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Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung betrifft Hautpflegezusammensetzungen,
die eine Säure
und ein Retinoid enthalten, und kosmetische Verfahren, die das Auftragen
solcher Zusammensetzungen auf die Haut einbeziehen.
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Hintergrund der Erfindung
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Retinol (Vitamin A) ist eine endogene
Verbindung, die natürlicherweise
im menschlicher Körper
vorkommt und für
normale epitheliale Zelldifferentiation wesentlich ist. Natürliche und
synthetische Vitamin-A-Derivate wurden ausgiebig bei der Behandlung
einer Vielzahl von Hautstörungen
verwendet und wurden als Hautreparier- und -erneuerungsmittel verwendet.
Retinsäure
wurde angewendet, um eine Vielzahl von Hautzuständen zu behandeln, beispielsweise
Akne, Falten, Psoriasis, Altersflecken und Entfärbung. Siehe beispielsweise
Vahlquist, A. et al., J. Invest. Dermatol., Band 94, Holland D.
B. und Cunliffe, W. J. (1990;, Seiten 496–498; Ellis, C. N. et al., „Pharmacology
of Retinols in Skin",
Vasel, Karger, Band 3 (1989), Seiten 249–52; Lowe, N. J. et al., „Pharmacology
of Retinols in Skin",
Band 3 (1989), Seiten 240–248;
PCT Patent Anmeldung Nr. WO 93/19743. Es wird angenommen, dass die
Verwendung von Retinol oder Estern von Retinol gegenüber Retinsäure bevorzugt
sein würde.
Retinol ist eine endogene Verbindung. Ester von Retinol hydrolysieren
in-vivo unter Erzeugung von Retinol. Retinol und Retinylester werden
als sicherer als Retinsäure
betrachtet. Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf dem Auffinden,
dass eine Kombination von Retinol oder Retinylester mit Oleanolsäure und/oder
Ursolsäure
eine synergistische Inhibierung der Keratinocyten-Differentiation
ergibt. Die Wirkungen von Oleanolsäure und/oder Ursolsäure, kombiniert
mit Retinol oder einem Retinylester, waren analog zu den Wirkungen
von Retinsäure.
Somit ahmt ein Gemisch von Oleanolsäure und/oder Ursolsäure mit Retinol
oder Retinylestern, Retinsäure
nach und ist dennoch leichter und sicherer als Retinsäure anzuwenden.
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Kurzdarstellung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung schließt zum Teil
eine hautkonditionierende Zusammensetzung ein, enthaltend:
- (a) 0,001% bis 10% eines Retinoids, ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus Retinol, Retinylester und Gemischen davon;
- (b) 0,0001% bis 50% einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend
aus Oleanolsäure,
Ursolsäure
und Gemischen davon; und
- (c) einen kosmetisch verträglichen
Träger.
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Die Erfindung stellt auch ein kosmetisches
Verfahren zum Konditionieren von Haut bereit, umfassend örtliches
Auftragen der vorliegenden Zusammensetzung auf die Haut. Sie stellt
weiterhin ein kosmetisches Verfahren bereit, das die Wirkung von
Retinsäure
auf Haut nachahmt, umfassend örtliches
Ruftragen der vorliegenden Zusammensetzung auf die Haut.
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Der wie hierin verwendete Begriff „Konditionieren" bedeutet Verhinderung
und Behandlung von einer oder mehreren der nachstehenden Hautzustände: trockene
Haut, lichtgeschädigte
Haut, Auftreten von Falten, Altersflecken, gealterte Haut, Akne,
Psoriasis, atopische Dermatosis. Die Zusammen setzungen können auch angewendet
werden, um Hautaufhellung, erhöhte
Stratum corneum-Flexibilität,
gesteuerte Sebumexkretion und im Allgemeinen Erhöhung der Hautqualität zu erreichen.
Die Zusammensetzung kann verwendet werden, um die Hautabschuppung
und zelluläre
Proliferation zu verbessern.
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Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsform
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Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten
als einen ersten, wesentlichen Bestandteil eine Verbindung, ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus Retinol, Retinylester und Gemischen davon.
