RU2756403C2 - Анализ относительной активности вирусного вектора, кодирующего изомерогидролазы - Google Patents
Анализ относительной активности вирусного вектора, кодирующего изомерогидролазы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2756403C2 RU2756403C2 RU2018141675A RU2018141675A RU2756403C2 RU 2756403 C2 RU2756403 C2 RU 2756403C2 RU 2018141675 A RU2018141675 A RU 2018141675A RU 2018141675 A RU2018141675 A RU 2018141675A RU 2756403 C2 RU2756403 C2 RU 2756403C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- paragraphs
- cells
- aav
- retinol
- Prior art date
Links
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 52
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title abstract description 64
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 title abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 109
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 149
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 79
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 claims description 74
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 11-cis-Retinol Chemical compound OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 71
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 70
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 69
- 239000011717 all-trans-retinol Substances 0.000 claims description 37
- 235000019169 all-trans-retinol Nutrition 0.000 claims description 37
- 229940100609 all-trans-retinol Drugs 0.000 claims description 37
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 31
- FPIPGXGPPPQFEQ-HPNHMNAASA-N 11-cis-retinol Natural products OCC=C(C)C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-HPNHMNAASA-N 0.000 claims description 30
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 claims description 29
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 28
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 102100028001 Retinaldehyde-binding protein 1 Human genes 0.000 claims description 23
- 101710101931 Retinaldehyde-binding protein 1 Proteins 0.000 claims description 23
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 20
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 20
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 20
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 19
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 17
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 17
- 210000003583 retinal pigment epithelium Anatomy 0.000 claims description 16
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 13
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 claims description 9
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 9
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 claims description 8
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 claims description 8
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 claims description 8
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 claims description 8
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 claims description 8
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 claims description 8
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 claims description 8
- 241000649045 Adeno-associated virus 10 Species 0.000 claims description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 8
- 101710122462 65 kDa protein Proteins 0.000 claims description 7
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 claims description 6
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 claims description 6
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 claims description 6
- GREHPZMOJNYZIO-QXBAZQDESA-N retinoyl coa Chemical compound C([C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O1)N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1)OP(O)(O)=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C GREHPZMOJNYZIO-QXBAZQDESA-N 0.000 claims description 6
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 claims description 4
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N Carbamic acid Chemical group NC(O)=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 4
- WWDMJSSVVPXVSV-YCNIQYBTSA-N retinyl ester Chemical compound CC1CCCC(C)(C)C1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C(O)=O WWDMJSSVVPXVSV-YCNIQYBTSA-N 0.000 claims description 4
- 238000000527 sonication Methods 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- FPIPGXGPPPQFEQ-HWCYFHEPSA-N 13-cis-retinol Chemical compound OC/C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-HWCYFHEPSA-N 0.000 claims description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-MKOSUFFBSA-N 9-cis-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-MKOSUFFBSA-N 0.000 claims description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-DPZDGVIMSA-N dihydroretinol Natural products CC(=CCO)C=CC=C(C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-DPZDGVIMSA-N 0.000 claims description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 2
- DRNXZGJGRSUXHW-UHFFFAOYSA-N silyl carbamate Chemical group NC(=O)O[SiH3] DRNXZGJGRSUXHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 94
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 73
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 66
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 48
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 36
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 31
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 31
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 31
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 31
- 230000006870 function Effects 0.000 description 25
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 235000010354 butylated hydroxytoluene Nutrition 0.000 description 23
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 239000004322 Butylated hydroxytoluene Substances 0.000 description 21
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 19
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 18
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 15
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 15
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 15
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 14
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 14
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 13
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 12
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- -1 rRNA Proteins 0.000 description 11
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 11
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 11
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 10
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 8
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 8
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 8
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 8
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 8
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 7
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 6
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 5
- 239000012537 formulation buffer Substances 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 5
- 108010054126 retinoid isomerohydrolase Proteins 0.000 description 5
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 5
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 5
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 5
- 241000649046 Adeno-associated virus 11 Species 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100031176 Retinoid isomerohydrolase Human genes 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 4
- 229940095259 butylated hydroxytoluene Drugs 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 4
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 4
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 3
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 3
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 3
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 102100029455 RING finger protein unkempt homolog Human genes 0.000 description 3
- 238000010811 Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 3
- 238000000668 atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 3
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 3
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 11-cis-retinal Chemical compound O=C/C=C(\C)/C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 0.000 description 2
- OEVCHROQUIVQFZ-YTLHQDLWSA-N Ala-Thr-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OEVCHROQUIVQFZ-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AITKTFCQOBRJTG-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N AITKTFCQOBRJTG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N N-L-cysteinyl-L-phenylalanine Natural products SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004330 Rhodopsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000820 Rhodopsin Proteins 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 2
- HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N bis-tris propane Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCNC(CO)(CO)CO HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004807 desolvation Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- YQXYQOXRCNEATG-ZAYJLJTISA-N (2s,3s,6r)-3-[[(3r)-3-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoyl]amino]-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,6-dihydro-2h-pyran-2-carboxylic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.O1[C@H](C(O)=O)[C@@H](NC(=O)C[C@H](N)CCN(C)C(N)=N)C=C[C@@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 YQXYQOXRCNEATG-ZAYJLJTISA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- KDZIGQIDPXKMBA-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[2-[(2-amino-3-methylbutanoyl)amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NCC(=O)NC(CO)C(=O)NC(C(O)=O)CCC(O)=O KDZIGQIDPXKMBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024878 Adenovirus E1A Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010087905 Adenovirus E1B Proteins Proteins 0.000 description 1
- XQJAFSDFQZPYCU-UWJYBYFXSA-N Ala-Asn-Tyr Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N XQJAFSDFQZPYCU-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- LSLIRHLIUDVNBN-CIUDSAMLSA-N Ala-Asp-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN LSLIRHLIUDVNBN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- UQJUGHFKNKGHFQ-VZFHVOOUSA-N Ala-Cys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O UQJUGHFKNKGHFQ-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- OMMDTNGURYRDAC-NRPADANISA-N Ala-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OMMDTNGURYRDAC-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- RGDKRCPIFODMHK-HJWJTTGWSA-N Ala-Leu-Leu-His Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 RGDKRCPIFODMHK-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N Ala-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- GNYUVVJYGJFKHN-RVMXOQNASA-N Arg-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N GNYUVVJYGJFKHN-RVMXOQNASA-N 0.000 description 1
- LLUGJARLJCGLAR-CYDGBPFRSA-N Arg-Ile-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N LLUGJARLJCGLAR-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- KZXPVYVSHUJCEO-ULQDDVLXSA-N Arg-Phe-Lys Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KZXPVYVSHUJCEO-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- INOIAEUXVVNJKA-XGEHTFHBSA-N Arg-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O INOIAEUXVVNJKA-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- PFOYSEIHFVKHNF-FXQIFTODSA-N Asn-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PFOYSEIHFVKHNF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- SLKLLQWZQHXYSV-CIUDSAMLSA-N Asn-Ala-Lys Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O SLKLLQWZQHXYSV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- APHUDFFMXFYRKP-CIUDSAMLSA-N Asn-Asn-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N APHUDFFMXFYRKP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- GFFRWIJAFFMQGM-NUMRIWBASA-N Asn-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GFFRWIJAFFMQGM-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- JQSWHKKUZMTOIH-QWRGUYRKSA-N Asn-Gly-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N JQSWHKKUZMTOIH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- SPCONPVIDFMDJI-QSFUFRPTSA-N Asn-Ile-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SPCONPVIDFMDJI-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- JEEFEQCRXKPQHC-KKUMJFAQSA-N Asn-Leu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JEEFEQCRXKPQHC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- YXVAESUIQFDBHN-SRVKXCTJSA-N Asn-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXVAESUIQFDBHN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- UXHYOWXTJLBEPG-GSSVUCPTSA-N Asn-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O UXHYOWXTJLBEPG-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 1
- DPSUVAPLRQDWAO-YDHLFZDLSA-N Asn-Tyr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N DPSUVAPLRQDWAO-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- PBVLJOIPOGUQQP-CIUDSAMLSA-N Asp-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PBVLJOIPOGUQQP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IXIWEFWRKIUMQX-DCAQKATOSA-N Asp-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O IXIWEFWRKIUMQX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HAFCJCDJGIOYPW-WDSKDSINSA-N Asp-Gly-Gln Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HAFCJCDJGIOYPW-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- SVABRQFIHCSNCI-FOHZUACHSA-N Asp-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SVABRQFIHCSNCI-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- UMHUHHJMEXNSIV-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O UMHUHHJMEXNSIV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LIVXPXUVXFRWNY-CIUDSAMLSA-N Asp-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O LIVXPXUVXFRWNY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VSMYBNPOHYAXSD-GUBZILKMSA-N Asp-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VSMYBNPOHYAXSD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- MVRGBQGZSDJBSM-GMOBBJLQSA-N Asp-Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CC(=O)O)N MVRGBQGZSDJBSM-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- JJQGZGOEDSSHTE-FOHZUACHSA-N Asp-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O JJQGZGOEDSSHTE-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- ALMIMUZAWTUNIO-BZSNNMDCSA-N Asp-Tyr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ALMIMUZAWTUNIO-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 239000007989 BIS-Tris Propane buffer Substances 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- ZOLXQKZHYOHHMD-DLOVCJGASA-N Cys-Ala-Phe Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N ZOLXQKZHYOHHMD-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- SKSJPIBFNFPTJB-NKWVEPMBSA-N Cys-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CS)N)C(=O)O SKSJPIBFNFPTJB-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- RJPKQCFHEPPTGL-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RJPKQCFHEPPTGL-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- PXEGEYISOXISDV-XIRDDKMYSA-N Cys-Trp-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CS)=CNC2=C1 PXEGEYISOXISDV-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- 102000003844 DNA helicases Human genes 0.000 description 1
