CZ295983B6

CZ295983B6 - Kosmetický prostředek a způsob ošetřování pleti

Info

Publication number: CZ295983B6
Application number: CZ19991089A
Authority: CZ
Inventors: Stewart Paton Granger; Alla Robert Burger; Ian Richard Scott; Koichi Iwata; Kelly Hua Zhang; Anthony Vincent Rawlings
Original assignee: Unilever N. V.
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 2005-12-14
Also published as: WO1998013020A1; AU4775897A; ES2193357T3; CZ108999A3; PL332430A1; EP0932387B1; CA2265635C; ID21932A; TW503112B; DE69719528D1; CN1253493A; CA2265635A1; DE69719528T2; CN1105554C; AU714271B2; KR100330678B1; KR20000048705A; JP2000503031A; EP0932387A1; PL188574B1

Abstract

Kosmetický prostředek obsahuje a) 0,001 až 10 % sloučeniny ze skupiny retinol, retinylester a směsi těchto látek, b) 0,001 až 50 % sloučeniny, která v koncentraci 100 .mi.M vyvolá inhibici nejméně 20 % esterifikace retinolu, katalyzované LRAT nebo ARAT při měření na mikrosomech in vitro, sloučenina se volí z derivátů cyklických nenasycených uhlovodíků a smáčedel, hydroxyethylimidazolinových derivátů mastných kyselin a c) nosič, přijatelný z kosmetického hlediska. Součást řešení tvoří také způsob ošetřování pleti, který spočívá v nanášení uvedeného kosmetického prostředku na pleť.

Description

Kosmetický prostředek a způsob ošetřování pleti

Oblast techniky

Vynález se týká kosmetického prostředku pro péči o plet a způsobu ošetřování pleti.

Dosavadní stav techniky

Retinol (vitamin A) je endogenní sloučenina, která se přírodně vyskytuje v lidském organismu a má zásadní význam pro normální diferenciaci epitheliálních buněk. Z tohoto důvodu byly přírodní i syntetické deriváty vitaminu A široce užívány k léčení různých kožních onemocnění a k obnově pokožky. Kyselina retinová byla užívána například k léčení akné, vrásek, lupenky, stařeckých skvrn a odlišně zbarvených oblastí pokožky, jak bylo popsáno například v publikacích Vahlquist A. a další, J. Invest. Dermatol., sv. 94, Holland D. B. a Cunliffe W. J., 1990, str.496 až 498, Ellis C. N. a další, Pharmacology of Retinols in Skin, Vasel, Karger, sv. 3, 1989, str. 249 až 252, Lowe N. J. a další, Pharmacology of Retinols in Skin, sv. 3, 1989, str. 240 až 248 a PCT patentová přihláška WO 93/19743.

FR dokument 2 666 226 popisuje použití flavonoidů spolu s estery retinolu k výrobě prostředků pro péči o pleť.

Obvykle se považuje použití retinolu nebo esteru retinolu za výhodnější než použití samotné kyseliny. Retinol se přirozeně vyskytuje v lidském organismu a jeho použití se tedy považuje za bezpečnější než použití kyseliny retinové. Estery retinolu se in vivo hydrolyzují za vzniku retinolu. Je pravděpodobné, že se estery retinolu a retinol v pokožce metabolicky mění na kyselinu podle následujícího schématu:

retinylester _Σ*retinol kyselina retinová

Většina endogenního retinolu je však rychle převedena na neúčinné estery mastných kyselin pro uložení v keratinocytech pokožky, Esterifikace retinolu na neúčinné retinylestery je prováděna v buňkách přenosem acylové skupiny afatické kyseliny z acylCoA, reakce je katalyzována enzymem acylCoAretinoltransferázou, ARAT, nebo může jit o přenos acylové skupiny z fosfatidylcholinu, katalyzovaný enzymem lecithinretinolacyltransferázou, LRAT. Tyto esterifikační reakce jsou v keratinocytech velmi účinné, takže převážná většina 95 % buněčných retionidů je ve formě retinylesterů s mastnými kyselinami, přestože tedy retinol a retinylestery jsou při použiti bezpečnější než kyselina retinová, jsou naneštěstí méně účinné.

Vynález je z části založen na objevu, že některé sloučeniny mohou vyvolat inhibici těchto esterifikačních reakcí, a tím potenciaci účinku retinolu zvýšením množství retinolu, které je k dispozici pro přeměnu kyseliny retinové, směs těchto látek s retinolem nebo retinylestery tedy napodobuje působeni kyseliny retinové, její použití je však bezpečnější.

-1 CZ 295983 B6

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří kosmetický prostředek pro péči o pleť, který obsahuje

a) 0,001 až 10 % sloučeniny ze skupiny retinol, retinylester a směsi těchto látek,

b) 0,0001 až 50 % sloučeniny, která v koncentraci 100 μΜ vyvolá inhibici nejméně 20 % esterifíkace retinolu, katalyzované LRAT nebo ARAT při měření na mikrozomech in vitro, přičemž tato sloučenina je odlišná od amidu mastné kyseliny nebo dimethylimidazolidinonu a volí se ze skupiny derivátů cyklických nenasycených uhlovodíků, diterpenů a smáčedel, hydroxyethylimidazolinových derivátů mastných kyselin vzorcel

R

kde

R znamená alifatický nasycený nebo nenasycený uhlovodíkový zbytek s přímým nebo rozvětveným řetězcem, obsahující 8 až 20 atomů uhlíku, nebo směs těchto látek, a

c) nosič, přijatelný z kosmetického hlediska.

Sloučeniny, užité spolu s retinolem a/nebo retinylesterem se volí podle schopnosti vzniklé kombinace napodobit účinek kyseliny retinové na pokožce. Další možností je zkouška in vitro na mikrozomech ke stanovení, zda takové látky vyvolávají dostatečnou inhibici esterifíkace retinolu, katalyzované LRAT nebo ARAT.

Uvedený prostředek je možno použít k péči o pleť místním nanesením prostředku na pokožku k napodobení účinku kyseliny retinové.

Pod pojmem „péče o pleť“ se rozumí například prevence a/nebo léčení suché pokožky nebo pokožky, poškozené například slunečním zářením, léčení nebo prevence vrásek, stařeckých skvrn, zvýšení flexibility stratům corneum nebo zesvětlení barvy pokožky a obecně zlepšení jejího celkového stavu.

Podle vynálezu je možno přidáním účinného množství sloučeniny, která v koncentraci 100 μΜ vyvolává inhibici nejméně 20 % esterifíkace retinolu, katalyzované ARAT nebo LRAT při měření in vitro na mikrozomech, podstatně zlepšit účinek kosmetického prostředku.

Popis výhodných provedení

První základní složkou kosmetického prostředku podle vynálezu je sloučenina ze skupiny, tvořené retinolem a retinylesteru. Pod pojmem „retinol“ se mimo jiné rozumí následující izomery retinolu. alfall-trans-retinol, 13-cis-retinol, 11-cis-retinol, 9-cis-retinol, 3,4-didehydroretinol. Výhodnými izomeryjsou alfall-trans-retinol, 13-cis-retinol, 3,4-didehydroretinol a 9-cis-retinol. Nejvýhodnější je alfal 1-trans-retinol vzhledem k tomu, že je běžně dodáván.

Retinyiester je ester retínolu. Retinylestery, vhodné pro použití v kosmetickém prostředku podle vynálezu, mají 1 až 30 atomů uhlíku, s výhodou 2 až 20 atomů uhlíku v esterové skupině, nejvýhodnější jsou estery, obsahující 2, 3 a 16 atomů uhlíku vzhledem k tomu, že jsou běžně dostupné. Jako příklady retiny testerů je možno uvést například: retinylpalmitát, retinylformiát, retinylacetát, retinylpropionát, retinylbutyrát, retinylvalerát, retinylisovalerát, retinylhexanát, retinylheptanoát, retinyloktanoát, retinylnonanoát, retinyldekanoát, retinylundekanoát, retinyllaurát, retinyltridekanoát, retinylmyristát, retinylpentadekanoát, retinylheptadekanoát, retinylstearát, retinylisostearát, retinylnonadekanoát, retinylarachidonát, retinylbehenát, retinyllinoleát a retinyloleát.

