾癬、加齢斑、およびしみを処理するために用いられて来た。例えばＶａｈｌｑｕｉｓｔ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．第９４巻、Ｈｏｌｌａｎｄ Ｄ．Ｂ．およびＣｕｎｌｉｆｆｅ、Ｗ．Ｊ．（１９９０）、４９６〜４９８ページ、Ｅｌｌｉｓ，Ｃ．Ｎ．ら、「皮膚におけるレチノールの薬理学（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｔｉｎｏｌｓ ｉｎ Ｓｋｉｎ）」、Ｂａｓｅｌ、Ｋａｒｇｅｒ、第３巻、（１９８９）、２４９〜２５２ページ、およびＰＣＴ特許出願第ＷＯ９３／１９７４３号参照。

しかしながらレチノイド代謝は、レチノイドを有益でない副生物へ転換する結果になることがあり、したがって皮膚の状態を処理するのに有益なレチノイン酸をより少量しか生じない。したがっていくつかの先行技術文献は、皮膚の状態、例えばにきび、小じわ、乾癬、加齢斑、およびしみの処理を助けるための多様な天然活性物質の使用を教示している。例えばフィトエストロゲン（すなわち、エストロゲン様活性を有しており、植物中に見られる天然の化合物）は、美容目的および治療目的のためにますます用いられるようになっている。エストロゲンおよびエストロゲンのように作用する合成化合物は、皮層の厚さを増し、老化しつつある肌への小じわの形成を減少させることが知られている。皮膚の変化、例えば肌の乾燥、閉経後に発生する肌の弾力性およびふっくらした感じの喪失は、エストロゲン生産の欠如に帰因すると考えられる。エストロゲン療法は、老化しつつある肌に伴なう変化の多くを防ぐかまたは遅らせる（Ｃｒｅｉｄｉら、「老化しつつある顔の肌への複合エストロゲンクリーム（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｃｒｅａｍ）、（プレマリン（Ｐｒｅｍａｒｉｎ）（登録商標））の効果（（登録商標）） ｏｎ Ａｇｉｎｇ Ｆａｃｉａｌ Ｓｋｉｎ）」、Ｍａｔｕｒｉｔａｓ，１９、２１１〜２１３ページ、１９９４）。

いくつかのフィトエストロゲンが、先行技術において美容効果のために開示されている。例えば米国特許第５，７２８，７２６号は、チロシンキナーゼ阻害活性のためのゲニステインの使用を教示している。エイボン社（Ａｖｏｎ）に譲渡された米国特許第５，８４７，００３号および第５，８３４，５１３号は、レチノイドと組合わせたオキソ酸およびオキソ二酸の使用を開示している。どちらのエイボンの特許も、酸化防止剤のビオフラボノイド、例えばゲニステインおよびダイザインの任意成分としての使用を開示している。

しかしながらフィトエストロゲンはレチノールの酸化を誘発し、したがってレチノール分解の原因となることが発見された。組成物を送達するための多区画系は先行技術に記載されてはいるが、どれもフィトエストロゲンとレチノイドとを分離する必要性を開示していない。例えば、本発明の譲受人に発行された米国特許第５，９１４，１１６号は、１つの区画にレチノイドが入っており、第二区画に異なる第二効果を与える第二活性物質が入っている第二区画を有する、二重皮膚効果を与えるための２つの異なる皮膚活性物質を分離するための２つの別個の容器について記載している。

したがって、フィトエストロゲンの効果を向上させるレチノイドとともに、レチノイドの皮膚効果を与える組成物へのニーズが依然として存在する。

本発明は、下記のものを含む安定スキンケア製品を提供する：
約０．００１％から約１０％のレチノイドを含む第一組成物、
０．０００１％から約５０％の少なくとも１つのレチノイドブースターと約０．００１％から約１０％のフィトエストロゲンとを含む第二組成物、
第一組成物を保存するための第一区画、および
第二組成物を保存するための第二区画であって、第一区画と第二区画とが互いに接合されている区画。

ここで用いられている「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、構成されている（ｍａｄｅ ｕｐ ｏｆ）、構成されている（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）、成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）、および／または本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）ことを意味する。操作例および比較例において以外、または明らかに他の指摘がなされていなければ、物質または反応の状態、物質の物理的性質および／または使用の量または比を示す、本明細書におけるすべての数字は、「約」という単語によって修飾されているものと理解すべきである。

本発明の組成物は、好ましい成分としてレチノールを含んでいる。これは、レチニルエステル、レチノール、レチナール、およびレチノイン酸から選ばれ、好ましくはレチノールまたはレニチルエステルである。「レチノール」という用語には、レチノールの下記の異性体が含まれる。すなわち、オール−トランス−レチノール、１３−シス−レチノール、１１−シス−レチノール、９−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−レチノール、３，４−ジデヒドロ−１３−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−１１−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−９−シス−レチノールである。好ましい異性体は、オール−トランス−レチノール、１３−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−レチノール、９−シス−レチノールである。最も好ましくは、その幅広い商業的入手性によってオール−トランス−レチノールである。

レチニルエステルは、レチノールのエステルである。「レチノール」という用語は上に規定されている。本発明における使用に適しているレチニルエステルは、レチノールのＣ_１〜Ｃ_３０エステル、好ましくはＣ_２〜Ｃ_２０エステル、最も好ましくはＣ_２、Ｃ_３、およびＣ_１６エステルであるが、その理由は、これらがより普通に入手しうるからである。レチニルエステルの例には次のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、レチニルパルミテート、レチニルホルメート、レチニルアセテート、レチニルプロピオネート、レチニルブチレート、レチニルバレレート、レチニルイソバレレート、レチニルヘキサノエート、レチニルヘプタノエート、レチニルオクタノエート、レチニルノナノエート、レチニルデカノエート、レチニルウンデカノエート、レチニルラウレート、レチニルトリデカノエート、レチニルミリステート、レチニルペンタデカノエート、レチニルヘプタデカノエート、レチニルステアレート、レチニルイソステアレート、レチニルノナデカノエート、レチニルアラキドネート、レチニルベヘネート、レチニルリノレエート、レチニルオレエートである。

本発明に用いるのに好ましいエステルは、レチニルパルミテート、レチニルアセテート、およびレチニルプロピオネートから選ばれるが、その理由は、これらが最も商業的入手性が高く、したがって最も安価だからである。レチニルリノレエートおよびレチニルオレエートも、これらの有効性によって好ましい。

レチノールまたはレチニルエステルは、本発明の組成物において、約０．００１％から約１０％、好ましくは約０．０１％から約１％の量で、最も好ましくは約０．０１％から約０．５％の量で用いられる。

レチノイドは、チャート１に記載されたメカニズムにしたがって、皮膚中で酵素的にレチノイン酸に転換されると考えられる。

驚くべきことに、あるいくつかの化合物は、ＡＲＡＴ／ＬＲＡＴ、レチナールレダクターゼ、ＣＲＡＢＰＩＩ、およびレチノイン酸酸化（この後者のものは、シトクロムＰ４５０系によって触媒される）を阻害し、一方で、あるいくつかの他の化合物はレチノールデヒドロゲナーゼを増強することが発見された。これらの化合物は集合的に、本明細書において「ブースター」と呼ばれ、上のチャート１に見られるようにグループＢ１からグループＢ５として符号化される。これらのブースターは、単独で、または互いに組合わせて、レチノイン酸への転換に有効なレチノール量を増すことによって、およびレチノイン酸の分解を阻害することによって、レチノイドの作用を増強する。これらのブースターは、レチノイド（例えばレチノール、レチニルエステル、レチナール、レチノイン酸）とともに作用し、後者は皮膚中に内因的に存在する。しかしながらこれらの好ましい組成物は、性能を最適化するために、ブースターと共存してこの組成物中にレチノイドを含んでいる。

本発明は部分的には、少なくとも１つのブースター化合物を組成物の約０．０００１重量％から約５０重量％、好ましくは約０．００１重量％から約１０重量％、最も好ましくは０．００１重量％から約５重量％含む第二組成物であって、この化合物が、１０ｍＭの単独または組合わされた濃度で、生体内トランスグルタミナーゼアッセイにおいて、トランスグルタミナーゼを５０％以上まで阻害する組成物と、化粧品的に許容しうるビヒクルとを含んでいる。

