CZ289876B6

CZ289876B6 - Kosmetický prostředek

Info

Publication number: CZ289876B6
Application number: CZ19991088A
Authority: CZ
Inventors: Stewart Paton Granger; Ian Richard Scott
Original assignee: Unilever N. V.
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 2002-04-17
Also published as: IN189578B; ID21761A; RU2175546C2; AU714984B2; CZ108899A3; CN1237897A; US5723139A; PL332547A1; AU4775597A; CA2266615A1; TW541182B; DE69720539T2; KR100320138B1; JP2000503030A; ZA978658B; KR20000048698A; EP0975319B1; BR9712135A; AR009098A1; WO1998013019A1

Abstract

Kosmetick² prost°edek obsahuj c a) 0,001 a 10 % retinoidu, kter² se vol z retinolu, retinylesteru a sm si t chto l tek, b) 0,0001 a 50 % kyseliny, kter se vol z kyseliny oleanolov , ursolov a sm si t chto l tek a c) kosmeticky p°ijateln² nosi . Prost°edek je vhodn² na vr s itou k i, suchou, drsnou a olupuj c se poko ku, poko ku po oslun n , ale tak na zdravou ple k z bran nebo zpomalen jej ho st rnut .\

Description

(57) Anotace:

Kosmetický prostředek obsahující a) 0,001 až 10 % retinoidu, který se volí z retinolu, retinylesteru a směsi těchto látek, b) 0,0001 až 50 % kyseliny, která se volí z kyseliny oleanolové, ursolové a směsi těchto látek a c) kosmeticky přijatelný nosič. Prostředek je vhodný na vrásčitou kůži, suchou, drsnou a otupující se pokožku, pokožku po oslunění, ale také na zdravou pleť k zábraně nebo zpomalení jejího stárnutí.

CD m

co N00

O)

CM

N o

Kosmetický prostředek

Oblast techniky

Vynález se týká kosmetického prostředku, obsahujícího kyselinu a retinoid.

Dosavadní stav techniky

Retinol (vitamin A), je endogenní sloučenina, která se přírodně vyskytuje v lidském organismu a má zásadní význam pro normální diferenciaci epiteliálních buněk. Z tohoto důvodu byly přírodní i syntetické deriváty vitaminu A široce užívány k léčení různých kožních onemocnění a k obnově pokožky. Kyselina retinová byla užívána například k léčení akné, vrásek, lupénky, stařeckých skvrn a odlišně zbarvených oblastí pokožky, jak bylo popsáno například v publikacích Vahlquist A. a další, J. Invest. Dermatol., sv. 94, Hollad D. B. a Cunliffe W. J., 1990, str. 496 až 498, Ellis C. N. a další, Pharmacology of Retinols in Skin, Vasel, Karger, sv. 3,1989, str. 249 až 252, Lowe N. J. a další, Pharmacology of Retinols in Sin, sv. 3, 1989, str. 240 až 248 a PCT patentová přihláška č. WO 93/19743.

Předpokládá se, že použití retinolu nebo esterů retinolu je výhodnější než použití kyseliny retinové. Retinol je endogenní látka, estery retinolu se hydrolyzují in vivo za vzniku retinolu a retinol i retinylestery jsou z uvedeného důvodu bezpečnější než kyselina retinová. Vynález je zčásti založen na zjištění, že při kombinaci retinolu nebo retinylesteru s kyselinou oleanolovou a/nebo ursolovou dochází k synergické inhibici diferenciace keratinocytů. Kombinovaný účinek kyseliny oleanolové a/nebo ursolové a retinolu nebo retinylesteru je analogický účinku kyseliny retinové. Znamená to, že směs kyseliny oleanolové a/nebo ursolové s retinolem nebo retinylesterem má obdobný účinek jako kyselina retinová, použití této směsi je však bezpečnější.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří kosmetický prostředek pro péči o pleť, který obsahuje

a) 0,001 až 10 % retinoidu, který se volí z retinolu, retinylesteru nebo směsi těchto látek,

b) 0,0001 až 50 % sloučeniny, která se volí z kyseliny oleanolové, ursolové a směsi těchto látek a

c) kosmeticky přijatelný nosič.

Uvedený prostředek je možno použít k péči o pleť místním nanesením prostředku na pokožku. Tímto způsobem je možno napodobit účinek kyseliny retinové na pokožku.

