CZ289857B6

CZ289857B6 - Kosmetický prostředek

Info

Publication number: CZ289857B6
Application number: CZ19991087A
Authority: CZ
Inventors: Stewart Paton Granger; Anthony Vincent Rawlings; Ian Richard Scott
Original assignee: Unilever N. V.
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 2002-04-17
Also published as: JP2000503029A; ZA978653B; CN1237898A; AU4704497A; DE69718023D1; BR9711421B1; ES2188903T3; PL188577B1; CA2266925A1; JP3667772B2; KR100320137B1; EP0929288A1; BR9711421A; PL332544A1; KR20000048697A; DE69718023T2; EP0929288B1; CA2266925C; AR009099A1; WO1998013018A1

Abstract

Kosmetick² prost°edek obsahuj c a) 0,001 a 10 % retinolu nebo retinylesteru, b) 0,0001 a 50 % N-substituovan ho amidu mastn kyseliny obecn ho vzorce I, kde R.sub.1.n. je alkyl nebo alkoxyskupina s 1 a 10 atomy uhl ku, R.sub.2.n. je alkyl nebo alkenyl s 8 a 25 atomy uhl ku, R.sub.3.n. je alkyl s 1 a 5 atomy uhl ku nebo fosf tov esterov skupina, c) kosmeticky p°ijateln² nosi . Prost°edek je ur en k p i o ple , nap° klad p°i prevenci nebo l en such poko ky, vr sek, sta°eck²ch skvrn a podobn .\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká kosmetického prostředku, obsahujícího amid mastné kyseliny a retinol nebo retinylester.

Dosavadní stav techniky

Retinol (vitamin A), je endogenní sloučenina, která se přírodně vyskytuje v lidském organismu a á zásadní význam pro normální diferenciaci epiteliálních buněk. Z tohoto důvodu byly přírodní i syntetické deriváty vitaminu A široce užívány k léčení různých kožních onemocnění a k obnově pokožky. Kyselina retinová byla užívána například k léčení akné, vrásek, lupénky, stařeckých skvrn a odlišně zbarvených oblastí pokožky, jak bylo popsáno například v publikacích Vahlquist A. a další, J. Invest. Dermatol., sv. 94, Hollad D. B. a Cunliffe W. J., 1990, str. 496 až 498, Ellis C. N. a další, Pharmacology of Retinols in Skin, Vasel, Karger, sv. 3,1989, str. 249 až 252, Lowe N. J. a další, Pharmacology of Retinols in Sin, sv. 3, 1989, str. 240 až 248 a PCT patentová přihláška WO 93/19743.

Obvykle se považuje použití retinolu nebo esteru retinolu za výhodnější než použití samotné kyseliny. Retinol se přirozeně vyskytuje v lidském organismu a jeho použití se tedy považuje za bezpečnější než použití kyseliny retinové. Estery retinolu se in vivo hydro lyžují za vzniku retinolu. Je pravděpodobné, že se estery retinolu a retinol v pokožce metabolicky mění na kyselinu podle následujícího schématu:

retinylester retinol kyselina retinová

Většina endogenního retinolu je však rychle převedena na neúčinné estery mastných kyselin pro uložení v keratinocytech pokožky. Esterifíkace retinolu na neúčinné retinylestery je prováděna v buňkách přenosem acylové skupiny alifatické kyseliny z acylCoA, reakce je katalyzována enzymem acylCoAretinoltransferázou, ARAT, nebo může jít o přenos acylové skupiny z fosfatidylholinu, katalyzovaný enzymem lecitinretinolacyltransferázou, LRAT. Tyto esterifikační reakce jsou v keratinocytech velmi účinné, takže převážná většina 95 % buněčných retinoidů je ve formě retinylesterů s mastnými kyselinami. Přestože tedy retinol a retinylestery jsou při použití bezpečnější než kyselina retinová, jsou naneštěstí méně účinné.

Vynález je založen zčásti na objevu, že některé N-substituované amidy mastných kyselin mohou vyvolat inhibici uvedených esterifikačních reakcí a tím zvýšit účinek retinolu zvýšením množství retinolu, který je k dispozici pro přeměnu na kyselinu retinovou. To znamená, že směs takových N-substituovaných amidů mastných kyselin s retinolem nebo retinylestery svým účinkem odpovídá účinku kyseliny retinové, avšak použití směsi je bezpečnější. V evropské patentové přihlášce EP 742 005 (Unilever) s pávem přednosti ze dne 8. května 1995, zveřejněné 13. listopadu 1996, to znamená po dni, od nějž přísluší právo přednosti předmětné přihlášce, se uvádí kombinace amidů mastných kyselin s retinolem nebo substituovanými amidy mastných kyselin, avšak neuvádějí se specifické N-substituované amidy mastných kyselin, které se užívají podle vynálezu ani amidy mastných kyselin, které mají na dusíkovém atomu rozvětvený substituent, nesoucí alkoxyskupinu.

-1 CZ 289857 B6

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří kosmetický prostředek, který obsahuje

a) 0,001 až 10 % retinolu nebo retinylesteru,

b) 0,001 až 50 % N-substituovaného amidu mastné kyseliny obecného vzorce I

H,C—R. O

Ί ¹ II

NH—C—

HjC—O— Rj (X), kde

Ri znamená alkyl nebo alkoxyskupinu vždy o 1 až 10 atomech uhlíku,

R₂ znamená alkyl nebo alkenyl vždy o 8 až 25 atomech uhlíku,

R₃ znamená alkyl o 1 až 5 atomech uhlíku nebo fosfátovou esterovou skupinu,

c) kosmeticky přijatelný nosič.