本発明の組成物中に含まれているブースターは、下記のものから成る群から選ばれる：
（ａ）２つのブースターであって、どちらもＢ２、Ｂ３、Ｂ４から成る同じ群から選ばれるもの、
（ｂ）下記のものから成る群から選ばれるブースターの二成分の組合わせ：
Ｂ１／Ｂ２、Ｂ１／Ｂ３、Ｂ１／Ｂ４、Ｂ１／Ｂ５、Ｂ２／Ｂ３、Ｂ２／Ｂ４、Ｂ２／Ｂ５、Ｂ３／Ｂ４、Ｂ３／Ｂ５、Ｂ４／Ｂ５、
（ｃ）下記のものから成る群から選ばれるブースターの三成分の組合わせ：
Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３、Ｂ１／Ｂ２／Ｂ４、Ｂ１／Ｂ２／Ｂ５、Ｂ１／Ｂ３／Ｂ４、Ｂ１／Ｂ３／Ｂ５、Ｂ１／Ｂ４／Ｂ５、Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４、Ｂ２／Ｂ３／Ｂ５、Ｂ２／Ｂ４／Ｂ５、Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５、
（ｄ）下記のものから成る群から選ばれるブースターの四成分の組合わせ：
Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４、Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３／Ｂ５、Ｂ１／Ｂ２／Ｂ４／Ｂ５、Ｂ１／Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５、Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５、および
（ｅ）ブースターの５つのグループの組合わせ：Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５。

好ましい組成物は、異なる群（すなわち前記群（ｂ）から（ｅ））からの少なくとも１つのブースターを含む。しかしながら、異なる群から選ばれたブースターのあらゆる組合わせはまた、所望の増強効果のために本発明の組成物において用いられてもよい。

本発明にブースターとして含まれる化合物はまず、下記のセクション２．１から２．７に記載されているような特異的酵素に対する試験管内ミクロソームアッセイに、このような化合物が表Ａに挙げられているある濃度において合格する能力に基づいて選ばれる。ついでこの化合物は（単独または別のブースターと組合わせて）、１０ｍＭの個別濃度または組合わされた濃度において、下記の試験管内トランスグルタミナーゼアッセイに付される。このような組合わせが、トランスグルタミナーゼを５０％以上阻害するならば、その場合には、これは本発明における使用に適している。ブースターが個別にテストされ、このトランスグルタミナーゼアッセイに合格するならば、これはこのトランスグルタミナーゼアッセイに合格する別のブースターまたは組合わせと組合わされてもよい。

本発明による好ましい組成物は、１０ｍＭの個別濃度において、トランスグルタミナーゼを５０％以上阻害するブースターの組合わせを含んでいる。

本明細書において用いられている「コンディショニング」という用語は、乾燥肌、にきび、光損傷肌、小じわの外見、加齢斑、老化肌の予防および処置、角質層の柔軟性の増加、肌の色を明るくすること、皮脂分泌の制御、および一般的な肌の品質の向上を意味する。この組成物は、皮膚の落屑および表皮分化を改良するために用いられてもよい。

ブースターは、下記のセクション２．１から２．７に記載されている試験管内ミクロソームアッセイに合格する化合物である。本発明の化合物は、表Ａに挙げられた濃度において阻害するかまたは向上させる。少なくとも表Ａに挙げられている幅広い％までの酵素が、ついで、本発明の組成物中に含めることの適切さを決定するために、（単独でまたは別の化合物と組合わせて）試験管内トランスグルタミザーゼアッセイに付される。

本発明の組成物に化合物を含めることの適切さを決定するために用いられた試験管内ミクロソームアッセイは、次のとおりである。

１．材料
オール−トランス−レチノール、オール−トランス−レチノイン酸、パルミトイル−ＣｏＡ、ジラウロイルホスファチジルコリン、ＮＡＤ、およびＮＡＤＰＨは、シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）から購入された。これらのミクロソームアッセイのためのレチノイドの保存溶液は、ＨＰＬＣグレードアセトニトリル中で作製された。ＨＰＬＣ分析用のすべてのレチノイド標準保存溶液は、エタノール中で調製され、−７０℃においてＮ_２雰囲気下に保存され、保存から取り出された時は、黄色灯下で氷上に維持された。その他の薬品および阻害剤は、化粧品材料供給業者または化学会社、例えばアルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ）またはインターナショナル・フレーバーズ・アンド・フレグランシーズ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｌａｖｏｒｓ ａｎｄ Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ）から商品として入手可能であった。

２．方法
２．１ ＲＰＥミクロソームの単離（Ｊ．Ｃ．Ｓａａｒｉ ＆ Ｄ．Ｌ．Ｂｒｅｄｂｅｒｇ、「レチナール色素上皮におけるＣｏＡおよび非ＣｏＡ依存性レチナールエステル化（ＣｏＡ ａｎｄ Ｎｏｎ−ＣｏＡ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｒｅｔｉｎｏｌ Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）」、Ｊ．Ｂｉｌｌ．Ｃｈｅｍ．２６３、８０８４〜８０９０（１９８８）から修正された）。

網膜および房水が除去されている５０個の凍結された二等分ウシ眼杯を、米国ネブラスカ州（ＮＥ，ＵＳＡ）、リンカーンのＷ．Ｌ．ローソン社（Ｗ．Ｌ．Ｌａｗｓｏｎ Ｃｏ．，Ｌｉｎｃｏｌｎ）から入手した。これらの眼を一晩解凍し、着色された虹彩膜を、ピンセットで剥がして除去した。各々の眼球を、絵筆またはゴム冠ポリスマンを用いて、黒い色素細胞をこすって、２×０．５ｍＬの冷たい緩衝液（０．１Ｍ ＰＯ_４／１ｍＭ ＤＴＴ／０．２５Ｍスクロース、ｐＨ７）で洗浄した。この細胞懸濁液を虹彩膜に添加し、懸濁液を、テフロン攪拌棒を用いてビーカーで数分間攪拌した。懸濁液を、目の粗いフィルター（スペクトラ（Ｓｐｅｃｔｒａ）／Ｐｏｒ ９２５μ細孔サイズポリエチレンメッシュ）を通して濾過して大きい粒子を除去し、その結果生じた黒く着色された懸濁液を、モーター駆動テフロンホモジナイザーを備えたグラス−コル（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ）を用いて均一化した。この細胞ホモジェネートを、２０，０００ｇで３０分間遠心分離した（１４，０００ＲＰＭにおける２．５×１０ｃｍ管にＳＳ３４ローターを有するソルバール（Ｓｏｒｖａａｌ）モデルＲＣ−５Ｂ遠心分離機）。その結果生じた上澄み液を、１５０，０００ｇにおいて６０分間、さらなる遠心分離に付した（４０，０００ＲＰＭにおける１３×５１ｍｍ管にＳＷ５０．１ローターを有するベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）モデルＬ８０超遠心分離機）。その結果生じたペレットを、ヒート・システムズ・ウルトラソニックス社（Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）モデルＷ１８５Ｄソニファイヤー・セル・ディスラプター（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ）を用いて、約５ｍＬ ０．１Ｍ ＰＯ_４／５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７緩衝液中に分散し、その結果生じたミクロソーム分散液を、小さい管中にアリコートし、−７０℃で保存した。これらのミクロソームのタンパク質濃度は、ＢＳＡを標準として用い、バイオラッド・ダイ（ＢｉｏＲａｄ Ｄｙｅ）結合アッセイを用いて測定した。

２．２ ラット肝臓ミクロソームの単離（Ｒ．Ｍａｒｔｉｎｉ ＆ Ｍ．Ｍｕｒｒａｙ、「ラット肝臓ミクロソームレチノイン酸４−ヒドロキシル化へのＰ４５０ ３Ａ酵素の参加（Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ４５０ ３Ａ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｒａｔ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ ４−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ）」、Ａｒｃｈｉｖｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０３、５７−６６（１９９３）から修正された）。