- 108090000133 DNA helicases Proteins 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- NUMFTVCBONFQIQ-DRZSPHRISA-N Gln-Ala-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O NUMFTVCBONFQIQ-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- VOLVNCMGXWDDQY-LPEHRKFASA-N Gln-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)C(=O)O VOLVNCMGXWDDQY-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- KHGGWBRVRPHFMH-PEFMBERDSA-N Gln-Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N KHGGWBRVRPHFMH-PEFMBERDSA-N 0.000 description 1
- XZLLTYBONVKGLO-SDDRHHMPSA-N Gln-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)C(=O)O XZLLTYBONVKGLO-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- OZEQPCDLCDRCGY-SOUVJXGZSA-N Gln-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)C(=O)O OZEQPCDLCDRCGY-SOUVJXGZSA-N 0.000 description 1
- HMIXCETWRYDVMO-GUBZILKMSA-N Gln-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HMIXCETWRYDVMO-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BBFCMGBMYIAGRS-AUTRQRHGSA-N Gln-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BBFCMGBMYIAGRS-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- JPHYJQHPILOKHC-ACZMJKKPSA-N Glu-Asp-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O JPHYJQHPILOKHC-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- CXRWMMRLEMVSEH-PEFMBERDSA-N Glu-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CXRWMMRLEMVSEH-PEFMBERDSA-N 0.000 description 1
- CBWKURKPYSLMJV-SOUVJXGZSA-N Glu-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O CBWKURKPYSLMJV-SOUVJXGZSA-N 0.000 description 1
- DXVOKNVIKORTHQ-GUBZILKMSA-N Glu-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DXVOKNVIKORTHQ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JVYNYWXHZWVJEF-NUMRIWBASA-N Glu-Thr-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O JVYNYWXHZWVJEF-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- RGJKYNUINKGPJN-RWRJDSDZSA-N Glu-Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N RGJKYNUINKGPJN-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 1
- DLISPGXMKZTWQG-IFFSRLJSSA-N Glu-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DLISPGXMKZTWQG-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- DJTXYXZNNDDEOU-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN)C(=O)N DJTXYXZNNDDEOU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- INLIXXRWNUKVCF-JTQLQIEISA-N Gly-Gly-Tyr Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 INLIXXRWNUKVCF-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- ALOBJFDJTMQQPW-ONGXEEELSA-N Gly-His-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)CN ALOBJFDJTMQQPW-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N Gly-Leu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- LHYJCVCQPWRMKZ-WEDXCCLWSA-N Gly-Leu-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LHYJCVCQPWRMKZ-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- WZSHYFGOLPXPLL-RYUDHWBXSA-N Gly-Phe-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WZSHYFGOLPXPLL-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- JYPCXBJRLBHWME-IUCAKERBSA-N Gly-Pro-Arg Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JYPCXBJRLBHWME-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- SYOJVRNQCXYEOV-XVKPBYJWSA-N Gly-Val-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SYOJVRNQCXYEOV-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- KSOBNUBCYHGUKH-UWVGGRQHSA-N Gly-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CN KSOBNUBCYHGUKH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- VJJSDSNFXCWCEJ-DJFWLOJKSA-N His-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VJJSDSNFXCWCEJ-DJFWLOJKSA-N 0.000 description 1
- ZSKJIISDJXJQPV-BZSNNMDCSA-N His-Leu-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 ZSKJIISDJXJQPV-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- ZVKDCQVQTGYBQT-LSJOCFKGSA-N His-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZVKDCQVQTGYBQT-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- XIGFLVCAVQQGNS-IHRRRGAJSA-N His-Pro-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 XIGFLVCAVQQGNS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- IAYPZSHNZQHQNO-KKUMJFAQSA-N His-Ser-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N IAYPZSHNZQHQNO-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- GBMSSORHVHAYLU-QTKMDUPCSA-N His-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O GBMSSORHVHAYLU-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000729271 Homo sapiens Retinoid isomerohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- HERITAGIPLEJMT-GVARAGBVSA-N Ile-Ala-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 HERITAGIPLEJMT-GVARAGBVSA-N 0.000 description 1
- BEWFWZRGBDVXRP-PEFMBERDSA-N Ile-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BEWFWZRGBDVXRP-PEFMBERDSA-N 0.000 description 1
- NUKXXNFEUZGPRO-BJDJZHNGSA-N Ile-Leu-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N NUKXXNFEUZGPRO-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- XQLGNKLSPYCRMZ-HJWJTTGWSA-N Ile-Phe-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N XQLGNKLSPYCRMZ-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- FQYQMFCIJNWDQZ-CYDGBPFRSA-N Ile-Pro-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 FQYQMFCIJNWDQZ-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- MLSUZXHSNRBDCI-CYDGBPFRSA-N Ile-Pro-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N MLSUZXHSNRBDCI-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- COWHUQXTSYTKQC-RWRJDSDZSA-N Ile-Thr-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N COWHUQXTSYTKQC-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 1
- RTSQPLLOYSGMKM-DSYPUSFNSA-N Ile-Trp-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N RTSQPLLOYSGMKM-DSYPUSFNSA-N 0.000 description 1
- WIYDLTIBHZSPKY-HJWJTTGWSA-N Ile-Val-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 WIYDLTIBHZSPKY-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- YHFPHRUWZMEOIX-CYDGBPFRSA-N Ile-Val-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N YHFPHRUWZMEOIX-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N L-valyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 201000003533 Leber congenital amaurosis Diseases 0.000 description 1
- VIWUBXKCYJGNCL-SRVKXCTJSA-N Leu-Asn-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 VIWUBXKCYJGNCL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OXKYZSRZKBTVEY-ZPFDUUQYSA-N Leu-Asn-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O OXKYZSRZKBTVEY-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- VQPPIMUZCZCOIL-GUBZILKMSA-N Leu-Gln-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VQPPIMUZCZCOIL-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XQXGNBFMAXWIGI-MXAVVETBSA-N Leu-His-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CC1=CN=CN1 XQXGNBFMAXWIGI-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- KUIDCYNIEJBZBU-AJNGGQMLSA-N Leu-Ile-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KUIDCYNIEJBZBU-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- JKSIBWITFMQTOA-XUXIUFHCSA-N Leu-Ile-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JKSIBWITFMQTOA-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- AIRUUHAOKGVJAD-JYJNAYRXSA-N Leu-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AIRUUHAOKGVJAD-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- KTOIECMYZZGVSI-BZSNNMDCSA-N Leu-Phe-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 KTOIECMYZZGVSI-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- PJWOOBTYQNNRBF-BZSNNMDCSA-N Leu-Phe-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N PJWOOBTYQNNRBF-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- PTRKPHUGYULXPU-KKUMJFAQSA-N Leu-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PTRKPHUGYULXPU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- SVBJIZVVYJYGLA-DCAQKATOSA-N Leu-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SVBJIZVVYJYGLA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ZJZNLRVCZWUONM-JXUBOQSCSA-N Leu-Thr-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZJZNLRVCZWUONM-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- FPFOYSCDUWTZBF-IHPCNDPISA-N Leu-Trp-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)=CNC2=C1 FPFOYSCDUWTZBF-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- XZNJZXJZBMBGGS-NHCYSSNCSA-N Leu-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XZNJZXJZBMBGGS-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- IXHKPDJKKCUKHS-GARJFASQSA-N Lys-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N IXHKPDJKKCUKHS-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- SJNZALDHDUYDBU-IHRRRGAJSA-N Lys-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O SJNZALDHDUYDBU-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- DEFGUIIUYAUEDU-ZPFDUUQYSA-N Lys-Asn-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O DEFGUIIUYAUEDU-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- FACUGMGEFUEBTI-SRVKXCTJSA-N Lys-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN FACUGMGEFUEBTI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- NDORZBUHCOJQDO-GVXVVHGQSA-N Lys-Gln-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NDORZBUHCOJQDO-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- WGLAORUKDGRINI-WDCWCFNPSA-N Lys-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WGLAORUKDGRINI-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- KYNNSEJZFVCDIV-ZPFDUUQYSA-N Lys-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KYNNSEJZFVCDIV-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- NJNRBRKHOWSGMN-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NJNRBRKHOWSGMN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HVAUKHLDSDDROB-KKUMJFAQSA-N Lys-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HVAUKHLDSDDROB-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- TWPCWKVOZDUYAA-KKUMJFAQSA-N Lys-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O TWPCWKVOZDUYAA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- LNMKRJJLEFASGA-BZSNNMDCSA-N Lys-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LNMKRJJLEFASGA-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- MIROMRNASYKZNL-ULQDDVLXSA-N Lys-Pro-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MIROMRNASYKZNL-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- MIMXMVDLMDMOJD-BZSNNMDCSA-N Lys-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MIMXMVDLMDMOJD-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- DZTDEZSHBVRUCQ-FXQIFTODSA-N Met-Asp-Cys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N DZTDEZSHBVRUCQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- BMHIFARYXOJDLD-WPRPVWTQSA-N Met-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BMHIFARYXOJDLD-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- SMVTWPOATVIXTN-NAKRPEOUSA-N Met-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O SMVTWPOATVIXTN-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- VCUFZILGIRCDQQ-KRWDZBQOSA-N N-[[(5S)-2-oxo-3-(2-oxo-3H-1,3-benzoxazol-6-yl)-1,3-oxazolidin-5-yl]methyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C1O[C@H](CN1C1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1)CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F VCUFZILGIRCDQQ-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 1
- 108010066427 N-valyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Chemical group 0.000 description 1
- 101710087110 ORF6 protein Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- JWQWPTLEOFNCGX-AVGNSLFASA-N Phe-Glu-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JWQWPTLEOFNCGX-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- HBGFEEQFVBWYJQ-KBPBESRZSA-N Phe-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 HBGFEEQFVBWYJQ-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- QPVFUAUFEBPIPT-CDMKHQONSA-N Phe-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QPVFUAUFEBPIPT-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- BYAIIACBWBOJCU-URLPEUOOSA-N Phe-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BYAIIACBWBOJCU-URLPEUOOSA-N 0.000 description 1
- WLYPRKLMRIYGPP-JYJNAYRXSA-N Phe-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 WLYPRKLMRIYGPP-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- GPLWGAYGROGDEN-BZSNNMDCSA-N Phe-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GPLWGAYGROGDEN-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- WEDZFLRYSIDIRX-IHRRRGAJSA-N Phe-Ser-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 WEDZFLRYSIDIRX-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- VIIRRNQMMIHYHQ-XHSDSOJGSA-N Phe-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N VIIRRNQMMIHYHQ-XHSDSOJGSA-N 0.000 description 1