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Der Begriff „Retinol" schließt unter anderem die nachstehenden
Isomeren von Retinol: all-trans-Retinol, 13-cis-Retinol, 11-cis-Retinol, 9-cis-Retinol,
3,4-Didehydroretinol ein. Bevorzugte Isomeren sind all-trans-Retinol,
13-cis-Retinol,
3,4-Didehydroretinol, 9-cis-Retinol. Besonders bevorzugt ist all-trans-Retinol aufgrund
seiner breiten kommerziellen Verfügbarkeit.
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Retinylester ist ein Ester von Retinol.
Der Begriff „Retinol" wurde vorstehend
definiert. Retinylester, die zur Verwendung in der vorliegenden
Erfindung geeignet sind, sind C1-C30-Ester von Retinol, vorzugsweise C2-C20-Ester und besonders
bevorzugt C2-, C3-
und C16-Ester, weil sie üblicherweise verfügbar sind.
Beispiele für
Retinylester schließen
ein, sind jedoch nicht begrenzt auf: Palmitinsäureretinylester, Ameisensäureretinylester,
Essigsäureretinylester,
Propionsäureretinylester,
Buttersäureretinylester,
Valeriansäureretinylester,
Isovaleriansäureretinylester,
Hexansäureretinylester,
Heptansäureretinylester,
Octansäureretinylester,
Nonansäureretinylester,
Decansäureretinylester,
Undecansäureretinylester,
Laurinsäureretinylester,
Tridecansäureretinylester,
Myristinsäureretinylester,
Pentadecansäureretinylester,
Heptadecansäureretinylester,
Stearinsäureretinyl ester,
Isostearinsäureretinylester,
Nonadecansäureretinylester,
Arachidonsäureretinylester,
Behensäureretinylester,
Linolsäureretinylester
und Ölsäureretinylester,
Milchsäureretinylester,
Glycolsäureretinylester,
Hydroxycaprylsäureretinylester,
Hydroxylaurinsäureretinylester,
Weinsäureretinylester.
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Der bevorzugte Ester zur Verwendung
in der vorliegenden Erfindung ist aus Palmitinsäureretinylester, Essigsäureretinylester
und Propionsäureretinylester
ausgewählt,
weil diese die am besten kommerziell Verfügbaren sind und deshalb die
Kostengünstigsten.
Linolsäureretinylester
ist aufgrund seiner Wirksamkeit ebenfalls bevorzugt.
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Retinol und/oder Retinylester wird
in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
in einer Menge von 0,001% bis 10%, vorzugsweise in einer Menge von
0,01% bis 1%, besonders bevorzugt in einer Menge von 0,01 bis 0,5%,
angewendet.
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Der zweite wesentliche Bestandteil
der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
ist Oleanolsäure, Ursolsäure oder
eine Kombination davon. Die Strukturen von diesen Säuren sind
wie nachstehend:
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Es sollte selbstverständlich sein,
dass in Abhängigkeit
von dem pH-Wert der Zusammensetzung Oleanolsäure und/oder Ursolsäure in der
Zusammensetzung als ein Salz, beispielsweise Alkali- oder Erdalkalimetallsalz,
vorliegen kann.
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Oleanolsäure und/oder Ursolsäure ist
in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
in einer Menge im Bereich von 0,0001% bis 50%, vorzugsweise 0,01
bis 10%, besonders bevorzugt 0,1% bis 5% eingeschlossen.
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Kosmetisch verträglicher
Träger
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Die erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst
auch einen kosmetisch verträglichen
Träger,
um als Verdünnungsmittel,
Dispersant oder Träger
für die
Wirkstoffe in der Zusammensetzung zu wirken, um ihre Verteilung
zu erleichtern, wenn die Zusammensetzung auf die Haut aufgetragen
wird.
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Träger, die verschieden sind von
oder zusätzlich
zu Wasser, können
flüssige
oder feste Erweichungsmittel, Lösungsmittel,
Feuchthaltemittel, Verdicker und Pulver einschließen. Ein
besonders bevorzugter nichtwässeriger
Träger
ist ein Polydimethylsiloxan und/oder ein Polydimethylphenylsiloxan.
Die erfindungsgemäßen Silikone
können
jene mit Viskositäten
im Bereich von etwa 10 bis 10 000 000 mm2/s
(Centistokes) bei 25°C sein.
Besonders erwünscht
sind Gemische von Silikonen mit niedriger und hoher Viskosität. Diese
Silikone sind von der General Electric Company unter den Handelsmarken
Vicasil, SE und SF, und von der Dow Corning Company unter der 200er-
und 550er-Reihe erhältlich.