Výhodné estery pro použití v kosmetickém prostředku podle vynálezu se volí z retinylpalmitátu, retinylacetátu a retinylpropionátu vzhledem k tomu, že tyto látky se běžně dodávají a jsou proto nejlevnější. Retinyllinoleát je rovněž výhodný vzhledem ke své účinnosti.

Retinol a/nebo retinyiester je v prostředku podle vynálezu obsažen v množství 0,001 až 10 %, s výhodou v množství 0,01 až 1 % a zvláště 0,01 až 0,5 %.

Druhou základní složkou kosmetického prostředku podle vynálezu jsou látky, které při zkouškách na mikrozomech in vitro vyvolávají v koncentraci 100 μΜ nejméně 20% inhibici esterifíkace retinolu, katalyzované LRAT nebo ARAT. Dále bude popsána zkouška in vitro na mikrozomech pro stanovení vhodnosti zkoumané látky pro zařazení do kosmetického prostředku podle vynálezu.

Ve výhodném provedení vynálezu se pro zařazení do kosmetického prostředku volí látky, které v koncentraci 100 μΜ vyvolávají inhibici nejméně 40 a s výhodou nejméně 50 % esterifikace retinolu, katalyzované LRAT nebo ARAT.

Zkouška na mikrozomech in vitro

Mikrozomy se získají způsobem podle publikace J. C. Saari a D. L. Bredberg, CoA and NonCoA Dependent Retinol Esterification in Retinal Pigment Epithelium, J, Biol. Chem., 263, 8084 až 8090, 1988.

Roztok, obsahující 0,1 M pufru s fosfátem sodným o pH 7, 5 mM dithiothreitolu, 2 mg/ml sérového albuminu skotu, 40 μΜ roztok palmitoyl CoA, 40 μΜ roztok dialuroylfosfatidylcholinu, 10 μΜ roztok retinolu a zkoumanou látku nebo pouze rozpouštědlo v případě slepé zkoušky se inkubuje 1 hodinu při teplotě 37 °C s mikrozomální frakcí, izolovanou z pigmentových epitheliálních buněk sítnice skotu. Po inkubaci se reakce zastaví přidáním stejného objemu ethanolu a vytvořené retinylestery (retinyllaurát z reakce, katalyzované LRAT a retinylpalmitát z reakce, katalyzované ARAT) se extrahují hexanem. Hexanová vrstva se oddělí, odpaří pod dusíkem a odparek se analyzuje pomocí HPLC na sloupci v reverzní fázi Cis s rozměrem 3,9 x 300 mm při použití 80% methanolu v tetrahydrofuranu jako mobilní fáze a při detekci fluorescencí (excitace 325 nm, emise 480 nm) ke kvantitativnímu stanoveni retinylesteru, Množství esteru, vytvořeného v přítomnosti rozpouštědla jako slepé zkoušky se pokládá za 100 %, ze získaných hodnot se vypočítá inhibice tvorby esterů v procentech pro každou ze zkoumaných látek. Při kontrolním pokusu se stejné množství mikrozomů inaktivuje varem po dobu 5 minut, čímž dojde k nejméně 95% inhibici tvorby esteru.

Příkladem sloučenin, splňujících podmínky svrchu popsané zkoušky in vitro na mikrozomech mohou být deriváty cyklických nenasycených uhlovodíků, diterpeny, flavonony, flavonoly a některá smáčedla typu derivátů hydroxyethylimidazolínů s mastnými kyselinami. Tyto látky budou dále podrobněji popsány. Použít je však možno i jiné látky, pokud splní uvedené podmínky.

-3 CZ 295983 B6

Deriváty cyklických nenasycených sloučenin

Vhodné látky tohoto typu byly vybírány podle výsledků svrchu uvedené zkoušky na mikrozomech.

Výhodné deriváty cyklických nenasycených sloučenin se volí ze skupiny cyklických nenasycených aldehydů, ketonů, alkoholů a esterů.

Výhodnými cyklickými nenasycenými aldehydy, ketony, alkoholy a estery jsou: alfa-damaskon, 10 beta-damaskon, delta-damaskon, iso-damaskon, damascenon, alfa-ionon, beta-ionon, allyl— alfa-ionon, isobutylionon, alfa-methylionon, gamma-methylionon, brahmanol, sandanol, alfaterpineol, lyral, ethylsafranát a směsi těchto látek. Jde o sloučeniny s následující strukturou:

alfa-damaskon

de Ita-damaskon

-4CZ 295983 B6

damascenon

alfa-ionon.

bet a-i orion

alfa-methylionon

-5CZ 295983 B6

gamma-me thylionon

ethyl-safranát

K dosažení maximálních výhod při nejmenších nákladech se cyklická nenasycená sloučenina volí ze skupiny damaskonů a iononů se svrchu uvedenou strukturou.

Nejvýhodnějšími cyklickými nenasycenými sloučeninamijsou alfa-damaskon a/nebo alfa-ionon.

-6CZ 295983 B6

Cyklickou nenasycenou sloučeninu je možno do prostředku podle vynálezu zařadit v množství, které se pohybuje v rozmezí 0,0001 až 50 % hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost kosmetického prostředku, výhodné rozmezí je 0,01 až 10 a zvláště 0,1 až 5% hmotnostních.

Diterpeny

Diterpeny, vhodnými pro použití v kosmetickém prostředku podle vynálezu jsou takové diterpeny, které splňují svrchu uvedenou zkoušku na mikrozomech. Výhodný je geranylgeranion s následující strukturou

Diterpeny mohou být v kosmetickém prostředku podle vynálezu obsaženy v množství 0,0001 až 50 % hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost prostředku, výhodné rozmezí je 0,01 až 10 a zvláště 0,1 až 5 % hmotnostních. Smáčedla na bázi sloučenin hydroxyethylimidazolinu s mastnými kyselinami.

Ze smáčedel tohoto typu jsou vhodná ta smáčedla, která splňují podmínky svrchu uvedené zkoušky in vitro na mikrozomech. Výhodné látky tohoto typuje možno vyjádřit obecným vzorcem

R \—N—CH,CH,OH i kde R znamená alifatický nasycený nebo nenasycený uhlovodíkový zbytek s přímým nebo rozvětveným řetězcem, obsahující 8 až 20 atomů uhlíku.

Jako příklad vhodných hydroxyethylimidazolinových derivátů mastných kyselin je možno uvést kokoylhydroxyethylimidazolin, v němž R je odvozeno od masných kyselin kokosového oleje, z nichž většina má 12 atomů uhlíku a některé mají delší řetězce, dále může jít o laurylhydroxyethylimidazolin vzorce R = CH₃(CH₂)i₀, myristylhydroxyethylimidazolin vzorce R = CH₃(CH₂)|₂, stearylhydroxyethylimidazolin vzorce R=CH₃(CH₂)i₆ a oleylhydroxyethylimidazolin R % CH₃(CH₂)₇ CH = CH(CH₂)₇.

V uvedených sloučeninách obsahuje R s výhodou 8 až 18 a zvláště 11 až 18 atomů uhlíku. Nejvýhodněji je použitou látkou oleylhydroxyethylimidazolin vzhledem ke své účinnosti a dobré dostupnosti.

Uvedené hydroxyethylimidazolinové deriváty mohou být v kosmetickém prostředku podle vynálezu obsaženy v množství 0,0001 až 50 % hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost prostředku, s výhodou jsou obsaženy v množství 0,01 až 10 a zvláště 0,1 až 5% hmotnostních.

Kosmeticky přijatelný nosič

Kosmetický prostředek podle vynálezu obsahuje také kosmeticky přijatelný nosič jako ředidlo, disperzní prostředí nebo nosič pro retinol a/nebo retinylester a N-substituovaný amid mastné kyseliny, nosič nebo nosné prostředí slouží zejména ke snadnému nanášení kosmetického prostředku na pokožku.