- MLQVJYMFASXBGZ-IHRRRGAJSA-N Pro-Asn-Tyr Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O MLQVJYMFASXBGZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- YFNOUBWUIIJQHF-LPEHRKFASA-N Pro-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O YFNOUBWUIIJQHF-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- UEHYFUCOGHWASA-HJGDQZAQSA-N Pro-Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 UEHYFUCOGHWASA-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- CLNJSLSHKJECME-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 CLNJSLSHKJECME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- VGVCNKSUVSZEIE-IHRRRGAJSA-N Pro-Phe-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VGVCNKSUVSZEIE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- HOTVCUAVDQHUDB-UFYCRDLUSA-N Pro-Phe-Tyr Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=C(O)C=C1 HOTVCUAVDQHUDB-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- UGDMQJSXSSZUKL-IHRRRGAJSA-N Pro-Ser-Tyr Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O UGDMQJSXSSZUKL-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 101150116978 RPE65 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- FTVRVZNYIYWJGB-ACZMJKKPSA-N Ser-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FTVRVZNYIYWJGB-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- UFKPDBLKLOBMRH-XHNCKOQMSA-N Ser-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O UFKPDBLKLOBMRH-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- MLSQXWSRHURDMF-GARJFASQSA-N Ser-His-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O MLSQXWSRHURDMF-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- GVIGVIOEYBOTCB-XIRDDKMYSA-N Ser-Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 GVIGVIOEYBOTCB-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- FPCGZYMRFFIYIH-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FPCGZYMRFFIYIH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CUXJENOFJXOSOZ-BIIVOSGPSA-N Ser-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O CUXJENOFJXOSOZ-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- DKGRNFUXVTYRAS-UBHSHLNASA-N Ser-Ser-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O DKGRNFUXVTYRAS-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- KIEIJCFVGZCUAS-MELADBBJSA-N Ser-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O KIEIJCFVGZCUAS-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- PCMZJFMUYWIERL-ZKWXMUAHSA-N Ser-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PCMZJFMUYWIERL-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- MFEBUIFJVPNZLO-OLHMAJIHSA-N Thr-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O MFEBUIFJVPNZLO-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- DJDSEDOKJTZBAR-ZDLURKLDSA-N Thr-Gly-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DJDSEDOKJTZBAR-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- NCXVJIQMWSGRHY-KXNHARMFSA-N Thr-Leu-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O NCXVJIQMWSGRHY-KXNHARMFSA-N 0.000 description 1
- GYUUYCIXELGTJS-MEYUZBJRSA-N Thr-Phe-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N)O GYUUYCIXELGTJS-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- REJRKTOJTCPDPO-IRIUXVKKSA-N Thr-Tyr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O REJRKTOJTCPDPO-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 1
- ABCLYRRGTZNIFU-BWAGICSOSA-N Thr-Tyr-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N)O ABCLYRRGTZNIFU-BWAGICSOSA-N 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- FFWCYWZIVFIUDM-OYDLWJJNSA-N Trp-Val-Trp Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(O)=O FFWCYWZIVFIUDM-OYDLWJJNSA-N 0.000 description 1
- KSVMDJJCYKIXTK-IGNZVWTISA-N Tyr-Ala-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 KSVMDJJCYKIXTK-IGNZVWTISA-N 0.000 description 1
- FQNUWOHNGJWNLM-QWRGUYRKSA-N Tyr-Cys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O FQNUWOHNGJWNLM-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- WZQZUVWEPMGIMM-JYJNAYRXSA-N Tyr-Gln-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O WZQZUVWEPMGIMM-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- IGXLNVIYDYONFB-UFYCRDLUSA-N Tyr-Phe-Arg Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 IGXLNVIYDYONFB-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- 101710095001 Uncharacterized protein in nifU 5'region Proteins 0.000 description 1
- 108091034131 VA RNA Proteins 0.000 description 1
- DDRBQONWVBDQOY-GUBZILKMSA-N Val-Ala-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O DDRBQONWVBDQOY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XWYUBUYQMOUFRQ-IFFSRLJSSA-N Val-Glu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O XWYUBUYQMOUFRQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 1
- WFENBJPLZMPVAX-XVKPBYJWSA-N Val-Gly-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O WFENBJPLZMPVAX-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- ZHQWPWQNVRCXAX-XQQFMLRXSA-N Val-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N ZHQWPWQNVRCXAX-XQQFMLRXSA-N 0.000 description 1
- QRVPEKJBBRYISE-XUXIUFHCSA-N Val-Lys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C(C)C)N QRVPEKJBBRYISE-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- YMTOEGGOCHVGEH-IHRRRGAJSA-N Val-Lys-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O YMTOEGGOCHVGEH-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- XPKCFQZDQGVJCX-RHYQMDGZSA-N Val-Lys-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O XPKCFQZDQGVJCX-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- GBIUHAYJGWVNLN-UHFFFAOYSA-N Val-Ser-Pro Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O GBIUHAYJGWVNLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIAZWUMFUURQNP-YDHLFZDLSA-N Val-Tyr-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N MIAZWUMFUURQNP-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- PMKQKNBISAOSRI-XHSDSOJGSA-N Val-Tyr-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N PMKQKNBISAOSRI-XHSDSOJGSA-N 0.000 description 1
- LLJLBRRXKZTTRD-GUBZILKMSA-N Val-Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N LLJLBRRXKZTTRD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000012494 forced degradation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010013768 glutamyl-aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- JYPCXBJRLBHWME-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-prolyl-L-arginine Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O JYPCXBJRLBHWME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010025801 glycyl-prolyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010031424 isoleucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010084957 lecithin-retinol acyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000012907 medicinal substance Substances 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010015796 prolylisoleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 238000013102 re-test Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 201000010682 retinitis pigmentosa 20 Diseases 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010031491 threonyl-lysyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010015666 tryptophyl-leucyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- 239000006200 vaporizer Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
- A61K31/07—Retinol compounds, e.g. vitamin A
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/32—Bonded phase chromatography
- B01D15/325—Reversed phase
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D15/3804—Affinity chromatography
- B01D15/3819—Affinity chromatography of the nucleic acid-nucleic acid binding protein type
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/533—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving isomerase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01135—Phosphatidylcholine--retinol O-acyltransferase (2.3.1.135)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12Y301/01064—Retinoid isomerohydrolase (3.1.1.64)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
- G01N2333/918—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/16—Ophthalmology
- G01N2800/164—Retinal disorders, e.g. retinopathy
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Information Retrieval, Db Structures And Fs Structures Therefor (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к способу измерения активности изомерoгидролазы с использованием аденоассоциированного вирусного вектора, колоночной хроматографии и масс-спектрометрии. 19 ил., 18 табл., 3 пр.
Description
РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] По этой заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США серийный No. 62/328916, поданной 28 апреля 2016 г. Полное содержание предшествующей заявки приведено в настоящем описании в качестве ссылки, включая весь текст, таблицы, список последовательностей и чертежи.
ВВЕДЕНИЕ
[0002] Активность или силу изомерoгидролазы можно измерять посредством количественной оценки продуктов, образуемых такими ферментами. Изобретение относится к измерению активности и/или силы изомерoгидролазы.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003] Изобретение относится к способам измерения и/или детекции активности изомерoгидролазы. В конкретных вариантах осуществления, способы относятся к использованию нерадиоактивного субстрата изомерoгидролазы или предшественника субстрата изомерoгидролазы и детекции нерадиоактивного продукта реакции, полученного путем превращения посредством изомерoгидролазы. В конкретных вариантах осуществления, способы включают использование масс-спектрометрии для количественной оценки продукта реакции, таким образом, измерение и/или детекцию активности изомерoгидролазы.
[0004] В конкретном варианте осуществления, способ измерения и/или детекции активности изомерoгидролазы включает (a) приведение клеток (например, эукариотических клеток), экспрессирующих лецитин:ретинол-ацилтрансферазу (LRAT), в контакт с вирусным вектором (например, аденоассоциированным вирусным вектором (AAV)), содержащим трансген, кодирующий белок изомерoгидролазу (например, RPE65), в условиях, позволяющих трансдукцию клеток; инкубацию трансдуцированных вирусным вектором клеток в условиях, позволяющих экспрессию кодированного белка изомерoгидролазы (например, RPE65); лизис трансдуцированных клеток для получения экстракта (например, экстракта клеток), содержащего кодированный белок изомерoгидролазу; инкубацию экстракта (например, экстракта клеток) с субстратом в течение периода времени и в условиях, позволяющих превращение субстрата посредством белка изомерoгидролазы в продукт реакции; подвергание продукта реакции колоночной (жидкостной) хроматографии, таким образом, получая очищенный колоночной (жидкостной) хроматографией продукт реакции; и подвергание указанного очищенного колоночной (жидкостной) хроматографией продукта реакции масс-спектрометрии, таким образом, количественная оценка продукта реакции, где количество продукта реакции отражает активность изомерoгидролазы, таким образом, измерение активности изомерoгидролазы.
[0005] В различных вариантах осуществления, белок изомерoгидролаза содержит специфический для пигментного эпителия сетчатки белок, 65-кДа (RPE65). В различных вариантах осуществления, белок изомерoгидролаза содержит специфический для пигментного эпителия сетчатки белок дикого типа, 65-кДа (RPE65). В различных вариантах осуществления, белок изомерoгидролаза содержит вариант или мутант специфического для пигментного эпителия сетчатки белка, 65-кДа (RPE65). В различных вариантах осуществления, белок изомерoгидролаза содержит специфический для пигментного эпителия сетчатки белок млекопитающего, 65-кДа (RPE65). В различных вариантах осуществления, белок изомерoгидролаза содержит специфический для пигментного эпителия сетчатки белок человека, 65-кДа (RPE65).
[0006] В различных вариантах осуществления, трансдуцированные клетки содержат клетки млекопитающих. В различных вариантах осуществления, трансдуцированные клетки содержат клетки человека. В различных вариантах осуществления, трансдуцированные клетки содержат клетки эмбриональной почки человека (HEK) 293.
[0007] В различных вариантах осуществления, трансдуцированные клетки экспрессируют LRAT, стабильно или временно. В различных вариантах осуществления, трансдуцированные клетки экспрессируют CRALBP, стабильно или временно. В различных вариантах осуществления, трансдуцированные клетки экспрессируют LRAT и/или CRALBP, стабильно или временно.
[0008] В различных вариантах осуществления, субстрат содержит полностью-транс-ретиниловый сложный эфир.
[0009] В различных вариантах осуществления, стадия (d) включает добавление предшественника субстрата в экстракт, где предшественник превращается в субстрат посредством экспрессированной LRAT. В различных вариантах осуществления, стадия (d) включает добавление клеточного связывающего ретинальдегид белка (CRALBP) и предшественника субстрата в экстракт, где предшественник превращается в субстрат посредством экспрессированной LRAT.
[0010] В различных вариантах осуществления, количество добавленного CRALBP составляет между приблизительно 50 и приблизительно 500 мкг.
[0011] В различных вариантах осуществления, предшественник содержит полностью-транс-ретинол или состоит из него. В различных вариантах осуществления, предшественник, такой как полностью-транс-ретинол, добавляют таким образом, что конечная концентрация составляет от приблизительно 1 до приблизительно 20 мМ.
[0012] В различных вариантах осуществления, продукт реакции содержит 11-цис-ретинол или состоит из него.
[0013] В различных вариантах осуществления, стадию (d), (e) и/или (f) проводят в темноте, при тусклом свете или при тусклом желтом свете.
[0014] В различных вариантах осуществления, субстрат, предшественник или продукт реакции является нерадиоактивным.
[0015] В различных вариантах осуществления, период времени на стадии (d) составляет от приблизительно 30 минут до приблизительно 240 минут.
[0016] В различных вариантах осуществления, после стадии (d), но до стадии (e) реакцию останавливают или гасят. В различных вариантах осуществления, после стадии (d), но до стадии (e), добавляют спирт.
[0017] В различных вариантах осуществления, после стадии (d), но до стадии (e), продукт реакции экстрагируют. В различных вариантах осуществления, после стадии (d), но до стадии (e), продукт реакции экстрагируют органическим растворителем, например, гексаном.
[0018] В различных вариантах осуществления, способ из любой из стадий (a)-(d) осуществляют, как указано в примере 1.
[0019] В различных вариантах осуществления, способ из любой из стадий (e)-(f) осуществляют, как указано в примере 2.
[0020] В различных вариантах осуществления, аденоассоциированный вирусный (AAV) вектор содержит белковую последовательность капсида или последовательность инвертированного концевого повтора, имеющие 70% или более идентичности последовательности с белковой последовательностью капсида или с последовательностью инвертированного концевого повтора любого серотипа, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 и AAV10.
[0021] В различных вариантах осуществления, аденоассоциированный вирусный (AAV) вектор содержит белок капсида или инвертированный концевой повтор из любого серотипа, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10.
[0022] В различных вариантах осуществления, стадию (a) приведения клеток в контакт проводят с количеством от приблизительно 500 до приблизительно 5 миллионов частиц вектора AAV/клетку. В различных вариантах осуществления, стадию (a) приведения клеток в контакт проводят с количеством от приблизительно 1000 до приблизительно 1000000 частиц вектора AAV/клетку. В различных вариантах осуществления, стадию (a) приведения клеток в контакт проводят с количеством от приблизительно 2000 до приблизительно 500000 частиц вектора AAV/клетку.
[0023] В различных вариантах осуществления, стадия (b) включает инкубацию трансдуцированных клеток в течение периода времени от приблизительно 6 часов до приблизительно 96 часов.