約６グラムの凍結ラット肝臓（アキュリット・ケミカル・アンド・サイエンティフィック社（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．）からのハーラン・スプラーグ・ドーリー（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットから入手したもの）を、ブリンクマン・ポリトロン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）を用いて、０．１Ｍトリス／０．１Ｍ ＫＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．２５Ｍスクロース、ｐＨ７．４緩衝液３容積中に均一化した。その結果生じた組織懸濁液を、前記のモーター駆動テフロンホモジナイザーにおいてさらに均一化した。その結果生じたホモジェネートを、１０，０００ｇにおいて３０分間、２０，０００ｇにおいて３０分間、および３０，０００ｇにおいて１５分間連続的に遠心分離し、その結果生じた上澄み液を、１０５，０００ｇにおいて８０分間超遠心分離した。このペレットを前記のように５ｍＬまでの０．１Ｍ ＰＯ_４／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ／５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．４緩衝液中に超音波処理し、−７０℃でアリコートとして保存した。タンパク質濃度は、前記のように測定した。

２．３ ＡＲＡＴおよびＬＲＡＴ活性についてのアッセイ（Ｂ１を同定するため）
下記手順は、Ｊ．Ｃ．Ｓａａｒｉ ＆ Ｄ．Ｌ．Ｂｒｅｄｂｅｒｇ、「ウシレチナール色素上皮ミクロソームのＡＲＡＴおよびＬＲＡＴ活性（ＡＲＡＴ ＆ ＬＲＡＴ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｂｏｖｉｎｅ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９０、１５６−１６３（１９９０）に記載されているものの修正方法である。下記緩衝液を調製し、４℃で保存した：０．１Ｍ ＰＯ_４／５ｍＭ ジチオトレイトール、ｐＨ７．０（ＰＯ_４／ＤＴＴ）。アッセイ当日に、緩衝液１ｍＬあたり２ｍｇのＢＳＡを添加して、ＰＯ_４／ＤＴＴ／ＢＳＡ使用緩衝液を作った。１ｍＭレチノール基質を、アセトニトリル中で調製し、窒素ガス下−２０℃で黄色ビンに保存した。使用緩衝液（アリコートとして保存されているもの）中の４ｍＭパルミトイル−ＣｏＡの溶液およびエタノール中の４ｍＭジラウロイルホスファチジルコリンの溶液を調製し、−２０℃で保存した。阻害剤は、Ｈ_２Ｏ、エタノール、アセトニトリル、またはＤＭＳＯ中の１０ｍＭ保存溶液として調製した。反応停止溶液は、５０μｇ／ｍＬブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を含む純粋エタノールを用いて調製し、５０μｇ／ｍＬ ＢＨＴを含むヘキサン溶液を、抽出のために用いた。

２ドラムガラスビンに、下記のものを順に添加する。５００μＬの総容積を生じるためのＰＯ_４／ＤＴＴ／ＢＳＡ緩衝液、５μＬアシルドナー（４ｍＭパルミトイル−ＣｏＡおよび／またはジラウロイルホスファチジルコリン）、５μＬ阻害剤または溶媒ブランク（１０ｍＭ保存溶液またはその他の希釈液）、ついで約１５μｇのＲＰＥミクロソームタンパク質（１ｍｇ／ｍＬまでのミクロソームタンパク質アリコート約１５μＬ）。３７℃で５分間インキュベートして、反応温度を平衡させ、ついで５μＬの１ｍＭレチノールを添加する。これらのビンに蓋をし、５秒間渦巻き攪拌し、３７℃で３０から９０分間インキュベートする。０．５ｍＬエタノール／ＢＨＴを添加して反応を停止させる。３ｍＬヘキサン／ＢＨＴを添加してレチノイドを抽出し、これらの管を数秒間数回渦巻き攪拌し、これらの管を低速で５分間遠心分離して、これらの層を素早く分離する。上部ヘキサン層をきれいなビンの中に取り出し、前記のように別の３ｍＬヘキサン／ＢＨＴでこの水性層を再抽出する。これらのヘキサン層を組合わせ、加熱されたアルミニウムブロック上で窒素ガス流下、３７℃で乾燥することによってヘキサンを蒸発させる。ＨＰＬＣ分析まで、この乾燥残渣を−２０℃で保存する。下記のようなＨＰＬＣシグナルの統合によって、それぞれＡＲＡＴおよびＬＲＡＴ活性について、レチニルパルミテートおよびレチニルラウレートの量を定量化する。

このインキュベーション溶液が４０μＭアシルドナー、１００μＭまたはそれ以下の阻害剤、１０μＭレチノール、約３０μｇ／ｍＬミクロソームタンパク質、および約０．１Ｍ ＰＯ_４、ｐＨ７／５ｍＭ ＤＴＴ／２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むことに注意のこと。レチノールの添加後のすべての工程は、暗所または黄色灯下で実施した。

２．４ レチノールデヒドロゲナーゼ活性についてのアッセイ（Ｂ２を同定するため）
下記の保存溶液を調製した。
５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．４緩衝液、濾過滅菌されたもの、
ＤＭＳＯ中１０ｍＭオールトランスレチノール（シグマＲ７６３２）、
滅菌水中２００ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート、ナトリウム塩（ＮＡＤＰ）（シグマＮ０５０５）、
適切な溶媒中４０ｍＭテスト化合物（水、緩衝液、エタノール、クロロホルム、またはＤＭＳＯ）、
５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．４緩衝液（４μｇ／μｌ）中ラット肝臓ミクロソームの１：１０希釈液。

ネジ蓋を備えた２ドラムガラスビンに、下記のものを順序よく添加する。
４００μＬの最終容積を生じるための緩衝液、
２５μｌ希釈ミクロソーム（最終＝１００μｇ）−対照のために沸騰ミクロソームを用い、テストサンプルのために通常のミクロソームを用いる、
２００ｍＭ ＮＡＤＰ ４μｌ（最終＝２ｍＭ）、
４０ｍＭテスト化合物１μｌ（最終＝１００μＭ）、
１０ｍＭレチノール８μｌ（最終＝２００μＭ）。

３７℃振とう水浴中で４５分間ガラスビンをインキュベートする。各ガラスビンに、５００μｌの氷冷エタノールを添加し、反応を停止させる。レチノイドを氷冷ヘキサンで２回抽出する（１抽出あたり２．７ｍｌ）。第一抽出の間、各サンプルにおける抽出効率を監視する手段として、各々のガラスビンにレチニルアセテート（９００μＭ保存溶液５μｌ）を添加する。サンプルを１０秒間渦巻き攪拌し、その後ベックマンＧＳ−６Ｒ遠心分離機において、１０００ｒｐｍ、５℃で５分間静かに遠心分離した。レチノイドを含む上部ヘキサン層は、きれいな２ドラムガラスビンへの各々の抽出後、水性層から除去する。静かな窒素ガス流下、ヘキサンを蒸発除去する。ＨＰＬＣ分析まで乾燥残渣を−２０℃で保存する。

２．５ レチナールレダクターゼ活性についてのアッセイ（Ｂ３を同定するため）
すべての保存溶液は、下記のような置換えを行なって前記のように調製した。
ＤＭＳＯ中１０ｍＭオールトランスレチナルデヒド（シグマＲ２５００）（レチノールの代わり）、
２００ｍＭ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート、還元形態、四ナトリウム塩（ＮＡＤＰＨ）、滅菌液中、（シグマＮ７５０５）（ＮＡＤＰの代わり）。

ネジ蓋を備えた２ドラムガラスビンに、下記のものを順に添加する：
４００μＬの最終容積を生じるための緩衝液、
２５μＬ希釈ミクロソーム（最終＝１００μｇ）−対照のために沸騰ミクロソームを用い、テストサンプルのために通常のミクロソームを用いる、
２００ｍＭ ＮＡＤＰＨ ４μｌ（最終＝２ｍＭ）、
４０ｍＭテスト化合物１μｌ（最終＝１００μＭ）、
１０ｍＭレチナルデヒド３μｌ（最終＝７５μＭ）。

上に詳細に記載されたものと同じインキュベーションおよび抽出手順にしたがう。

２．６ ＣＲＡＢＰＩＩアンタゴニストについてのアッセイ（Ｂ４を同定するため）
２．６．１．ＣＲＡＢＰＩＩの合成
ａ．発現系
遺伝子ＣＲＡＢＰＩＩを、ｐＥＴ２９ａ−ｃ（＋）プラスミド（ノバゲン社（Ｎｏｖａｇｅｎ））中にクローンした。このクローン遺伝子は、強力なバクテリオファージＴ７転写および翻訳シグナルの制御下にあった。Ｔ７ポリメラーゼ源は、ホスト細胞Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ノバゲン社）によって供給された。この後者のものは、ＩＰＴＧの存在によって誘発される、ｌａｃＵＶ５制御下にあるＴ７ポリメラーゼの染色体コピーを有する。このプラスミドは、製造業者のプロトコル（ノバゲン社）にしたがった形質転換によって、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞に転移された。