-7CZ 295983 B6

Nosná prostředí, odlišná od vody nebo užívaná společně s vodou zahrnují kapalná nebo pevná změkčovadla, rozpouštědla, zahuštovadla, látky zadržující vodu a různé práškové materiály. Zvláště výhodným nosičem nevodné povahy je polydimethylsiloxan a/nebo polydimethylfenylsiloxan. Silikony pro použití v kosmetickém prostředku podle vynálezu mají s výhodou viskozitu 10 až 10 000 000 mm²/s při teplotě 25 °C. Zvláště vhodné jsou směsi silikonů s nízkou a vysokou viskozitou. Tyto silikony se běžně dodávají pod obchodními názvy Vicasil SE a SF (Generál Electric company) a pod čísly 200 a 550 (Dow Orning Company). Množství silikonu, které je možno použít v prostředku podle vynálezu je 5 až 95 %, s výhodou 25 až 90 % hmotnostních prostředku.

Kosmeticky přijatelný nosič bude tvořit obvykle 5 až 99,9, s výhodou 25 až 80 % hmotnostních prostředku a může v nepřítomnosti dalších kosmeticky přijatelných složek doplnit kosmetický prostředek na požadované množství. S výhodou tvoří nosné prostředí nejméně z 50 % a zvláště z 80 % hmotnostních voda. Výhodný obsah vody je zvláště 60 až 80 % hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost kosmetického prostředku.

Případné další účinné a pomocné složky

K získání emulze typu voda v oleji nebo olej ve vodě může být v kosmetickém prostředku podle vynálezu obsažen olej nebo materiál typu oleje spolu s emulgátorem v závislosti na hydrofílnělipofilní rovnováze HLB použitého emulgátoru.

Kosmetické prostředky podle vynálezu s výhodou obsahují ochranné látky proti slunečnímu záření. Jde o materiály, běžně užívané k ochraně proti ultrafialovému záření. Z těchto látek je možno uvést deriváty PABA, cinnamát a salicylát. Je například možno použít oktylmethoxycinnamát a 2-hydroxy-4-methoxybenzofenon, známý také jako oxybenzon. Oktylmethoxycinnamát a 2hydroxy-4-methoxybenzofenon se běžně dodávají pod obchodními názvy Parsol MCX a Benzophenon-3. Přesné množství těchto látek v emulzi se může měnit v závislosti na požadovaném stupni ochrany proti slunečnímu záření.

Další výhodnou případnou složkou jsou esenciální mastné kyseliny EFA, to znamená takové mastné kyseliny, které jsou nezbytné pro tvorbu plazmatické membrány všech buněk, například u keratinocytů dochází při nedostatku EFA ke zvýšené proliferaci. Tento stav je možno léčit dodáním EFA. EFA také podporuji biosyntézu lipidů v pokožce a poskytují lipidy pro tvorbu bariery pokožky. Z esenciálních mastných kyselin je možno zvláště uvést kyselinu linolovou, gammalinolenovou, homo-gamma-linolenovou, columbinovou, eicosa-(n-6,9,13)-trienovou, arachidonovou, timnodonovou, hexaenovou a směsi těchto kyselin.

Do kosmetických prostředků podle vynálezu se často přidávají změkčovadla. Množství změkčovadel se může pohybovat v rozmezí 0,5 až 50, s výhodou 5 až 30 % hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost prostředku. Změkčovadla pro toto použití jsou látky z různých chemických skupin, jako estery, mastné kyseliny a alkoholy, polyoly a uhlovodíky.

Estery mohou být monoestery nebo diestery. Přijatelnými příklady diesterů mastných kyselin mohou být dibutyladipát, diethylsebakát, diisopropyldimerát a dioktylsukcinát. Přijatelné estery mastných kyselin s rozvětveným řetězcem zahrnují 2-ethylhexylmyristát, isopropylstearát a isostearylpalmitát. Přijatelné estery trikarboxylových kyseliny zahrnují triisopropyltrilinoleát a trilaurylcitrát. Přijatelné estery mastných kyselin s přímým řetězcem zahrnují laurylpalmitát, myristyllaktát, oleylerukát a stearyloleát. Výhodnými estery jsou kokokaprylát/kaprát (směs kokokaprylátu a kokokaprátu), acetát myristyletheru propylenglykolu, diisopropyladipát a cetyloktanát.

Z vhodných mastných alkoholů a kyselin je možno uvést sloučeniny, obsahující 10 až 20 atomů uhlíku. Zvláště výhodné jsou cetyl·-, myristyl-, palmityl- a stearylalkoholy a příslušné kyseliny.

-8CZ 295983 B6

Z polyolů, použitých jako změkčovadla je možno uvést alkylpolyhydroxysloučeniny s přímým nebo rozvětveným řetězcem. Výhodnými látkami z této skupiny jsou propylenglykol, sorbitol a glycerol. Použitelné jsou také polymerní polyoly, jako polypropylenglykol a polyethylenglykol. Butylenglykol a propylenglykol jsou zvláště výhodné jako látky, které usnadňují průnik.

Z uhlovodíků, použitých jako změkčovadla je možno uvést zejména uhlovodíky, obsahující 12 až 30 atomů uhlíku. Specifickými příklady mohou být minerální olej, vazelína, squalen a isoparafíny·

Další kategorií funkčních složek pro kosmetické prostředky podle vynálezu jsou zahušťovadla. Látky tohoto typu budou obvykle obsaženy v množství 0,1 až 20, s výhodou 0,5 až 10 % hmotnostních z celkové hmotnosti kosmetického prostředku. Jako příklady zahušťovadel je možno uvést zesítěné polyakryláty, dodávané pod obchodním názvem Carbopol (B. F. Goodrich Company). Je také možno užít gumy, jako xanthan, carrageenan, želatinu, karayu, pektin a gumu z bobů. Za určitých okolností může být zahušťovadlo voleno z látek, použitých jako silikon nebo jako změkčovadla. Například silikonové pryže s viskositou vyšší než lOcentistoke a také některé estery, například glycerolstearát mohou v kosmetickém prostředku splnit dvojí funkci.

Do kosmetických prostředků podle vynálezu je možno začlenit také práškové materiály. Takovými složkami jsou například křída, mastek, kaolin, škrob, smektit, chemicky modifikovaný křemičitan hořečnatohlinitý, organicky modifikovaná montmorilonitová hlinka, hydratovaný křemičitan hlinitý, vysušený oxid křemičitý, oktenylsukcinát škrobu ve formě hlinité soli a směsi těchto látek.

Do kosmetických prostředků podle vynálezu mohou být zařazeny v malém množství také další složky, jako jsou barviva, parfémy a podobně. Množství těchto složek se může pohybovat v rozmezí 0,001 až 20 % hmotnostních.

Použití kosmetického prostředku

Kosmetický prostředek podle vynálezu je primárně určen pro místní podání na lidskou pokožku, zejména k péči o pleť a k prevenci nebo odstranění vrásek nebo jiných projevů stárnutí pokožky.

Při použití se malé množství prostředku, například 1 až 100 ml, nanese na příslušné části pokožky z vhodné nádobky nebo aplikátoru a popřípadě se pak materiál roztírá a/nebo vetře do pokožky rukou, prsty nebo vhodnými pomůckami.

Výrobky a balení

Prostředky podle vynálezu pro místní podání mohou být například emulze, krémy nebo gely. Tyto materiály mohou být baleny do vhodných nádobek podle viskozity a předpokládaného použití. Například emulze nebo krémy je možno uložit do lahviček, popřípadě opatřených ve výstupním otvoru kulkou pro snadnější nanášení, nebo je možno prostředek uložit do přístroje pro nanášení aerosolu s hnacím prostředkem nebo do nádobky s mechanickým nanášením pomocí prstů. V případě krémuje možno použít nedeformující se kelímek nebo také tubu. Prostředek je rovněž možno ukládat do kapslí, například podle US 5 063 057.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu. V příkladové části přihlášky budou užity různé materiály a budou také prováděny různé typy zkoušek.

