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Die
Erfindung betrifft stabile Hautpflegezusammensetzungen, die ein
Retinoid in einer ersten Kammer und ein Phytoöstrogen in einer zweiten Kammer
von einer Doppelkammerverpackung enthalten.
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Retinoide
(beispielsweise Retinol und Retinylester) sind übliche Bestandteile, die in
kosmetischen Produkten verwendet werden. Retinol (Vitamin A) ist
eine endogene Verbindung, die natürlicherweise im menschlichen
Körper
vorkommt und für
normale epitheliale Zelldifferenzierung essentiell ist. Natürliche und
synthetische Vitamin-A-Derivate wurden bei der Behandlung einer
Vielzahl von Hautstörungen
ausgedehnt verwendet, und wurden als Hautreparatur- und -erneuerungsmittel
verwendet. Retinsäure
wurde angewendet, um eine Vielzahl von Hautzuständen, beispielsweise Akne,
Falten, Psoriasis, Altersflecken und Entfärbung, zu behandeln. Siehe
beispielsweise Vahlquist, A. et al., J. Invest. Dermatol., Band
94, Holland D. B. und Cunliffe, W. J. (1990), Seiten 496–498; Ellis,
C. N. et al., "Pharmacology
of Retinols in Skin",
Vasel, Karger, Band 3, (1989), Seiten 249–252; PCT Patent-Anmeldung
Nr. WO 93/19743.
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Jedoch
kann der Retinoidmetabolismus die Umwandlung von dem Retinoid zu
nicht vorteilhaften Nebenprodukten ergeben, wodurch eine geringere
Menge an vorteilhafter Retinsäure
erhalten wird, um die Hautzustände
zu behandeln. Verschiedene Literaturstellen des Standes der Technik
lehren deshalb die Verwendung von einer Vielzahl von natürlichen
Wirkstoffen zum Unterstützen
bei der Behandlung von Hautzuständen, wie
Akne, Falten, Psoriasis, Altersflecken und Entfärbung. Beispielswei se wurden
Phytoöstrogene
(d.h. natürliche
Verbindungen, die Östrogen-artige
Wirksamkeit aufweisen und die in Pflanzen gefunden werden), zunehmend
für kosmetische
und therapeutische Zwecke verwendet. Östrogene und synthetische Verbindungen,
die wie Östrogene
wirken, sind dafür
bekannt, dass sie die Dicke der Dermalschicht erhöhen und
die Faltenbildung bei alternder Haut vermindern. Die Veränderungen
in der Haut, wie Hauttrockenheit, Verlust an Hautelastizität und Prallheit,
was nach der Menopause auftritt, wird dem Mangel an Östrogenproduktion
zugeschrieben. Östrogentherapie
verhindert oder verlangsamt viele von den Veränderungen, die mit der Hautalterung
verbunden sind (Creidi et al., "Effect
of a Conjugated Oestrogen Cream (Premarin®) on
Aging Facial Skin",
Maturitas, 19, Seiten 211–213,
1994).
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Verschiedene
Phytoöstrogene
wurden im Stand der Technik aufgrund von kosmetischen Vorteilen
offenbart. Beispielsweise lehrt US-Pat. Nr. 5 728 726 die Verwendung
von Genistein gegen die Thyrosinkinase-Inhibitorwirkung. US-Pat.
Nummern 5 847 003 und 5 834 513, die Avon übertragen wurden, offenbaren
die Verwendung von Oxasäuren
und Oxadisäuren,
in Kombination mit Retinoiden. Beide Avon-Patente offenbaren die
Verwendung von Antioxidationsmittel Bioflavonoiden, wie Genistein
und Daidzein, als wahlweise Bestandteile.
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EP 1 000 613 A2 offenbart,
dass eine Kombination von bestimmten Retinoiden und einer speziellen Klasse
von Pflanzenhormon, sichtbar den Effekten, die mit dem Altern der
Haut verbunden sind, entgegenwirken. Isoflavone werden als ein Beispiel
für ein
geeignetes Pflanzenhormon angeführt
und Daidzein oder Genistein werden als Beispiel für Isoflavone
angeführt.