ｂ．誘発
これらの形質転換細胞の一晩培養物を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含む２ｘＹＴ中に１：１００で希釈した。これらの細胞は、６００ｎｍにおけるＯＤが０．６から０．８に達するまで、３７℃において振とうして成長した。ついでＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度まで添加し、この培養物をさらに２時間インキュベートした。これらの細胞は、室温において１０分間５０００ｇで遠心分離によって採集した。このペレットを−２０℃で保存した。

２．６．２．精製
精製は、Ｎｏｒｒｉｓ ａｎｄ Ｌｉ、１９９７に記載されている方法にしたがって実施した。

ａ．溶解
この凍結ペレットを室温で解凍し、新たに調製された溶解緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）ナトリウムアジド、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２、２．５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、２．５ｍＭベンズアミジン、６μｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ）１から２ペレット容積中に再懸濁した。溶解物を室温で３０分間インキュベートした。それ以上の溶解は、音波処理によって実施した（１０，０００ｐｓｉにおける６回の３０秒バーストと、氷上での５回の３０秒遅延を交互に）。この溶解物の不溶フラクションを、４℃で１時間１５０００ｒｐｍにおける遠心分離によって除去し、上澄み液を−２０℃で保存する。

ｂ．セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ３００でのゲル濾過
工程ａからの上澄み液を、室温においてセファクリルＳ−３００（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））の２．５×１００ｃｍカラムに添加した。溶離緩衝液は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％アジ化ナトリウムであった（緩衝液Ａ）。流量は２ｍＬ／分であった。回収された２−ｍＬフラクションを、２８０ｎｍにおける紫外線吸光度についてチェックした。ピークを示すフラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＣＲＡＢＰＩＩの存在について調べた。

ｃ．陰イオン交換クロマトグラフィー
ＣＲＡＢＰＩＩを含む２ｍＬのゲル濾過フラクションを、第四アミン陰イオン交換カラムＦＰＬＣ（高速タンパク質液体クロマトグラフィー）型モノＱ（ファルマシア社）に添加した。ＣＲＡＢＰＩＩは、１００％緩衝液Ａから３０％緩衝液Ｂまでの勾配緩衝液（１００％緩衝液Ｂ＝緩衝液Ａ＋２５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いて、室温で２０分間にわたって溶出した。１ｍＬフラクションを毎分回収した。再度、ＣＲＡＢＰＩＩの存在をＳＤＳ−ＰＡＧＥによってチェックした。ＣＲＡＢＰＩＩを４℃で保存し、その後ガラスビンプラットホームアタッチメント（エドワーズ・ハイ・バキュアム・インターナショナル社（Ｅｄｗａｒｄｓ Ｈｉｇｈ Ｖａｃｕｕｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））を備えたマイクロモデュリョ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄｕｌｙｏ）１．５Ｋを用いて凍結乾燥した。これらの乾燥サンプルを、結合アッセイに用いるまで室温で保存した。

ｄ．ＣＲＡＢＰＩＩの存在の検出
ＣＲＡＢＰＩＩの発現および精製は、７％から１５％ポリアクリルアミドゲル（バイオラッド社）上の変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて確認した。１０μｌのサンプルと、２×負荷緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％ＳＤＳ、０．２％ＢＰＢ、２０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ）１０μｌとを混合し、加熱（８０℃で２分）によって変性した。これらのサンプルを、１×トリス−グリシン緩衝液（バイオラッド社）中に浸漬されたゲルに添加し、定電流（２５ｍＡ）を室温で１時間加えた。クマシーブルー染色後、タンパク質を、ベンチマーク着色タンパク質ラダー（ギブコ社（ＧｉｂｃｏＢＲＬ））を用いて確認された分子量にしたがって同定した。

ウエスタンブロットを用いて、ＣＲＡＢＰＩＩの存在を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離されたタンパク質を、バイオラッドカセットを用いて、イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）−Ｐトランスファーメンブレン（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））上に転移させた。この転移は、１×トリス−グリシン緩衝液（バイオラッド社）＋１０％メタノール中で行なわれた。電流（６０ｍＡ）を３時間加えて、タンパク質をこの膜を通って移動させた。その後、この膜を、室温で１時間１×ＴＢＳ中５％ドライミルクで遮断し、一晩４℃において同じ緩衝液中で、ＣＲＡＢＰＩＩへの一次抗体（マウス抗クローン５−ＣＲＡ−Ｂ３の１／１０００希釈液）でプローブした。翌日、この膜をＰＢＳで洗浄し（３×５分）、ついで室温で１時間、二次抗体、ペルオキシダーゼ共役抗マウス抗体（ＥＣＬＴＭ、アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））の１：２０００希釈液でインキュベートした。この膜を１×ＰＢＳで洗浄し（３×５分）、ＥＣＬ検出キットを用いて、製造業者の指示（アマーシャム社）にしたがってタンパク質を検出した。

精製ＣＲＡＢＰＩＩの濃度は、ＢＳＡキット（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ））を用いて測定した。

２．６．３．放射能結合アッセイ
２２０ｐｍｏｌのＣＲＡＢＰＩＩを、総容積７０μＬ中に１５ｐｍｏｌの放射性オールトランスレチノイン酸（ＮＥＮ）を有する２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４中でインキュベートした。競合アッセイのために、もう１つの過剰リガンド（６６７０：１、６７０：１、または７０：１）を、このミックスに添加した。反応は、暗所で室温において１時間行なわれた。結合オールトランスレチノイン酸から未結合オールトランスレチノイン酸を分離するために、６ｋＤカットオフミニクロマトグラフィーカラム（バイオラッド社）を用いた。保存緩衝液を、マイクロプレックス（Ｍｉｃｒｏｐｌｅｘ）マニフォールドを用いて、製造業者の指示にしたがって（ファルマシア社）処分した。これらのサンプルをカラムに添加し、分離は３０分間にわたって重力によって行なわれた。ＣＲＡＢＰＩＩに結合したレチノイン酸（「ＲＡ」）は、濾過物中に現われたが、一方、遊離ＲＡはカラムに残留した。この濾過物の放射能を、シンチレーションカウンターによって測定した。

２．７ ＮＡＤＰＨ依存性レチノイン酸酸化についてのアッセイ（Ｂ５を同定するため）
下記手順は、Ｒ．Ｍａｒｔｉｎｉ ＆ Ｍ．Ｍｕｒｒａｙ、「ラット肝臓ミクロソームレチノイン酸４−ヒドロキシル化へのｐ４５０ ３Ａ酵素の参加（Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ４５０ ３Ａ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｒａｔ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ ４−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ）」、Ａｒｃｈｉｖｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０３、５７−６６（１９９３）に記載されている方法の修正方法である。下記のアッセイ緩衝液を調製し、４℃で保存する：０．１Ｍ Ｐ０_４／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ／５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．４。アッセイ当日、緩衝液中６０ｍＭ ＮＡＤＰＨ溶液を調製する。阻害剤保存溶液、酸性化エタノール／ＢＨＴ停止溶液、およびヘキサン／ＢＨＴを上記のように調製する。１ｍＭレチノイン酸使用溶液は、１５ｍＭ保存溶液（ＤＭＳＯ中）をエタノールで希釈することによって調製した。

２ドラムバイアルに、次のものを順に添加する。最終容積５００μＬを生じるためのアッセイ緩衝液、２０μＬ ６０ｍＭ ＮＡＤＰＨ、５μＬの阻害剤または溶媒ブランク、ついで約２ｍｇのラット肝臓ミクロソームタンパク質。
３７℃で５分間インキュベートし、ついで５μＬの１ｍＭレチノイン酸使用溶液を添加する。３７℃で６０分間インキュベーションを続行するが、ガラスビンに蓋をしない。酸化プロセスには、ＮＡＤＰＨに加えて分子Ｏ_２が必要だからである。酸性化エタノール／ＢＨＴで反応を停止し、前記のようにヘキサン／ＢＨＴで抽出する。下記のようにＨＰＬＣシグナルの統合によって、急速に溶離する極性レチノイン酸代謝物（４−オキソレチノイン酸であると推測される）を定量化する。