-9CZ 295983 B6

Materiály a metody

Buněčná kultura

Lidské keratinocyty, izolované z předkožky novorozence působením trypsinu se pěstují v Eaglově prostředí v Duíbeccově modifikaci DME HamsF12 (1 : 1) s 10% fetálního telecího séra v přítomnosti ozáření myších fibroblastů 3T3 pro zahájení dělení kolonií keratinocytů. Buňky byly pěstovány až do druhé pasáže a pak byly udržovány ve zmrazeném stavu pro příští použití. Pak byly keratinocyty opět rozmraženy ve svrchu uvedeném prostředí a pěstovány 5 dnů, načež bylo prostředí vyměněno na prostředí na bázi MCBD 153, prosté séra a vhodné pro pěstování keratinocytů, KGM (Clonetic Corporation, San Diego, CA), prostředí obsahuje 0,15 mM vápníku, nebo je také možno užít prostředí KSFM, prosté séra a vhodné pro pěstování keratinocytů (GIBCO), které obsahuje 0,09 mM vápníku. Ve dni 7 vytvořil buněčný materiál vrstvu, souvislou na 80 až 90 %, vrstva byla zpracována trypsinem a nanesena na plotny v prostředí, prostém séra, pro různé zkoušky.

Zkouška s thymidinem

Příjem ³H-thymidinu a proliferace keratinocytů

Příjem ³H-thymidinu keratinocyty, pěstovanými v kultuře, byl užit jako zkouška na proliferaci keratinocytů. Thymidin je jeden ze čtyř deoxynukleotidů, které jsou monomemími jednotkami DNA, univerzální banku genetické informace u živočichů.před dělením buněk, například keratinocytů dochází k úplné replikaci genomu dělící se buňky. K tomuto účelu buňka produkuje velké množství DNA tak, aby obě dceřinné buňky obsahovaly totožné kopie genetického materiálu.

V případě, že se do živného prostředí pro keratinocyty přidá ³H-thymidin, dojde k zařazení tohoto značeného nukleosidu do nově syntetizované DNA v průběhu přípravy na dělení buněk. Míra příjmu radioaktivního thymidinu do určité populace buněk je tedy přímo úměrná množství syntetizované DNA v této buněčné populaci a je tedy současně také indikátorem proliferace těchto buněk.

Keratinocyty, pěstované svrchu uvedeným způsobem se nanesou na plotny s 24 vyhloubeními v množství 20 000 buněk na vyhloubení v 1 ml prostředí. Materiál se inkubuje 4 dny nebo tak dlouho, až se vytvoří vrstva, souvislá na 60 až 70 %, pak se prostředí vymění za čerstvé prostředí. 24 hodin po výměně prostředí se ve trojím opakování do vyhloubení přidají zkoumané látky a po dalších 4 hodinách se do každého vyhloubení přidá ještě 50 mikrolitrů živného prostředí s obsahem 1 pCi ³H-thymidinu. Buněčný materiál se pak inkubuje dalších 24 hodin. Pak se prostředí odstraní, přidá se 10% kyselina trichloroctová TCA, chlazená ledem a plotny se inkubují v ledu 30 minut. Pak se buněčný materiál pětkrát promyje 5% TCA a nechá se rozpouštět v 500 mikrolitrech 0,1 MNaOH nejméně 1 hodinu, obvykle přes noc. Pak se vzorky neutralizují přidáním 0,1 M HC1, načež se 50 mikrolitrů preparátu užije ke stanovení celkového obsahu bílkovin. Radioaktivní vodík v DNA se na základě počtu rozpadů za minutu DPM stanoví kapalinovou scintilací při použití vzorku s objemem 900 mikrolitrů. Příjem thymidinu se vyjádří jako DPM/mikrogram bílkoviny.

Zkouška na transglutaminázu

Zkouška na transglutaminázu a diferenciace keratinocytů

V průběhu konečné diferenciace epidermis se vytváří na vnitřním povrchu periferie buněk vrstva bílkoviny s tloušťkou 15 nm, označovaná jako obalová vrstva CE. Tato vrstva CE je tvořena řadou bílkovin, které byly spolu zesítěny za tvorby N^eta-(gamma-glutamyl)lysinisodipeptidových vazeb, tato tvorba je katalyzována působením nejméně dvou různých transglutamináz TG, k jejichž expresi dochází v epidermis. K expresi transglutaminázy I TG I dochází ve velkém množství v diferencovaných vrstvách epidermis, zvláště v granulární vrstvě, avšak nedochází k ní

-10CZ 295983 B6 v nediferencované bazální vrstvě. To znamená, že uvedený enzym je vlastně průkazem diferenciace keratinocytů, přičemž vyšší množství enzymu je vždy ukazatelem diferencovanějšího stavu. Při průkazu tohoto enzymu zkouškou ELISA při použití protilátky proti uvedenému enzymu je možno prokázat stav diferenciace vypěstovaných keratinocytů, jak bude uvedeno v následujících příkladech.

V případě příkladu 1 bylo použito následujícího postupu:

Keratinocyty, vypěstované svrchu uvedeným způsobem, byly naneseny na plotnu s 96 vyhloubeními v množství 3000 buněk na vyhloubení ve 200 mikrolitrech živného prostředí. Po inkubaci 4 dny bylo prostředí vyměněno za prostředí, obsahující zkoumané látky, každá látka byla užita v dané koncentraci vždy v šesti opakováních. Pak byly buňky pěstovány dalších 72 hodin a pak po odsátí živného prostředí byly plotny uloženy při teplotě -70 °C. Pro použití byly plotny vyjmuty z mrazicího zařízení a buněčný materiál byl promytPBS. Bylo přidáno 100 mikrolitrů sterilní vody a buněčný materiál se rozruší zmrazením na -70 °C s následným rozmražením. Buňky se inkubují 1 hodinu při teplotě místnosti v PBS se 3 % BSA, jde o promývací pufr se sérovým albuminem skotu, pak se buněčný materiál promyje čerstvým podílem promývacího pufru. Buňky se inkubují spolu s 50 mikrolitry primární myší monoklonální protilátky proti lidské transglutamináse, IgG (Biomedical Industries) v ředění 1 : 2000 v promývacím pufru 1 hodinu při teplotě 37 °C a pak se promyjí dvakrát po sobě promývacím pufrem. Pak se buněčný materiál inkubuje 150 mikrolitry sekundární protilátky (fragment Fab, protilátka IgG proti myším tkáním, konjugované s peroxidázou, Amersham) v ředění 1 :4000 v promývacím pufru 1 hodinu při teplotě 37 °C, načež se dvakrát promyje promývacím pufrem. Buňky se inkubují s roztokem substrátu, jde o roztok 4 mg o-fenylendiaminu a 3,3 mikrolitrů 30% peroxidu vodíku v 10 ml a 0,1 M citrátového pufru o pH 5,0 celkem 5 minut při teplotě místnosti ve tmě pod hliníkovou fólií. Reakce se zastaví přidáním 50 mikrolitrů 4 N kyseliny sírové. Absorbance vzorků se odečítá příslušným přístrojem při 492 nm. Ze Šesti vzorků byly ke čtyřem vzorkům přidány obě protilátky, ke dvěma byla přidána pouze sekundární protilátka ke stanovení vazby protilátky, konjugované s enzymem. Koncentrace transglutaminázy byly stanoveny odečtením takto zjištěného pozadí z koncentrace, zjištěné v jednotlivých vzorcích a stanovením směrodatné odchylky pro vzorky, k nimž byly přidány obě protilátky.

