CN1662216B - 含有模拟视黄酸皮肤作用的化合物的皮肤调理组合物 - Google Patents

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Abstract

一种护肤产品，含有约0.001％-约10％的类维生素A，与0.0001％-约50％的类维生素A增效剂的组合物。

Description

含有模拟视黄酸皮肤作用的化合物的皮肤调理组合物
本发明涉及含有某些模拟视黄酸的皮肤作用的化合物的皮肤调理化妆品组合物。
视黄醇(维生素A)是一种天然存在于人体中的内源性化合物，并且是正常上皮细胞分化所必需的。天然和合成的维生素A衍生物业已广泛应用在多种皮肤疾病的治疗中并且用作皮肤修复或更新剂。视黄酸已经用来治疗多种皮肤疾病，例如痤疮、皱纹、牛皮癣、老年斑和变色。参见譬如Vahlquist，A.等，J.Invest.Dermatol.，94卷，Holland D.B.和Cunliffe，W.J.(1990)，496-498页；Ellis，C.N.等，″皮肤中视黄醇的药理学″，Vasel，Karger，3卷，(1989)，249-252页；Lowe，N.J.等，″皮肤中视黄醇的药理学″，3卷，(1989)，240-248页；PCT专利申请WO 93/19743。
人们相信视黄醇酯和视黄醇在酶作用下按照下列机理在皮肤内转化为视黄酸：
视黄醇在表皮中的代谢：
酶名称
本发明基于发现了某些提高视黄酯和视黄醇向视黄酸的转化作用的化合物。所述的化合物总称为″增效剂″并且按照具体化合物的增效机理划分为B1-B5组。增效剂组的机理如下所述：抑制ARAT/LRAT(脂酰辅酶A(CoA)：视黄醇酰基转移酶/卵磷脂：视黄醇酰基转移酶)活性(B1)，增强视黄醇脱氢酶活性(B2)，抑制视黄醛还原酶活性(B3)，拮抗视黄酸的CRABP-II(细胞视黄酸结合蛋白II)结合(B4)，和抑制细胞色素P450依赖性视黄酸的氧化(B5)。
所述的增效剂单独或彼此组合可以通过提高类维生素A向视黄酸的转化作用和防止视黄酸的降解来加强类维生素A的作用。所述的增效剂与类维生素A(例如视黄醇、视黄酯、视黄醛、视黄酸)联合作用，后者内源性存在于皮肤中。然而，优选的组合物，在组合物中包括与增效剂或增效剂的组合共存的类维生素A，使性能最佳化。
Granger等的若干专利描述了类维生素A增效剂在化妆品组合物中提高视黄醇和视黄酯的功效的用途(美国专利号：5759556，5756109，5747051，5716627，5811110，5536740，5747051，5599548，5955092，5885595，5759556，5693330)。这些专利中描述的增效剂局限在B1和B5类。此外，Johnson & Johnson持有一系列的专利，它们描述了属于第5类增效剂分子的分子的用途(U.S.5028628；U.S.5037829；U.S.5151421；U.S.476852；U.S.5500435；U.S.5583136；U.S.5612354)。
起类维生素A增效剂作用的分子是化妆品中的普通组分。现有技术大量描述了其在化妆品组合物中的用途。大多数现有技术公开了两种或多种此类分子在相同组合物中的用途。现有技术的一些实例是US5,665,367，US 5747049，US 5853705，US 5766575，和US 5849310。
然而，现有技术没有阐述过由增效剂分子的组合所导致的协同作用。观察到增效剂分子的组合对类维生素A活性的协同增效是意外发现。现有技术没有公开增效剂分子的最佳浓度或比例或增效剂分子与类维生素A的比例。所以，在通过将化妆用类维生素A与增效剂分子以最适当浓度或比例组合从而显著提高类维生素A的功效方面，本发明是有新颖性的。
适合在本发明中使用的增效剂种类包括但不限于下表所列的B1-B5的增效剂。
最佳增效剂组
B1化合物
  1.脂肪酸酰胺类   这些物质容易商购并且具有作为表面活性剂的附加优点，因此有助于生成适合化妆品制剂的乳液。
  2.神经酰胺类   这些物质可以附加地起到角质层屏障神经酰胺的前体的作用。
  3.类胡萝卜素类   这些物质可以提供某种UV防护作用并起天然色素的作用。
  4.黄烷类化合物   天然抗氧剂。
  5.环状香料   这些物质容易商购并且还可以用于使产品具有芳香。
  6.非环状香料   这些物质可以用来使产品具有芳香。
  7.磷脂类似物   这些物质被皮肤细胞用来滋养屏障组分的产生。
  8.脲类   这些物质容易商购并还可以用作产品的防腐剂。
B2化合物
  1.磷脂酰胆碱   最优选作为视黄醇脱氢酶的最高活性激活剂。
  2.鞘磷脂
B3化合物
  花生四烯酸亚油酸亚麻酸肉豆蔻酸   维持角质层屏障的脂肪酸
  亚油酸亚麻酸   必需脂肪酸
  花生四烯酸肉豆蔻酸   非必需脂肪酸
  甘草次酸   容易由植物来源获得的多环三萜羧酸
  磷脂酰乙醇胺   可以掺混入细胞膜
B4化合物
  十六烷二酸12-羟基硬脂酸异硬脂酸   饱和脂肪酸
  亚麻子油反油酸   不饱和脂肪酸
  反油酸异硬脂酸十六烷二酸   室温下为固体
  亚麻子油12-羟基硬脂酸   室温下为液体
B5化合物
  联苯苄唑苯咪丁酮克霉唑氯氧甲苯咪唑酮康唑咪康唑   抗微生物剂(Antimicotics)
  苯咪丁酮   容易商购
  月桂基羟乙基咪唑啉   容易商购并具有作为表面活性剂的附加优点且因此有助于生成适合化妆品制剂的乳液的化合物
  槲皮素   具有抗氧剂性质的天然黄烷类化合物
  香豆素   天然着色剂
  喹啉类异喹啉类
  美替拉酮
本发明部分地包括一种皮肤调理组合物，其含有占该组合物约0.0001％-约50％(重量)，优选0.001％-10％(重量)，最优选0.001％-5％(重量)的增效剂或增效剂的组合和化妆可接受载体。
含在本发明组合物中的所述增效剂或其组合选自：
(a)选自B2；B3；B4组的增效剂；
(b)选自下组的二元增效剂组合：B1/B2；B1/B3；B1/B4；B1/B5；B2/B3，B2/B4；B2/B5，B3/B4；B3/B5；B4/B5
(c)选自下组的增效剂的三元组合：B1/B2/B3；B1/B2/B4；B1/B2/B5；B1/B3/B4；B1/B3/B5；B1/B4/B5；B2/B3/B4；B2/B3/B5；B2/B4/B5；B3/B4/B5
(d)选自下组的增效剂的四元组合：B1/B2/B3/B4；B1/B2/B3/B5；B1/B2/B4/B5；B1/B3/B4/B5；B2/B3/B4/B5；
和
(e)五组增效剂的组合：B1/B2/B3/B4/B5。
优选的组合物含有占该组合物约0.001％-约10％(重量)的类维生素A。
本发明中所含作为增效剂的化合物是基于这些化合物在表A所列的某些浓度下通过在下文部分2.1-2.7中所述对特定酶的体外试验的能力来选择的。此类增效剂包含在本发明中，即使在此没有作详细描述。换言之，如果化合物在下述试验中充分抑制或增强酶，它将与类维生素A组合起模拟视黄酸对角质细胞(皮肤细胞)的作用，并因此属于本发明的范围内。
在此所用的术语″调理″是指对干燥皮肤、痤疮、光损伤皮肤、皱纹的出现、老年斑、老化皮肤的预防和治疗，提高角质层弹性，使肤色增亮，控制皮脂分泌和全面提高皮肤的质量。所述的组合物可以用来改善皮肤脱落和表皮分化。
选定化合物在本发明产品中的存在显著提高了类维生素A的性能。
本发明组合物含有类维生素A作为优选成分，其选自视黄酯、视黄醇、视黄醛和视黄酸，优选视黄醇或视黄酯。术语″视黄醇″包括下列视黄醇的异构体：全反式视黄醇，13-顺式-视黄醇，11-顺式-视黄醇，9-顺式-视黄醇，3，4-二脱氢视黄醇，3，4-二脱氢-13-顺式-视黄醇；3，4-二脱氢-11-顺式-视黄醇；3，4-二脱氢-9-顺式-视黄醇。优选的异构体是全反式视黄醇，13-顺式-视黄醇，3，4-二脱氢-视黄醇，9-顺式-视黄醇。最优选全反式视黄醇，因为其可以广泛商购。
视黄酯是视黄醇的酯。术语″视黄醇″业已在上文定义。适用于本发明的视黄酯是视黄醇的C1-C30酯，优选C2-C20酯，并且最优选C2、C3和C16酯，因为它们更容易商购。视黄酯的酯包括但不限于：棕榈酸视黄酯、甲酸视黄酯、乙酸视黄酯、丙酸视黄酯、丁酸视黄酯、戊酸视黄酯、异戊酸视黄酯、己酸视黄酯、庚酸视黄酯、辛酸视黄酯、壬酸视黄酯、癸酸视黄酯、十一烷酸视黄酯、十二烷酸视黄酯、十三烷酸视黄酯、肉豆蔻酸视黄酯、十五烷酸视黄酯、十七烷酸视黄酯、硬脂酸视黄酯、异硬脂酸视黄酯、十九烷酸视黄酯、花生四烯酸视黄酯、山嵛酸视黄酯、亚油酸视黄酯和油酸视黄酯。
适用于本发明的优选的酯选自棕榈酸视黄酯、乙酸视黄酯和丙酸视黄酯，因为这些是最容易商购，且因此最便宜。亚油酸视黄酯和油酸视黄酯也因其功效而成为优选。
视黄醇或视黄酯在本发明组合物中的用量是约0.001％-约10％，优选用量是约0.01％-约1％，最优选用量是约0.01％-约0.5％。
本发明组合物的基本成分是通过下列部分2.1-2.7所述体外试验的化合物。适用于本发明的化合物在表A所列的浓度下抑制或提高酶达到表A中所列的百分宽度。
部分A：增效剂的鉴定：
表A
增效剂试验浓度和％抑制率/增高率
ARAT/LRAT试验        (鉴定B1增效剂)
  本发明   化合物浓度   ％抑制率
  宽泛   100μM   ＞10％
  优选的   100μM   ＞25％
  最优选的   100μM   ＞40％
  最佳   100μM   ＞50％
视黄醇脱氢酶试验    (鉴定B2增效剂)
  本发明   化合物浓度   ％增高率
  宽泛   100μM   ＞10％
  优选的   100μM   ＞15％
  最优选的   100μM   ＞20％
  最佳   100μM   ＞25％
视黄醛还原酶试验    (鉴定B3增效剂)
  本发明   化合物浓度   ％抑制率
  宽泛   100μM   ＞5％
  优选的   100μM   ＞10％
  最优选的   100μM   ＞20％
  最佳   100μM   ＞35％
CRABPII拮抗剂试验    (鉴定B4增效剂)
  本发明   化合物∶视黄酸比例   ％抑制率
  宽泛   7000∶1   ＞25％
  优选的   7000∶1   ＞50％
  最优选的   70∶1   ＞25％
  最佳   70∶1   ＞50％
视黄酸氧化试验    (鉴定B5增效剂)
  本发明   化合物浓度   ％抑制率
  宽泛   100μM   ＞25％
  优选的   100μM   ＞45％
  最优选的   100μM   ＞70％
  本发明   化合物浓度   ％抑制率
  最佳   100μM   ＞80％
利用下列体外微粒体试验来测定本发明组合物含有所述化合物的适合性：
1.材料
全反式-视黄醇、全反式-视黄酸、棕榈酰-CoA、二月桂酰基磷脂酰胆碱、NAD和NADPH购自Sigma Chemical Company。微粒体试验所用的类维生素A的储备液用HPLC级乙腈制成。HPLC分析所用的全部类维生素A标准储备液是在乙醇中配制，储藏在N2和-70℃下并当不储藏时在琥珀色光照下保持在冰上。其它化学品和抑制剂购自化妆品材料供应商或化学公司例如Aldrich或International Flavours andFragrances。
2.方法
2.1RPE微粒体的分离(由(1)修饰)
50个冷冻的切半牛视杯(除去视网膜和房水)得自W.L.LawsonCo.，Lincoln，NE，USA。眼睛融化过夜并用镊子剥下有色的虹膜。各视杯用2x0.5mL冷缓冲液(0.1M PO4/1mM DTT/0.25M蔗糖，pH 7)冲洗用画刷或橡胶淀帚擦去深色细胞。将细胞混悬液加入到虹膜并在烧杯中将该混悬液用聚四氟乙烯搅拌棒搅拌数分钟。该混悬液经粗糙滤膜(Spectra/Por 925μ孔径聚乙烯筛)过滤除去大微粒，并将所得深色混悬液用Glas-Col马达驱动的聚四氟乙烯均化器匀浆化。
将细胞匀浆在20,000g下离心30分钟(Sorvaal型RC-5B离心机，带有SS34转子，在2.5x10cm管中，14,000RPM下)。将所得上清液在150,000g下进一步离心60分钟(Beckman型L80超离心机，带有SW50.1转子，在13x51mm管中，40,000RPM下)。所得小球用Heat Systems Ultrasonics，Inc.的W185D型Sonifier细胞破裂器分散到约5mL 0.1M PO4/5mM DTT，pH 7缓冲液中，所得微粒体分散体等分到小管中并储藏在-70℃下。通过BioRad染料结合试验、用BSA作标准测定微粒体的蛋白浓度。
2.2大鼠肝脏微粒体的分离(4)
约6g的冷冻大鼠肝脏(得自Accurate Chemical & ScientificCorp.的Harlan Sprague Dawley大鼠)在3个体积的0.1M三羟甲基氨基甲烷/0.1M KCl/1mM EDTA/0.25M蔗糖，pH 7.4缓冲液中用Brinkmann Polytron均化。所得的组织混悬液进一步在上述马达驱动的聚四氟乙烯均化器中均化。得到的匀浆依次在10,000g下离心30分钟、在20,000g下离心30分钟和在30,000g下离心15分钟，得到的上清液在在105,000g下超速离心80分钟。小球在上述约5mL的0.1MPO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2，pH 7.4缓冲液中超声处理并等份储藏在-70℃下。按照上述方法测定蛋白浓度。