[0024] В различных вариантах осуществления, лизис трансдуцированных клеток из (c) проводят посредством замораживания-размораживания, обработки ультразвуком или их комбинации.
[0025] В различных вариантах осуществления, определяют общее количество клеточного белка, полученного после стадии (c). В различных вариантах осуществления, общее количество клеточного белка, полученного после стадии (c), определяют посредством анализа Бредфорд.
[0026] В различных вариантах осуществления, предшественник смешивают с 10-100% раствором DMF.
[0027] В различных вариантах осуществления, после сбора клеток, но до стадии (c) лизиса, собранные клетки ресуспендируют в буфере.
[0028] В различных вариантах осуществления, после стадии (c) лизиса собранных клеток для получения экстракта, экстракт разводят в буфере.
[0029] В различных вариантах осуществления, буфер представляет собой солевой буфер. В различных вариантах осуществления, буфер представляет собой буфер NaCl.
[0030] В различных вариантах осуществления, экстракт, полученный на стадии (c), включает от приблизительно 10 мкг до приблизительно 2000 мкг общего клеточного белка, или его доводят до от приблизительно 10 мкг до приблизительно 2000 мкг общего белка.
[0031] В различных вариантах осуществления, экстракт, полученный на стадии (c), включает от приблизительно 50 мкг до приблизительно 750 мкг общего клеточного белка, или его доводят до от приблизительно 50 мкг до приблизительно 750 мкг общего белка.
[0032] В различных вариантах осуществления, стадию (d) инкубации проводят при температуре от приблизительно 30 до приблизительно 40°C.
[0033] В различных вариантах осуществления, колоночная хроматография отделяет 11-цис-ретинол от 9-цис-ретинола и/или отделяет 11-цис-ретинол от 13-цис-ретинола.
[0034] В различных вариантах осуществления, колоночная хроматография включает обращенно-фазовую хроматографию. В различных вариантах осуществления, колоночная хроматография включает обращенно-фазовую стационарную фазу.
[0035] В различных вариантах осуществления, стационарная фаза содержит цепь C18. В различных вариантах осуществления, стационарная фаза содержит гидрофильную группу. В различных вариантах осуществления, гидрофильная группа содержит карбаматную группу. В различных вариантах осуществления, стационарная фаза содержит гидрофильную карбаматную группу в цепи C18. В различных вариантах осуществления, эта фаза содержит силилкарбаматную группу.
[0036] В различных вариантах осуществления, способ является линейным от приблизительно 1×104 до приблизительно 2×106 геномов вектора AAV на клетку.
[0037] В различных вариантах осуществления, коэффициент детерминации способа (R2) составляет более, чем приблизительно 0,85.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0038] На фигуре 1 показан обзор функций RPE65 в цикле превращений родопсина
[0039] На фигуре 2 обобщен общий анализ активности RPE65 на основе вектора. 11-цис-ретинол экстрагируют гексаном и затем анализируют жидкостной хроматографией/масс-спектрометрией.
[0040] На фигуре 3 показана стандартная кривая (верхняя панель) и профиль элюции 11-цис-ретинола посредством жидкостной хроматографии.
[0041] На фигуре 4 показана оптимизация CRALBP и полностью-транс-ретинола (atROL) посредством оценки концентрации. В этом анализе, оптимальная концентрация CRALBP составляет 10 мкМ, и оптимальная концентрация atROL составляет 1,0 мкМ.
[0042] На фигуре 5 показана воспроизводимость анализа с использованием всего 9 анализов RPE65.
[0043] На фигуре 6 показана увеличенная продукция 11-цис-ретинола с увеличением MOI AV-RPE65. Оценивали 8 различных MOI. BLOQ=ниже уровня количественного определения. SD=стандартное отклонение. CV=коэффициент изменчивости.
[0044] На фигуре 7 показан анализ 11-цис-ретинола из двух различных партий вектора AAV-RPE65 при пяти различных MOI.
[0045] На фигуре 8 показаны кривые зависимости ответа от дозы по PLA 3.0 для эталонного стандарта AAV2-hRPE65v2 (темный) и образца буфера для получения состава для определения специфичности (светлый) из анализа 14.
[0046] На фигуре 9 показана линейность разведения: символы представляют оцененные значения относительной активности из 13 анализов, перечисленных в таблице 11, нанесенные на график против соответствующих им значений целевой активности. Подобранная кривая регрессии представляет собой относительную активность (RP), зарегистрированную посредством PLA v3.0,=-0,112815+1,1649975*целевой уровень.
[0047] На фигуре 10 показан для аналитика 1 (или аналитика 2), препарата 1, пример схемы планшета для 9 MOI, аналитический эталонный стандарт по сравнению с образцом (тестируемым препаратом) (уровень точности 100%).
[0048] На фигуре 11 показан для аналитика 1 (или аналитика 2), препарата 1, пример схемы планшета для 9 MOI, аналитический эталонный стандарт по сравнению с образцом (тестируемым препаратом) (уровень точности 50%).
[0049] На фигуре 12 показан для аналитика 1 (или аналитика 2), препарата 1, пример схемы планшета для 9 MOI, аналитический эталонный стандарт по сравнению с образцом (тестируемым препаратом) (уровень точности 150%).
[0050] На фигуре 13 показана относительная систематическая ошибка (точка) и ее 90% доверительный интервал, оцененные для каждого целевого уровня из таблицы 11.
[0051] На фигуре 14 показаны кривые зависимости ответа от дозы по PLA 3.0 для эталонного стандарта AAV2-hRPE65v2 (темный) и тестируемого препарата, сутки 1, аналитик 1, 50% (светлый) из анализа 1.
[0052] На фигуре 15 показаны кривые зависимости ответа от дозы по PLA 3.0 для эталонного стандарта AAV2-hRPE65v2 (темный) и тестируемого препарата, сутки 1, аналитик 2, 50% (светлый) из повтора анализа 2.
[0053] На фигуре 16 показаны кривые зависимости ответа от дозы по PLA 3.0 для эталонного стандарта AAV2-hRPE65v2 (темный) и тестируемого препарата, сутки 1, аналитик 1, 100% (светлый) из анализа 5.
[0054] На фигуре 17 показаны кривые зависимости ответа от дозы по PLA 3.0 для эталонного стандарта AAV2-hRPE65v2 (темный) и тестируемого препарата, сутки 1, аналитик 2, 100% (светлый) из повтора анализа 6.
[0055] На фигуре 18 показаны кривые зависимости ответа от дозы по PLA 3.0 для эталонного стандарта AAV2-hRPE65v2 (темный) и тестируемого препарата, сутки 1, аналитик 1, 150% (светлый) из анализа 9.
[0056] На фигуре 19 показаны кривые зависимости ответа от дозы по PLA 3.0 для эталонного стандарта AAV2-hRPE65v2 (темный) и тестируемого препарата, сутки 1, аналитик 2, 150% (светлый) из анализа 10.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0057] Изобретение относится к способам измерения и/или детекции активности и/или функции белка изомерoгидролазы. В различных вариантах осуществления, способы являются специфическими (не подверженными влиянию буфера), являются линейными при разведении, являются точными и обладают воспроизводимостью в широком диапазоне множественности инфекции (MOI). Например, в диапазоне от 50% до 150% номинальной концентрации по способу, при множественности инфекции (MOI) 1,00E+04, 2,00E+04, 4,00E+04, 6,00E+04, 8,00E+04, 1,60E+05, 3,20E+05, 6,40E+05, 1,28E+06 геномов вектора (гв) на клетку, поддерживается линейность, точность и воспроизводимость данных.
[0058] Способы по изобретению для измерения и/или детекции активности и/или функции белка изомерoгидролазы, указанные в настоящем описании, включают способы, сертифицированные для тестирования как лекарственной субстанции (DS), так и продукта лекарственного средства (DP). Критерии стабильности системы соблюдались для каждого аналитического множества. Способы по изобретению включают способы, как показано, пригодные для предназначенной для них цели.
[0059] Последовательности нуклеиновой кислоты и белка последовательности изомерoгидролазы, которые можно использовать по изобретению, включают ретиноид-изомерoгидролазу, такую как специфический для пигментного эпителия сетчатки белок 65 кДа (RPE65). Ретиноид-изомерoгидролаза, также обозначаемая как полностью-транс-ретинил-пальмитат-гидролаза и ретинол-изомераза, наряду с другими синонимами, вовлечена в синтез 11-цис-ретинола. (RPE65) представляет собой фермент цикла превращений родопсина позвоночных, который является ответственным за активность изомерoгидролазы, или превращение полностью-транс-ретинилового сложного эфира в 11-цис-ретинол (Moiseyev, et.al. 2005). Полностью-транс-ретинол (atROL) подвергается эстерифицикации посредством лецитин:ретинол-ацилтрансферазы (LRAT), затем сложный эфир поступает к RPE65 для реакции изомеризации (Moiseyev, et.al. 2003).
[0060] Заболевания, ассоциированные с недостаточностью Rpe65, включают, например, врожденный амавроз Лебера и пигментный ретинит 20.
[0061] Репрезентативный белок RPE65 человека приведен как:
MSIQVEHPAG GYKKLFETVE ELSSPLTAHV TGRIPLWLTG SLLRCGPGLF EVGSEPFYHL FDGQALLHKF DFKEGHVTYH RRFIRTDAYV RAMTEKRIVI TEFGTCAFPD PCKNIFSRFF SYFRGVEVTD NALVNVYPVG EDYYACTETN FITKINPETL ETIKQVDLCN YVSVNGATAH PHIENDGTVY NIGNCFGKNF SIAYNIVKIP PLQADKEDPI SKSEIVVQFP CSDRFKPSYV HSFGLTPNYI VFVETPVKIN LFKFLSSWSL WGANYMDCFE SNETMGVWLH IADKKRKKYL NNKYRTSPFN LFHHINTYED NGFLIVDLCC WKGFEFVYNY LYLANLRENW EEVKKNARKA PQPEVRRYVL PLNIDKADTG KNLVTLPNTT ATAILCSDET IWLEPEVLFS GPRQAFEFPQ INYQKYCGKP YTYAYGLGLN HFVPDRLCKL NVKTKETWVW QEPDSYPSEP IFVSHPDALE EDDGVVLSVV VSPGAGQKPA YLLILNAKDL SEVARAEVEI NIPVTFHGLFKKS (SEQ ID NO:1)
[0062] Дополнительные белки RPE65 включают варианты, такие как описанные в WO2016018816A1, содержание которой приведено в настоящем описании в качестве ссылки.
[0063] Термин «вектор» относится к небольшой молекуле нуклеиновой кислоты - переносчику, плазмиде, вирусу (например, вектору AAV), или другому переносчику, поддающемуся манипуляциям посредством вставки или включения нуклеиновой кислоты. Векторы можно использовать для генетических манипуляций (т.е., «клонирующие векторы»), для введения/переноса полинуклеотидов в клетки, и для транскрипции или трансляции вставленного полинуклеотида в клетках. «Экспрессирующий вектор» представляет собой вектор, содержащий ген или последовательность нуклеиновой кислоты с необходимыми регуляторными областями, нужными для экспрессии в клетке-хозяине. Последовательность нуклеиновой кислоты вектора, как правило, содержит по меньшей мере точку начала репликации для размножения в клетке, и необязательно, дополнительные элементы, такие как последовательность нуклеиновой кислоты изомерoгидролазы, элемент для контроля экспрессии (например, промотор, энхансер), интрон, инвертированные концевые повторы (ITR), необязательный селективный маркер, сигнал полиаденилирования.