V ostatních příkladech byl užit následující postup:

Keratinocyty, vypěstované svrchu uvedeným způsobem byly naneseny na plotnu s 96 vyhloubeními v množství 3 000 buněk na vyhloubení ve 200 ml živného prostředí. Po inkubaci 4 dny bylo prostředí nahrazeno prostředím s obsahem zkoumaných látek, zkoušky byly prováděny v šesti opakováních. Pak byl buněčný materiál pěstován ještě 72 hodin, načež byly po odsátí živného prostředí plotny uloženy při -70 °C. Po vyjmutí z mrazicího zařízení byl buněčný materiál znovu zmrazen a rozmražen a pak třikrát promyt PBS. Pak byly buňky inkubovány 1 hodinu při teplotě místnosti v pufru TBS s 5 % BSA. Pak byly buňky inkubovány se 100 mikrolitry primární protilátky, monoklonální myšíprotilátky IgG proti lidské transglutamináse (Biomedical Technologies Inc.) v ředění 1 : 2000 v pufru TBS s 1 % BSA 2 hodiny při teplotě 37 °C, načež byly 6x promyty promývacím pufrem TBS s 1 % BSA a s 0,05 % Tween-20. Pak byl buněčný materiál inkubován se 100 mikrolitry fragmentu Fab sekundární protilátky, protilátky IgG proti myším tkáním, konjugované s peroxidázou (Amersham) v ředění 1 : 4000 v promývacím pufru celkem 2 hodiny při teplotě 37 °C, načež byl materiál 3x promyt promývacím pufrem a pak ještě 3x PBS. Buňky pak byly inkubovány s roztokem substrátu, 4 mg o-fenylendiaminu a 3,3 mikrolitrů 30% peroxidu vodíku v 10 ml 0,1 M citrátového pufru o pH 5,0 celkem 5 minut při teplotě místnosti a ve tmě pod hliníkovou fólií. Reakce byla zastavena přidáním 50 mikrolitrů 4 N kyseliny sírové. Absorbance vzorků byla odečítána příslušným přístrojem při 492 nm. Ze šesti opakování byly ke čtyřem vzorkům přidány obě protilátky a ke dvěma z nich pouze sekundární protilátka ke stanovení pozadí vazby enzymu konjugovanou protilátkou. Koncentrace transglutaminázy I byly stanoveny odečtením tohoto pozadí od výsledku pro každý ze vzorků za současného stanovení směrodatné odchylky.

-11 CZ 295983 B6

Stanovení DNA

Množství transglutaminázy I, zjištěná po zpracování buněk může být ovlivněna počtem buněk, to znamená, že čím větší bude počet buněk, tím vyšší bude koncentrace enzymu. Koncentrace enzymu byla tedy normalizována na obsah DNA v buňkách téhož vyhloubení, čímž byly vyloučeny variace, způsobené rozdílem v počtu buněk. Kvantitativní stanovení DNA je zvláště vhodným ukazatelem počtu buněk včetně keratinocytů vzhledem k tomu, že každá z buněk má stejný genom a tím i stejné množství DNA. Celkové množství DNA ve vyhloubení je tedy přímo úměrná počtu buněk v tomto vyhloubení. Pak je možno stáhnout údaje o koncentraci enzymu na zjištěné množství DNA.

Keratinocyty byly naneseny na plotny s 96 vyhloubeními v množství 3000 buněk na vyhloubení ve 200 mikrolitrech živného prostředí. Po inkubaci 4 dny bylo prostředí nahrazeno prostředím s obsahem zkoumaných látek, každá zkouška byla provedena v šesti opakováních. Pak byly buňky pěstovány ještě 72 hodin, načež bylo živné prostředí odstraněno odsátím a plotny byly uloženy nejméně na 1,5 hodiny při teplotě -70 °C. Pak byly plotny vyjmuty z mrazicího zařízení a na 30 minut rozmraženy, do každého vyhloubení bylo přidáno 100 mikrolitrů barviva Hoechst (konečná koncentrace 1 mikrogram/ml) a plotny byly inkubovány 15 minut, překryty a výsledek byl odečítán fluorimetrem (excitace 360 nm, emise 460 nm). Pak byl roztok barviva odstraněn a vyhloubení byla promyta PBS a tak připravena na stanovení transglutaminázy.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Kyselina retinová je účinnější než retinol při změně stadia diferenciace keratinocytů

Byl sledován účinek transglutaminázy, normalizované na obsah DNA v buňkách po přidání kyseliny retinové RA a retinolu ROH, výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 1 :

Tabulka 1

	průměr TGáza/DNA x 10 ⁴ + s.d. (% kontroly)	hodnota p proti kontrole	PPro 2.5x 10’MROH	ppro 2.5x 10 ⁸ M ROH	ppro 2.5x 10'⁹MROH
kontrola	2.44 + 0.24(100%)	-	0.001	0.001	0.001
2.5x10’’ M RA	0.16 ±0.11 (7%)	0.001	0.001	0.001	0.001
2.5xl0⁷ M ROH	1.14 ±0.22 (47%)	0.001	-	0.001	0.001
2.5xl0‘⁸ MRA	1.34 ±0.40 (55%)	0.001	0.2	0.001	0.001
2.5χ10⁸M ROH	1.89 ±0.30 (77 %)	0.001	0.001	-	0.001
2.5x10·’ MRA	1.87 ± 0.49 (77 %)	0.001	0.001	0.784	0.001
2.5x10’’ M ROH	2.70 ±0.59 (>100%)	0.001	0.001	0.001	—

n = 3

Všechny zkoušené koncentrace kyseliny retinové, to znamená 2,5 x 10“⁷M, 2,5 x 10“⁸M a 2,5 x 10~⁹ M snižovaly diferenciaci keratinocytů ve významně vyšším rozsahu než retinol ve stejných koncentracích. Snížení množství transglutaminázy bylo závislé na dávce jak v případě

-12CZ 295983 B6 kyseliny retinové, tak v případě retinolu. To je v souladu se skutečností, že kyselina retinová má na diferenciaci epithelu větší účinnost než retinol.

Příklad 2

Esterifikace retinolu v mikrozomech in vitro

Mikrozomy byly získány podle publikace J. C. Saari a D. L. Bredberg, CoA and Non-CoA Dependent Retinol Esterifikation in Retinal Pigment Epithelium, J. Biol. Chem., 23, 8084 až 8090, 1988:

Roztok, obsahující 0,1 M pufru s fosfátem sodným o pH 7, 5 mM dithiothreitolu, 2 mg/ml sérového albuminu, skotu, 40 μΜ roztok palmitoyl CoA, 40 μΜ roztok dilauroylfosfatidylcholinu, 10 μΜ roztok retinolu a zkoumanou látku nebo pouze rozpouštědlo V případě slepé zkoušky se inkubuje 1 hodinu při teplotě 37 °C s mikrozomální frakci, izolovanou z pigmentových epitheliálních buněk sítnice skotu. Po inkubaci se reakce zastaví přidáním stejného objemu ethanolu a vytvořené retinylestery (retinyllaurát z reakce, katalyzované LRAT a retinylpalmitát z reakce, katalyzované ARAT) se extrahují hexanem. Hexanová vrstva se oddělí, odpaří pod dusíkem a odparek se analyzuje pomocí HPLC na sloupci v reverzní fázi Ci₈ s rozměrem 3,9 x 300 mm při použití 80% methanolu v tetrahydrofuranu jako mobilní fáze a při detekci fluorescenci (excitace 325 nm, emise 480 nm) ke kvantitativnímu stanovení retinylesteru. Množství esteru, vytvořeného v přítomnosti rozpouštědla jako slepé zkoušky se pokládá za 100 %, ze získaných hodnot se vypočítá inhibice tvorby esterů v procentech pro každou ze zkoumaných látek. Při kontrolním pokusu se stejné množství mikrozomů inaktivuje varem po dobu 5 minut, čímž dojde nejméně 95% inhibici tvorby esteru.

Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 2:

Tabulka 2 sloučenina_________________________koncentrace μΜ % inhib. ARAT % inhib. LRAT

oleylhydroxyethylimidazolin	100	90	95
oleylhydroxyethylimidazolin	10	14	28
kapryloylhydroxyethylimidazolin	100	-	8
diazolidinyl močovina	100	0	0
thiamin	100	0	0
kofein	100	0	0
adenin	100	0	0
kyselina fenylbenzimidazolsulfonová	100	0	0
uráčil	100	0	0
tryptofan	100	0	0
kokoglutamát	100	0	0
dimethylkokoaminoxid	100	0	0
sodná sůl kokoaminu diacetátu	100	0	0
oleylamidopropylbetain	100	0	0
oleylaminoxid	100	0	0
lauroylsarkosin	100	20	0

Je zřejmé, že smáčedla na bázi hydroxyethylimidazolinu jsou účinnými inhibitory esterifikace, jiná smáčedla a jiné heterocyklické sloučeniny jsou v podstatě neúčinné. Hydroxyethylimidazolinový derivát kyseliny kaprylové vzorce I (R = CH₃(CH₂)₆) neinhibuje dostatečně LRAT.