2.3ARAT和LRAT活性的试验(鉴定B1)
下面的方法是文献(2)中所述方法的改进。制备下列缓冲液并储藏在4℃下：0.1M PO4/5mM二硫苏糖醇，pH 7.0(PO4/DTT)。在试验当天，加入2mg BSA/mL缓冲液得到PO4/DTT/BSA工作缓冲液。在乙腈中制备1mM视黄醇底物并在氮气和-20℃下储藏在琥珀瓶中。制备4mM棕榈酰-CoA在工作缓冲液(等份储藏)中的溶液和4mM二月桂酰基磷脂酰胆碱在乙醇中的溶液并储藏在-20℃。将抑制剂在H2O、乙醇、乙腈或DMSO中制成10mM储备液。用纯乙醇制备骤冷液，其含有50μg/mL丁基化羟基甲苯(BHT)，并且用含有50μg/mL BHT的己烷溶液进行提取。
向2英钱的玻璃杯依次加入下列物质：PO4/DTT/BSA缓冲液至总体积为500μL，5μL酰基供体(4mM棕榈酰-CoA和/或二月桂酰基磷脂酰胆碱)，5μL抑制剂或空白溶剂(10mM储备液或进一步的稀释液)，随后约15μg的RPE微粒体蛋白(约15μL的约1mg/mL微粒体蛋白等份试样)。该混合物在37℃下温育5分钟至平衡反应温度并随后加入5μL的1mM视黄醇。将瓶子加盖，涡旋5秒且在37℃下温育30-90分钟。通过加入0.5mL乙醇/BHT终止该反应。加入3mL己烷/BHT提取类维生素A，涡旋试管数秒若干次并在低速下离心该管5分钟以使各层快速分离。将己烷上层转移到干净瓶中，水层按照上述方法再用3mL己烷/BHT提取。合并己烷层，在37℃氮气流下在加热铝块上进行烘干而蒸发己烷。干燥的残余物储藏在-20℃下直至HPLC分析。通过如下整合HPLC信号，分别用棕榈酸视黄酯和十二烷酸视黄酯的量定量测定ARAT和LRAT活性。
注意，温育溶液含有40μM酰基供体、100μM或更少的抑制剂、10μM视黄醇、约30μg/mL微粒体蛋白和约0.1MPO4/pH 7/5mM DTT/2mg/mLBSA。所有在加入视黄醇之后的步骤是在无光或在琥珀光下进行。
2.4视黄醇脱氢酶活性的试样(鉴定B2)
制备下面储备液：
50mM KH2PO4，pH 7.4缓冲液，经无菌过滤。
10mM全反式视黄醇(Sigma R7632)于DMSO中。
200mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐，钠盐(NADP)(Sigma N0505)于灭菌水中。
40mM于适当溶剂(水、缓冲液、乙醇、氯仿或DMSO)中的试验化合物。
大鼠肝脏微粒体在50mM KH2PO4，pH 7.4缓冲液(4μg/μl)中的1∶10稀释液。
在带有螺旋盖的2英钱玻璃瓶中，依次加入下列物质：
缓冲液使终体积为400ul
25μl稀释微粒体(终量＝100μg)-煮沸的微粒体用作对照且正常微粒体用作试验样本。
4μl的200mM NADP(终浓度＝2mM)
1μl的40mM试验化合物(终浓度＝100μM)
8μl的10mM视黄醇(终浓度＝200μM)
瓶子在37℃的振荡水浴中温育45分钟。向各瓶内加入500μl冰冷的乙醇以终止该反应。用冰冷的己烷(2.7ml/提取)提取2次类维生素A。在第一次提取过程中将乙酸视黄酯(5μl的900μM储备液)加入到各瓶内作为监测各样本提取效率的手段。将样本涡旋10秒，随后在1000rpm、5℃下在Beckman GS-6R离心机中轻度离心5分钟。在每次提取之后将含有类维生素A的己烷上层自水层取出置于一个干净的2英钱瓶内。在轻微的氮气流下蒸发己烷。干燥的残余物随后储藏在-20℃下直至HPLC分析。
2.5视黄醛还原酶活性的试验(鉴定B3)
按照下列替换如上制备全部储备液：
10mM于DMSO中的全反式视黄醛(Sigma R2500)代替视黄醇。
用200mM于灭菌水中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐，还原形式，四钠盐(NADPH)(Sigma N7505)代替NADP。
在带有螺旋盖的2英钱玻璃瓶中依次加入下列物质：
缓冲液至终体积为400μl
25μl的稀释微粒体(最终量＝100μg)-用煮沸的微粒体作为对照且用正常微粒体作为试验样本。
4μl的200mM NADPH(终浓度＝2mM)
1μl的40mM试验化合物(终浓度＝100μM)
3μl的10mM视黄醛(终浓度＝75μM)
按照与上文相同的方法进行温育和提取。
2.6CRABPII拮抗剂的试验(鉴定B4)
2.6.1.CRABPII的合成
a.表达体系
把基因CRABPII克隆在pET 29a-c(+)质粒(Novagen)中。克隆的基因处于强大噬菌体T 7转录和翻译信号的控制之下。T7聚合酶的来源是由宿主细胞大肠杆菌BLR(DE3)pLysS(Novagen)提供。后者具有一个在lacUV5控制下的通过IPTG的存在诱导的T7聚合酶的染色体拷贝。
按照制造商说明通过转化将质粒转移到大肠杆菌BLR(DE3)pLysS细胞中。
b.诱导
将转移细胞的过夜培养物以1∶100稀释到含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的2xYT中。使该细胞生长，同时在37℃下振摇直至在600nm下的OD达到0.6-0.8。随后加入IPTG至终浓度为1mM且培养物继续温育2小时。通过在5,000g室温下离心10分钟收获细胞。将颗粒储藏在-20℃。
2.6.2.纯化
纯化是按照Norris和Li，1997所述方法进行。
a.细胞溶解
将冷冻的颗粒在室温下融化并重新悬浮在1-2个颗粒体积的新制溶胞缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8，10％(w/v)蔗糖，1mM EDTA，0.05％(w/v)叠氮化钠，0.5mM DTT，10mM MnCl2，2.5mM苯甲基磺酰氟，2.5mM苯甲脒，6ug/mL DNase)中。溶胞产物在室温下温育30分钟。通过超声处理进一步完成溶胞(在10,000psi下六次30秒脉冲，与在冰上五次30秒的延迟交替进行)。通过在15,000rpm下4℃离心1小时除去溶胞产物的不溶部分，并将上清液储藏在-20℃下。
b.在Sephacryl S300上的凝胶过滤
室温下将步骤a所得的上清液加载在sephacryl S-300的2.5x100cm柱(Pharmacia)上。洗脱缓冲液是20mM Tris-HCl，pH8，0.5mM DTT，0.05％叠氮化钠(缓冲液A)。流速为2mL/分钟。对收集的2-mL馏分来检测在280nm下的紫外吸光度。通过SDS-page测定代表峰的馏分以确定CRABPII的存在。
c.阴离子交换色谱
2mL的含CRABPII的凝胶过滤馏分加载在季铵阴离子交换柱FPLC(快速蛋白液体色谱)型monoQ(Pharmacia)上。在室温下约20分钟内用100％缓冲液A-30％缓冲液B(100％缓冲液B＝缓冲液A+250mM NaCl)的梯度缓冲液洗脱下CRABPII。每1分钟收集1mL馏分。再次，通过SDS记录检查CRABPII的存在。将CRABPII储藏在4℃下，随后用带有瓶子平台附件的Micromodulyo 1.5K(Edwards HighVacuum International)冷冻干燥。干燥样本储藏在室温下直至其用于结合试验中。
d.检测CRABPII的存在
CRABPII的表达和纯化是利用变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)试验、在7-15％聚丙烯酰胺凝胶(Biorad)上验证。10μL样本与10μL的2X加载缓冲液(100mM Tris-HCl pH 6.8，4％SDS，0.2％BPB，20％甘油，1mM DTT)混合并通过加热变性(2分钟，80℃下)。将样本加载在凝胶上，该凝胶浸渍在1X Tris-甘氨酸缓冲液(Biorad)中并在室温下施加一个恒定电流(25mA)1小时。在用考马斯蓝染色之后，根据用Benchmark预染色的蛋白梯(Gibco BRL)测定的分子量鉴定蛋白。
用蛋白质印迹确定CRABPII的存在。用Biorad盒将在SDS-PAGE上分离的蛋白转移到Immobilon-P转移膜(Millipore)。转移发生在1X Tris-甘氨酸缓冲液(Biorad)+10％甲醇中。施加电流(60mA)3小时使蛋白迁移穿过膜。此后，室温下该膜用1X TBS中的5％奶粉封阻1小时且用CRABPII的初级抗体(小鼠抗克隆5-CRA-B3的1/1000稀释液)在相同缓冲液中4℃下探测过夜。次日，膜用PBS(3x5分钟)冲洗，随后用次级抗体，偶联抗小鼠抗体的过氧化物酶(ECLTM，Amersham)的1∶2000稀释液在室温下温育1小时。膜用1xPBS(3x5分钟)洗涤并用ECL检测试剂盒按照制造商说明(Amersham)检测蛋白。
纯化CRABPII的浓度用BSA试剂盒(Pierce)测定。
2.6.3.放射性结合试验
220pmol的CRABPII在20mM Tris-HCl缓冲液pH 7.4中与15pmol的放射性全反式视黄酸(NEN)以70μL的总体积温育。对于竞争试验，向混合物中加入过量的另一种配体(6670∶1，670∶1或70∶1)。室温下无光下该反应进行1小时。为了将未结合的全反式视黄酸与结合的全反式视黄酸分开，使用6kD截断的微型色谱柱(Biorad)。用Microplex歧管按照制造商说明(Pharmacia)弃去储藏缓冲液。将样本加载在色谱柱上并在30分钟内借助于重力进行分离。与CRABPII结合的视黄酸(″RA″)出现在滤液中，同时游离RA残留在柱中。通过闪烁计数器测量滤液的放射性。
2.7NADPH依赖性视黄酸氧化的试验(鉴定B5)
下列方法是文献(4)所述方法的一个改进方法。制备下列试验缓冲液并储藏在4℃下：0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2，pH 7.4。在试验当天，制备60mM NADPH在缓冲液中的溶液。按照上述方法制备抑制剂储备液、酸化的乙醇/BHT终止液，和己烷/BHT。1mM视黄酸工作溶液是通过用乙醇稀释15mM储备液(在DMSO中)来制成。
向2英钱瓶中，依次加入下列物质：试验缓冲液使终体积为500μL，20μL的60mM NADPH，5μL抑制剂或溶剂空白，随后约2mg的大鼠肝脏微粒体蛋白。
该混合物在37℃下温育5分钟，随后加入5μL的1mM视黄酸工作溶液。继续在37℃下温育60分钟-瓶子不加盖，因为该氧化过程除了NADPH以外还需要分子O2。用酸化的乙醇/BHT进行终止且用上述己烷/BHT提取。快速洗脱的极性视黄酸代谢产物(假设为4-氧代视黄酸)的定量是通过整合下述HPLC信号来完成。
加入视黄酸之后的所有步骤是在无光或在琥珀色光下进行。最终的温育溶液含有2.4mM NADPH，100μM或更少的抑制剂，10μM视黄酸，约4mg/mL大鼠肝脏微粒体蛋白和约0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2。
各种类维生素A的HPLC分析
通过将各瓶中的残余物溶解在100μL甲醇中来制备用于HPLC定量分析类维生素A的样本。将溶液转移到1ml外壳瓶内的150μL玻璃圆锥形管中，盖紧，并且置于Waters 715自动取样仪中。即刻注射60μL的等份试样并分析类维生素A的含量。
色谱仪由Waters 600梯度控制器/泵、Waters 996光电二极管数组检测器和Waters 474扫描荧光检测器组成。采用两种HPLC方案进行类维生素A分析。对于ARAT和LRAT试验，用Waters 3.9x300mm C18Novapak反相分析柱和Waters Sentry NovaPak C18防护柱用流速调整至1mL/分钟的80∶20(v/v)甲醇/THF等度流动相进行10分钟的视黄醇和视黄醇酯的分离。监测洗脱液在325nm下的吸光度和325ex/480em下的荧光。
用较短的Waters 3.9x150mm C18 Novapak反相分析柱和WatersSentry NovaPak C18防护柱、采用Barua(5)所述的梯度体系的一个改进体系分离视黄醇和视黄醇氧化试验的类维生素A酸和醇类。该体系由自含10mM乙酸铵的68∶32(v/v)甲醇/水至4∶1(v/v)甲醇∶二氯甲烷的20分钟线性梯度和随后以1mL/分钟的流速的5分钟保持组成。在300nm-400nm下监测柱洗脱液。
这些方案的选择基于其明确地解析各试验中有关类维生素A酸、醇类、醛类和/或酯类的性能和相对较快速的分离。通过HPLC鉴定各种类维生素A是基于未知峰的保留时间与可得的可信类维生素A标准品的精确比对以及未知峰相对于可得的可信类维生素A的UV光谱分析(300-400nm)。
参考文献
1J.C.Saari & D.L.Bredberg，″视黄醛色素上皮中CoA和非CoA依赖性视黄醇酯化作用″，J.Bill.Chem.263，8084-8090(1988).