[0064] Вектор AAV происходит из аденоассоциированного вируса. Векторы AAV можно использовать в качестве векторов для генотерапии, поскольку они могут проникать в клетки и вводить нуклеиновую кислоту/генетический материал таким образом, что нуклеиновая кислота/генетический материал может стабильно поддерживаться в клетках. Кроме того, эти вирусы могут вводить нуклеиновую кислоту/генетический материал в специфические участки, например, такие как специфический участок на хромосоме 19. Поскольку AAV не ассоциированы с патогенным заболеванием у человека, векторы AAV являются способными доставлять гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты (например, терапевтические белки и средства) пациентам-людям, не вызывая значительного патогенеза или заболевания из-за AAV.
[0065] Термин «рекомбинантный», в качестве определения вектора, такого как векторы рAAV, так же как в качестве определения последовательностей, таких как рекомбинантные полинуклеотиды и полипептиды, означает, что эти составы подвергали манипуляции (т.е., конструированию) таким образом, какой, как правило, не встречается в природе. Конкретным примером рекомбинантного вектора AAV является вектор, в котором нуклеиновая кислота, например, изомерoгидролазы, которая в норме не присутствует в геноме AAV дикого типа, вставлена в вирусный геном. Хотя термин «рекомбинантный» не всегда используют в настоящем описании применительно к векторам AAV, так же как к последовательностям, таким как полинуклеотиды, рекомбинантные формы, включая векторы AAV, полинуклеотиды, изомерoгидролазы и т.д., включены в явной форме, несмотря на любое такое опущение.
[0066] «Вектор рAAV» получен из генома вируса дикого типа, такого как AAV, с использованием способов на молекулярной основе для удаления генома дикого типа из генома AAV и замены на неприродную (гетерологичную) нуклеиновую кислоту, такую как нуклеиновая кислота, кодирующая изомерoгидролазу. Как правило, в случае AAV, последовательности одного или обоих инвертированных концевых повторов (ITR) из генома AAV сохраняют в векторе рAAV. рAAV отличается от генома AAV, поскольку весь или часть генома AAV заменен на неприродную последовательность по отношению к геномной нуклеиновой кислоте AAV, например, на гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую изомерoгидролазу. Включение неприродной последовательности, таким образом, определяет AAV как «рекомбинантный» вектор AAV, который можно обозначать как «вектор рAAV».
[0067] Последовательность рекомбинантного вектора AAV может являться упакованной - обозначенной в настоящем описании как «частица» для последующей инфекции (трансдукции) клетки, ex vivo, in vitro или in vivo. Когда последовательность рекомбинантного вектора является инкапсидированной или упакованной в частицу AAV, частицу можно также обозначать как «рAAV» или «частицу рAAV» или «вирион рAAV». Такие рAAV, частицы рAAV и вирионы рAAV включают белки, инкапсидирующие или упаковывающие геном вектора. Конкретные примеры включают, в случае AAV, белки капсида.
[0068] «Геном» вектора относится к части последовательности рекомбинантной плазмиды, которую в конечном счете упаковывают или инкапсидируют для формирования частицы рAAV. В случаях, когда рекомбинантные плазмиды используют для конструирования или получения рекомбинантных векторов AAV, геном вектора AAV не включает часть «плазмиды», которая не соответствует последовательности генома вектора из рекомбинантной плазмиды. Эту не относящуюся к геному вектора часть рекомбинантной плазмиды обозначают как «остов плазмиды», который является важным для клонирования и амплификации плазмиды, процесса, необходимого для размножения и продукции рекомбинантного вируса, но который сам не подвергается упаковке или инкапсидированию в частицы рAAV. Таким образом, «геном» вектора относится к нуклеиновой кислоте, упакованной или инкапсидированной посредством рAAV.
[0069] «Функции помощника AAV» относятся к происходящим из последовательностям AAV (белкам), которые можно экспрессировать для получения продуктов генов AAV и векторов AAV, которые, в свою очередь, функционируют в транс-положении для продуктивной репликации и упаковки AAV. Таким образом, функции помощника AAV включают обе главные открытые рамки считывания (ORF) AAV, rep и cap. Показано, что продукты экспрессии Rep имеют множество функций, включая, среди прочих: узнавание, связывание и внесение разрывов в точку начала репликации ДНК AAV; активность ДНК-хеликазы; и модуляцию транскрипции с промоторов AAV (или других гетерологичных). Продукты экспрессии Cap (капсиды) поддерживают необходимые функции упаковки. Функции помощника AAV используют для транс-комплементации функций AAV, которые отсутствуют у геномов вектора AAV.
[0070] «Конструкция помощника AAV» относится, в общем, к последовательности нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидные последовательности, обеспечивающие функции AAV, делетированные из вектора AAV, предназначенной для получения трансдуцирующего вектора AVV для доставки представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты, например, посредством генотерапии, субъекту. Конструкции помощника AAV обычно используют для обеспечения временной экспрессии генов rep и/или cap AAV для комплементации отсутствующих функций AAV, необходимых для репликации вектора AAV. Конструкции помощника, как правило, лишены ITR AAV и сами не могут ни реплицироваться, ни упаковываться. Конструкции помощника AAV могут находиться в форме плазмиды, фага, транспозона, космиды, вируса или вириона. Описан ряд конструкций помощника AAV, таких как плазмиды pAAV/Ad и pIM29+45, которые кодируют продукты экспрессии как Rep, так и Cap (см., например, Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; и McCarty et al. (1991) J. Virol. 65:2936-2945). Описан ряд других векторов, которые кодируют продукты экспрессии Rep и/или Cap (см., например, Патенты США No. 5139941 и 6376237).
[0071] Термин «вспомогательные функции» относится к не происходящим из AAV вирусным и/или клеточным функциям, от которых AAV зависит для репликации. Термин включает белки и РНК, необходимые для репликации AAV, включая группы, вовлеченные в активацию транскрипции генов AAV, специфическую для стадии сплайсинга мРНК AAV, репликацию ДНК AAV, синтез продуктов экспрессии Cap и упаковку капсида AAV. Вспомогательные функции на основе вирусов могут происходить из любого из известных вирусов-помощников, таких как аденовирус, вирус герпеса (отличный от вируса простого герпеса типа-1) и вирус осповакцины.
[0072] «Вектор с вспомогательной функцией» относится, в общем, к молекуле нуклеиновой кислоты, включающей полинуклеотидные последовательности, обеспечивающие вспомогательные функции. Такие последовательности могут находиться на векторе с вспомогательной функцией и подвергаться трансфекции в подходящую клетку-хозяина. Вектор с вспомогательной функцией является способным поддерживать продукцию вириона рAAV клеткой-хозяином. Векторы с вспомогательными функциями могут находиться в форме плазмиды, фага, транспозона или космиды. Кроме того, полная комплементация генов аденовируса не является необходимой для вспомогательных функций. Например, опубликовано, что мутанты аденовируса, неспособные к репликации ДНК и синтезу поздних генов, являются пермиссивными для репликации AAV (Ito et al., (1970) J. Gen. Virol. 9:243; Ishibashi et al, (1971) Virology 45:317). Подобным образом, показано, что мутанты в областях E2B и E3 поддерживают репликацию AAV, показывая, что области E2B и E3, возможно, не вовлечены в обеспечение вспомогательных функций (Carter et al., (1983) Virology 126:505). Аденовирусы, дефектные по области E1, или имеющие делецию области E4, являются неспособными поддерживать репликацию AAV. Таким образом, области E1A и E4 по-видимому, являются необходимыми для репликации AAV, либо напрямую, либо опосредованно (Laughlin et al., (1982) J. Virol. 41:868; Janik et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1925; Carter et al., (1983) Virology 126:505). Другие охарактеризованные мутанты аденовирусов включают: E1B (Laughlin et al. (1982), выше; Janik et al. (1981), выше; Ostrove et al., (1980) Virology 104:502); E2A (Handa et al., (1975) J. Gen. Virol. 29:239; Strauss et al., (1976) J. Virol. 17:140; Myers et al., (1980) J. Virol. 35:665; Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2927; Myers et al., (1981) J. Biol. Chem. 256:567); E2B (Carter, Adeno-Associated Virus Helper Functions, in I CRC Handbook of Parvoviruses (P. Tijssen ed., 1990)); E3 (Carter et al. (1983), выше); и E4 (Carter et al.(1983), выше; Carter (1995)). Исследования вспомогательных функций, обеспечиваемых аденовирусами, имеющими мутации в кодирующей области E1B, привели к противоречивым результатам, однако, E1B55k может являться необходимым для продукции вириона AAV, в то время как E1B19k может не являться (Samulski et al., (1988) J. Virol. 62:206-210). Кроме того, в Международной публикации WO 97/17458 и в Matshushita et al., (1998) Gene Therapy 5:938-945, описаны векторы с вспомогательными функциями, кодирующие различные гены аденовирусов. Иллюстративные векторы с вспомогательными функциями содержат кодирующую область РНК VA аденовируса, кодирующую область ORF6 E4 аденовируса, кодирующую область E2A 72 кДа аденовируса, кодирующую область E1A аденовируса, и область E1B аденовируса, лишенную интактной кодирующей области E1B55k. Такие векторы с вспомогательными функциями описаны, например, в Международной публикации No. WO 01/83797.
[0073] Как применяют в настоящем описании, термин «серотип» представляет собой отличительный признак, используемый для обозначения AAV, имеющего капсид, серологически отличный от других серотипов AAV. Серологическое различие определяют на основании отсутствия перекрестной реакционной способности между антителами против одного AAV по сравнению с антителами против другого AAV. Различия в перекрестной реакционной способности обычно обусловлены различиями в последовательностях/антигенных детерминантах белков капсида (например, обусловлены различиями последовательностей VP1, VP2 и/или VP3 серотипов AAV).
[0074] По традиционному определению, серотип означает, что представляющий интерес вирус тестировали против сыворотки, специфической для всех существующих и охарактеризованных серотипов по нейтрализующей активности, и не обнаружено антител, нейтрализующих представляющий интерес вирус. По мере открытия большего количества природных изолятов вируса и/или получения мутантов капсида, могут присутствовать или могут не присутствовать серологические различия с любым из существующих в настоящее время серотипов. Таким образом, в случаях, когда новый вирус (например, AAV) не имеет серологических отличий, этот новый вирус (например, AAV) представляет собой подгруппу или вариант соответствующего серотипа. Во многих случаях, серологическое тестирование нейтрализующей активности еще необходимо провести для мутантных вирусов с модификациями последовательности капсида для определения того, представляют ли они собой другой серотип в соответствии с традиционным определением серотипа. Соответственно, для удобства и для избегания повторения, термин «серотип» в широком смысле относится как к серологически различным вирусам (например, AAV), так же как к вирусам (например, AAV), которые не являются серологически различными, которые могут находиться в пределах подгруппы или варианта данного серотипа.