Mengen von Silikon, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen genutzt
werden können,
liegen im Bereich von etwa 5% bis 95%, vorzugsweise 25% bis 90 Gewichtsprozent,
der Zusammensetzung.
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Der kosmetisch verträgliche Träger wird
gewöhnlich
5% bis 99,9%, vorzugsweise 25% bis 80 Gewichtsprozent, der Zusammensetzung
ausmachen und kann in Abwesenheit von anderen kosmetischen Hilfsmitteln
den Rest der Zusammensetzung bilden. Vorzugsweise ist der Träger mindestens
50%, bevorzugter mindestens 80 Gewichtsprozent Wasser, auf das Gewicht
des Trägers.
Vorzugsweise umfasst Wasser mindestens 50 Gewichtsprozent der erfindungsgemäßen Zusammensetzung,
besonders bevorzugt 60 bis 80 Gewichtsprozent, auf das Gewicht der
Zusammensetzung.
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Wahlweise Hautvorteilsmaterialien
und kosmetische Hilfsstoffe
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Ein Öl oder öliges Material kann zusammen
mit einem Emulgator vorliegen, unter Bereitstellung von entweder
einer Wasser-in-Öl-Emulsion
oder einer Öl-in-Wasser-Emulsion,
in Abhängigkeit
von dem mittleren hydrophilen-lipophilen Ausgleich (HLB) des angewendeten
Emulgators.
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Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen schließen vorzugsweise
Sonnenschutzmittel ein. Sonnenschutzmittel schließen jene
Materialien, die üblicherweise
angewendet werden, um Ultraviolettlicht zu blockieren, ein. Erläuternde
Verbindungen sind die Derivate von PABA, Cinnamat und Salicylat.
Beispielsweise können
Methoxyzimtsäureoctylester
und 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon (auch bekannt als Oxybenzon) verwendet
werden. Methoxyzimtsäureoctylester
und 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon
sind unter den Handelsmarken Parsol MCX bzw. Benzophenon-3 erhältlich.
Die exakte Menge an in den Emulsionen angewendetem Sonnenschutzmittel
kann in Abhängigkeit
vom erwünschten
Schutzgrad vor UV-Sonnenstrahlung variieren.
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Ein weiterer bevorzugter, wahlweiser
Bestandteil ist ausgewählt
aus essentiellen Fettsäuren
(EFAs); das heißt
jenen Fettsäuren,
die für
die Plasmamembranbildung von allen Zellen essentiell sind, wobei
Keratinozyten-EFA-Mangel Zellen hyperproliferativ macht. Die Ergänzung von
EFA korrigiert dies. EFA erhöhen auch
die Lipidbiosynthese der Epidermis und stellen Lipide für die Sperrbildung
der Epidermis bereit. Die essentiellen Fettsäuren werden vorzugsweise aus
Linolsäure, γ-Linolensäure, Homo-γ-linolensäure, Columbinsäure, Eicosan-(n-6,9,13)-triensäure, Arachidonsäure, Timnodonsäure, Hexaensäure und
Gemischen davon, ausgewählt.
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Ein weiterer bevorzugter, wahlweiser
Bestandteil ist ausgewählt
aus Azolen, beispielsweise Climbazol, Bifonazol, Clotrimazol, Ketoconazol,
Miconazol, Econazol, Itraconazol, Fluconazol, Terconazol, Butoconazol, Sulconazol,
Lionazol und Gemischen davon. Das Azol kann in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in
einer Menge von 0,001 bis 50 Gewichtsprozent, vorzugsweise 0,001
bis 10 Gewichtsprozent, besonders bevorzugt 0,1 bis 5%, enthalten
sein.
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In die erfindungsgemäßen kosmetischen
Zusammensetzungen werden häufig
Erweichungsmittel eingearbeitet. Anteile von solchen Erweichungsmitteln
können
im Bereich von 0,5% bis 50%, vorzugsweise zwischen 5% und 30 Gewichtsprozent,
der Gesamtzusammensetzung liegen. Erweichungsmittel können unter solchen
allgemeinen chemischen Kategorien, wie Ester, Fettsäuren und
Alkohole, Polyole und Kohlenwasserstoffe, eingeteilt werden.
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Ester können Mono- oder Diester sein.