Uvedený prostředek je možno použít k péči o pleť místním nanesením prostředku na pokožku. Tímto způsobem je možno napodobit účinek kyseliny retinové na pokožku.

Pod pojmem „péče o pleť“ se rozumí například: prevence a/nebo léčení suché pokožky nebo pokožky poškozené zářením, zvláště slunečním zářením, léčení nebo prevence vrásek, stařeckých skvrn a jiných projevů stárnutí pokožky, jako jsou zvýšení flexibility stratům comeum nebo zesvětlení barvy pokožky, dále je možno pod tímto pojmem rozumět také potlačení tvorby mazu a obecně zlepšení stavu pokožky.

Bylo prokázáno, že N-substituované amidy mastných kyselin obecného vzorce I při koncentraci 100 μΜ vyvolávají inhibici nejméně 20% esterifikace, katalyzované LRAT nebo ARAT při měření mikrozomální zkoušky in vitro, která bude dále popsána. To znamená, že přítomnost N-substituovaného amidu mastné kyseliny obecného vzorce I v kosmetickém prostředku podle vynálezu podstatně zlepšuje účinnost retinolu nebo retinylesteru v tomto prostředku.

V textu popisu jsou všechna uváděná množství v kosmetickém prostředku hmotnostní, není-li výslovně uvedeno jinak.

První základní složkou kosmetického prostředku podle vynálezu je sloučenina ze skupiny, tvořené retinolem a retinylesterem. Pod pojmem „retinol“ se mimo jiné rozumí následující izomery retinolu: alfall-trans-retinol, 13-cis-retinol, 11-cis-retinol, 9-cis-retinol, 3,4-didehydroretinol. Výhodnými izomery jsou alfall-trans-retinól, 13-cis-retinol, 3,4-didehydroretinol a 9-cis-retinol. Nejvýhodnější je alfall-trans-retinol vzhledem k tomu, že je běžně dodáván.

Retinylester je ester retinolu. Retinylestery, vhodné pro použití v kosmetickém prostředku podle vynálezu mají 1 až 30 atomů uhlíku, s výhodou 2 až 20 atomů uhlíku v esterové skupině, nejvýhodnější jsou estery, obsahující 2, 3 a 16 atomů uhlíku vzhledem ktomu, že jsou běžně dostupné. Jako příklady retinylesterů je možno uvést například: retinylpalmitát, retinylformiát,

-2CZ 289857 B6 retinylacetát, retinylpropionát, retinylbutyrát, retinylvalerát, retinylizovalerát, retinylhexanát, retinylheptanoát, retinyloktanoát, retinylnonanoát, retinyldekanoát, retinylundekanoát, retinyllaurát, retinyltridekanoát, retinylmyristát, retinylpentadekanoát, retinylheptadekanoát, retinylarachidonát, retinylbehenát, retinyllinoleát a retinyloleát.

Výhodné estery pro použití v kosmetickém prostředku podle vynálezu se volí z retinylpalmitátu, retinylacetátu a retinylpropionátu vzhledem k tomu, že tyto látky se běžně dodávají a jsou proto nejlevnější. Retinyllinoleát je rovněž výhodný vzhledem ke své účinnosti.

Retinol a/nebo retinylester je v prostředku podle vynálezu obsažen v množství 0,001 až 10%, s výhodou v množství 0,01 až 1 % a zvláště 0,01 až 0,5 %.

Druhou základní složkou prostředku podle vynálezu je N-substituovaný amid mastné kyseliny obecného vzorce I

HjC—O—R3 (I) kde

Ri znamená alkyl nebo alkoxyskupinu vždy o 1 až 10 atomech uhlíku,

R₂ znamená alkyl nebo alkinyl vždy o 8 až 25 atomech uhlíku,

R₃ znamená alkyl o 1 až 5 atomech uhlíku nebo fosfátovou esterovou skupinu.

S výhodou znamená R] nasycenou alkylovou skupinu nebo alkoxyskupinu s lineárním řetězcem, obsahující 1 až 5 a zvláště 1 nebo 4 atomy uhlíku.

Výhodným významem pro R₂ je nenasycený alkenylový zbytek s přímým řetězcem, obsahující 10 až 20, s výhodou 10 až 18 atomů uhlíku.

Optimálním významem pro R₂ je zbytek kyseliny linolové (Ci_8:2).

Výhodným významem pro R₃ je methylová skupina nebo fosfátová esterová skupina, s výhodou fosfátový ester cholinu nebo glykolu.

V nejvýhodnějším provedení se N-substituovaný amid mastné kyseliny volí ze sloučeniny s dále uvedeným vzorcem A a B

-3CZ 289857 B6

Vzorec A

Vzorec B

N-substituovaný amid mastné kyseliny je v kosmetickém prostředku podle vynálezu obsažen v množství 0,0001 až 50, s výhodou 0,01 až 10 a zvláště 0,1 až 5 %.

N-substituovaný amid mastné kyseliny obecného vzorce I vyvolává v koncentraci 100 μΜ inhibicí nejméně 20 % esterifikace retinolu, katalyzované LRAT nebo ARAT při měření mikrozomální zkouškou in vitro.