Pod pojmem „péče o pleť“ se rozumí například: prevence a/nebo léčení suché pokožky nebo pokožky poškozené zářením, zvláště slunečním zářením, léčení nebo prevence vrásek, stařeckých skvrn a jiných projevů stárnutí pokožky, jako jsou zvýšení flexibility stratům comeum nebo zesvětlení barvy pokožky, dále je možno pod tímto pojmem rozumět také potlačení tvorby mazu a obecně zlepšení stavu pokožky.

První základní složkou kosmetického prostředku podle vynálezu je sloučenina ze skupiny, tvořené retinolem a retinylesterem. Pod pojmem „retinol“ se mimo jiné rozumí následující izomery retinolu. Alfall-trans-retinol, 13-cis-retinol, 11-cis-retinol, 9-cis-retinol, 3,4-didehydroretinol. Výhodnými izomery jsou alfall-trans-retinol, 13-cis-retinol, 3,4-didehydro-1 CZ 289876 B6 retinol a 9-cis-retinol. Nejvýhodnější je alfall-trans-retinol vzhledem ktomu, že je běžně dodáván.

Retinylester je ester retinolu. Retinylestery, vhodné pro použití v kosmetickém prostředku podle vynálezu mají 1 až 30 atomů uhlíku, s výhodou 2 až 20 atomů uhlíku v esterové skupině, nejvýhodnější jsou estery, obsahující 2, 3 a 16 atomů uhlíku vzhledem ktomu, že jsou běžně dostupné. Jako příklady retinylesterů je možno uvést například: retinylpalmitát, retinylformiát, retinylacetát, retinylpropionát, retinylbutyrát, retinylvalerát, retinylizovalerát, retinylhexanát, retinylheptanoát, retinyloktanoát, retinylnonanoát, retinyldekanoát, retinylundekanoát, retinylaurát, retinyltridekanoát, retinylmyristát, retinylpentadekanoát, retinylheptadekanoát, retinylstearát, retinylizostearát, retinylnonadekanoát, retinylarachidonát, retinylbehenát, retinyllinoleát a retinyloleát.

Výhodné estery pro použití v kosmetickém prostředku podle vynálezu se volí z retinylpalmitátu, retinylacetátu a retinyIpropionátu vzhledem k tomu, že tyto látky se běžně dodávají a jsou proto nejlevnější. Retinyllinoleát je rovněž výhodný vzhledem ke své účinnosti.

Retinol a/nebo retinylester je v prostředku podle vynálezu obsažen v množství 0,001 až 10%, s výhodou v množství 0,01 až 1 % a zvláště 0,01 až 0,5 %.

Druhou základní složkou kosmetického prostředku podle vynálezu je kyselina oleanolová, ursolová nebo směs těchto kyselin, které mají následující strukturu.

kyselina oleanolová

COOH

kyselina ursolová l·

H₃C ch₃

-2CZ 289876 B6

V závislosti na pH kosmetického prostředku mohou být obě kyseliny, kyseliny oleanolová a/nebo ursolová přítomny ve formě solí, například s alkalickými kovy nebo s kovy alkalických zemin.

Kyselina oleanolová a/nebo ursolová jsou v kosmetické prostředku obsaženy v množství 0,0001 až 50, s výhodou 0,01 až 10 a zvláště 0,1 až 5 % hmotnostních.

Kosmeticky přijatelný nosič

Kosmetický prostředek podle vynálezu obsahuje také kosmeticky přijatelný nosič jako ředidlo, disperzní prostředí nebo nosič pro retinol a/nebo retinylester a N-substituovaný amid mastné kyseliny. Nosič nebo nosné prostředky slouží zejména ke snadnému nanášení kosmetického prostředku na pokožku.

Nosná prostředí, odlišná od vody nebo užívaná společně s vodou zahrnují kapalná nebo pevná změkčovadla, rozpouštědla, zahušťovadla, látky zadržující vodu a různé práškové materiály. Zvláště výhodným nosičem nevodné povahy je polydimethylsiloxan a/nebo polydimethylfenylsiloxan. Silikony pro použití v kosmetickém prostředku podle vynálezu mají s výhodou viskozitu 10 až 10 000 000 m²/s při teplotě 25 °C. Zvláště vhodné jsou směsi silikonů s nízkou a vysokou viskozitou. Tyto silikony se běžně dodávají pod obchodními názvy Vicasil SE a SF (Generál Electric Company) a pod čísly 200 a 550 (Dow Oming Company). Množství silikonu, které je možno použít v prostředku podle vynálezu je 5 až 9 %, s výhodou 25 až 90 % hmotnostních prostředku.