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Es
wurde jedoch gefunden, dass Phytoöstrogene Oxidation von Retinol
einleiten und deshalb zum Abbau von Retinol beitragen. Obwohl Mehrkammersysteme
zum Abgeben von Zusammensetzungen im Stand der Technik beschrieben
wurden, wird nicht der Bedarf für
getrennte Phytoöstrogene
aus Retinoiden offenbart. Beispielsweise US-Pat. Nr. 5 914 116,
erteilt dem Anmelder der vorliegenden Erfindung. Insbesondere beschreibt
das Patent zwei getrennte Behälter
zum Abtrennen von zwei verschiedenen Hautwirkstoffen, um duale Hautvorteile
bereitzustellen, wobei eine Kammer Retinoide enthält und die
zweite Kammer einen zweiten Wirkstoff enthält, der einen zweiten und verschiedenen
Vorteil bereitstellt.
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Deshalb
gibt es noch einen Bedarf für
Zusammensetzungen, die Hautvorteile von Retinoiden mit den Retinoid-verstärkenden
Vorteilen von Phytoöstrogenen
bereitstellen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein stabiles Hautpflegeprodukt bereit,
enthaltend:
eine erste Zusammensetzung, umfassend 0,001% bis
10% von einem Retinoid, zur Bereitstellung eines ersten Vorteils;
eine
zweite Zusammensetzung, umfassend 0,001% bis 10% von einem Phytoöstrogen,
wobei das Phytoöstrogen
den ersten Vorteil verstärkt;
wobei das Phytoöstrogen
ausgewählt
ist aus Genistein, Daidzein, Glycitin, Biochanin A, Formononetin,
Equol und Gemischen davon;
eine erste Kammer zum Aufnehmen
der ersten Zusammensetzung; und
eine zweite Kammer zum Aufnehmen
der zweiten Zusammensetzung, wobei die ersten und zweiten Kammern miteinander
verbunden sind.
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Wie
hierin verwendet, bedeutet der Begriff "umfassend" einschließlich, sich zusammensetzen
aus, zusammengesetzt aus, bestehend und/oder bestehend im Wesentlichen
aus.
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Der
Begriff "Konditionieren", wie hierin verwendet,
bedeutet Verhinderung und Behandlung, ob kosmetisch oder andersartig,
von trockener Haut, Akne, lichtgeschädigter Haut, Auftreten von
Falten, Altersflecken, gealterter Haut, Erhöhen der Biegsamkeit des Stratum
corneum, Aufhellen von Hautfarbe, Bekämpfen von Sebumexkretion und
allgemeines Erhöhen
der Hautqualität.
Die Zusammensetzung kann verwendet werden, um Hautschuppung und
epidermale Differenzierung zu verbessern.
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Die
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
enthalten als einen bevorzugten Bestandteil ein Retinoid, das ausgewählt ist
aus Retinylestern, Retinol, Retinal und Retinsäure, vorzugsweise Retinol oder
Retinylester. Der Begriff "Retinol" schließt die nachstehenden
Isomeren von Retinol ein: all-trans-Retinol, 13-cis-Retinol,
11-cis-Retinol, 9-cis-Retinol, 3,4-Didehydro-retinol, 3,4-Didehydro-13-cis-retinol;
3,4-Didehydro-11-cis-retinol; 3,4-Didehydro-9-cis-retinol. Bevorzugte
Isomeren sind all-trans-Retinol, 13-cis-Retinol, 3,4-Didehydro-retinol,
9-cis-Retinol. Besonders bevorzugt ist all-trans-Retinol, aufgrund seiner breiten kommerziellen
Verfügbarkeit.
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Retinylester
ist ein Ester von Retinol. Der Begriff "Retinol" wurde vorstehend definiert. Retinylester,
die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind,
sind C1-C30-Ester
von Retinol, vorzugsweise C2-C20-Ester
und besonders bevorzugt C2-, C3-
und C16-Ester, aufgrund ihrer üblicheren
Verfügbarkeit.
