CZ20024220A3

CZ20024220A3 - Prostředek pro péči o pleť

Info

Publication number: CZ20024220A3
Application number: CZ20024220A
Authority: CZ
Inventors: Stewart Paton Granger; Ian Richard Scott; Robert Mark Donovan; Susanne Teklits Iobst; Lisa Licameli
Original assignee: Unilever N. V.
Priority date: 2000-06-30
Filing date: 2001-06-25
Publication date: 2003-06-18
Also published as: KR20030011937A; US20140050676A1; US20110206626A1; AU2001279687B2; US8409550B2; PL365167A1; CN1662216B; AU7968701A; RU2003102634A; CA2412788C; BR0112142A; KR100866671B1; CN1662216A; US7959913B2; ES2524559T3; WO2002002074A3; EP1333800B1; WO2002002074A2; US8226933B2; ZA200210288B

Description

Prostředek pro péči o pleť.

Oblast techniky

Vynález se týká prostředku pro péči o pleť s obsahem látek, podporujících účinek retinové kyseliny. Vynález se týká zejména prostředků s obsahem různých výhodných kombinací takových látek.

Dosavadní stav techniky

Retinol, vitamin A je endogenní látka, která se přirozeně vyskytuje v lidském organismu a je podstatná pro normální diferenciaci epithelových buněk. Přírodní a synthetické deriváty vitaminu A jsou široce využívány při léčení různých kožních onemocnění a také k regeneraci pokožky. Kyselina retinová je rovněž používána k léčení různých chorobných stavů, například akné, vrásek, lupenky, stařeckých skvrn a různých poruch pigmentace, jak je popsáno například v publikacích Vahlquist, A. a další, J. Invest. Dermatol., sv. 94, Holand D. B. a Cunliffe, W. J., 1990, s. 496-498, Ellis, C. N. a další, Pharmacology of Retinols in Skin, Vasel, Karger, sv. 3, 1989, s. 249-252, Lowe, N. J. a další, Pharmacology of Retinols in Skin, sv. 3, 1989, s. 240-248, PCT patentová přihláška WO 93/19743.

Estery retinolu a retinol se v pokožce enzymaticky mění na kyselinu retinovou podle následujícího mechanismu:

• · ··· ·

Metabolismus retinolu v epidermis:

z. Retlnyl

Estery

Retinol

AR AT/ LRAT ,(B1} Retiny! -< Ester

Retlnal, reductaza (B3)

Retinol

Retlnal retinová kyselina

Retlnyl ester, hydrolaZďr

Retinol ₍ Retinal , dahydrogena^ dehydrogenazo (B2)

CRABP-2 (B4) degradované

-produkty

Cytochrom

P450 (B5)

RBP- Retinol (systemicíty}

Vynález je založen na zjištění, že některé sloučeniny podporují přeměnu retinylesterů a retinolu na kyselinu retinovou. Tyto sloučeniny se souhrnně nazývají „zesilovače a označují se názvy skupin Bl až B5 podle mechanismu, jímž dochází k zesílení účinku. Tyto mechanismy jsou následující: inhibice ARAT/LRAT (acylkoenzym A, CoA: retinolacyltransf eráza/lecithin: retinolacyltransferáza) , jde o skupinu Bl, skupina B2 zesiluje účinnost retinoldehydrogenázy, skupina B3 vyvolává inhibici retinolreduktázy, skupina B4 antagonizuje vazbu CRABP-II na kyselinu retinovou (CRABP-II je protein II, schopný vázat kyselinu retinovou v buňkách), skupina B5 vyvolává inhibici oxidace kyseliny retinové v závislosti na cytochromu P450.

Zesilovače jako takové nebo ve vzájemné kombinaci zesilují působení retinoidů tak, že zvyšují jejich přeměnu na kyselinu retinovou a brání degradací retinové kyseliny. Zesilovače působí společně s retinoidem, • · · · · · ·· · · · · • · · · · • · · · · · · · • ♦ · · · · · · ·· ·· · · · · například s retinolem, retinylesterem, retinalem nebo kyselinou retinovou v pokožce. Výhodné prostředky však obsahují retinoid spolu se zesilovačem nebo s kombinací zesilovačů tak, aby došlo k optimálnímu účinku.

Několik patentových spisů Grangera a další popisuje použití zesilovačů retinoidů v kosmetických prostředcích » ke zvýšení účinku retinolu a retinylesterů. Jde o patentové spisy US 5759556, US 5756109, US 5747051,

US 5716627, US 5811110, US 5536740, US 5747051,

US 5599548, US 5955092, US 5885595, US 5759556 a US 5693330. Zesilovače, popsané v těchto patentových spisech spadají do skupin B1 a B5. Mimoto Johnson & Johnson popisují v řadě patentových spisů sloučeniny, které spadají do skupiny B5, jde o patentové spisy US 5028628, US 5037829, US 5151421, US 5476852,

US 5500435, US 5583136 a US 5612354.

V kosmetických výrobcích se běžně používají molekuly, které působí jako zesilovače účinku retinoidů. Ve známém stavu techniky je možno nalézt rozsáhlé údaje, , týkající se takových kosmetických prostředků. Je také možno nalézt publikace, popisující použití dvou nebo většího počtu takových látek v tomtéž prostředku. Jde například o patentové spisy US 5665367, US 5747049,

US 5853705, US 5766575 a US 5849310.

Dosavadní stav techniky však nepopisuje synergii, k níž dochází při použití kombinace různých zesilovačů.

Toto zjištění synergie při použití kombinace uvedených molekul je zcela neočekávané. Dosavadní stav techniky nepopisuje optimální koncentrace nebo poměry jednotlivých zesilovačů ani poměry zesilovačů k retinoidům. Vynález je • · · 0 0 · • · 0 0 0 0 ···· ··· ·· ·· tedy založen na zjištění nejvýhodnějších koncentrací nebo poměrů zesilovačů mezi sebou s zesilovačů a retinoidů v kosmetických prostředcích.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří prostředek pro péči o pleť, který obsahuje

a) 0,001 až 10 % retinoidů,

b) kombinaci alespoň dvou zesilovačů účinku retinoidů ze skupin Bl až B5 v množství 0,0001 až 50 %, přičemž vzájemný poměr těchto dvou látek se pohybuje v rozmezí 1:1000 až 1000:1,

c) kosmeticky přijatelné nosné prostředí.

Skupiny zesilovačů, vhodné pro použití v prostředcích podle vynálezu zahrnují látky, uvedené v následujících tabulkách Bl až B5.

Sloučeniny Bl

1. Amidy mastných kyselin	Běžně se dodávají a mimoto působí jako smáčedla, takže napomáhají vzniku emulze v kosmetickém prostředku.
2. Ceramidy	Mohou působit také jako prekursory bariérových ceramidů ve stratům corneum.
3. Karotenoidy	Poskytují určitou ochranu před UV zářením a působí jako přírodní barvivo.
4. Flavanoidy	Přírodní antioxidační látky.
5. Cyklické vonné látky	Běžně se dodávají a je možno je použít k úpravě vůně prostředku.

·· ··· · ·· ·9·· • · · · ·· · ·· · • · ··· 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9999 9 9 9 9

9999 999 99 99 99 99

6. Necyklické vonné látky	Užívají se k úpravě vůně prostředku.
7. Analogy	Mohou být využity kožními buňkami
fosfolipidů	pro regeneraci bariérových složek.
8. Močoviny	Běžně se dodávají a konzervují kosmetický prostředek.

Sloučeniny B2

1. Fosfatidylcholin	Nejvýhodnější jako velmi účinný aktivátor retinoldehydrogenázy.
2. Sfingomyelin

Sloučeniny B3

Kyselina arachidonová Kyselina linolová Kyselina linolenová Kyselina myristová	Mastné kyseliny, napomáhající udržet bariéru ve stratům corneum.
Kyselina linolová Kyselina linolenová	Esenciální mastné kyseliny
Kyselina arachidonová Kyselina myristová	Neesenciální mastné kyseliny
Kyselina glycyrrhetinová	Polycyklická triterpenová karboxylová kyselina z rostlinných zdrojů.
Fosfatidylethanolamin	Může být zabudován do buněčných membrán.

Sloučeniny B4

Kyselina hexadekandikarboxylová Kyselina 12-hydroxystearová Kyselina isostearová

Nasycené mastné kyseliny

Olej z lněných semen Kyselina elaidinová	Nenasycené mastné kyseliny
Kyselina elaidinová Kyselina isostearová Kyselina hexadekandikarboxylová	Pevné při teplotě místnosti
Olej z lněných semen Kyselina 12-hydroxystearová	Kapalné při teplotě místnosti

Sloučeniny B5

Bifonazol Climbazol Clotrimazol Econazol Ketoconazol Miconazol	Antimykotika
Climbazol	Běžně se dodává
Laurylhydroxyethylimidazol in	Běžně se dodává, působí jako smáčedlo a napomáhá vzniku emulze.
Kvercetin	Přírodně se vyskytující flavanoid s antioxidačními vlastnostmi.
Kumarin	Přírodní barvivo
Chinoliny Isochinoliny
Metyrapon

Prostředek podle vynálezu tedy obsahuje 0,0001 až 50 %, s výhodou 0,001 až 10 % a zvláště 0,001 až 5 % hmotnostních zesilovače nebo kombinace zesilovačů v kosmeticky přijatelném nosném prostředí.

• · « · ·· ····

Zesilovače nebo kombinace zesilovačů je v prostředcích podle vynálezu možno volit z následujících skupin:

a) zesilovač ze skupiny B2, B3, B4,

b) binární kombinace zesilovačů ze skupin B1/B2, B1/B3, B1/B4, B1/B5, B2/B3, B2/B4, B2/B5, B3/B4, B3/B5 a B4/B5,

c) ternární kombinace zesilovačů ze skupin B1/B2/B3, B1/B2/B4,' B1/B2/B5, B1/B3/B4, B1/B3/B5, B1/B4/B5, B2/B3/B4, B2/B3/B5, B2/B4/B5 a B3/B4/B5,

d) kvarterní kombinace zesilovačů ze skupin

B1/B2/B3/B4, B1/B2/B3/B5, B1/B2/B4/B5, B1/B3/B4/B5 a B2/B2/B4/B5 a

e) kombinace všech pěti skupin B1/B2/B3/B4/B5.

Výhodné prostředky obsahují 0,01 až 10 % hmotnostních retinoidu.

Sloučeniny, které jsou v prostředku podle vynálezu obsaženy jako zesilovače, se volí podle své schopnosti vyhovět v určité koncentraci, uvedené v tabulce A podmínkám pokusu in vitro pro specifické enzymy, které budou dále popsány v odstavcích 2.1. až 2.7. Tyto zesilovače mohou být zahrnuty do prostředku podle vynálezu, i když nejsou výslovně uvedeny. V případě, že jakákoliv sloučenina vyvolává dostatečnou inhibici nebo zesílení účinku určitého enzymu v dále popsaných pokusech, bude působit v prostředku podle vynálezu podobně jako kyselina retinová na kožní buňky a je tedy možno takovou látku použít pro účely vynálezu.

Pod pojmem „péče o pleč se rozumí prevence a léčení příliš suché pokožky, akné, poškození působením slunečního záření, vznik vrásek, stařecké skvrny, zvýšená ·· · ·· ···· ·· ···· ···· ·· · · · * • · · · · · · 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 99 99 99 ohebnost stratům corneum, zesvětlení barvy pokožky, poruchy vylučování mazu a podobně. Prostředek podle vynálezu může také zlepšit olupování kůže a diferenciaci kožních buněk.

Přítomnost určitých sloučenin podle vynálezu v prostředku podstatně zlepšuje účinek retinoidu.

Prostředek podle vynálezu obsahuje jako výhodnou složku retinoid, který se volí z retinylesterů, retinolu, retinalu a kyseliny retinové, zvláště výhodné jsou retinol a retinylestery. Pod pojmem „retinol jsou zahrnuty následující isomery retinolu: all-trans-retinol, 13-cís-retinol, 11-cis-retinol, 9-cis-retinol, 3,4didehydroretinol, 3,4-didehydro-13-cis-retinol, 3,4didehydro-11-cis-retinol, 3,4-didehydro-9-cis-retinol. Výhodnými isomery jsou all-trans-retinol, 13-cis-retinol,

3,4-didehydroretinol a 9-cis-retinol. Nejvýhodnější je all-trans-retinol vzhledem ke své běžné dostupnosti.

Retinylester je ester retinolu. Retinol byl definován svrchu. Retinylestery, vhodné pro použití prostředku podle vynálezu jsou Cl-C30estery retinolu, s výhodou C2-C20estery a zvláště C2, C3 a C16-estery vzhledem k tomu, že se běžně dodávají. Z vhodných retinylesterů je možno uvést retinylpalmitát, retinylmravenčan, retinylacetát, retinylpropionát, retinylbutyrát, retinylvalerát, retinylisovalerát, retinylhexanoát, retinylheptanoát, retinyloktanoát, retinylnonanoát, retinyldekanoát, retinylundekanoát, retinyllaurát, retinyltridekanoát, retinylmyristát, retinylpentadekanoat, retinylheptadekanoat, retinylstearát, retinylisostearát, retinylnonadekanoát, ·» · ♦···«· ···«·· ···· · · · * * » • · · · · ··· • ···· · · · · · • · ···· · · · · ···· ·*· ·· ·· ·· ·· retinylarachidonát, retinylbehenát, retinyllinoleát a retinyloleát.

Výhodný ester pro použití v prostředku podle vynálezu je zvláště retinylpalmitát, retinylacetát a retinylpropionát vzhledem k tomu, že se běžně dodávají a jsou proto nej levnější. Retinyllinoleát a retinyloleát jsou rovněž výhodné vzhledem k jejích dobrému účinku.

Retinyl nebo retinylester se v prostředku užije v množství 0,001 až 10 %, s výhodou 0,01 až 1 % a zvláště v množství 0,01 až 0,5 %.

V prostředcích je tedy možno použít látky, které vyhovují při zkouškách in vitro, které budou dále popsány v odstavcích 2.1 až 2.7. Sloučenina, vhodná k uvedenému účelu vyvolává v koncentraci, uvedené v tabulce A inhibici nebo zvýšení účinku enzymu alespoň v rozsahu, který je rovněž uveden v tabulce A.

Tabulka A.

Identifikace zesilovačů. Koncentrace zesilovače a procento inhibice nebo zesílení účinku.

Zkouška ARAT/LRAT k identifikaci zesilovačů B1

Rozmezí	Koncentrace	% Inhibice
Široké	100 μΜ	> 10 %
Výhodné	100 μΜ	> 25 %
Velmi výhodné	100 μΜ	> 40 %
Optimální	100 μΜ	> 50 %

»· ·♦·· *

·*· • · · • · · • * * * • · · · «· ·· ·· ·«# · » · · • t * • · · • · · · ♦ · ··

Zkouška s retinoldehydrogenázou k identifikaci zesilovačů B2

Rozmezí	Koncentrace	% zesílení
Široké	100 μΜ	> 10 %
Výhodné	100 μΜ	> 15 %
Velmi výhodné	100 μΜ	> 20 %
Optimální	100 μΜ	> 25 %

Zkouška s retinalreduktázou k identifikaci zesilovačů B3

Rozmezí	Koncentrace	% Inhibice
Široké	100 μΜ	> 5 %
Výhodné	100 μΜ	> 10 %
Velmi výhodné	100 μΜ	> 20 %
Optimální	100 μΜ	> 35 %

Zkouška na antagonismus CRABPII k identifikaci zesilovačů B4

Rozmezí	Poměr sloučeniny ke kyselině retinové	% Inhibice
Široké	7000 :1	> 25 %
Výhodné	7000 :1	> 50 %
Velmi výhodné	70:1	> 25 %
Optimální	70:1	> 50 %

Oxidace kyseliny retinové k identifikaci zesilovačů B5

Rozmezí	Koncentrace	% Inhibice
Široké	100 μΜ	> 25 %
Výhodné	100 μΜ	> 45 %
Velmi výhodné	100 μΜ	> 70 %
Optimální	100 μΜ	> 80 %

« · *

····

9» ·*·* *· ···♦ ·· · · · r · · • · · · > · · • « « · · e · · · • ···· · · · · ·#· ·· ·· ♦* ··

Byly provedeny zkoušky in vitro na mikrosomech ke stanovení vhodnosti použití zkoumaných látek v prostředku podle vynálezu.

1. Materiály

All-trans-retinol, all-trans-retinová kyselina, palmitoyl-CoA, dilauroylfosfatidylcholin, NAD a NADPH byly získány od Sigma Chemical Company. Zásobní roztoky retinoidů pro zkoušky na mikrosomech byly připraveny v acetonitrilu s čistotou, dostatečnou pro HPLC. Všechny standardní zásobní roztoky retinoidů pro HPLC byly připraveny v ethanolu a uloženy v atmosféře dusíku při teplotě -70 °C a po vyjmutí byly udržovány v ledu za osvětlení tmavým světlem. Další chemické látky a použité inhibitory se běžně dodávají například od společnosti Aldrich nebi International Flavours and Fragrances.

2. Metody

2.1 Isolace mikrosomů RPE (modifikace 1) očních bulev Skotu, s vyjmutou sítnicí a sklivcem bylo získány od W. L. Lawson Co., Lincoln, NE, USA. Po rozmražení přes noc byla duhovka oddělena pinzetou. Každá oční bulva byla promyta 2x 0,5 ml chladného pufru s obsahem 0,1M PO₄/1 mM DTT/0,25M sacharóza, pH 7 tak, že tmavě pigmentované buňky byly současně vyjmuty pomocí kartáčku. Buněčná suspenze byla smísena s duhovkami a suspenze byla míchána několik minut pomocí teflonové tyčinky. Pak byla suspenze zfiltrována přes hrubý filtr Spectra/Por z polyethylenu s velikostí pórů 925 μιη k odstranění hrubších částic a výsledná tmavě zbarvená • · · 4 • · · · · « • · · ··«· « • ·· · · ·· · • · · · · · fr · suspenze byla homogenizována v teflonovém homogenizátoru v zařízení Glas-Col.

Buněčný homogenát byl odstředěn 30 minut při 20000 g (odstředivka Sorvaal model RC-5B s rotorem SS34, zkumavky s rozměrem 2,5 x 10 cm, 14000 otáček za minutu). Výsledný supernatant byl znovu odstředěn 6 0 minut při 15 0 0 00 g (ultraodstředivka Beckman model L80 s rotorem SW50.1, zkumavky 13x51 mm, 40 000 otáček za minutu. Výsledné usazeniny byly dispergovány přibližně v 5 ml pufru s obsahem 0,1M PO₄/5 mM DTT o pH 7 při použití ultrazvukového zařízení Heat System Ultrasonic, lne., model W185D k rozrušení buněk a výsledná disperze mikrosomů byla rozdělena na malé podíly, uložena do malých zkumavek a skladována při teplotě -70 °C. Koncentrace proteinu v mikrosomech byla stanovena při použití zkoušky na vazbu barviva (BioRad) při použití BSA jako standardu.

2.2 Izolace mikrosomů s krysích jater (4)

Přibližně 6 g zmrazených krysích jater kmene Harlan Sprague Dawley (Accurate Chemical and Scientific Corp.) bylo homogenizováno ve 3 objemech pufru s obsahem 0,1M tris/Ο,ΙΜ KCl/l mM EDTA/0,25M sacharózy o pH 7,4 při použití zařízení Brinkmann Polytron. Výsledná suspenze tkáně byla dále homogenizována ve svrchu popsaném teflonovém homogenizátoru. Výsledný homogenát byl postupně odstředbván 30 minut při 10 000 g, 30 minut při 20 000 g a 15 minut při 30 000 g a výsledný supernatant byl pak odstředbván v ultraodstředivce 80 minut při 105 000 g. Usazenina byla rozrušena ultrazvukem v přibližně 5 ml pufru s obsahem 0,1M PO₄/0,l mM EDTA/5 mM * * 0 0 · 0000 • · ·0 00 0

0 0 0 0 • 0 0 0 0 0 0 • 0 0 0 0 0

...........

MgCl₂ o pH 7,4, jak bylo popsáno svrchu a po rozdělení na podíly byla suspenze uložena při teplotě -70 °C. Koncentrace proteinu byla stanovena jako svrchu.

2.3 Zkouška na účinnost ARAT a LRAT k identifikaci Bl

Byla použita modifikace postupu, popsaného v literatuře (2). Byl připraven pufr, obsahující O,1M PO₄/5 mM dithiothreitolu o pH 7,0 a tento pufr byl uložen při teplotě 4 °C. Pufr byl označen PO₄/DTT. Ve dni provedení zkoušky bylo přidáno na 1 ml pufru 2 mg BSA, čímž byl připraven pracovní pufr s obsahem PO4/DTT/BSA. Pak byl připraven roztok 1 mM retinolu v acetonitrilu, který byl uložen ve tmavých lahvích pod dusíkem při -20 °C. Byly připraveny roztoky 4 mM palmitoyl-CoA v pracovním pufru a 4 mM dilauroylfosfatidylcholinu v ethanolu a byly uloženy pří teplotě -20 °C. Inhibitory byly připraveny v 10 mM zásobním roztoku ve vodě, ethanolu, acetonitrilu nebo DMSO. Roztok k zastavení reakce byl připraven při použiti čistého ethanolu s obsahem 50 μg/ml butylovaného hydroxytoluenu BHT a k extrakcím byl použit roztok hexanu s obsahem 50 gg/ml BHT. Do 2 lahviček byly postupně přidány následující složky: PO4/DTT/BSA pufr do celkového objemu 50 0 μΐ, 5 μΐ donoru acylové skupiny (4mM palmitoyl-CoA a/nebo dilauroylfosfatidylcholin) , 5 μΐ inhibitoru nebo rozpouštědla v případě slepé zkoušky (10 mM zásobního roztoku nebo další ředění) a pak přibližně 15 μg mikrosomálního proteinu RPE (přibližně 15 μΐ podílu mikrosomálního proteinu s obsahem přibližně 1 mg/ml) . Směs byla inkubována 5 minut při teplotě 37 °C k dosažení rovnovážného stavu reakční směsi a pak bylo přidáno 5 ml lmM retinolu. Lahvičky byly uzavřeny zátkou,

···· promíchány magnetickým míchadlem po dobu 5 sekund a inkubovány 30 až 90 minut při teplotě 37 °C. Pak byla reakce zastavena přidáním 0,5 ml ethanolu/BHT. Retinoidy byly extrahovány přidáním 3 ml hexanu/BHT, obsah zkumavek byl několikrát promíchán vždy po dobu několika sekund a pak byly zkumavky odstředěny 5 minut pomalou rychlostí k rychlému rozdělení na vrstvy. Horní hexanová vrstva byla přenesena do čisté lahvičky a vodná vrstva byla znovu extrahována dalším podílem 3 ml hexanu/BHT, jak bylo popsáno svrchu. Hexanové vrstvy byly spojeny a hexan byl odpařen při teplotě 37 °C pod proudem plynného dusíku na vyhřívaném hliníkovém bloku. Vysušený materiál byl uložen při teplotě -20 °C až do provedení HPLC. Množství retinylpalmitátu a retinyllaurátu bylo kvantitativně stanoveno pro účinnost ARAT a LRAT integrací signálu HPLC, jak bude dále popsáno.