[0075] Векторы рAAV включают любой вирусный штамм или серотип. В качестве неограничивающего примера, плазмида или геном вектора, или частица (белок капсида) рAAV могут быть основаны на любом серотипе AAV, например, таком как AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11. Такие векторы могут быть основаны на одном и том же штамме или серотипе (или подгруппе, или варианте), или могут являться отличными друг от друга. В качестве неограничивающего примера, геном плазмиды или вектора, или частица (капсид) рAAV на основе генома одного серотипа, могут являться идентичными одному или нескольким из белков капсида, упаковывающих вектор. Кроме того, геном плазмида или вектора рAAV могут быть основаны на геноме серотипа AAV (например, AAV2), отличном от одного или нескольких из белков капсида, упаковывающих геном вектора, в этом случае, по меньшей мере один из трех белков капсида может представлять собой, например, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 или его вариант. Векторы рAAV, таким образом, включают последовательности генов/белков, идентичные последовательностям генов/белков, характерным для конкретного серотипа, так же как смешанных серотипов.
[0076] В различных иллюстративных вариантах осуществления, вектор рAAV включает последовательность капсида или состоит из последовательности капсида, по меньшей мере на 70% или более (например, на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% и т.д.) идентичной одному или нескольким белкам капсида AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 или AAV11. В различных иллюстративных вариантах осуществления, вектор рAAV включает последовательность или состоит из последовательности, по меньшей мере на 70% или более (например, на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% и т.д.) идентичной одному или нескольким инвертированным концевым повторам (ITR) AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 или AAV11.
[0077] рAAV, такие как AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 и AAV11, и их варианты, гибридные и химерные последовательности, можно конструировать с использованием рекомбинантных способов, известных специалисту в данной области, для включения гетерологичного полинуклеотида (последовательности изомерoгидролазы), фланкированного одной или несколькими функциональными последовательностями ITR AAV. Такие векторы имеют один или несколько генов AAV дикого типа, делетированных полностью или частично, но сохраняют по меньшей мере одну функциональную фланкирующую последовательность(последовательности) ITR, как необходимо для спасения, репликации и упаковки рекомбинантного вектора в частицу вектора рAAV. Геном вектора рAAV может, таким образом, включать последовательности, необходимые в цис-положении для репликации и упаковки (например, функциональные последовательности ITR)
[0078] В данной области известны способы получения вирионов рAAV. Например, трансфекция с использованием вектора AAV и последовательностей помощника AAV в сочетании с совместной инфекцией вирусами-помощниками AAV (например, аденовирусом, вирусом герпеса или вирусом осповакцины) или трансфекция с использованием рекомбинантного вектора AAV, вектора-помощника AAV и вектора с вспомогательной функцией. Неограничивающие примеры способов получения вирионов рAAV описаны, например, в Патентах США No. 6001650 и 6004797. После продукции рекомбинантного вектора рAAV (т.е. получения вектора в системах культур клеток), вирионы рAAV можно получать из клеток-хозяев и супернатанта культуры клеток, и необязательно, очищать.
[0079] Термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» используют взаимозаменяемо в настоящем описании для обозначения всех форм нуклеиновой кислоты, олигонуклеотидов, включая дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). Нуклеиновые кислоты включают геномную ДНК, кДНК и антисмысловую ДНК, и подвергнутую или не подвергнутую сплайсингу мРНК, рРНК, тРНК и ингибирующие ДНК или РНК (РНКи, например, малую или короткошпилечную (кш)РНК, микроРНК (мкРНК), малую или короткую интерферирующую (ми)РНК, подвергнутую транс-сплайсингу РНК, или антисмысловую РНК). Нуклеиновые кислоты включают природные, синтетические и преднамеренно модифицированные или измененные полинуклеотиды. Нуклеиновые кислоты могут является одноцепочечными, двухцепочечными или трехцепочечными, линейными или кольцевыми, и могут иметь любую длину. При обсуждении нуклеиновых кислот, последовательность или структура конкретного полинуклеотида могут быть описаны в настоящем описании в соответствии с соглашением о предоставлении последовательности в направлении от 5' до 3'.
[0080] «Клетка-хозяин» обозначает, например, микроорганизмы, клетки дрожжей, клетки насекомых и клетки млекопитающих, которые могут быть использованы или использованы в качестве реципиентов плазмидного вектора AAV, конструкции помощника AAV, вектора с вспомогательной функцией или другой переносимой ДНК. Термин включает потомство исходной клетки, которую вводили посредством трансфекции. Таким образом, «клетка-хозяин», в общем, относится к клетке, трансфицированной с использованием экзогенной последовательности ДНК. Понятно, что потомство отдельной родительской клетки не обязательно может являться полностью идентичным по морфологии или по геномной или общей комплементарной ДНК исходному родителю, из-за естественных, случайных или преднамеренных мутаций. Иллюстративные клетки-хозяева включают клетки эмбриональной почки человека (HEK), такие как клетки HEK293.
[0081] «Трансдуцированная клетка» представляет собой клетку, в которую введен трансген (например, последовательность изомерoгидролазы). Соответственно, «трансдуцированная» клетка означает генетическое изменение в клетке после включения экзогенной молекулы, например, нуклеиновой кислоты (например, трансгена) в клетку. «Трансдуцированная» включает также ее потомство. Клетку(клетки) можно размножать (культивировать), и экспрессировать введенный белок (например, белок изомерoгидролазу), или продуцировать вектор, такой как рAAV, в клетке. В случае клеток в культуре, последовательности нуклеиновой кислоты, такие как гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты или плазмида, или вектор, вставленные в хромосому, могут сохраняться в ходе множества пассажей клеток.
[0082] «Линия клеток» относится к популяции клеток, способных к непрерывному или длительному росту и делению in vitro в подходящих условиях культивирования. Линии клеток могут, но не обязательно, представлять собой клональные популяции, происходящие от одной клетки-предшественника. В линиях клеток, спонтанные или индуцированные изменения могут возникать в кариотипе в ходе хранения или транспортировки таких клональных популяций, так же как в ходе длительного пассирования в культуре клеток. Таким образом, клетки-потомки, происходящие из линии клеток, могут не являться точно идентичными клеткам или культурам-предкам. Иллюстративной линией клеток, применимой в производственных способах по изобретению, являются клетки HEK293, такие как HEK-LRAT.
[0083] «Элемент для контроля экспрессии» относится к последовательности(последовательностям) нуклеиновой кислоты, влияющим на экспрессию функционально связанной нуклеиновой кислоты. Контрольные элементы включают элементы для контроля экспрессии, как указано в настоящем описании, такие как промоторы и энхансеры. Векторы рAAV могут включать один или несколько «элементов для контроля экспрессии». Как правило, такие элементы включены, чтобы способствовать надлежащей транскрипции и, при необходимости, трансляции гетерологичного полинуклеотида (например, промотор, энхансер, сигнал сплайсинга для интронов, элементы для поддержания правильной рамки считывания гена, чтобы позволять трансляцию мРНК в рамке считывания, и стоп-кодоны и т.д.). Такие элементы, как правило, действуют в цис-положении, обозначаемые «цис-действующим» элементом, но могут также действовать в транс-положении.
[0084] Контроль экспрессии можно осуществлять на уровне транскрипции, трансляции, сплайсинга, стабильности матричной РНК и т.д. Как правило, элемент для контроля экспрессии, модулирующий транскрипцию, размещают около 5'-конца (т.е., «выше») транскрибируемой нуклеиновой кислоты. Элементы для контроля экспрессии могут быть также локализованы на 3'-конце (т.е. «ниже») транскрибируемой последовательности или внутри транскрипта (например, в интроне). Элементы для контроля экспрессии могут быть локализованы вблизи или на расстоянии от транскрибируемой последовательности (например, 1-10, 10-25, 25-50, 50-100, 100-500, или более нуклеотидов от полинуклеотида), даже на значительных расстояниях. Тем не менее, вследствие ограничений по длине векторов рAAV, элементы для контроля экспрессии, как правило, находятся в пределах 1-1000 нуклеотидов от транскрибированной нуклеиновой кислоты.
[0085] Функционально, экспрессию функционально связанной нуклеиновой кислоты можно, по меньшей мере частично, контролировать посредством элемента (например, промотора), так что элемент модулирует транскрипцию нуклеиновой кислоты и, по необходимости, трансляцию транскрипта. Конкретным примером элемента для контроля экспрессии является промотор, который обычно локализован на 5' от транскрибируемой последовательности. Промотор, как правило, увеличивает количество, экспрессированное с функционально связанной нуклеиновой кислоты, по сравнению с количеством, экспрессированным в отсутствие промотора.
[0086] «Энхансер», как применяют в настоящем описании, может относиться к последовательности, локализованной по соседству с последовательностью нуклеиновой кислоты, такой как селективный маркер или гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты. Энхансерные элементы, как правило, локализованы выше промоторного элемента, но также могут функционировать и могут быть локализованы ниже или внутри последовательности. Таким образом, энхансерный элемент может быть локализован выше или ниже, например, в пределах 100 пар оснований, 200 пар оснований, или 300 или более пар оснований от селективного маркера и/или гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующей терапевтический белок или полинуклеотидную последовательность. Энхансерные элементы, как правило, увеличивают экспрессию функционально связанной нуклеиновой кислоты выше экспрессии, обеспечиваемой промоторным элементом.
[0087] Термин «функционально связанный» означает, что регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, помещены в соответствующие положения относительно последовательности, так чтобы обеспечивать экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты. Такое же определение иногда применяют к расположению последовательностей нуклеиновой кислоты и элементов контроля транскрипции (например, промоторных, энхансерных и терминирующих элементов) в экспрессирующем векторе, например, векторе рAAV.
[0088] В примере элемента для контроля экспрессии в функциональной связи с нуклеиновой кислотой, взаимосвязь является такой, что контрольный элемент модулирует экспрессию нуклеиновой кислоты. Более конкретно, например, две последовательности ДНК, функционально связанные, означает, что две ДНК расположены (цис или транс) в такой взаимосвязи, что по меньшей мере одна из последовательностей ДНК способна проявлять физиологический эффект в зависимости от другой последовательности.
[0089] Соответственно, дополнительные элементы для векторов включают, без ограничения, элемент для контроля экспрессии (например, промотор/энхансер), сигнал терминации транскрипции или стоп-кодон, 5'- или 3'-нетранслируемые области (например, последовательности полиаденилирования (полиA)), которые фланкируют последовательность, такую как одна или несколько копий последовательности ITR AAV, или интрон.
[0090] Дополнительные элементы включают, например, заполняющие или балластные полинуклеотидные последовательности, например, для улучшения упаковки и уменьшения присутствия загрязняющей нуклеиновой кислоты. Векторы AAV, как правило, допускают вставки ДНК, имеющие размер в диапазоне, который, как правило, составляет от приблизительно 4 т.п.о. до приблизительно 5,2 т.п.о., или немного больше. Таким образом, для более коротких последовательностей, включение балласта или заполнителя, чтобы довести длину до близкого к нормальному или нормального размера геномной последовательности вируса, приемлемой для вектора, пакующегося в частицу рAAV. В различных вариантах осуществления, заполняющая/балластная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой нетранслируемый (не кодирующий белок) фрагмент нуклеиновой кислоты. Для последовательности нуклеиновой кислоты менее, чем 4,7 т.п.о., заполняющая или балластная полинуклеотидная последовательность имеет длину, которая при объединении (например, при вставке в вектор) с этой последовательностью имеет общую длину между приблизительно 3,0-5,5 т.п.о. или между приблизительно 4,0-5,0 т.п.о., или между приблизительно 4,3-4,8 т.п.о.