Zkouška na mikrozomech in vitro

Mikrozomy se získají způsobem podle publikace J. C. Saari a D. L. Bredberg, CoA and NonCoA Dependent Retinol Esterification in Retinal Pigment Epithelium, J. Biol. Chem., 263, 8084 až 8090,1988.

Roztok, obsahující 0,1 M pufru s fosfátem sodným o pH 7, 5 mM dithiothreitolu, 2 mg/ml sérového albuminu skotu, 40 μΜ roztok palmitoyl CoA, 40 μΜ roztok dialuroylfosfatidylcholinu, 10 μΜ roztok retinolu a zkoumanou látku nebo pouze rozpouštědlo v případě slepé zkoušky se inkubuje 1 hodinu při teplotě 37 °C s mikrozomální frakcí, izolovanou 25 z pigmentových epiteliálních buněk sítnice skotu. Po inkubaci se reakce zastaví přidáním stejného objemu ethanolu a vytvořené retinylestery (retinyllaurát z reakce, katalyzované LRAT a retinylpalmitát z reakce, katalyzované ARAT) se extrahují hexanem. Hexanová vrstva se oddělí, odpaří pod dusíkem a odparek se analyzuje pomocí HPLC na sloupci v reverzní fázi Cu s rozměrem 3,9 χ 300 mm při použití 80% methanolu v tetrahydrofuranu jako mobilní fáze a při 30 detekci fluorescencí (excitace 325 nm, emise 480 nm) ke kvantitativnímu stanovení retinylesteru.

Množství esteru, vytvořeného v přítomnosti rozpouštědla jako slepé zkoušky se pokládá za 100%, ze získaných hodnot se vypočítá inhibice tvorby esterů v procentech pro každou ze

-4CZ 289857 B6 zkoumaných látek. Při kontrolním pokusu se stejné množství mikrozomů inaktivuje varem po dobu 5 minut, čímž dojde k nejméně 95% inhibici tvorby esteru.

Ve výhodném provedení vynálezu se užije N-substituovaný amid mastné kyseliny, který při koncentraci 100 μΜ vyvolá nejméně 40% inhibici esterifikace retinolu, katalyzované LRAT nebo ARAT.

Kosmeticky přijatelná nosič

Kosmetický prostředek podle vynálezu obsahuje také kosmeticky přijatelný nosič jako ředidlo, disperzní prostředí nebo nosič pro retinol a/nebo retinylester a N-substituovaný amid mastné kyseliny, nosič nebo nosné prostředí slouží zejména ke snadnému nanášení kosmetického prostředku na pokožku.

Nosná prostředí, odlišná od vody nebo užívaná společně s vodou zahrnují kapalná nebo pevná změkčovadla, rozpouštědla, zahušťovadla, látky zadržující vodu a různé práškové materiály. Zvláště výhodným nosičem nevodné povahy je polydimethylsiloxan a/nebo polydimethylfenylsiloxan. Silikony pro použití v kosmetickém prostředku podle vynálezu mají s výhodou viskozitu 10 až 10 000 000 mm²/s při teplotě 25 °C. Zvláště vhodné jsou směsi silikonů s nízkou a vysokou viskozitou. Tyto silikony se běžně dodávají pod obchodními názvy Vicasil SE a SF (Generál Electric Company) a pod čísly 200 a 550 (Dow Oming Company). Množství silikonu, které je možno použít v prostředku podle vynálezu je 5 až 95 %, s výhodou 25 až 90 % hmotnostních prostředku.

Kosmeticky přijatelný nosič bude tvořit obvykle 5 až 99,9, s výhodou 25 až 80 % hmotnostních prostředku a může v nepřítomnosti dalších kosmeticky přijatelných složek doplnit kosmetických prostředek na požadované množství. S výhodou tvoří nosné prostředí nejméně z 50 % a zvláště z 80 % hmotnostních voda. Výhodný obsah vody je zvláště 60 až 80 % hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost kosmetického prostředku.

Případné další účinné a pomocné složky

K získání emulze typu voda v oleji nebo olej ve vodě, může být v kosmetickém prostředku podle vynálezu obsažen olej nebo materiál typu oleje spolu s emulgátorem v závislosti na hydrofilnělipofilní rovnováze HLB použitého emulgátoru.

Kosmetické prostředky podle vynálezu s výhodou obsahují ochranné látky proti slunečnímu záření. Jde o materiály, běžně užívané k ochraně proti ultrafialovému záření. Z těchto látek je možno uvést deriváty PABA, cinnamát a salicylát. Je například možno použít oktylmethoxycinnamát a 2-hydroxy-4-methoxybenzofenon, známý také jako oxybenzon. Oktylmethoxycinnamát a 2-hydroxy-4-methoxybenzofenon se běžně dodávají pod obchodními názvy Parsol MCX a Benzophenon-3. Přesné množství těchto látek v emulzi se může měnit v závislosti na požadovaném stupni ochrany proti slunečnímu záření.

Další výhodou případnou složkou jsou esenciální mastné kyseliny EFA, to znamená takové mastné kyseliny, které jsou nezbytné pro tvorbu plazmatické membrány všech buněk, například u keratinocytů dochází při nedostatku EFA ke zvýšené proliferaci. Tento stav je možno léčit dodáním EFA. EFA také podporují biosyntézu lipidů v pokožce a zejména lipidy pro tvorbu bariéry. Z esenciálních mastných kyselin je možno zvláště uvést kyselinu linolovou, gama-linolenovou, homo-gama-linolenovou, columbinovou, eicosa-(n-6,9,13)-trienovou, arachidonovou, timnodonovou, hexaenovou a směsi těchto kyselin.

