PL188577B1

PL188577B1 - Kompozycja do pielęgnacji skóry

Info

Publication number: PL188577B1
Application number: PL97332544A
Authority: PL
Inventors: Stewart Paton Granger; Anthony Vincent Rawlings; Ian Richard Scott
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 2005-02-28
Also published as: AR009099A1; JP2000503029A; AU714982B2; CA2266925C; PL332544A1; KR100320137B1; AU4704497A; EP0929288B1; BR9711421A; ES2188903T3; TW491706B; CN1093757C; JP3667772B2; BR9711421B1; ZA978653B; CZ289857B6; CA2266925A1; CZ108799A3; CN1237898A; WO1998013018A1

Abstract

1. Kompozycja do pielegnacji skóry, znamienna tym, ze zawiera: a) od 0,001% do 10% zwiazku wybranego z grupy skladajacej sie z retinolu, estru retinylu i ich mieszanin, b) 0,0001% do 50% N-podstawionego amidu kwasu tluszczowego o budowie: w którym R 1 = alkil lub alkoksyl o 1 do 10 atomach wegla; R2 = alkil lub alkenyl o 8 do 25 atomach wegla; R3 = alkil zawierajacy od 1 do 5 atomów wegla, albo ester fosforanowy; oraz c) kosmetycznie dopuszczalny nosnik. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są kompozycje do pielęgnacji skóry zawierające amid kwasu tłuszczowego i retinol lub ester retinylu.

Tło wynalazku

Retinol (witamina A) jest endogennym związkiem, który występuje naturalnie w ludzkim ciele i jest niezbędny do normalnego różnicowania komórek naskórkowych. Naturalne i syntetyczne pochodne witaminy A były szeroko stosowane do leczenia różnych chorób skóry a także były stosowane jako środki regenerujące i rewitalizujące. Kwas retinowy był stosowany do traktowania różnych stanów skóry, na przykład trądzika, zmarszczek, łuszczyc, starczych plam i przebarwień. Patrz na przykład publikacje Vahlquist, A i in. J. /nrest. Dermatol., tom 94, Holland D.B. and Cunliffe, W.J. (1990), strony 496-498; Ellis, C.N. i in., „Pharmacology of Retinols in Skin”, Vasel, Karger, tom 3 (1989), strony 249-252; Lowe, N. J. i in., „Pharmacology of Retinols in Skin”, tom 3 (1989), strony 240-248; zgłoszenie patentowe PCT WO 93/19743.

Uważa się, że stosowanie retinolu lub estrów retinylu powinno być korzystniejsze niż kwasu retinowego. Retinol występuje naturalnie w ludzkiej skórze i jest uważany za dużo

188 577 bardziej bezpieczny niż kwas retinowy. Estry retinolu hydroi.i:zujŁą in vivo wytwarzając retinol. Uważa się, że estry retinylu i retinol są metabolicznie przekształcane w skórze w kwas retinowy zgodnie z następującym mechanizmem:

Ester retinylu «-> retinol I kwas retinowy

Jednak, większość wewnętrznie podawanego retinolu jest szybko przekształcana w nieaktywne estry tłuszczowe przechowywane w komórkach naskórka (keratynocytach). Estryfikacja retinolu w nieaktywne estry retinylu jest osiągana w komórkach przez przeniesienie tłuszczowej grupy acylowej z acyloCoA, katalizowane przez enzym transferaza acyloCoA retinol (ARAT), albo przez przeniesienie grupy acylowej z fosfotydylocholiny, katalizowane przez enzym acylotransferaza lecytyna retinol (LRAT). Te reakcje estryfikacji są bardzo wydajne, w keratynocytach większość (95%) komórkowych retinoidów występuje w postaci tłuszczowych estrów retinylu. Niestety dlatego, chociaż retinol i estry retinylu są bezpieczniejsze do stosowania niż kwas retinowy, to są one mniej skuteczne niż kwas retinowy w korzystnym działaniu na skórę.

Niniejszy wynalazek jest częściowo oparty na stwierdzeniu, że pewne N-podstawione amidy kwasów tłuszczowych hamują reakcje estryfikacji a przez to zwiększają działanie retinolu przez zwiększenie ilości dostępnego retinolu do przekształcania w kwas retinowy. Zatem mieszanina tych N-podstawionych amidów kwasów tłuszczowych z retinolem lub estrami retinylu naśladuje skutki działania kwasu retinowego a jest bezpieczniejsza do stosowania niż kwas retinowy. Wcześniejsze zgłoszenie europejskie EP 0 742005 (Unilever; pierwszeństwo z dnia 8 maja 1995), publikowane 13 listopada 1996 (po dacie pierwszeństwa niniejszego zgłoszenia), ujawnia połączenie amidów kwasów tłuszczowych z retinolem lub estrami retinylu. Jednak ta publikacja nie ujawnia specyficznych N-podstawionych amidów kwasów tłuszczowych według niniejszego wynalazku, ani amidów kwasów tłuszczowych o rozgałęzionym, alkoksylowym podstawniku przy atomie azotu.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja do pielęgnacji skóry zawierająca:

a) od 0,001% do 10% związku wybranego z grupy składającej się z retinolu, estru retinylu i ich mieszanin,

b) 0,0001% do 50% N-podstawionego amidu kwasu tłuszczowego o budowie:

O

II

I—C—Rj

H,C—O—R, w którym

Ri = alkil lub alkoksyl o 1 do 10 atomach węgla;

R2 = alkil lub alkenyl o 8 do 25 atomach węgla;

R3 = alkil zawierający od 1 do 5 atomów węgla, albo ester fosforanowy; oraz

c) nośnik.