[0091] Если не определено иное, все технические и научные термины применяемые в настоящем описании, имеют такое же значение, какое является общепринятым для специалиста в области, к которой относится это изобретение. Хотя способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным в настоящем описании, можно использовать в практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения, пригодные способы и материалы описаны в настоящем описании.
[0092] Полное содержание всех заявок, публикаций, патентов и других ссылок, ссылок на GenBank и ссылок на ATCC, процитированных в настоящем описании, приведено в качестве ссылки. В случае несоответствия, это описание, включая определения, имеет преимущество.
[0093] Все из признаков, описанных в настоящем описании, можно комбинировать в любой комбинации. Каждый признак, описанный в этом описании, можно заменять альтернативным признаком, служащим для такой же, эквивалентной или сходной цели. Таким образом, если явно не указано иное, описанные признаки (например, последовательности изомерoгидролазы, векторы, векторы рAAV и т.д.) являются примером рода эквивалентов или сходных признаков.
[0094] Как применяют в настоящем описании, неконкретизированные и конкретизированные формы единственного числа включают объекты ссылки множественного числа, если контекст явно не указывает на иное. Таким образом, например, ссылка на «вектор AAV» или «частицу AAV», включает множество таких векторов AAV и частиц AAV, и ссылка на «клетку» или «клетку-хозяина» включает множество клеток и клеток-хозяев.
[0095] Термин «приблизительно», как применяют в настоящем описании, означает значения, находящиеся в пределах 10% (плюс или минус) от упомянутого значения.
[0096] Как применяют в настоящем описании, все числовые значения или числовые диапазоны включают целые числа внутри таких диапазонов, и дроби значений или целых чисел внутри диапазонов, если контекст явно не указывает на иное. Таким образом, для иллюстрации, ссылка на 80% или более идентичности включает 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% и т.д., так же как 81,1%, 81,2%, 81,3%, 81,4%, 81,5% и т.д., 82,1%, 82,2%, 82,3%, 82,4%, 82,5% и т.д., и т.д.
[0097] Ссылка на целое число с более (больше) или менее чем, включает любое количество более или менее, чем упомянутое число, соответственно. Таким образом, например, ссылка на менее, чем 100, включает 99, 98, 97 и т.д., все снижение до числа один (1); и менее, чем 10, включает 9, 8, 7 и т.д., все снижение до числа один (1).
[0098] Как применяют в настоящем описании, все числовые значения или диапазоны являются включительными. Кроме того, все числовые значения или диапазоны включают дроби значений и целые числа внутри таких диапазонов, и дроби целых чисел внутри таких диапазонов, если контекст явно не указывает на иное. Таким образом, для иллюстрации, ссылка на числовой диапазон, такой как 1-10, включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, так же как 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 и т.д., и т.д. Ссылка на диапазон 1-50, таким образом, включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и т.д., вплоть до и включая 50, так же как 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 и т.д., 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5 и т.д., и т.д.
[0099] Ссылка на серии диапазонов включает диапазоны, объединяющие значения границ различных диапазонов в сериях. Таким образом, для иллюстрации, ссылка на серии диапазонов, например, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5500-6000, 6000-7000, 7000-8000 или 8000-9000, включает диапазоны 10-50, 50-100, 100-1000, 1000-3000, 2000-4000 и т.д.
[0100] Изобретение в общем описано в настоящем описании с использованием утвердительных выражений для описания многочисленных вариантов осуществления и аспектов. Изобретение также конкретно включает варианты осуществления, в которых конкретный объект изобретения исключен, полностью или частично, такой как вещества или материалы, стадии способа и условия, протоколы или процедуры. Например, в конкретных вариантах осуществления или аспектах изобретения, материалы и/или стадии способа исключены. Таким образом, даже несмотря на то, что изобретение в общем не сформулировано в настоящем описании в отношении того, что изобретение не включает, аспекты, которые не исключены явно из изобретения, тем не менее, описаны в настоящем описании.
[0101] Описан ряд вариантов осуществления изобретения. Тем не менее, специалист в данной области, без отклонения от сущности и объема изобретения, может осуществлять различные изменения и модификации изобретения для его адаптации к различным применениям и условиям. Соответственно, следующие примеры предназначены для иллюстрации, а не для ограничения объема заявленного изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Обобщение способа
[0102] Разработан способ культивирования клеток эмбриональной почки человека 293 с лецитин:ретинол-ацилтрансферазой (HEK-LRAT) вместе с соответствующей вирусной трансдукцией RPE65 (AAV2-hRPE65v2) в клетки HEK-LRAT. За этим способом следует последующее использование белка, полученного в результате трансдукций клеток, в анализе активности изомеразы/изомерoгидролазы.
[0103] Клетки HEK-LRAT выращивают в культуре перед рассевом и позволяют расти в течение 3 суток до трансдукции. На сутки трансдукции, в одной лунке клетки подсчитывают для определения количества клеток. Необходимое количество вируса для трансдукции рассчитывают на основании количества клеток и желательной MOI. После трансдукции, клетки инкубируют в течение 1-3 суток до сбора клеток для анализа. После сбора клеток, осадки гомогенизируют в 100 мкл реакционного буфера (10 мМ BTP, pH 8,0, доведенный с использованием 10 Н HCl, 100 мМ NaCl), и концентрацию белка определяют посредством анализа Бредфорд. Объем лизата, необходимый для получения 100 мкг общего белка, рассчитывают, и конечный объем доводят до 200 мкл посредством добавления BTP (pH 8,0), NaCl, BSA, CRALBP и воды таким образом, что конечные концентрации компонентов составляют 10 мМ, 100 мМ, 0,5% и 25 мкМ, соответственно. С защитой от света с этого момента, добавляют 2 мкл полностью-транс-ретинола (подготовленного в 100% DMF), получая конечную концентрацию 5мкМ, и образцы инкубируют при 37°C в течение 2 час. Через 2 час, реакцию останавливают (гасят) посредством добавления 300 мкл 10 мМ BHT в метаноле и встряхивания в течение 1 мин. Затем образцы экстрагируют гексаном и анализируют.
Оборудование и материалы
[0104] Общее лабораторное оборудование и материалы (можно заменять эквивалентным оборудованием).
Сертифицированные пипетки Rainin, Rainin Instruments, Woburn, MA
Пипеточный дозатор, Drummond
Серологические пипетки, в индивидуальной упаковке, VWR
Микровесы, Mettler AX205DR, Mettler Instruments
pH-метр, Orion, Thermo Scientific
FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech
Инкубатор Forma 3100, Thermo Scientific
Мини-встряхиватель-смеситель, VWR
Водяная баня, VWR
Холодильник, от 2 до 8°C, Northland
Морозильник, от -35°C до -20°C, Kenmore
Морозильник, -80°C, Revco
Бокс биологической безопасности с очисткой класса II (BSC), Delta Series, Labconco
CO2-инкубатор Steri-Cycle, Thermo Scientific
Автоматический счетчик клеток Countess, Invitrogen
Предметные стекла с лунками для счета клеток Countess™, Invitrogen или эквивалентные.
Центрифуга Eppendorf 5804R
Генератор ультразвука Virsonic 100
Микроскоп Nikon Eclipse TE300
1,5 мл полипропиленовые микроампулы, VWR
15 мл полипропиленовые пробирки, VWR
50 мл полипропиленовые пробирки, VWR
4 мл флаконы из оранжевого стекла, VWR
20 мл стеклянные флаконы, VWR
40 мл флаконы из оранжевого стекла, VWR
150 мл бутыли для хранения, Corning,
96-луночные планшеты, Thermo Scientific
Скреби для клеток, Fisher
10 см чашки для культивирования клеток Nunclon, Thermo Scientific
6-луночные планшеты, Fisher
Флаконы T150 CellBind, Corning
Флаконы T75 CellBind, Corning
Программное обеспечение CellPort, Absorption Systems
Криобочка LN2, серия 2300, Custom Biogenic Systems
2 мл криогенные ампулы CryoElite, Wheaton
Вставки с 2D матричным штрих-кодом, Wheaton
70% этанол, VWR
Краситель трипановый синий 0,4%, Invitrogen
Любое дополнительное общее лабораторное оборудование
Реагенты
Примечание: замена на материалы сравнимой квалификации от различных поставщиков является приемлемой, если конкретно не указано иное.
Клетки эмбриональной почки человека 293 с лецитин:ретинол-ацилтрансферазой (HEK-LRAT)
Полностью-транс-ретинол, (синтетический, ≥95% по HPLC, кристаллический), кат. # R7632, закуплен из Sigma-Aldrich, MO;
2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол, (BHT, бутилированный гидрокситолуол), кат. # B1378-100G, Sigma-Aldrich, MO;
N,N-диметилформамид, DMF, (квалификации для HPLC, ≥99,9%), кат. # 270547-1L, Sigma-Aldrich, MO;
Метанол, MeOH, (квалификации для UHPLC), кат. # A456-4, Fisher Scientific, NJ;
Вода, dH2O, собственного производства, деионизированная и фильтрованная (0,2 мкм) с использованием системы Millipore, Millipore Corp, Milford, MA;
Среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко, DMEM, высокий уровень глюкозы, кат. #11965-092, Thermo Scientific, MA;
Пенициллин-стрептомицин-глутамин (100X), (Pen/Strep/L-Glut), кат. # 10378-016, Thermo Scientific, MA;
Эмбриональная бычья сыворотка, сертифицированная, инактивированная нагреванием, происхождения из США, кат. #10082-147, Thermo Scientific, MA;
Бластицидин-S-HCl, 10 мг/мл, кат. # A11139-03, Thermo Scientific, MA;
0,25% трипсин-ЭДТА, кат. # 25200.056, Thermo Scientific, MA;
PBS (фосфатно-солевой буфер Дульбекко, 1X), кат. # 14190-144, Thermo Scientific, MA;
ЭДТА (0,5 M), кат. # 15575-020, Thermo Scientific, MA;
37% дымящаяся соляная кислота (HCl), кат. #1003171000, Millipore;
BTP (1,3-бис[трис(гидроксиметил)метиламино]пропан), кат. #: B6755-100G, Sigma;
NaCl, кат. # 0241-2,5KG, Amresco;
BSA (альбумин, бычий сывороточный), кат. # 126579-100GM, Millipore;
Набор реагентов для анализа белка Кумасси (Бредфорд) Thermo Scientific™ Pierce™ Coomassie (Bradford) Protein Assay, кат. # 23200, Thermo Scientific;
Полноразмерный белок CRALBP человека, EyeCRO;
Рекомбинантный белок из специфического для пигментного эпителия сетчатки белка человека 65кДа (RPE65), кат. # TP310433, Origene;
Подготовка реагентов
Примечание: взвешенные количества и/или объемы растворов можно масштабировать вверх или вниз в соответствии с необходимостью.