Beispiele für
Retinylester schließen
ein, sind jedoch nicht darauf begrenzt: Palmitinsäureretinylester,
Ameisensäureretinylester,
Essigsäureretinylester,
Propionsäureretinylester,
Buttersäureretinylester,
Valeriansäureretinylester,
Isovaleriansäureretinylester,
Hexansäureretinylester,
Heptansäureretinylester,
Octansäureretinylester,
Nonansäureretinylester,
Decansäureretinylester,
Undecansäureretinylester,
Laurinsäureretinylester,
Tridecansäureretinylester,
Myristinsäureretinylester,
Pentadecansäureretinylester,
Heptadecansäureretinylester,
Stearinsäureretinylester,
Isostearinsäureretinylester,
Nonadecansäureretinylester,
Arachidonsäureretinylester,
Behensäureretinylester,
Linolsäureretinylester, Ölsäureretinylester.
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Der
bevorzugte Ester zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist
ausgewählt
aus Palmitinsäureretinylester,
Essigsäureretinylester
und Propionsäureretinylester,
weil diese die am meisten kommerziell verfügbaren und deshalb die kostengünstigsten
sind. Linolsäureretinylester
und Ölsäureretinylester
sind auch aufgrund ihrer Wirksamkeit bevorzugt.
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Retinol
oder Retinylester wird in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in einer
Menge von etwa 0,001% bis etwa 10%, vorzugsweise in einer Menge
von etwa 0,01% bis etwa 1%, besonders bevorzugt in einer Menge von
etwa 0,01% bis etwa 0,5%, angewendet.
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Phytoöstrogene
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Als
Teil der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden,
dass Phytoöstrogene
synergistisch die Hautvorteile von Retinoiden verbessern. Im Wesentlichen
erhöhen
Phytoöstrogene
die Empfindlichkeit der Haut auf Retinoide.
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Deshalb
enthält
die vorliegende Erfindung 0,001% bis 10% von mindestens einem Phytoöstrogen
in der zweiten Zusammensetzung.
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Die
erfindungsgemäßen Phytoöstrogene
sind Genistein, Daidzein, Glycitin, Biochanin A, Formononetin und
Equol und Gemische davon.
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Doppelkammerverpackung
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Zusammensetzungen,
die Retinoide einschließen,
sind im Allgemeinen instabil und können chemischem Abbau unterliegen.
Als einen weiteren Retinoid-erhöhenden
Vorteil sind Phytoöstrogene
eine wesentliche Komponente der vorliegenden Erfindung. Phytoöstrogene,
wie Genistein und Daidzein, treten synergistisch mit Retinoiden,
um Hautvorteile abzugeben, in Wechselwirkung. Jedoch tragen Phytoöstrogene
zu der Oxidation und somit zum Abbau von Retinoiden bei. Die Phytoöstrogen-induzierte
Retinoldestabilisierung vermindert dramatisch die Gesamtwirksamkeit
der verstärkten
Retinoidzusammensetzung, wenn beide Bestandteile in einer einzelnen
Formulierung enthalten sind. Um deshalb gegen Retinoidabbau zu schützen, wobei aber
dennoch die vorteilhaften synergistischen Effekte von Phytoöstrogenen
bereitgestellt werden, stellt die vorliegende Erfindung eine Doppelkammerverpackung
bereit, die eine erste Zusammensetzung enthält, die Retinoide in einer
ersten Kammer enthält,
und eine zweite Zusammensetzung, die mindestens ein Phytoöstrogen
in einer zweiten Kammer enthält.
Die erste Zusammensetzung stellt einen ersten Vorteil der Haut bereit, während die
zweite Zusammensetzung arbeitet, um die Wirkung von dem ersten Vorteil
zu verstärken
oder zu erhöhen.
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Die
Doppelkammerverpackung kann in unterschiedlicher Weise, die dem
gewöhnlichen
Fachmann bekannt sind, aufgebaut sein, solange der Zweck des Bereitstellens
der ersten und zweiten Zusammensetzungen in zwei getrennten Behältern erreicht
wird. In einer Ausführungsform
liegt die Doppelkammerverpackung in Form von zwei Gefäßen oder
Flaschen, die benachbart befestigt sind, vor. In einer zweiten Ausführungsform liegt
die Doppelkammerverpackung in der Form von einer einzelnen Flasche/eines
einzelnen Gefäßes mit
einer Einteilung, die das Innere von der Flasche/dem Gefäß in eine
erste und zweite Kammer teilt, vor. Andere Ausführungsformen werden als innerhalb
des Umfangs der vorliegenden Erfindung betrachtet, solange die Zusammensetzungen
getrennt gehalten werden.