レチノイン酸の添加後のすべての工程は、暗所あるいは黄色灯下で実施されることに注意のこと。最終インキュベーション溶液は、２．４ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１００μＭまたはそれ以下の阻害剤、１０μＭレチノイン酸、約４ｍｇ／ｍＬラット肝臓ミクロソームタンパク質、および約０．１Ｍ ＰＯ_４／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ／５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含んでいる。

個々のレチノイドのＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣによるレチノイド定量化のためのサンプルは、１００μＬのメタノールを用いて残渣を各ガラスビン中に溶解して調製した。この溶液を、１ｍＬのシェルバイアルの中の１５０μＬのガラスの円錐管に移し替え、きっちりと蓋をし、ウオーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）７１５オートサンプラー（Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ）の中に入れた。６０μＬのアリコートを直ちに注入し、レチノイド含量について分析した。

クロマトグラフィー機器は、ウオーターズ６００勾配制御器／ポンプ、ウオーターズ９９６光ダイオードアレイ検出器、およびウオーターズ４７４走査蛍光検出器から成っていた。２つのＨＰＬＣプロトコルを、レチノイド分析のために用いた。ＡＲＡＴおよびＬＲＡＴアッセイの場合、レチノールとレチノールエステルとの分離は、ウオーターズ３．９×３００ｍｍ Ｃ１８ノバパック（ＮｏｖａＰａｋ）逆相分析カラム、および１０分間、流量１ｍＬ／分に調節された８０：２０（ｖ／ｖ）メタノール／ＴＨＦイソクラテック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）移動相を有するウオーターズ・セントリー（Ｓｅｎｔｒｙ）・ノバパックＣ１８ガードカラムを用いて実施した。この溶出液を、３２５ｎｍにおける吸光度および３２５ｅｘ／４８０ｅｍにおける蛍光についてモニターした。Ａ．Ｂ．Ｂａｒｕａ、「水溶性化合物：グルコロニドの分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：Ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄｅｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８９、１３６−１４５（１９９０）によって記載された勾配系の修正例を用いて、レチノールおよびレチノイン酸酸化アッセイのためにレチノイド酸とアルコールとを分離するために、より短いウオーターズ３．９×１５０ｍｍ Ｃ１８ノバパック逆相分析カラムおよびウオーターズ・セントリー・ノバパックＣ１８ガードカラムを用いた。この系は、１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む６８：３２（ｖ／ｖ）メタノール／水から４：１（ｖ／ｖ）メタノール：ジクロロメタンまでの２０分間の線状勾配、ついで５分間の流量１ｍＬ／分維持から成っていた。このカラム溶出液を、３００ｎｍから４００ｎｍまでモニターした。

これらのプロトコルは、各アッセイにとって適切なレチノイド酸、アルコール、アルデヒド、および／またはエステルを明白に解明する能力、および分離の相対的迅速性に基づいて選ばれた。ＨＰＬＣによる個々のレチノイドの同定は、未知のピークの保持時間と、有用な真正レチノイド標準の保持時間との正確なマッチ、および有用な真正レチノイドに対する未知のピークのＵＶスペクトル分析（３００ｎｍから４００ｎｍ）に基づいていた。

トランスグルタミナーゼアッセイにおけるさらなるテストに適したブースターには、下記表Ｂ１からＢ５に挙げられたブースターが含まれるが、これらに限定されるわけではない。

ブースターまたはこれらの組合わせは、下記のトランスグルタミナーゼアッセイにおいてトランスグルタミナーゼ（以後「Ｔｇａｓｅ」）を、１０ｍＭの濃度において少なくとも５０％まで阻害する。

トランスグルタミナーゼアッセイおよびケラチン生成細胞分化
表皮中の末端分化プロセスの間、角化膜（ＣＥ）として知られているタンパク質の１５ｎｍ厚さの層が、細胞周辺部の内側表面上に形成される。このＣＥは、多くの別個のタンパク質から構成されており、これらのタンパク質は、表皮中に発現された少なくとも２つの異なるトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）の作用によって触媒されたＮ^ε−（Ｙ−グルタミル）リシンイソジペプチド結合の形成によって互いに架橋されている。ＴＧａｓｅ Ｉは、この表皮の分化層、特に顆粒層中に豊富に発現されるが、未分化基底表皮中には存在しない。したがってＴＧａｓｅＩは、さらに分化された状態を示す高いＴＧａｓｅ Ｉレベルを有する表皮ケラチン生成細胞分化の有用なマーカーである。ＴＧａｓｅ Ｉ抗体を用いるＥＬＩＳＡベースのＴＧａｓｅ Ｉアッセイを用いて、下記実施例における培養ケラチン生成細胞の分化の状態を評価した。

ケラチン生成細胞（前記のように培養されたもの）を、２００μｌ培地中１ウエルあたり４，０００から５，０００細胞の密度で、９６ウエルプレート中において培養した。２から３日間のインキュベーション後、または細胞が約５０％密集成長するまで、この培地を、テスト化合物を含む培地に変えた（１テストあたり５反復）。これらの細胞をさらに９６時間培養し、その後この培地を吸引し、これらのプレートを−７０℃で保存した。プレートをフリーザーから取り出し、これらの細胞を２００μｌの１×ＰＢＳで２回洗浄した。これらの細胞を、室温（Ｒ／Ｔ）において１時間、ＴＢＳ／５％ＢＳＡ（洗浄緩衝液、ウシ血清アルブミン）でインキュベーションした。次に、ＴＧａｓｅ一次抗体を添加した。洗浄緩衝液中１：２０００希釈した５０μｌのモノクローナル抗−ＴＧａｓｅＩＡｂ Ｂ．Ｃ．。この一次抗体を３７℃で２時間インキュベートし、ついで洗浄緩衝液で６×濯ぎ洗いを行なった。ついで細胞を、３７℃で２時間、洗浄緩衝液中に１：４，０００希釈された５０μｌの二次抗体（Ｆａｂ断片、アマーシャム社から得られるペルオキシダーゼ共役抗マウスＩｇＧ）でインキュベートし、ついで洗浄緩衝液で３回濯ぎ洗いを行なった。洗浄緩衝液での濯ぎ洗いに続いて、これらの細胞をＰＢＳで３×濯ぎ洗いした。比色展開のために、これらの細胞を、暗所で（アルミニウムホイル下）、室温で正確に５分間、１００μｌ基質溶液（４ｍｇのｏ−フェニレンジアミンおよび１０ｍｌ ０．１Ｍクエン酸塩緩衝液ｐＨ５．０中の３．３μｌ ３０％ Ｈ_２Ｏ_２）でインキュベートした。反応は、５０μｌの４Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４の添加によって停止した。サンプルの吸光度を、９６ウエルプレートＵＶ分光光度計で４９２ｎｍにおいて読取った。５反復のうち４つを両方の抗体で処理し、５つ目の複製をＴＧａｓｅバックグラウンド対照として用いた。ＴＧａｓｅレベルを測定し、パーセンテージ対照として表示した。

トランスグルタミナーゼレベルを測定し、前記表のＢ１からＢ５において下記のどちらかとして表示した。
（ｉ）％（ブースター＋レチノール阻害／対照阻害）−％（ＲＯＨ阻害／対照阻害）、これは、レチノール単独よりも優れた、ブースター＋レチノール誘発ＴＧａｓｅ阻害の追加の効果を測定する。あるいは、
（ｉｉ）多ブースター濃度の阻害効果が調べられた時のＩＣ５０値として。これは、１０^−７Ｍの一定のレチノール濃度と組合わせた場合にＴＧａｓｅを５０％阻害するブースターの濃度を提供する。

本発明において基準として用いられるのはＩＣ５０値である。

フィトエストロゲン
本発明の一部として、驚くべきことに、フィトエストロゲンはレチノイドの皮膚効果を相乗作用的に改良することが発見された。本質的にはフィトエストロゲンがレチノイドへの皮膚の感受性を高める。