Inkubační roztok obsahoval 4 0 μΜ donoru acylové skupiny, 100 μΜ nebo menší množství inhibitoru, 10 μΜ retinolu, přibližně 30 μg/ml mikrosomálního proteinu a přibližně 0,1 M PO₄/pH 7/5mM DTT/2 mg/ml BSA. Všechny stupně po přidání retinolu byly provedeny ve tmě nebo téměř ve tmě.

2.4 Zkouška na účinnost retinoldehydrogenázy k identifikaci B2

Byly připraveny následující zásobní roztoky:

- pufr 50mM KH₂PO₄ o pH 7,4, sterilizační filtrace,

- lOmM all-trans-retinol (Sigma R7632) v DMSO,

- 2 0 0mM nikotinamidadenindinukleotidfosfátu ve formě sodné soli, NADP (Sigma N0505) ve sterilní vodě,

- 4 0mM zkoumané látky v příslušném rozpouštědle, jako je voda, pufr, ethanol, chloroform nebo DMSO,

- ředění 1:10 mikrosomů z krysích jater v 50mM KH₂PO₄ o pH 7,4 (4 pg/pl).

Do skleněné lahvičky se šroubovacím uzávěrem se postupně přidají následující složky: pufr do konečného objemu 400 μΐ, μΐ zředěných mikrosomů (konečné množství 100 μ9), povařené mikrosomy byly použity v kontrolních pokusech a nativní mikrosomy pro provedení zkoušek, μΐ 200mM MADP (konečné množství 2mM) μΐ 40mM roztoku zkoumané látky (konečné množství 100μΜ), μΐ lOmM retinolu (konečné množství 200 μΜ).

Lahvičky byly inkubovány při teplotě 3 7 °C na vodní lázni za protřepávání celkem 45 minut. Pak bylo do každé lahvičky přidáno 500 μΐ ledového ethanolu k ukončení reakce. Retinoidy byly dvakrát etrahovány ledovým hexanem, vždy bylo užito 2,7 ml hexanu. Pak bylo do každé lahvičky přidáno v průběhu první extrakce 5 μΐ retinylacetátu ve formě zásobního roztoku 9 μΜ tak, aby bylo možno sledovat účinnost extrakce pro každý vzorek. Vzorky pak byly 10 sekund míchány, načež byly opatrně odstředěny 5 minut při 1000 otáčkách za minutu a při 5 °C v odstředivce Beckman GS-6R. Horní hexanová vrstva, obsahující retinoidy byla oddělena po každé extrakci od vodné vrstvy. Hexan byl odpařen v proudu dusíku a vysušený materiál byl uložen při teplotě -20 °C až do provedení HPLC.

• ·

9 9 99 9

2.5 Zkouška na účinnost retinalreduktázy k idenditifikaci B3

Všechny zásobní roztoky byly připraveny jako svrchu s následujícími změnami:

10mM all-trans-retinaldehydu (Sigma R2500) v DMSO místo retinolu,

200mM nikotinamidadenindinukleotidfosfátu v redukované formě a ve formě tetrasodné soli NADPH (Sigma N7505) ve sterilní vodě místo NADP

Do skleněné lahvičky se šroubovacím uzávěrem byly postupně uloženy následující složky: pufr do konečného objemu 400 μΐ, μΐ zředěných mikrosomů (konečné množství 100 μg) byly použity povařené mikrosomy pro kontrolní zkoušky a neporušené mikrosomy pro zkoumané látky, μΐ 200mM NADPH (konečné množství 2mM), μΐ 40mM zkoumané látky (konečné množství 100 μΜ) , μΐ lOmM retinaldehydu (konečné množství 75 μΜ).

Inkubace a extrakce byla provedena stejným způsobem j ako svrchu.

2.6 Zkouška na antagonizaci CRABPII k identifikaci B4

2.6.1 Syntéza CRABPII

a) Systém exprese

Gen CRABPII byl klonován v plasmidu pET 29a-c(+) (Novagen). Klonovaný gen byl pod řízením silných transkripčních a translačních signálů bakteriofágu T7.

Zdroj T7 polymerázy byl zajištěn z hostitelských buněk E.coli BLR (DE3) pLysS (Novagen). Tento kmen měl chromosomální kopii T7 polymerázy pod řízením lacUV5, indukovaným přítomností IPTG.

Plasmid byl přenesen do buněk E. coli BLR(DE3)pLysS transformacím podle návodu výrobce (Novagen) .

b) Indukce

Transformované buňky byly pěstovány přes noc a pak byla kultura zředěna v poměru 1:100 prostředím 2xYT s obsahem 50 ng/ml kanamycinu a 25 ng/ml chloramfenicolu. Buňky rostly při teplotě 37 °C za protřepávání až do optické hustoty OD 0,6 až 0,8 při 600 nm. Pak byl přidán IPTG do konečné koncentrace ImM a kultura byla inkubována ještě 2 hodiny. Pak byly buňky odděleny odstředěním 10 minut při 5000 G při teplotě místnosti. Usazenina byla uložena při -20 °C.

2.6.2 Čištění

Materiál byl čištěn způsobem podle publikace Norris a Li, 1997.

a) Rozrušení

Zmrazená usazenina byla rozmražena při teplotě místnosti a uvedena do suspenze v 1 až 2 objemech čerstvě připraveného pufru pro rozrušení buněk, který obsahoval 50 mM tris-HCl, o pH 8, 10 g/100 ml sacharózy, 1 mM EDTA, 0,05 g/100 ml azidu sodíku, 0,5 mM DTT, 10 mM MnCl₂,

2,5mM fenylmethylsulfonylfluoridu, 2,5 mM benzamidinu a •» ·»·· · · ···· • · · · · · • · · · · · • · · » · · · • ·· · · · · · pg/ml DNázy. Rozrušený materiál byl inkubován 30 minut při teplotě místnosti. Rozrušení bylo podporováno působením ultrazvuku 6 x 30 sekund při 70 MPa s prodlevou vždy 30 sekund v ledu. Nerozpustná frakce byla odstraněna odstředěním 1 hodinu při 15 000 otáčkách za minutu při teplotě 4 °C a supernatant byl uložen při teplotě -20 °C.

b) Filtrace na gelu Sephacryl S300

Supernatant ze stupně a) byl nanesen na sloupec s rozměrem 2,5 x 100 cm s náplní Sephacryl S-300 (Pharmacia) při teplotě místnosti. K eluci byl použit pufr s obsahem 20 mM tris-HCl o pH 8 s 0,5 mM DTT a 0,05 % azidu sodíku (pufr A). Rychlost průtoku byla 2 ml/min. Byly odebírány frakce s objemem 2ml a byla sledována absorbance při 280 nM. Frakce z vrcholů byly sledovány pomocí SDS-page na přítomnost CRABPII.

c) Chromatografie na aniontoměniči ml frakcí z gelové filtrace s obsahem CRABPII byly naneseny na sloupec FPLC s obsahem aniontoměniče typu kvarterního aminu (Fast Protein Liquid CHromatography, Pharmacia), typ monoQ. CRABPII byl vymýván při použití gradientu ze 100 % pufru A až do 30 % pufru B (100 % pufr B = pufr A + 250 mM NaCl) v průběhu 20 minut při teplotě místnosti. Každou minutu byla odebrána frakce s objemem 1 ml. Přítomnost CRABPII byla znovu sledována pomocí SDS-page. CRABPII byl uložen při teplotě 4 °C a pak lyofilizován při použití zařízení Micromodulyo 1,5 K (Edwards High Vacuum International). Vysušené vzorky byly uloženy při teplotě místnosti až do použití při sledování vazby.

d) Detekce přítomnosti CRABPII

Exprese a čištění CRABPII bylo vyhodnoceno při použití elektrofořezy na SDS-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE), použit byl 7 až 15% polyakrylamidový gel (Biorad). 10 μΐ vzorku bylo smíseno s 10 μΐ dvojnásobné koncentrace pufru pro nanášení vzorku s obsahem lOOmM tris-HCl o pH 6,8, 4 % SDS, 0,2 % BPB, 20 % glycerolu, lmM DTT a materiál se denaturuje zahříváním 2 minuty na 80 °C. Pak se vzorky nanesou na gel, ponořením v 1 x tri-glycinovém pufru (Biorad) a nechá se probíhat stálý proud 25 mA po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti.

Po barvení modří Coomassie se protein identifikuje podle své molekulové hmotnosti srovnáním s předem zbarveným proteinem Benchmark (Gibco BRL).

K potvrzení přítomnosti CRABPII se užije western blot. Proteiny, oddělené pomocí SDS-PAGE, se přenesou na membránu Immobilon-P (Millipore) při použití kazety Biorad. Přenos se provádí v lx tri-glycinovém pufru (Biorad) s 10 % methanolu. Pak se nechá procházet 3 hodiny elektrický proud 60 mA k umožnění migrace proteinu přes membránu. Pak se membrána blokuje 5% sušeným mlékem v lx TBS celkem 1 hodinu při teplotě místnosti a nanesou se primární protilátky proti CRABPII (ředění 1:1000 myší antiklonální protilátky 5-CRA-B3) v tomtéž pufru přes noc při teplotě 4 °C. Následujícího dne se membrána 3x5 minut promývá PBS a pak se inkubuje s ředěním 1:2000 sekundární protilátky, jde o protilátku proti myším tkáním, konjugovanou s peroxidázou (ECLTM, Amersham), celkem 1 hodinu při tepélotě místnosti. Pak se membrána

3x5 minut promývá 1 x PBS a množství proteinu se stanoví pomocí ECL zkušebního balíčku podle návodu výrobce (Amersham).

Koncentrace čištěného CRABPII se stanoví při použití zkušebního balíčku BSA (Pierce).

2.6.3 Zkouška na vazbu radioaktivní látky

0 pmol CRABPII se inkubuje ve 20 mM tris-HCl pufru o pH 7,4 s 15 pmol radioaktivní all-trans-retinové kyseliny (NEN), v celkovém objemu 70 μΐ. Pro kompetitivní zkoušky je možno ke směsi přidat další ligand v přebytku 6670:1, 670:1 nebo 70:1). Reakce probíhá ve tmě 1 hodinu při teplotě místnosti. Aby bylo možno oddělit nenavázanou all-trans-retinovou kyselinu od vázané kyseliny byl použit minichromatografický sloupec (Biorad) oddělující látky od molekulové hmotnosti 6 000. Pufr pro skladování byl odstraněn podle instrukce výrobce pomocí balíčku Microplex (Pharmacia). Vzorky byly naneseny na sloupec a oddělení probíhalo na základě zemské přitažlivosti celkem 30 minut. Retinová kyselina, vázaná na CRABPII byla obsažena ve filtrátu, kdežto volná kyselina zůstala ve sloupci. Radioaktivita filtrátu byla měřena pomocí scintilačního počítače.

2.7 Zkouška na oxidaci retinové kyseliny, závislou na NADPH k identifikaci B5

Dále uvedený postup je modifikací postupu, popsaného v literatuře (4). Byl připraven pufr, obsahující 0,1M PO₄/0,lmM EDTA/5mM MgCl₂ o pH 7,4 a byl uložen při teplotě 4 °C. Při provádění zkoušky byl připraven roztok ♦ ♦ · · · · ·· ««·· • · · » ·

60mM NADPH v tomto pufru. Dále byl připraven zásobní roztok inhibitoru, roztok k zastavení reakce a roztok hexanu/BHT stejně jako svrchu. Pracovní roztok lmM retinové kyseliny byl připraven zředěním zásobního 15mM roztoku v DMSO ethanolem.

Do lahvičky byly uloženy jednotlivé složky v následujícím pořadí: pufr k provedení zkoušek do konečného objemu 500 μΐ, 2 0 μΐ 60mM NADPH, 5 μΐ inhibitoru nebo rozpouštědla jako slepé zkoušky a 2 mg proteinu z mikrosomů krysích jater.

Směs byla inkubována 5 minut při teplotě 37 °C a pak bylo přidáno 5 μΐ pracovního lmM roztoku kyseliny retinové. Inkubace pokračovala 60 minut při 37 °C, lahvičky nebyly uzavřeny vzhledem k tomu, že oxidace vyžadovala přítomnost molekulového kyslíku kromě NADPH. Reakce byla zastavena okyseleným ethanolem/ΒΗΤ a extrakce byla prováděna hexanem/BHT stejně jako svrchu. Kvantitativní stanovení polárních metabolitů retinové kyseliny, pravděpodobně 4-oxoretinové kyseliny bylo prováděno integrací signálu HPLC stejně jako svrchu.

Všechny stupně po přidání retinové kyseliny byly provedeny ve tmě nebo téměř ve tmě. Konečný roztok pro inkubaci obsahoval 2,4 mM NADPH, 100 μΜ nebo menší množství inhibitoru, 10 μΜ retinové kyseliny, přibližně 4 mg/ml proteinu z mikrosomů krysích jater a přibližně 0,lM PO₄/0,lmM EDTA/5mM MgCl₂.

Analýza HPLC jednotlivých retinoidů • 9

99

9 9

9 9 9

9 9

999 99

9999

9 9

9999

9 9

9 9 9 • 9 99

Vzorky pro kvantitativní stanovení retinoidů pomocí HPLC byly připraveny tak, že materiál z každé lahvičky byl rozpuštěn ve 100 μΐ methanolu. Roztok byl přenesen do konické zkumavky s objemem 150 μΐ, uložené do lahvičky s objemem 1 ml, uzavřené uzávěrem a uložen uvnitř automatického analyzátoru vzorků Waters 715. Okamžitě byly vstříknuty podíly po 60 μΐ, které byly analyzovány na obsah retinoidů. Chromatografické, zařízení obsahovalo čerpadlo Waters 600, detektor Waters 996 s fotodiodou a fluorescenční detektor Waters 474. Pro analýzu retinoidů byly použity vždy 2 zkoušky. V případě zkoušky na ARAT a LRAT bylo oddělení retinolu a jeho esterů uskutečněno pomocí analytického sloupce Waters 3,9x300 mm C18 Novapak v reverzní fázi a sloupce Waters Sentry NovaPak C18 při použití směsi methanolu/THF v objemovém poměru 80:20 jako isokratické mobilní fáze při rychlosti průtoku 1 ml/min, analýza trvá 10 minut. Absorbance eluátu se sleduje při 325 nm a fluorescence při 325ex/480em.

Kratší analytický sloupec Waters 3,9x150 mm C18 Novapak v reversní fázi a sloupec Waters Sentry NovaPak C18 byly užity k oddělení retinové kyseliny a alkoholů od retinolu a oxidačních produktů retinové kyseliny při použití gradientu, popsaného v publikaci Barua (5). Tento systém spočíval v 20 minut probíhajícím lineárním gradientu od objemového poměru 68:32 methanolu a vody s obsahem 10 mM octanu amonného až do objemového poměru 4:1 methanolu a dichlormethanu, konečná koncentrace gradientu byla ponechána ještě 5 minut při rychlosti průtoku 1 ml/min. Eluát byl sledován při 300 až 400 nM.

Tímto způsobem je možno od sebe oddělit retinoidy ve formě kyselin, alkoholů, aldehydů a/nebo esterů, přičemž ·· ·♦·· ·· · ·· · průběh zkoušky je poměrně rychlý. Identifikace jednotlivých retinoidů pomocí HPLC byla založena na přesné znalosti doby retence, takže vrcholy pro neznámé látky byly srovnávány s autentickými standardy, přičemž bylo použito UV spektrum v rozmezí 300 až 400 nm.

Literární údaje ( l) J. C. Saari & D. L. Bredberg, CoA and Non-CoA Dependent Retinol Esterification in Retinal Pigment Epithelium, J. Bili. Chem. 263, 8084-8090 (1988).

ζ2) J. C. Saari & D. L. Bredberg, ARAT & LRAT Activities of Bovine Retinal Pigment Epithelial Microsomes, Methods Enzymol. 190, 156-163 (1990) .

(3) J. L. Napoli & K. R. Race, The Biosynthesis of Retinoic Acid from Retinol by Rat Tissues in vitro, Archives Biochem. Biophys. 255, 95-101 (1987).

^4) R. Martini & M. Murray, Participation of P450 3A Enzymes in Rat Hepatic Microsomal Retinoic Acid 4Hydroxylation, Archives Biochem. Biophys. 303, 57-66 (1993).

(ýQ A. B. Barua, Analysis of Water-Soluble Compounds: Glucuronides, Methods Enzymol. 189, 136-145 (1990).

Zesilovače, vhodné pro použití v prostředku podle vynálezu zahrnují například látky, uvedené v následujících tabulkách B1 až B5. V tabulkách je uvedeno chemické jméno sloučeniny a výsledky příslušných zkoušek pro jednotlivé typy zesilovačů, tak jak byly podrobně uvedeny svrchu.

CN ·· · • · ·· • « • · • ♦ ·♦·· ··· ·· ··· · • · · • · · • · · ·· ·· ·· ♦ · • · • · • · ··

Inhibitory ARAT/LRAT (Bl)

I £
β =L		C0
22 Φ A		rd						03		CT\
α u <; o		+1						+1		-Η
Η ·β « O	ιη	ο	LD			ιη	sF	C0
o\° 23 A h	rd	12)	03			<0	CO	ιη		C0
1 H £		Ο
22 Φ A i		rd
β U <		+1
•Η ·β K O		ο
o\° 22 A Ή	Ο	rd
1 £
•β =L		ϊ—1
22 Φ A		rd						νο
β u rtj o		+1						+1		-Η
•β ·β K O	Μ»	03	00		ιη	C0	co	rd	Ο	C0
o\° γΏ rd	C0	V)	οι		04	Ό	rd		οι	CN
I -H £		03
22 Φ A =t		rd
β 0 <3		+1
•β -β (2 o	LT)	o
ο\θ < Ή	rd	rd
	ιη	<43		LT)		θ'				ιη
	ο	o		ο		ο				Ο
£ Φ 0	1 ω	1 W		ω		Μ				ω
24 S	LD	co		LD						σ\
r-4 U	θ'	r		03		C0				ο>
O Φ H				*		-				*·
Au —	C0	KO		ΓΟ		Ο)				ο
M
(1) tó
υ \
•Η K
A £ O
•η Φ pi
A 24 1
Pí r—l '
•β Φ O			ο·				rd
o\o O H			rd				i—l
					β
					•Η
					β
					44			44
					Φ	1	___s	'β		β
				ω	Α	ι—1	A	Φ		•Η
		β	rN	£	1—1		•rd	ι—1		β
		•rd	β		Ϊ>1	Α	£	0		0
		0)	rd	Ό	a	44	β	1		σ
		0	ι—J	Φ	0	Φ	říj 1—1	<c		β
		cn	1 Φ	1—1	β		H 0	ο		•rd
		β	ca. ra	0	a	X β	£ β	a		<44
β		•rd	ι >ι		0	0 ·β	1 β	1	Α	β
	β	Μ-d	m 24	'(β	π	Ρί ι—1	A A	ι—1	•Η	ι—1
Pí	Η	ω	rd	>	•Η	Τ3 0	•β 44	0	ε	>1
φ	4-)	»—1	Ο i4	0	£	ίβ Ν	£ Φ	β	β	0
>U	Φ	!>Ί	0	β	β	Α β	β 0	φ	β	β
β	υ	4-1	Ρ β	Ή	0	0 Ό	0 β	U	β	β
0	0	Φ	•η τ5	φ	24	24 -β	24 0		><	X
	β	u	£ >.	Ή	0	0 £	0 £	γΗ	φ	φ
ω	U	β	β Α	β	24	24 ·β	24 —	σ	α	22
			Α 'β	Α 'β	Α 'β	Α 'β	Α 'β	Α 'β	Α 'β	22
		β	υ β	υ β	υ β	υ β	U β	Ο β	U β	U
		1—1	Ά ·η	'Á-β	Ά -β	Ά ·β	'ίβ -β	')β ·β	'ίβ -β	Ά
		τ5	Ρί τη	£ ·ΓΊ	PÍ *ΓΊ	PJ ·ΓΊ	PÍ Ί™1	β Π	β ·π	β
	Ά	β Φ	44	44	44	44	44	44	44	44
	Η	>u	β β	β β	β β	β β	β β	β β	β β	β
	0	>ΐ'β	β β	β β	β β	β β	β β	β β	β β	β
β	β	β £	£ β γΗ	£ β Η	£ β Γβ	£ β Γβ	£ β rH	£ β zj	£ β γΗ	ε
β	φ	'φ ·Η Μ	•η χ)	•β Τ)	β Ό	β η	-β Α	•β Α	•β Α
♦Η	44	β γ-4	ι—1 (Ď	rd φ	rH Q)	ι—1 Φ	r-d Φ	r-d Φ	ίβ γΗ Φ
a	0	44 φ \β	τ) φ >υ	Ό φ >υ	Ό φ >υ	Α Φ >Ο	Α φ >U	Α Φ >υ	Α φ >υ	Ό
β	β	β β β	•η ω \β	•β β \β	•β β \β	β β \β	•β β \β	•β β \β	-β β \β	•Η
24	β	Φ κΝ ·Η	£ >ι £	£ S £	£ Α £	£ >ι £	£ ίβ £	£ ίβ £	£ ίβ £	ε
Μ	24	£24·π	β 24 Μ	β 24 β	β 24 β	β 24 β	β 24 β	β 24 β	β 24 β	β

·· *« ··♦« ·· ···· • · · · · · • · · · · · * · · ·»«· · • · · · · · · · ·· »· ·· ··