2J.C.Saari & D.L.Bredberg，″牛视黄醛色素上皮微粒体的ARAT& LRAT活性″，Methods Enzymol.190，156-163(1990)。
3J.L.Napoli & K.R.Race，″大鼠组织体外由视黄醇生成视黄酸的生物合成″，Archives Biochem.Biophys.255，95-101(1987)。
4R.Martini & M.Murray，″P450 3A酶在大鼠肝脏微粒体视黄酸4-羟基化作用中的参与″，Archives Biochem.Biophys.303，57-66(1993)。
5A.B.Barua，″水溶性化合物：葡糖苷酸的分析″，Methods Enzymol.189，136-145(1990)。
适用于本发明的增效剂包括但不限于：下表B1-B5所列的增效剂。下表给出增效剂种类(B1-B5)，化合物的化学名，由鉴定增效剂的适当试验获得的结果(即ARAT/LRAT用于鉴定B1，视黄醇脱氢酶用于鉴定B2，视黄醛抑制作用用于鉴定B3，CRABP结合用于鉴定B4并且视黄酸氧化抑制作用用于鉴定B5)。
Figure G018148603D00151
Figure G018148603D00171
Figure G018148603D00221
Figure G018148603D00231
部分B.增效剂组合的作用
为了评估增效剂分子的组合物的作用，需要一种包括5类增效剂的各种的作用的试验。单一酶试验不适合这种目的，因为它只对一类的增效剂分子具有特异性。反映角质细胞中的类维生素A浓度的试验必需使单一增效剂分子与增效剂分子的组合的作用相联系。因此，采用转谷氨酰胺酶(Tgase)试验。Tgase类是钙依赖性酶，其催化蛋白中共价交联的形成。若干Tgase酶在角质细胞中与膜结合，这对于表皮细胞的成熟至关重要。这种酶受到视黄酸抑制。视黄酸的浓度越高，对Tgase表达的抑制作用越大。所以，Tgase同时是角质细胞分化和类维生素A对角质细胞作用的良好标识。
转谷氨酰胺酶作为皮肤分化的一种标识
在表皮中末期分化过程中，在细胞四周的内表面形成厚15nm的蛋白层(称作角质化包膜(CE))。CE由许多不同的蛋白组成，这些蛋白业已在至少两种不同的表皮内表达的转谷氨酰胺酶(TGases)的催化下通过N∑-(γ-谷酰基)赖氨酸异二肽(isodipeptide)键的形成交联在一起。Tgase I大量表达在表皮的分化层尤其是颗粒层中，但不存在于未分化基底表皮中。所以TGase I是具有高TGase I水平的表皮角质细胞分化的有用标识，其指示出较高的分化状态。用基于ELISA的TGase I试验、使用TGase I抗体在下列实施例中来评估培养角质细胞的分化状态。
将角质细胞(按照上述方法培养)铺板在96孔平板中200μl培养基内达到4,000-5,000细胞/孔的密度。温育2-3天后，或直至细胞约50％融合之后，将培养基更换为含有试验化合物的培养基(每种试验一式五份)。细胞继续培养96小时，此后吸出培养基并将平板储藏在-70℃。从冰箱中取出平板，并且细胞用200μl的1xPBS冲洗2次。细胞在室温(R/T)下与TBS/5％BSA(洗涤缓冲液，牛血清白蛋白)一起温育1小时。此后加入TGase初级抗体：50μl在洗涤缓冲液中1∶2000稀释的单克隆抗Tgase I Ab B.C.。初级抗体在37℃下温育2小时且随后用洗涤缓冲液漂洗6次。细胞继续与50μl在洗涤缓冲液中1∶4,000稀释的次级抗体(Fab片段，得自Amersham的过氧化物酶的偶联抗小鼠IgG)在37℃下温育2小时，此后用洗涤缓冲液漂洗3次。用洗涤缓冲液漂洗后，细胞用PBS漂洗3次。为了比色显影，在R/T和黑暗(在铝箔覆盖下)下，将细胞与100μl底物溶液(4mg邻苯二胺和3.3μl的30％H2O2于10ml 0.1M柠檬酸盐缓冲液pH 5.0中)精确温育5分钟。通过加入50μl的4N H2SO4终止该溶液。在96孔平板UV分光光度计中492nm下读取样本的吸光度。在5份复制试验中，其中4份用两种抗体处理，第5份用作Tgase背景对照。测定TGase水平并表示为对照的百分比。
Tgase试验细节：
在开始试验之前，为了测定增效剂分子的组合的作用，先研究标准Tgase试验条件。建立一个如下所述的全面有效的Tgase试验：
A.试剂
细胞：人角质细胞(P2在T75烧瓶中；      新生儿包皮
P3在96孔试验平板中)
初级抗体：TGm特异性单克隆Ab B.C1      Biogenesis(Cat # 5560-
                                      6006)
次级抗体：过氧化物酶标记的抗小鼠Ig    Amersham(Cat#NA9310)
F(ab)2
底物溶液：对于10ml磷酸盐柠檬酸盐
缓冲液
4.0mg邻苯二胺                         SigmaP-7288
3.3μl的30％H2O2                      SigmaH-1909
B.培养基/缓冲液
角质细胞生长培养基(KGM)               Clonetics(Cat # 3111)
磷酸盐缓冲盐水；Dulbecco氏培养基      Life Technology(Cat#
不含Ca/MgCl2)                         14200-075)
Tris缓冲盐水
封阻缓冲液(1xTBS+5％奶粉)             BioRad(Cat # 170-6404)
洗涤缓冲液(1％奶粉在TBS+0.05％        Sigma(Cat#P-7949)
Tween20中)
磷酸盐柠檬酸盐缓冲液：0.2M磷酸氢二钠  Sigma(Cat # S-9763)
和0.1M柠檬酸的1∶1混合物              Sigma(Cat # C-1909)
4N H2SO4
C.培养器具
96孔聚丙烯微量滴定平板            Costar(Cat # 3595)
96孔聚丙烯U底平板                 Costar(Cat # 3794)
T75-开口盖                        Costar(Cat # 3376)
D：仪器/设备
Biotek Model EL 340微板读数器     Bio-tek Instuments Inc.