Další výhodnou případnou složkou mohou být azoly, například climbazol, bifonazol, clotrimazol, ketoconazol, miconazol, econazol, itraconazol, fluconazol, terconazol, butoconazol, sulconazol, lionazol a směsi těchto látek. Azoly mohou být do kosmetického prostředku podle vynálezu

-5CZ 289857 B6 přidávány v množství 0,001 až 50, s výhodou 0,001 až 10 a zvláště v množství 0,1 až 5 % hmotnostních.

Do kosmetických prostředků podle vynálezu se často přidávají změkčovadla. Množství změkčovadel se může pohybovat v rozmezí 0,5 až 50, s výhodou 5 až 30% hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost prostředku. Změkčovadla pro toto použití jsou látky z různých chemických skupin, jako estery, mastné kyseliny a alkoholy, polyoly a uhlovodíky.

Estery mohou být monoestery nebo diestery. Přijatelnými příklady diesterů mastných kyselin mohou být dibutyladipát, diethylsebakát, diizopropyldimerát a dioktylsukcinát. Přijatelné estery mastných kyselin s rozvětveným řetězcem zahrnují 2-ethylhexylmyristát, izopropylstearát a izostearylpalmitát. Přijatelné estery trikarboxylových kyselin zahrnují triizopropyltrilinoleát a trilaurylcitrát. Přijatelné estery mastných kyselin s přímým řetězcem zahrnují laurylpalmitát, myristyllaktát, oleylerukát a stearyloleát. Výhodnými estery jsou kokokaprylát/kaprát (směs kokokapiylátu a kokokaprátu), acetát myristyletheru propylenglykolu, diizopropyladipát a cetyloktanát.

Z vhodných mastných alkoholů a kyselin je možno uvést sloučeniny, obsahující 10 až 20 atomů uhlíku. Zvláště výhodné jsou cetyl-, myristyl-, palmityl- a steaiylalkoholy a příslušné kyseliny.

Z polyolů, použitých jako změkčovadla je možno uvést alkylpolyhydroxysloučeniny s přímým nebo rozvětveným řetězcem. Výhodnými látkami z této skupiny jsou propylenglykol, sorbitol a glycerol. Použitelné jsou také polymemí polyoly, jako polypropylenglykol a polyethylenglykol. Butylenglykol a propylenglykol jsou zvláště výhodné jako látky, které usnadňují průnik.

Z uhlovodíků, použitých jako změkčovadla je možno uvést zejména uhlovodíky obsahující 12 až 30 atomů uhlíku. Specifickými příklady mohou být minerální olej, vazelína, squalen a izoparafíny.

Další kategorií funkčních složek pro kosmetické prostředky podle vynálezu jsou zahušťovadla. Látky tohoto typu budou obvykle obsaženy v množství 0,1 až 20, s výhodou 0,5 až 10% hmotnostních z celkové hmotnosti kosmetického prostředku. Jako příklady zahušťovadel je možno uvést zesítěné polyakryláty, dodávané pod obchodním názvem Carbopol (B. F. Goodrich Company). Je také možno užít gumy, jako xanthan, carrageenan, želatinu, karayu, pektin a gumu z bobů. Za určitých okolností může být zahušťovadlo voleno z látek použitých jako silikon nebo jako změkčovadla. Například silikonové piyže s viskozitou vyšší než 10 mm².s^_1 a také některé estery, například glycerolstearát mohou v kosmetickém prostředku splnit dvojí funkci.

Do kosmetických prostředků podle vynálezu je možno začlenit také práškové materiály. Takovými složkami jsou například křída, mastek, kaolin, škrob, smektit, chemicky modifikovaná montmorillonitová hlinka, hydratovaný křemičitan hlinitý, vysušený oxid křemičitý, oktenylsukcinát škrobu ve formě hlinité soli a směsi těchto látek.

Do kosmetických prostředků podle vynálezu mohou být zařazeny v malém množství také další složky, jako jsou barviva, parfémy a podobně. Množství těchto složek se může pohybovat v rozmezí 0,001 až 20 % hmotnostních.

Použití kosmetického prostředku

Kosmetický prostředek podle vynálezu je primárně určen pro místní podání na lidskou pokožku, zejména k péči o pleť a k prevenci nebo odstranění vrásek nebo jiných projevů stárnutí pokožky.

Při použití se malé množství prostředku, například 1 až 100 ml, nanese na příslušné části pokožky z vhodné nádobky nebo aplikátoru a popřípadě se pak materiál roztírá a/nebo vetře do pokožky rukou, prsty nebo vhodnými pomůckami.

-6CZ 289857 B6

Výrobky a balení

Prostředky podle vynálezu pro místní podání mohou být například emulze, krémy nebo gely. Tyto materiály mohou být baleny do vhodných nádobek podle viskozity a předpokládaného použití. Například emulze nebo krémy je možno uložit do lahviček, popřípadě opatřených ve výstupním otvoru kuličkou pro snadnější nanášení, neboje možno prostředek uložit do přístroje pro nanášení aerosolu s hnacím prostředkem nebo do nádobky s mechanickým nanášením pomocí prstů. V případě krému je možno použít nedeformující se kelímek nebo také tubu. Prostředek je rovněž možno ukládat do kapslí, například podle US 5 063 057.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu. V příkladové části přihlášky budou užity různé materiály a budou také popsány různé typy zkoušek.