Kosmeticky přijatelný nosič bude tvořit obvykle 5 až 99,9, s výhodou 25 až 80 % hmotnostních prostředku a může v nepřítomnosti dalších kosmeticky přijatelných složek doplnit kosmetický prostředek na požadované množství. S výhodou tvoří nosné prostředí nejméně z 50 % a zvláště z 80 % hmotnostních voda. Výhodný obsah vody je zvláště 60 až 80 % hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost kosmetického prostředku.

Případné další účinné a pomocné složky

K získání emulze typu voda v oleji nebo olej ve vodě, může být v kosmetickém prostředku podle vynálezu obsažen olej nebo materiál typu oleje spolu s emulgátorem v závislosti na hydrofilnělipofilní rovnováze HLB použitého emulgátoru.

Kosmetické prostředky podle vynálezu s výhodou obsahují ochranné látky proti slunečnímu záření. Jde o materiály, běžně užívané k ochraně proti ultrafialovému záření. Z těchto látek je možno uvést deriváty PABA, cinnamát a salicylát. Je například možno použít oktylmethoxycinnamát a 2-hydroxy-4-methoxybenzofenon, známý také jako exybenzon. Oktylmethoxycinnamát a 2-hydroxy-4-methoxybenzofenon se běžně dodávají pod obchodními názvy Parsol MCX a Benzophenon-3. Přesné množství těchto látek v emulzi se může měnit v závislosti na požadovaném stupni ochrany proti slunečnímu záření.

Další výhodnou případnou složkou jsou esenciální mastné kyseliny EFA, to znamená takové mastné kyseliny, které jsou nezbytné pro tvorbu plazmatické membrány všech buněk, například u keratinocytů dochází při nedostatku EFA ke zvýšené proliferaci. Tento stav je možno léčit dodáním EFA. EFA také podporují biosyntézu lipidů v pokožce a zejména lipidy pro tvorbu bariéry. Z esenciálních mastných kyselin je možno zvláště uvést kyselinu linolovou, gama-linolenovou, homo-gama-linolenovou, columbinovou, eicosa-(n-6,9,13)-trienovou, arachidonovou, timnodonovou, hexaenovou a směsi těchto kyselin.

Další výhodnou případnou složkou mohou být azoly, například climbazol, bifonazol, clotrimazol, ketoconazol, miconazol, econazol, itraconazol, fluconazol, terconazol, butoconazol, sulconazol, lionazol a směsi těchto látek. Azoly mohou být do kosmetického prostředku podle vynálezu

-3CZ 289876 B6 přidávány v množství 0,001 až 50, s výhodou 0,001 až 10 a zvláště v množství 0,1 až 5 % hmotnostních.

Do kosmetických prostředků podle vynálezu se často přidávají změkčovadla. Množství změkčovadel se může pohybovat v rozmezí 0,5 až 50, s výhodou 5 až 30 % hmotnostních, vztaženo na celkovou hmotnost prostředku. Změkčovadla pro toto použití jsou látky z různých chemických skupin, jako estery, mastné kyseliny a alkoholy, polyoly a uhlovodíky.

Estery mohou být monoestery nebo diestery. Přijatelnými příklady diesterů mastných kyselin mohou být dibutyladipát, diethylsebakát, diizopropyldimerát a dioktylsukcinát. Přijatelné estery mastných kyselin s rozvětveným řetězcem zahrnují 2-ethylhexylmyristát, izopropylstearát a izostearylpalmitát. Přijatelné estery trikarboxylových kyseliny zahrnují triizopropyltrilinoleát a trilaurylcitrát. Přijatelné estery mastných kyselin s přímým řetězcem zahrnují laurylpalmitát, myristyllaktát, oleylerukát a stearyloleát. Výhodnými estery jsou kokokaprylát/kaprát (směs kokokaprylátu a kokokaprátu), acetát myristyletheru propylenglykolu, diizopropyladipát a cetyloktanát.

Z vhodných mastných alkoholů a kyselin je možno uvést sloučeniny, obsahující 10 až 20 atomů uhlíku. Zvláště výhodné jsou cetyl-, myristyl-, palmityl- a stearylalkoholy a příslušné kyseliny.