复合探针II                        Packard
E：细胞培养方法
角质细胞在96孔平板中的接种
1.制备一种角质细胞的混悬液，其在KGM培养基中的浓度为3000细胞/200μl/孔(各微量滴定平板使用3x105细胞/12ml培养基)
2.将200μl的角质细胞混悬液只转移到内部60个孔的各个孔中。
3.把200μl的KGM培养基吸移至外孔中(以保持热平衡)。
4.各平板在37℃和5％CO2下温育3天或直至细胞约50％融合为止。
含样本的角质细胞的处理
5.在DMSO中制备样本的储备液。
6.将样本稀释至所需浓度，使DMSO的最终试验浓度为0.1％。
7.将20μl的样本转移到孔中且加入180μl的KGM培养基使最终的试验体积为200μl。
8.平板在37℃和5％CO2下温育72小时。
9.从各孔中取出全部培养基。
10.孔用200μl的1xPBS漂洗2次。
11.最后将它们在-70℃下冷冻至少1.5小时。
F：转谷氨酰胺酶试验
1.封阻：
平板在室温下用200μl/孔的封阻缓冲液温育1小时。
2.初级抗体：
抽吸封阻缓冲液。用100μl/孔的TGm特异性单克隆抗体B.C1(以1∶2000在洗涤缓冲液中稀释)在37℃下温育至少2小时。背景对照孔中不加入初级抗体。
3.用洗涤缓冲液漂洗孔6次。
4.次级抗体：
用100μl/孔过氧化物酶标记的抗小鼠IgF(ab)2片段(1∶4000在洗涤缓冲液中稀释)在37℃下温育2小时。
5.孔用洗涤缓冲液(加入200μl)漂洗3次且在每次漂洗后吸出。
6.孔用PBS(无Tween)漂洗3次。
7.100μl/孔底物溶液在室温下精确温育5分钟。
8.用50μl/孔4N H2SO4终止该反应。
9.在492nm在Bio-tek平板读取器中读取吸光度。
I.最佳化研究
a.转谷氨酰胺酶产生的时程
在96孔平板(4000细胞/孔)中进行时程试验从而测定角质细胞生长中转谷氨酰胺酶生产的最佳温育时间。该时程研究使用多个变量进行，包括视黄酸和视黄醇的剂量反应分析以及在1.2mM CaCl2存在下的温育。虽然转谷氨酰胺酶生产在对照细胞(0.1％DMSO)中没有改变，但视黄酸和视黄醇两者在5天的温育期内表现出对转谷氨酰胺酶的剂量依赖性抑制作用。最显著的类维生素A作用是在第2天和第3天观察到。在第2天观察到最低抑制作用，转谷氨酰胺酶的生产在最高浓度(1μM)的视黄酸和视黄醇的存在下分别被抑制85％和55％。还通过改变细胞密度(3000细胞/孔和5000细胞/孔)进行相同的试验且观察到可比较的结果。
B：DMSO敏感性
用在0-2％内的不同浓度的DMSO测试在角质细胞中对转谷氨酰胺酶生产的影响。高于0.5％DMSO时，该试验对DMSO浓度敏感并且对活性的抑制作用非常显著。所以，选择0.1％的最终试验浓度来进行随后的样本浓度研究。
C：剂量反应曲线：视黄酸和视黄醇
基于数据，选择第3天作为最佳时间并选择0.1％DMSO作为进一步试验的浓度。用视黄酸和视黄醇在0.1％DMSO的存在下进行另一个剂量反应试验，并且在第3天分析转谷氨酰胺酶的生产。对于视黄酸和视黄醇的Tgase抑制作用可以观察到一个良好的剂量反应。10-7M的视黄醇在线性范围的浓度内产生Tgase的抑制作用。所以，选择视黄醇的这个浓度来评估增效剂组合物。
D.用于试验增效剂或增效剂的组合的最终条件
用视黄醇和多种增效剂培养角质细胞的天数
                                          -3天
DMS0终浓度                                -小于0.1％
视黄醇浓度                                -10-7M(0.1μM)
增效剂浓度                                -10mM至0.1nM
利用上述条件，测试所有不同增效剂(B1-B5)的剂量反应以鉴定以组合试验的增效剂的最佳浓度。
测定转谷氨酰胺酶水平并在表B1-B5中表示为：
(i)％(增效剂+视黄醇抑制/对照抑制)-％(ROH抑制/对照抑制)，它测定出与视黄醇单用相比的增效剂+视黄醇所诱导的TGase抑制作用的附加作用，或
(ii)当测定多种增效剂浓度的抑制作用时表示为IC50值-这提供了与10-7M的恒定视黄醇浓度组合抑制50％TGase时的增效剂的浓度。增效剂组合和增效剂比例：
现在惊奇地发现某些化合物可以通过不同的机理提高由视黄醇或视黄酯形成视黄酸的内源性水平。这些化合物在此总称为″类维生素A增效剂″。这些包括：ARAT/LRAT的抑制剂(B1增效剂)，视黄醛还原酶的抑制剂(B3增效剂)，结合CRABP-2的视黄酸抑制剂(B4增效剂)和细胞色素P450酶催化的视黄酸氧化的抑制剂(B5增效剂)，或某些其它提高或激活视黄醇脱氢酶的化合物(B2增效剂)。这些增效剂编号为B1-B5组，如上表1所述。
所述增效剂单用或彼此组合，可以通过增加可用于转化为视黄酸的视黄醇的量并抑制视黄酸的降解来加强类维生素A的作用。所述增效剂与类维生素A(例如视黄醇、视黄酯、视黄醛、视黄酸)联合作用，后者内源性存在于皮肤中。然而，优选的组合物包括在组合物中与增效剂共存的类维生素A，以使性能最佳化。
本发明部分涉及第二种组合物，该组合物含有占组合物重量约0.0001％-约50％，优选0.001％-10％，最优选0.001％-5％(重量)的至少一种增效剂化合物，或二元、三元、四元或五元增效剂组合物的组合，和化妆可接受载体。增效剂组合物以下列比例特定的0.001％-5％的合并浓度，在体外转谷氨酰胺酶试验中可以抑制转谷氨酰胺酶超过50％。
本发明组合物所包括的增效剂选自：
a.两种增效剂，其中两者均选自B2、B3和B4；
b.增效剂的二元组合，选自B1/B2；B1/B3，B1/B4；B1/B5；B2/B3，B2/B4；B2/B5；B3/B4，B3/B5；B4/B5
c.增效剂的三元组合，选自B1/B2/B3；B1/B2/B4；B1/B2/B5；B1/B3/B4；B1/B3/B5；B1/B4/B5；B2/B3/B4；B2/B3/B5；B2/B4/B5；B3/B4/B5
d.增效剂的四元组合，选自B1/B2/B3/B4；B1/B2/B3/B5；B1/B2/B4/B5；B1/B3/B4/B5；B2/B3/B4/B5；和
e.5组的增效剂的组合B1/B2/B3/B4/B5。
增效剂与增效剂的比例：
如上所述的不同种类(B1-B5)组合的增效剂在化妆品中以下述特定比例具有介于0.001％-5％内的抑制Tgase活性至少低于50％的最佳浓度：
本发明增效剂与增效剂的比例浓度
宽泛        1∶10,000-10,000∶1    100mM-1nM
优选的      1∶1000-1000∶1        10mM-10nM
最优选的    1∶100-100∶1          1mM-100nM
最佳        1∶10-10∶1            0.1mM-1μM
类维生素A与增效剂的比例：
优选的组合物包括组合物中与增效剂或增效剂的组合共存的类维生素A(例如视黄醇，视黄酯，和视黄醛)，从而使性能最佳化。
为了使性能最佳化，类维生素A与增效剂的浓度应该以下列比例存在于组合物中：
本发明    增效剂与类维生素A的比例        浓度
宽泛      10,000∶1-1∶10,000        100mM-1nM增效剂；
                                     0.001-10％类维生素A
优选的    1000∶1-1∶1000            10mM-10nM增效剂；
                                     0.001-10％类维生素A
最优选的  100∶1-1∶100              1mM-100nM增效剂；
                                     0.01-1％类维生素A
实施例中所用各种增效剂的浓度：
由于目的在于通过活性化合物与视黄醇的组合来建立对转谷氨酰胺酶表达的协同抑制，所以当分别在视黄醇的存在下进行测试时，必需测定活性化合物的剂量反应分布(IC20和IC50值)。属于B2-B4的增效剂的详细剂量反应在下表中给出，之前为IC50和IC20表。这个数据用来鉴定各活性化合物的适当次最大抑制浓度，最终可以鉴定在视黄醇存在下活性化合物的混合物的推定协同作用。下表中的数据表示IC50和IC20(对照的80％)值和测试增效剂的组合的协同性时所用的浓度。
为了证明两种化合物的协同作用，必需选择至多为IC20的浓度来测试，也就是说，独自使视黄醇对Tgase表达的抑制作用增效20％时的化合物浓度。两种这样的化合物应该具有40％的附加抑制作用。利用这种策略来测定浓度保留下40-100％的进一步抑制的窗口以测定两种试验化合物的协同作用。
更具挑战性的浓度标准将是选择化合物单用没有抑制作用，但组合时表现出抑制作用时的浓度。然而在这样的研究中，我们选择更具挑战性的标准。我们选择了化合物的比最小有效Tgase抑制浓度低10-1000倍的浓度。利用这样非常低浓度鉴定协同性组合应该意味着鉴定出最有效的协同组合。
  增效剂种类   化合物名称   IC50   IC20   协同(二元、三元、四元)所用的浓度
  B1   亚油酰基一乙醇酰胺(LAMEA)   1.61E-05   1.48E-05   1E-05至1E-09
  棕榈酸酰胺一乙醇酰胺   ND   ND   1E-06至1E-10
  增效剂种类   化合物名称   IC50   IC20   协同(二元、三元、四元)所用的浓度
  油基甜菜碱   2.80E-05   1.08E-05   1E-05至1E-8
  柑桔素   ND   ND   1E-05至1E-09
  Echinacea   ND   ND   1E-05至1E-09
  二甲基咪唑啉酮   ND   ND   1E-05至1E-09
  亚油甲苄胺   ND   ND   1E-05至1E-09
  香叶草基香叶醇   ND   ND   1E-05至1E-09
  法呢醇   9.35E-05   7.82E-05   1E-06至1E-09
  香叶醇   7.83E-03   4.72E-03   1E-03至1E-07
  α-二氢大马酮   3.35E-04   1.69E-04   1E-04至1E-08
  α-紫罗兰酮   9.27E-04   1.42E-04   1E-04至1E-08
  蓖麻油甲酯酸(MEA)   3.25E-05   9.38-E06   1E-06至1E-09
  乌索酸   1.46E-06   5.94-E07   1E-06至1E-09
  Utrecht-2   3.47-E06   3.30-E06   1E-06至1E-09
  椰油基羟乙基咪唑啉   2.84E-07   9.21E-08   1E-08至1E-11
  乙酰鞘氨醇(C2神经酰胺)   6.78E-06   5.15E-06   1E-06至1E-09
  己酰基鞘氨醇(C6神经酰胺)   9.99E-05   6.94E-05   1E-05至1E-09
  番红花酸   3.75E-05   2.52E-05   1E-05至1E-09
  Lyrial   1.27E-04   4.00E-05   1E-05至1E-09
  增效剂种类   化合物名称   IC50   IC20   协同(二元、三元、四元)所用的浓度
  N-羟乙基-2-羟基十二烷基酰胺   3.29E-05   2.40E-05   1E-05至1E-09
  B2   磷脂酰胆碱   ND   ND   1E-05至E1-09
  鞘磷脂   ND   ND   1E-05至1E-09
  TCC   9.64E-07   6.18-E07   1E-07至1E-10
  1，2-二辛酰基-sn-甘油基-3-二氧磷乙醇酰胺   ND   ND   1E-05至1E-09
  B3   安吖啶-HCl   6.26E-06   3.30E-06   1E-06至1E-09
  甘珀酸   3.61E-07   2.00E-07   1E-07至1E-10
  甘草次酸   8.64E-06   5.96E-06   1E-06至1E-09
  亚油酸   1.63E-04   8.95E-05   1E-05至1E-09
  亚麻酸   1.34E-04   1.21E-04   1E-05至1E-09
  花生四烯酸(Na<sup>+</sup>盐)   ND   ND   1E-05至1E-09
  肉豆蔻酸   1.72E-05   1.05E-05   1E-05至1E-09
  香兰素   9.70E-03   8.47E-03   1E-03至1E-06
  B4   十六烷二酸   1.30E-04   8.40E-05   1E-05至1E-09
  12-羟基硬脂酸   2.91E-05   1.45E-05   1E-05至1E-09
  反油酸   6.50E-05   5.88E-05   1E-05至1E-09
  亚麻子油   ND   ND   1E-05至1E-09
  增效剂种类   化合物名称   IC50   IC20   协同(二元、三元、四元)所用的浓度
  异硬脂酸   6.88E-05   6.23E-05   1E-05至1E-09
  2-羟基硬脂酸   ND   ND   1E-05至1E-09
  B5   苯咪丁酮   4.47E-06   2.45E-07   1E-07至1E-10
  克霉唑   ND   ND   1E-05至1E-09
  咪康唑   2.78E-07   8.42E-08   1E-08至1E-11
  香豆素   ND   ND   1E-05至1E-09
  酮康唑   1.85E-07   5.52E-08   1E-08至1E-11
  3，4，-二氢-2(1H)-喹啉酮(氢化喹诺酮)   ND   ND   1E-05至1E-09
  2-羟基喹啉(2-羟基喹啉)   3.64E-04   1.70E-04   1E-04至1E-08
  氨基苯并三唑   ND   ND   1E-05至1E-09
  月桂基羟乙基咪唑啉   4.67E-07   2.69E-07   1E-07至1E-10
  槲皮素   6.29E-05   5.11E-05   1E-05至1E-09
  油基羟乙基咪唑啉   3.02E-05   5.65E-06   1E-06至1E-09
  7H-苯并咪唑[2，1-a]苯并[de]-异喹啉-7-酮   8.59E-07   4.69E-07   1E-07至1E-09
ND：没有测定或没有观察到一个确定的剂量反应。对于协同作用，测试宽范围的浓度(4个数量级10-5至10-9M)。
B2-B4类增效剂的剂量反应
下列各表包括有关属于B2-B4类的增效剂的剂量反应的数据。增效剂的浓度是以摩尔浓度计；4个复制品的平均Tgase水平和标准偏差表示为对照(0.1％DMSO和10-7M视黄醇)的百分比(％)。较高数值(接近100或大于100)表示没有Tgase的抑制作用。数值越低，抑制剂该浓度下的效价越高。由这个剂量反应表计算出IC50和IC20值并表示在上表中。
B2类增效剂：
磷酯酰胆碱(B2)
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  4.4E-05   90.9   0.01
  1.47E-05   120.3   10.6
  4.89E-06   70.1   11.4
  1.63E-06   98.8   0.00
  5.43E-07   86.7   6.19
  1.8E-07   75.9   20.5
  6.0E-08   87.8   3.9
  1.2E-08   159   42.3
  2.4E-09   85.5   0.39
鞘磷酯(B2)
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  3.0E-05   45   3.21
  1.0E-05   77.8   25.5
  3.33E-06   76.4   7.55
  1.1E-06   98.8   0.00
  3.73E-07   91.6   14.9
  1.23E-07   70.0   3.63
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  4.10E-08   74.6   4.19
  8.2E-08   115.2   1.02
  1.65E-09   68.4   2.03