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Kosmetisch verträglicher
Träger
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Das
erfindungsgemäße Produkt
umfasst auch einen kosmetisch verträglichen Träger, der als ein Verdünnungsmittel,
Dispersionsmittel oder Träger
für die
Wirkstoffkomponenten in einer oder beiden der ersten und zweiten
Zusammensetzungen wirkt, um deren Verteilung zu erleichtern, wenn
die Zusammensetzung auf die Haut aufgetragen wird.
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Träger, die
von Wasser verschieden sind oder zusätzlich dazu, können flüssige oder
feste Erweichungsmittel, Lösungsmittel,
Feuchthaltemittel, Verdickungsmittel und Pulver einschließen. Ein
besonders bevorzugter nichtwässriger
Träger
ist ein Polydimethylsiloxan und/oder ein Polydimethylphenylsiloxan.
Die erfindungsgemäßen Silikone
können
jene mit Viskositäten
im Bereich irgendwo von etwa 10 bis 10 000 000 Centistokes bei 25°C sein. Besonders
erwünscht
sind Gemische von Silikonen mit niederer und hoher Viskosität. Diese
Silikone sind von der General Electric Company unter den Handelsmarken
Vicasil, SE und SF, und von der Dow Corning Company unter den 200er-
und 550er-Reihen erhältlich.
Silikonmengen, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen angewendet
werden können,
liegen im Bereich irgendwo von 5 bis 95%, vorzugsweise 25 bis 90
Gewichtsprozent der Zusammensetzung.
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Wahlweise Hautvorteilsmaterialien
und kosmetische Hilfsstoffe
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In
entweder einer oder beiden von den ersten und zweiten Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung kann ein Öl- oder öliges Material vorliegen, zusammen
mit einem Emulgator, um entweder eine Wasser-in-Öl-Emulsion oder eine Öl-in-Wasser-Emulsion in Abhängigkeit
von der Stärke
auf den mittleren hydrophilen-lipophilen Ausgleich (HLB) des angewendeten
Emulgators bereitzustellen.
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Verschiedene
Arten von Wirkbestandteilen können
in entweder einer oder beiden von den ersten und zweiten kosmetischen
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung vorliegen und werden
nachstehend beschrieben. Wirkstoffe werden als Haut- oder Haarvorteilsmittel,
anders als Erweichungsmittel und anders als Bestandteile, die nur
die physikalischen Eigenschaften der Zusammensetzung verbessern,
definiert. Obwohl nicht auf diese Kategorie begrenzt, schließen allgemeine
Beispiele Sonnenschutzmittel, Haut aufhellende Mittel, Bräunungsmittel
ein.
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Sonnenschutzmittel
schließen
jene Materialien ein, die üblicherweise
zum Blockieren von Ultraviolettlicht angewendet werden, ein. Erläuternde
Verbindungen sind die Derivate von PABA, Cinnamat und Salicylat. Beispielsweise
kann Methoxyzimtsäureoctylester
und 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon (auch bekannt als Oxybenzone)
verwendet werden. Methoxyzimtsäureoctylester
und 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon sind unter den Handelsmarken
Parsol MCX bzw. Benzophenone-3 kommerziell erhältlich.
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Die
exakte Menge an in den Emulsionen angewendetem Sonnenschutzmittel
kann von dem Schutzgrad, der vor der UV-Sonnenstrahlung erwünscht ist, abhängen.
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Ein
weiterer bevorzugter wahlweiser Bestandteil ist ausgewählt aus
essentiellen Fettsäuren
(EFAs), d.h. jene Fettsäuren,
die für
die Plasmamembranbildung von allen Zellen essentiell sind. In Keratinozyten macht
EFA-Mangel die Zellen hyperproliferativ. Ergänzung von EFA korrigiert dies.