したがって本発明は、第二組成物中に、約０．００１％から約１０％の少なくとも１つのフィトエストロゲンを含む。

フィトエストロゲンには、フラボノイド、例えばエストロゲンフラボノイド、ゲニステイン、ダイゼイン、グリシチン、ビオカニンＡ、フォルモノネチン（ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ）、およびイクオール（ｅｑｕｏｌ）、およびこれらの混合物、ゲニステインおよびダイゼインのアセチルおよびマロニルエステル、およびゲニステインおよびダイゼインのグルコシドが含まれる。前記リストは排他的なものではなく、当業者に知られているその他のフィトエストロゲンを含めてもよいことに注意すべきである。

二重区画包装
レチノイド類を含む組成物は一般に不安定であり、化学分解を受けることがある。さらには、ブースターはレチノイド効果を向上させるのに有利であるが、驚くべきことに、同時にレチノイドの化学的不安定性にも寄与することが発見された。ブースター誘発のレチノール不安定化は、両方の成分が単一配合物に含まれている時に、高められたレチノイド組成物の全体の有効性を減少させる。したがってレチノイド崩壊に対して保護する一方で、なおもレチノイドブースターの有利な効果を与えるために、本発明は、第一区画にレチノイドを含んでいる第一組成物、および第二区画に少なくとも１つのレチノイドブースターを含んでいる第二組成物が入っている二重区画包装を提供する。第一組成物は皮膚に第一効果を与えるが、一方、第二組成物は、第一効果の作用を高めるかまたは向上させる働きをする。

さらなるレチノイド向上効果として、フィトエストロゲンは、本発明の必須成分である。フィトエストロゲン、例えばゲニステインとダイザインとはレチノイドと相乗作用的に相互作用を行なって皮膚効果をもたらす。しかしながらフィトエストロゲンは、酸化の原因になり、したがってレチノイドの分解の原因になる。したがって本発明は、第一効果の作用をさらに向上させるために、二重区画包装の第二区画において第二組成物の一部としてフィトエストロゲンを提供する。

この二重区画包装は、２つの別々の容器において第一組成物と第二組成物とを供給するという目的が達成されるかぎり、当業者に知られた様々な方法で設計されていてもよい。１つの実施態様において、この二重区画包装は、隣接して付着された２つのつぼまたはビンの形態にある。第二実施態様において、この二重区画包装は、ビン／つぼの内部を第一区画と第二区画とに分けている区域を有する単一のビン／つぼの形態にある。これらの組成物が別々に保持されているかぎり、他の実施態様も本発明の範囲内にあると考えられる。

化粧品的に許容しうるビヒクル
本発明による製品はまた、この組成物が皮膚に付けられる時にその分布を促進するように、第一組成物と第二組成物とのどちらかまたはその両方において、活性成分用の希釈剤、分散剤、またはキャリヤーとして作用するための、化粧品的に許容しうるビヒクルも含んでいる。

水以外のビヒクル、または水に加えてのビヒクルには、液体または固体エモリエント、溶剤、湿潤剤、増粘剤、および粉末を含めることができる。特に好ましい非水性キャリヤーは、ポリジメチルシロキサンおよび／またはポリジメチルフェニルシロキサンである。この発明のシリコーンは、２５℃において約１０センチストークスから１０，０００，０００センチストークスの粘度を有するものであってもよい。特に望ましくは、低粘度シリコーンと高粘度シリコーンとの混合物である。これらのシリコーンは、ジェネラル・エレクトリック社（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ）から商標ビカシル（Ｖｉｃａｓｉｌ）、ＳＥ、およびＳＦとして、ダウ・コーニング社（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）から２００および５５０シリーズとして入手しうる。この発明の組成物に用いることができるシリコーンの量は、この組成物の５重量％から９５重量％、好ましくは２５から９０重量％の範囲にある。

選択的な皮膚効果物質および化粧品添加剤
本発明の第一組成物および第二組成物のうちのどちらか１つまたは両方において、油中水エマルジョンあるいは水中油エマルジョンを供給するための乳化剤とともに、主として、用いられる乳化剤の平均親水性親油性バランス（ＨＬＢ）に応じて、油または油性物質が存在してもよい。

様々な種類の活性成分が、本発明の第一化粧品組成物および第二化粧品組成物のどちらか１つまたは両方に存在してもよく、これらは下に記載されている。活性物質は、エモリエント以外、および単にこの組成物の物理的特徴を改良する成分以外の、皮膚または毛髪効果剤として規定される。このカテゴリーに限定されるわけではないが、一般的な例には、日焼け止め剤、皮膚を明るくする作用物質、日焼け剤が含まれる。

日焼け止め剤は、紫外線光を遮断するために通常用いられている物質を含む。化合物の例は、ＰＡＢＡ誘導体、シンナメート、およびサリチレートである。例えばオクチルメトキシシンナメートおよび２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（オキシベンゾンとしても知られている）を用いることができる。オクチルメトキシシンナメートおよび２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノンは、それぞれ商標パーソル（Ｐａｒｓｏｌ）ＭＣＸおよびベンゾフェノン−３という商品として入手しうる。

エマルジョンに用いられる日焼け止め剤の正確な量は、日光のＵＶ放射線から望まれる保護の程度に応じて変えることができる。

もう１つの好ましい選択的成分は、必須脂肪酸（ＥＦＡ）、すなわち、すべての細胞の原形質膜形成にとって必須である脂肪酸から選ばれる。ケラチン生成細胞において、ＥＦＡ欠乏は細胞を超増殖性にする。ＥＦＡの補足がこれを補正する。ＥＦＡはまた、表皮の脂質生合成も向上させ、表皮のバリアー形成のための脂質を供給する。これらの必須脂肪酸は好ましくは、リノール酸、Ｙ−リノレン酸、ホモ−Ｙ−リノレン酸、コロンビン酸、エイコサ−（ｎ−６，９，１３）−トリエン酸、アラキドン酸、Ｙ−リノレン酸、チムノドン酸、ヘキサエン酸、およびこれらの混合物から選ばれる。

多くの場合、本発明の化粧品組成物中にエモリエントが組込まれる。このようなエモリエントのレベルは、総組成物の約０．５重量％から約５０重量％、好ましくは約５重量％から３０重量％であってもよい。エモリエントは、例えばエステル、脂肪酸、およびアルコール、ポリオール、および炭化水素などの一般的な化学カテゴリーに分類することができる。

エステルは、モノ−またはジ−エステルであってもよい。脂肪ジ−エステルの許容しうる例には、ジブチルアジペート、ジエチルセバケート、ジイソプロピルジメレート、およびジオクチルスクシネートが含まれる。許容しうる枝分かれ鎖脂肪エステルには、２−エチル−ヘキシルミリステート、イソプロピルステアレート、およびイソステアリルパルミテートが含まれる。許容しうる三塩基性酸エステルには、トリイソプロピルトリリノレエート、およびトリラウリルシトレートが含まれる。許容しうる直鎖脂肪エステルには、ラウリルパルミテート、ミリスチルラクテート、オレイルユルケート（ｅｕｒｃａｔｅ）、およびステアリルオレエートが含まれる。好ましいエステルには、ココカプリレート／カプレート（ココ−カプリレートとココ−カプレートとのブレンド）、プロピレングリコールミリスチルエーテルアセテート、ジイソプロピルアジペート、およびセチルオクタノエートが含まれる。

適切な脂肪アルコールおよび酸には、１０個から２０個の炭素原子を有する化合物が含まれる。特に好ましくは、例えばセチル、ミリスチル、パルミチンアルコールおよびステアリルアルコール、およびパルミチン酸およびステアリル酸である。

エモリエントとしての役目を果たしうるポリオールには、線状および枝分かれ鎖アルキルポリヒドロキシル化合物がある。例えばプロピレングリコール、ソルビトール、およびグリセリンが好ましい。同様に、ポリマーポリオール、例えばポリプロピレングリコールおよびポリエチレングリコールも有用であろう。ブチレンおよびプロピレングリコールも、浸透促進剤として特に好ましい。

エモリエントとしての役目を果たしうる炭化水素の例は、１２個から３０個の炭素原子の炭化水素鎖を有するものである。具体例には、鉱油、石油ゼリー、スクアレン、およびイソパラフィンが含まれる。