  3.29E-10   69.2   2.1
TCC(B2)
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  1.14E-03   36.3   4.6
  3.8E-04   3.8   0.96
  3.31.23E-04   -3.2   0.91
  4.22E-05   -11.2   0
  1.41E-06   -.3   4.88
  4.69E-07   15.9   3.52
  6.26E-08   18.9   3.12
  1.25E-08   100.2   23.3
  6.9E-09   77.6   21.2
  1.0E-09   54.4   11.23
1，2-二辛酰基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺(B2)
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  1.6E-04   58.1   2.08
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  5.33E-05   95.4   21.3
  1.78E-05   104   4.01
  5.93E-06   129   0.0
  1.98E-06   110   8.74
  6.58E-07   92.8   15.78
  2.19E-09   88.6   12.3
  4.39E-08   127.3   3.39
  8.78E-09   119   21.1
  1.79E-9   82   15.6
B3类增效剂
安吖啶B3
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  3.0E-05   -10   3.29
  1.0E-05   1.8   7.45
  3.33E-06   64   4.2
  1.1E-06   84   0
  3.73E-07   109   6.2
  1.23E-07   65   15.8
  4.10E-08   110   10.5
  8.2E-08   131   27
  1.65E-09   113   18
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  3.29E-10   92   8.9
甘珀酸(B3)
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  3.0E-06   -7.1   0
  1.0E-06   27.3   1.15
  3.33E-07   51.7   0
  1.1E-07   158   0
  3.73E-08   126   4.67
  1.23E-08   81   29
  4.10E-09   135   6.88
  8.2E-10   112   32
  1.65E-10   77.8   10.6
  3.29E-11   64   49
甘草次酸(B3)
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  3.0E-04   -0.3   3.9
  1.0E-05   0.7   3.55
  3.33E-05   2.5   2.1
  1.1E-06   96.4   0.00
  3.73E-06   120   33.2
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  1.23E-07   112   38
  4.10E-07   93   11
  8.2E-08   225   108
  1.65E-08   103   11
  3.29E-9   100   6.2
亚油酸(B3)
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  9.0E-03   -6   3.06
  3.0E-03   0.1   2.01
  1E-03   -16.4   16.3
  1.1E-04   4.4   0
  3.73E-04   79.2   0
  1.23E-05   62.6   6.2
  4.10E-05   76.8   3.69
  8.2E-06   146   44.2
  1.65E-07   106   20.2
  3.29E-07   60.2   2.3
亚麻酸(B3)
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  9.0E-03   -11   8.7
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  3.0E-03   -5.7   0.74
  1E-03   -7.5   7.8
  1.1E-04   -23   0
  3.73E-04   68   0.57
  1.23E-05   94.9   17.2
  4.10E-05   65.9   0.03
  8.2E-06   119   1.6
  1.65E-07   77   8.5
  3.29E-07   98   7.0
肉豆蔻酸(B3)
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  1E-03   -2   4.1
  1.1E-04   -8   2.3
  3.73E-04   -6   1.16
  1.23E-05
  4.10E-05   75.1   1.06
  8.2E-06   74.2   10.0
  1.65E-07   88.9   8.4
  3.29E-07   101   4.47
  5.0E-08
  1.1E-08
香兰素(B3)
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  1.4E-02   21.5   24.2
  4.8E-03   93.8   1.7
  1E-03   124   15.6
  1.1E-04
  3.73E-04   101   14.3
  1.23E-05   82   14.6
  4.10E-05   98   2.4
  8.2E-06   109   22
  1.65E-07   80   4
  3.29E-07   93   41
B4类增效剂
十六烷二酸(B4)
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  1E-03
  1.1E-04   14.2   2.7
  3.73E-04   43.4   8.4
  1.23E-05   130   0
  4.10E-05   105   14
  8.2E-06   114   12
  1.65E-07   95   1.9
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  3.29E-07
  5.0E-08   74   6.7
  1.1E-08   70   10.4
12-羟基硬脂酸(B4)
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  3.73E-04
  1.23E-05   -5.2   2.3
  4.10E-05   32.4   5.3
  8.2E-06   97.6   0
  1.65E-07   90.2   11
  3.29E-07   82   28
  5.0E-08   81   3.8
  1.1E-08   98   24
  2.0E-08   118   28
  4.3E-09   71   2.3
反油酸(B4)
  浓度   Tga se水平(平均)   Tgase(SD)
  1E-03   12.8   12.1
  1.1E-04   8   0.45
  3.73E-04   13.8   1.92
  浓度   Tga se水平(平均)   Tgase(SD)
  1.23E-05   80.9   0
  4.10E-05   58.2   8.8
  8.2E-06
  1.65E-07   58   0.13
  3.29E-07   69   44
  5.0E-08   50.5   3.8
  1.1E-08
亚麻子油(B4)
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  1E-04   138   15
  3.73E-05   145   2.5
  1.23E-05   88   12
  4.10E-06   113   0
  8.2E-06   113   13
  1.65E-07   96   18
  3.29E-07   106   10
  5.0E-08   134   22
  1.1E-09   83   13
  9.9E-10   73   15
异硬脂酸(B4)
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  1E-03   -8.6   3.4
  1.1E-04   1.2   3.0
  3.73E-04   -5.3   1.1
  1.23E-05   80   00
  4.10E-05   67   7.9
  8.2E-06   103   12.3
  1.65E-07   95   5.5
  3.29E-07   123   0.5
  5.0E-08   78   12.2
  1.1E-08   78   29
2-羟基硬脂酸(B4)
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  9.1E-04   46.6   6.2
  3.73E-04   69.3   8.3
  1.23E-04   51   8.8
  3.10E-05   96.0   0.0
  1.2E-05   105   30
  3.65E-06   63   8.0
  1.29E-06   80   4.7
  2.0E-07   142   34
  5.1E-08   64   20
  浓度   Tgase水平(平均)   Tgase(SD)
  1.0E-08   58   17
增效剂的二元组合对Tgase抑制作用的协同效果
为了研究两种不同种类的增效剂的组合与视黄醇对Tgase表达的协同抑制作用，在上表给出的浓度下测试化合物的选定组合。测试浓度比Tgase活性最低抑制所需浓度(即IC20)小一个对数数量级。所述化合物单独和以组合方式进行测试并给出各化合物和各组合的Tgase的％抑制率。
下列实施例给出所有可能的二元组合的协同组合(B1/B2；B1/B3，B1/B4；B1/B5；B2/B3，B2/B4；B2/B5；B3/B4，B3/B5；B4/B5)。当组合物的％抑制率大于各化合物加和在一起的抑制率时，表示具有协同作用(即组合物的抑制率大于化合物1的抑制率+化合物2的抑制率)。下表中所有二元组合实施例均协同抑制Tgase。
  二元组合   化合物1   化合物2   TG作为％C化合物1   TG作为％C化合物2   TG％C组合
  B1/B2   二甲基咪唑啉酮   磷脂酰胆碱   99   97   84
  B1/B2   α-二氢大马酮   磷脂酰胆碱   95   97   86
  B1/B2   己酰基鞘氨醇   磷脂酰胆碱   109   97   86
  B1/B2   α-紫罗兰酮   鞘磷脂   101   98   76
  B1/B2   1，2二辛酰基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺   磷脂酰胆碱   106   98   78
  B1/B2   α-二氢大马酮   鞘磷脂   95   84   67
  B1/B3   1，2二辛酰基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺   安吖啶   123   134   75
  二元组合   化合物1   化合物2   TG作为％C化合物1   TG作为％C化合物2   TG％C组合
  B1/B3   1，2二辛酰基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺   甘珀酸(Carbenoxelone)   123   164   96
  B1/B3   蓖麻油MEA   甘珀酸   96   164   67
  B1/B3   Utrecht-2   安吖啶   102   98   86
  B1/B3   Utrecht-2   甘珀酸   102   164   91
  B1/B3   己酰基鞘氨醇   甘珀酸   122   164   78
  B1/B3   Lyral   甘珀酸   120   164   82
  B1/B3   蓖麻油MEA   甘珀酸   110   164   78
  B1/B3   己酰基鞘氨醇   安吖啶   122   134   92
  B1/B3   己酰基鞘氨醇   反油酸   122   144   85
  B1/B3   α紫罗兰酮   安吖啶   101   134   78
  B1/B3   1，2二辛酰基-sn-甘油基-3-二氧磷基乙醇酰胺   甘草次酸   95   92   69
  B1/B4   柑桔素   2-羟基硬脂酸   95   112   78
  B1/B4   己酰基鞘氨醇   2-羟基硬脂酸   99.3   112   77
  B1/B4   Lyral   十六烷酸   120   95   69
  B1/B4   蓖麻油MEA   十六烷二酸   110   125   82
  B1/B4   己酰基鞘氨醇   异硬脂酸   122   146   93
  二元组合   化合物1   化合物2   TG作为％C化合物1   TG作为％C化合物2   TG％C组合
  B1/B4   油酰基甜菜碱   十六烷二酸   99.5   125   80
  B1/B5   己酰基鞘氨醇   椰油基羟乙基咪唑啉   99   102   68
  B1/B5   法呢醇   酮康唑   98   111   84
  B1/B5   己酰基鞘氨醇   咪康唑   99   101   56
  B1/B5   己酰基鞘氨醇   酮康唑   99   99   65
  B1/B5   己酰基鞘氨醇   月桂基羟乙基咪唑啉   99   98   51
  B1/B5   Utrecht-2   氨基苯并三唑   122   105   83
  B1/B5   己酰基鞘氨醇   3，4-二氢-2-喹啉酮   122   102   89
  B1/B5   己酰基鞘氨醇   氨基苯并三唑   122   126   85
  B1/B5   蓖麻油MEA   月桂基羟乙基咪唑啉   110   98   56
  B1/B5   己酰基鞘氨醇   苯咪丁酮   122   98   83
  B1/B5   己酰基鞘氨醇   咪康唑   122   99   78
  B1/B5   己酰基鞘氨醇   酮康唑   122   110   90
  B1/B5   油酰基甜菜碱   酮康唑   96   116   81
  B1/B5   Utrecht-2   月桂基羟乙基咪唑啉   122   98   57
  二元组合   化合物1   化合物2   TG作为％C化合物1   TG作为％C化合物2   TG％C组合
  B1/B5   α-二氢大马酮   油酰基羟乙基咪唑啉   112   73   76
  B1/B5   α-紫罗兰酮   月桂基羟乙基咪唑啉   101   98   49
  B1/B5   α-紫罗兰酮   油酰基羟乙基咪唑啉   101   73   75
  B2/B3   磷脂酰胆碱   甘草次酸   98   92   73
  B2/B4   磷脂酰胆碱   2-羟基硬脂酸   98   82   70
  B2/B5   磷脂酰胆碱   苯咪丁酮   98   102   82