	LD m	O co		Ο	51±15	LD ω	75±4	43±21	11±11
					σι	C0
					+1	+1
					Η	ο
					γ—1	CN
							C0	LH	ν
					ΓΠ		ι—1	γΗ	γΗ
					+1		+1	+1	+1
	in	in	o	CN	C0	LD	σι	’Ο»	γΗ
	cn	CN	CN	Η	V	C0	Ό	Ό	Μ¹	sf
					ΓΠ
					+1
					CN
					τ—1	γΗ
	LO					ι_η				LC1
	O					Ο				Ο
	ω					ώ				κ
	σ\					γΗ				ο
	CN					10				C0
						«ο				*»
	n					γΗ				CN
					σ>
					ιη
									β
							1		•Η
	X	X					1-1		ω
	1 -H	1 ·Η	β				£β		0
	CN 6	CN £	•rl		X		a		X
	1 (ti	1 (ti	03		říj Ή		0		β
	rH 1	i—1 1	0		W £	W	β χ		β
	>1 CN	>Ί Ό	14		Q β	S	Xj ·β		03	β
	X H	X H	β		1 rd	1	ο ε			Ή
	4-) U	X U	β		X 0	X	X β	X	1-1	β
	β i	01 i	03	β	•Η β	Η	•Η ι—1	•Η	Ϊ>Ί	X
			ι—1	•Η	ε β	£	ε >ι	ε	0	β
		Μ «	ί>Ί	β	β X	β	β χ	β	X	X
	0 0	0 0	0	υ	ρΗ 4-)	i—ι	ι—1 4-)	β	03	1-1
	β β	β β	β	0	0 β	0	0 β	•Η	•Η
	χ x	X X)	β	X	β ·β	β	β ε	ι—1	β	β
	Í>1	£β kŇ	β	•Η	•Η X	•Η	•Η -Η	β		1—1
	X X	X! X!	1—ί	ι—1	(—ί	1-ί	Γβ X	ε	ε	0
'β	X '(ti	X '(ti	X! 'β	X 'β	X 'β	X 'β	X 'β	X 'β		X 'β
β	U β	u β	υ β	0 β	υ β	υ β	β β	υ β	υ β	υ β
•Η	'£>ι -Η	'S-H	·η	'>ί ·Η	'£>1 ·Η	·Η	'κΝ Ή	'ί>Ί ·Η	'£β ·β	Ή
m	£ ·Γ~)	C -n	£} ·\|—>	ΰ ·Γ-1	β το	tí ΤΟ	C το	ΰ το	£ ·ΓΊ	το
	4-)	X	X	X	X	X	X	X	X	X
β	ω (ΰ	03 (ti	03 β	03 β	03 β	ω β	03 β	03 β	03 β	Μ β
(ti	(ti (ti	β (ti	β β	β β	β β	β β	β β	β β	β β	β
i—i	£ β H	£ β r-l	£ β Η	£ βπ	ε βπ	ε βπ	£ β ι—ι	£ β γΗ	£ β Γβ	£ β
•H X	•η X	•Η X)	-β X	-Η X	•β X	•β χ	-β X	-β X	-β χ	-Η
i—1 (D	í>j i—1 (D	(>i H <D	ί>Ί γ—ι i)	κ*Ί 1—1 G)	(>Ί γΗ (D	Ϊ>ί γ—1 (L)	£>ί r—1 <ϋ	£>ί ι—ί G)	ί>1 1—1 Q)	S γΗ
οι >υ	X CD >U	X 01 >u	χ β >υ	χ αι >υ	X οι >υ	χ β >υ	χ β >υ	X β >υ	X β >03	X β
οι \(ΰ	•β 01 '(ti	β 03 '(ti	•Η 03 'β	η m 'β	β 03 'β	•β 03 'β	β ω 'β	-β 03 'β	•β 03 'β	•β 03
£	£ S £	£ ^ £	ε >ι ε	£ S £	£ >ι £	£ >ι £	ε s ε	£ >·. £	ε >. ε	£
ϋ w	β X oi	β 14 03	β 14 Μ	β X Μ	β X 03	β X 03	β 14 03	β X 03	β X 03	β X

9 9 • 9 99*9 99 99·· • 9 9*9 9

9 9 9 9 9

9 9 9999 9

99 9 9 99 9

99 99 99

33

10

LO +1 co sf

cn +1 CM cd

rd

36±7 |

| 98 + 1 1

|49+30 1

ΔΔ

L25

CN CD

LZ5

CD r

L95

co rd

CD ςρ

'φ

L38

1«

LO Η

CN CD

O

rd

co

+1

!—1

rd

C'

CN

CD

v

rd

Lf)

rd

co

IX)

CN

LO

cn

CN

CD

CN

rd

CN

+1

ΓΟ

Ο

^P

cn

CN

cn

Lf)

1>

vx>

<d

o

C

cn

rd

CN

rd

C0

Ο

(Ν

rd

Lf)

00

cn

CN

co

sd

LD

CN

co

I

Γ

co

X

Lf)

rd

CN

00

Η

C0

T

rd

CN

+1

ΓΩ

CN

LO

Lf)

cn

CO

LO

^p

sn

r~1

LO

<d

CN

Lf)

<o

<d

o

O

W

w

r

Lf)

o

cn

CN

«,

«»

».

cn

o

rd

CM

Ό

β

£

0

β

a

β

υ

ι—1

TJ

0

β

0

>.

tí

β

rd

β

Ή

i—1

υ

•Η

ω

X

0

a

0

β

0

I

X

0

•rd

β

2

0

•rd

0

•rd

Φ

0

u

td

'(ti

X

rd

Ο

(ti

1

β

1

0

ι—1

β

u

ω

X

β

0

>1

β

τ)

a

td

m

a

s

•rd

CO

β

td

rd

(ti

X

Ο

φ

0

•Η

>ί

rd

CN

•rd

Ή

td

0

X

X,

td

i—I

0

£

td

β

i—l

X

•Η

m

U

£

X

1

β

rd

£

β

X)

β

£

0

β

(ti

1

X

td

φ

ι—1

0

co

td

1—1

X

φ

td

0

Φ

td

β

φ

TJ

0

(ti

i—1

£

ι—I

td

X

ί>1

X!

X

Cn

1

TJ

rd

£

X)

TJ

td

o

1

β

co

1

X

£

•rd

β

u

a

rd

1

£

co

β

TJ

1—1

X

cd

β

0Ί

td

£

td

0)

Φ

•rd

>N

rd

td

(ti

X!

cd

X

!>i

u

£

X

υ

Ti

rd

Φ

β

rd

4-4

X

44

4-1

x>

td

£

1—1

X

β

£

0

υ

(ti

X

td

i—1

X

i—1

Φ

β

(ti

Φ

•rd

X

Φ

cd

co

m

co

a

co

X

O

a

td

X

XI

TJ

Φ

X

σι

•Η

Ή

-rd

X \rd

X Μΰ

X 'td

U β

ο β

u β

o β

^χ!>1 Ή

·Η

'^*ι Ή

^λί>Ί Ή

£ ·ΓΊ

řJ *m

£ ή

β *r~i

><

Í>í

>1

Ϊ>Ί

0*1

0Ί

>1

Í>1

>1

rd

X

!>ί

14

X

co η}

co td

w td

co td

Ti

X

X)

X

(ti

(0 td

td td

•H

'td

'<d

'td

,—1

£ βΗ

£ β X

£ β x

0

i—1

rd

I—i

i—1

i—!

i—1

i—I

rd

ι—1

1—i

X

i—I

TJ

•Η TJ

X Tj

X TJ

a

Φ

0Ί 1—1 φ

0Ί rd φ

£d rd Φ

0H Φ

td

'Φ

'φ

'Φ

>υ

TJ φ >ϋ

TJ 0) >u

TJ Φ >U

T) Φ >u

>

a

c

β

'(ti

•η co \<c

-η co \<d

η co \td

X CO 'Cd

td

a

β

£

£ >ι £

£ >.£

£ S £

£ >1 £

i—1

0

m

td X co

td ΛΙ ra

td X co

X

t>

>

ϊ>

>

ί>

00 • 0	0 0 0	0	00 0	0000 0	00	0 00 0 0
•	0
0	0	0 0	0	0	0 0	0	0
0 0000	0 000	0	0 0 0	0 0 0 0	0 00	0	0 0 0 ·

71

22

33 |

22

28 1

o

53 + 19

77±13

o

37

17+17

10±7

+1 1~~í

o

<0

23 1

25

'Φ Γ0

50 |

22

27 I

22

20

30

53±18

32 _1

81±6 1

28

20

12

50+2

23±18

13

38±12

CN

1,27Ε-04

<0 o ! ω <0 ’φ rH

9,35E-05

7,83E-03

1 22

35

lyral |

santalon 1

i—1 0 g (C 4-) tí (0 ra

timberol

tonalid

traseolid 1

kokotrimethylamoniumchlorid

kyselina urosolová

citral

citronellol

farněsol

geraniol

geranylgeraniol

linalool

nonadienal

pseudoionon

dioktylfosfátidylethanolamin

dímethylimidazolidinon

imidazolidinylmočovina

1 vonné látky 1

vonné látky

různé

monocyklické vonné látky

monocykli cké vonné látky

monocyklické vonné látky

monocykli cké vonné látky

monocyklické vonné látky

fosfolipid

I močovina

močovina

«· • · ···· • ♦· ♦ · · · • · • « « · * · ···· • · · » · ♦ • » · • · » · e« ··

CO

CN

CQ >1

N

Cí <D o

i <u

O d

•H

4J

0) >1

O

U '(ti f>

•H •U c

% zvýšení dehydrogenázy	ΓΖ_21	26 1
(ti	lcholin j	lin
d		Φ
-H	Ό
d	•1—1	£
ω	44	0
>cj	(ti	tn
d	44	d
0	CO	•H
i—1	0	44
w	44	CQ
(ϋ	ipid	ipid
d	1—1	1—1
•H	0	0
	4-1	44
d	CQ	CQ
34	0	0
ω		IL

Í>1

N '(ti

4J

Ό (D

Ό £

Φ

Ό (ti d

•H

Φ

Í4

O

JJ

Ή h

r4

Λ ri

% inhibice retinalreduktázy	CO	1 20 1	1 49 \|	CM +1 CM CO	[ 54 + 16 \|	1 26 \|	\| 22 + 8 \|	\| 26+2 1	38±1	1_37_j
TG celkem (IC₅₀) _	9,70E-03 \|			1 l,63E-04	( 1,34Ε-04 1	\| l,72E-05 i	co o 1 W co CM CO	\| 3,61E-07	[ 8,64E-06
Sloučenina	váni1lin 1	kyselina arachidová 1	kyselina arachidonová \|	kyselina linolová 1	kyselina linolenová \|	kyselina myristová	amsacrin	karbenoxolon J	kyselina glycyrrhetinová	fosfatidylethanolamin
Skupina	aldehyd	mastná kyselina	mastná kyselina	mastná kyselina	mastná kyselina	mastná kyselina	různé	různé	různé	fosfolipid

• » 44 • · • · • 4

4444 ·<· »4 4444 • 4 4

4 4

4 4 4

44 <44· «4 4

4 4

4 4 4

44

• · · · · · • · · • · · • · ··· ·

Inhibitory oxidace retinové kyseliny (B5)

%inhibice retinové kyseliny (100 μΜ)

001

1 92 1

⁸⁵ 1

I 001 I

co

1 ⁸⁶ 1

80

Z⁴

%inhibice retinové kyseliny (10 μΜ)

| 68

80

⁷⁶ 1

co co

sť CO

1 ⁷⁴ 1

54

1 40

TG celkem (IC₅₀)

<0 0 1 W 'Φ

1 l,85E-07

0 1 H CO CN

4,67E-07

3,02E-05

| 6,29E-05

| 8,59E-07

3,64E-04

Sloučenina

bifonazol 1

climbazol |

clotrimazol |

econazol |

ketoconazol

miconazol

1aurylhydroxyethylimidazolin

01ey1hydroxyethy1imidaz01in

kvercetin

kumarin

7H-benzimidazol(2,1-a)benz[de]-isochinolin-7-on

| hydroxychinolin (Carbostyril)

metyrapon (2-methyl-1,2-di-3-pyridyl-1-propan)

Skupina

imidazol

amidy mastných kyselin a jiná smáčedla

flavanoidy

kumarin

chinolin

• · ·

Účinky kombinace zesilovačů

Aby bylo možno prokázat účinky kombinace zesilovačů, bylo nutno navrhnout zkoušku, která by vyhodnotila účinky každé ze svrchu uvedených skupin. Zkouška na jediný enzym není pro tento účel vhodná, protože by byla specifická pouze pro jednu skupinu zesilovačů. Bylo zapotřebí použít zkoušku, která odráží koncentraci retinoidů v keratinocytech, tak aby bylo možno současně zjistit účinky kombinace zesilovačů. K tomuto účelu byla použita zkouška na transglutaminázu (TGázu). Jde o enzym, závislý na vápníku, který katalýzuje tvorbu kovalentních zesilujících vazeb v proteinech. Několik enzymů tohoto typu je vázáno na membránu v keratinocytech a jejich přítomnost je důležitá pro zrání epidermálních buněk. Enzym je inhibován retinovou kyselinou. Čím vyšší je koncentrace retinové kyseliny, tím vyšší je inhibice exprese uvedených enzymů. To znamená, že TGáza je dobrým označením pro diferenciaci keratinocytů i pro stanovení účinku retinoidů na keratinocyty.

Transglutamináza jako značení pro diferenciaci kožních buněk

V průběhu konečné diferenciace buněk v epidermis se vytváří na vnitřním povrchu této vrstvy 15 nm silná vrstva proteinu, označovaná jako obalová vrstva CE.

Vrstva CE se skládá z celé řady odlišných proteinů, které jsou vzájemně zesítěny tvorbou ΝΣ-(γ-glutamyl) lysin isodipeptidových vazeb, tvorba je katalyzována působením alespoň dvou od sebe odlišných transglutamináz, k jejichž expresi dochází v epidermis. TGáza I je exprimována ve velkém množství v diferenciovaných vrstvách epidermis, ····

·· ·· zvláště v granulární vrstvě, avšak před diferenciací v bazální epidermis není přítomna. To znamená, že uvedený enzym je cenným značením diferenciace keratinocytů v epidermis, přičemž vysoká koncentrace enzymu znamená vyšší diferenciaci. Ke stanovení stavu diferenciace keratinocytů v kultuře v následujících příkladech byla použita zkouška ELISA při použití protilátek proti TGáze.

Keratinocyty byly naočkovány na plotny s 96 vyhloubeními při hustotě 4000 až 5000 buněk v jednom vyhloubení ve 200 μΐ živného prostředí. Po inkubaci 2 nebo 3 dny nebo až do alespoň 50% spojité vrstvy buněk bylo živné prostředí zaměněno za prostředí, obsahující zkoumané látky, každá zkouška byla provedena 5krát. Buňky byly pěstovány dalších 96 hodin, pak bylo prostředí odstraněno a plotny byly uloženy při teplotě -70 °C. Pak byly plotny vyjmuty z mrazícího zařízení a buňky byly 2krát promyty vždy 200 μΐ lkrát PBS. Pak byly buňky inkubovány 1 hodinu při teplotě místnosti v promývacím pufru (TBS/5 % BSA, sérového albuminu skotu). Pak byla přidána primární protilátka proti TGáze: bylo použito 50 μΐ monoklonální protilátky I Ab B.C. v ředění 1:2000 v promývacím pufru. Primární protilátka byla inkubována 2 hodiny při teplotě 37 °C a pak byla odstraněna 6násobným opláchnutím promývacím pufrem. Pak byly buňky inkubovány s 50 μΐ sekundární protilátky (fragment Fab, protilátka IgG proti myším tkáním, konjugovaná s peroxidázou, Amersham) v ředění 1:4000 v promývacím pufru, materiál byl inkubován 2 hodiny při teplotě 37 °C a pak byla protilátka vymyta trojím promytím promývacím pufrem. Pak byly buňky ještě 3krát promyty PBS. Pro kolorimetrické ·· ···· stanovení byly buňky ínkubovány se 100 μΐ roztoku substrátu (4 mg o-fenylendiaminu a 3,3 μΐ 30% H₂O₂ v 10 ml 0,1 M citrátového pufru o pH 5,0) po dobu přesně 5 minut při teplotě místnosti ve tmě pod hliníkovou fólií. Reakce byla zastavena přidáním 50 μΐ 4N roztoku kyseliny sírové. Absorbance vzorků byla odečítána při 492 nm spektrofotometrem pro plotny s 96 vyhloubeními.

Z 5 prováděných zkoušek byly u 4 zkoušek použity obě protilátky, pátá zkouška sloužila jako kontrolní vzorek. Koncentrace enzymu byly stanoveny pro každé opakování a vyjádřeny v procentech kontrolního vzorku.

Provedení zkoušky

Před provedením pokusu byly určeny reakční složky pro tento pokus.

A. Reakční složky

Buňky: lidské keratinocyty (P2 v lahvích T75, P3 na plotnách s 96 vyhloubeními

Primární protilátka: TGm-specifická monoklonální Ab B.C1

Sekundární Ab: Ig F(ab)₂ proti myším tkáním, značená peroxidázou

Roztok substrátu: na 10 ml pufru s fosfátem a citrátem se užije 4,0 mg o-fenylendiaminu

3,3 μΐ 3 0% H₂O₂ j ednotlivé

Pokožka lidského novorozence

Amersham (č. kat. NA9310)

Sigma P-7288 Sigma H-1909

Clonetic (č. kat. 3111) • · « · · · • · · · · ♦ · tt ·· ♦·

B. Prostředí/pufry

Růstové prostředí pro keratinocyty (KGM)

Fyziologický roztok chloridu sodného s fosfátovým pufrem, Dulbeccovo prostředí bez Ca/MgCl₂

Life Technology (č. kat. 14200-075)

Fyziologický roztok chloridu sodného s tris-pufrem

Blokovací pufr mléka) lxTBS + 5 % sušeného

BioRad (č.k.170-6404)

Promývací pufr (1 % sušeného mléka v TBS + 0,05 % Tween 20)

Sigma (č

k.P-7949)

Fosfátový a citrátový pufr, směs 1:1 0,2M hydrogenfosforečnanu sodného a 0,1M kyseliny citrónové 4N H₂SO₄

Sigma

č.k.S-9763)

č.k.C-1909)

C. Pomůcky pro pěstování kultury Polypropylenová mikrotitrační plotna s 96 vyhloubeními Polypropylenová plotna se dnem tvaru U s 96 vyhloubeními T75- uzávěr pro vypouštění plynů

Costar (č

k.3595)

Costar

Costar (č.k.3794) (č.k.3376)

D. Zařízení

Odečítací zařízení biotek Model EL 340 pro mikrotitrační plotny Bio-tek Instruments lne.

Zařízení Multiprobe II Packard • · · · • ·· ···· ·· ···· • · * · · · * • « · · ···· · • · · · « ···· • · · ·β · * ·· ··

Ε. Pěstování buněčné kultury

Naočkování keratinocytů na plotny s 96 vyhloubeními

1. Připraví se suspenze keratinocytů při koncentraci 3000 buněk/200 μΐ/vyhloubení v prostředí KGM, bylo použito 3xl0⁵ buněk/12 ml živného prostředí pro každou mikrotitrační plotnu.

2. 200 μΐ suspenze keratinocytů se přenese pouze do každého ze 60 vnitřních vyhloubení.

3. 200 μΐ prostředí KGM se přenese pipetou do vnějších vyhloubení k udržení tepelné rovnováhy.

4. Každá plotna se inkubuje při teplotě 37 °C při koncentraci 5 % oxidu uhličitého v ovzduší 3 dny nebo tak dlouho, až buňky vytvoří 50% spojitou vrstvu.

Působení vzorků na keratinocyty

5. Zásobní roztoky zkoumaných látek se připraví v DMSO.

6. Vzorky se zředí na požadovanou koncentraci tak, aby konečná koncentrace DMSO byla 0,1 %.

7. 20 μΐ vzorku se přenese do vyhloubení a přidá se 180 μΐ prostředí KGM, takže konečný objem zkoušky je 200 μΐ.

8. Plotny se inkubuji při teplotě 37 °C a koncentraci oxidu uhličitého v ovzduší 5 % celkem 72 hodin.

9. Z každého vyhloubení se úplně odstraní prostředí.

10. Prostředí se vypláchnou 2x200 μΐ lxPBS.

11. Materiál se zmrazí na alespoň 1,5 hodiny na teplotu -70 °C.

• · ···· ·· ···· • · · · · · « · · · · · φ φ • · · φ · · φ *

F. Zkouška na transglutaminázu

1. Blokování :

Plotny se inkubuji při teplotě místnosti s blokovacím pufrem v množství 200 μΐ/vyhloubení celkem 1 hodinu.

2. Primární protilátka:

Blokovací pufr se odsaje. Materiál se inkubuje s TGn-specifickou monoklonální protilátkou B.C1 v množství 100 μΐ/vyhloubení v ředění 1:2000 v promývacím pufru při teplotě 37 °C alespoň 2 hodiny. Primární protilátka se nepřidává do kontrolních vyhloubení.

3. Vyhloubení se 6 promyji promývacím pufrem.

4. Sekundární protilátka:

Buňky se inkubuj i v množství 10 0 μΐ/vyhloubení s fragmentem IgF(ab)₂ protilátky proti myším tkáním, značené peroxidázou v ředění 1:4000 v promývacím pufru při teplotě 37 °C celkem 2 hodiny.

5. Vyhloubení se 3krát propláchnou vždy 200 μΐ promývacího pufru, který se po každé odsaje.

6. Vyhloubení se 3krát propláchnou PBS w/o Tween.

7. Buňky se inkubuj i v množství 100 μΐ/vyhloubení s roztokem substrátu při teplotě místnosti po dobu přesně 5 minut.

8. Reakce se zastaví tak, že se do každého vyhloubení přidá 50 μΐ 4N roztoku kyseliny sírové.

9. Absorbance se odečte při 492 nm zařízením Bio-tek pro odečítání ploten.

A A A · » AAAA AA • · · A · · A ♦ ·

A AAAA AAAA A

A A AAAA AAAA

I. Optimalizační zkoušky

A. Průběh produkce transglutaminázy

Byly provedeny pokusy pro stanovení optimální doby inkubace pro produkci transglutaminázy v keratinocytech, pěstovaných na plotnách s 96 vyhloubeními, užije se 4000 buněk/vyhloubení. Pokus se provádí tak, že se mění různé parametry a analyzuje se závislost odpovědi na dávce při použití retinové kyseliny a retinolu, byla provedena i inkubace v přítomnosti 1,2 mM CaCl₂. Přestože produkce transglutaminázy v kontrolních buňkách s koncentrací 0,1 % DMSO nebyla změněna, po přidání retinové kyseliny a retinolu došlo v závislosti na dávce k inhibici produkce transglutaminázy v průběhu inkubace, trvající 5 dnů.

Nejvyjádřenější účinek retinoidů byl pozorován ve dnech 2 a 3. Maximální inhibice byla pozorována ve dni 2, přičemž produkce transglutaminázy byla inhibována na 85 a na 55 % v přítomnosti nejvyšší koncentrace 1 μΜ retinové kyseliny artinolu. Tentýž pokus byl také proveden s odlišnou hustotou buněk 3000 a 5000 buněk/vyhloubení, byly dosaženy srovnatelné výsledky.

B. Citlivost na DMSO

Různé koncentrace DMSO v rozmezí 0 až 2 % byly podrobeny zkouškám na vliv na produkci transglutaminázy v keratinocytech. Nad koncentrací 0,5 % DMSO došlo k podstatné inhibici účinnosti. Z tohoto důvody byla zvolena konečná koncentrace 0,1 % k provádění zkoušek.

C. Křivky závislosti účinku na dávce pro retinovou kyselinu a retinol • · · · • « · ·

Podle výsledků svrchu uvedených pokusů byl zvolen den 3 jako optimální doba stanovení a koncentrace 0,1 % DMSO jako koncentrace pro provádění zkoušek. Další pokus závislosti účinku na dávce byl proveden s retinovou kyselinou a retinolem v přítomnosti 0,1 % DMSO ve dni 3. Byla získána křivka pro závislost Ínhibice enzymu na koncentraci kyseliny retinové a retinolu. Při koncentraci 10-7M retinolu došlo k lineárnímu průběhu závislosti ínhibice na koncentrací. Z tohoto důvodu byla tato koncentrace retinolu zvolená pro vyhodnocení kombinace zesilovačů.