Z polyolů, použitých jako změkčovadla je možno uvést alkylpolyhydroxysloučeniny s přímým nebo rozvětveným řetězcem. Výhodnými látkami z této skupiny jsou propylenglykol, sorbitol a glycerol. Použitelné jsou také polymemí polyoly, jako polypropylenglykol a polyethylenglykol. Butylenglykol a propylenglykol jsou zvláště výhodné jako látky, které usnadňují průnik.

Z uhlovodíků, použitých jako změkčovadla je možno uvést zejména uhlovodíky, obsahující 12 až 30 atomů uhlíku. Specifickými příklady mohou být minerální olej, vazelína, squalen a izoparafíny.

Další kategorií funkčních složek pro kosmetické prostředky podle vynálezu jsou zahušťovadla. Látky tohoto typu budou obvykle obsaženy v množství 0,1 až 20, s výhodou 0,5 až 10% hmotnostních z celkové hmotnosti kosmetického prostředku. Jako příklady zahušťovadel je možno uvést zesítěné polyakryláty, dodávané pod obchodním názvem Carbopol (B. F. Goodrich Company). Je také možno užít gumy, jako xanthan, carrageenan, želatinu, karayu, pektin a gumu z bobů. Za určitých okolností může být zahušťovadlo voleno z látek, použitých jako silikon nebo jako změkčovadla. Například silikonové pryže s viskozitou vyšší než 10 mm², s¹ a také některé estery, například glycerolstearát mohou v kosmetickém prostředku splnit dvojí funkci.

Do kosmetických prostředků podle vynálezu je možno začlenit také práškové materiály. Takovými složkami jsou například křída, mastek, kaolin, škrob, smektit, chemicky modifikovaný křemičitan hořečnatohlinitý, organicky modifikovaná montmorillonitová hlinka, hydratovaný křemičitan hlinitý, vysušený oxid křemičitý, oktenylsukcinát škrobu ve formě hlinité soli a směsi těchto látek.

Do kosmetických prostředků podle vynálezu mohou být zařazeny v malém množství také další složky, jako jsou barviva, parfémy a podobně. Množství těchto složek se může pohybovat v rozmezí 0,001 až 20 % hmotnostních.

Použití kosmetického prostředku

Kosmetický prostředek podle vynálezu je primárně určen pro místní podání na lidskou pokožku, zejména k péči o pleť a k prevenci nebo odstranění vrásek nebo jiných projevů stárnutí pokožky.

-4CZ 289876 B6

Při použití se malé množství prostředku, například 1 až 100 ml, nanese na příslušné části pokožky z vhodné nádoby nebo aplikátoru a popřípadě se pak materiál roztírá a/nebo vetře do pokožky rukou, prsty nebo vhodnými pomůckami.

Výrobky a balení

Prostředky podle vynálezu pro místní podání mohou být například emulze, krémy nebo gely. Tyto materiály mohou být baleny do vhodných nádobek podle viskozity a předpokládaného použití. Například emulze nebo krémy je možno uložit do lahviček, popřípadě opatřených ve výstupním otvoru kuličkou pro snadnější nanášení, neboje možno prostředek uložit do přístroje pro nanášení aerosolu s hnacím prostředkem nebo do nádobky s mechanickým nanášením pomocí prstů. V případě krému je možno použít nedeformující se kelímek nebo také tubu. Prostředek je rovněž možno ukládat do kapslí, například podle US 5 063 057.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu. V příkladové části přihlášky budou užity různé materiály a budou také popsány různé typy zkoušek.

Materiály a metody

Buněčná kultura

Lidské keratinocyty, izolované z předkožky novorozence působením trypsinu se pěstují v Eaglově prostředí v Dulbeccově modifikaci DME Hams F12(l:l)sl0% fetálního telecího séra v přítomnosti ozářených myších fibroblastů 3T3 pro zahájení dělení kolonií keratinocytů. Buňky byly pěstovány až do druhé pasáže a pak byly udržovány ve zmrazeném stavu pro příští použití. Pak byly keratinocyty opět rozmraženy ve svrchu uvedeném prostředí a pěstovány 5 dnů, načež bylo prostředí vyměněno na prostředí na bázi MCBD 153, prosté séra a vhodné pro pěstování keratinocytů, KGM (Clonetic Corporation, San Diego, CA), prostředí obsahuje 0,15 mM vápníku, neboje také možno užít prostředí KSFM, prosté séra a vhodné pro pěstování keratinocytů (GIBCO), které obsahuje 0,09 mM vápníku. Ve dni 7 vytvořil buněčný materiál vrstvu, souvislou na 80 až 90 %, vrstva byla zpracována trypsinem a nanesena na plotny v prostředí, prostém séra, pro různé zkoušky.