-13CZ 295983 B6

Příklad 3

Byl opakován postup podle příkladu 2 při použití různých hydroxyethylimidazolidinových smáčedel se skupinami R, uvedenými v tabulce 3. Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 3.

Tabulka 3

R	konc. μΜ	% INHIB. ARAT	% INHIB. LRAT
Oleyl	100	90	90
Oleyl	10	15	12
Lauryl	100	53	47
Lauryl	10	0	0
Coco	100	68	65
Coco	10	0	0

Výsledky v tabulce 3 ukazují relativní účinnost zbytku kyseliny olejové, laurové a zbytků kyselin z kokosového oleje. Zbytky kyselin z kokosového oleje jsou velmi výhodné pravděpodobně z toho důvodu, že neobsahují pouze zbytky o 12 atomech uhlíku, nýbrž také některé delší zbytky.

Údaje v tabulce 2, týkající se hydroxyethylimidazolinového derivátu kyseliny kapiylové ukazují pouze 8% inhibici při koncentraci 100 μΜ. Je tedy zřejmé, že výhodnost klesá od nejvhodnějšího zbytku kyseliny olejové přes zbytky kyselin z kokosového oleje a zbytek kyseliny laurové až ke zbytku kyseliny kaprylové.

Příklad 4

Zkouška na transglutaminázu byla provedena při použití oleylhydroxyethylimidazolinuOHI, kyseliny retinové RA, retinolu ROH a retinylpalmitátu RP. Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 4.

Tabulka 4

příkl.	sloučenina	konc. μΜ	% kontroly
1	RA	0.25	35.1
1	ROH	0.25	76.2
1	OHI	1	80.7
1	ROH+OHI	0.25+1	45.1
2	RA	0.25	43.4
2	ROH	0.025	91.6
2	OHI	1	78.2
2	ROH+OHI	0.025+1	57.9
3	RA	0.25	45.9
3	RP	0.25	91.6
3	OHI	1	91.1
3	RP+OHI	0.25+1	71.6

-14CZ 295983 B6

Z výsledků, uvedených v tabulce 4 je zřejmé, že kyselina retinová podstatně snižuje diferenciaci keratinocytů, zatímco retinol, oleylhydroxyethylimidazolina retinylpalmitát neovlivní diferenciaci keratinocytů nebojí ovlivní jen do menšího rozsahu než kyselina retinová.

V pokusech I a 2, v nichž byl retinol kombinován s oleylhydroxyethylimidazolinem, došlo k synergnímu účinku na pokles diferenciace keratinocytů na hodnoty, odpovídající hodnotám při použití kyseliny retinové.

V pokusu 3 byl oleylhydroxyethylimidazolin kombinován s retinylpalmitátem, výsledek nebyl io tak průkazný jako v pokusech 1 a 2, přesto však je možno pozorovat synergní účinek na pokles diferenciace.

Tento příklad také prokazuje, že sloučeniny, které splňují podmínky zkoušky na mikrozomech in vitro, mají účinek na keratinocyty v kombinaci s retinolem, přičemž tento účinek je srovnatelný 15 s účinkem kyseliny retinové.

Příklad 5

Zkouška in vitro na mikrozomech byla provedena se sloučeninami, uvedenými v následujících tabulkách 5A a 5B.

Sloučeniny z tabulky 5A byly podrobeny zkouškám v koncentraci 100 μΜ. Sloučeniny z tabulky RB byly zkoušeny v koncentraci 100 μΜ.

Tabulka 5 A

sloučenina	% inhib. ARAT	% inhib. LRAT
alfadamaskon	83	98
betadamASKON	84	92
deltadamaskon	87	95
isodamaskon	80	92
damascenon	70	79
alfaionon	45	49
betaionon	22	24
allylalfa-ionon	22	36
isobutylionon	8	45
alfa-methylionon	67	77
gamma-methyl ionon	21	38
brahmanol	70	75
sandanol	15	43
alfa-terpineol	26	25
timberol	34	33
lyral	76	71
tonalid	50	33
ethylsafranát	51	49
traseolid	41	21
sandalon	23	12

-15CZ 295983 B6

Tabulka 5B

alfa-damaskon	67	87
beta-damaskon	45	52
delta-damaskon	58	64
damascenon	23	29
allylalfa-ionon	16	17

Z výsledků, uvedených v tabulkách 5A a 5B je zřejmé, že některé cyklické alifatické nenasycené sloučeniny jsou účinnými inhibitory esterifikace retinolu, katalyzované působením LRAT a ARAT.

Srovnávací příklad 6

Zkouška in vitro na mikrozomech byla provedena s dalšími cyklickými alifatickými nenasycenými sloučeninami. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 6, v níž byla každá látka podrobena zkouškám při koncentraci 100 μΜ.

Tabulka 6 % inhib. LRAT sloučenina % inhib. ARAT

dihydro-alfa-ionon	13	18
alfa-ionol	0	0
beta-ionol	0	0
cinnamaldehyd	0	0
vanilin	0	0
eukalyptol	0	0
mentol	0	0
thymol	0	0
carvon	0	0
kamphor	0	0
menton	0	0
fenchylalkohol	12	4
isocyklogeraniol	18	16
dimethylionon	0	9
delta-methylionon	0	10

Z výsledků je zřejmé, že jen některé cyklické alifatické nenasycené sloučeniny vyvolávají dostatečnou inhibici esterifikace retinolu, katalyzované LRAT a ARAT.

Příklad 7

Byl zkoumán vliv sloučenin z tabulky 7 a jejich kombinací na diferenciaci keratinocytů. Výsledky byly vyjádřeny v procentech kontroly. Koncentrace transglutaminázy byla normalizována na množství DNA. Údaje jsou ze dvou pokusů, v nichž byla pozměněna koncentrace retinolu. Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 7.

-16CZ 295983 B6

Tabulka 7

pokus	sloučenina	koncentrace mM	% kontroly
1	kyselina retinová	0,00025	24
1	retinol	0,001	67
1	alfa-damaskon	1	92
1	retinol + alfa-damaskon	0,001+1	34
2	kyselina retinová	0,00025	8
2	retinol	0,00025	63,5
2	alfa-damaskon	1	86
2	retinol + alfa-damaskon	0,00025+1	30

Výsledky v tabulce 7 prokazují, že samotný alfa-damaskon a samotný retinol nejsou příliš účinné, avšak kombinace těchto dvou látek dává vznik synergii a zvýšenému snížení množství transglutaminázy, která napodobuje účinek kyseliny retinové na diferenciaci keratinocytů. Výsledky jsou také dokladem dobré korelace mezi zkouškou in vitro na mikrozomech a mezi výsledky, získanými na buněčné kultuře.

Příklad 8

Test in vitro na mikrozomech byl proveden s diterpenovými sloučeninami, geranylgeraniolem nebo famesolem. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 8.

Tabulka 8

sloučenina	koncentrace μΜ	% inhibice ARAT	% inhibice LRAT
geranylgeraniol¹	100	81	77
geranylgeraniol	10	38	16
famesol²	100	43	43
famesol	10	20	10

TCI America (Portland, Oregon) nebo také Sigma a CTC Organics (Atlanta, Georgia).

Givaudan Co., Bedoukian Co., nebo Dragaco Co.

Z výsledků, uvedených v tabulce 8 je zřejmé, že geranylgeraniol i famesol způsobují inhibici esterifikace retinolu. Geranylgeraniol je podstatně účinnější inhibitor esterifíkace než famesol s následující strukturou:

- 17CZ 295983 B6

Příklad 9

Příjem ³H-thymidinu byl měřen způsobem, který byl popsán svrchu při popisu použitých metod. Získané výsledky jsou shrnuty v tabulkách 9A a 9B.