Materiály a metody

Buněčná kultura

Lidské keratinocyty, izolované z předkožky novorozenců působením trypsinu se pěstují v Eaglově prostředí v Dulbeccově modifikaci DME Hams F12 (1 : l)s 10% fetálního telecího séra v přítomnosti ozářených myších fibroblastů 3T3 pro zahájení dělení kolonií keratinocytů. Buňky byly pěstovány až do druhé pasáže a pak byly udržovány ve zmrazeném stavu pro příští použití. Pak byly keratinocyty opět rozmraženy ve svrchu uvedeném prostředí a pěstovány 5 dnů, načež bylo prostředí vyměněno na prostředí na bázi MCBD 153, prosté séra a vhodné pro pěstování keratinocytů, KGM (Clonetic Corporation, San Diego, CA), prostředí obsahuje 0,15 mM vápníku, neboje také možno užít prostředí K.SFM, prosté séra a vhodné pro pěstování keratinocytů (GIBCO), které obsahuje 0,09 mM vápníku. Ve dni 7 vytvořil buněčný materiál vrstvu, souvislou na 80 až 90 %, vrstva byla zpracována trypsinem a nanesena na plotny v prostředí, prostém séra, pro různé zkoušky.

Zkouška na transglutaminázu

Zkouška na transglutaminázu a diferenciace keratonicytů

V průběhu na transglutaminázu a diferenciace epidermis se vytváří na vnitřním povrchu periferie buněk vrstva bílkoviny s tloušťkou 15 nm, označovaná jako obalová vrstva CE. Tato vrstva CE je tvořena řadou bílkovin, které byly spolu zesítěny za tvorby N^eta-(gama-glutamyl)lysinizodipeptidových vazeb, tato tvorba je katalyzována působením nejméně dvou různých transglutamináz TG, k jejichž expresi dochází v epidermis. K expresi transglutaminázy I TG I dochází ve velkém množství v diferencovaných vrstvách epidermis, zvláště v granulámí vrstvě, avšak nedochází kní v nediferencované bazální vrstvě. To znamená, že uvedený enzym je vlastně průkazem diferenciace keratinocytů, přičemž vyšší množství enzymu je vždy ukazatelem diferencovanějšího stavu. Při průkazu tohoto enzymu zkouškou ELISA při použití protilátky proti uvedenému enzymu je možno prokázat stav diferenciace vypěstovaných keratinocytů, jak bude uvedeno v následujících příkladech.

V případě příkladu 1 bylo použito následujícího postupu:

Keratinocyty, vypěstované svrchu uvedeným způsobem, byly naneseny na plotnu s 96 vyhloubeními v množství 3000 buněk na vyhloubení ve 200 mikrolitrech živného prostředí. Po inkubaci 4 dny bylo prostředí vyměněno za prostředí, obsahující zkoumané látky, každá látka byla užita v dané koncentraci vždy v šesti opakováních. Pak byly buňky pěstovány dalších 72 hodin a pak po odsátí živného prostředí byly plotny uloženy při teplotě -70 °C. Pro použití byly plotny vyjmuty z mrazicího zařízení a buněčný materiál byl promyt PBS. Bylo přidáno

-7CZ 289857 B6

100 mikrolitrů sterilní vody a buněčný materiál se rozruší zmrazením na -70 °C s následným rozmražením. Buňky se inkubují 1 hodinu při teplotě místnosti v PBS se 3 % BSA, jde opromávací pufr se sérovým albuminem skotu, pak se buněčný materiál promyje čerstvým podílem promávacího pufru. Buňky se inkubují spolu s 50mikrolitry primární myší monoklonální protilátky proti lidské transglutamináze, IgG (Biomedical Industries) v ředění 1 : 2000 v promývacím pufru 1 hodinu při teplotě 37 °C a pak se promyjí dvakrát po sobě promávacím pufrem. Pak se buněčný materiál inkubuje 150 mikrolitry sekundární protilátky (fragment Fab, protilátka IgG proti myším tkáním, konjugované s peroxidázou, Amersham) v ředění 1 :4000 v promávacím pufru 1 hodinu při teplotě 37 °C, načež se dvakrát promyje promávacím pufrem. Buňky se inkubují s roztokem substrátu, jde o roztok 4 mg o-fenylendiaminu a 3,3 mikrolitrů 30% peroxidu vodíku v 10 ml 0,lM citrátového pufru o pH 5,0 celkem 5 minut při teplotě místnosti ve tmě pod hliníkovou fólií. Reakce se zastaví přidáním 50 mikrolitrů 4N kyseliny sírové. Absorbance vzorků se odečítá příslušným přístrojem při 492 nm. Ze šesti vzorků byly ke čtyřem vzorkům přidány obě protilátky, ke dvěma byla přidána pouze sekundární protilátka ke stanovení vazby protilátky, konjugované s enzymem. Koncentrace transglutaminázy byly stanoveny odečtením takto zjištěného pozadí z koncentrace, zjištěné v jednotlivých vzorcích a stanovením směrodatné odchylky pro vzorky, k nimž byly přidány obě protilátky.