Korzystnie kompozycja zawiera N-podstawiony amid kwasu tłuszczowego, który w stężeniu 100 μΜ hamuje w co najmniej 20% estryfikację retinolu katalizowaną LRAT lub ARAT, mierzoną testem mikrosomalnym in vitro.

Korzystnie kompozycja zawiera N-podstawiony amid kwasu tłuszczowego, który w stężeniu 100 μΜ hamuje w co najmniej 40% estryfikację retinolu katalizowaną LRAT lub ARAT, mierzoną testem mikrosomalnym in vitro.

W innym korzystnym wykonaniu kompozycja zawiera ester retinylu wybrany z grupy składającej się z palmitynianu retinylu, octanu retinylu, propionianu retinylu, linoleinianu retinylu i ich mieszanin.

Szczególnie korzystny jest linoleinian retinylu.

Korzystnie kompozycja według wynalazku jako składnik (a) zawiera retinol.

HC—NI

188 577

Kompozycje według wynalazku maja zastosowanie w kosmetycznym sposobie traktowania skóry polegającym na zewnętrznym stosowaniu kompozycji na skórę. Kompozycje według wynalazku mają także zastosowanie w kosmetycznym sposobie naśladowania skutków działania kwasu retinowego na skórę, polegającego na zewnętrznym stosowaniu kompozycji na skórę.

Stosowane określenie „traktowanie” oznacza jedno lub więcej niż jedno z następujących: prewencyjne i/lub lecznicze działanie przy suchości skóry, oparzeniach słonecznych skóry, występowaniu zmarszczek, starczych plam, starzeniu się skóry, zwiększaniu giętkości warstwy rogowej naskórka, rozjaśnianiu barwy skóry, regulowaniu wydzielania łoju oraz ogólnej poprawie jakości skóry.

Stwierdzono że N-podstawione amidy kwasów tłuszczowych o wzorze I korzystnie hamują, przy stężeniu 100 μΜ, co najmniej 20% reakcji estryfikacji retinolu katalizowanej LRAT lub ARAT, mierzone według niżej opisanego testu mikrosomalnego in vitro. Zatem obecność N-podstawionego amidu kwasu tłuszczowego o wzorze I w kompozycjach według wynalazku zasadniczo poprawia działanie retinolu lub estru retinylu w kosmetycznych kompozycjach.

Opis korzystnych wykonań

Wszystkie ilości podano w stosunku do wagi końcowej kompozycji, jeżeli nie wskazano inaczej.

Kompozycje według wynalazku zawierają, jako pierwszy niezbędny składnik, związek wybrany z grupy składającej się z retinolu i estrów retinylu. Określenie „retinol” obejmuje między innymi następujące izomery retinolu: wszystkie izomery trans, 13-cis-retinol, 11-cisretinol, 9-cis-retinol, 3,4-didehydroretinol. Korzystne są wszystkie izomery trans-retinolu, 13cis-retinol, 3,4-didehydroretinol, 9-cis-retinol. Najbardziej korzystne są wszystkie izomery trans-retinolu z powodu ich szerokiej dostępności na rynku.

Ester retinylu jest estrem retinolu. Określenie „retinol” zostało zdefiniowane powyżej. Estry retinylu odpowiednie do stosowania w niniejszym wynalazku to Cuso-estry retinylu, korzystnie estry C2-20, najbardziej korzystne C2, C3 i C16 estry z powodu ich powszechnej dostępności. Przykłady estrów retinylu obejmują, ale nie są do nich ograniczone: palmitynian retinylu, mrówczan retinylu, octan retinylu, propionian retinylu, maślan retinylu, walerian retinylu, izowalerian retinylu, heksanonian retinylu, heptanonian retinylu, oktanonian retinylu, nonanonian retinylu, dekanonian retinylu, undekanonian retinylu, laurynian retinylu, tridekanonian retinylu, mirystynian retinylu, pentadekanonian retinylu, heptadekononian retinylu, stearynian retinylu, izostearynian retinylu, nonadekanonian retinylu, arachidonian retinylu, behenian retinylu, linoleinian retinylu, oleinian retinylu, mleczan retinylu, glikolan retinylu, hydroksykaprylan retinylu, hydroksylaurynian retinylu, winian retinylu.

Korzystne estry do stosowania w niniejszym wynalazku są wybrane z palmitynianu retinylu, octanu retinylu i propionianu retinylu, ponieważ są one handlowo dostępne i dlatego, że są najtańsze. Linoleinian retinylu jest również korzystny z powodu jego skuteczności.

Retinoid i/lub ester retinylu jest stosowany w kompozycjach według wynalazku w ilości od 0,001% do 10%, korzystnie w ilości od 0,01% do 1%, a najbardziej korzystnie w ilości od 0,01% do 0,5%.

Drugim niezbędnym składnikiem kompozycji według wynalazku jest N-postawiony amid kwasu tłuszczowego o wzorze I:

*1 9 i ii

HC—NB—C—

I o—r₃ w którym:

R1 = alkil lub alkoksyl o od 1 do 10 atomach węgla;

188 577

R₂ = alkil lub alkenyl o od 8 do 25 atomach węgla;

R3 = alkil zawierający od 1do 5 atomów węgla, albo ester fosforanowy.

Korzystnie R1 oznacza liniową nasyconą alkilową lub alkoksylową grupę zawierającą do 5 atomów węgla, najkorzystniej 1 do 4 atomów węgla.

R₂ korzystnie oznacza linową nienasyconą grupę alkenylową zawierającą od 10 do 20 atomów węgla, najbardziej korzystnie od 10 do 18 atomów węgla.