EFAs verstärken
auch die Lipidbiosynthese der Epidermis und stellt Lipide für die Sperrbildung
der Epidermis bereit. Die essentiellen Fettsäuren sind vorzugsweise ausgewählt aus
Linolsäure, γ-Linolensäure, Homo-γ-linolensäure, Columbinsäure, Eicosa-(n-6,9,13)-triensäure, Arachidonsäure, γ-Linolensäure, Timnodonsäure, Hexaensäure und
Gemischen davon.
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Erweichungsmittel
sind häufig
in die erfindungsgemäßen kosmetischen
Zusammensetzungen eingearbeitet. Anteile von solchen Erweichungsmitteln
können
im Bereich von etwa 0,5% bis etwa 50%, vorzugsweise zwischen etwa
5% und 30 Gewichtsprozent der Gesamtzusammensetzung, liegen. Erweichungsmittel können unter
solche allgemeinen chemischen Kategorien, wie Ester, Fettsäuren und
Alkohole, Polyole und Kohlenwasserstoffe, eingeteilt werden.
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Ester
können
Mono- oder Diester sein. Annehmbare Beispiele für Fettsäurediester schließen Adipinsäuredibutylester,
Sebacinsäurediethylester,
Dimersäurediisopropylester
und Bernsteinsäuredioctylester
ein. Annehmbare verzweigtkettige Fettsäureester schließen Myristinsäure-2-ethylhexylester,
Stearinsäureisopropylester
und Palmitinsäureisostearylester
ein. Annehmbare dreibasige Säureester
schließen
Trilinolensäuretriisopropylester
und Zitronensäuretrilaurylester
ein. Annehmbare geradkettige Fettsäureester schließen Palmitinsäurelaurylester,
Milchsäuremyristylester,
Erucasäureoleylester
und Ölsäurestearylester
ein. Bevorzugte Ester schließen
Coco-caprylat/Caprat (ein Gemisch von Coco-caprylat und Coco-caprat), Propylenglycolmyristyletheracetat,
Adipinsäurediisopropylester
und Octansäurecetylester
ein.
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Geeignete
Fettalkohole und Säuren
schließen
jene Verbindungen mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen ein. Besonders
bevorzugt sind solche Verbindungen, wie Cetyl-, Myristyl-, Palmitin-
und Stearylalkohole und -säuren.
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Unter
den Polyolen, die als Erweichungsmittel dienen können, sind lineare und verzweigtkettige
Alkylpolyhydroxylverbindungen. Beispielsweise sind Propylenglycol,
Sorbit und Glycerin bevorzugt. Auch verwendbar sein können polymere
Polyole, wie Polypropylenglycol und Polyethylenglycol. Butylen- und Propylenglycol sind
auch als Eindringverstärker
besonders bevorzugt.
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Beispielhafte
Kohlenwasserstoffe, die als Erweichungsmittel dienen können, sind
jene mit Kohlenwasserstoffketten irgendwo von 12 bis 30 Kohlenstoffatomen.
Spezielle Beispiele schließen
Mineralöl,
weißes
Vaseline, Squalen und Isoparaffine ein.
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Eine
weitere Kategorie von funktionellen Bestandteilen innerhalb der
erfindungsgemäßen kosmetischen
Zusammensetzungen sind Verdickungsmittel. Ein Verdickungsmittel
wird gewöhnlich
in Mengen irgendwo von 0,1 bis 20 Gewichtsprozent, vorzugsweise
etwa 0,5% bis 10 Gewichtsprozent, der Zusammensetzung vorliegen.
Beispielhafte Verdickungsmittel sind vernetzte Polyacrylatmaterialien,
die unter der Handelsmarke Carbopol von der B. F. Goodrich Company
erhältlich
sind. Gummen können
angewendet werden, wie Xanthan-, Carrageenan-, Gelatine-, Karaya-,
Pektin- und Johannisbrotbaumgummi. Unter bestimmten Umständen kann
die verdickende Funktion von einem Material, das auch als ein Silikon
oder Erweichungsmittel dient, begleitet werden. Beispielsweise haben
Silikongummen oberhalb 10 Centistokes und Ester, wie Stearinsäureglycerinester,
duale Funktionalität.