V případě příkladu 3 bylo použito následujícího postupu:

Keratinocyty, vypěstované svrchu uvedeným způsobem, byly naneseny na plotnu s 96 vyhloubeními v množství 3000 buněk na vyhloubení ve 200 μΐ živného prostředí. Po inkubaci 4 dny bylo prostředí nahrazeno prostředím s obsahem zkoumaných látek, zkoušky byly prováděny v šesti opakováních. Pak byl buněčný materiál pěstován ještě 72 hodin, načež byly po odsátí živného prostředí plotny uloženy při -70 °C. Po vyjmutí z mrazicího zařízení byl buněčný materiál znovu zmrazen a rozmražen a pak třikrát promyt PBS. Pak byly buňky inkubovány 1 hodinu při teplotě místnosti v pufru TBS s 5 % BSA. Pak byly buňky inkubovány se 100 mikrolitry primární protilátky, monoklonální myší protilátky IgG proti lidské transglutamináze (Biomedical Technologies lne.) v ředění 1 : 2000 pufru TBS s 1 % BSA 2 hodiny při teplotě 37 °C, načež byly 6* promyty promývacím pufrem TBS s 1 % BSA a s 0,05 % Tween-20. Pak byl buněčný materiál inkubován se 100 mikrolitry fragmentu Fab sekundární protilátky, protilátky IgG proti myším tkáním, konjugované s peroxidázou (Amersham) v ředění 1 : 4000 v promývacím pufru celkem 2 hodiny při teplotě 37 °C, načež byl materiál 3* promyt promývacím pufrem a pak ještě 3χ PBS. Buňky pak byly inkubovány s roztokem substrátu, 4 mg o-fenylendiaminu a 3,3 mikrolitrů 30% peroxidu vodku v 10 ml 0,lM citrátového pufru o pH 5,0 celkem 5 minut při teplotě místnosti a ve tmě pod hliníkovou fólií. Reakce byla zastavena přidáním 50 mikrolitrů 4N kyseliny sírové. Absorbance vzorků byla odečítána příslušným přístrojem při 492 nm. Ze šesti opakování byly ke čtyřem vzorkům přidány obě protilátky a ke dvěma z nich pouze sekundární protilátka ke stanovení pozadí vazby enzymu konjugovanou protilátkou. Koncentrace transglutaminázy I byly stanoveny odečtením tohoto pozadí od výsledku pro každý ze vzorků za současného stanovení směrodatné odchylky.

Stanovení DNA

Množství transglutaminázy I, zjištěná po zpracování buněk, může být ovlivněna počtem buněk, to znamená, že čím větší bude počet buněk, tím vyšší bude koncentrace enzymu. Koncentrace enzymu byla tedy normalizována na obsah DNA v buňkách téhož vyhloubení, čímž byly vyloučeny variace, způsobené rozdílem v počtu buněk. Kvantitativní stanovení DNA je zvláště vhodným ukazatelem počtu buněk včetně keratinocytů vzhledem k tomu, že každá z buněk má stejný genom a tím i stejné množství DNA. Celkové množství DNA ve vyhloubení je tedy přímo úměrné počtu buněk v tomto vyhloubení. Pak je možno stáhnout údaje o koncentraci enzymu na zjištěné množství DNA.

Keratinocyty byly naneseny na plotny s 96 vyhloubeními v množství 3000 buněk na vyhloubení ve 200 mikrolitrech živného prostředí. Po inkubaci 4 dny bylo prostředí nahrazeno prostředím

-8CZ 289857 B6 s obsahem zkoumaných látek, každá zkouška byla provedena v šesti opakováních. Pak byly buňky pěstovány ještě 72 hodin, načež bylo živné prostředí odstraněno odsátím a plotny byly uloženy nejméně na 1,5 hodiny při teplotě -70 °C. Pak byly plotny vyjmuty z mrazicího zařízení a na 30 minut rozmraženy, do každého vyhloubení bylo přidáno 100 mikrolitrů barviva Hoechst (konečná koncentrace 1 mikrogram/ml) a plotny byly inkubovány 15 minut, překryty a výsledek byl odečítán fluorimetrem (excitace 360 nm, emise 460 nm). Pak byl roztok barviva odstraněn a vyhloubení byla promyta PBS a tak připravena na stanovení transglutaminázy.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Kyselina retinová je účinnější než retinol při změně stadia diferenciace keratinocytů

Byl sledován účinek transglutaminázy, normalizované na obsah DNA v buňkách po přidání kyseliny retinové RA a retinolu ROH, výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 1:

Tabulka 1

	průměr TGáza/DNA x 10^±s.d (% kontroly)	hodnota p proti kontrole	ppro 2,5 x 10‘⁷M ROH	PPro 2,5 x 10 ⁸M ROH	PPro 2,5 x 10’⁹M ROH
kontrola	2,44 ±0,24 (100%)	-	0,001	0,001	0,001
2,5x10⁷MRA	0,16 ±0,11 (7%)	0,001	0,001	0,001	0,001
2,5x10⁷MROH	1,14 ± 0,22 (47 %)	0,001	-	0,001	0,001
2,5x10~⁸MRA	1,34 ± 0,40 (55 %)	0,001	0,2	0,001	0,001
2,5x10⁸MROH	1,89 ±0,30 (77%)	0,001	0,001	-	0,001
2,5xlO‘^yMRA	1,87 ± 0,49 (77 %)	0,001	0,001	0,784	0,001
2,5xlO^yMROH	2,70 ±0,59 (>100%)	0,001	0,001	0,001	-

n = 3

Všechny zkoušené koncentrace kyseliny retinové, to znamená 2,5 x 10~⁷M, 2,5 x 10^_8M a 2,5 x 10^_9M snižovaly diferenciaci keratinocytů ve významně vyšším rozsahu než retinol ve stejných koncentracích. Snížení množství transglutaminázy bylo závislé na dávce jak v případě kyseliny retinové, tak v případě retinolu. To je v souladu se skutečností, že kyselina retinová má na diferenciaci epitelu větší účinnost než retinol.