Optymalnie R2 oznacza resztę kwasu linolenowego (Cjg 2).

R3 korzystnie oznacza zarówno grupę metylową jak i ester fosforanowy, najkorzystniej ester fosforanowy choliny lub glikolu.

Najbardziej korzystnie N-podstawiony amid kwasu tłuszczowego jest wybrany ze związków o poniższych wzorach A i B.

O łl

O

II 'CH.

•CHjOH o'

Wzór A

O

II

Wzór B

N-postawiony amid występuje w kompozycjach według wynalazku w ilości w zakresie od 0,0001% do 50%, korzystnie od 0,01% do 10%, najbardziej korzystnie od 0,1% do 5%.

N-podstawiony amid kwasu tłuszczowego o wzorze I korzystnie hamuje, w stężeniu 100 pM, co najmniej 20% reakcji estryfikacji retinolu katalizowanej LRAT lub ARAT, mierzone in vitro testem mikrosomalnym.

Test wikrosomalny in vitro:

Mikrosomy otrzymano sposobem opisanym w publikacji: J. C. Saari i D. L. Breuberg, „CoA i Non-CoA Depandent Retinol Esteryfication in Retinal Pigment Epithelium: J. Biol. Chem. 263, 8084-90 (1988).

Roztwór zawierający 0,1M fosforanu sodu bufor pH 7; 5 mM ditiotreitolu, 2 mg/ml albimuny surowicy bydlęcej, 40 mikromoli palmitoiłd-CoA, 40 mikromoli dilauroilofosfatydylocholiny, 10 mikromoli retinolu i badany związek lub ślepy rozpuszczalnik, inkubowano przez jedną godzinę w 37°C z mikrosomalną frakcją izolowaną z pigmentowanym retinolem bydlęcymi komórkami naskórka. Po inkubacji reakcję gwałtownie przerwano przez dodanie równej objętości etanolu, a utworzone estry retinylu (palmitynian retinylu z reakcji katalizo6

188 577 wanej ARAT, i laurynian z reakcji katalizowanej LRAT) ekstrahowano heksanem. Warstwę heksanową usuwano, odparowywano w atmosferze azotu, a pozostałość analizowano HPLC na kolumnie z odwróconą fazą 3,9 x 300 mm Cis stosując jako fazę ruchomą 80% metanol w tetrahydrofuranie a ilość estrów określano fluorescencyjnie (naświetlanie 325 nm, emisja 480 nm). Ilość estrów utworzonych w obecności ślepego rozpuszczalnika przyjmowano jako 100%, i stosowano do obliczania procentowego zahamowania tworzenia estrów dla badanych związków. Jako kontrolną próbkę podwielokrotność mikrosomów inaktywowano przez gotowanie przez 5 minut, co dawało co najmniej 95% zahamowanie tworzenia estrów.

W korzystnym wykonaniu wynalazku wybierany jest N-podstawiony amid kwasu tłuszczowego który w stężeniu 100 μΜ hamuje co najmniej 40% reakcji estryfikacji retinolu katalizowanej LRAT lub ARAT.

Kosmetycznie dopuszczalny nośnik

Kompozycje według wynalazku zawierają również kosmetycznie dopuszczalny nośnik działający jako rozcieńczalnik, środek dyspergujący lub nośnik retinolu i/lub estru retinylu oraz N-podstawionego amidu kwasu tłuszczowego w kompozycji, w celu ułatwienia rozprowadzania gdy kompozycja jest nakładana na skórę.

Nośniki inne niż woda lub stanowiące uzupełnienie wody mogą zawierać ciekłe lub stałe substancje zmiękczające skórę, rozpuszczalniki, środki nawilżające skórę, środki zagęszczające i proszki. Szczególnie korzystnym niewodnym nośnikiem jest polidimetylosiloksan i/lub polidimetylofenylosiloksan. Silikonami w wynalazku mogą być te których lepkość mieści się w zakresie od 10 do 10000000 mm²/s (centystoksa) w 25°C. Szczególnie pożądane są mieszaniny silikonów o niskiej i wysokiej lepkości. Te silikony są dostępne z General Electric Company pod nazwami handlowymi Vicasil, SE i SF oraz z Dow Corning Company w serii 200 i 550. Ilość silikonu, który może być stosowany w kompozycjach według wynalazku mieści się w zakresie od 5% do 95%, korzystnie od 25% do 90% wagowych kompozycji.

Kosmetycznie dopuszczalny nośnik zazwyczaj stanowi od 5% do 99,9%, korzystnie od 25% do 80% wagowych kompozycji i może, w nieobecności innych kosmetycznych dodatków, tworzyć uzupełnienie składu kompozycji. Korzystnie nośnik jest co najmniej w 50%, bardziej korzystnie co najmniej 80% wagowych wodą, licząc na wagę nośnika. Korzystnie woda stanowi co najmniej 50% wagowych kompozycji według wynalazku, najbardziej korzystnie od 60 do 80% wagowych, licząc na wagę kompozycji.

Ewentualne materiały korzystne dla skóry i dodatki kosmetyczne

Mogą występować oleje lub materiały oleiste, razem z emulgatorami w celu wytworzenia emulsji woda-w-oleju lub emulsji olej-w-wodzie, w większości w zależności od średniej równowagi hydrofilowo-lipofilowej (HLB) zastosowanego emulgatora.