Zkouška na transglutaminázu

Zkouška na transglutaminázu a diferenciace keratinocytů

V průběhu konečné diferenciace epidermis se vytváří na vnitřním povrchu periferie buněk vrstva bílkoviny s tloušťkou 15 nm, označovaná jako obalová vrstva CE. Tato vrstva CE je tvořena řadou bílkovin, které byly spolu zesítěny za tvorby N^e,a-(gama-glutamyl)lysinizodipeptidových vazeb, tato tvorba je katalyzována působením nejméně dvou různých transglutamináz TG, k jejichž expresi dochází v epidermis. K expresi transglutaminázy ITGI dochází ve velkém množství v diferencovaných vrstvách epidermis, zvláště v granulámí vrstvě, avšak nedochází k ní v nediferencované bazální vrstvě. To znamená, že uvedený enzym je vlastně průkazem diferenciace keratinocytů, přičemž vyšší množství enzymu je vždy ukazatelem diferencovanějšího stavu. Při průkazu tohoto enzymu zkouškou ELISA při použití protilátky proti uvedenému enzymu je možno prokázat stav diferenciace vypěstovaných keratinocytů, jak bude uvedeno v následujících příkladech.

V případě příkladu 1 bylo použito následujícího postupu:

Keratinocyty, vypěstované svrchu uvedeným způsobem, byly naneseny na plotnu s 96 vyhloubeními v množství 3000 buněk na vyhloubení ve 200 mikrolitrech živného prostředí. Po inkubaci 4 dny bylo prostředí vyměněno za prostředí, obsahující zkoumané látky, každá látka

-5CZ 289876 B6 byla užita v dané koncentraci vždy v šesti opakováních. Pak byly buňky pěstovány dalších 72 hodin a pak po odsátí živného prostředí byly plotny uloženy při teplotě -70 °C. Pro použití byly plotny vyjmuty z mrazicího zařízení a buněčný materiál byl promyt PBS. Bylo přidáno 100 mikrolitrů sterilní vody a buněčný materiál se rozruší zmrazením na -70 °C s následným rozmražením. Buňky se inkubují 1 hodinu při teplotě místnosti v PBS se 3% BSA, jde opromývací pufr se sérovým albuminem skotu, pak se buněčný materiál promyje čerstvým podílem promývacího pufru. Buňky se inkubují spolu s 50 mikrolitry primární myší monoklonální protilátky proti lidské transglutamináze, IgG (Biomedical Industries) v ředění 1 : 2000 v promývacím pufru 1 hodinu při teplotě 37 °C a pak se promyjí dvakrát po sobě promývacím pufrem. Pak se buněčný materiál inkubuje 150 mikrolitry sekundární protilátky (fragment Fab, protilátka IgG proti myším tkáním, konjugované s peroxidázou, Amersham) v ředění 1 :4000 v promývacím pufru 1 hodinu při teplotě 37 °C, načež se dvakrát promyje promývacím pufrem. Buňky se inkubují s roztokem substrátu, jde o roztok 4 mg o-fenylendiaminu a 3,3 mikrolitrů 30% peroxidu vodíku v 10 ml 0,lM citrátového pufru o pH 5,0 celkem 5 minut při teplotě místnosti ve tmě pod hliníkovou fólií. Reakce se zastaví přidáním 50 mikrolitrů 4N kyseliny sírové. Absorbance vzorků se odečítá příslušným přístrojem při 492 nm. Ze šesti vzorků byly ke čtyřem vzorkům přidány obě protilátky, ke dvěma byla přidána pouze sekundární protilátka ke stanovení vazby protilátky, konjugované s enzymem. Koncentrace transglutaminázy byly stanoveny odečtením takto zjištěného pozadí z koncentrace, zjištěné v jednotlivých vzorcích a stanovením směrodatné odchylky pro vzorky, k nimž byly přidány obě protilátky.