Annehmbare Beispiele von Fettsäurediestern
schließen
Adipinsäuredibutylester,
Sebacinsäurediethylester,
Dimersäurediisopropylester
und Bernsteinsäuredioctylester ein.
Annehmbare verzweigtkettige Fettsäureester schließen Myristylsäure-2-ethylhexylester,
Stearinsäureisopropylester
und Palmitinsäureisostearylester
ein. Annehmbare dreibasige Säureester
schließen
Trilinolsäuretriisopropylester
und Zitronensäuretrilaurylester
ein. Annehmbare geradkettige Fettsäureester schließen Palmitinsäurelaurylester,
Milchsäuremyristylester,
Erucasäureoleylester
und Ölsäurestearylester
ein. Bevorzugte Ester schließen
Cococaprylat/Caprat (ein Gemisch von Cococaprylat und Cococaprat),
Propylenglycolmyristyletheracetat, Adipinsäurediisopropylester und Octansäurecetylester
ein.
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Geeignete Fettalkohole und -säuren schließen jene
Verbindungen mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen ein. Besonders bevorzugt
sind solche Verbindungen, wie Cetyl-, Myristyl-, Palmitin- und Stearylalkohole
und -säuren.
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Unter den Polyolen, die als Erweichungsmittel
dienen können,
sind lineare und verzweigtkettige Alkylpolyhydroxylverbindungen.
Beispielsweise sind Propylenglycol, Sorbit und Glycerin bevorzugt.
Auch verwendbar können
polymere Polyole, wie Polypropylenglycol und Polyethylenglycol,
sein. Butylenund Propylenglycol sind besonders auch als Eindringverstärker bevorzugt.
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Beispielhafte Kohlenwasserstoffe,
die als Erweichungsmittel dienen können, sind jene mit Kohlenwasserstoffketten,
mit etwa von 12 bis 30 Kohlenstoffatomen. Spezielle Beispiele schließen Mineralöl, Vaseline, Squalen
und Isoparaffine ein.
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Eine weitere Kategorie von funktionalen
Bestandteilen innerhalb der erfindungsgemäßen kosmetischen Zusammensetzungen
sind Verdickungsmittel. Ein Verdickungsmittel wird gewöhnlich in
Mengen etwa von 0,1 bis 20 Gewichtsprozent, vorzugsweise von 0,5%
bis 10 Gewichtsprozent, der Zusammensetzung vorliegen. Beispielhafte
Verdickungsmittel sind vernetzte Polyacrylatmaterialien, die unter
der Handelsmarke Carbopol von B. F. Goodrich Company erhältlich sind.
Gummen können
als Xanthan-, Carrageenan-, Gelatine-, Karaya-, Pektin- und Johannesbrotbaumgummi
angewendet werden. Unter bestimmten Umständen kann die verdickende Funktion
durch ein Material, das auch als ein Silikon oder Erweichungsmittel
dient, bewirkt werden. Beispielsweise haben Silikongummies mit einer
Viskosität
oberhalb von 10 Centistokes und Ester, wie Stearinsäureglycerinester,
duale Funktionalität.
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In die erfindungsgemäße kosmetische
Zusammensetzung können
Pulver eingearbeitet werden. Diese Pulver schließen Kreide, Talkum, Fullers-Erde,
Kaolin, Stärke,
Smectittone, chemisch modifiziertes Magnesiumaluminiumsilikat, organisch
modifizierten Montmorillonitton, hydratisiertes Aluminiumsilikat,
pyrogene Kieselsäure,
Aluminiumstärkeoctenylsuccinat
und Gemische davon ein.
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Andere unterstützende geringe Komponenten
können
auch in die kosmetischen Zusammensetzungen eingearbeitet werden.
Diese Bestandteile können
färbende
Mittel, Opazitätsmittel
und Parfums einschließen. Mengen
dieser anderen in geringer Menge vorliegenden Hilfskomponenten können im
Bereich von etwa 0,001% bis zu 20 Gewichtsprozent der Zusammensetzung
liegen.
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Verwendung der Zusammensetzung
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Die erfindungsgemäße Zusammensetzung ist hauptsächlich als
Produkt zur örtlichen
Auftragung auf menschliche Haut, insbesondere als Mittel zum Konditionieren
und Glätten
der Haut und Verhindern oder Vermindern des Aussehens von faltiger
oder gealterter Haut vorgesehen.