Příklad 2

Esterifikace retinolu v mikrozomech in vitro

Mikrozomy byly získány podle publikace J. C. Saari a D. L. Bredberg, CoA and Non-CoA Dependent Retinol Esterifikation in Retinal Pigment Epithelium, J. Biol. Chem., 23, 8084 až 8090,1988:

Roztok, obsahující 0,lM pufru s fosfátem sodným o pH 7,5 mM dithiothreitolu, 2mg/ml sérového albuminu skotu, 40 μΜ roztok dialuroylfosfatidylcholinu, 10 μΜ roztok retinolu a zkoumanou látku nebo pouze rozpouštědlo v případě slepé zkoušky se inkubuje 1 hodinu při teplotě 37 °C s mikrozomální frakcí, izolovanou z pigmentových epiteliálních buněk sítnice skotu. Po inkubaci se reakce zastaví přidáním stejného objemu ethanolu a vytvořené retinylestery

-9CZ 289857 B6 (retinyllaurát z reakce, katalyzované LRAT a retinylpalmitát z reakce, katalyzované ARAT) se extrahují hexanem. Hexanová vrstva se oddělí, odpaří pod dusíkem a odparek se analyzuje pomocí HPLC na sloupci v reverzní fázi C_]8 s rozměrem 3,9 x 300 mm při použití 80% methanolu v tetrahydrofuranu jako mobilní fáze a při detekci fluorescencí (excitace 325 nm, emise 480 nm) ke kvantitativnímu stanovení retinylesteru. Množství esteru, vytvořeného v přítomnosti rozpouštědla jako slepé zkoušky se pokládá za 100 %, ze získaných hodnot se vypočítá inhibice tvorby esterů v procentech pro každou ze zkoumaných látek. Při kontrolním pokusu se stejné množství mikrozomů inaktivuje varem po dobu 5 minut, čímž dojde k nejméně 95% inhibici tvorby esteru.

Získané výsledky jsou shrnuty v následujících tabulkách 2A a 2B.

Sloučeniny v tabulce 2A byly podrobeny zkouškám při koncentraci 100 μΜ, kdežto sloučeniny v tabulce 2B byly zkoušeny při koncentraci 10 μΜ.

Mimoto byla podrobena zkouškám také sloučenina vzorce C, která není zahrnuta do předmětu vynálezu.

Vzorec C

----CCH-j

Tabulka 2A

sloučenina	% inhibice ARAT	% inhibice LRAT
kontrola	0	0
vzorec C	0	0
vzorec B	83	92
vzorec A	54	48
Tabulka 2B
sloučenina	% inhibice ARAT	% inhibice LRAT
kontrola	0	0
vzorec C	N/D	N/D
vzorec B	42	51
vzorec A	43	0

Z výsledků, uvedených v tabulkách 2A a 2B je zřejmé, že N-substituované amidy mastných kyselin, v nichž R₂ obsahuje více než 7 atomů uhlíku, to znamená sloučeniny vzorce A a B jsou účinnými inhibitory esterifikace retinolu, katalyzované působením LRAT a ARAT.

-10CZ 289857 B6

Příklad 3

Byl sledován vliv sloučenin z tabulky 3 a kombinací těchto sloučenin na diferenciaci keratinocytů. Získané výsledky byly vyjádřeny v procentech kontrolní hodnoty. Koncentrace transglutaminázy byla normalizována na stanovené množství DNA.

	průměr TGáza/DNA x 10⁵±s.d (% kontroly)	hodnota p proti kontrole	ppro 2,5 x 10’⁷M ROH	ppro 2,5 x 10’⁸M RA	ppro ÍO^M vzorec A
kontrola	58,80 ±8,61 (100%)	-	0,020	0,004	0,003
2,5x10‘⁷MRA	39,99 ± 5,28 (69 %)	0,004	0,093	—	0,525
2,5x1 0’⁷M Retinol	45,60 ± 3,92 (79 %)	0,020	—	0,093	0,054
ÍO^M vzorec A	41,57 ±0,75 (72%)	0,003	0,054	0,525	-
2,5 x 10^-7 ROH+1 θ'⁴vzorec A	33,27 ± 3,97 (58 %)	0,001	0,001	0,052	0,002

n = 3

Koncentrace 2,5 x 10⁷M kyseliny retinové byla účinná při potlačení koncentrace transglutaminázy TG I na 69 % kontrolní hodnoty. Koncentrace 2,5 x 10^_7M retinolu a 1 O^M sloučeniny vzorce A byly méně účinné v případě, že byly použity samy o sobě. Avšak kombinace 2,5 x 10'⁷M retinolu a ÍO^M sloučeniny vzorce A potlačila koncentraci enzymu v keratinocytech až na 58 % kontrolní hodnoty. Z příkladu je rovněž zřejmá dobrá korelace mezi údaji, získanými na mikrozomech a údaji na buněčné kultuře.