D. Konečné podmínky, použité pro pokusy se zesilovači nebo s jejich kombinacemi Dny inkubace keratinocytů

s retinolem a zesilovači	3 dny
Konečná koncentrace DMSO	nižší než 0,1 %
Koncentrace retinolu	10-7M (0,1 μΜ)
Koncentrace zesilovače	10 mM až 0,1 nM
Za použití svrchu uvedených	podmínek byly získány

křivky závislosti pro všechny zesilovače ze skupin Bl až B5 tak, aby bylo mošno identifikovat nejvýhodnější koncentrace těchto látek pro provedení testů v kombinacích.

Koncentrace transglutaminázy je v tabulkách Bl až B5 vyj ádřena j ako

i) procento (ínhibice v přítomnosti zesilovače a retinolu/kontrolní ínhibice) - procento (ínhibice ROH/kontrolní ínhibice), měří se tedy přídatný účinek zesilovače a retinolu na inhibici enzymu ve srovnání s účinkem samotného retinolu, nebo * «· * · # · · · * · « · 9 · 9 · ··«* 9 9 9 9 9 • ···· · · · ·

99 9 ·· ·· ·* ·· ii) jako hodnota IC₅₀, a to v případě, že se sleduje účinek většího počtu koncentrací zesilovačů, tímto způsobem se zjišťuje koncentrace zesilovače, která v kombinaci se stálou koncentrací retinolu 10⁷ M vyvolává inhibici enzymu na 50 %.

Kombinace zesilovačů a jejich poměry

Bylo neočekávaně zjištěno, že některé látky zvyšují tvorbu endogenní retinové kyseliny z retinolu nebo retinylesterů různými mechanismy. Tyto látky se souhrnně označují jako zesilovače retinoidů. Jde o inhibitory ARAT/LRAT, označované jako skupina Bl, inhibitory retinaldehydreduktázy, skupina B3, inhibitory vazby retinové kyseliny na CRABP-2, skupina B4 a inhibitory oxidace retinové kyseliny, katalyzované enzymy ze skupiny cytochromu P450, skupina B5, může také jít o látky, které aktivují retinoldehydrogenázu ze skupiny B2. Tyto sloučeniny byly rozděleny do skupin Bl až B5, jak již bylo svrchu uvedeno.

Zesilovače jako takové nebo ve vzájemné kombinaci vyvolávají potenciaci účinku retinoidů tím, že zvyšují množství retinolu, které je k dispozici pro přeměnu na retinovou kyselinu a mimoto vyvolávají inhibici degradace retinové kyseliny. Zesilovače působí ve spojení s retinoidem, například retinolem, retinylesterem, retinalem nebo kyselinou retinovou, která je endogenně přítomna v pokožce. Výhodné prostředky obsahují spolu se zesilovačem také retinoid, aby byl zajištěn vyšší účinek.

Prostředek podle vynálezu tedy obsahuje 0,0001 až 50, s výhodou 0,001 až 10 a zvláště 0,001 až 5 % ·> ··· · • · · · • · · ···* ··« ·♦ · · hmotnostních alespoň jednoho zesilovače nebo kombinaci dvou, tří, čtyř nebo pěti zesilovačů. Při koncentraci kombinace 0,001 až 5 % dochází k inhibici transglutaminázy až na více než 50 %, mimoto prostředek obsahuje kosmeticky přijatelné nosné prostředí.

a) zesilovač ze skupiny B2, B3, B4,

c) ternární kombinace zesilovačů ze skupin B1/B2/B3, B1/B2/B4, B1/B2/B5, B1/B3/B4, B1/B3/B5, B1/B4/B5, B2/B3/B4, B2/B3/B5, B2/B4/B5 a B3/B4/B5,

d) kvarterní kombinace zesilovačů ze skupin

B1/B2/B3/B4, B1/B2/B3/B5, B1/B2/B4/B5, B1/B3/B4/B5 a B2/B2/B4/B5 a

e) kombinace všech pěti skupin B1/B2/B3/B4/B5.

Vzájemné poměry zesilovačů

Zesilovače z různých skupin B1 až B5 jsou obsaženy v kosmetickém prostředku v celkové koncentraci 0,001 až 5 % hmotnostních při specifických poměrech, které jsou dále uvedeny tak, aby došlo k inhibici účinnosti TGázy až na méně než 50 %.

Rozmezí	Poměr zesilovačů	Koncentrace
Široké	1:10 000 až 10 000:1	100 mM až 1 nM
Výhodné	1:1 000 až 1 000:1	10 mM až 10 nM
Velmi výhodné	1:100 až 100:	1 mM až 10 nM
Optimální	1:10 až 10:1	0,1 mM až 1 μΜ

·· ··· ·

Poměr retinoidu k zesilovači

Výhodný prostředek obsahuje retinoid, například retinol, retinylester nebo retinaldehyd spolu se zesilovačem nebo kombinací zesilovačů k dosažení optimálního účinku.

Pro optimální výsledek byl měla být koncentrace retinoidu k zesilovači v prostředku podle vynálezu v následujících poměrech:

Rozmezí	Poměr zesilovače k retinoidu	Koncencentrace zesilovače a retinoidu
Široké	10000:1 až 1:10000	100 mM až 1 nM, 0,001 až 10 %
Výhodné	1000:1 až 1:1000	10 mM až 10 nM, 0,001 až 10 %
Velmi výhodné	100:1 až 1:100	1 mM až 100 nM, 0,01 až 1 %

Koncentrace jednotlivých zesilovačů, použitá v příkladech

Vzhledem k tomu, že bylo zapotřebí sledovat možnou synergii při inhibici exprese transglutaminázy kombinacemi různých látek s retinolem, bylo zapotřebí stanovit křivky závislosti odpovědi na dávce, zejména hodnoty IC₂o a IC₅₀ pro jednotlivé účinné látky v přítomnosti retinolu. Výsledky jsou pro jednotlivé zesilovače ze skupin B2 až B4 uvedeny v následujících tabulkách. Údaje byly použity k identifikaci submaximálních inhibičních koncentrací pro každou účinnou • * · · · ·*·· 0 · «··· • * · · ·· · · * « • · W » · · · W · · • « · · ♦ · · W » · ·#»* ··· ·* ·· ** *· látku tak, aby bylo možno identifikovat případný synergní účinek směsí účinných látek v přítomnosti retinolu. Údaje v následující tabulce uvádějí hodnoty IC₅₀ a IC₂₀ (80 % kontrolní hodnoty), uvedeny jsou koncentrace účinných látek v případě kombinací.

Aby bylo možno prokázat synergní účinek dvou látek, je nutno zvolit zkoumané koncentrace, které jsou nejvýš IC₂₀, to znamená takovou koncentraci, která vyvolává inhibici exprese enzymu o 20 %. Dvě použité látky by tedy měly mít úhrnnou inhibici 40 %. V případě, že inhibice je vyšší, to znamená 40 až 100 %, znamená to synergní účinek obou látek.

Je také možno sledovat sloučeniny, které jako takové nemají inhibiční účinek, avšak při jejich kombinaci k synergnímu účinku dochází. V tomto případě jsme použili koncentrace, které byly 10 až lOOOkrát nižší než minimální účinná inhibiční koncentrace pro TGázu. V případě, že je takto identifikován synergní účinek, znamená to, že kombinace je velmi účinná.

♦ 9

9999 ·· ·«·· · · 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 · 9 9 9 · 9 9 9 9 9 9 9

Sloučeniny, použité pro synergii

1E-05 až 1E-09

1E-06 až 1E-10 |

1E-05 až 1E-8 |

1E-05 až 1E-09 |

1E-06 až 1E-09 |

1 1E-03 až 1E-07 |

1E-04 až 1E-08

1E-06 až 1E-09

1 1E-06 až 1E-09 |

| 1E-08 až 1E-11 |

| 1E-06 až 1E-09 |

1E-05 až 1E-09

| 1E-05 až 1E-09 |

1E-05 až 1E-09

O CN u H

ω co ld v o - 1 H

ND 1

1,08Ε-05 1

ND |

ND 1

I QN

7,82E-05 |

! 4,72E-03 |

1,69E-04

1,42E-04

9,38E-06

5,94E-07 |

1 3,30E-06 |

| 9,21E-08 i

| 5,15E-06

6,9E-05

1 2,52E-05

so-aoo'fr l

Lf) O 1 ω o K. CN

O tn U HH

1,61E-05

ND |

2,80E-05 1

| ON

ND |

ND Π

1 ^ND 1

ND |

9,35E-05 Π

! 7,83E-03 1

3,35E-04

9,27E-04

Lf) O 1 W Lf) CN ro

LO o 1 M LO H

LO O 1 H r- n

| 2,84E-07 J

1 6,78E-06

Lf) O 1 W CD σι σ

1 3,75E-05

o 1 CN 1—i

Lf) O 1 ω σ CN ro

Sloučenina

Ί3 •H ε us i—1 0 a (0 Λ 4J CD 0 fi 0 ε i—1 !>ί 0 — CD < r-l M o Ξ a S i—1

pa1mitamidmonoethano1amid

oleylbetain 1

naringenin J

echinacea J

dimethylimidazolinon 1

melinamid 1

geranylgeraniol 1

farnesol |

geraniol 1

a-damascon

C 0 C 0 Ή 1 8

methylester kyseliny z ricinového oleje (MEA)

kyselina ursolová 1

Utrecht-2

kokoylhydroxyethylimidazolin

acetylsfingosin (C2-ceramid)

hexanoylsfingosin (C6-ceramid)

crocetin

lyrial

N-hydroxyethyl-2 -hydroxydode cylamid

Zesilovač skupina

B1

·» «44 4 ····

4 4 9 4 4 4 « 44 4 4 · 4 · • · «9 ·* · ·

σ

ο

σ

ο

σ

40

σ

ο

σ

rd

σ

rd

σ

C0

σ

ο

rd

ο

rd

ο

o

O

o

O

o

ο

Ο

rd

ο

rd

ο

rd

O

ο

Ο

W

ω

1 ω

W

ω

Ω

rd

Η

rd

>Ν

>N

>Ν

>ES4

>N

>Ν

(ΰ

(ti

Cti

cti

(ti

(0

(ti

(ΰ

(ti

tn

LD

ο-

tn

to

Ο-

40

L0

IO

in

n

IO

10

in

to

ΙΟ

LO

θ'

LO

CO

ΙΟ

CO

LO

4<

LO

ο

Ο

ο

Ο

o

O

o

O

o

O

Ο

O

o

O

Ο

ω

1 ω

ω

Ω

Η

rd

Η

rd

<0

40

ΙΟ

'tf¹

IO

CO

IO

LO

IO

ΙΟ

ο-

CO

Μ*

ο

Ο

ο

o

O

o

O

o

ο

o

Ο

Ω

1 ω

Ω

ω

Ω

o

Ω

S

a

C0

a

ο

Ο

40

ΙΟ

rd

§

to

o-

o

IO

co

a

σ

a

to

a

οι

a

04

a

Ο

a

rd

CQ

ο

σ

Ol

O

v

co

οι

«Φ

to

ο-

x

χ

X

*»

*·

<0

C0

CN

ΙΟ

C0

rd

1—I

co

rd

IO

40

Ol

C0

LO

rd

t

40

Γ-

40

'Φ

LO

co

sf

tn

to

ΙΟ

40

θ'

o-

ο

Ο

ο

Ο

ο

o

O

o

O

o

ο

Ο

ο

o

ο

Ω

ρ

ω

Ω

ω

Ω

Q

Ω

S

2

a

40

rd

Ν¹

C0

sh

s

Ol

O

rd

O

a

C0

a

co

a

LO

a

40

04

40

m

θ'

Γ

m

σ

LO

C0

r

co

40

χ

X

*·

σι

40

co

C0

rd

σ

rd

04

40

04

rd

C0

1

'(ti

β

m

β

'(ti

0

1

Ti

>

'(β

β

0

>

•rd

β

'<ti

ω

rd

β

0

i—1

φ

>

>1

(ti

β

0

υ

0

K

Φ

φ

β

>.

β

\(ΰ

0

Ω

φ

•rd

Γ“Η

•Η

>

Ω

ω

'Iti

Ω

σι

Ω

'(ti

0

β

>1

'(ti

ί>

ω

0

1

Φ

>

β

'(0

(ti

X

>

0

>1

1 .

β ω

Ω

'(ti

0

>

Ω

0

β

X!

«*—“ »—1

β

ι—1

β

ω -η

Η

i>

β

Ti

0

•rd

β

(ΰ

0

a -η

•rd

0

•Η

ι £

β

0

Φ

•rd

Ω

Ti

•rd

φ

β

rd íd

ι—1

Ν

«—1

rd (l5

rd

Ω

ω

β

ί>Ί

Ti

Ω

Ti

rN

0

(ti

0

ί>Ί ι—1

U

0

U

•rd

<ti

Ω

•rd

ω

>1

Ol Ω

β —

•rd

Ω

β

0 0

,—|

β

>1

β

(ti

β

X

1

(ti

0

Ω

i tn

•rd rd

β

0

•β

β C

U

0

rd

•rd

β

Φ

04

rd

ω

1

γΉ

i—1

0 0

Ω ·β

Ω

ι—1

rd

cti φ

a

1-1

σι

rd

(ti

£

Ω

rd

Φ

•ΓΊ

•Η

04

ο

0

β Ω

Ο β

0

ί>Ί

φ

Ω Ω

1

ο

Φ

ι—I

Ν

ι—1

N

Ό β

>4 £>ί

Ν

Ώ

ί>Ί

Ω 4->

β

X!

(ΰ

(ti

(0

(ti

i—1

(ΰ

(ti

0

(ti

0

(ti

>Ί (ti

X! Ω

β

•Η

ε

0 Φ

•rd

0

β

0

β

Ν

£

Ν

β

Ω Ω

0 ω

Φ

Ω

0

•rd 0

Μ

β

•rd

•H

•rd

•r|

•rd

•H

•rd

(ti

•rd

(0

•rd

0

•Η 0

β 0

Ω

(ΰ

cn

Ti 4-1

Φ

ι—1

i—1

f—1

i—i

i—1

1—1

'>1

r—1

ι—1

(0

β

Ω

TJ β

Ti Ω

0

Μ-Ι

β

ι ω

(0

Ω

Φ

Φ —

Φ

•rd

Φ

β

Φ

φ

£

Ω

0

(ti

0

ι Ό

>1 β

β

ω

•rd

U

04 0

ω

β

ω

tn

ra

m h

ω

β

tn

cn

>φ

tn

ω

•rd

0

υ

b

Ω

S

Ω Φ

•rd

0

4-1

Ο

- 4-1

£

(ti

>1

>ι·β

>1

(ti

>1

β

!>ι

ί>ϊ

ι—1

•rd

β

Φ

Ώ

ι Ω

£

4-1

ω

Η

rd 1

cti

U

Ω

Ω ω

Ω

>

Ω

ι—1

Ω

υ

£

Ω

ω '

οι

(ti

ΟΙ

m

sť

ΙΟ

Ω

Lf)

Ní*

Ο	σ	σ	σ
γΗ	ο	ο	ο
ώ	ώ	ώ	ώ
γΗ	γΗ	γΗ	τ—1
>Ν	>Ν	>Ν	>Ν
β	β	β	β
Γ*	141	V)	γ-
Ο	Ο	Ο	ο
ω	ώ	Μ	ώ
γΗ	γΗ	γΗ	Η
	ιη	<0	ο
ο	ο	ο	ο
W	Μ	ώ	ώ
σ	rd	ι_η	σ
V)	γΉ	κο	ν
«.	·.	κ	«.
CN	ιη	ιη
[	LD	14)	Γ
ο	Ο	Ο	ο
ώ	ώ	ώ	Η
Γ'	σ	CN	σ
VI	CN	Ο	14)
	«.	<s
	V)	η	00
			1 τ—“1
β		β	β
•Η		•Η	τ)
γΗ		ι—1	¹—¹
ο		ο	Ν
Ν		Ν	β
β		β	β
Τ4		Τί	44
•Η		•Η	,—,
Ε		ε	β
•Η		•Η	1
ι—1		ι—1	γΗ
>1		>,	' β
44		44	co 0
4J		4J	¹—¹ 1
β		β	0 Γ~
!>ι		Ι>1	Ν 1
Μ		X	β β
0		0	τ) ·η
β		β	Ή γΗ
Ό	β	τ4	Ε 0
!>ι	•Η	>1	•Η β
44	4J	44	Ν ·Η
Γ—1	β	ι—1	β 44
Ϊ>Ί	U	>1	β U
β	β	0	44 0
β'	β	β	ι ra
β	>	ι—1	44 ·η
ι—1	44	0	> ι

Si β

H β

4) β

ra 'β tí >Ν

Ο

Ε >0)

τ) — β 2 a σι Ή I >β Ο ίΜ Η > >Ν β '>ι ω

Ε ι

I—I Ο β ι-Η >β

Ν Ή Ν β

ŤS Ν >1 γΗ Ό >ΐ'β 44 >Β β β Ο

Ή β U β β β

Ο 44 β

Λ β

I—I β 'β γ—ι 44 S>ra Λ β \β β 44 β β 44 -Η >ra >ra β ο β 44 β Ν 'β

Ε

II β Ο

Q 44 2 Ν * t· 9999 99 9999

9 99 9 9 9 9 9 9

9 »·♦ · 9 9

9 9 · 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 999 9» 99 99 99 ·* ···· ·· ···· *« » · · · · · · · * 0 * · 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 0 0 9

9999 999 99 99 99 99

Závislost odpovědi na dávce pro zesilovače ze skupin B2 až B4

V následujících tabulkách jsou uvedeny údaje pro závislosti odpovědi na dávce zesilovače ze skupiny B2 až B4. Jsou uvedeny molární koncentrace zesilovačů. Mimoto je uvedena průměrná koncentrace TGázy a standardní odchylka pro pokusy ve 4 opakováních jako procento hodnoty pro kontrolní skupinu (0,1 % DMSO a 10-7M retinolu). Vysoká čísla v blízkosti 100 nebo vyšší než 100 znamenají, že k inhibici TGázy nedošlo. Čím nižší je číslo, tím účinnější je inhibitor v uvedené koncentraci. Ze závislosti odpovědi na dávce byly vypočítány hodnoty IC₅₀ a IC₂o, které jsou uvedeny v předchozí tabulce.

Zesilovače ze skupiny B2 Fosfatidylcholin (B2)

Koncentrace	Konc. iGázy (průn.)	IGáza (SD)
4.4E-05	90.9	0.01
1.47E-05	120.3	10.6
4.89E-Q6	70.1	11.4
1.63E-06	98.8	0.00
5.43E-07	86.7	6.19
1.8E-07	75.9	20.5
6.0E-08	87.8	3.9
1.2E-08	159	42.3
2.4E-09	85.5	0.39

* 4 •

• 44 4 4 • 4 · • 4 · • 4*4

4« ·

4 «· 4 ♦· 4

Sfingomyelin (B2)

Koncentrace	Koncentrace TGázv (prům.)	TGáza (SD)
3.0E-05	'45	3.21
1.0E-05	77.8	25.5
3.33E-06	76.4	7.55
1.1E-06	98.8	0.00
3.73E-07	91.6	14.9
1.23E-07	70.0	3.63
4.10E-08	74.6	4.19
8.2E-08	115.2	1.02
1.65E-09	68.4	2.03
3.29E-10	69.2	2.1

TCC (B2)

Koncentrace	Koncentrace IGázy (prům.)	IGáza (SD)
1.14E-03	36.3	4.6
3.8E-04	3.8	0.96
3.31..23E-04	-3.2	0.91
4.22E-05	-11.2	0
1.41E-06	-.3	4.88
4.69E-07	15.9	3.52
6.26E-08	18.9	3.12
1.25E-08	100.2	23.3
6.9E-09	77.6	21.2
1.0E-09	54.4	11.23

999 9

9999 99 9999

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9.9 99 99

1,2 -dioktanoyl -sn-glycerol -3 -fosfoethanolamid (B2)

Koncentrace	Koncentrace IGázy (prům.) '	IGáza (SD)
1.6E-04	58.1	2.08
5.33E-05	95.4	21.3
l.'78E-05	104	4.01
5'. 93E-06	129	0.0
1.98E-06	110	8.74
6.58E-07	92.8	15.78
2.19E-09	88.6	12.3
4.39E-08	127.3	3.39
8.78E-09	119	21.1
1.79E-9	82	15.6

Zesilovače ze skupiny B3 Amsacrin B3

Koncentrace	Koncentrace IGázy (pran.)	IGáza (SD)
3.0E-05	-10	3.29
1.0E-05	1.8	7.45
3.33E-06	64	4.2
1.1E-06	84	0
3.73E-07	109	6.2
1.23E-07	65	15.8
4.10E-08	110	10.5
8.2E-Q8	131	27
1.65E-09	113	18
3.29E-10	92	8.9

«» ·»··

Carbenoxolon (B3)

Koncentrace	Koncentrace TCázv (prim.)	IGáza (SD)
3.ÓE-06	-7.1	0
1.0E-06	27.3	'<?' 1.15
3.33E-07	51.7	0
1.1E-07	158	0
3.73E-08 .	126	4.67
1.23E-08	81	29
4.10E-09	135	6.88
8.2E-10	112	32
1.65E-10	77.8	10.6
3.29E-11	64	49

Kyselina glycyrrhetinová (B3)

Koncentrace	Koncentrace IGázy (prim.)	IGáza (SD)
3.0E-04	-0.3	3.9
1.0E-05	0.7	3.55
3.33E-05	2.5	2.1
1.1E-06	96.4	0.00
3.73E-06	120	33.2
1.23E-07	112	38
4.10E-07	93	11
8.2E-08	225	108
1.65E-08	103	11
3.29E-9	100	6.2

• *· ·

Α Φ» *

ΦΦ · ·

Φ Φ ·

ΦΦΦΦ

Φ ΦΦΦ

ΦΦ · Φ· φφ φ

Φ Φ * « Φ Φ Φ

ΦΦΦ ΦΦΦΦ Φ φ ΦΦΦΦ

ΦΦ ΦΦ

Kyselina linolová (Β3)

Koncentrace	Koncentrace _(SD) TCázy (prum.)
9.0E-03	-6	3.06
3.0E-03	0.1	2.01
1E-03	-16.4	16.3
1.1E-04	4.4	0
3.73E-04	79.2	0
1.23E-05	62.6	6.2
4.10E-05	76.8	3.69
8.2E-06	146	44.2
1.65E-07	• 106	20.2
3.29E-07	60.2	2.3

Kyselina linolenová (B3)