  B2/B5   磷脂酰胆碱   咪康唑   98   111   92
  B2/B5   磷脂酰胆碱   酮康唑   98   101   89
  B2/B5   磷脂酰胆碱   月桂基羟基咪唑啉   98   106   82
  B3/B4   安吖啶   2-羟基硬脂酸   102   82   75
  B3/B4   肉豆蔻酸   2-羟基硬脂酸   110   82   78
  B3/B5   安吖啶   氨基苯并三唑   102   98   84
  B3/B5   安吖啶   二甲基咪唑啉   102   112   94
  B3/B5   肉豆蔻酸   苯咪丁酮   110   102   82
  二元组合   化合物1   化合物2   TG作为％C化合物1   TG作为％C化合物2   TG％C组合
  B4/B5   亚麻子油   月桂基羟乙基咪唑啉   98   73   57
  B4/B5   2-羟基硬脂酸   酮康唑   92   109   77
  B4/B5   亚麻子油   油酰基羟乙基咪唑啉   98   92   75
  B4/B5   2-羟基硬脂酸   香豆素   92   96   70
增效剂的三元组合对Tgase抑制作用的协同效果
为了研究三种不同种类的增效剂的组合与视黄醇对Tgase表达的协同抑制作用，在上表给出的浓度下测试化合物的选定组合。测试浓度比Tgase活性最低抑制所需浓度(即IC20)小一个对数数量级。所述化合物单独和以组合方式进行测试并给出各化合物和各组合的Tgase的％抑制率。下列实施例给出所有可能的三元组合的协同组合(B1/B2/B3；B1/B2/B4；B1/B2/B5；B1/B3/B4；B1/B3/B5；B1/B4/B5；B2/B3/B4；B2/B3/B5；B2/B4/B5；B3/B4/B5)。当组合物的％抑制率大于各化合物加和在一起的抑制率时，则表示具有协同作用(即组合物的抑制率大于化合物1的抑制率+化合物2的抑制率+化合物3的抑制率)。下表中所有三元组合实施例在10-7M视黄醇的存在下均协同抑制Tgase。
化合物1     化合物2    化合物3        TG作   TG作   TG作   TG作
                                      为％C  为％C  为％C  为％C
                                      化合物 化合物 化合物 组合
                                      1      2      3
B1/B2/B3
组合：
磷脂酰胆碱  甘草次酸   蓖麻油 甲酯酸  88     91     85     53
                       (MEA)
磷脂酰胆碱  甘草次酸   Echinacea      88     91     119    52
磷脂酰胆碱  甘草次酸   柑桔素         88     91     94     52
磷脂酰胆碱  甘草次酸   乙酰鞘氨醇     88     91     99     58
                       (C2神经酰
                       胺)
磷脂酰胆碱  甘草次酸   法呢醇         88     91     118    49
1，2-二辛酰 甘草次酸   α-二氢大马    81     91     89     58
基-sn-甘油             酮
基-3-二氧磷
基乙醇酰胺
1，2-二辛酰 磷脂酰胆碱 柑桔素         81     88     94     66
基-sn-甘油
基-3-二氧磷
基乙醇酰胺
1，2-二辛酰  安吖啶-HCl  亚油酰基一乙  81   79  127  60
基-sn-甘油               醇酰胺
基-3-二氧磷              (LAMEA)
基乙醇酰胺
1，2-二辛酰  安吖啶-HCl  棕榈酸酰胺一  81   79  95   63
基-sn-甘油   乙醇酰胺
基-3-二氧磷
基乙醇酰胺
1，2-二辛酰  甘草次酸    α-二氢大马   81   91  89   58
基-sn-甘油               酮
基-3-二氧磷
基乙醇酰胺
1，2-二辛酰  甘草次酸    柑桔素        81   91  94   75
基-sn-甘油
基-3-二氧磷
基乙醇酰胺
1，2-二辛酰  甘草次酸    Echinacea     81   91  119  77
基-sn-甘油
基-3-二氧磷
基乙醇酰胺
1，2-二辛酰  甘草次酸    二甲基咪唑啉  81   91  87   67
基-sn-甘油               酮
基-3-二氧磷
基乙醇酰胺
蓖麻油甲酯酸甘珀酸       磷脂酰胆碱    85   95  88   63
(MEA)
B1/B2/B4组
合：
B1/B2/B5组
合：
磷脂酰胆碱   苯咪丁酮    Echinacea     88   84  119  75
磷脂酰胆碱   苯咪丁酮      柑桔素        88    84    94    83
磷脂酰胆碱   苯咪丁酮      香叶醇        88    84    105   76
磷脂酰胆碱   苯咪丁酮      法呢醇        88    84    118   82
磷脂酰胆碱   苯咪丁酮      乙酰鞘氨醇    88    84    99    82
                           (C2神经酰
                           胺)
磷脂酰胆碱   咪康唑        α-紫罗兰酮   88    92    88    70
磷脂酰胆碱   咪康唑        蓖麻油甲酯酸  88    92    85    72
                           (MEA)
B1/B3/B4组
合：
安吖啶-HCl   二甲基咪唑啉  反油酸        79    87    93    0
             酮
α-紫罗兰酮  安吖啶-HCl    12-羟基硬脂   68    79    95    62
                           酸
Lyrial       十六烷二酸    香兰素        97    90    134   81
己酰基鞘氨醇 异硬脂酸      甘草次酸      104   87    91    58
(C6神经酰
胺)
B1/B3/B5组
合：
安吖啶-HCl   二甲基咪唑啉  2-羟基喹啉    79    87    95    32
             酮            (2-羟基喹
                           啉)
安吖啶-HCl   二甲基咪唑啉  月桂基羟乙基  79    87    52    -13
             酮            咪唑啉
安吖啶-HCl   二甲基咪唑啉  槲皮素        79    87    92    -24
             酮
安吖啶-HCl   二甲基咪唑啉  油酰基羟乙基  79    87    76    39
             酮            咪唑啉
安吖啶-HCl    二甲基咪唑啉  7H-苯并咪唑   79   87   94   32
              酮            并[2，1-a]苯
                            并[de]-异喹
                            啉-7-酮
安吖啶-HCl    二甲基咪唑啉  香豆素        79   87   80   30
              酮
己酰基鞘氨醇  甘珀酸        油酰基羟乙基  104  88   76   64
(C6神经酰     咪唑啉
胺)
己酰基鞘氨醇  3，4，-二氢-  香兰素        104  90   134  62
(C6神经酰     2(1H)-喹啉
胺)           酮(氢化喹诺
              酮)
安吖啶-HCl    氨基苯并三唑  Echinacea     79   105  119  48
己酰基鞘氨醇  氨基苯并三唑  鞘磷脂        104  105  60   69
(C6神经酰
胺)
安吖啶-HCl    氨基苯并三唑  乙酰鞘氨醇    79   105  99   -7
                            (C2神经酰
                            胺)
α-紫罗兰酮   安吖啶-HCl    7H-苯并咪唑   68   79   94   54
                            并[2，1-a]苯
                            并[de]-异喹
                            啉-7-酮
Utrecht-2     甘珀酸        槲皮素        76   88   92   74
Utrecht-2     甘珀酸        油酰基羟乙基  76   88   76   69
                            咪唑啉
Utrecht-2     甘珀酸        7H-苯并咪唑   76   88   94   73
                            并[2，1-a]苯
                            并[de]-异喹
                            啉-7-酮
Utrecht-2    甘珀酸       3，4-二氢-    76    88    90    70
                          2(1H)-喹啉
                          酮(氢化喹诺
                          酮)
肉豆蔻酸     苯咪丁酮     香叶醇        79    84    105   74
肉豆蔻酸     苯咪丁酮     α-二氢大马   79    84    89    73
                          酮
肉豆蔻酸     苯咪丁酮     乙酰鞘氨醇    79    84    99    70
                          (C2神经酰
                          胺)
油基甜菜碱   酮康唑       甘珀酸        62    85    88    78
油基甜菜碱   酮康唑       甘草次酸      62    85    91    71
油基甜菜碱   酮康唑       亚油酸        62    85    11    83
油基甜菜碱   酮康唑       亚麻酸        62    85    208   80
己酰基鞘氨醇 3，4，-二氢  香兰素        104   90    134   62
(C6神经酰    2(1H)-喹啉
胺)          酮(氢化喹诺
             酮)
B1/B4/B5组
合：
反油酸       2-羟基喹啉   蓖麻油甲酯酸  93    95    85    75
             (2-羟基喹    (MEA)
             啉)
反油酸       2-羟基喹啉   柑桔素        93    95    94    86
             (2-羟基喹
             啉)
反油酸       2-羟基喹啉   α-二氢大马   93    95    89    80
             (2-羟基喹    酮
             啉)
反油酸        2-羟基喹啉  法呢醇       93   95  118  82
              (2-羟基喹
              啉)
反油酸        2-羟基喹啉  番红花酸     93   95  90   78
              (2-羟基喹
              啉)
B2/B3/B4组
合：
1，2-二辛酰   甘草次酸    12-羟基硬脂  81   91  95   57
基-sn-甘油                酸
基-3-二氧磷
基乙醇酰胺
1，2-二辛酰   甘草次酸    亚麻子油     81   91  103  62
基-sn-甘油
基-3-二氧磷
基乙醇酰胺
1，2-二辛酰   甘草次酸    反油酸       81   91  93   75
基-sn-甘油
基-3-二氧磷
基乙醇酰胺
磷脂酰胆碱    2-羟基硬脂  花生四烯酸   88   83  78   60
              酸          (Na+盐)
B2/B3/B5组
合：
磷脂酰胆碱    苯咪丁酮    亚麻酸       88   84  208  84
磷脂酰胆碱    苯咪丁酮    花生四烯酸   88   84  78   83
                          (Na+盐)
1，2-二辛酰   安吖啶-HCl  苯咪丁酮     81   79  84   58
基-sn-甘油
基-3-二氧磷
基乙醇酰胺
1，2-二辛酰   安吖啶-HCl  7H-苯并咪唑    81  79  94   59
基-sn-甘油                并[2，1-a]苯
基-3-二氧磷               并[de]-异喹
基乙醇酰胺                啉-7-酮
1，2-二辛酰   甘草次酸    3，4，-二氢-   81  91  90   56
基-sn-甘油                2(1H)-喹啉
基-3-二氧磷               酮(氢化喹诺
基乙醇酰胺                酮)
1，2-二辛酰  甘草次酸     2-羟基喹啉     81  91  95   75
基-sn-甘油                (2-羟基喹
基-3-二氧磷               啉)
基乙醇酰胺
1，2-二辛酰  甘草次酸     氨基苯并三唑   81  91  105  72
基-sn-甘油
基-3-二氧磷
基乙醇酰胺
1，2-二辛酰  甘草次酸     月桂基羟乙基   81  91  52   79
基-sn-甘油                咪唑啉
基-3-二氧磷
基乙醇酰胺
1，2-二辛酰  甘草次酸     槲皮素         81  91  92   73
基-sn-甘油
基-3-二氧磷
基乙醇酰胺
1，2-二辛酰  甘草次酸     苯咪丁酮       81  91  84   54
基-sn-甘油
基-3-二氧磷
基乙醇酰胺
1，2-二辛酰 甘草次酸     克霉唑        81   91  79   42
基-sn-甘油
基-3-二氧磷
基乙醇酰胺
1，2-二辛酰 甘草次酸     咪康唑        81   91  82   43
基-sn-甘油
基-3-二氧磷
基乙醇酰胺
B2/B4/B5组
合：
磷脂酰胆碱  2-羟基硬脂   氨基苯并三唑  88   83  105  77
            酸
磷脂酰胆碱  2-羟基硬脂   月桂基羟乙基  88   83  52   74
            酸           咪唑啉
磷脂酰胆碱  2-羟基硬脂   槲皮素        88   83  92   69
            酸
磷脂酰胆碱  2-羟基硬脂   油酰基羟乙基  88   83  76   75
            酸           咪唑啉
磷脂酰胆碱  2-羟基硬脂   7H-苯并咪唑   88   83  94   79
            酸           并[2，1-a]苯
并[de]-异喹
                         啉-7-酮
磷脂酰胆碱  苯咪丁酮     反油酸        88   84  93   81
B3/B4/B5组
合：
反油酸      2-羟基喹啉   甘珀酸        93   95  88   69