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Bei der Verwendung wird eine kleine
Menge der Zusammensetzung, beispielsweise 1 bis 100 ml, auf exponierte
Flächen
der Haut aus einem geeigneten Behälter oder Applikator aufgetragen
und, falls erforderlich, wird sie dann darüber verteilt und/oder unter
Verwendung von Hand oder Fingern oder einer geeigneten Vorrichtung
in die Haut eingerieben.
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Produktform und Verpackung
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Die erfindungsgemäße örtliche Hautbehandlungszusammensetzung
kann als Lotion, Fluidcreme, Creme oder Gel formuliert werden. Die
Zusammensetzung kann in einem geeigneten Behälter verpackt werden, der sich
für ihre
Viskosität
und zur vorgesehenen Verwendung durch den Verbraucher eignet. Beispielsweise kann
eine Lotion oder Creme in eine Flasche oder einen Rollkugelapplikator
oder eine Kapsel oder eine mit Treibmittel betriebene Aerosolvorrichtung
oder einen mit einer Pumpe zur geeigneten Fingerbetätigung ausgestatteten
Behälter
verpackt werden. Wenn die Zusammensetzung eine Creme darstellt,
kann sie einfach in einer nicht verformbaren Flasche oder einem
Quetschbehälter,
wie eine Tube oder eine mit Deckel versehene Dose, gelagert werden.
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Die Zusammensetzung kann auch in
Kapseln, wie jene, beschrieben in US-Patent 5 063 057, eingeschlossen
sein.
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Die Erfindung stellt folglich auch
einen verschlossenen Behälter,
der eine hierin definierte kosmetisch verträgliche Zusammensetzung enthält, bereit.
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Die nachstehenden speziellen Beispiele
erläutern
weiterhin die Erfindung. In den Beispielen verwendete Retinoide
wurden von Sigma erhalten. Ursolsäure und Oleanolsäuren wurden
von Aldrich erhalten.
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MATERIALIEN UND VERFAHREN
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Zellkultur:
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Humankeratinozyten, isoliert aus
neonataler Vorhaut durch Trypsinbehandlung, wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-(DME)
plus Hams F12-(1:1)-Medium/10%igem fötalem Kalbsserum in Gegenwart
von bestrahlten 3T3-Maus-Fibroblasten zur Herstellung einer Teilung
von Keratinozytenkolonien wachsen lassen. Die Zellen wurden unter
der vorstehenden Bedingung wachsen lassen bis zu ihrer zweiten Passage
und bis zur zukünftigen
Verwendung gefroren gehalten. Gefrorene Keratinozyten in der zweiten
Passage wurden aufgetaut und in dem vorstehenden Medium angeordnet
und für
fünf Tage
wachsen lassen, bevor sie zu einem serumfreien MCDB-153-Basenmedium Keratinozytenwachstumsmedium
(KGM) von Clonetics Corporation, San Diego, CA, enthaltend 0,15
mM Ca, oder Keratinozyten serumfreiem Medium (KSFM) von GIBCO, enthaltend 0,09
mM Ca) umgestellt wurden. Am Tag 7, als die Zellen 80-90% zusammengeflossen
waren, wurden sie trypsinisiert und für verschiedene Versuche in
serumfreiem Medium angeordnet.
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TRANSGLUTAMINASE-ASSAY
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Transglutaminase-Assay
und Keratinozyten-Differentiation
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Während
des Vorgangs der terminalen Differentiation in der Epidermis wird
eine 15 nm dicke Schicht Protein, bekannt als Hornhülle (CE),
auf der inneren Oberfläche
der Zellperipherie gebildet. Die CE ist aus zahlreichen verschiedenen
Proteinen zusammengesetzt, die miteinander durch die Bildung von
Nε-(γ-Glutamyl)lysinisodipeptidbindungen,
katalysiert durch die Wirkung von mindestens zwei verschiedenen
in der Epidermis exprimierten Transglutaminasen (TGasen), vernetzt
sind. Transglutaminase I (TGase I) wird im Überschuss in den differenzierten
Schichten der Epidermis, insbesondere der granulären Schicht, exprimiert und liegt
in der undifferenzierten Basalepidermis nicht vor. Somit ist TGase
I ein verwendbarer Marker von epidermaler Keratinozytendifferentiation
bei hohen TGase-I-Spiegeln, was einen differenzierteren Zustand
ausweist. Ein auf ELISA basierendes TGase-I-Assay unter Verwendung
eines TGase-I-Antikörpers
wurde zum Bewerten des Zustands der Differentiation von gezüchteten
Keratinozyten in den folgenden Beispielen verwendet.