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Pulver
können
in eine oder beide von den ersten und zweiten kosmetischen Zusammensetzungen
des erfindungsgemäßen kosmetischen
Produkts eingearbeitet werden. Diese Pulver schließen Kreide,
Talkum, Fuller's
Erde, Kaolin, Stärke,
Smectittone, chemisch modifiziertes Magnesiumaluminiumsilikat, organisch
modifizierten Montmorillonitton, hydratisiertes Aluminiumsilikat,
gebranntes Siliziumdioxid, Aluminiumstärkeoctenylsuccinat und Gemische
davon ein.
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Andere
geringfügige
Hilfskomponenten können
auch in eine oder beide von den ersten und zweiten Zusammensetzungen
des erfindungsgemäßen kosmetischen
Produkts eingearbeitet sein. Diese Bestandteile können färbende Mittel,
Opazitätsmittel
und Parfüms
einschließen.
Mengen von diesen Materialien können
im Bereich irgendwo von 0,001% bis zu 20 Gewichtsprozent der Zusammensetzung
liegen.
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Die
ersten und zweiten Zusammensetzungen des erfindungsgemäßen kosmetischen
Produkts sind hauptsächlich
als ein Produkt zur örtlichen
Auftragung auf menschliche Haut, insbesondere als ein Mittel zum Konditionieren
und Glätten
der Haut, und Verhindern oder Vermindern des Auftretens von faltiger
oder gealterter Haut, beabsichtigt.
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Bei
der Verwendung wird eine kleine Menge der ersten Zusammensetzung,
beispielsweise 1 bis 5 ml, auf exponierte Flächen der Haut aus einem geeigneten
Behälter
oder Applikator aufgetragen und, falls erforderlich, wird sie dann über die
Haut verbreitet und/oder in sie eingerieben, unter Verwendung von
Hand oder Fingern oder einer geeigneten Vorrichtung. Gleichzeitig
wird eine kleine Menge der zweiten Zusammensetzung, beispielsweise
1 bis 5 ml, auf exponierte Flächen
der Haut aus einem geeigneten Behälter oder Applikator aufgetragen
und, falls erforderlich, auch über
die Haut verbreitet und/oder in sie, unter Verwendung der Hand oder
Finger oder einer geeigneten Vorrichtung, eingerieben. Deshalb können in
Abhängigkeit
von der Intensität
der erwünschten
Behandlungsvorteile die ersten und zweiten Zusammensetzungen einzeln,
gleichzeitig oder in aufeinander folgender Weise verwendet werden.
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Produktform und Verpackung
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Die
erfindungsgemäße örtliche
Hautbehandlungszusammensetzung kann als eine Lotion, eine fluide Creme,
eine Creme oder ein Gel formuliert werden.
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BEISPIEL 1
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Synergie von Retinoiden
und Phytoöstrogenen:
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(a) Zellkulturverfahren:
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Humane
Erwachsenen-Fibroblasten, die von einem sonnengeschützten Innenarm
eines 25–30
Jahre alten weiblichen Probanden erhalten wurden, wurden darin verwendet.
Die Zellen wurden in 1:1 DMEM/Hams F12 Medien, enthaltend 10% FBS,
wachsen lassen, bei 37°C
in einer 5%igen CO2-Atmosphäre, unter
normalem Atmosphärensauerstoffpartialdruck,
gehalten. Der dritte Durchgang von erwachsenen Fibroblasten wurde in
DMEM-Medien mit
10%igem FBS in 12-Vertiefungs-Platten, bei einer Beimpfungsdichte
von 2500 Zellen/ml/Vertiefung, wachsen lassen. Die Zellen bei 80%
Zusammenfluss wurden in serumfreien und phenolrotfreien (PRF) DMEM-Medien
zweimal gespült.