Tabulka 9A

Pokus 1

	DPM/mikrogram průměr	bílkoviny s.d.	% kontroly
kontrola		(278)	100
250 nM retinolu	2082	(146)	108
250 nM kyseliny retinové	3013	(226)	156
250 nM retinolu +10 nM geranylgeraniolu	2970	(308)	154

Tabulka 9B

Pokus 2

	DPM/mikrogram průměr	bílkoviny s.d.	% kontroly
kontrola		(322)	100
250 nM retinolu	974	(148)	107
250 nM kyseliny retinové	1494	(45)	163
250 nM retinolu + 10 nM geranylgeraniolu	1450	(318)	159

Z výsledků je zřejmé, že geranylgeraniol významně zvyšuje účinek retinolu na proliferaci buněk až do úrovně, srovnatelné s působením kyseliny retinové. Výsledky jsou rovněž důkazem dobré korelace mezi výsledky zkoušky na mikrozomech a výsledky, získanými v buněčné kultuře.

Příklad 10

Zkouška na mikrozomech in vitro byla provedena při použití sloučenin, uvedených v tabulce 10. Získané výsledky jsou shrnuty rovněž v tabulce 10. Sloučeniny byly použity v koncentraci 100 μΜ.

Tabulka 10 % inhibice LRAT sloučenina % inhibice ARAT

kontrola	0	0
naringenin	33	14
quercetin	25	14

-18CZ 295983 B6

Příklad 11

Synergní inhibice diferenciace karatinocytů kombinací naringeninu a retinolu

Po působení zkoumaných látek po dobu 72 hodin byly zjištěny koncentrace transglutaminázy I, normalizované na obsah DNA v buňkách. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 11. Naringenin byl získán od firmy Sigma.

Tabulka 11

Vliv retinolu a naringeninu na transglutaminázu keratinocytů/DNA

	průměr TGáza/DNA xlO⁵ ± s.d. (% kontroly)	p proti kontrole	p pro 2.5 x 10'⁹MROH	p pro 2.5 x 10“⁷MRA	ppro 10“⁷M naringenin
	52.78 ±5.69 (100%)	-	0.235	0.001	0.329
2.5x10''MRA	22.47 ±2.31 (42%)	0.001	0.001	-	0.001
2.5xl0'⁹ M Retinol	48.31 ±5.31 (92%)	0.235		0.001	0.585
10^-/ M Naringenin	49.84 ± 2.76 (94 %)	0.329	0.585	0.001	-
2.5xl0~⁹ M ROH + 10“⁷ M Naringenin	27.61 ± 10.79 (53 %)	0.002	0.005	0.328	0.002

n = 3

Z výsledků, uvedených v tabulce 11 je zřejmé, že 2,5 x 10 ⁷M kyseliny retinové mělo značný účinek na potlačení transglutaminázy I v keratinocytech, a to až na 42 % hodnoty pro kontroly. Množství 2,5 x 10^-9 retinolu bylo zcela neúčinné (91 %) a 10'⁷M naringeninu rovněž nemělo žádný vliv na koncentraci enzymu. Avšak při použití směsi 2,5 x 10“⁹ M retinolu a 10“⁷ M naringeninu došlo ke nížení koncentrace transglutaminázy I až na 53 % koncentrace u kontrol. Naringenin a retinol tedy měly synergní účinek při potlačování diferenciace geratinocytů, přičemž tento účinek byl srovnatelný s účinkem kyseliny retinové.

Příklad 12

Synergní účinek naringeninu a retinylpalmitátu na inhibici diferenciace keratinocytů

Účinek uvedených látek na koncentraci transglutaminázy I, normalizovanou na obsah DNA v buňkách byl sledován po působení zkoumaných látek po dobu 72 hodin. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 12.

-19CZ 295983 B6

Tabulka 12

Účinek retinylpalmitátu a naringeninu na transglutaminázu keratinocytů/DNA

	průměr TGázy/DNA x 10⁵ ± s.d. % kontroly	p proti kontrole	p pro 2.5.x 10⁶MRP	p pro 2.5 x 10'⁷MRA	ppro 10“⁸ M naringenin
Control	50.64 ± 1.74 (100 %)	-	0.143	0.001	0.001
2.5x10“™ ^kA	16.31 +2.58 (32 %)	0.001	0.001	-	0.001
2.5xl0'⁸ M Retinyl Palmitate (RP)	47.32 ± 4.22 (93 %)	0.143	—	0.001	0.296
10'⁸ M Naringenin	45.01 ± 1.90 (89%)	0.001	0.296	0.001	-
2.5x10'“ M RP + 10'⁸ M Naringenin	43.12 ± 13.01 (85 %)	0.005	0.036	0.001	0.065

n = 3

Z výsledků v tabulce 12 je zřejmé, že 2,5 x 10'⁷ M kyseliny retinové účinně potlačuje koncentraci ío transglutaminázy I v keratinocytech, a to až na 32 % hodnot u kontrol. Koncentrace 2,5 x 10'⁹ M retinylpalmitátu je neúčinná (93 %) a 10~⁸ M naringeninu má jen malý inhibiční účinek na transglutaminázu I. Avšak kombinace 2,5 x 10'⁸ M retinolu a 10~⁹ M naringeninu snižuje koncentraci transglutaminázy I v keratinocytech na 85 % kontrolních hodnot. Jde tedy o synergní účinek, kombinace obou látek potlačuje diferenciaci keratinocytů obdobným způsobem jako kyseli15 na retinová.

Příklad 13

Quercetin a retinol mají synergní inhibiční účinek na diferenciaci keratinocytů

Byl zkoumán účinek použitých látek po jejich působení 72 hodin na koncentraci transglutaminázy I, normalizovanou na obsah DNA v buňkách. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 13. Quercetin byl získán od firmy Sigma.

Tabulka 13

	průměr TGázy/DNA x 10⁵ ± s.d. % kontroly	p proti kontrole	p pro 2.5 x 10'⁷ M ROH	p pro 2.5 x 10'⁷ M RA	^ppro 1 (Γ⁶ M quercetin
	69.16 ± 4.26 (100 %)	-	0.042	0.001	0.003
2.5x10'⁷ MRA	35.91 ±3.01 (52%)	0.001	0.001	-	0.001
2.5x10^/ M Retinol	61.93 ±5.18 (90%)	0.042	-	0.001	0.328
10”⁶ M Quercetin	59.04 ± 3.38 (85 %)	0.003	0.328	0.001	-
2.5xl0'⁷ M ROH + 10'⁶ M Quercetin	48.45 ± 8.60 (70 %)	0.001	0.017	0.015	0.034

n = 3

Z výsledků, uvedených v tabulce 13 je zřejmé, že koncentrace 2,5 x 1(T⁷M kyseliny retinové účinně snižuje množství transglutaminázy I v keratinocytech, a to až na 52 % kontrolní hodnoty.

Koncentrace 2,5 x 10“⁷M retinolu je neúčinná (90%) a 10 ⁶M quercetinu mělo jen malý inhibiční účinek na množství uvedeného enzymu. Avšak kombinace 2,5xlO⁷M retinolu + 10“⁶ M quercetinu snížila koncentraci transglutaminázy v keratinocytech až na 70 % kontrolní

-20CZ 295983 B6 hodnoty. Obě látky tedy měly synergní účinek a potlačovaly diferenciaci keratinocytů způsobem, srovnatelným s účinkem kyseliny retinové.

V průběhu uvedených zkoušek byla kyselina retinová použita jako pozitivní kontrola a referenční sloučenina, s níž byl srovnáván účinek dalších zkoumaných látek. Kyselina retinová snižuje koncentraci transglutaminázy I v keratinocytech pokožky v závislosti na použité dávce. Jinak řečeno, kyselina retinová snižuje diferenciaci keratinocytů. Retinol a retinylpalmitát jsou při inhibici diferenciace keratinocytů statisticky významně méně účinné než kyselina retinová.