本発明の化粧品組成物中の機能成分のもう１つのカテゴリーは、増粘剤である。増粘剤は通常、この組成物の０．１重量％から２０重量％、好ましくは約０．５重量％から１０重量％の量で存在する。増粘剤の例は、Ｂ．Ｆ．グッドリッチ社（Ｂ．Ｆ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ）から商標カルボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）として入手しうる架橋ポリアクリレート物質である。ガム、例えばキサンタン、カラゲーナン、ゼラチン、カラヤ、ペクチン、およびイナゴマメガムなどを用いることができる。ある一定の条件下、増粘機能はシリコーンまたはエモリエントとしても役立つ物質によって得ることができる。例えば１０センチストークス以上のシリコーンガムおよび例えばグリセロールステアレートなどのエステルは、二重の機能を有する。

本発明の化粧品の第一化粧品組成物および第二化粧品組成物のうちの１つまたは両方に、粉末を組込んでもよい。これらの粉末には、チョーク、タルク、フラー土、カオリン、デンプン、スメクタイト粘土、化学的に変性されたマグネシウムアルミニウムシリケート、有機的に変性されたモンモリロナイト粘土、水和アルミニウムシリケート、ヒュームドシリカ、アルミニウムデンプンオクテニルスクシネート、およびこれらの混合物が含まれる。

その他の添加剤微量成分も同様に、本発明の化粧品の第一組成物および第二組成物のうちの１つまたは両方に組込まれてもよい。これらの成分には、着色剤、乳白剤、および香料が含まれてもよい。これらの物質の量は、この組成物の０．００１重量％から２０重量％までの範囲であってもよい。

本発明の化粧品の第一組成物および第二組成物は主として、ヒトの皮膚への局所使用のための製品として、特に皮膚のコンディショニングおよびスムージングのため、および小じわの寄ったまたは老化した肌の外見を予防または減少させるための作用物質として意図されている。

使用時、少量、例えば１ｍｌから５ｍｌの第一組成物を、適切な容器またはアプリケーターから皮膚の暴露区域に付け、ついで必要であればこれを、手または指または適切な器具を用いて皮膚の上に伸ばすか、および／または皮膚の中にすり込む。同時に、少量、例えば１ｍｌから５ｍｌの第二組成物を、適切な容器またはアプリケーターから皮膚の暴露区域に付け、必要であればこれも同様に、手または指または適切な器具を用いて皮膚の上に伸ばすか、および／または皮膚の中にすり込む。したがって望まれる処理効果の強度に応じて、第一組成物および第二組成物は、単独で、または同時に、または連続的に用いられてもよい。

製品形態および包装
本発明の局所皮膚処理組成物は、ローション、流動クリーム、クリーム、またはジェルとして配合することができる。

方法
レチノール（トウイーン８０中５０％）を、約５０％水性エタノール中に溶解し、標準９６ウエル分光光度計を用いて９６ウエルプレート中２００μｌ容積で測定された時に約０．６の３６０ｎｍにおけるＯＤを生じる溶液を用意した。

ブースター分子を約０．１％の濃度で添加後、上記の通りＯＤ３６０を、添加直後および６０時間後に、室温、暗所にて測定した。プレートからの溶剤の蒸発により増加したレチノール濃度の原因を説明するために、６０時間後にＯＤに修正を加えた（０．８５で割る）。

テストされたブースターは、顕著なレチノールの不安定性の増加を引き起こした。

このことから、ブースターが用いられた時に、レチノール単独の場合に必要とされるものと比較して、かなり良好な安定性をレチノールに与える配合／包装の選択を用いる必要がある。

トランスグルタミナーゼ発現の相乗作用阻害が、Ｂ１およびＢ５活性化合物とレチノールとの組合わせによって発生したかどうかを立証するために、レチノールの存在下に個々にテストされた時に、これらの活性化合物の用量応答プロフィール（ＩＣ５０値を含む）を決定することが重要である。このデータは、レチノールの存在下における活性化合物の混合物の相乗作用を確認することを可能にするために、各活性化合物の適切な亜最大阻害濃度を決定するために用いられた。２つの化合物の相乗作用を証明するために、多くてもせいぜいＩＣ２０であるようなテストのための濃度、換言すればトランスグルタミナーゼ発現のレチノール阻害を個々に２０％高める化合物濃度を選択することが重要である。このような２つの化合物は、４０％の付加的阻害を有すべきである。濃度を決定するためにこの戦略を用いることによって、試験中のこれら２つの化合物の相乗作用を検出するために、さらなるトランスグルタミナーゼ阻害のために４０％から１００％のウインドウを残す。さらに難しい濃度基準は、単独ではトランスグルタミナーゼの高められたレチノール阻害を示さない化合物の濃度を選択する。しかしながらこの研究において本発明者らは、さらに難しい基準を選んだ。本発明者らは、最小限に効果的なトランスグルタミナーゼの阻害的濃度よりも１０倍および１００倍も低い化合物濃度を選んだ。このように非常に低い濃度を用いた相乗作用の組合わせの確認は、最も効果的な相乗作用の組合わせが確認されたことを意味する。

下記表におけるデータは、最小限に阻害的な化合物濃度よりも２対数低い化合物の濃度を表わす。これらは、Ｂ１／Ｂ５の組合わせの研究に用いられた濃度であった。

Ｂ１およびＢ５活性化合物とレチノールとの組合わせによるトランスグルタミナーゼ発現の相乗作用阻害を調査するために、化合物の選択された組合わせを、上記表に示された濃度においてテストした。下記のデータが得られた。

Ｂ１／Ｂ５の組合わせの有効性は、２つの種類に分けられる。すなわち、特に効果的な組合わせ（上の表中の太字）とほとんど効果的でない組合わせ（太字でない）である。あるいくつかのＢ１／Ｂ５の組合わせが他の組合わせよりも良好な作用を行なうことは、意外であった。ほとんど効果のない組合わせは、（ｉ）脂肪酸アミド＋アゾール、（ｉｉ）ヒドロキシ脂肪酸アミド＋アゾール、および（ｉｉｉ）ナリンゲニン／ケルセチン＋アゾールであった。効果的な組合わせは、下記の種類からのＢ５ブースターと組合わされたＢ１ブースターを含んでいた。すなわち、脂肪ヒドロキシエチルイミダゾリン界面活性剤、環式脂肪族不飽和化合物、多環式トリテルペン、ｎ−置換脂肪酸アミドである。

この実施例では、レチノイドとフィトエストロゲンとの相乗作用を示す。

（ａ）細胞培養方法：
２５歳から３０歳の女性志願者の太陽光線から保護された、腕の内側から得られたヒトの成人の繊維芽細胞を用いた。細胞を、１０％ＦＢＳを含む１：１ＤＭＥＭ／Ｈａｍｓ Ｆ１２培地中で成長させ、標準大気酸素圧下５％ＣＯ_２雰囲気中で３７℃に維持した。第三継代の成人繊維芽細胞を、１２ウエルプレートにおいて２５００細胞／ｍｌ／ウエルの接種密度で１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中に成長させた。８０％密集成長にあるこれらの細胞を、無血清かつ無フェノールレッド（ＰＲＦ）ＤＭＥＭ培地中で２回濯ぎ洗いした。４時間フィト−化合物での前処理を実施し、ついでレチノイドを投与し、４８時間インキュベートした。インキュベーション後、これらのウエルを１×ＰＢＳで２回洗浄し、この細胞単層を、１００μｌ細胞溶解緩衝液（１×ＰＢＳ、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ、０．５％ナトリウムデオキシコレート、プロテアーゼ阻害剤（イソプロパノール中１０ｍｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ、１０μｌ／ｍｌ）を含む０．１％ＳＤＳを含む）中に採集した。この懸濁液を、１４０００ｒｐｍで１０分間回転させ、上澄み液を回収し、この上澄み液のアリコートをタンパク質定量化に用いた。タンパク質濃度を、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）タンパク質キットを用いて測定した。１００μｌ上澄み液（細胞溶解物）の残りは、このサンプルを５分間沸騰させて４０μｌサンプル緩衝液（ノベックス（ＮＯＶＥＸ））と０．５％ベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ）との混合物中に変性させた。ついで等量のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質分析、およびＣＲＡＢＰ−２タンパク質発現に対するウエスタン免疫ブロッティングのために、１６％トリス−グリシンゲル上に載せた。