Kompozycje według wynalazku korzystnie zawierają środki chroniące przed światłem słonecznym. Środki chroniące przed światłem słonecznym obejmują materiały powszechnie stosowane do blokowania światła ultrafioletowego. Przykładowymi związkami są pochodne PABA, cynamoniany i salicylany. Na przykład mogą być stosowane oktylometoksycynamonian i 2-hydiOksv-4-metoksybenzofenon (znany też jako oksybenzon), oktylometoksycynamonian i 2hydroksy-4-metoksybenzofenon są handlowo dostępne pod nazwami handlowymi, odpowiednio Parsol MCX i Benzophenon-3. Dokładna ilość środka chroniącego przed światłem słonecznym może się zmieniać w zależności od pożądanego stopnia ochrony przed słonecznym promieniowaniem UV.

Inny korzystny ewentualny składnik jest wybrany z niezbędnych kwasów tłuszczowych (EFAs), tych kwasów tłuszczowych, które są niezbędne dla tworzenia membrany piazmatycznej wszystkich komórek, w keratynocytach brak EFA powoduje że komórki stają się hyperproliferatywne. Uzupełnianie EFA to reguluje. EFA również zwiększają biosyntezę lipidów w epidermie i dostarczają lipidów dla tworzenia granicy naskórka. Niezbędne kwasy tłuszczowe są korzystnie wybrane z kwasu linoleinowego, kwasu γ-linolenowego, kwasu homo-γlinolenowego, kwasu kolumbinowego, kwasu eikoza-(n-6,9,13)-trienowego, kwasu arachidonowego, kwasu timnodonowego, kwasu heksanowego i ich mieszanin.

188 577

Jeszcze inny korzystny składnik jest wybrany z azoli, na przykład klimbazolu, bifonazolu, klotrimazolu, ketokonazolu, mikonazolu, ekonazolu, itrakonazolu, flukonazolu, terkonazolu, butokonazolu, sulkonazolu, lionazolu i ich mieszanin. Azol może być włączany w kompozycje według wynalazku w ilości od 0,001 do 50% wagowych, korzystnie od 0,001 do 10% wagowych, najbardziej korzystnie od 0,1 do 5%.

Środki zmiękczające skórę są często włączane w kompozycje według wynalazku. Ilość takich środków zmiękczających skórę mieści się w zakresie od 0,5% do 50%, korzystnie między 5% a 30% wagowych całej kompozycji. Środki zmiękczające skórę mogą być klasyfikowane na takie ogólne chemiczne kategorie jak estry, kwasy tłuszczowe i alkohole, poliole i węglowodory.

Estry mogą być mono- i diestrami. Dopuszczalne przykłady diestrów tłuszczowych obejmują dibutyloadypinian, dietylosebacynian, diizopropylodimeranian i dioktylobursztynian. Dopuszczalne estry kwasów tłuszczowych o rozgałęzionych łańcuchach obejmują 2etylo-heksylomirystynian, izopropylostearynian i izostearylopalmitynian. Dopuszczalne trizasadowe kwaśne estry obejmują triizopropylotrilinoleinlan i trilaurylocytrynian. Dopuszczalne prostołańcuchowe estry tłuszczowe obejmują palmitynian laurylu, mleczan mirystylu, eurkanian oleilu i oleinian stearylu. Korzystne estry obejmują kokokaprylanian/kapranian (mieszanka kokokaprylanianu i kokokapranianu), propylenoglikolo-mirystyloeterooctan, diizopropyloadypinian i cetylooktanian.

Odpowiednie alkohole tłuszczowe i kwasy tłuszczowe obejmują związki mające od 10 do 20 atomów węgla. Szczególnie korzystne są takie związki jak alkohole i kwasy cetylowe, mirystylowe, palmitynowe i stearylowe.

Poliole, które mogą być stosowane jako środki zmiękczające skórę są to liniowe i rozgałęzione alkilopolihydroksylowe związki. Na przykład korzystne są propylenoglikol, sorbitol i gliceryna. Również użyteczne są polimeryczne poliole takie jak polipropylenoglikol i polietylenoglikol. Również szczególnie korzystne jako środki zwiększające penetrację sąbutyleno i propylenoglikol.

Przykładami węglowodorów, które mogą służyć jako środki zmiękczające skórę są węglowodory o łańcuchach od 12 do 30 atomów węgla. Specyficzne przykłady obejmują olej mineralny, wazelinę, skwalen i izoparafiny.

Inną kategorią funkcjonalnych składników w kompozycjach według wynalazku są środki zagęszczające. Środek zagęszczający zazwyczaj występuje w ilościach od 0,1 do 20% wagowych, korzystnie od 0,5% do 10% wagowych licząc na kompozycję. Przykładami środków zagęszczających są sieciowane poliakrylanowe materiały dostępne pod nazwami handlowymi Carbopol z B. F. Goodrich Company. Mogą być stosowane żywice takie jak ksantan, karagenian, żelatyna, karaja, pektyna i żywica locust bean. W pewnych warunkach funkcja środka zagęszczającego może być spełniana przez materiał służący również jako silikon lub środek zmiękczający skórę. Na przykład żywice silikonowe o lepkości powyżej 10 centyskoksów i estry takie jak stearynian glicerolu mogą być dwufunkcjonalne.

Do kompozycji według wynalazku mogą być włączane również proszki. Te proszki obejmują kredę, talk, kaolin, skrobie, glinki smektytowe, chemicznie modyfikowany krzemian glinowomagnezowy, organicznie modyfikowana glinka montmorilonitową, uwadarniany krzemian glinu, strącana krzemionka, glinowoskrobiooktenylo bursztynian i ich mieszaniny.

Również inne dodatkowe mniejszościowe składniki mogą być włączane do kosmetycznych kompozycji. Te składniki obejmują środki barwiące, środki zmętniające i zapachy.

Ilość tych innych dodatkowych mniejszościowych składników może zmieniać się od 0,001% aż do 20% wagowych kompozycji.