V případě příkladu 2 bylo použito následujícího postupu:

Keratinocyty, vypěstované svrchu uvedeným způsobem, byly naneseny na plotnu s 96 vyhloubeními v množství 3000 buněk na vyhloubení ve 200 μΐ živného prostředí. Po inkubaci 4 dny bylo prostředí nahrazeno prostředím s obsahem zkoumaných látek, zkoušky byly prováděny v šesti opakováních. Pak byl buněčný materiál pěstován ještě 72 hodin, načež byly po odstátí živného prostředí plotny uloženy při -70 °C. Po vyjmutí z mrazicího zařízení byl buněčný materiál znovu zmrazen a rozmražen a pak třikrát promyt PBS. Pak byly buňky inkubovány 1 hodinu při teplotě místnosti v pufru TBS s 5 % BSA. Pak byly buňky inkubovány se 100 mikrolitiy primární protilátky, monoklonální myší protilátky IgG proti lidské transglutamináze (Biomedical Technologies lne.) v ředění 1 :2000 v pufru TBS s 1 % BSA 2 hodiny při teplotě 37 °C, načež byly 6x promyty promývacím pufrem TBS s 1 % BSA a s 0,05 % Twenn-20. Pak byl buněčný materiál inkubován se 100 mikrolitry fragmentu Fab sekundární protilátky, protiláty IgG proti myším tkáním, konjugované s peroxidázou (Amersham) v ředění 1 : 4000 v promývacím pufru celkem 2 hodiny při teplotě 37 °C, načež byl materiál 3x promyt promývacím pufrem a pak ještě 3x PBS. Buňky pak byly inkubovány s roztokem substrátu, 4 mg o-fenylendiaminu a 3,3 mikrolitrů 30% peroxidu vodíku v 10 ml 0,lM citrátového pufru o pH 5,0 celkem 5 minut při teplotě místnosti a ve tmě pod hliníkovou fólií. Reakce byla zastavena přidáním 50 mikrolitrů 4N kyseliny sírové. Absorbance vzorků byla odečítána příslušným přístrojem při 492 nm. Ze šesti opakování byly ke čtyřem vzorkům přidány obě protilátky a ke dvěma z nich pouze sekundární protilátka ke stanovení pozadí vazby enzymu konjugovanou protilátkou. Koncentrace transglutaminázy I byly stanoveny odečtením tohoto pozadí od výsledku pro každý ze vzorků za současného stanovení směrodatné odchylky.

Stanovení DNA

Množství transglutaminázy I, zjištěná po zpracování buněk může být ovlivněna počtem buněk, to znamená, že čím větší bude počet buněk, tím vyšší bude koncentrace enzymu. Koncentrace enzymu byla tedy normalizována na obsah DNA v buňkách téhož vyhloubení, čímž byly vyloučeny variace, způsobené rozdílem v počtu buněk. Kvantitativní stanovení DNA je zvláště vhodným ukazatelem počtu buněk včetně keratinocytů vzhledem k tomu, že každá z buněk má stejný genom a tím i stejné množství DNA. Celkové množství DNA ve vyhloubení je tedy přímo

-6CZ 289876 B6 úměrné počtu buněk v tomto vyhloubení. Pak je možno stáhnout údaje o koncentraci enzymu na zjištěné množství DNA.

Keratinocyty byly naneseny na plotny s 96 vyhloubeními v množství 3000 buněk na vyhloubení ve 200 mikrolitrech živného prostředí. Po inkubaci 4 dny bylo prostředí nahrazeno prostředím s obsahem zkoumaných látek, každá zkouška byla provedena v šesti opakováních. Pak byly buňky pěstovány ještě 72 hodin, načež bylo živné prostředí odstraněno odsátím a plotny byly uloženy nejméně na 1,5 hodiny při teplotě -70 °C. Pak byly plotny vyjmuty z mrazicího zařízení a na 30 minut rozmraženy, do každého vyhloubení bylo přidáno 100 mikrolitrů barviva Hoechst (konečná koncentrace 1 mikrogram/ml) a plotny byly inkubovány 15 minut, překryty a výsledek byl odečítán fluorimetrem (excitace 360 nm, emise 460 nm). Pak byl roztok barviva odstraněn a vyhloubení byla promyta PBS a tak připravena na stanovení transglutaminázy.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Kyselina retinová je účinnější než retinol při změně stadia diferenciace keratinocytů