（ｂ）細胞レチノイン酸結合タンパク質２（ＣＲＡＢＰ−２）の検出：
これらの細胞中で、レチノールおよびレチノイン酸は、特異的細胞結合タンパク質に結合され、これらの主要タンパク質のうちの２つは、ＣＲＡＢＰ−１およびＣＲＡＢＰ−２である（Ｒｏｏｓら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ：５０、３１５−３３３、１９９８）。これらのタンパク質は、レチノイド代謝において、保存またはシャトルタンパク質のどちらとしても作用することによって、レチノイドの細胞内濃度を調節するように作用する。高レベルまたは低レベルのレチノイドが、細胞死を含む細胞損傷を引き起こし、したがってレチノイドおよびその結合タンパク質の一定レベルの調節は、細胞生存に対して非常に重大なものである。このタンパク質のこれらのレベルは、これらの細胞中のレチノイン酸の量によって調節される。レチノイドの比較的高い細胞レベルは、ＣＲＡＢＰ−２の発現を増加させる。したがって細胞中のこのタンパク質の量は、これらの細胞のレチノイド活性の尺度である。皮膚細胞は、表皮と真皮との両方に、高レベルのＣＲＡＢＰ−２を含む。試験管内繊維芽細胞におけるレチノイド投与へのＣＲＡＢＰ−２応答は、ヒトの皮膚応答を予測するレチノイド生物活性の再現可能な尺度として用いられる（Ｅｌｄｅｒら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０６：５１７−５２１、１９９６）。ＣＲＡＢＰ−２における増加はまた、増加した表皮分化および真皮レチノイド作用とも関連がある。したがってこれらの研究において、本発明者らは、表皮分化の増加（皮膚のコンディショニングおよび乾燥肌効果）、および真皮コラーゲンおよび細胞外マトリックス合成（老化防止、小じわ防止効果）を生じるレチノイド活性の尺度として、繊維芽細胞のＣＲＡＢＰ−２発現を用いた。

繊維芽細胞中のＣＲＡＢＰ−２のレベルを測定するために、細胞上澄み液の等量のタンパク質を、製造業者によって指示されているように、ドットブロット装置においてニトロセルロースブロット上に載せ、標準的手順にしたがって、ＣＲＡＢＰ−２へのモノクローナル抗体を用いて免疫染色を実施した。ＣＲＡＢＰ−２タンパク質バンドは、サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（カリフォルニア州サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＣＡ））から入手した化学発光系を用いて、ドットブロットにおいて視覚化された。このフィルムにおけるバンドは、デンシトメトリック走査によって定量化され、三組の重複製サンプルからのデータは、対照の％として計算され、下記表において、対照を超える増加％（対照を１００％として）＋／−ＳＤ三組のとして表示された。

この実施例では、フィトエストロゲンフラボノイドの存在下におけるレチノールの安定性を示す。

レチノールを、水性エタノール（１：１水：エタノール）中１０％溶液として溶解した。この溶液を、０．００１％、約３０μＭまで希釈した。この溶液は、９６ウエルプレート分光光度計で３６０ｎｍにおいて約０．３５吸収単位のＯＤを生じた。

ゲニステイン、ダイゼインの水性エタノール保存溶液を、０．１％、０．０１％、または０．００１％として調製した。９６ウエルプレートにおける２００μｌの０．００１％レチノール溶液に、２０μｌのフラボノイドを添加する（すなわち１から１０希釈）と、０．０１、０．００１、および０．０００１％の最終フラボノイド濃度を生じた。これらのプレートを混合し、３６０ｎｍにおいて最初のＯＤ読取りを行なった。これらのプレートを、室温において暗所で２日間までインキュベートし、その後の読取りを、８、２４、および４８時間目に行なった。これらの時点におけるＯＤ読取りを、０時点の読取りに標準化した。レチノール安定性を、０時におけるレチノールの％（ＯＤ読取り）として表示した。データを実施例５に示す。

下記２つの表において、ゲニステインおよびダイゼインとレチノイドとの相乗作用を試験した。これらの調査のどちらにおいても、ゲニステインを、ＤＭＳＯ：エタノール中の可溶性形態で細胞に送達した。単独の１μＭのゲニステインは、ＣＲＡＢＰ−２を有意に刺激した。ゲニステインおよびダイゼインの両方が、相乗作用的にレチノイド活性を刺激する。レチニルアセテート以外のテストされたすべてのレチノイドは、ゲニステインおよびダイゼインとの相乗作用を示した。これらのデータは、フィトエストロゲンフラボノイドのゲニステインおよびダイゼインが、可溶性形態で細胞に供給された時、レチノイドの活性を相乗作用的に向上させるという本発明者らの主張を裏付ける。

実施例５：下記の表は、レチノールの不安定化に対するゲニステインおよびダイゼインの効果を示している。この実験は、方法のセクションに記載されているように実施した。二重の測定からのＯＤ読取りを平均し、ここに示した。

作用物質の不存在下における単独のレチノールは、ゆっくりと分解した（８時間までに８％、２４時間までに１４％、４８時間までに１９％）。しかしゲニステインおよびダイゼインの存在下では、レチノールの分解は加速された。早ければ８時間で、レチノールの１６％から１８％が、これらのフラボノイドの存在下において分解された。このことは、ゲニステインおよびダイゼインの両方が、レチノールの不安定性に顕著な増加を引き起こしたことを示唆している。このことによって、レチノイドとフラボノイドとを含む製品において、レチノール用に１つの区画、フラボノイド用にもう１つの区画という特別な包装を用いることが必要となる。

本発明は本明細書において、ある具体性をもって、およびこれらのあるいくつかの好ましい実施態様を参照して記載されてはいるが、当業者なら、本発明の範囲および精神の範囲内にあり、かつ実施することができる、記載されている発明の多くの変形例、修正例、および置換例が分かるであろう。これら全ての修正例および変形例は、本明細書に記載され、かつ特許請求されている本発明の範囲内にあり、これらの発明は、特許請求の範囲によってのみ限定され、かつこのような特許請求の範囲は合理的であるかぎり幅広く解釈されるものとする。この出願全体において、様々な出版物が引用されている。これらの出版物の各々の全体が、参照して本発明に組込まれる。

Claims (10)

1. ０．００１％から１０％のレチノイドを含む第一組成物、
   ０．０００１％から５０％の少なくとも１つのレチノイドブースターであって、バニリン、アラキジン酸、リノール酸、ミリスチン酸、アムサクリン、カルベノキソロン、グリチルレチン酸、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるものと、０．００１％から１０％の少なくとも１つのフィトエストロゲンとを含む第二組成物、
   第一組成物を保存するための第一区画、並びに
   第二組成物を保存するための第二区画であって、第一区画と第二区画とが互いに接合されている区画を含む、安定スキンケア製品。
2. 第二組成物が、少なくとも２つのレチノイドブースターを、０．０００１％から５０％の量において有する、請求項１に記載の安定スキンケア製品。
3. レチノイドが第一効果を与え、ブースターおよびフィトエストロゲンが第一効果を高める、請求項１または２に記載の安定スキンケア製品。
4. ゲニステイン、ダイゼイン、グリシチン、ビオカニンＡ、フォルモノネチン（ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ）、イクオール（ｅｑｕｏｌ）およびこれらの混合物から選択される、少なくとも１つのフィトエストロゲンを含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の安定スキンケア製品。
5. レチノイドブースターが、グリチルレチン酸、ホスファチジルコリンおよびそれらの混合物からなる群から選択される請求項１に記載の安定スキンケア製品。
6. レチノイドブースターが、グリチルレチン酸およびホスファチジルコリンである請求項２に記載の安定スキンケア製品。
7. 皮膚の落屑を改良するための薬剤の調製における、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の安定スキンケア製品の第一組成物および第二組成物の使用。
8. 表皮分化を改良するための薬剤の調製における、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の安定スキンケア製品の第一組成物および第二組成物の使用。
9. 乾燥肌、にきび、光損傷肌、小じわの外見、加齢斑、および／または老化肌の処置、角質層の柔軟性の増加、肌の色を明るくすること、および／または皮脂分泌の制御のための薬剤の調製における、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の安定スキンケア製品の第一組成物および第二組成物の使用。
10. 乾燥肌、にきび、光損傷肌、小じわの外見、加齢斑、および／または老化肌の処置、角質層の柔軟性の増加、肌の色を明るくすること、皮脂分泌の制御、皮膚の落屑の改良、および／または表皮分化の改良のための、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の安定スキンケア製品。