Stosowanie kompozycji

Kompozycja według wynalazku jest w pierwszym rzędzie pomyślana jako produkt do zewnętrznego stosowania na ludzką skórę, szczególnie jako środek do pielęgnowania i wygładzania skóry oraz zapobiegający lub zmniejszający widoczne zmarszczki lub starość skóry.

Przy stosowaniu, mała ilość kompozycji na przykład od 1 do 100 ml, jest nakładana na odsłonięty obszar skóry, z odpowiedniego pojemnika lub aplikatora, i jeżeli to konieczne jest ona następnie rozprowadzana i/lub wcierana w skórę przy użyciu dłoni lub palców albo odpowiedniego urządzenia.

188 577

Postać produktu i opakowanie

Kompozycje do zewnętrznego traktowania skóry według wynalazku mogą być formułowane w postaci lotionu, kremu lub żelu. Kompozycja może być pakowana w odpowiedni pojemnik dostosowany do jej lepkości i przeznaczony do stosowania przez konsumenta. Na przykład lotion lub krem mogą być pakowane do butelek lub aplikatorów typu roll-on, albo do urządzenia rozpylającego aerozol z propelentem lub pojemnika wyposażonego w pompkę obsługiwaną palcem. Gdy kompozycja ma postać kremu może być przechowywana w nie ulegającej deformacji butelce lub zakręcanym pojemniku, takim jak tuba lub słoik.

Kompozycja może być również zawarta w kapsułkach takich jak opisane w patencie US 5063057.

Korzystnie kompozycja ma postać zamykanego pojemnika zawierającego kosmetycznie dopuszczalną tutaj określoną kompozycję.

Następujące przykłady bliżej ilustrują wynalazek.

Materiały i metody Hodowla komorkowo

Ludzkie keratynocyty, izolowane z noworodkowego naskórka przez traktowanie trypsyną wzrastały w środowisku Dulbecco Modification Eagle (DME) Hams F12 (1:1) /10% surowica płodowa bydlęca w obecności napromieniowanych 3T3 mysich fibroplastów dla wytworzenia podzielonych kolonii keratynocytu. Komórki wzrastały w wyżej podanych warunkach do drugiego pasażu i były utrzymywane zamrożone przed dalszym użyciem. Zamrożony drugi pasaż keratynocytu odmrażano, matrycowano w powyższym medium i komórki wzrastały przez pięć dni przed skierowaniem do bez-surowiczego medium MCDB 153 - zasadowego medium wzrostu keratynocytu (KGM) z Clonetics Corporation, San Diego, CA, zawierającego 0,15 mM Ca, albo bez-surowiczego medium keratynocytu (KSFM) z GIBCO zawierającego 0,09 mM Ca). Siódmego dnia gdy komórki były w 80-90% zlane, zostały poddane działaniu trypsyny i zmatrycowane w bez-surowiczym medium dla dalszych doświadczeń.

Test transglutaminazy

Test transglutaminazy i różnicowania keratynocytu

Podczas procesu końcowego różnicowania naskórka tworzona jest na wewnętrznym obwodzie komórki warstwa białka o grubości 15 nm, znana jaiko zrogowaciała otoczka (CE). CE składa się z wielu oddzielnych białek, które zostały usieciowane razem przez tworzenie wiązań N^c-(y-glutamylo)lizynoizodipeptydowych katalizowane przez działanie co najmniej dwóch różnych transglutaminaz wytwarzanych metodą ekspresji w naskórku. Transglutaminaza I (TGase I) jest w dostatecznej ilości wyrażana w zróżnicowanych warstwach naskórka, zwłaszcza w warstwie granularnej, ale nie występuje w niezróżnicowanym podstawowym naskórku. Zatem TGase I jest użytecznym znacznikiem różnicowania keratynocytu naskórka ponieważ wysoki poziom TGase I wskazuje na bardziej zróżnicowany stan. Do oceny stanu zróżnicowania hodowlanych keratynocytów w poniższych przykładach stosowano test ELISA oparty na TGase I wykorzystujący przeciwciało TGase I.

Dla przykładu I stosowano następującą procedurę:

Keratynocyty (hodowane jak opisano powyżej) matrycowano w 96 otworkowych płytach, gęstość 3000 komórek na otwór w 200 μί medium. Po inkubacji przez cztery dni, zmieniano medium na medium zawierające badany związek (sześć powtórzeń na test). Komórki hodowano przez następne 72 godziny, po tym czasie medium odsysano a matryce przechowywano w -70°C. Matryce usuwano z zamrażarki a komórki przemywano PBS. Dodawano 100 μ1 sterylnej wody, komórki frakcjonowano przez zamrażanie w -70°C a następnie rozmrażanie. Komórki inkubowano przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej (R/T) w PBS / 3% BSA (bufor przemywający, albumina surowicy bydlęcej), następnie płukano świeżą ilością buforu przemywającego. Komórki inkubowano z 50 |il pierwszego przeciwciała monoklonalnego anty-ludzka transglutaminaza mysiego przeciwciała (JgG) otrzymana z Biomedical Industries rozcieńczona 1:2000 w buforze przemywającym przez jedną godzinę, 37°C, następnie przepłukano dwukrotnie buforem przemywającym. Następnie komórki inkubowano z 50 |il drugiego przeciwciała (fragment Fab, skoniugowanej peroksydazy przeciwciała mysiego IgG otrzymany z Amersham) rozcieńczonego

188 577

1:4000 w przemywającym buforze przez jedną godzinę w 37°C, następnie przepłukano dwukrotnie buforem przemywającym. Komórki inkubowano w roztworze substratu (4 mg ofenylenodiamina i 3,3 μ1 30% H2O2 w 10 ml 0,1 M buforu cytrynianowego pH 5,0) przez pięć minut, R/T, w ciemności (pod folią aluminiową). Reakcje zatrzymywano przez dodanie 50 (ił 4N H2SO4. Odczytywano absorbancję próbek przy 492 nm. Z sześciu powtórzeń, cztery były traktowane oboma przeciwciałami, dwa były traktowane tylko drugim przeciwciałem (tj. aby określić tło związania enzymu skoniugowanego Ab). Ilość TGase I określano przez odejmowanie tła od odczytanych wartości dla każdego traktowania i określano średnią ± odchylenie standardowe (s.d.) dla powtórzeń poddanych działaniu obu przeciwciał.