Koncentrace	Koncentrace . IGázy (prům.)	IGáza (SD)
9.0Ξ-03	-11	8.7
3.0E-03	-5.7	0.74
1E-03	-7.5	7.8
1.1E-04	-23	0
3.73E-04 .	68	0.57
1.23E-05	94.9	17.2
4.10E-05	65.9	0.03
8.2E-06	119	1.6
1.65E-07	77	8.5
3.29E-07	98	7.0

• •9

9999 • 9

Kyselina myristová (B3)

Koncentrace Koncentrace IGázy (prům.)	TCáza (SD)
1E-03	......... -2	4.1
1.1E-04	-8	2.3
3.73E-Q4	-6	1.16
1.23E-05
4.10E-05	75.1	1.06
8.2E-06	74.2	10.0
1.65E-07	88.9	8.4
3.29E-07	•101	4.47
5.0E-08
1.1E-08

Vanilin (B3)

Koncentrace Koncentrace TCázy (průn.)	TCáza (SD)
1.4E-02	21.5	24.2
4.8E-03	93.8	1.7
1E-03	124	15.6
1.1E-04
3.73E-04	101	. 14.3
1.23E-05	82	14.6
4.10E-05	98	2.4
8.2E-06	109	22
1.65E-07	80	4
3.29E-07	93	41

9999

Zesilovače ze skupiny B4 Kyselina hexandikarboxylová (B4)

Koncentrace Koncentrace (SD) IGázy (prům.) i
1E-03
1.1E-04	14.2	2.7
3.73E-04	43.4	8.4
1.23E-05	130	0
4.10E-05	105	14
8.2E-06	114	12
1.65E-07	95	1.9
3.29E-07
5.0E-08	74	6.7
1.1E-08	70	10.4

Kyselina 12-hydroxystearová (B4)

Koncentrace	Koncentrace . IGázy (prům.)	IGáza (SD)
3.73E-04
Ϊ.23Ε-05		-5.2	2.3
4.10E-05		32.4	5.3
8.2E-06		97.6	0
1.65E-07		90.2	11
3.29E-07		82	28
5.0E-08		81	3.8
1.1E-08		r 98	' 24
2.0E-08		118	28
4.3E-09		71	2.3

·« · • · ··

9

9999 999 ·· ····

9 9 9 9

9 * · 9

9 9 9 9 9

99 99 ·« ··»*

Kyselina elaidinová (B4)

Koncentrace	Koncentrace IGázy fprům.)	TGáza (SD)
ÍE-03	12.8	12.1
1.1E-04	8	0.45
3.73E-04	13.8	1.92
1.23E-05	80.9	0
4.10E-05	58.2	8.8
8.2E-06
1.65E-07	58	0.13
3.29E-07	69	44
5.0E-08	50. S	3.8
1.1E-08

Lněný olej (B4)

Koncentrace Koncentrace TCázy (prum.)	IGáza (SD)
1E-04	138	15
3.73E-05	145	2.5 ·
1.23E-05	88	12
4.10E-06	113	0
8.2E-06	113	13
1.65E-07	96	18
3.29E-07	106'	10
5.0E-08	134	22
1.1E-09	83	13
9.9E-10	73	15

·· • · ···· • «» ···· ·· ···* ·· · · · · · · • · · · · · · • · · · · · ♦ · · • · · · · * · · » ·«· ·· ·· ·· ··

Kyselina ísostearová (B4)

Koncentrace	Koncentrace . IGázy (průra.)	IGáza (SD)
ΓΙΕ-Ό3	-8.6	3.4
1.1E-04	1.2	3.0
3.73E-04	-5.3	1.-.I 1.1
1.23E-05	80	00
4.10E-05	67	7.9
8.2E-06	103	12.3
1.65E-07	95	5.5
3.29E-07	123	0,5
5.0E-08	78	12.2
1.1E-08	78	29

Kyselina 2-hydroxystearová (B4)

Koncentrace Koncentrace IGázy (prům.)	IGáza (SD)
9.1E-04	46.6	6.2
3.73E-04	69.3	8.3
1.23E-04	51	8.8
3.10E-05	96.0	0.0
1.2E-05	105	30
3.65E-06	63	8.0
1.29E-06	80	4.7
2.0E-07	142	34
5.1E-08	64	20
1.0E-08	58	17

Synergie inhibice TGázy binárními kombinacemi zesilovačů

Aby bylo možno sledovat inhibici exprese TGázy kombinací dvou různých skupin zesilovačů s retinolem, byly podrobeny zkouškám vybrané kombinace sloučenin ve svrchu uvedených koncentracích. Zkoušené koncentrace byly o řád nižší než koncentrace, jichž je zapotřebí pro minimální inhibici TGázy (to znamená IC₂₀) · Sloučeniny byly zkoumány jednotlivě a v kombinaci a pro každou sloučeninu a její kombinaci je uvedeno procento inhibice TGázy.

Následující příklady uvádějí synergní kombinace, a to všechny možné binární kombinace, (B1/B2, B1/B3, B1/B4, B1/B5, B2/B3, B2/B4, B2/B5, B3/B4, B3/B5 a B4/B5). V případě, že procento inhibice pro kombinaci je vyšší než součet inhibice pro obě látky, jde o synergíi, což znamená, že inhibice pro kombinaci uvedených látek je vyšší než inhibice sloučeniny 1 + inhibice sloučeniny 2). U všech binárních kombinací, uvedených v následující tabulce byla zjištěna synergní inhibice TGázy.

· ·· ···· ·· 0000 • 000 ·· · · · ·

0 · · · 0 0 · • ···· 0 0 0 0 0

0 0000 0000 0000 000 00 00 00 00

1 Ν -Η \<ΰ P <D o ε υ Η 0 ctí o\° Λί tí

co

VD co

86 |

co o

78

co

Lf)

co σ

22

86

22

78

| 82 1

1 ⁷⁸ 1

92

Lf) CO

78

σ co

>Ί · Ν >ϋ \r0 2 Ο 0 CN Η ι-H ο\° W

97 1

97

97 1

86

98

’Φ co

134

164

co r—1

86 I

1 164

164

1 164

1 134

1 144

134

92

%TGázy slouč. 1

I 66

95

109 1

101

106

95

123

co σ

¹⁰²

| 102

122

1 120

1 110

1 122

| 122

101

95

Sloučenina 2

fosfatidylcholin |

fosfatidylcholin

fosfatidylcholin |

sfingomyelin

fosfatidylcholin

sfingomyelin

amsacrin

carbenoxolon

I carbenoxolon

| amsacrin

| carbenoxolon

carbenoxolon

| carbenoxolon

| amsacrin

| kyselina eliadová

amsacrin

kyselina glycyrrhetinová

Sloučenina 1

dímethylimidazolidinon

a-damascon

hexanoy1sfingosin

g 0 g 0 H 1 a

1,2-dioktanoyl-sn- -glycero-3- -fosfoethanolamid

a-damascon

1,2-dioktanoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamid

ricinový olej MEA 1

Utrecht-2

hexanoy1sfingosin

lyral

ricinový olej MEA

hexanoylsfingosin

g •H ra 0 cn g H 44 ra i—I 0 g <D

a-ionon

1,2-dioktanoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamid

Binární kombinace

CN CQ 1—1 m

B1/B2

B1/B3

IB1/B3

B1/B3

• · • · · · · · o

Lfi

78

77 |

I 69

82

93 1

08

co co

84 1

56 1

65 |

51

| 83 1

1 58 1

C ..85

i 56 1

1 83 1

1 78 1

1 06 |

1 81 1

57

co

CD

Lfl [>

CQ

o t

§2

1_92 J

112

112 |

95

125

146 1

125

102 |

¹¹¹ Ί

¹⁰¹ 1

1 99 |

CO σι

1 105 I

[ 102 |

1 126 I

CO σι

1 98 1

CD CD

1 11°

1 118

1 98

73

86

CQ

CN CD

| 82

I 102

| ni

95

99,3 1

120 |

110

122 1

99,5

cd cd

| 86

CD CD

[ 99 1

1 122 I

1 122 J

Γ 110

122

Γ 122 {

1 122

CD CD

1 122

112

rH O rH

101

| 98

86 |

1 98

j 98

kyselina 2-hydroxystearová |

kyselina hexadekanová |

kyselina hexadekandikarboxylová

kyselina isostearová |

kyselina hexadekandikarboxylová

kokoylhydroxyethylimidazolin |

ketoconazol |

miconazol |

ketoconazol |

laurylhydroxyethylimidazolin |

Γ—1 0 N Π3 •rl f-i 4J 0 N fí (1) Λ 0 G •rl ε co

| 3,4-dihydro-2-chinolinon |

| aminobenzotriazol |

| laurylhydroxyethylimidazolin

climbazol

| miconazol /

| ketoconazol j

| ketoconazol

| laurylhydroxyethylimidazolin

oleoylhydroxyethylimidazolin

laurylhydroxyethylimidazolin

oleoylhydroxyethylimidazolin

| kyselina glycyrrhetinová

| kyselina 2-hydroxystearová

| climbazol

| miconazol

a •H fí <u Cn G •H (0 G

hexanoylsfingosin

lyral

ricinový olej ΜΕΆ

[ hexanoylsfingosin I

oleoylbetain

hexanoylsfingosin 1

1 farnesol 1

hexanoy1s f ingos iη 1

hexanoylsfingosin 1

CN 1 4J h u 0) μ 4J to

hexanoylsfingosin 1

ricinový olej ΜΕΑ 1

hexanoylsfingosin 1

hexanoy1sfingosin

hexanoylsfingosin

oleoylbetain

Utrecht-2

G 0 u m (C ε TJ 1 a

G 0 G 0 •rl 1 a

a-ionon

fosfatidylcholin

IB1/B4 I

B1/B4

IB1/B4 1

B1/B4

IB1/B5 I

in ffl Γ”J

in CQ

m m 1—1 PQ

IB1/B5 I

B1/B5

IB1/B5 I

IB1/B5 1

IB1/B5 I

IB1/B5 1

B1/B5

IB2/B3 I

B2/B4

B2/B5

• · • · · · · · • · · · · ·

68	82 \|	i Z5	⁷⁸ 1	sP co	1 ⁹⁴ 1	1 ⁸² 1	ΣΖ	77	75	70
101	106 1	82 \|	i_82	co cři	1 ¹¹² 1	¹⁰²	⁷³ Ί	109	CN σ\	96
86	98 1	102 1	no 1	¹⁰² 1	102	¹¹⁰	1 ⁸⁸ \|	CN cn	⁸⁸ 1	CN σ\
ι—1 0 N 05 C 0 u 0 4J <l> Λ4	laurylhydroxyimidazolin \|	kyselina 2-hydroxystearová \|	\| kyselina 2-hydroxystearová \|	aminobenzotriazol \|	\| dimethylimidazolin \|	\|climbazol j	d •ri i—1 O N 05 T5 H ε •H i—1 Λ 4J <U & 0 μ Ό ί>Η b 1—1 !>ί μ d 05 1—1	ketoconazol	(oleoylhydroxyethylimidazolin	kumarin
fosfatidylcholin 1	fosfatidylcholin	amascarin	kyselina myristová 1	(amascarin \|	•H μ 05 υ ra 05 ε 05	kyselina myristová	lněný olej	kyselina 2-hydroxystearová i	\| lněný olej	kyselina 2-hydroxystearová
LD CQ CN	B2/B5	B3/B4	B3/B4	B3/B5	B3/B5	B3/B5	B4/B5	B4/B5	IB4/B5 \|	B4/B5

Synergní inhibice TGázy při použití terciárních kombinací zesilovačů

Aby bylo možno sledovat synergní inhibici exprese TGázy při použití kombinací tří odlišných skupin zesilovačů spolu s retinolem, byly podrobeny zkouškám vybrané kombinace sloučenin. Zkoumané koncentrace byly o řád nižší než koncentrace, jichž je zapotřebí pro minimální inhibici účinnosti TGázy (IC₂o) · Sloučeniny byly podrobeny zkouškám jednotlivě a v kombinaci a pro každou látku je uvedena inhibice TGázy při použití látky jednotlivě a při jejím použití v kombinaci. Byly použity všechny možné terciární kombinace, to znamená B1/B2/B3, B1/B2/B4, B1/B2/B5, B1/B3/B4, B1/B3/B5, B1/B4/B5, B2/B3/B4, B2/B3/B5, B2/B4/B5 a B3/B4/B5. Procento inhibice pro kombinaci je vyšší než inhibice pro součet účinnosti jednotlivých látek, což znamená synergní účinek (inhibice pro kombinaci je vyšší než inhibice pro sloučeninu 1 + inhibice pro sloučeninu 2 + inhibice pro sluočeninu 3). Při použití všech kombinací zesilovačů z následující tabulky bylo dosaženo synergní inhibice TGázy v přítomnosti 10-7M retinolu.

• · · · ·

Ο

53

CM in

OJ LQ

58 1

cn

58

LD LO

09

CO kO

00 LQ

75

77

r- lo

CO 10

ο

lq 00

119

cn

σ> σι

ί 118

0Λ 00

127 !

LQ <A

89

'Φ σ»

119

> co

00 co

CQ

91

rH σ\

91 I 1_

91

00 co

CA

<A r~-

91

γΗ

tH σ\

91

j 95

00 co

co co

co 00

81

l—1 co

81

LQ 00

(Sloučenina 1 |Sloučenina 2 |Sloučenina 3

1 Kombinace B1/B2/B3 (

w s <D 1—ί 0 ť 0 α rl u •H X

KS Φ 0 KS d rl X! U <U

¹ naringenin i

acetylsfingosin (C2-ceramid)

farnesol

a-damascon

naringenin

1inoleoylmonoethanolamid (LAMEA)

palmitamidmonoethanol- amid

d 0 o co KS E kS -ú 1 a

d rl d Φ tn d -r| X KS d

echinacea

dimethylimidazolinon

| fosfatidylcholin

kyselina glycyrrhetinová

kyselina glycyrrhet inová

kyselina glycyrrhetinová

kyselina glycyrrhet inová

kyselina glycyrrhetinová

fosfatidylcholin

amsacrin-HCl

amsacrin-HCl 1 _ 1

kyselina glycyrrhetinová

kyselina glycyrrhet inová

kyselina glycyrrhetinová

| karbenoxolon

fosfatidylcholin

1,2-dioktanoyl-sn-glycero-3 -fosfoethanolamid

1 0 x <D u Ϊ>Ί r—i cnO 1 X tí E cfl KS 1 i—1 i—1 0 tí 0 KS d x KS X X OJ X 0 0 X •rl co τ) o 1 X OJ 1 >· cn X 1

1,2-dioktanoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamid

1 0 X Φ O rX σιτ5 1 Ή d E CO KS l i—1 X 0 S d 0 KS d x KS X x <u X 0 0 X rl CO XS 0 1 X OJ 1 >· ΓΩ X 1

1,2-dioktanoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamid

ricinový olej MEA

• · ··«· · · · · · 4 • ♦ * · · « • · · · · · • · · · · · « • · · · · ·· « • · · · ·4> · ·

·« · · · · ·· ···· • · · · · • · · · · · • · · · · · · ·· ·· · · · · rd <0

ld r~

CO co

CO r-

CM CO

<N co

70

CM

O

CM LO

81

58

CN CO

CO rd 1

-24

σ\ co

32

σι

io

CO

o>

co

IO

co

LO

7

rd

LO

CM

LO

7

rd rd

σι

O rd

rd i—1

σι

co

CTi

0>

CO rd

σι

LO

Ch

r-

Ch

7

•7

7

CM

r·

Ch

o

r-

l>

Γ-

co

00

co

σι

CO

c-

σι

co

CO

co

CO

co

CO

co

00

OO

σ»

co

r~

7

Ch

σι

co

CO

r-

LO

σι

(—1

c-

r*

'(ti

í>

0

d •rd

'(ti

44

1

I

P>

'(ti

Φ

rd

r-4

0

P>

43

d

w

d

0

d

•rd

43

1

d

s

•H

d

i—1

44

1 r—n

7ti

(ti

0

Φ

0 Φ

CQ

‘Π

•rd

Φ

U

d —

!>h

Pd

N 7ti

0

Φ

(ti

44

íd

•rd i—1

X

(ti —¹

d Ό

1—I

CQ

rd

43 -rl

0

7ti N

f]

d -η

0

Φ

>,

On

cj d

d d

•rl d

tú

•rl £

X

íd >1

7ti -rl

d

7ti -Η

g Φ

Φ

β

44 (ti

'íd

(ti

(ti 0

(ti

X 44

Σ>ί rd

•rd

í>i i—1

•rd 33

cj

Φ

0

CQ d

d

>

d

d d

d

0 CQ

43 0

44

43 0

N r—r

(d

tn

CQ

rd (D

0

•rd

•rl 7ti

•rd

d 0

i—1 N

Φ

i—1 N

d φ

JZj

d

Φ

>4 CJ

d

i—1

i—1 >1

i—l

7ti 45

Pd (ti

CJ

Pd (ti

Φ 1

fd

d

44 1

0

rd

Φ

Φ Xl

•rd

Φ

íd d

d 7ti

d

0 7ti

44 rd

Xl

Í4

d

Φ CM

•H

CJ

CQ

CQ i

d

CQ

43 (0

d -η

Φ

φ -rl

1

o

(ti

Φ

(ti

ϋ u

1

•rd

íd

>i CM

φ

!>i

1 CJ

(ti g

>

rd £

PQ cm

Φ

d

44

(ti

a

d

32

32 r4

í>

32

CM

i—1 -rd

32

CJ Ή

c- —·

i—l

1

d

1

u

-rl '(ti

'(ti

0

g d

PQ

7ti í>

>

d

1—1

rd

i—1

rd

rl 0

l

d o

0

1 -rd

1 Ή

i Ή

1 *rd

1 -rd

0

i—i α

d

(ti (ti r4

(ti d

r4 r4

i—1 i—1

r-4 r-4

i—1 i—1

i—1 i—i

N

Pd -rl

-rl

d 32 >1

d φ

íd 0

>1 0

íd 0

Íd 0

(ti

4η 1-1

d

•rl φ X

•rl Φ

43 N

d

44 0

cj

H 7ti 0

i—1 -U

44 (ti

p

P

£

0

φ N

Φ (ti 45

Φ CQ

Φ 7ti

-rl

Ή

-rd

-H

•rd

υ

CJ

g (ti

CQ

CQ X d

CQ 0

E -H

ε ·η

£ 'H

£

£ -H

i—1

rd

•rd

•rl 7ti

g

>1 Φ (ti

>i CQ

•rl £

•H g

-rd £

•H £

cj

u

o

CJ

u

g

7ti -H

(ti

32 Xl 31

32 -rl

7ti -rl

7ti -H

7ti -rl

Μ¹

7

LO

PQ

d

PQ

d

•rd

\

CM

•rl

•rd

Ή

•rd

Ή

•rl

•rd

co

CQ

co

PQ

i—l

r-4

rd

PQ

0

PQ

0

\

Ol

rd

43

xl

rd

43

Xl

rd

i—1

d —

rd

i—1

rd

1-1

1—1

PQ

υ

u

υ

PQ

CJ

•rl 7ti

PQ

CJ

u

CJ

cj

r-4

t—1

rd

t—í

r-4

rd

PQ

44 -r|

PQ

PC

PQ

1)

Pd

ί>Ί

íd

ř*<

í>l

X?

Φ

1

CQ £

Φ

l

1

I

1

υ

7ti

<4

d

i—i

CJ

d

(ti

•r|

•rd

•H

rd

Ή

•H

•rd

(ti

•rd

d

(ti

Ή

•rd

rd

•rd

•H

d

44

d

0

0 Φ

d

•rd

(ti

•rd

υ

d

i—1

d υ

•rd

o

CJ

Q

44

(ti

0

(ti

(ti 1

Q

(ti

£

CQ

£

CQ

•r)

d

X O

p

CQ

co

CQ

0

o

g

1

>1

Φ u

0

g

Xl

44

(ti

8

rd

43

P2

(ti

9 9 9 · 9 9 9 99 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

99 99 99

30

<0

CM Ό

48 |

σ ιο

> 1

Μ* ιη

Μ* Ο-

σ <0

ΓΠ

Ο

ΓΩ Ο

ο

C0

ο

ν

σι

ο

σ

Ο]

10

·=τ

ο

ΙΓ)

σι

C0

ω

Γ0 γΗ

γΗ γΗ

<0

σ>

σ

Οι

ο

σι

γΗ

C0

σι

C0

{>

C0

ο

ιη

σ

00

C0

00

sf

sr

ιη

C0

σι

Ο γΗ

ι—1

ω

C0

co

C0

(7\

Μ¹

’Φ

σ

σι

C0

ιο

ισ

10

ΙΟ

σ

σ>

ΟΙ

Γ

ο r-H

Ο r4

Γ-

ο 1—{

Γ-

<0

ο-

Γ»

Ο·

ο·

ο-

ιο

1

I ι—1

£

β

1>1

β

>--* 1—1

0

X

1 0

X

1 0

a ·η

f

X

β

1 Γ—ί 1

χ

1 I^-π 1

γΗ Μ

β

4)

•Η

0 Φ »

φ

0 Φ Ο

'— Ϊ>Ί

•Η

1

>Ί

ω

Ν X 1

>1

Ν X ι

Ol X

ra

£

X!