Byl sledován účinek transglutaminázy, normalizované na obsah DNA v buňkách po přidání kyseliny retinové RA a retinolu ROH, výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 1:

Tabulka 1

	průměr TGáza/DNA x 10 ± s.d. (% kontroly)	hodnota p proti kontrole	ppro 2,5x 10’⁷M ROH	ppro 2,5x 10’⁸M ROH	PPro 2,5xlO’’M ROH
kontrola	2,44 ± 0,24 (100%)	—	0,001	0,001	0,001
2,5x10^_7M RA	0,16± 0,11 (7%)	0,001	0,001	0,001	0,001
2,5x10“⁷M ROH	1,14 + 0,22 (47%)	0,001	-	0,001	0,001
2,5xlO'⁸M RA	1,34 ±0,40 (55 %)	0,001	0,2	0,001	0,001
2,5x10~⁸M ROH	1,89 ±0,30 (77 %)	0,001	0,001	-	0,001
2,5x10^_9M RA	1,87 ±0,49 (77 %)	0,001	0,001	0,784	0,001
2,5x10*⁹M ROH	2,70 ± 0,59 (>100%)	0,001	0,001	0,001	-

n = 3

Všechny zkoušené koncentrace kyseliny retinové, to znamená 2,5 x 10 ⁷ M, 2,5xlO^_8M a 2,5 x 10⁹ M snižovaly diferenciaci keratinocytů ve významně vyšším rozsahu než retinol ve stejných koncentracích. Snížení množství transglutaminázy bylo závislé na dávce, jak v případě kyseliny retinové, tak v případě retinolu. To je v souladu se skutečností, že kyselina retinová má na diferenciaci epitelu větší účinnost než retinol.

Příklad 2

Synergický účinek kyseliny oleanolové a retinolu při inhibici diferenciace keratinocytů

Byl sledován účinek zkoumaných látek po dobu 72 hodin na koncentraci transglutaminázy I, normalizovanou na obsah DNA v buněčném materiálu. Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 2.

Tabulka 2

Vliv retinolu a kyseliny oleanolové na TGázu/DNA v keratinocytech

	průměr TGázy/DNA x 10⁵±s.d. % kontroly	p proti kontrola	ppro 2,5x 10’⁷M ROH	ppro 2,5x 10’⁷M RA	ppro ÍO^M kyselinu oleanolovou
kontrola	22,46 ± 2,05 (100 %)	-	0,001	0,001	0,001
2,5x10~⁷M RA	9,95 ± 2,74 (44 %)	0,001	0,001	—	0,001
2,5x1 0“⁷M Retinol	18,27 ±3,30 (81 %)	0,001	-	0,001	0,001
10+m kyselina oleanolová	20,95 ± 1,95 (93 %)	0,001	0,001	0,001	-
2,5x10~⁷M ROH + 10“⁶M kyselina oleanolová	14,83 ± 3,90 (66 %)	0,001	0,001	0,001	0,001

n = 3

Kyselina retinová v koncentraci 2,5 x 10 ⁷ M byla velmi účinná při snižování koncentrace transglutaminázy I v keratinocytech, až na 44 % kontrolní hodnoty. Retinol v téže koncentraci byl méně účinný než kyselina retinová a kyselina oleanolová v koncentraci 10*⁴ M měla jen malý inhibiční účinek na koncentraci transglutaminázy I v keratinocytech. Kombinace 2,5xlO~⁷M retinolu a 10“⁶ M kyseliny oleanolové však snížila koncentraci enzymu v keratinocytech až na 66 % kontrolní hodnoty. To znamená, že kyselina oleanolová a retinol mají synergní účinek na potlačení diferenciace keratinocytů, který je srovnatelný s účinkem kyseliny retinové.

V příkladech 1 a 2 byla kyselina retinová užita jako pozitivní kontrola a referenční sloučenina, s jejímž účinkem byl srovnáván účinek ostatních látek. Kyselina retinová snižuje koncentraci transglutaminázy v keratinocytech pokožky v závislosti na použité dávce. Jinak vyjádřeno, snižuje kyselina retinová diferenciaci keratinocytů. Retinol má na tuto diferenciaci statisticky významně nižší vliv než kyselina retinová.