Dla przykładu 3 stosowano następującą procedurę:

Keratynocyty (hodowane jak opisano powyżej) matrycowano w 96 otworkowych płytach, gęstość 3000 komórek na otwór w 200 |il medium hodowlanego. Po inkubacji przez cztery dni, zmieniano medium na medium zawierające badany związek (sześć powtórzeń na test). Komórki hodowano przez następne 72 godziny, po tym czasie medium odsysano a matryce przechowywano w -70°C. Matryce usuwano z zamrażarki, komórki frakcjonowano przez zamrożenie i rozmrożenie, a następnie komórki przemywano 3 x PBS. Komórki inkubowano przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej (R/T) w TBS / 5% buforu BSA. Następnie komórki inkubowano z 100 fil monoklonalnego przeciwciała anty-ludzka transglutaminaza mysiego przeciwciała (IgG) (pierwsze przeciwciało) otrzymana z Biomedical Industries rozcieńczona 1:2000 w TBS / 1% buforze BSA przez dwie godziny, 37°C, następnie przepłukano sześciokrotnie buforem (TBS/1% BSA/0,05% Tween-20). Następnie komórki inkubowano z 100 μ.1 fragmentem Fab, skoniugowana peroksydaza przeciwciała mysiego IgG (drugie przeciwciało) otrzymanym z Amersham rozcieńczonym 1:4000 w przemywającym buforze przez dwie godziny w 37°C, następnie przepłukano trzykrotnie buforem przemywającym i trzykrotnie PBS. Komórki inkubowano w roztworze substratu (4 mg o-fenylenodiamina i 3,3 |il 30% H2O2 w 10 ml 0,1 M buforu cytrynianowego pH 5,0) przez pięć minut, R/T, w ciemności (pod folią aluminiową). Reakcję zatrzymywano przez dodanie 50 fil 4N H2SO4. Odczytywano absorbancję próbek przy 492 nm. Z sześciu powtórzeń, czteiy były traktowane oboma przeciwciałami, dwa były traktowane tylko drugim przeciwciałem (tj. aby określić tło wiązania enzymu skoniugowanego Ab). Ilość transglutaminazy I (TGase I) określano przez odejmowanie tła od odczytanych wartości dla każdego traktowania i określano średnią ± standardowe odchylenie (s.d.) dla powtórzeń poddanych działaniu obu przeciwciał.

/'e.st DNA

Poziom TGase I stwierdzony po traktowaniu komórek powinien być zależny od ilości komórek, tj. im większa liczba komórek tym więcej stwierdzonej TGase I. Ilość TGase I była normalizowana do zawartości DNA w komórkach w tych samych otworkach aby wyeliminować różnice związane z różnicą w ilości komórek. Ilościowanie DNA jest szczególnie użytecznym wskaźnikiem dla wielu komórek, w tym komórek keratynocytu, ponieważ każda komórka ma co do zawartości i celu identyczny genom a zatem identyczna ilość DNA. Całkowita zawartość DNA w komórkach w otworku jest wprost proporcjonalna do ilości komórek w otworku. Ilościowanie DNA było stosowane do normalizacji danych TGase do ilości komórek.

Keratynocyty matrycowano w 96 otworkowych płytach, gęstość 3000 komórek na otwór w 200 ul medium. Po inkubacji przez cztery dni, zmieniano medium na medium zawierające badany związek (sześć powtórzeń na test). Komórki hodowano przez następne 72 godziny, po tym czasie medium odsysano a matryce przechowywano przez co najmniej 1,5 godziny w -70°C. Matryce usuwano z zamrażarki i rozmrażano przez 30 minut. Dodawano 100 gl/otwór barwnika Hoechst (1 pg/ml końcowego stężenia) i inkubowano przez 15 minut, pod przykryciem, następnie odczytywano na mierniku fluoroscencyjnym (naświetlanie 360 nm i emisja 460 nm). Roztwór barwnika usuwano a otworki przepłukiwano w PBS przygotowując do testu TGase I.

188 577

Przykład 1

Kwas retinowy jest bardziej skuteczny niż retinol przy zmianie stanu różnicowania keratynocytu

Badano działanie na poziom transglutaminazy normalizowanej do zawartości DNA w komórkach po dodaniu kwasu retinowego (RA) i retinolu (ROH), wyniki przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1