Neočekávané výsledky, ilustrované jednotlivými příklady prokazují, že účinek retinolu nebo retinylesteru na keratinocyty, pěstované v buněčné kultuře je možno zvýšit až na účinek, srovnatelný s účinkem kyseliny retinové tak, že se retinol nebo jeho ester kombinuje se sloučeninou, která v koncentraci 100 μΜ vyvolává alespoň 20% inhibici esterifíkace retinolu, katalyzované LRAT nebo ARAT při měření zkouškou na mikrozomech in vitro. Tato látka se užije v množství 0,0001 až 50 % hmotnostních, vztaženo na celkové množství použitého prostředku. Získaný účinek je vyšší než účinek retinolu nebo jeho esteru nebo použité látky jako takové, jde o synergní účinek obou látek, vyvolávající u keratinocytů odpověď, srovnatelnou súčinkem kyseliny retinové.

Svrchu uvedené výsledky prokazují, že sloučeniny, které splňují podmínky zkoušky in vitro na mikrozomech, působí synergním způsobem s retinolem a retinylestery a snižují diferenciaci keratinocytů a/nebo zvyšují jejích proliferaci, takže jejich účinek na keratinocyty je obdobný účinku kyseliny retinové.

V následujících příkladech 14 až 19 jsou uvedeny různé kosmetické prostředky podle vynálezu, určené pro místní podání. Prostředky je možno připravit obvyklým způsobem a použítje k běžnému účelu, zejména jsou tyto prostředky vhodné pro ošetření vrásek, drsné a suché pokožky, otupující se, stárnoucí a/nebo ultrafialovým zářením poškozené pokožky, kde mohou zlepšit celkový vzhled i pocit na pokožce. Prostředky jsou také určeny k použití na zdravou pokožku k prevenci nebo zpomalení jejího stárnutí.

Příklad 14

Tento příklad uvádí kosmetický prostředek podle vynálezu typu emulze voda v oleji s vysokým obsahem vnitřní fáze.

% hmotnostní

	A	B	C	D
retinol	0,5	—	_	0,01
retinylpalmitát	-	0,15	0,15	-
plně hydrogenovaný kokosový olej	3,9	3,9	3,9	3,9
naringenin	-	5	0,1	5
quercetin	1	1	-	-
brij 92^x	5	5	5	5
bentone 38	0,5	0,5	0,5	0,5
MgSO₄.7H₂O	0,3	0,3	0,3	0,3
butylovaný hydroxytoluen	0,01	0,01	0,01	0,01
parfém		podle potřeby
voda do	100	100	100	100

Brij 92 je polyoxyethylen (2) oleylether

-21 CZ 295983 B6

Příklad 15

Krém typu olej ve vodě

	A	% hmotnostní
B	C	D
retinylpalmitát	_	0,15	0,15
retinol	0,15	—	0,001	0,15
minerální olej	4	4	4	4
alfa-ionon	1	—	_	1
alfa-methylionon	—	0,5	_
lyral	—	—	—	0,2
isodamaskon	—	_	0,3	_
brij 56^x	4	4	4	4
alfol 16RD*	4	4	4	4
triethanolamin	0,75	0,75	0,75	0,75
butan-l,3-diol	3	3	3	3
xanthanová guma	0,3	0,3	0,3	0,3
parfém		podle potřeby
butylovaný hydroxytoluen	0,01	0,01	0,01	0,01
voda do	100	100	100	100
□ x Brij 56 je cetylalkohol POE (10)
x Alfol 16RD je cetylalkohol

Příklad 16

Lotion % hmotnostní

	A	B	C	D
retinol	_	0,15	0,15
retinylpalmitát	0,15	—	—	0,15
alfa-damaskon	0,1		0,1	_
geranylgeraniol		1		0,2
ethanol	40	40	40	40
parfém		podle potřeby
butylovaný hydroxytoluen	0,01	0,01	0,01	0,01
voda do	100	100	100	100

Příklad 17

Tento příklad popisuje kosmetický prostředek podle vynálezu ve formě alkoholického lotionu.

	% hmotnostní
retinol oleylhydroxyethylimidazolin ethanol antioxidační látka parfém voda do	0,15 0,1 40 0,1 podle potřeby 100

-22CZ 295983 B6

Příklad 18

Tento příklad popisuje kosmetický prostředek podle vynálezu jako opalovací krém.

% hmotnostní

retinylpalmitát	0,01
kokoylhydroxyethylimidazolin	0,1
silikonový olej 200 cts	7,5
glycerylmonostearát	3
cetostearylalkohol	1,6
poloxyethylen-(20)-cetylalkohol	1,4
xanthanová guma	0,5
parsol 1789	1,5
oktylmethoxycinnamát (Parsol MCX)	7
parfém	podle potřeby
barvivo	podle potřeby
voda do	100
Příklad 19
Pleťový krém nevodné povahy
	% hmotnostní
retinylpalmitát	0,15
laurylhydroxyethylindazolin	1
silikonová pryž SE-30¹	10
kapalný silikon 345²	20
kapalný silikon 344³	55,79
squalen	10
kyselina linolová	0,01
cholesterol	0,03
kyselina 2-hydroxy-n-oktanová	0,7
linoleát vitaminu E	0,5
květinový olej	0,5
ethanol	2

dimethylsilikonový polymer s molekulovou hmotností nejméně 50 000 a viskositou nejméně 10 000 cts při teplotě 25 °C, (GEC), ² cyklický pentamer dimethylsiloxanu (Dow Coming Corp.) ³ tetramer dimethylsiloxanu (Dow Coming Corp.).

V případě, že to v příkladech není uvedeno, jsou dále uvedené materiály dodávány uvedenými výrobci:

Palmitoyl CoA, BSA, dilauroylfosfatidylcholin, retinol, kyselina retinová, dithiothreitol- Sigma.

Cyklické nenasycené alifatické sloučeniny:

Damaskony - Firmenich

-23CZ 295983 B6

Ionony IFF, ostatní: uvedeno ve Flavor and Fragrance Materials, 1991, Allured Pub. Co.

Smáčedla imidazolinové povahy: Oleylimidazolin byl Scherozoline 0, ostatní od Mclntyre, pod názvem Mackezolin CY (kyselina kaprylová), C (kokosový olej), L (kyselina laurová).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kosmetický prostředek pro péči o pleť, vyznačující se tím, že obsahuje

a) 0,001 až 10 % sloučeniny ze skupiny retinol, retinylester a směsi těchto látek,

b) 0,0001 až 50% sloučeniny, která v koncentraci 100 μΜ vyvolá inhibici nejméně 20% esterifikace retinolu, katalyzované LRAT nebo ARAT při měření na mikrozomech in vitro, přičemž tato sloučenina je odlišná od amidu mastné kyseliny nebo dimethylimidazolidinonu a volí se ze skupiny derivátů cyklických nenasycených uhlovodíků, diterpenů a smáčedel, hydroxyethylimidazolinových derivátů mastných kyselin vzorcel

R kde

R znamená alifatický nasycený nebo nenasycený uhlovodíkový zbytek s přímým nebo rozvětveným řetězcem, obsahující 8 až 20 atomů uhlíku, nebo směs těchto látek, a

c) nosič, přijatelný z kosmetického hlediska.
2. Kosmetický prostředek podle nároku 1,vyznačující se tím, že jako cyklickou alifatickou nenasycenou sloučeninu obsahuje sloučeninu ze skupiny alfa-damaskon, beta-damaskon, delta-damaskon, isodamaskon, damascenon, alfa-ionon, beta-ionon, allyl-alfa-ionon, isobutylionon, alfa-methylionon, gamma-methylionon, brahmanol, sandanol, alfa-terpineol, lyral, ethylsaffranát a směsi těchto látek.
3. Kosmetický prostředek podle nároku 1,vyznačující se tím, že jako diterpen obsahuje geranylgeraniol.
4. Kosmetický prostředek podle některého z nároků 1 až 3, vy z n a č uj í c í se tím, že jako retinylester obsahuje sloučeninu ze skupiny retinylpalmitát, retinylacetát, retinylpropionát, retinyllinoleát nebo směsi těchto látek.
5. Způsob ošetřování pleti, vyznačující se t í m , že se místně nanáší kosmetický prostředek podle některého z nároků 1 až 4.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se kosmetický prostředek nanáší io pro napodobení účinku kyseliny retinové.