Vorbehandlung mit Phytoverbindungen für 4 Stunden wurde durchgeführt und
dann mit Retinoiden dosiert und wurde 48 Stunden inkubiert. Nach
der Inkubation wurden die Vertiefungen zweimal mit 1 × PBS gewaschen
und die Zellmonoschicht wurde in 100 μl Zelllysepuffer (enthält 1 × PBS, 1%
Triton X, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS, enthaltend Proteaseinhibitor
(10 mg/ml PMSF in Isopropanol, 10 μl/ml)) geerntet. Die Suspension
wurde bei 14000 U/min für
10 Minuten zentrifugiert, der Überstand
gesammelt und eine aliquote Menge dieses Überstands wurde für die Proteinquantifizierung verwendet.
Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des Pierce-Proteinkits
bestimmt. Der Rest von 100 μl Überstand
(Zelllysat) wurde in einem Gemisch von 40 μl Probenpuffer (NOVEX) und 0,5% β-Mercaptoethanol (BME)
und durch Sieden der Probe für
5 Minuten denaturiert. Gleiche Menge an Protein wurde dann auf 16%ige Tris-Glycin-Gele
zur Proteinanalyse durch SDS-Page und Western-Immuno-Blotting für CRABP-2-Proteinexpression
gegeben.
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(b) Nachweise von zellulärem Retinsäure-Bindungsprotein
2 (CRABP-2)
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Innerhalb
der Zellen werden Retinol und Retinsäure an spezifische zelluläre Bindungsproteine
gebunden, 2 von den Hauptproteinen sind CRABP-1 und -2 (Roos et
al., Pharmacological Reviews: 50, 315–333, 1998). Diese Proteine
wirken beim Regulieren der intrazellulären Konzentration von Retinoiden
durch das Wirken von sowohl Lagerungs- oder Transportproteinen in
dem Retinoidmetabolismus. Hohe oder niedrige Spiegel an Retinoiden
verursachen Zellschädigung,
einschließlich
Zelltod, und deshalb sind Regulierung von konstanten Spiegel an
Retinoiden und ihren Bindungsproteinen für das Zellüberleben sehr kritisch. Die
Spiegel an diesem Protein werden durch die Menge an Retinsäure innerhalb
der Zellen reguliert. Höhere
zelluläre
Spiegel von Retinoiden erhöhen
die Expression von CRABP-2. Deshalb ist die Menge von diesem Protein
in den Zellen ein Maß für die Retinoidwirkung
der Zellen. Hautzellen enthalten hohe Spiegel an CRABP-2, sowohl
in der Epidermis als auch der Dermis. CRABP-2-Reaktion auf Retinoidverabreichung
in Fibroblasten in vitro wird als ein reproduzierbares Maß von Retinoidbiowirkung
verwendet, das die humanen Hautreaktionen voraussagt. (Elder et
al., J. Invest. Dermatol., 106: 517–521, 1996). Die Erhöhung in
CRABP-2 ist auch mit erhöhter
epidermaler Differenzierung und dermaler Retinoidwirkung verbunden.
Deshalb haben wir in diesen Studien CRABP-2-Expression von Fibroblasten
als ein Maß von
Retinoidwirksamkeit verwendet, was zu einer erhöhten Epidermaldifferenzierung
(Hautkonditionierung und trockener Hautvorteil) und dermaler Collagen-
und extrazellulärer
Matrixsynthese (Antialterung, Antifaltenvorteile) führt.
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Um
die Spiegel an CRABP-2 in den Fibroblasten zu messen, wurde die
gleiche Menge von Protein vom Zellüberstand auf Nitrozelluloseblots
in einer Dot-Blotapparatur, wie nach den Anweisungen des Herstellers,
beladen und Immunoanfärben
wurde unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern zu CRABP-2 gemäß Standardverfahren
ausgeführt.
Die CRABP-2-Proteinbande wurde in den Dot-Blots, unter Verwendung des
Chemilumineszenzsystems, das von Santa Cruz Biotechnology (SantaCruz,
Kalif.) erhalten wurde, visualisiert. Die Banden in dem Film wurden
durch Densitometriescanning quantifiziert, wobei von den Dreifachproben
als % Kontrolle die Daten berechnet wurden und in den nachstehenden
Tabellen als % Erhöhung
gegenüber
der Kontrolle (mit Kontrolle als 100%) ± Standardabweichung dreifach
ausgedrückt
werden.