Traktowanie	Średni TGase/DNA x10'⁴ ±s.d (% kontroli)	Wartość p względem kontroli	Wartość p wzgl. 2,5x10M ROH	Wartość p wzgl. 2,5x10’⁸ M ROH	Wartość p wzgl. 2,5x10’⁹ M ROH
Kontrolna	2,44 ± 0,24 (100%)	-	0,001	0,001	0,001
2,5x10'7M RA	0,16 ±0J1 (7%)	0,001	0,001	0,001	0,001
2,5x10- M ROH	1,14 ± 0,22 (47%)	0,001	-	0,001	0,001
2,5x10'⁸M RA	1,34 ±0,40 (55%)	0,001	0,2	0,001	0,001
2,5x10'^sM ROH	1,89 ± 0,30 (77%)	0,001	0,001	-	0,001
2,5x10'⁹M RA	1,87 ±0,49 (77%)	0,001	0,001	0,784	0,001
2,5x10‘⁹ M ROH	2,70 ±0,59 >100%)	0,001	0,001	0,001	-

n = 3

Wszystkie badane stężenia kwasu retinowego czyli 2,5x10'⁷ M, 2,5?<10~^S M i 2,5x10⁹ M zmnieeszają różnicowanie keratynocytu znacznie bardziej niż każde traktowanie retinolem o stężeniu odpowiednio 2,5x10 M'7, 2,5x10’⁸ M i 2,5x10’⁹ M. Zmniejszenie ilości transglutaminazy było zależne zarówno od kwasu retinowego jak i retinolu. Jest to zgodne z tym, że kwas retinowy daje większy efekt hamowania różnicowania nabłonka niż retinol.

Przykład 2

Mikrosomalna estryfikacja retinolu in vitro

Przygotowano mikrosomy jak opisano w: J. C. Saari i D. L. Bredberg, „CoA and NonCoA Dependent Retinol Esterification in Retinal Pigment Epithelium” J. Biol. Chem. 23, 808-^^-90(1988).

Roztwór zawierający 0,1 M fosforanu sodu (bufor o pH 7) 5 mM ditiotreitolu, 2 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 40 mikrom^oli palmitoilu-CoA, 40 mikromoli dilauroilofosfatydylocholiny. 10 mikromoli retinolu i badany związek lub ślepy rozpuszczalnik, inkubowano przez jedną godzinę w 37°C z mikrosomalną frakcją izolowaną z pigmentowanymi retinalem bydlęcymi komórkami naskórka. Po inkubacji reakcję gwałtownie przerwano przez dodanie równej objętości etanolu, a utworzone estry retinylu (palmitynian retinylu z reakcji katalizowanej ARAT, i laurynian z reakcji katalizowanej LRAT) ekstrahowano heksanem. Warstwę heksanową usuwano, odparowywano w atmosferze azotu, a pozostałość analizowano HPLC na kolumnie z odwróconą fazą 3,9 x 300 mm C18 stosując jako fazę ruchomą 80% metanol w tetrahydrofuranie a ilość estrów określano fluorescencyjnie (naświetlanie 325 nm, emisja 480 nm). Ilość estrów utworzonych w obecności ślepego rozpuszczalnika przyjmowano jako 100%, i stosowano do obliczania procentowego zahamowania tworzenia estrów dla badanych związków. Jako kontrolną próbkę podwielokrotność mikrosomów inaktywowano przez gotowanie przez 5 minut, co dawało co najmniej 95% zahamowanie tworzenia estrów.

Otrzymane wyniki przedstawiono w tabelach 2 A i 2B.

Związki z tabeli 2A były badane w stężeniu 100 ęiM. Związki z tabeli 2B były badane w stężeniu 10 μM.

188 577

Związek o wzorze C, który nie jest objęty zakresem niniejszego wynalazku był również badany.

och₃

NH

O

II

OCH,

Wzór C

Tabela 2A

Związek	% zahamowania, ARAT	% zahamowania, LRAT
Kontrolna	0	0
WzórC	0	0
WaórB	83	92
Wzór A	54	48

Tabela 2B

Związek	% zahamowania, ARAT	% zahamowania, LRAT
Kontrolna	0	0
WzórC	N/D	N/D
WzórB	42	51
Wzór A	43	0

Jak widać z wyników podanych w tabelach 2A i 2B N-podstawione amidy kwasów tłuszczowych, w których R2 ma więcej niż 7 atomów węgla (tj. wzór A i B) są silnymi inhibitorami estryfikacji retinolu katalizowanej LRAT i ARAT.

Przykład 3

Badano wpływ na różnicowanie keratynocytu związków i kombinacji przedstawionych w tabeli 3. Wyniki przedstawiono jako % próbki kontrolnej. Ilość transglutaminazy normalizowano do DNA.

188 577

Tabela 3

Działanie retinolu i amidu o wzorze A na TGase /DNA keratynocytu

Traktowanie	Średnia TGase/DNA x10⁵ ± s.d (% kontroli)	Wartość p względem kontroli	Wartość p wzgl. 2,5x10'7 M ROH	Wartość p wzgl. 2,5x10’7 M RA	Wartość p wzgl. 2,5 x 10-4 m wzór A
Kontrolna	57,80 ±8,61 (100%)	-	0,020	0,004	0,003
2,5x10'7M RA	39,99 ± 5,28 (69%)	0,004	0,093	-	0,525
2,5x10‘7M ROH	45,60 ± 3,92 (79%)	0,020	-	0,093	0,054
10-4 m _Wzór A	41,57 ± 0,75 (72%)	0,003	0,525	0,525	-
2,5x10‘7m ROH + 10'4 M wzór A	33,27 ± 3,97 (58%)	0,001	0,052	0,052	0,002

n = 3

2,5x10-7 M kwas retinolowy był skuteczny przy zmniejszaniu ilości TG1 keratynocytu (do 69% ilości kontrolnej). 2,5x10’⁷ M retinolu i 10'⁴ M związku o wzorze A były mniej skuteczne w hamowaniu ilości Tgase I keratynocytu gdy były stosowane pojedynczo. Jednak kombinacja 2,5x10'7 M retinolu +10-4 m związku o wzorze A zmniejszała ilość TGase I keratynocytu do 58% ilości kontrolnej. Ten przykład wykazuje również dobrą korelację między testem mikrosomalnym i danymi z hodowli komórek.