Bylo však zcela neočekávaně zjištěno, že účinek retinolu na keratinocyty, pěstované v kultuře, je možno zvýšit až na úroveň, srovnatelnou s účinkem kyseliny retinové tak, že se retinol kombinuje s kyselinou oleanolovou. Jde o synergní účinek, který je srovnatelný s účinkem kyseliny retinové na diferenciaci keratinocytů.

V příkladech 3 až 8 jsou uvedeny prostředky podle vynálezu pro místní podání, které je možno vyrobit běžnými postupy a které jsou určeny pro péči o pleť, zejména při tvorbě vrásek, u drsné a suché pleti, stárnoucí pokožky nebo po oslunění. Prostředky jsou vhodné i pro zdravou pleť k zábraně nebo zpomalení jejího stárnutí.

-8CZ 289876 B6

Příklad 3

Kosmetický prostředek pro místní podání

	% hmotnostní
retinol	0,5
plně hydrogenovaný kokosový olej	3,9
kyselina ursolová	5
Brij 92*	5
bentone 38	0,5
MgSO₄.7H₂O	0,3
butylovaný hydroxytoluen	0,01
parfém	podle potřeby
voda do	100

^x Brij 92 je polyoxyethylen (2) oleylether.

io Příklad 4
Krém typu olej ve vodě
	% hmotnostní
kyselina retinová	0,15
minerální olej	4
kyselina oleanolová	1
Brij 56^x	4
Alfol 16RD^X	4
triethanolamin	0,75
butan-l,3-diol	3
xanthanová guma	0,3
parfém	podle potřeby
butylovaný hydroxytoluen	0,01
voda do	100
15 ^x Brij 56 je cetylalkohol POE (10),
Alfol 16RD je cetylalkohol.

Příklad 5

Alkoholový lotion retinylpalmitát kyselina oleanolová ethanol parfém butylovaný hydroxytoluen voda do % hmotnostní

0,15

0,1 podle potřeby

0,01

100

-9CZ 289876 B6

Příklad 6
Alkoholový lotion
	% hmotností
retinol	0,15
kyselina ursolová	0,1
ethanol	40
antioxidační činidlo	0,1
parfém	podle potřeby
voda do	100
Příklad 7
Opalovací krém
	% hmotnostní
retinol	0,01
kyselina ursolová	0,1
silikonový olej 200 mm^-2.s^-1	7,5
glycerylmonostearát	3
cetostearylalkohol	1,6
polyoxyethylen (20) cetylalkohol	1,4
xanthanová guma	0,5
Parsol 1789	1,5
oktylmethoxycinnát (Parsol MCX)	7
parfém	podle potřeby
barvivo	podle potřeby
voda do	100

Příklad 8

Pleťový krém nevodné povahy

	% hmotnostní
kyselina retinová	0,15
kyselina oleanolová	1
siliková pryž SE-30¹	10
kapalný silikon 345²	20
kapalný silikon 344³	55,79
squalen	10
kyselina linolová	0,01
cholesterol	0,03
kyselina 2-hydroxy-n-oktanová	0,7
linoleát vitaminu E	0,5
květinový olej	0,5
ethanol	2

Dimethylsilikonový polymer s molekulovou hmotností nejméně 50 000 a viskozitou nejméně 10 000 mm².s^_1 při teplotě 25 °C (GEC), cyklický pentamer dimethylsiloxanu (Dow Coming Corp.),

-10CZ 289876 B6 tetramer dimethylsiloxanu (Dow Coming Corp.).

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Kosmetický prostředek pro péči o pleť, vyznačující se tím, že obsahuje

a) 0,001 až 10 % retinoidu, který se volí z retinolu, retinylesteru a směsi těchto látek,

b) 0,0001 až 50 % kyseliny, která se volí z kyseliny oleanolové, ursolové a směsi těchto látek a

c) kosmeticky přijatelný nosič.

2. Kosmetický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že se retinylester volí ze skupiny retinylpalmitát, retinylacetát, retinylpropionát, retinyllinoleát a směsi těchto látek.

3. Kosmetický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako složku a) obsahuje retinol.

4. Kosmetický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako složku a) obsahuje retinylester.

5. Způsob péče o pleť, vyznačující se tím, že se na pleť nanáší kosmetický prostředek podle některého z nároků 1 až 4.

6. Způsob napodobení účinku kyseliny retinové, vyznačující se tím, že se nanáší na pleť kosmetický prostředek podle některého z nároků 1 až 4.