            (2-羟喹啉)
反油酸      2-羟基喹啉   香兰素        93   95  134  81
            (2-羟喹啉)
安吖啶-HCl  氨基苯并三唑 亚麻子油      79   105 103  45
肉豆蔻酸    苯咪丁酮    1 2-羟基硬脂  79   84   95   81
                        酸
肉豆蔻酸    苯咪丁酮    亚麻子油      79   84   103  81
反油酸      2-羟基喹啉  花生四烯酸    93   95   78   63
            (2-羟喹啉)  (Na+盐)
增效剂的四元组合对Tgase抑制作用的协同效果
为了研究四种不同种类的增效剂的组合与视黄醇对Tgase表达的协同抑制作用，在上表给出的浓度下测试化合物的选定组合。试验浓度比Tgase活性最低抑制所需浓度(即IC20)小一个对数数量级。
所述化合物单独和以组合方式进行测试并给出各化合物和各组合的Tgase的％抑制率。下列实施例给出所有可能的三元组合的协同组合(B1/B2/B3/B4；B1/B2/B3/B5；B1/B2/B4/B5；B1/B3/B4/B5；B2/B3/B4/B5；)。如果(4种增效剂)的组合的％抑制率差别比3种增效剂组合的抑制率差别大于30％(即4种增效剂组合物的％抑制率等于或大于3中增效剂组合的％抑制率+30％)，则证明具有协同作用。下表中增效剂的所有四元组合均表现出协同作用。
化合物1     化合物2     化合物3   化合物4     四元   三元    差异
                                              TG     (1-3    (＜30％
                                              (％C)  组      ＝协
                                                     合；TG  同)
                                                     ％C)
B1/B2/B3/B
4组合：
蓖麻油甲酯  磷脂酰胆碱  甘草次酸  12-羟基-硬  21     64      42
酸(MEA)                           脂酸
柑桔素      磷脂酰胆碱  甘草次酸  12-羟基-硬  15     57      41
                                  脂酸
亚油酰基一  1，2-二辛酰  甘草次酸    12-羟基-硬  -3  40  43
乙醇酰胺    基-sn-甘油               脂酸
(LAMEA)     基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
亚油酰基一  1，2-二辛酰  甘草次酸    异硬脂酸    5   40  35
乙醇酰胺    基-sn-甘油
(LAMEA)     基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
亚油酰基一  1，2-二辛酰  安吖啶-HCl  12-羟基-硬  -3  42  45
乙醇酰胺    基-sn-甘油               脂酸
(LAMEA)     基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
亚油酰基一  1，2-二辛酰  安吖啶-HCl  反油酸      8   42  34
乙醇酰胺    基-sn-甘油
(LAMEA)     基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
己酰基鞘氨  TCC          甘草次酸    异硬脂酸    7   54  47
醇(C6神经
酰胺)
Lyrial      TCC          香兰素      十六烷二酸  10  48  38
椰油基羟乙  1，2-二辛酰  甘草次酸    异硬脂酸    0   37  37
基咪唑啉    基-sn-甘油
            基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
椰油基羟乙  磷脂酰胆碱   花生四烯酸  2-羟基-硬   -1   37  38
基咪唑啉                 (Na+盐)     脂酸
椰油基羟乙  1，2-二辛酰  甘草次酸    亚麻子油    -2   45  47
基咪唑啉    基-sn-甘油
            基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
B1/B2/B3/B
5组合：
蓖麻油甲酯  磷脂酰胆碱   甘草次酸    苯咪丁酮    20  64  44
酸(MEA)
蓖麻油甲酯  磷脂酰胆碱   甘草次酸    克霉唑      26  64  38
酸(MEA)
蓖麻油甲酯  磷脂酰胆碱   甘草次酸    咪康唑      9   64  55
酸(MEA)
蓖麻油甲酯  磷脂酰胆碱   甘草次酸    酮康唑      5   64  59
酸(MEA)
蓖麻油甲酯  磷脂酰胆碱   甘草次酸    月桂基羟乙  15  64  49
酸(MEA)                              基咪唑啉
蓖麻油甲酯  磷脂酰胆碱   甘草次酸    油酰基羟乙  2   64  61
酸(MEA)                              基咪唑啉
蓖麻油甲酯  磷脂酰胆碱   甘草次酸    7H-苯并咪   25  64  39
酸(MEA)                              唑并[2，1-
                                     a]苯并
                                     [de]-异喹
                                     啉-7-酮
Echinacea   磷脂酰胆碱   甘草次酸    12-羟基硬   18  62  44
                                     脂酸
Echinacea   磷脂酰胆碱   甘草次酸    苯咪丁酮    22  62  40
Echinacea   磷脂酰胆碱   甘草次酸    克霉        24  62  38
Echinacea   磷脂酰胆碱   甘草次酸    咪康唑      13  62  50
Echinacea  磷脂酰胆碱  甘草次酸  酮康唑      12   62  50
Echinacea  磷脂酰胆碱  甘草次酸  月桂基羟乙  14   62  49
                                 基咪唑啉
Echinacea  磷脂酰胆碱  甘草次酸  油酰基羟乙  3    62  59
                                 基咪唑啉
Echinacea  磷脂酰胆碱  甘草次酸  7H-苯并咪   24   62  39
                                 唑并[2，1-
                                 a]苯并
                                 [de]-异喹
                                 啉-7-酮
柑桔素     磷脂酰胆碱  甘草次酸  咪康唑      1    57  56
柑桔素     磷脂酰胆碱  甘草次酸  酮康唑      22   57  34
柑桔素     磷脂酰胆碱  甘草次酸  月桂基羟乙  10   57  46
                                 基咪唑啉
柑桔素     磷脂酰胆碱  甘草次酸  油酰基羟乙  2    57  54
                                 基咪唑啉
柑桔素     磷脂酰胆碱  甘草次酸  7H-苯并咪   15   57  42
                                 唑并[2，1-
                                 a]苯并
                                 [de]-异喹
                                 啉-7-酮
棕榈酸酰胺 磷脂酰胆碱  甘草次酸  咪康唑      -2   39  41
一乙醇酰胺
棕榈酸酰胺 磷脂酰胆碱  甘草次酸  油酰基羟乙  6    39  33
一乙醇酰胺                       基咪唑啉
法呢醇     磷脂酰胆碱  甘草次酸  咪康唑      3    43  40
法呢醇     磷脂酰胆碱  甘草次酸  油酰基羟乙  6    43  37
                                 基咪唑啉
香叶醇      1，2-二辛酰  安吖啶-HCl  咪康唑      11  47  36
            基-sn-甘油
            基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
香叶醇      1，2-二辛酰  安吖啶-HCl  油酰基羟乙  3   47  44
            基-sn-甘油   基咪唑啉
            基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
亚油酰基一  1，2-二辛酰  甘草次酸    苯咪丁酮    2   40  37
乙醇酰胺    基-sn-甘油
(LAMEA)     基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
亚油酰基一  1，2-二辛酰  甘草次酸    咪康唑      5   40  35
乙醇酰胺    基-sn-甘油
(LAMEA)     基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
亚油酰基一  1，2-二辛酰  甘草次酸    酮康唑      0   40  40
乙醇酰胺    基-sn-甘油
(LAMEA)     基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
亚油酰基一  1，2-二辛酰  甘草次酸    月桂基羟乙  -2  40  41
乙醇酰胺    基-sn-甘油               基咪唑啉
(LAMEA)     基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
亚油酰基一  1，2-二辛酰  甘草次酸    油酰基羟乙    5   40  35
乙醇酰胺    基-sn-甘油               基咪唑啉
(LAMEA)     基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
亚油酰基一  1，2-二辛酰  甘草次酸    7H-苯并咪     1   40  39
乙醇酰胺    基-sn-甘油               唑并[2，1-
(LAMEA)     基-3-二氧                a]苯并
            磷基乙醇酰               [de]-异喹
            胺                       啉-7-酮
亚油酰基一  1，2-二辛酰  安吖啶-HCl  苯咪丁酮      7   42  35
乙醇酰胺    基-sn-甘油
(LAMEA)     基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
亚油酰基一  1，2-二辛酰  安吖啶-HCl  克霉唑        10  42  32
乙醇酰胺    基-sn-甘油
(LAMEA)     基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
亚油酰基一  1，2-二辛酰  安吖啶-HCl  咪康唑        5   42  37
乙醇酰胺    基-sn-甘油
(LAMEA)     基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
亚油酰基一  1，2-二辛酰  安吖啶-HCl  酮康唑        11  42  32
乙醇酰胺    基-sn-甘油
(LAMEA)     基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
亚油酰基一  1，2-二辛酰  安吖啶-HCl  月桂基羟乙  -4  42  46
乙醇酰胺    基-sn-甘油               基咪唑啉
(LAMEA)     基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
亚油酰基一  1，2-二辛酰  安吖啶-HCl  油酰基羟    5   42  37
乙醇酰胺    基-sn-甘油               基咪唑啉
(LAMEA)     基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
亚油酰基一  1，2-二辛酰  安吖啶-HCl  7H-苯并咪   8   42  35
乙醇酰胺    基-sn-甘油               唑并[2，1-
(LAMEA)     基-3-二氧                a]苯并
            磷基乙醇酰               [de]-异喹
            胺                       啉-7-酮
棕榈酸酰胺  1，2-二辛酰  安吖啶-HCl  咪康唑      13  43  30
一乙醇酰胺  基-sn-甘油
            基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
棕榈酸酰胺  1，2-二辛酰  安吖啶-HCl  油酰基羟乙  3   43  40
一乙醇酰胺  基-sn-甘油               基咪唑啉
            基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
α-二氢大马 1，2-二辛酰  安吖啶-HCl  咪康唑      11  48  37
酮          基-sn-甘油
            基-3-二氧
            磷基乙醇酰
            胺
α-二氢大马  1，2-二辛酰  安吖啶-HCl  酮康唑      13  48  34
酮           基-sn-甘油
             基-3-二氧
             磷基乙醇酰
             胺
α-二氢大马  1，2-二辛酰  安吖啶-HCl  月桂基羟乙  15  48  33
酮           基-sn-甘油               基咪唑啉
             基-3-二氧
             磷基乙醇酰
             胺
α-二氢大马  1，2-二辛酰  安吖啶-HCl  油酰基羟基  3   48  45
酮           基-sn-甘油               咪唑啉
             基-3-二氧
             磷基乙醇酰
             胺
蓖麻油 甲酯  磷脂酰胆碱   甘珀酸      12-羟基硬   3   55  52
酸(MEA)                               脂酸
蓖麻油 甲酯  磷脂酰胆碱   甘珀酸      苯咪丁酮    6   55  49
酸(MEA)
蓖麻油 甲酯  磷脂酰胆碱   甘珀酸      咪康唑      -2  55  57
酸(MEA)