V příkladech 4 až 9 jsou uvedeny různé kosmetické prostředky podle vynálezu, určené pro místní podání. Tyto prostředky mohou být připraveny běžným způsobem a jsou vhodné k uvedenému účelu. Zvláště se předpokládá použití těchto prostředků v případě vrásčité, drsné, suché, olupující se a/nebo slunečním zářením poškozené pokožky ke zlepšení jejího vzhledu a pocitu na pokožce a také použití v případě zdravé pokožky k prevenci nebo zpomalení jejího poškození.

Příklad 4

Tento příklad uvádí prostředek podle vynálezu typu emulze voda v oleji s vysokým obsahem vnitřní fáze.

složka retinol plně hydrogenovaný kokosový olej sloučenina vzorce A

Brij 92*

Benton 38

MgSO₄.7H₂O butylovaný hydroxytoluen parfém voda % hmotnostní

0,5

3,9

0,5

0,3

0,01 podle potřeby do 100

Brij 92 je polyoxyethylen (2) oleylether.

-11 CZ 289857 B6

Příklad 5

Tento příklad popisuje krém typu olej ve vodě

složka	% hmotnostní
retinol minerální olej sloučenina vzorce B Brij 56’ Alfol 16RD* triethanolamin butan-l,3-diol xanthanová guma butylovaný hydroxatoluen voda	0,15 4 2 4 4 0,75 3 0,3 0,01 do 100

* Brij 56 je cetylalkoholpolyethylenethylether (10), Alfol 16RD je cetylalkohol.

Příklad 6

Příklad popisuje kosmetický prostředek ve formě alkoholového lotionu.

složka	% hmotnostní
retinylpalmitát sloučenina vzorce B ethanol butylovaný hydroxytoluen voda	0,15 0,5 40 0,01 do 100

Příklad 7

Příklad popisuje další kosmetický prostředek ve formě alkoholového lotionu.

složka	% hmotnostní
retinol sloučenina vzorce A ethanol antioxidační látka voda	0,15 0,2 40 0,1 do 100

-12CZ 289857 B6

Příklad 8

Tento příklad popisuje opalovací krém podle vynálezu.

% hmotnostní složka

retinol	0,01
sloučenina vzorce A	0,3
silikonový olej 200 mm².s^-1	7,5
glycerylmonostearát	3
cetostearylalkohol	1,6
polyoxyethylen (2)-cetylalkohol	1,4
xanthanová guma	0,5
Parsol 1789	1,5
oktylmethoxycinnamát (PARSOL MCX)	7
parfém podle potřeby
barvivo podle potřeby
voda	do 1

Příklad 9

V tomto příkladu se uvádí nevodný prostředek podle vynálezu pro péči o pleť.

% hmotnostní složka

retinylpalmitát	0,15
sloučenina vzorce B	1
silikonová pryž SE-30¹	10
silikonová kapalina 345²	20
silikonová kapalina 344³	55,79
squalen	10
kyselina linovová	0,01
cholesterol	0,03
kyselina 2-hydroxy-N-oktanová	0,7
linoleát vitaminu E	0,5
květinový olej	0,5
ethanol	2

dimethylsilikonový polymer s molekulovou hmotností nejméně 50 000 a viskozitou nejméně 10 000 mm².s^_1 při 25 °C (GEC), ² cyklický pentamer dimethylsiloxanu (Dow Coming Corp.), ³ tetramer dimethylsiloxanu (Dow Coming Corp.).

Sloučeniny z jednotlivých příkladů byly získány z následujících zdrojů:

retinol retinylpalmitát kyselina retinová

Sigma

N-substituované amidy mastných kyselin University of Utrecht, Nizozemí.

Claims

1. Kosmetický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje

a) 0,001 až 10 % retinolu nebo retinylesteru,

b) 0,0001 až 50 % N-substituovaného amidu mastné kyseliny obecného vzorce I

Hťj:—NH—C—Ri

HjC—o—Rj (I), kde

Ri znamená alkyl nebo alkoxyskupinu vždy o 1 až 10 atomech uhlíku,

R₂ znamená alkyl nebo alkenyl vždy o 8 až 25 atomech uhlíku,

c) kosmeticky přijatelný nosič.

2. Kosmetický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím,že obsahuje N-substituovaný amid mastné kyseliny, který v koncentraci 100 μΜ vyvolává inhibici nejméně 20 % esterifikace retinolu, katalyzované LRAT nebo ARAT při měření in vitro na mikrozomech.

3. Kosmetický prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím,že obsahuje N-substituovaný amid mastné kyseliny, který v koncentraci 100 μΜ vyvolává inhibici nejméně 40 % esterifikace retinolu, katalyzované LRAT nebo ARAT při měření na mikrozomech in vitro.

4. Kosmetický prostředek podle některého z nároků laž 3, vyznačující se tím, že se retinylester volí ze skupiny retinylpalmitát, retinylacetát, retinylpropionát a směsi těchto látek.

5. Kosmetický prostředek podle některého z nároků laž3,vyznačující se tím, že jako retinylester obsahuje retinyllinoleát.

6. Kosmetický prostředek podle některého z nároků laž3,vyznačující se tím, že jako složku a) obsahuje retinol.

7. Způsob péče o pleť, vyznačující se tím,že se místně nanáší kosmetický prostředek podle některého z nároků 1 až 6.

-14CZ 289857 B6

8. Způsob napodobení účinku kyseliny retinové na pokožku, vyznačující se tím, že se místně nanáší kosmetický prostředek podle některého z nároků 1 až 6.