β

0 —

β — β

X

β ^t-' β

ι ra

0 —

β

0

Ή

tmx

X Ν ·Η

0

X Ν -Η

0 0

tmx

0

μ β

γΗ

β χ

•Η £ Η

μ β

Η β Η

μ χ

β

β ·Η

ι—1

0

X -Η

β

4)

•Η £

ε φ ο

β

X -Η

ε φ ο

X β β

0

•β ε

0

β

4)

X β

•Η X β

•Η

•Η X β

5>ι ·Η Π5

ι—1

υ

X β

X

£

β

Φ

ε

ra μ

Ν γ—, ·Η

X

X 0

Ν γ—ι Ή

β Η U

0

ra

ra β

0

χ

Η Ν

β

0

1—i d)

β β X

φ

ι—1 Ν

β β X

-Η 0 0

•Η

β

ι—1 Φ

β

0

μ

>ι β

β

tm

>1 Φ

Φ 1 φ

4)

>1 β

Φ ι υ

X β β

β

ε

1>ι ο

Φ

ο

Ó X

•Η

β

X ι

X X 0

μ

0 X

X Η 0

1 -Η X

β

X 1

X

m

ε

φ -Η

β

X

Η

φ OJ

ι · ra

φ

φ -Η

ι ' ra

X >1

β

X

φ ΟΙ

β

5

-ι ε

β

φ

X

φ U

a oj ·η

ί>

ι—ι £

a CN -Η

- U χ

φ

1

υ ο

β

1

0 ·Η

>

0)

ra

β —·

Ο —¹ 1

χ

0 Ή

> — I

ΓΠ 1

tm

a

β

0

ι—1

1-1

ι—1

1—1

a ·η

0

η μ

Ν

>1

β

CM X

•Η

α

β

ι m

μ

1—1

β

0

0 0

χ

υ

0

(—}

β

μ χ

0

a

ι—1

I—1

1-1

0

χ β μ

Ν

1

0

ι—1

1—1

ι—1

Ν

X

!>ί ·Η £

β

X

0

ο

β

>1 0

0

χ ι—ι ο

Φ

4)

Ή

υ

0

Ν

β

X Ν

β

•μ ο 0

X

μ

β

0

X β

4)

X β β

0

φ

rQ

Φ

φ X

X

I -Η χ

β

χ

X

ě

£

0

μ

v χ

•Η

•γΗ

•Η

ra

μ

β

•Η

X

η ε

β

-οχ

ε

β

Η

γΗ

γ~Η

Φ

X -Η

φ

η ι

φ

β

χ

X

0

φ

υ

X

'β

β

>

•Η

0

ra

X

χ

0

ω

ra

ω

tm

•Η

ι—1

β —

1-1

β —

ι—1

β

υ

•Η X

-Η χ

υ

Η χ

υ

£>ί

β

a

X -Η

a

X -Η

a

ε

•Η

1

ra ε

m ε

1

ra ε

1

OJ

ΟΙ

CM

Ο]

β

ι—ι ίΰ

ι—ι π3

β

X β

β

1

ι

β

X

•Η

>, μ

>ι μ

Ή

>, Μ

•Η

β

X

β

φ

μ

0 4)

0 <υ

β

0 Φ

μ

0

X

•Η

X

φ

β φ

β υ

0

β υ

φ

β

υ

Γ-1

1—1

ι—1

Γ—1

β

β ι

β 1

β

β 1

β

0

φ

Φ

φ

ra

X ό

X

ra

X <ο

ra

•Η

μ

β

ra

ω

φ

ε

4) U

4J U

ε

φ υ

ε

1

χ

><

ιΗ

β

X —

φ

χ —

β

a

X

0

· ·· ···· ·· ···· * · ♦· 9 9 9 9 9 9

9 0 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 99 9 9 9 9 9 9 0 ··

ΓΩ

ο

ΟΙ

Lfl

<£>

ο

ΟΙ

C0

Γ'

Ol

m

ο

μ¹

ΓΩ

Γ-

00

C0

LO

C0

00

α>

Γ»

ιη

LD

LO

00

C0

Lf)

Φ

σ

00

ο

ιη

γω

m

00

00 ο

00

σι

rd

ο CN

ΓΩ rd

00

σ

00

rd

σ

rd

σ

οι

θ'

ΙΌ

LO

Lfl

ο

Lf)

Lfl

LD

ιη

Η

rd

η

Μ¹

Sf

00

C0

00

σι

σ

σ>

σ

00

CN

sf

ΓΩ

Η

rd

C0

b£>

<Ο

<0

Ο rd

σ

C0

co

C0

'Φ

>

0 £

'φ

\φ

>

1)

'frt

\φ

0

'φ

0

φ

>

'Φ

>

β

>

β

μ

'03

0

>

0

μ

>

£

Μ

0

β

σ

β

σ

μ

0

Φ

S

β

•rd

•Η

φ

•rl

>Ί

μ

φ

ι—1

35

1—{

35

υ

0

”Γ“>

φ

rd

φ

0

Φ

κΝ

β

φ

μ

Φ

φ

β

Φ

rd

Η

Φ

β —

•rd

β —-

tri

Η

ι—1

0

β

•m

φ

ο3 ι—1

ι—1

θ3 rd

•Η

0

!4

Φ

•β

π3

ο5

π5

'(μ

β

φ

1—1

β

Φ 0

1—1

φ

φ φ

Φ

φ φ

£

β

>

φ

0

•Η

β β

o

β

•Η

0

σι

Φ

φ

μ

•μ 73

rd

-μ \φ

•Η

•μ 'Φ

rd

β

£

φ

Φ

rd £>ι

'>1

ι—1

μ β

ι—1

μ β

φ

Φ

φ

•Η

-rd

Ή

Φ

β

Φ

Φ X!

β

Φ

Φ Τ5

φ

Φ 73

ω

β

φ

β

73

β

0

φ ι

>φ

φ

Φ 0

φ

Φ 0

>,

>1

φ

•Η

φ

1

φ

β

>Ί ΟΙ

β

ί>Ί

>1 Φ

!>ι

>1 Φ

Λ!

34

>

μ

β

a

μι

Φ

34 μ

rd

34

34 —

34

34 --

1 »*—. ι—1

β

'Φ

Κ ·Η

•rd

•Η

•μ

>1

rd

ι—1

I—1

ι—!

ι—1

'Φ

0

>

β

ΟΙ μ)

β —

β —-

β —

0

Φ

ι Φ

rd ι—1

•rd rd

•Η ι—1

β

Φ

ι—1

0 0

35 Ή

35 ·Η

35 Ή

35 ·η

35 ·μ

•rd

•Η

Η

μ

0

β Λ

Φ β

φ β

Φ β

φ β

μ

Φ

Ν

Ό β Β

ί>Ί !>Ί

řŇ ί>ι

ίμ X

ίμ ίμ

Φ

φ

Φ

ί><

I—1

1—1

ίθ

Φ

π3

X μ>

X μ)

b μ)

X μ

!4 μ

Φ X!

Φ 35

Φ X!

Φ X

0

β

β Η Ο

ο φ

0 Φ

0 φ

β β

β 0

Ν

0

•μ 0 0

β 0

•Η Μ

•η řd

μ β

-rd Jd

Φ

φ

υ

τ) β μ

Ό Λ

Ό 35

73 Λ

73 33

rd £>ι

ι—1 £*ί

1—1 ί>Ί

μ τ)

X}

jQ

0

1 ·Η 73

Š β

X β

>, β

ίμ β

(μ β

Φ φ

φ >Ί

fcs

Η

+J

4-)

μι

•Φ -β >1

rC Φ

-β Φ

35 φ

35 Φ

X! Φ

Φ ίμ

Φ >1

Φ 35

•rd

•Η

0)

φ

Φ

' Φ 35

ι υ

1 Φ

I U

1 Φ

ι Φ

>μ

ίμ μ

)μ μ

ϊμ ι

ι—1

Λ!

34

m ι —

CN —

ΟΙ

CN —

ΟΙ —

CN

34 (J1

34 σι

34 tm

34 οι

φ

1 0

I 0

1 0

β

φ

ίμ

rd

r—1

'Φ

\φ

'Φ

tm Ό

ση3

σΐΌ

ΙΠ

ί>

>

ί>

Μ*

ι μ

1 ·Η

tn

β

ffl

0

Ο

0

(Ώ

β £

β ε

β £

m

•Η

β

Φ φ

φ φ

φ Φ

β

ω

•Η

•rd

•Η

ΓΩ

1 ι—1

•Η

ΓΌ

•rd

0

PQ

73

η

Ό

CQ

rd 0

ι—1 0

rd

m

ι—1

σι

•Η

rd

•Η

Ή

>1 β

0

β —

rd

Φ

CN

0 Φ

35

Ο]

35

β

•Η Ό

m

ι—I

Μ

1—ί

ι—1

Ρ3

β X!

β 35

Φ

CQ

Φ

•Η

Η

•Η

4-1 -Η

φ

Φ

φ

φ μ

Φ μ

1—1

ι—1

rd

Φ

φ Η

φ

Φ

μ Φ

!>ί

Φ

-Ρ

μ)

ι—ι cd

Φ

φ

Φ

34 0

τ)

Φ

Ό

73

Φ

φ

Φ

>ι μ

φ

β

Φ

0 44

ο μ

0 4-1

rd

Φ

•rd

35

33

Λ

0 Φ

β

Ή

•Η

rd

•Η

•rd

β

•μ Φ

-μ Φ

Η Φ

μ

β

μ

1—I

ι—1

β υ

•Η

I—1

ι—1

rd

ι—1

μ

•rd

73 0

Τ5 0

Φ

•rd

Φ

R

Φ 1

X}

Φ

φ

ι μ

μ

X}

μ

φ

Φ

ί*! L0

C

φ

Φ

φ

£

ΟΙ ι

CN 1

CN ι

φ

£

φ

ι—1

Φ U

0

>1

κΗ

Κ*Ί

ό

> m

- m

~ m

0

Q

0

35 —

34

Í4

rd 1

μ ι

μ

Í4

μ

• Φ φφφφ φφ φφφφ «φ • φ • φ

φ φφφφ • φ φ

ΦΦΦ ΦΦΦ « «

Φ Φ Λ Φ ΦΦ Φ·

Φ · Φ « Φ Φ Φ Φ Φ

Φ Φ · Φ • Φ ΦΦ

58

σι ιη

k£> LT)

in

CM 0*

σ o

73

54

42

43

LL

74

σ kD

75

84

σ

90

95 1-

, 105 1

52

CM Ch

co

!>

82

105

52

Ol σ

kD r-

σ Γ

79

91

rH cn

91

t~4 σ

91

91 _1

91

83

Γ^-1 C0

81

⁸¹

81

00 co

CO co

88

climbazol

7H-benzimidazo[2,1-a]benz[de]-isochinolin-7-on

· i—! b Ή ι—1 (-1 — íx Ol 44 i ra 0 o d Λ b d d ÍX -H (C b r—i o H 0 0 t β h 1 -Η b q* b - o b ΓΩ 1

2-hydroxychinolin (carbostyril)

aminobenzotriazol

1aury1hydroxye thy1 -imidazolin

kvercetin

climbazol

clotrimazol

miconazol

aminobenzotriazol

laurylhydroxyethyl -imidazolin

kvercetin

oleoylhydroxyethyl -imidazolin

amsacrin-HCl

kyselina glycyrrhet inová

kyselina g1ycyrrhet inová

kyselina glycyrrhetinová

'(0 > 0 d d 0 44 ra ϊχ d o •H d r-4 b ra řx ra b ÍX i b Ol

kyselina 2-hydroxystearová

1,2-dioktanoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamid

1, 2-dioktanoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamid

1,2-dioktanoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamid

1,2-dioktanoyl-sn-glycero-3 -fosfoethanolamid

1 0 d 0 o ΪΧ r4 Cnb 1 Ή c ε ra rn 1 i—1 r-t 0 d 0 ti d b (Ú 44 4-> (D b o 0 44 -H 0] b o 1 44 C4 1 >· n rH 1

1,2-dioktanoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamid

1 0 d 0 O ÍX r4 tnb 1 Ή d £ ω rcs 1 r-4 i—1 0 íx d 0 (Ú d b (0 44 44 0 b o 0 44 •rl ra b o 1 44 Ol 1 - f*l rH 1

1,2-dioktanoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamid

Kombinace B2/B4/B5

fosfatidylcholin

fosfatidylcholin 1

fosfatidylcholin

·

LP

σ>	rd		σι	H	in	rd	rd	co
	co		co	co	v	co	co	CD
	co		co		CO o	Lfl	co o	00
σι	σ		co	rd	rd	σ\	rd	í>
co	v		in	Lfl	LP	4*	<4*	LT>
co	co		σ	σι	i—i	co	co	σ
co	co		CO	CO	σ>	σ	σ	CO
co	CO		σ\	cn		r-	Γ	σ
								'(ti
								>
	X							0
	>					'(ti		G
i G	o					>		0
	G					o		X
OJ i	•rd					G		•rd
0 X r~	X					(ti		X
N —· 1	-rl					CD		o
(ti N G	(3		G			X		(ti
X G -H	t—i		0			co		G —
•Η (U H	<D		1—1		•ro	íg	•ro	Π} rd
£ X 0			0		CD	X	CD	•G
•H r—. G	(ti		X		1—1	(ti O	i—1	(ti co
N (0 -H	G		0	G	0	G G	0	G
G 1 X	•rl		G	•rl		G X		-rl \íti
cd η o	rd		(1)	1—1	'>1	i—1	'ÍG	i—1 G
X - 0	CD		X	•rl	G	CD X	G	CD X
1 CN 0]	co		G	G	>CD	CO 1	><D	co 0
ffi -G	>1		cd	(ti	G	>i CN	G	>i CD
> 1 1	X		o	>	rd	X H	r^-1	x
'(ti			G	G	t—4			G
>			•rl	•rl	0			•rl
0			i—I	i—1	N			i—1
G			0	0	(0			0
(ti			G —	G —	Ή			G —-
0)			•rl rd	•rl i—l	G			♦rl i—1
4-1			X -H	X -H	X			X -H
co			O G	0 G	O			CJ G
><	rd		>1 >1		N	i—1	1—1
(ti X	0		X X	X X	G	0	0	x x
G 0	N		0 co	0 co	CD	N	N	0 co
	cti		G 0	G 0	X	(ti	(ti	G U
rH Ό			X X	X X	O	á	X,	X X
(U >i	pí		>, G	>·. G	G			rO fd	X CN CO
CO X	•rl		X cti	X (ti	•rl	•rl	•rl	X (ti
>1 1	1—1		I O	ι υ	£	rd	i—1	i 0	G G G
X CN	CJ		CN	CN --	(ti	o	o	CN	G G G -H
									G G G (ti
									(D CD CD G
									>U >0 >0 -H
									G G G X
									0 0 0 E
									i—1 i—1 i—1 0
									CO CO CO X
			'(ti	'(ti				'(ti
		Lfl	>	>		'(ti	'(ti	>	0 0 0 0
		m	0	0		>	>	0	G G G G
G	G		G	G		0	0	G	O, X, řř CD
	•rl	v	•rl	•rl		X	X	•rl
	1—1	m	X			CD	co	X	CD CD CD CD
0	0		•H	•rl		•H	•rl	•r\|	O O O 0
X)	X!	co	cti	(ti	1—1	G	G	(ti	Ή *rl ·Η Ή
o	o	CQ	1—1	rd	u	>>		i—1	X X X X
	rd		CD	CD	ffi	£	£	CD	•rl Ή ·Η Ή
	>1	<D			1				X X X X
X	τ)	υ	(0	(ti	G	(ti	(ti	(ti	G G G G
•rl	•rl	fC	G	G	•H	G	G	G	•rl Ή rl rl
X	X	G	•rl	•rd	G	•H	•rl	•r\|
<ti	(0	•rl	i—1	r—1	o	rd	i—1	ι—1	o\O o\° o\° o\°
4-1	4-1	Π	<d	cd	(ti	<D	CD	<D
CO	CO	c	co	co	co	CO	CO	CO	II II II II
0	0	o			£		rO	rO
4-1	4-1	X	X	X	(ti	X	X	X	< m u d

·· • ·

9· 99·· ·

• ·

9 • 9 · ► 99 ·· ···· • 9 ·

9 • · · ► 99 ·· · ·

Synergie při inhibici TGázy kvarterními kombinacemi zesilovačů

Aby bylo možno sledovat synergii při inhibici exprese TGázy při použití kombinace čtyř skupin zesilovačů s retinolem, byly podrobeny zkouškám vybrané kombinace sloučenin. Sledované koncentrace byly pořád nižší než koncentrace, jichž je zapotřebí pro minimální inhibici účinnosti TGázy (IC₂o) ·

Sloučeniny byly podrobeny zkouškám jednotlivé v kombinaci, takže bylo zjištěno procento Ínhibice pro každou z uvedených látek a pro kombinaci. Byly sledovány všechny možné kvarterní kombinace, to znamená B1/B2/B3/B4, B1/B2/B3/B5, B1/B2/B4/B5, B1/B3/B4/B5 a B2/B2/B4/B5. Synergie byla považována za prokázanou v případě, že ínhibice kombinací čtyř zesilovačů je alespoň o 30 % vyšší než součet ínhibice třemi sloučeninami jednotlivě (to znamená, že procento ínhibice kombinace čtyř zesilovačů je rovna nebo vyšší než ínhibice v procentech pro tři sloučeniny + 30 %) . Všechny kvarterní kombinace zesilovačů, uvedené v následující tabulce, měly synergní účinek.

• · · · · · • · · · · · • · · ·· ι

VO

υ

04

rH

co Sft

35 i

45

ΓΩ

θ' SP

C0 ΓΩ

37

co η

47

θ'

σ

ο

04

C0

ο

10)

CQ

νο

LOI

sP

^Ρ

Lf)

sp

ΓΟ

ω

sp

<

21

LT1 γΗ

ΓΩ 1

10)

ΓΩ I

ω

θ'

ο γΗ

ο

γ4 1

1

'03

\β

I *Η

\β

>

τ

>

'fd

ό3

'β

0

'β

\β

0

β

0

>

μ

>

μ

β

μ

'β

0

β

ο

0

ο3

34

03

>

μ

φ

μ

β

Φ

0

fd

ο3

β

43

β

•Η

43

τ

43

μ

φ

ω

φ

τ

β

•φ

33

4-1

43

0

43

β

0

φ

ω

β

ω

ι—1

ω

Φ 'β

β

43

ίΰ

>4

>1

>,

Ή

φ

-Η

34 >

„,_Ι

β

•η

β

X

0

>1

φ

β 0

β

β 0

β

(C ι—1

β

β X

ι—1

β

β L

β μ

β

β μ

β

β >4

β

β 0

0

Ο)

•Η Ό

-Η Τ5

•Η Τ5

•Η

•η τ

•Η

•Η X

Ή

Ή ^-1

>υ

ι—1 £>ί

ι—1

Γ—1 ί>Ί

γΗ

ι—1

ι—1 0

γΗ

r-ι τ

'>4

Φ 34

φ

Φ 34

φ

Φ 34

φ

φ >1

β

ο

W 1

ω ι

ω

β ι

β

β μ

ω

β 34

>φ

>4 04

>ι 04

>4 04

>1

>4 04

>4 β

r?

>4 1

β

ω

34 Η

34

34 Η

34

34 34

Λί

34 οι

i—1

'03

'β

\β

>

0

ΓΩ

ΕΓ

β

γ3

1—I

β

\β

β

Ή

U

υ

•Η

Ή

> —

Ή

π3

jj

4-1

43

Κ

44

43

0 ι—I

43

c

φ

Φ

1

Φ

β ·β

Φ

β 34

β

β 34

β 0 β

β 34

£

β β

β μ

•Η

Ή

β μ

β

β μ

β τ

β μ

φ

•η μ

•Η

μ

•Η Μ

•Η

•Η Ή \(lj

μ μ

>υ

r-Η

υ

rH

ι—ί

γΗ

.-Ι 34 β

ι—1

φ ύ

Φ ύ

Φ υ

φ υ

β

Φ υ

Ή

φ υ

φ υ τ

φ υ

0

β >,

Μ >4

ω >,

m ><

β

φ

β >1

β

β >4

β β 0

β >4

>, ι—1

r-ι

|>4 ι—ι

£

κ*ΐ γ-Η

β

ί>1 Γ“4

>ι μ ω

ί>Ί Γ-Η

ω

34 σι

34 σ

β

34 σ

>

34 σ

34 β

34 σ

β Ό

β τ

1 α τί

η

ο

β ·μ

m ·μ

β -η

β ·Η

β

β -μ

ι £

•Η

ι £

γΗ

rH

r—4 β

ι—ι ο3

ι—1 03

ι—ι ο5

ι—1

ι—ι (ύ

0

<Ί ι—1

Ϊ>Ί 1—1

ί>Ί Ή

ί>Ί Γ—1

£>ί ι—1

0

St γΗ

03

34

0 0

34

0 0

ο

ϋ

β ι β

β 1 β

β I β

U

β I β

ít

ιΗ

β η β

β ΓΊ β

β β β

β 07 β

1—1

β ΓΩ β

β

43 I 34

43 1 34

>4

43 1 34

τ

η

34 0 43

τ

34 0 43

β

•Η

μ

ο μ Φ

ο μ φ

•Η

ο μ φ

Ο)

43

-Η Φ 0

•Η Φ 0

Η Φ 0

•Η φ 0

43

Ή Φ 0

>υ

π5

β

β ϋ Ή

β U 44

τ ο η-4

τ ο 43

β ϋ 44

β

τ υ 43

β

4-ι

4-3

ι >, ω

ι >. ω

1 >, β

1 >Ί β

>43

1 >4 β

0

ω

04 γΗ 0

03 r—1 0

03 γ—1 0

04 Η 0

υ

σ

04 γΗ 0

β

04 ι-Ι 0

0

- σΜ-ι

· 0)44

- σ^-ι

- σ μ-4

υ

ο

' Οίμ

0

· σ4-ι

ω

4-4

43

Η 1 1

r4 1 1

γ^-4 1 1

Η 1 1

Η

rd 1 ι

43

Η 1 1

<!

β

Η

•Η

2

β

1

0

ι ·Η

ι ·μ

1 Ή

•ΓΊ

0

σ

Ϊ>Ί ι—1

^4 Η

Ι>4 γΗ

Γ-1

..