蓖麻油 甲酯  磷脂酰胆碱   甘珀酸      酮康唑      1   55  54
酸(MEA)
蓖麻油 甲酯  磷脂酰胆碱   甘珀酸      月桂基羟乙  4   55  51
酸(MEA)      基咪唑啉
蓖麻油 甲酯  磷脂酰胆碱   甘珀酸      油酰基羟乙  3   55  52
酸(MEA)      基咪唑啉
蓖麻油 甲酯 磷脂酰胆碱  甘珀酸     7H-苯并咪   11  55  44
酸(MEA)                            唑并[2，1-
                                   a]苯并
                                   [de]-异喹
                                   啉-7-酮
柑桔素      磷脂酰胆碱  亚油酸     苯咪丁酮    -1  45  46
香叶醇      磷脂酰胆碱  亚油酸     苯咪丁酮    1   40  39
乙酰鞘氨醇  磷脂酰胆碱  亚油酸     苯咪丁酮    0   40  40
(C2神经酰
胺)
乙酰鞘氨醇  磷脂酰胆碱  亚麻酸     苯咪丁酮    10  40  30
(C2神经酰
胺)
二甲基咪唑  TCC         安吖啶-HCl 反油酸      14  47  33
啉酮
二甲基咪唑  TCC         安吖啶-HCl 槲皮素      12  44  32
啉酮
二甲基咪唑  TCC         安吖啶-HCl 香豆素      14  58  44
啉酮
己酰基鞘氨  TCC         甘草次酸   氨基苯并三  8   48  40
醇(C6神经                          唑
酰胺)
α-二氢大马 TCC         肉豆蔻酸   苯咪丁酮    10  44  34
酮
B1/B2/B4/B
5组合：
Lyrial      香兰素      十六烷二酸 咪康唑      12  48  36
Lyrial      香兰素      十六烷二酸 油酰基羟乙  4   48  45
                                   基咪唑啉
番红花酸    TCC         反油酸     2-羟基喹啉  11  48  37
                                   (2-羟喹啉)
己酰基鞘氨  甘草次酸    12-羟基硬  氨基苯并三  14  48  33
醇(C6神经               脂酸       唑
酰胺)
二甲基咪唑  磷脂酰胆碱  2-羟基硬脂 7H-苯并咪   2   44  42
啉酮                    酸         唑并[2，1-
                                   a]苯并
                                   [de]-异喹
                                   啉-7-酮
亚油甲苄胺  磷脂酰胆碱  2-羟基硬脂 7H-苯并咪   5   44  39
                        酸         唑并[2，1-
                                   a]苯并
                                   [de]-异喹
                                   啉-7-酮
香叶草基香  磷脂酰胆碱  2-羟基硬脂 7H-苯并咪   9   44  35
叶醇                    酸         唑并[2，1-
                                   a]苯并
                                   [de]-异喹
                                   啉-7-酮
椰油基羟乙  磷脂酰胆碱  2-羟基硬脂 7H-苯并咪   -8  44  52
基咪唑啉                酸         唑并[2，1-
                                   a]苯并
                                   [de]-异喹
                                   啉-7-酮
乙酰鞘氨醇  磷脂酰胆碱  2-羟基硬脂 7H-苯并咪   10  44  34
(C2神经酰               酸         唑并[2，1-
胺)                                a]苯并
                                   [de]-异喹
                                   啉-7-酮
番红花酸     磷脂酰胆碱  2-羟基硬脂  7H-苯并咪   10  44  34
                         酸          唑并[2，1-
                                     a]苯并
                                     [de]-异喹
                                     啉-7-酮
N，N-二乙基  磷脂酰胆碱  2-羟基硬脂  7H-苯并咪   4   44  40
椰油酰胺                 酸          唑并[2，1-
(椰油酰胺                            a]苯并
DEA)                                 [de]-异喹
                                     啉-7-酮
椰油羟乙基   磷脂酰胆碱  反油酸      苯咪丁酮    -4  30  34
咪唑啉
B1/B3/B4/B
5组合：
二甲基咪唑   安吖啶-HCl  反油酸      咪康唑      7   47  40
啉酮
二甲基咪唑   安吖啶-HCl  反油酸      酮康唑      6   47  41
啉酮
二甲基咪唑   安吖啶-HCl  反油酸      油酰基羟乙  3   47  44
啉酮         基咪唑啉
己酰基鞘氨   甘草次酸    异硬脂酸    克霉唑      20  54  34
醇(C6神经
酰胺)
己酰基鞘氨   甘草次酸    异硬脂酸    咪康唑      10  54  43
醇(C6神经
酰胺)
己酰基鞘氨   甘草次酸    异硬脂酸    月桂基羟乙  20  54  33
醇(C6神经                            基咪唑啉
酰胺)
己酰基鞘氨  甘草次酸    异硬脂酸    油酰基羟乙  5    54   48
醇(C6神经                           基咪唑啉
酰胺)
番红花酸    亚油酸      反油酸      2-羟基喹啉  0    48   48
                                    (2-羟喹啉)
番红花酸    亚麻酸      反油酸      2-羟基喹啉  -2   48   50
                                    (2-羟喹啉)
蓖麻油甲酯  亚油酸      反油酸      2-羟基喹啉  -1   31   32
酸(MEA)                             (2-羟喹啉)
椰油基羟乙  甘珀酸      反油酸      2-羟基喹啉  -6   28   34
基咪唑啉                            (2-羟喹啉)
B2/B3/B 4/B
5组合：
1，2-二辛酰 甘草次酸    异硬脂酸    酮康唑      4    37   33
基-sn-甘油
基-3-二氧
磷基乙醇酰
胺
1，2-二辛酰 甘草次酸    异硬脂酸    油酰基羟乙  6    37   31
基-sn-甘油                          基咪唑啉
基-3-二氧
磷基乙醇酰
胺
磷脂酰胆碱  花生四烯酸  2-羟基硬脂  咪康唑      6    37   31
            (Na+盐)     酸
磷脂酰胆碱  花生四烯酸  2-羟基硬脂  油酰基羟乙  5    37   32
            (Na+盐)     酸          基咪唑啉
1，2-二辛酰  甘草次酸  亚麻子油    咪康唑      -1  45   47
基-sn-甘油
基-3-二氧
磷基乙醇酰
胺
1，2-二辛酰  甘草次酸  亚麻子油    油酰基羟乙  7   45   38
基-sn-甘油                         基咪唑啉
基-3-二氧
磷基乙醇酰
胺
磷脂酰胆碱   甘珀酸    2-羟基硬脂  7H-苯并咪   8   44   36
                       酸          唑并[2，1-
                                   a]苯并
                                   [de]-异喹
                                   啉-7-酮
磷脂酰胆碱  亚油酸     2-羟基硬脂  7H-苯并咪   -3  44   47
                       酸          唑并[2，1-
                                   a]苯并
                                   [de]-异喹
                                   啉-7-酮
磷脂酰胆碱  甘草次酸   反油酸      苯咪丁酮    -3  30   33
磷脂酰胆碱  亚油酸     反油酸      苯咪丁酮    -2  30   32
化妆可接受载体
本发明的组合物还含有化妆可接受载体以在组合物中发挥活性成分的稀释剂、分散剂或载体的作用，从而在将组合物涂敷在皮肤上时使它们易于分布。
非水或除水以外的载体可以包括液体或固体润肤剂、溶剂、保湿剂、增稠剂和散剂。尤其优选的非水载体是聚二甲基硅氧烷和/或聚二甲基苯基硅氧烷。本发明的聚硅氧烷可以是那些25℃下粘度介于约10-10,000,000厘沲内的聚硅氧烷。尤其希望是低粘度和高粘度聚硅氧烷的混合物。这些聚硅氧烷购自General Electric Company，商标名为Vicasil、SE和SF，和购自Dow Corning Company的200和550系列。聚硅氧烷在本发明组合物中可以使用的量介于组合物重量的5-95％，优选25-90％(重量)。
任选的皮肤有益原料和化妆品辅剂
油或油性原料可以与乳化剂一起存在以提供油包水乳液或水包油乳液，这大部分取决于所用乳化剂的平均亲水-亲脂平衡(HLB)。
本发明的化妆品组合物中可以存在不同种类的活性成分。活性剂被定义为除润肤剂和其它只改善组合物物理特性的组分之外的皮肤或毛发有益剂。虽然不限于这种分类，一般性实例包括防晒剂、亮肤剂和晒褐剂。
防晒剂包括那些常用于阻断紫外光的物质。示例化合物是PABA、肉桂酸酯和水杨酸酯的衍生物。譬如，可以使用甲氧基肉桂酸辛酯和2-羟基-4-甲氧基二苯酮(也称作羟苯甲酮)。甲氧基肉桂酸辛酯和2-羟基-4-甲氧基二苯酮分别以商标Parsol MCX和Benzophenone-3销售。
防晒剂在乳液中的精确用量可以根据对太阳紫外辐射所需的防护程度而变化。
另一种优选的优选组分选自必需脂肪酸(EFAs)，也就是那些所有细胞的质膜形成中所必需的脂肪酸，在角质细胞中EFA缺乏导致细胞过度增殖。补充EFA可以校正这种现象。EFA也可以提高表皮的脂质生物合成并为表皮的屏障形成提供脂质。所述的必需脂肪酸优选自亚油酸、γ-亚麻酸、高-γ-亚麻酸、columbinic酸、二十碳-(n-6，9，13)-三烯酸、花生四烯酸、γ-亚麻酸、二十碳五烯酸、己烯酸及其混合物。
润肤剂常常掺混在本发明的化妆品组合物中。此类润肤剂的水平可以是组合物总重量的约0.5％-约50％，优选约5％-30％(重量)。润肤剂在通用化学目录下可以划分为酯类、脂肪酸和醇类，多元醇，和烃类。
酯可以是单-或二-酯。脂肪酸二酯的可接受实例包括己二酸二丁酯、癸二酸二乙酯、二聚酸二异丙酯，和琥珀酸二辛酯。可接受的支链脂肪酯包括肉豆蔻酸2-乙基-己酯、硬脂酸异丙酯和棕榈酸异硬脂基酯。可接受的三元酸酯包括三亚油酸三异丙酯和柠檬酸三月桂酯。可接受的直链脂肪酯包括棕榈酸月桂酯、乳酸肉豆蔻酯、芥酸油酯和油酸硬脂基酯。优选的酯包括椰油辛酸酯/癸酸酯(椰油辛酸酯和椰油癸酸酯的混合物)、丙二醇肉豆蔻基醚乙酸酯、己二酸二异丙酯和辛酸鲸蜡酯。
适当的脂肪醇和酸包括具有10-20个碳原子的那些化合物。尤其优选此类化合物例如鲸蜡基、肉豆蔻基、棕榈基和硬脂基醇类和酸类。
在可以起润肤剂作用的多元醇中是直链或支链烷基多羟基化合物。例如，优选丙二醇、山梨糖醇和甘油。也可以使用聚合多元醇，例如聚丙二醇和聚乙二醇。丁二醇和丙二醇也尤其优选作为渗透促进剂。
可以起润肤剂作用的烃类实例是那些具有12-30个碳原子的烃链的烃类。具体实例包括矿物油、矿脂、角鲨烯和异链烷烃。
本发明化妆品组合物中的另一类功能组分是增稠剂。增稠剂的含量一般是组合物重量的0.1-20％(重量)，优选约0.5％-10％(重量)。增稠剂实例是B.F.Goodrich公司以商品名Carbopol出售的交联聚丙烯酸酯材料。也可以使用树胶，例如黄原胶、角叉菜胶、明胶、梧桐胶、果胶和槐树豆胶。在某些情形下作为聚硅氧烷或润肤剂的材料也可以发挥增稠功能。譬如，大于10厘沲的聚硅氧烷胶和酯如硬脂酸甘油酯具有双重功能。
本发明的化妆品组合物中可以掺混粉末。这些粉末包括白垩粉、滑石粉、漂白土、高岭土、淀粉、绿土粘土、化学改性的硅酸镁铝、有机改性的蒙脱石粘土、水合硅酸铝、煅烧硅石、辛烯基琥珀酸淀粉铝和它们的混合物。
其它次要辅助成分也可以掺混在所述的化妆品组合物中。这些组分可以包括着色剂、遮光剂和香精。这些物质的含量可以是组合物重量的0.001％-20％(重量)。
组合物的使用
本发明的组合物主要意在作为局部涂敷在人皮肤上的产品，尤其是作为调理和平抚皮肤的试剂，和防止和减少皱纹和老化皮肤出现的试剂。
在使用中，从合适的容器或涂敷器将少量的组合物，例如1-5ml，涂敷在皮肤的暴露区域，并且如果必要，随后用手或手指或适当装置铺展和/或摩擦到皮肤内。
产品形式和包装
本发明的局部皮肤处理组合物可以配制为洗剂、流体霜剂、霜剂或凝胶。所述的组合物可以包装在适合其粘度和消费者用途的适当容器中。例如，洗剂或流体霜剂包装在瓶或滚珠涂敷器，或胶囊，或发生剂驱动气溶胶装置或带有适合手指操作的泵的容器中。当组合物是霜剂时，可以简单储藏在不变形瓶或挤压式容器如管或有盖的罐内。
本发明因此还提供含有化妆上可接受的本发明定义组合物的密闭容器。

Claims (3)

1.一种护肤组合物，含有：
a.0.001％重量-10％重量的类维生素A；
b.0.001％重量-5％重量的类维生素A增效剂的四元组合，选自B1/B2/B3/B4；B1/B2/B3/B5；B1/B2/B4/B5；B1/B3/B4/B5；和B2/B3/B4/B5，其中每一种增效剂的浓度为100mM-1nM，
其中B1选自脂肪酸酰胺类、神经酰胺类、类胡萝卜素类、黄烷类化合物、环状香料、非环状香料、磷脂和脲类；
其中B2选自磷脂酰胆碱和鞘磷脂；
其中B3选自花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、甘草次酸、和磷脂酰乙醇胺；
其中B4选自十六烷二酸、12-羟基硬脂酸、异硬脂酸、亚麻子油、和反油酸；
其中B5选自联苯苄唑、苯咪丁酮、克霉唑、氯氧甲苯咪唑、酮康唑、咪康唑、月桂基羟乙基咪唑啉、槲皮素、香豆素、喹啉类、异喹啉类、和美替拉酮；
c.化妆可接受载体。
2.权利要求1的组合物在制备用于调理皮肤的美容方法的药物方面的用途，该方法包括将权利要求1的组合物局部涂敷在皮肤上。
3.权利要求1的组合物在制备用于模拟视黄酸对皮肤的作用的美容方法的药物方面的用途，该方法包括将权利要求1的组合物局部涂敷在皮肤上。
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