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Für
Beispiel 1 wurde das nachstehende Verfahren verwendet:
Keratinozyten
(gezüchtet
wie vorstehend beschrieben) wurden in 96-Vertiefungs-Platten bei
einer Dichte von 3 000 Zellen pro Vertiefung in 200 μl Medien
plattiert. Nach Inkubation für
vier Tage wurden die Medien zu Medien, die Testverbindungen enthalten
(sechs Wiederholungen pro Test), geändert. Die Zellen wurden für weitere
72 Stunden gezüchtet,
wonach die Medien belüftet
wurden und die Platten bei –70°C gelagert
wurden. Die Platten wurden aus dem Gefrierschrank entfernt und die
Zellen mit PBS gewaschen. 100 μl
steriles Wasser wurden zugesetzt und die Zellen wurden gefriergebrochen
durch Gefrieren bei –70°C, dann Auftauen.
Die Zellen wurden eine Stunde bei Raumtemperatur (R/T) mit PBS/3%
BSA (Waschpuffer, Rinderserumalbumin) inkubiert, dann mit einer
frischen aliquoten Menge Waschpuffer gespült. Die Zellen wurden mit 50 μl von primärem Antikörper monoklonalen
Anti-Human-Transglutaminase-Maus-Antikörper (IgG), erhalten von Biomedical Industries,
verdünnt
1 : 2000 in Waschpuffer für
eine Stunde, 37°C,
dann zweimal mit Waschpuffer gespült, inkubiert. Die Zellen wurden
dann mit 50 μl
sekundärem
Antikörper
(Fab Fragment, Peroxidase, konjugiertem Anti-Maus-IgG, erhalten von
Amersham), verdünnt
1 : 4000 in Waschpuffer für
eine Stunde bei 37°C,
dann zweimal mit Waschpuffer gespült, inkubiert. Die Zellen wurden
mit Substratlösung
(4 mg o-Phenylendiamin und 3,3 μl
30%igem H2O2 in
10 ml 0,1 M Citratpuffer, pH 5,0) für fünf Minuten R/T in der Dunkelheit
(unter Aluminiumfolie) inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe
von 50 μl
4N H2SO4 gestoppt.
Die Absorption der Proben wurde bei 492 nm in einem Plattenleser
gelesen. Außer
den sechs Wiederholungen wurden vier mit beiden Antikörpern behandelt,
wobei zwei nur mit dem sekundären
Antikörper
(das heißt
zum Bestimmen des Hintergrundbindens des Enzymkonjugierten Ab) behandelt
wurden. Tease-Spiegel wurden durch Subtrahieren des Hintergrunds
von den Lesungen von jeder Behandlung und Bestimmen der mittleren ± Standardabweichung
für die
für beide
Antikörper
ausgedrückten
Wiederholungen bestimmt.
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Für
Beispiel 2 wurde das nachstehende Verfahren verwendet:
Keratinozyten
(gezüchtet
wie vorstehend beschrieben) wurden in 96-Vertiefungs-Platten bei
einer Dichte von 3 000 Zellen pro Vertiefung in 200 μl Zellkulturmedien
angeordnet. Nach Inkubation für
4 Tage wurden die Medien zu Medien, die Testverbindungen enthalten
(sechs Wiederholungen pro Test), geändert. Die Zellen wurden für weitere
72 Stunden gezüchtet,
wonach die Medien belüftet
wurden und die Platten bei –70°C gelagert wurden.
Anschließend
wurden die Platten aus dem Gefrierschrank entfernt, die Zellen wurden
weiter gefriergebrochen durch Gefrieren und Auftauen und dann 3x
mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden eine Stunde bei Raumtemperatur
(R/T) mit TBS/5% BSA Puffer inkubiert. Die Zellen wurden dann mit
100 : 1 monoklonalem Anti-Human-Transglutaminase-(IgG)-Maus-Antikörper (primärer Antikörper), erhalten
von Biomedical Technologies Inc., verdünnt 1 : 2000 in TBS/1% BSA
Puffer, für
zwei Stunden bei 37°C
inkubiert und dann sechsmal mit Waschpuffer (TBS/1% BSA/0,05% Tween-20)
gespült.