φ

β

β —

X 0

ι—1

0 TS

ο τι

ο τ

•η τ

0 Ν

β

CQ

0

β

ε ·η

ε ή

£ -Η

43 ·μ

μ β

β

\

•Η

η ε

γη £

γ-4 £

f~í £

β. £

τ τ

•Η

ΓΩ

't>4

β

>1 β

>4 β

>1 β

ι—1 ο3

-Η

κ>4 -μ

>ι -μ

β

CQ

>

Φ

0 γ3

0 ι—1 -·-

0 Ή

0 γΗ '

>ι μ

34 £

φ

0

σ

Φ 0 <

0 Φ

ι—ί -Η

ι—1 Ή

ι—1 ·Η

>υ

04

β

Η β Η

ι—1 β w

Η β Η

ι—1 β W

β υ

ι—I

ΐ>Ί ι—1

ί>Ί γΗ

!>t γ—1

β

CQ

•Η

0 β 2

β 1

β

0 >4

0 >,

0

\

υ

μ

β 34 2

ββ3

β 34 2

X LO

μ

34 34

ι—1

Η

β

•μ 43 J

•μ 43 j

-μ 43 j

•Η 43 J

Φ υ

>4

0 43

Μ

ω

β

rH Φ

ι—1 Φ

ι—1 φ

ι—ί φ

34 -

γΗ

34 Φ

• · · · A

AAA · » A A 4 AA AA

'Φ

ω η

ιό ΙΌ

σι ΙΌ

σ ’Φ

rH VD

σι ΓΩ

φ

Ο τΡ

C0 ΓΩ

Ο ΙΌ

ο ΙΌ

σ\ κΡ

σ ΙΌ

’Φ

V

’Φ

<Φ

’Φ

Φ

CN

10

CD

CO

C0

CO

C0

<0

CO

C0

<0

o CN

<Ο CN

σ

ΙΌ

LT1 γΜ

CN

ΙΌ CN

CO rH

CN CN

’Φ CN

ΓΩ γΗ

CN γΗ

γΗ

ΓΩ

'Φ

ι β

>

— 0

ο

β

Φ 1

β

ι Ή

1 ·γ4

0 Φ

φ

1 ·Η

í>t ι—Ι

γΗ

Ν >—¹ I

φ

γ—1

Ϊ>Ί γΗ

X 0

« 0

Φ Ν β

β

X 0

><! 0

0 Ν

Ό β ·Η

ra

ι—1

0 Ν

0

β φ

•Η 0 ι—1

0

β φ

β Φ

Ν

d d

£ Λ 0

X

J—}

Ν

ι—I

Ν

d d

0

π3

0

Φ

ή

Sl Ί-Ι

•Η β

Φ 0

0

Φ

0

Φ

>4 ·Η

ί>Ί ·Η

N

£

Ν

β

d £

Ν Φ -Η

β β

Ν

£

Ν

β

d £

Φ

ίΰ

0

r-i ·Η

β ι d

•η d

Φ

•Η

Φ

0

ι—1 -Η

ι—1 ·Η

β

C

υ

ί>4 γ4

ί>ϊ γΗ

Φ Η β

1—1

Ω

β

Κ*Ί «—1

<4 ιβ

c

β

0

β >4

0 >4

d ' 0

φ d

C

β

0

β >4

0 >4

0

υ

44

β d

φ d

ι cn ra

ra ι

•Η

0

β

β d

φ d

Φ

Φ 44

ι—1 4-)

ffi —* Ή

>4 CN

r—1

ι^-1

Ή

φ

φ β

ι—1 4-)

□

υ

£

d

ι—1 (D

0 Φ

> 1 ι

d η

β

£

d

ι—1 Φ

0 Φ

\rtf

'ίϋ

'ίΰ

'ίϋ

'Φ

'φ

'Φ

'φ

\φ

'Φ

'φ

'Φ

'φ

>

ί>

>

0

β

Η

•Η

Ή

•Η

Η

·π4

•Η

4J

β

44

β

φ

Φ

φ

Φ ,£

φ d

Φ d

φ d

β β

•Η Μ

Η kl

-Η £-1

•Η £-4

Ή ^4

-Η ^4

•Η $-4

Η £-4

•Η ^4

-Η β

•Η

-Η í-J

ι-Ι >1

.“4 J>1

ι—1 £>ί

ι—1 κΗ

ι—1 <*1

ι—1 ί>ι

ι—1

F^-1 ί>Ί

ι—ί

«—1

ι—1

1—1 Ϊ>Ί

ι—1

φ β

φ υ

φ β

Φ β

φ β

ra S

ra >ι

ra S

ra >ι

ra >4

ra >ι

ra

ra >ι

ra >4

m >ι

ra >4

>1 rH

>Ί 1-1

>11-4

>4 1-4

!>* γ-Η

!>< γ-η

κΗ γΗ

ί>Ί Γ“Η

Si γΗ

>Ί Γ-Η

!>ί γΗ

ί>Ί Γ-4

r-J

γ—1

d σι

β

*Η

•Η

Η

•Η

Ή

-Η

Ή

Γ-Η

ι—1

γΗ

ι—1

«—1

ι—1

0

d

υ

ο

β

ο

β

ο

β

γΗ

1—1

ι—1

ρ—1

ι—1

I-1

ι—1

γΗ

>4

κΗ

!>«

>ι

>4

κ*Ί

ί>1

d

Ό

d

•Η

Η

•Η

Ή

•Η

β

4->

44

β

Φ

φ

Φ

φ

β

44

β

Μ

ra

Μ

ra

m

ra

m

ra

0

44

β

<

Μ

«

ω

2

’ΓΗ

•γη

’Π

*ΓΗ

•γη

ΤΗ

.·

φ

Φ

φ

ΙΌ

γΗ

ι—1

i—1

ι—1

1—1

«—1

ω

0

φ

Φ

φ

'>Ί

'>4

'>1

'>4

'>Ί

φ

m

>

β

0

φ

Φ

φ

CN

β

CQ

•Η

Η

•Η

υ

β

d

rd

•Η

-Η

•Η

β

m

β

φ

Φ

···· ·· · · · <

• · · ’ • · · · • · · ·

39

56

n

46

⁵⁴

42

41

33

40

37

36

37

Ol Lf)

Lf)

l> Lf)

Lf)

39

39 -1

43 -1

43

40

24

rd

22

O I—1

O]

15

CN 1

LD

CO

LO

11

03

7H-benzimidazo - [2,1-a] benz [de] -isochinolin-7-on

miconazol

ketoconazol

1auryIhydroxyethylimidazolin

oleoylhydroxy- ethylimidazolin

7H-benzimidazo - [2,1-a] benz [de] -isochinolin-7-on

miconazol

oleoylhydroxy- ethylimidazolin

miconazol

oleoylhydroxy- ethylimidazolin

miconazol

oleoylhydroxy- ethylimidazolin

climbazol

kyselina glycyrrhet inová

kyselina glycyrrhetinová

kyselina glycyrrhet inová

kyselina glycyrrhetinová

kyselina ! glycyrrhet inová

amsacrin-HCl

kyselina glycyrrhet inová

fosfatidylcholin

fosfatidylcholin 1

1,2-dioktanoyl-sn- -glycero-3- -fosfoethanolamid

1,2-dioktanoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamid

echinacea

naringenin

palmitamidmono- ethanolamid

farnesol

geraniol

linoleoylmonoethano1amid (LAMEA)

···· «· 0 0 0 0 • · · · • · 0 ·

0*00 0

0 0 0 0 0 00 00 ··

LP	ο	Γ—1	ιη	σ>	ιη	ΟΙ	θ'	οι	40
η		^ί¹	η	ΓΟ	C0	C0	C0	C0	Φ
o	ο	ο	ο	ο	04	04	ΟΙ	04	04
Μ*	st*		χ	X		sT	sf	st<
Lf)	ο	CN I	LD	γΗ		Ο ι—1	LT>	γ—1 γΗ	1
				ι β
		β	β	γ-, Ο Φ 1					β
			1 Ή	ΟΤΐ					ί ·Η
		£>ί ι—ι	>ί r—1	Ν - 1					>Ί X
		X 0	X 0	Φ Ν β					0
		0 Ν	0 Ν	Τ β X		γΗ		ι—1	0 Ν
	0	β φ	Β Φ	•Η φ r—1		0		0	X Φ
	Ν	Τ Τ	X Τ	ε χ ο	ι—I	Ν	ι—I	Ν	τ τ
0	ίΰ	Ϊ>Ί ·Η	ί>Ί Ή	•Η γ—ι £	0	Φ	0	Φ	£>ί ·Η
Ν	β	χ ε	χ ε	Ν Φ X	Ν	ε	Ν	β	pd £
rú	ο	ι—ί -Η	rH Ή	β ι X	Φ	•Η	Φ	0	ι—1 ·Η
á	ο	ί>ι ι—1	Ϊ>ί r—1	Φ X Ο	Ο	44	β	υ	ι—1
0	0	(4 >ι	0 >ί	X - 0	ε	X	0	0	X >1
ο	X	β X	Φ X	1 04 03	•Η	0	Ο	X	β X
	φ	Φ 4-3	ι—1 -Ρ	X “ X	ι—1	«—1	•Η	φ	Φ χ
ε	X	ι—1 Φ	0 Φ	θ' 1 1	ο	υ	ε	X	1-1 Φ
'Φ	'Φ	'Φ	'φ	'Φ
>	>	>	>	>
0	0	0	0	0
β	β	β	β	β	ί—ί	1—ί	1—ί	γΗ	1-1
	Η	•Η	•Η	•Η	ο	υ	υ	υ	υ
4-)	X	X	X	4-3	X	X	X	X	X
<υ	Φ	Φ	Φ	Φ	1	ι	1	1	1
Φ X	Φ X	Φ X	Φ X	Φ X	β	β	β	β	β
Π X	β Β	β β	β χ	β X	Ή	Ή	•Η	Ή	Ή
		Η Μ	-Η β	•Η Ρ	β	44	β	X	X
	γΗ	ι—1	1—I Κ*Ί	ι—1 £*1	ο	ο	ο	ο	ο
0) ο	φ ο	Φ ο	φ ο	Φ ο	φ	Φ	φ	φ	φ
ω S	03 S	03 >ι	0! >ι	03 >ι	03	0!	ω	03	03
	ί>Ί ΓΗ	S	£*ί γ—1	£>ί γ—1	ε	ε	ε	ε	ε
χ σι	λ: σ3	χ σι	χ σ3	χ σι	φ	φ	φ	φ	φ
β Τ	β τ	β τ	β τ	β τ	β τ	β τ	β τ	β τ	β τ
ω ·η	0) -Η	ω χ	01 X	01 -Η	ω χ	03 X	01 X	03 X	03 X
ι ε	ι ε	ι ε	ι ε	ι ε	ι ε	ι ε	ι ε	ι ε	ι ε
		ι—1 (Τ5	ι-Η fÚ	γ—ι (Ό	<—1 π3	I-Η Φ	ι—ι Φ	X Φ	γ4 Φ
	£>ί r-H	rH	Κ*Ί γΗ	ι—1	γ—ι	>1 1-4	Ϊ>1 X	1—1	ί>ι γΗ
0 0	0 0	0 0	0 0	0 0	0 0	0 0	0 0	0 0	0 0
β I β	β I β	β 1 β	β 1 β	β 1 β	β 1 β	β 1 β	β 1 β	β 1 β	β 1 β
Φ οι Φ	ni rn íd	Φ η Φ	Φ η Φ	Φ η Φ	Φ ω Φ	Φ m Φ	Φ ΟΙ Φ	Φ η (ϋ	Φ η Φ
1)1 Γί	X 1 X	X 1 X	X 1 X	4-3 1 X	4-3 1 X	X ι X	X 1 X	X ι X	X ι X
2 Ο J	X 0 X	β 0 43	X 0 4-3	X 0 4-3	X 0 X	X 0 χ	X 0 X	χ ο χ	X 0 X
0 X Φ	0 X Φ	0 X Φ	0 X Φ	0 X Φ	0 X Φ	0 44 Φ	0 X Φ	0 X Φ	0 X Φ
X Φ 0	•Η φ 0	•Η φ 0	Η φ 0	-Η φ 0	•Η φ 0	•Η Φ 0	•Η Φ 0	X Φ 0	χ φ 0
Ό U +	τ ο χ	Τ Ο +4	Τ ο χ	Τ 0 X	Τ 0 +4	τ ο χ	Τ Ο X	Τ Ο X	Τ 0 χ
ι >ι 03	1 >1 03	1 >1 03	1 >1 03	1 >, 01	ι 0!	1 >, 03	1 >1 03	1 >1 03	1 >ι 03
	CM r—1 0	Γ4 Η 0	CN r—1 0	CN ι—1 0	CN γΗ 0	CN γ—1 0	04 X 0	04 X 0	04 X 0
- ΟΠΜ-Ι	- σι +4	- σι +4	- cn mm	·- σι μ	- σι χ	- σιχ	- 07Χ	- σιχ	' σιχ
γΗ 1 1	ι-Η 1 1	γΉ 1 1	X I 1	τ—1 1 1	ϊ—1 1 I	γΗ 1 1	X 1 1	γΗ 1 1	γ-1 1 1
1 0	1 0	1 0	1 0	1 0	1 0	1 0	1 0	1 0	1 0
β	β	β	β	β	β	β	β	β	β
ο Τ	0 Τ	0 Τ	0 Tl	0 τ	0 τ	0 τ	0 τ	0 τ	0 τ
ε ·η	g X	ε χ	£ *d	£ ‘EÍ	ε χ	ε ή	ε ·η	ε 'd	ε χ
ι—ι ε	χ ε	γ—ι ε	r—ι ε	*—ι ε	t—ι ε	ι—ι ε	γη ε	γ—ι ε	ι—ι ε
>ι Φ	>Ί Φ	>1 Φ	>1 Φ	>1 Φ	>1 Φ	>1 Φ	>1 Φ	>1 Φ	>1 φ
0 rH ρ—.	0 ι—1	0 ι—1	0 —Μ -	0 ι-H	0 γΗ χ—	0 γ—! χ---*	ΟΧ'-'	ΟΧ'-'	ΟΧ'^-'
Φ 0 <	Φ 0 <	Φ 0 <	Φ 0 <	Φ 0 <	Φ 0 <	Φ 0 <	Φ 0 <	Φ 0 <	Φ 0 <
X β Κ	Η β W	Η β Η	i—1 β W	ι-H β Μ	ι-Ι β Μ	χ β ω	X β Μ	χ β ω	X β Η
ο φ 2	0 Φ 2	0 Φ 2	0 Φ 2	0 Φ 2	0 Φ 2	0 Φ 2	0 Φ 2	0 Φ 2	0 Φ 2
β X S	ββ	β X <	β χ 2	β X 2	β X S	β χ 2	β X S	β χ 2	β X 3
Η U J	Η 43 J	Η 43 4	•Η 43 4	-γ4 4-> X	•Η 43 4	•Η X 4	XXX	XXX	XXX
1—( 0)	ι-Ι φ	Γ—t 1) *	ι—1 (U	ι—1 (1)	1-4 φ —	Η φ	1—1 φ *	ι—1 Φ ' *	ι—1 φ

t, ·· · · · · ···· « · · · · · • · · · · · • · · · · · · · • · · · · · · * ·· ·· ·· ··

η

35

30

40

37

34

33

45

52

r- in

1541

51

42

co

43

48

co

48

55

ιη

co

¹³

11

¹³

15

CO

CM 1

rH

oleoylhydroxyethylimidazolin

7H-benzimidazo -[2,1-a]benz[de]-isochinolin-7-on

miconazol 1

oleoylhydroxyethylimidazolin

miconazol 1

ketoconazol

laurylhydroxy- ethylimidazolin

o1eoy1hydroxy- ethylimidazolin

kyselina 12-hydroxystearová

1 climbazol

[miconazol

1 ketoconazol

laurylhydroxy- ethylimidazolin

amsacrin-HCl

amsacrin-HCl ..

amsacrin-HCl

amsacrin-HCl I

amsacrin-HCl

carbenoxolon

| carbenoxolon

carbenoxolon

1,2-dioktanoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamid

fosfatidylcholin

| fosfatidylcholin

fosfatidylcholin

linoleoylmono- ethanolamid (LAMEA)

linoleoylmonoethanolamid (LAMEA)

palmitamidmonoethanolamid

b 0 o ra β 6 β mi 1 a

a-damascon

β 0 o ra β e β ι d

ricinový olej MEA

• · ···· ·· ···· « · · · · · • · · · · · · » 9 9 · · · · • · ·« ·· ··

(N

γΡ

νο

ΟΝ

ο

ΓΩ

CN

sP

ο

^Ρ

ΙΌ

o

ΓΩ

ω

sp

ΧΡ

ΓΩ

ΓΠ

γω

ΓΩ

SP

Ν¹

ΓΩ

^Ρ

ΓΩ

LO

ΙΌ

ο

Ο

Ν¹

co

00

<Ρ

co

C0

00

C0

ΙΌ

^Ρ

φ

'φ

sp

^Ρ

Μ*

ΙΌ

Ν¹

SP

<Ρ

Ρ

P

Ρ

Ο

sP

CN

'Ρ

Ο

CN

1—I

ρ

ω

rd

1

rd

ο

rd

\φ

>

ι d

0

ι—1

d

ι—1

Γ-> Ο

d

ο

•rd

0

£

φ 1

•rd

Ν

d

rd

Ν

0 73 Γ-

Ό

Φ

1 Ή

0

Φ

Ν --¹ 1

•Η

•r|

ί>ί ι—1

d —

•Η

X 0

(ϋ ν d

Φ

μ

X ο

•rd rd

μ

0 Ν

τ3 d ·μ

1—1

μ

0 Ν

χ ·μ

μ

μ φ

•Η φ Η

φ

0

μ φ

υ μ

0

X 73

ε χ ο

rd

ι—1

rd

d

Ν

ι—1

73 73

>4 >4

Ν

>Ί ·Η

0

φ

•rd

ΰ

0

rd Ή

X μ

d

γ! p

Ν Φ -μ

Ν

d

44

d

φ

Ν

χ ε

0 Φ

φ

d 1 X

Φ

,Φ

•Η

Φ

•rd

X

Φ

ι—1 ·Η

μ ο

χ

>4 Γ-)

φ Η O

X

η

ι—1

ϋ

μ

0

X

d

ί>ι ι—1

73 χ

ο

0 >4

XI - 0

Ρ

ρ

ΐ

C

φ

μ

φ

ΰ

ε

0

0 >4

>4 μ

d

φ X

ι CN CD

ό

0

ω

φ

ε

•ri

•Η

υ

Φ X

X Φ

•rd

χ ·— ·μ

rd

1—1

rd

ϊ>

d

ε

rd

•rd

ι—1 4-)

ι ο

ε

ο φ

> 1 1

υ

0

X

φ

0

ε

0 Φ

CN

φ

\φ

'φ

'Φ

'φ

>

!>

>

0

'Φ

μ

ι—1

rd

μ

ι—1

1-1

1—1

>

ω

>d

>4

φ

0

•rd

X

φ

£

d

ι—1

1—1

1—t

d

μ

0

μ

0

o

•Η

•rd

-Η

υ

•Η

>ρ

X

Φ

ί—1

ι—1

)—1

\φ

X

μ

ε

μ

'Φ

0

o

>

1

Φ

φ

ί>

χ

X

Φ

Φ 0

d

Φ X

φ

Φ χ

Φ 0

0

o

d

d d

•rd

Ή

d μ

d

d -μ

d d

ΰ μ

δ

d

•Η

rd

•rd

Η φ

μ

-μ μ

•rd

-μ 73

•μ τ3

•rd Ή

-μ 73

φ

ι—1

rd

1—1 I—1

ο

υ

rd Si

ι—1

r4 d

rd β

rH 73

ι—1 rd

X

X!

φ

Φ 0

φ

φ σ

Φ

φ φ

φ -Η

Φ X

μ

ω

φ

ω d

ω

φ

Φ >4

φ

Φ X

Φ Φ

Φ 1

π3

>1

>4

£>ι -Η

ε

rd rd

Ι>ί

>4 φ

£>3 1—I

>4 CN

ϋ

υ

X

X r4

φ

χ σι

X

X X

X Φ

X γ4

d

ΰ

d

rd

•Η

Ή

•Η

•rd

'Φ

rd

ι—1

>

0

X

X!

X

d

υ

U

υ

•rd

γ—1

1—1

γ—1

rd

μ

ί>Ί

rd

!>d

Φ

73

X

Ό

Φ X

•Η

Ή

•Η

•rd

•Η

d

d μ

μ

44

•rd

•rd Jd

Φ

ι—1

ι—i

ι—1 rd

4-1

44

•rd

Φ υ

ω

Φ

Μ

Φ

υ

d

υ

ω ><

0

υ

φ

υ

rd r-d

44

Ε4

Η

Ε4

Η

Ε4

>

í>

Η

χ σ

d

ω

Η

•rd

S

d

φ

•rd

•Η

0

•m

’ΓΊ

ω

Φ

σ

D

φ

0 —

d

d —

«.

d —

rd

ι—1

στ3

3ιΧ

0

1

0

•μ 73

ΙΌ

-μ τ3

0

d

d -μ

d ·η

d

ε d

d

μ -η

d

X

44 -μ

Η

•Η Η

•η ε

1 ·Η

-μ ο

ι -μ

φ ε

0

φ ε

'>4

'ίμ

d

1—1

44 Φ

rd rd

r-d £

r-d rd

rd ÍÚ

ο

sP

d

rd Π3

>

φ

0

ω μ

>4 0

rd Ή

>4 0

>ι μ

φ

X

•Η

ίμ μ

0

σ

-rd

ι—1 φ

I—1 φ

X Ν

X r4

X Ν

0 Φ

φ

μ

0 Φ

d

ΰ

>4 U

44 φ

44 0

44 φ

d υ

ε

CN

i—1

rd

Φ

d υ

Ή

Η

•Η

φ

44 1

Φ X

φ Ν

Φ 73

Φ 1

φ

X

Φ

ϋ

Φ 1

υ

μ

Φ CN

ε ·η

ε φ

ε -μ

X νο

73

μ

0

X VO

Η

•Η

φ

υ υ

ϋ υ

ή ε

•μ 73

ή ε

Φ υ

1

rd

!>ί

>4

μ

Φ υ

μ

d

σι

φ —

Φ

73 ·Η

73 ·μ

τ3 -μ

χ —

Β

X

rd

υ

X ~

• ♦ · ♦ ♦ · • · ··· · • ·

·· ····

CN	σ	ιη	CN		4φ	o	^P		O	r4	v
	Γ0	cn	in	co	cn	šP	co			V
V		'Φ			SP		O		r·	θ'	Γ4
	ΈΡ	SP		V	'φ	v	co			V	sP
CN	LD	σ	00 1	O rd	o rd		’φ 1		C	10	cn
i C	i g	i g	i g	i g	i g	i g
		<—> o	r-n O	r-, O	— o	0
O) 1	Φ i	Φ 1	Φ 1	Φ 1	Φ 1	Φ 1					g
0 X O	0 Ti >	obr-	o x i>	0 X >	0 X o	0 x >					1 *rl
N ¹ i	N —¹ i	N '-J i	N 1	N 1	N *—¹ 1	N 1					i—1
rd cn g	rd n g	(d n g	td n g	rd n g	rd n g	rd n g					X 0
x g -η	X g -g	x g ή	X g -η	X g -η	x g -g	x g -g				I—l	0 N
H (D H			•rl 0 i—1	•Η Φ rl	•rd (D i—1	•rl (D i—1				0	g rd
e x o	£ X 0	£ Λ 0	£ X 0	£ X 0	£ X 0	£ X 0	1-1		i—I	CN	X X
•η i—i g	.,-1,-, Γ!	-η , g	•g Γ-, g	•rl r—t Ch	•g i—, g	•g --4 g	0		0	(ti	*rd
N ií -H	CN (ti -g	N (d -H	N (ti -H	N rd -H	N (ti -g	n <d -g	CN		N	g	X £
g i x	g i x	g i x	g i x	g i x	g i x	g i x	(ti		id	0	i—1 *rd
(1) H U	(1)4 0	Φ r4 U	Φ r4 O	φ η υ	φ g o	φ Η Φ			g	o	i—1
X - 0	X - 0	X - 0	X - 0	X ' 0	X - 0	X - 0			0	0	0 Ι>Ί
i cn ra	i cn ra	i cn ra	i cn ra	i cn ra	i cn ra	i cn ra	•rd		υ	P	Φ X
X *—¹ -g	X —‘ -H	X —‘ -H	X ^{1—J -}g	X —¹ -H	X — -g	X ⁱ—' -g	rd		•rd	φ	i—1 4-)
O l l	r- i i	Γ- l 1	> 1 l	l> 1 1	> 1 1	> 1 1	u		£	X	0 Φ
\rti	\(d	'fd	'(ti	'ftí	'(ti	'td
>	>	>	>	>	>	>
0	0	0	0	0	0	0
g	g	g	g	g	g	g
cti	rd	<d	(ti	rd	rd	(ti
(1)	ra	Φ	Φ	Φ	Φ	φ
p	P	P	P	P	P	P
ω	ra	ra	m	ra	ra	ra	'(ti		'(ti	X	'rd
	>4	>4			>4	>1	!>		>	>	!>
rd X	rd X	rd X	rd X	rd X	(ti X	(ti X	rd 0		rd 0	(ti 0	rd 0
g ó	g o	g o	g o	g o	g o	g o	g g		g g	g g	g g
			Ή <d	•rl íd	•rl (“d	•rd M	•rd Ή		•rd Ή	•rd «rd	•rd *rd
i—1 X	r4 X	r4 X	r4 X	r4 X	r4 X	r4 X	r4 X		r4 X	r4 X	Γ-l X
Φ >i	Φ >4	Φ >4	Φ >4	Φ >4	Φ >4	Φ >4	Φ -g		Φ -g	Φ -g	(V «rd
ra X	ra £	ra X	ra x	ra x	ra x	ra x	ra rd		ra rd	ra rd	ra rd
>i 1	>4 1	>4 1	>4 i	>4 i	>4 1	>4 1	i—1		r**! «—1	1—1	rd
X cn	x cn	X CN	X CN	X CN	X CN	X CN	X Φ		X Φ	X Φ	X Φ
g	g	g	g	g	g	g	g
•rl	Ή	•rd	•rl	•rd	•rd	•rd	•rd
		i—I	r-1	i—1	rd	i—1	i—1
0	0	0	0	0	0	0	0
x	X	X	X	X	X	X	X		i—1	i—1	rd
o	0	o	0	0	u	0	υ		cj	o	CJ
	rd	rd	i—1	i—1	i—1	i—1	i—1		X	X	X
	>4	>4	>4	>4	>4	>4	>4		1	1	1
X	X	X	X	X	X	X	X		g	g	g
	•rd	•H	•rd	•rd	•rl	•rd	•rd		•rd	•rl	•rd
P	P	P	P	P	P	P	P		g	g	g
rd	(d	rd	rd	(ti	id	rd	rd		υ	υ	υ
44	44	44	44	44	44	44	44		id	rd	(ti
ra	ra	ra	ra	ra	ra	ra	ra		ra	ra	ra
0	0	0	0	0	0	0	o		£	£	£
44	44	44	44	44	44	44	44		rd	(ti	rd
		i—1	g	g			g
		0	1 Ή	•rd			1 Ή
		•rd	t>4 r—1	ra			i—1
g		g	X 0	0 —		1 H	X 0		g	g	g
o		rd	0 N	cnx		rd Q	0 CN	LO	0	0	0
g		g	g id	g -rl		ί>Ί	g rd	m	g	g	g
I ·Η	X	φ	X X	•rd £		X	X X		I Ή	1 -rd	1 -rd
rd r-d	•rd	cn	1>4 -H	44 (ti	g	P X	I>4 -g	XP	i—1 i—1	i—1 i—1	i—1 rd
>4 0	£	i—1	X £	ra g	•rd	Φ -g	X £	X	>4 0	>4 0	>4 0
X N	id	>4	rd Ή	r~i 0	P	•rd £	r4 -g	\	X N	X N	X N
p (d	g	g	£>-i rd	>ι υ	Φ	X (ti	I—1	cn	P (ti	P rd	P (0
0) X	Ή	rd	0 >1	P l	□	i 0	0 >4	X	Φ X	Φ X	Φ X
£ ·Η	i—1	g	X X	Φ CN	0	S X	X X	\	£ -rd	£ -H	£ -H
•H £	Φ	φ	0 P	0 CJ	g	- 0	0 P	H	•rd £	•g c	•rd £
X -H	ε	cn	X Φ	(ti	u	S X	X Φ	X	X -g	X -g	X -g