Przykłady 4-9 ilustrują kompozycje do stosowania zewnętrznego według wynalazku. Kompozycje mogą być wytwarzane w konwencjonalny sposób. Są one odpowiednie do stosowania kosmetycznego. W szczególności kompozycje są odpowiednie do nakładania na skórę ze zmarszczkami, szorstką, suchą, zwiotczałą, postarzałą i/lub zniszczoną promieniowaniem UV, aby poprawić wygląd skóry i odczucia, jak też do stosowania na zdrowa skórę dla zapobiegania lub opóźniania jej niszczenia.

Przykład 4

Ten przykład ilustruje emulsje z wewnętrzną fazą woda-w-oleju zawierającą kompozycję według wynalazku.

Składnik	% wagowy
Retinol	0,5
W pełni uwodorniony olej kokosowy	3,9
Wzór A	5
Brij 92*	5
Bentone 38	0,5
MgSO4 · 7H2O	0,3
Butylowany hydroksytoluen	0,01
Zapach	qs
Woda	do 100

*Brij 92jestpolioksyetylenowanym (2)oleiloeterem

188 577

Przykład 5

Ten przykład ilustruje krem typu olej-w-wodzie zawierający kompozycję według wynalazku.

Składnik	% wagowy
Retinol	0,15
Olej mineralny	4
WzórB	2
Brij 56*	4
Alfol 16RD*	4
Trietanoloamina	0,75
Butano-1,3-diol	3
Żywica ksantanowa	0,3
Butylowany hydroksytoluen	0,01
Woda	do 100

• Brij 56 jest alkoholem cetylowym POE (10) • Alfol 16RD jest alkoholem cetylowym Przykład 6

Ten przykład ilustruje alkoholowy lotion zawierający kompozycję według wynalazku.

Składnik	% wagowy
Palmitynian retinylu	0,15
WzórB	0,5
Etanol	40
Butylowany hydroksytoluen	0,01
Woda	do 100

Przykład 7

Ten przykład ilustruje inny alkoholowy lotion zawierający kompozycję według wynalazku.

Składnik	% wagowy
Retinol	0, 15
Wzór A	0,2
Etanol	40
Przeciwutleniacz	0,1
Woda	do 100

Przykład 8

Ten przykład ilustruje krem przeciwsłoneczny zawierający kompozycję według wynalazku.

188 577

Składnik	% wagowy
Retinol	0,01
Wzór A	0,3
Olej silikonowy 200cts	7,5
Glicerylomonos^tea^iynia^n	3
Alkohol cetostearylowy	1,6
Alkohol polioksyetyleno-(20)-cetylowy	1,4
Żywica ksantanowa	0,5
Parsol 1789	1,5
Oktylometoksycynamonian (PARSOL MCX)	7
Zapach	qs
Barwnik	qs
Woda	do 100

Przykład 9

Ten przykład ilustruje nie-wodną kompozycję do pielęgnacji skóry zawierającą kompozycję według wynalazku.

Składnik	% wagowy
Palmitynian retinylu	0,15
Wzór B	1
Żywica silikonowa SE-301	10
Płynny silikon 345²	20
Płynny silikon 344³	55,79
Skwalen	10
Kwas linolenowy	0,01
Cholesterol	0,03
Kwas 2-hydroksy-n-oktanolowy	0,7
Linoleinian witaminy E	0,5
Olejek herbaciany	0,5
Etanol	2

'polimer dimetylosilikonowy o ciężarze cząsteczkowym co najmniej 50000 i lepkości co najmniej 10000 centy stoksów, w 25°C dostępny z firmy GEC ²dimetylosiloksan cykliczny pentamer dostępny z firmy Dow Corning Corp.

³dimetylosiloksan tetramer, dostępny z firmy Dow Corning Corp.

Związki badane w przykładach otrzymano z następujących źródeł:

Związek /.rócHo

Retinol Sigma

Palmitynian retinylu Sggma

Kwas retinowy Sggma

N-podstawiony amid kwasu tłuszczowego Uniwessytet Utrcchto, Holmdia

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycj a do pielęgnacji sH^tór^, znamienna tym, że zć^''^ii^^<a

a) od 0,001% do 10% związku wybranego z grupy składającej się z retinolu, estru retinylu i ich mieszanin,

b) 0,0001% do 50% N-podstawionego amidu kwasu tłuszczowego o budowie:

HC—NH—C—R,

I

HjC—O—Rj w którym

Ri = alkil lub alkoksyl o 1 do 10 atomach węgla;

R2 = alkil lub alkenyl o 8 do 25 atomach węgla;

R3 = alkil zawierający od 1do 5 atomów węgla, albo ester fosforanowy; oraz

c) kosmetycznie dopuszczalny nośnik.
2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera N-podstawiony amid kwasu tłuszczowego który w stężeniu 100 μΜ hamuje w co najmniej 20% estryfikację retinolu katalizowaną LRAT lub ARAT, mierzoną testem mikrosomalnym in vitro.
3. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera N-podstawiony amid kwasu tłuszczowego, który w stężeniu 100 μΜ hamuje w co najmniej 40% estryfikację retinolu katalizowantą LRAT lub ARAT, mierzoną testem mikrosomalnym in vitro.
4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera ester retinylu wybrany z grupy składającej się z palmitynianu retinylu, octanu retinylu, propionianu retinylu, linoleinianu retinylu i ich mieszanin.
5. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jako ester retinylu zawiera linoleinian retinylu.
6. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że jako składnik (a) zawiera retinol.