Die Zellen wurden dann mit 100 μl Fab-Fragment,
Peroxidase-konjugiertem Anti-Maus-IgG-Antikörper (sekundärer Antikörper) von
Amersham, verdünnt
1 : 4000 in Waschpuffer, für
zwei Stunden bei 37°C
inkubiert und dann dreimal mit Waschpuffer und dreimal mit PBS gespült. Die
Zellen wurden mit Substratlösung
(4 mg o-Phenylendiamin und 3,3 μl
30% H2O2 in 10 ml
0,1M Citratpuffer, pH 5,0) für
fünf Minuten
bei R/T und in der Dunkelheit (unter Aluminiumfolie) inkubiert.
Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 50 μl 4N H2SO4 gestoppt. Die Absorption der Proben wurde bei
492 nm in dem Plattenleser gelesen. Außerhalb der sechs Wiederholungen
wurden vier mit beiden Antikörpern
behandelt, wobei zwei nur mit dem sekundären Antikörper behandelt wurden (das
heißt,
um das Hintergrundbinden des Enzym-konjugierten Antikörpers zu
bestimmen). Transglutaminase-I-(TGase-I)-Spiegel wurden durch Subtrahieren
des Hintergrunds von den Lesungen von jeder Behandlung und Bestimmen
der mittleren ± Standardabweichung
für die
beiden Antikörper
exponierten Wiederholungen bestimmt.
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DNA-Assay
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Der Spiegel von TGase I, detektiert
nach Behandlung der Zellen, könnte
durch die Zellzahl beeinflusst werden; das heißt, je größer die Anzahl von Zellen,
umso größer ist
der detektierte TGase-I-Spiegel. Der TGase-I-Spiegel wurde auf DNA-Gehalt
der Zellen in der gleichen Vertiefung normalisiert, wodurch somit
die Variation aufgrund der Unterschiede in der Zellzahl beseitigt
wird. Die DNA-Zahlenangabe ist ein besonders verwendbarer Indikator
der Zellzahl, einschließlich
der Keratinozytenzellzahl, weil jede Zelle für alle Absichten und Zwecke
ein identisches Genom aufweist und deshalb eine gleiche Menge an
DNA. Der Gesamt-DNA-Gehalt einer Vertiefung von Zellen ist deshalb
direkt proportional der Zellzahl in der Vertiefung. Die Mengenangabe der
DNA wurde verwendet, um die Tease-Daten der Zellzahl zu normalisieren.
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Keratinozyten wurden in 96-Vertiefungs-Platten
bei einer Dichte von 3 000 Zellen pro Vertiefung in 200 μl Medien
plattiert. Nach Inkubation für
vier Tage wurden die Medien gegen Medien-enthaltende Testverbindungen
(6 Wiederholungen pro Test) gewechselt. Die Zellen wurden für weitere
72 Stunden gezüchtet,
wonach die Medien belüftet
wurden und die Platten für
mindestens 1,5 Stunden bei –70°C gelagert
wurden. Die Platten wurden aus dem Gefrierschrank entfernt und 30
Minuten aufgetaut. 100 μl/Vertiefung
Hoechst Farbstoff (1 μg/ml
Endkonzentration) wurden zugegeben und dies wurde 15 Minuten inkubiert,
bedeckt und dann in einem Fluorimeter (Ex. 360 nm und Em. 460 nm)
gelesen. Die Farbstofflösung
wurde entfernt und die Vertiefungen wurden mit PBS in der Zubereitung
für das
TGase-Assay gespült.
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Beispiel 1
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Retinsäure ist wirksamer als Retinol
beim Verändern
des Keratinozyten-Differentiationszustands
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Die Wirkung von Transglutaminasespiegeln,
normalisiert auf den DNA-Gehalt der Zellen, nach Zugabe von Retinsäure (RA)
und Retinol (ROH) wurde geprüft
und die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.
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Alle Konzentrationen von getesteter
Retinsäure;
das heißt
2 , 5 × 10–7 M,
2,5 × 10–8 M
und 2 , 5 × 10–9 M,
senkten die Keratinozytendifferentiation zu einem wesentlich größeren Ausmaß als jede
der entsprechenden 2,5 × 10–7 M,
2,5 × 10–8 M
und 2,5 × 10–9 M
Retinolbehandlung. Die Senkung des Transglutaminasespiegels war
für sowohl
Retinsäure
als auch Retinol dosisabhängig.