·· ··· · • ♦ · • · * • · · • · · · ·♦ ·· • « ·· · · ♦ · · • · · » · · · • · · · • · · · ·« · · ·

Ν’

ΓΟ

ω

C0

ο

CN

Ν’

CO

γΗ

CN

co

Ν’

C0

Ν¹

Ν’

ιη

co

ΓΟ

co

ΓΟ

C0

X

Ν’

00

C0

γΗ

ω

Γ

[-

Lfl

ιη

Ν'

Ν’

γο

CN

m

C0

m

ΓΟ

O

Ο

LT)

ο

CN

γΗ

10

χ

ΙΟ

ιο

ιη

CN

rd

CN

1

β

Ή

•Η

Ή

-Η

β

X

rH

ι—1

γΗ

β

0

1 ·Η

ΐ>1 γΗ

γΗ

β —

£>ί ι—1

>Ί X

X 0

•Η ι—1

Η »—1

X 0

0 Ν

X X

χ χ

ι—1

0 Ν

0

β β

0

β β

N

X X

>1 >1

ϊβ

£β £β

Ν

X X

ι—1

X X

0

(>Ί Ή

X X

χ χ

X χ

X X

β

!>ί Ή

0

·γ1

β

Ν

d Ρ

χ ε

0 β

0 ω

0 β

β

X £

Ν

χ ε

π3

ι—1 Ή

β 0

0

ι—1 Ή

β

ι—1 ·Η

β

£

£>ί χ

X X

β

<—*

β

γ-Η

4-)

0

β >1

0 >1

ίβ β

£β β

Š β

β

0

0 >1

0

0 >1

0

υ

β X

X β

χ

β X

β

β X

ι—1 4~)

ι ο

ι Ο

1 β

β

rH 4-)

X

ι—1 4-J

β

ε

ι—1 CD

0 β

CN

X

0 β

£

0 β

\β

'β

>

ί>

0

β

\Í0

'cd

'β

X

>

ί>

'β

>

β

0

>

ί>

>

ί>

0

£>ί

β β

β 0

β β

β X

β β

β 0

•Η β

Η β

•Η (ϋ

•Η ·Η

Η Ή

•Η ·Η

χ β

•Η Q)

X β

•Η Μ

X X

ι—1 4-)

X X

ι—1 4-)

χ X

X X

β ω

β 03

β X

β β

β >1

ω ο

03 0

ω ο

β 0

β β

β 0

β X

>ί ω

ί>ι 03

>1 03

>1 β

Ιβ X

κΌ «—1

ι—1

rH

>. β

>1 β

>1 ι

š 1

X ·β

Λ4 ·Η

X χ

X β

χ χ

X CN

\(ΰ

'β

Q

κ 0

'β

>

1—1

X

>

0

ο

0

β

'β

Ή

•Η

Ή

•Η

Ή

0

•Η

ί>

> —

X

ι—1

'β

ι—1

X

0 ι-Η

0 ιΗ

β

>

0

β

β ’β

β «β

β X

β

β 0

β

X

β X

β 0 β

β β

β

β β

β

0

β β

β X

•Η β

-Γ-) ^-J

Ή

X β

•Η

β

•Η {-Ι

•Η

•Η ·Η \(ΰ

Η Ή \(ΰ

X >ι

ι—1

1—1 Ϊ>Ί

ι—1 >ι

X

ι—1 ι—1

I—1

β

ι-Η >ο

ι—1

X X β

χ χ β

β Ο

β β

β υ

β

β 0

β

X

β β

β β X

β β χ

ω >.

03

β >1

β

β β

β

β >1

β β 0

£>Ί 1—1

!>ί γ-η

>1 γΗ

ί>Ί γΗ

!>ι

ί>Ί ·Η

£β

β

2ι X

γΗ

β β

>1 β β

χ σι

χ σ

X

χ χ

X

β

χ σ

X β —

X β —'

β

χ

•Η

ω

•Η

β

01

β

03

β

S

β

1 £

ι ε

•Η

0

1 -Η

X 1 β

ι—1 ι π3

ι—1

σ

ΤΟ

>Ί X

rN CO X

S η χ

0

β —

β

X 0

··

0 1 0

ο ι ο

X

•Η X

•Η χ

X χ

ι—1

0 Ν

ιη

β 0 β

β Ο β

β

X -Η

X X

0

β β

W

β β β

χ

ι—1

03 £

β Η

β ε

β £

X X

\

X β X

κΝ

ι—I π3

ί—1 Π5

ι—1 (0

ι—ι ίΰ

β

£>1 ·Η

Ν’

X β X

X

£β β

>1 β

>Ί β

•Η

>

X £

m

0 X β

0 >1 β

•Η

Ή

0 β

X

0

Η ·Η

Ή Η 0

Η γ-1 0

X

β 03

β υ

β

1—1

ΓΟ

χ σχ

β

β I

β 1

υ

Ή

0 >1

m

1 1 β

X

X ιο

X <ο

X νο

0

β

X X

CN β 0

β

β U

β

•Η

0 X

CN

> β χ

· β χ

0

X —

X ~

X —

0

β

X β

m

ι—Ί 1 1

γΗ 1 1

X

Lf) l>

O>	C0	ΙΟ	Ο>	ΓΩ	Ο]
Φ	γω	ΓΩ	φ	ΓΩ	ΓΩ
Lf)	Lf)	Φ	φ	ο	ο
Φ	Φ	φ	Φ	ΓΩ	00
r-l 1	Ο-	CO	ΓΩ I	ΓΩ 1	(Ν 1
		1 β	1 β
		_ ο	—. ο
	β	φ 1	Φ 1
	1 ·Η	ο β >	0 β ο
	rd	Ν 1	Ν >—¹ 1
	!*; ο	(ti Ν β	(ΰ Ν β
	0 Ν	β β Ή	β β Ή
	β β	•Η φ Η	•Η φ ι—1
	β β	ε β ο	ε β ο	ι—1	γ—1
0	Ϊ>Ί -Η	•Η ι—i p	•Η r—ι £j	0	0
N	β ε	Ν (ti -Η	Ν (ΰ -Η	Ν	Ν
(ti	ι—1 ·Η	β 1 β	β ι β	(ti	Φ
β	ί>Ί ι—1	φ Η Ο	φ Η U		X}
0	0 >1	β - 0	β ' 0	Ε	έ
u	<υ β	1 04 03	1 04 03	•Η	Ή
•H	ι—1 -Ρ	Κ *- -Η	W — ·β	ι—1	«—1
£	0 Φ	Ο- 1 1	Γ- I ι	υ	υ
		'(ΰ	'(ti
		>	>
		0	0
		β	β
		(ti	(ti
		Φ	φ
		β	4-1
Ό	*ΓΊ	03	ω	'β	'(ΰ
Φ	Φ		ί>1	>	ί>
	ι—1	(ti χ	(β Μ	(ti 0	(ΰ ο
0	0	β 0	β 0	β ΰ	β β
		Η Ρ	Ή Η	•Η ·Η	Ή Ή
'>Ί	'>Μ	r-l β	γ—1 β	ι-4 β	β β
β	β	Φ >1	Φ >ϊ	φ -Η	φ ·Η
>0)	>φ	ω β	03 β	03 (0	CQ (ti
β	β	>1 1	ϊβ 1	κΗ ι—1	£>ί «Η
r—1	Γ—1	β οι	β 04	β φ	β φ
			'(ti		'(β
			>		>
'(ti	'(ti		0	'(ti	0
>	>		1—1	>	ι—1
o	0		0	0	0
β	β	β	β	β	β
Ή	•Η	0	•Η	•Η	•Η
β	4-1	ι—1	ι—i	β	ι—1
<υ	Φ	0		φ
<ΰ β	(ΰ β	X	(ti	(ti β	(0
β β	β β	0	β	β β	β
•Η Ρ	•Η Μ	β	•Η	•Η Η	Ή
ι—1 Ϊ>ί	ι—1 S	φ	ι—1	ι—1 £*ι	ι—1
ο υ	Φ ο	β	Φ	Φ U	φ
Μ	03 >1	β	03	03 >4	(13
1>ί γ—ι	ί>Ί Γ-Η	(ΰ	ί>Ν	ί>Ί Γ“1
β tm	14 σ	ο	β	β σ	β
β	β
•Η	Η	β	β	β	β
ι ε	ι ε	•γΗ	•Η	•Η	•Η
γΗ ι π3	1—1 1 ίΰ	ι—1	γΗ	ι^-1	ι—1
ί>Ί ΓΩ ι—1	>\|C0 Η	0	0	0	0
0 1 0	Ο 1 Ο	β	β	β	β
β 0 β	β 0 β	ο	(1	0	υ
(0 β (0	(ti β (ti	ι—1	ι—1	ι—1	ι—1
4-1 4) β	4-1 Φ β			>4
14 0 4-1	β υ β	β	β	β	β
ο β ι>	Ο >1 Φ	•γΗ	Η	Ή	•Η
•Η ι—1 0	•Η Η 0	4-1	β	β	β
β trm	β Οΐβ	(ti	(ΰ	(ΰ	(0
ι ι οι	ι ι οι	44	4-4	β	β
04 β 0	04 β 0	(0	(Q	ω	03
» (13 44	- 03 β	0	0	0	0
Η 1 1	γΗ 1 1	4-4	44	β	β

co (0

οι	Η •Η σ β φ
	rd
Η	β	β
υ	Ή	>1
φ	β	03
β	φ
•Η	>υ	'(ti
Ο	β	β
£	0	Φ
0	γΗ	ε
β	(11	(β
Ή	Η	β Ν
β	(1
β	(ti	ο\°
φ	β
β	Η	ο
β	Ο	C0
(ΰ >	0	>Ν
β	β	Φ
0	0	β
β	β	Ή
Οι	η >03
Φ	Φ	>03
υ	υ	>
•Η	•Η
β	β	-
•Η	•Η	I—1
β	β	Ή
β	β	β
•Η	•Η	Ν
ο\°	oV>	0 β
1,	II	II

< ffl O

9999 ·· 9999

Kosmeticky přijatelné nosné prostředí

Prostředek podle vynálezu obsahuje také kosmeticky přijatelné nosné prostředí, které je ředidlem, dispergačním prostředím nebo nosičem pro účinné složky prostředku k usnadnění jejich roztírání na pokožce.

Kromě vody může nosné prostředí obsahovat kapalné nebo pevné změkčující látky, rozpouštědla, zahušťovadla, zvlhčující látky a práškové materiály. Zvláště výhodným nevodným nosičem je polydimethylsiloxan a/nebo polydimethylfenylsiloxan. Je možno použít silikony s viskozitou 0 až 10 000 000 cS při teplotě 25 °C. Zvláště výhodné jsou směsi silikonů s nízkou a vysokou viskozitou. Tyto silikony je možno získat od General Electric Company pod obchodními názvy Vicasil SE a SF a od Dow Corning Company v sériích 200 a 550. Prostředek podle vynálezu může obsahovat 5 až 95, s výhodou 25 až 90 % hmotnostních silikonu, vztaženo na celkovou hmotnost prostředku.

Případné přídatné kosmetické složky

Kromě svrchu uvedených složek může prostředek obsahovat ještě olej nebo materiál olejové polohy spolu s emulgátorem tak, aby bylo možno připravit emulzi typu voda v oleji nebo olej ve vodě v závislosti na hydrofilní-lipofilní rovnováze HLB použitého emulgátoru.

V prostředku podle vynálezu je možno použít ještě různé typy dalších účinných složek. Jde o látky, příznivé pro stav pokožky nebo vlasové části hlavy nebo o složky, ·· ··· · které chrání pokožku proti vlivu slunečního záření, prostředky pro zesvětlení pokožky a podobně.

Látky pro ochranu před slunečním zářením zahrnují běžné materiály, které blokují ultrafialové světlo. Jde o deriváty kyseliny p-aminobenzoové, skořicové a salicylové. Je například možno použít oktylmethoxycinnamát a 2-hydroxy-4-methoxybenzofenon, označovaný také jako oxybenzon. Oktylmethoxycinnamát a

2-hydroxy-4-methoxybenzofenon se běžně dodávají pod obchodními názvy Parsol MCX a Benzophenone-3.

Množství látky pro ochranu před slunečním zářením se může v emulzi měnit v závislosti na požadovaném stupni ochrany.

Další výhodnou případnou složkou mohou být esenciální mastné kyseliny, to znamená ty mastné kyseliny, které jsou podstatné pro tvorbu plasmatické membrány všech buněk, v případě nedostatku těchto kyselin u keratinocytů dochází k proliferaci těchto buněk. Tuto příliš vasoké proliferaci je možno napravit přídavkem esenciálních mastných kyselin. Tyto kyseliny také podporují biosyntézu lipidů v pokožce, takže je k dospozici dostatek lipidů pro bariérovou funkci epidermis. Z esenciálních mastných kyselin je s výhodou možno použít kyselinu linolovou, γ-linolenovou, homo-γ-linolenovou, columbinovou, eikosa-(n-6,9,13) -trienkarboxylovou, arachidonovou, tinmnodonovou, hexánkarboxylovou a směsi těchto kyselin.

Prostředek často obsahuje také změkčovadla. Tyto látky je možno použít v množství 0,5 až 50, s výhodou 5 • 0 ···· • 9 9999

9 9 9 9 9 9 9 9 9 až 30 % hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost prostředku. Může jít o estery, mastné kyseliny, alkoholy, polyoly a uhlovodíky.

Z esterů je možno uvést monoestery nebo diestery.

Jako příklad diesterů je možno uvést dibutyladipát, diethylsebakat, diisopropyldimerát a dioktylsukcinát.

Jako příklad rozvětvených esterů lze uvést

2-ethylhexylmyristát, isopropylstearát a isostearylpalmitát. Z dalších esterů může jít o triisopropyltrilinoleát a trilaurylcitrát. Přijatelné estery mastných kyselin s přímým řetězcem jsou například laurylpalmitát, myristyllaktát, oleylerukát a stearyloleát. Výhodnými estery jsou směs kokokaprylátu a kaprátu, dále je možno použít propylenglykolmyristyletheracetát, diisopropyladipát a cetyloktanoát.

Výhodné mastné alkoholy a kyseliny zahrnují sloučeniny, obsahující 10 až 20 atomů uhlíku. Zvláště výhodné jsou cetyl-, myristyl-, palmityl- a stearylalkoholy a odpovídající kyseliny.

Z polyolů, které mohou sloužit jako změkčovadla jsou výhodné zvláště alkylpolyhydroxylové sloučeniny s přímým nebo rozvětveným řetězcem. Výhodné jsou například propylenglykol, sorbitol a glycerol. Vhodné jsou také polymerní polyoly, jako polypropylenglykol a polyethylenglykol. Butylenglykol a propylenglykol j sou výhodnými látkami, usnadňujícími průnik prostředku do pokožky.

Jako příklad uhlovodíků, použitelných jako změkčovadla je možno uvést uhlovodíky s obsahem 12 až 30 ·« «»»· ·· 9999

9 9

9 9 9

9 99 atomů uhlíku. Příkladem může být minerální olej, vazelína, skvalen a isoparafiny.

Další kategorií funkčních složek, které mohou být obsaženy v kosmetických prostředcích podle vynálezu jsou zahušťovadla. Zahušťovadlo bude obvykle obsaženo v množství 0,1 až 20, s výhodou 0,5 až 10 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost prostředku. Příkladem zahušťovadel mohou být zesítěné polyakryláty, dodávané pod obchodním názvem Carbopol (B. F. Goodrich Company) . Je také možno použít různé gumy, jako xanthan, carrageenan, želatinu, karayu, pektin a guma ze svatojánského chleba. Za určitých okolností může být funkce zahušťovadla splněna také přítomností materiálu, který současně slouží jako silikon nebo změkčovadlo. Může jít například o silikony s viskozitou vyšší než 10 cS a některé estery, jako glycerolstearát s dvojí funkcí.

Do kosmetického prostředku podle vynálezu je možno zařadit také práškové materiály, jako křídu, mastek, infusoriovou hlinku, kaolin, různé škroby, smectit, chemicky modifikovaný křemičitan hořečnatohlinitý, organcky modifikovaný montmori Honit, hydrát ováný křemičitan hlinitý, pálený oxid křemičitý, oktenylsukcinát hlinitý, odvozený od škrobu a směsi těchto látek.

Prostředek může v menším množství obsahovat ještě další složky, běžně užívané v kosmetických prostředcích. Může jít o barviva, parfémy a látky, zajišťující neprůhlednost prostředku. Tyto složky mohou být obsaženy v množství 0,001 až 25 % hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost prostředku.

f ·· ·· * * ·· ·*·· * ·

• · · • · · · ·« ·«

Použití prostředku

Prostředek podle vynálezu je určen pro místní podání - na lidskou pokožku, zvláště pro prevenci tvorby vrásek a stárnutí pokožky nebo pro zlepšení těchto jevů.

K tomuto účelu se na příslušnou oblast pokožky nanese 1 až 5 ml prostředku a pak se prostředek roztírá a/nebo vetře do pokožky obvyklým způsobem.

Formy výrobku a balení

Prostředek pro místní podání podle vynálezu může být zpracován na emulzi, polotuhý krém, krém nebo gel. V závislosti na této formě může být prostředek balen do obalů, vyhovujících z hlediska jeho viskozity. Například emulzi nebo kapalný krém je možno balit do lahviček nebo do aplikátorů, opatřených kuličkou, do kapslí nebo do aerosolových nádobek s hnacím plynem nebo do nádobek, opatřených čerpadlem, uváděným do činnosti ručně. V případě krému je možno prostředek uložit do nedeformovatelné lahvičky, tuby nebo kelímku, opatřeného víkem.

Claims

PATENTOVÉ <»· • · #

·· · · ·« ·*» · » « · « · · • « 0 · ♦ · • · · · · · · • « · · ···· ♦ · ·· ·· ·«

NÁROKY

1. Prostředek pro péči o pleú, vyznačuj ící se t ί τη, že obsahuje

a) 0,001 až 10 % retinoidu,

b) kombinaci alespoň dvou zesilovačů účinku retinoidu ze skupiny B1 až B5 v množství 0,0001 až 50 %, přičemž vzájemný poměr dvou zesilovačů je v rozmezí 1:1000 až 1000:1,

c) kosmeticky přijatelné nosné prostředí.
2. Prostředek podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že kombinace zesilovačů obsahuje alespoň tři zesilovače ze skupin B1 až B5 v množství 0,0001 až 50 %.
3. Prostředek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že obsahuje kombinaci alespoň čtyř zesilovačů ze skupin B1 až B5 v množství 0,001 až 50 %.
4. Prostředek podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že obsahuje kombinaci všech pěti skupin zesilovačů B1 až B5.
5. Kosmetický způsob péče o pleť vyznačuj ící se t í m, že se místně nanáší prostředek podle některého z nároků 1 až 4.
6.. Způsob napodobení účinku kyseliny rethinové na pokožku, vyznačující se tím, že se nanáší prostředek podle některého z nároků 1 až 4.

·· 9 99 9999 9· ··**

9 · · · «· « r 9 ·

9 9 9 · 9 ··· • · 9 9 · 9999 9

9 9 9999 9 9 · ·

9·9· 9»· 99 ·« 99 9«
7. Prostředek pro péči o pleť, vyznačuj ící se t i m, že obsahuje

a) kombinaci alespoň dvou zesilovačů účinku retinoidů ze skupiny B1 až B5 v množství 0,0001 až 50 %, přičemž

7 vzájemný poměr dvou zesilovačů je v rozmezí 1:1000 až

O?

- 1000:1, ' \ b) kosmeticky přijatelné nosné prostředí.