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BEISPIEL 2
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Die Stabilität von Retinol
in Gegenwart von phytoöstrogenen
Flavonoiden:
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Retinol
wurde in einer 10%igen Lösung
in wässrigem
Ethanol (1:1 Wasser:Ethanol) gelöst.
Diese Lösung
wurde auf 0,001% (ungefähr
30 μM) verdünnt. Diese
Lösung
ergab eine OD von etwa 0,35 Absorptionseinheit bei 360 nm in einem
96-Vertiefungs-Platten-Spektrophotometer.
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Wässrige ethanolische
Stammlösungen
von dem Genistein, Daidzein, wurden als 0,1%, 0,01% oder 0,001%
hergestellt. Zu 200 μl
von 0,001% Retinollösung
in einer 96-Vertiefungs-Platte
wurden 20 μl
des Flavonoids (d.h. 1–10
Verdünnung)
gegeben, was eine Flavonoidendkonzentration von 0,01, 0,001 und
0,0001% ergibt. Die Platten wurden vermischt und das Anfangs-OD-Ablesen wurde
bei 360 nm genommen. Die Platten wurden bei Raumtemperatur im Dunkeln
für bis
zu 2 Tage inkubiert und anschließende Ablesungen wurden bei
8, 24 und 48 Stunden genommen. Die OD-Ablesungen zu diesen Zeitpunkten
wurden zu der Zeitpunkt-0-Ablesung normalisiert. Die Retinolstabilität wurde
als % Retinol (OD-Ablesung) zur Zeit 0 ausgedrückt. Die Daten werden in den
nachstehenden Tabellen gezeigt.
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In
den nachstehend gezeigten 2 Tabellen wurde Synergie zwischen Genistein
und Daidzein und Retinoiden getestet. In beiden Studien wurde Genistein
an die Zellen in einer löslichen
Form in DMSO:Ethanol abgegeben. 1 μM Genistein allein stimulierte
CRABP-2 signifikant. Sowohl Genistein als auch Daidzein stimulieren
die Retinoidwirksamkeit in einer synergistischen Weise. Alle von
den getesteten Retinoiden, mit Ausnahme von Essigsäureretinylester,
zeigten Synergie mit Genistein und Daidzein. Diese Daten stützen unsere
Behauptung, dass die phytoöstrogenen
Flavonoide Genistein und Daidzein, wenn zu Zellen in einer löslichen
Form hinzugefügt,
synergistisch die Wirksamkeit von Retinoiden verstärken.
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TABELLE
1 Synergie
zwischen Genistein und Retinoiden
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TABELLE
2 Synergie
zwischen Daidzein und Retinoiden
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Die
nachstehenden Tabellen zeigen die Wirkung von Genistein und Daidzein
auf das Destabilisieren von Retinol. Der Versuch wurde, wie in dem
Abschnitt Verfahren beschrieben, ausgeführt. Die OD-Ablesungen von
zweifachen Messungen wurden gemittelt und werden hier angegeben.
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TABELLE
3 Retinolstabilität in Gegenwart
von Genistein:
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TABELLE
4 Retinolstabilität in Gegenwart
von Daidzein
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Retinol
allein, in Abwesenheit von beliebigen Mitteln, baute langsam ab
(8% nach 8 Stunden, 14% nach 24 Stunden und 19% nach 48 Stunden).
Jedoch wurde in Gegenwart von Genistein und Daidzein der Abbau von
Retinol beschleunigt. Schon nach 8 Stunden wurden 16–18% Retinol
in Gegenwart von diesen Flavonoiden abgebaut. Dies lässt vermuten,
dass sowohl Genistein als auch Daidzein starke Erhöhungen in
der Instabilität
von Retinol verursachen. Dies erfordert die Anwendung einer speziellen
Verpackung, wobei in den Produkten, die Retinoide und die Flavonoide
enthalten, die eine Kammer für
Retinol und eine weitere für
die Flavonoide vorgesehen sind.