Dies stimmt mit der Retinsäure
mit einer größeren inhibitorischen
Wirkung auf epitheliale Differentiation als Retinol überein.
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Beispiel 2 synergistische
Inhibierung von Keratinocyten-Differentiation durch Oleanolsäure und
Retinol
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Die Wirkung auf Tgase I-Spiegel normalisiert
mit DNA-Gehalt der Zellen wurde in Reaktion auf eine Behandlung
mit den Testverbindungen von 72 Stunden geprüft. Die Ergebnisse werden in
Tabelle 2 gezeigt.
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Tabelle
2
Wirkung von Retinol und Oleanolsäure auf Keratinocyten – Tgase/DNA
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2,5*10–7M
Retinsäure
war sehr wirksam beim Herunterdrücken
der Keratinocyten-TGase I-Spiegel (auf 44% des Kontrollspiegels).
2,5*10–7M
Retinol war weniger wirksam als Retinsäure und 10–6M
Oleanolsäure
hatte nur eine gering inhibierende Wirkung auf den Keratinocyten-Tgase
I-Spiegel, wenn einzeln verwendet. Jedoch 2,5*10–7M
Retinol + 10–6M
Oleanolsäure
drückte
die Keratinocyten-TGase I auf 66% des Kontrollspiegels. Oleanolsäure und
Retinol wirken deshalb synergistisch zum Herunterdrücken von
Keratinocyten-Diffe rentiation in einer analogen Weise zu der Wirkung
von Retinsäure.
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In Beispielen 1 bis 2 wurde Retinsäure als
positive Kontrolle und Bezugsverbindung verwendet, gegen die die
anderen zu analysierenden Verbindungen verglichen wurden. Retinsäure senkte
in einer dosisabhängigen
Weise Transglutaminase I-Spiegel in Hautkeratinocyten. In anderen
Worten verminderte Retinsäure
die Keratinocyten-Differentiation. Retinol war signifikant weniger
wirksam als Retinsäure
beim Inhibieren von Keartinocyten-Differentiation.
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Das unerwartete Ergebnis dieser Untersuchung
war jedoch, dass die Wirkung von Retinol auf kultivierte Keratinocyten
auf Spiegel, die sich jenen von Retinsäure beim Kombinieren von Retinol
mit Oleanolsäure annäherten,
erhöht
werden kann. Diese Wirkung war nicht nur größer als die Wirkung von jeweils
Retinol oder Oleanolsäure
selbst, sondern die zwei Bestandteile wirkten in Synergie miteinander,
um eine Retinsäurereaktion
auf die Keratinocyten zu fördern.
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Beispiele 3 bis 8 erläutern erfindungsgemäße örtliche
Zusammensetzungen. Die Zusammensetzungen können in herkömmlicher
Weise verarbeitet werden. Sie sind zur kosmetischen Verwendung geeignet.
Insbesondere sind die Zusammensetzungen zur Auftragung auf faltige,
raue, trockene, schuppige, gealterte und/oder UV-geschädigte Haut
geeignet, um das Aussehen und das Anfühlen davon zu verbessern, sowie
zur Auftragung auf gesunde Haut, um die Verschlechterung davon zu
verhindern oder zu verzögern.
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Beispiel 3
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Dieses Beispiel erläutert eine
Wasser-in-Öl-Emulsion
mit einer hohen inneren Phase, in die die erfindungsgemäße Zusammensetzung
eingearbeitet ist.
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Beispiel 4
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Dieses Beispiel erläutert eine Öl-in-Wasser-Creme,
in die die erfindungsgemäße Zusammensetzung eingearbeitet
ist.
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Beispiel 5
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Dieses Beispiel erläutert eine
alkoholische Lotion, in die die erfindungsgemäße Zusammensetzung eingearbeitet
ist.
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Beispiel 6
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Dieses Beispiel erläutert eine
weitere, die erfindungsgemäße Zusammensetzung
enthaltende, alkoholische Lotion.
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Beispiel 7
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Dieses Beispiel erläutert eine
Sonnenschutzcreme, in die die erfindungsgemäße Zusammensetzung eingearbeitet
ist:
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Beispiel 8
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Dieses Beispiel erläutert eine
nicht wässrige
Hautpflegezusammensetzung, in die die erfindungsgemäße Kombination
eingearbeitet ist.
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