10 мМ BHT в MeOH
40 мкМ полностью-транс-ретинол в DMF
100 мМ BTP, 10x раствор для хранения, pH 8,0
Взвесить приблизительно 282,34 мг BTP (бис-трис-пропан, M.W. 282,33) и растворить в приблизительно 9,5 мл dH2O. Довести до pH 8,0 с использованием HCl, затем довести конечный объем до 10 мл с использованием dH2O. Хранить при 4°C. Срок хранения 1 месяц.
1M NaCl, 10x раствор для хранения
Взвесить приблизительно 584,4 мг NaCl (хлорид натрия, M.W. 58,44) и растворить в приблизительно 10 мл dH2O. Хранить при 4°C. Срок хранения 1 месяц.
5% BSA, 10x раствор для хранения
Взвесить приблизительно 100,0 мг BSA и растворить в приблизительно 2 мл dH2O. Хранить при 4°C. Срок хранения 3 суток.
Реакционный буфер BTP-NaCl, 1x раствор
Объединить 1 мл 10x BTP с 1 мл 10x NaCl и 8 мл dH2O. Хорошо перемешать. Хранить при 4°C. Срок хранения 1 месяц.
Полная среда DMEM
В боксе биологической безопасности с использованием асептических способов, добавить 56,2 мл HI FBS и 5,6 мл пенициллина/стрептомицина/L-глутамина в 500 мл бутыль DMEM. Переворачивать бутыль для перемешивания. Занести в программное обеспечение CellPort в ходе получения. Срок хранения 2 недели.
Полная среда DMEM с бластицидином
В боксе биологической безопасности с использованием асептических способов, добавить 0,56 мл бластицидина в полную бутыль полной среды DMEM (или добавить бластицидин до 1:1000 в полную среду DMEM). Переворачивать бутыль для перемешивания. Занести в программное обеспечение CellPort в ходе получения. Срок хранения 2 недели.
DPBS с ЭДТА
В боксе биологической безопасности с использованием асептических способов, добавить 2,5 мл 0,5M ЭДТА в полную бутыль dPBS. Переворачивать бутыль для перемешивания. Занести в программное обеспечение CellPort в ходе получения. Срок хранения 1 месяц.
Культивирование клеток
1) Манипуляции со всеми культурами клеток следует проводить с использованием асептических способов.
2) Документация: реагенты и действия регистрируют в проверенном программном обеспечении для культивирования клеток с получением соответствующих штрих-кодов. В редких случаях недоступности программного обеспечения, регистрировать данные в лабораторном журнале до ввода в программное обеспечение.
3) Предварительно нагреть все реагенты (полную среду для роста, трипсин-ЭДТА, DPBS с ЭДТА) в водяной бане при 37°C.
4) Протереть внутреннюю часть бокса биологической безопасности 70% этанолом. Поместить все материалы, которые не чувствительны к УФ-свету, внутрь бокса и включить УФ-свет минимум на 30 минут перед началом культивирования клеток.
5) Для размораживания, выбрать ампулу и извлечь ее из промышленной криобочки с использованием программного обеспечения CellPort перед размораживанием.
6) Извлечь одну ампулу из криобочки и разморозить при 37°C в водяной бане, опрыскать ампулу EtOH перед помещением в ламинар.
7) Перенести клетки (1 мл при 1,0×10E6 клеток/мл) из ампулы в 15 мл пробирку с использованием 9 мл полной среды DMEM.
8) Осторожно перемешать клетки посредством набора в пипетку и выливания 5-10 раз.
9) Центрифугировать клетки при 1200 об./мин в течение 5 мин при комнатной температуре, отобрать жидкость и ресуспендировать в 10 мл полной среды DMEM.
10) Посеять клетки в 1 флакон Corning Cellbind T75 с использованием дополнительных 10 мл полной среды DMEM (для общего объема среды 20 мл).
11) Поместить флакон в инкубатор при 37°C и 5% CO2.
12) Пассирование:
a. Предварительно нагреть все реагенты (полную среду для роста, трипсин-ЭДТА, DPBS с ЭДТА) в водяной бане при 37°C.
b. Протереть внутреннюю часть бокса биологической безопасности 70% этанолом. Поместить все материалы, которые не чувствительны к УФ-свету, внутрь шкафа и включить УФ-свет минимум на 30 минут перед началом культивирования клеток.
c. Отобрать среду из культурального флакона.
d. Промыть клетки с использованием DPBS с ЭДТА один или два раза, в зависимости от типа клеток. Отобрать DPBS с ЭДТА из культурального флакона.
e. Добавить достаточный объем раствора трипсина (0,25%, масс./об.)-ЭДТА (1 мМ) для смачивания поверхности монослоя (1 мл для T75 и 2 мл для T150).
f. Инкубировать флакон при комнатной температуре, пока клетки не начнут открепляться.
g. Когда клетки начнут открепляться, осторожно постучать по флакону вручную для обеспечения полного открепления. Немедленно добавить свежую среду для инактивации реакции протеазы. Осторожно пипетировать вверх и вниз 5-10 раз для обеспечения полной инактивации и для диссоциации сгустков клеток.
h. Отобрать аликвоту клеток, подсчитать клетки с использованием автоматического счетчика клеток Countess™.
i. Инокулировать флакон с желательным индексом разведения или плотностью клеток (засевать флаконы T150 при 5,0×10E5).
j. Добавить достаточный объем полной среды для роста в флакон(ы) по таблице ниже:
Таблица 1. Объем среды на флакон
Размер флакона | Общий объем в флаконе (мл) |
T-25 | 5-10 |
T-75 | 18-20 |
T-150 | 25-30 |
T-175 | 30-35 |
T-225 | 35-40 |
k. Поместить флакон в инкубатор при 37°C и 5% CO2.
l. Пометить флакон(ы) с использованием штрих-кода из проверенного программного обеспечения для культивирования клеток или с использованием линии клеток, номера пассажа, даты и инициалов оператора в редких случаях, когда программное обеспечение недоступно. После 1 пассажа после размораживания, полную среду DMEM с бластицидином используют для культивирования с этого момента.
Трансдукция клеток
1) Манипуляции со всеми культурами клеток следует проводить с использованием асептических способов.
2) Документация: реагенты и действия регистрируют в проверенном программном обеспечении для культивирования клеток с получением соответствующих штрих-кодов. В редких случаях недоступности программного обеспечения, регистрировать данные в лабораторном журнале до ввода в программное обеспечение
3) Диссоциировать и подсчитать клетки, следуя стадиям в разделах 12 a-h.
4) Клетки рассевают для трансдукции в 6-луночные планшеты при 1,0×10E6 клеток/лунку (6-луночные планшеты, Corning торговый #353046, Fisher кат. #08-772-1B) или в 100 мм чашки при 1,0×10E6 клеток/чашку (100 мм чашки, Nunclon Surface, торговый #150350, Fisher кат. #12565020). Засеять достаточное количество лунок/чашек для всех трансдукций плюс 1 для подсчета.
5) Трансдукции проводят через 1 сутки после рассева.
6) На сутки трансдукции, нагреть среды, трипсин и dPBS+ЭДТА.
7) Из eQCM, открыть шаблон трансдукции, подходящий для используемого типа планшетов (шаблоны в процессе добавления в eQCM), для использования для расчетов.
8) Отобрать среду из лунки, подлежащей подсчету.
9) Добавить 0,5 мл трипсина в лунку, инкубировать 1-2 мин до освобождения клеток, затем добавить 4,5 мл dPBS для подсчета. Для 100 мм чашки, добавить 2 мл трипсина на чашку, инкубировать 1-2 мин до освобождения клеток, затем добавить 8 мл dPBS для подсчета.
10) Перенести весь раствор в 15 мл пробирку и встряхивать для обеспечения диссоциации.
11) Отобрать 10 мкл и добавить в 10 мкл трипанового синего, провести подсчет.
Пример: | клеток/мл | объем (мл) | Общее количество клеток |
1,7E+05 | 5 | 8,5E+05 |
12) Способ работы с вирусом: трансдукция 30 лунок с использованием 9 MOI и 2 векторов=3 лунки/MOI. Количество трансдукций и MOI можно менять до достижения оптимизации.
Таблица 2. Пример списка условий и номенклатуры для трансдукции
Условия | MOI | Номенклатура | Обработка (Tx) |
Условия 1 | MOI 1,0E4 | Дата-RS-1A, Дата-RS-1B, Дата-RS-1C Дата-TA-1A, Дата-TA-1B, Дата-TA-1C | Tx при 10000 гв/клетку |
Условия 2 | MOI 2,0E4 | Дата-RS-2A, Дата-RS-2B, Дата-RS-2C Дата-TA-2A, Дата-TA-2B, Дата-TA-2C | Tx при 20000 гв/клетку |
Условия 3 | MOI 4,0E4 | Дата-RS-3A, Дата-RS-3B, Дата-RS-3C Дата-TA-3A, Дата-TA-3B, Дата-TA-3C | Tx при 40000 гв/клетку |
Условия 4 | MOI 6,0E4 | Дата-RS-4A, Дата-RS-4B, Дата-RS-4C Дата-TA-4A, Дата-TA-4B, Дата-TA-4C | Tx при 60000 гв/клетку |
Условия 5 | MOI 8,0E4 | Дата-RS-5A, Дата-RS-5B, Дата-RS-5C Дата-TA-5A, Дата-TA-5B, Дата-TA-5C | Tx при 80000 гв/клетку |
Условия 6 | MOI 1,6E5 | Дата-RS-6A, Дата-RS-6B, Дата-RS-6C Дата-TA-6A, Дата-TA-6B, Дата-TA-6C | Tx при 160000 гв/клетку |
Условия 7 | MOI 3,2E5 | Дата-RS-7A, Дата-RS-7B, Дата-RS-7C Дата-TA-7A, Дата-TA-7B, Дата-TA-7C | Tx при 320000 гв/клетку |
Условия 8 | MOI 6,4E5 | Дата-RS-8A, Дата-RS-8B, Дата-RS-8C Дата-TA-8A, Дата-TA-8B, Дата-TA-8C | Tx при 640000 гв/клетку |
Условия 9 | MOI 1,28E6 | Дата-RS-9A, Дата-RS-9B, Дата-RS-9C Дата-TA-9A, Дата-TA-9B, Дата-TA-9C | Tx при 1280000 гв/клетку |
Условия 10 | Буфер для получения состава | Дата-10 (3 лунки пулированы) | QC выделения для анализа LCMS |
Условия 11 | NTC | Дата-11 (2 лунки пулированы) | Отрицательный контроль |
13) На основании подсчета клеток, можно рассчитать объем для обработки AAV:
Таблица 3. Пример объема обработанной среды, необходимой для условий на основе примера в таблице 2
Условия | MOI | Количество лунок | Необходимый объем среды AAV (мл) | Добавить 5% среды (мл) | Конечный необходимый объем среды (мл) |
Условия 1 | MOI 1,0E4 | 3 | 6 | 0,3 | 6,3 |
Условия 2 | MOI 2,0E4 | 3 | 6 | 0,3 | 6,3 |
Условия 3 | MOI 4,0E4 | 3 | 6 | 0,3 | 6,3 |
Условия 4 | MOI 6,0E4 | 3 | 6 | 0,3 | 6,3 |
Условия 5 | MOI 8,0E4 | 3 | 6 | 0,3 | 6,3 |
Условия 6 | MOI 1,6E5 | 3 | 6 | 0,3 | 6,3 |
Условия 7 | MOI 3,2E5 | 3 | 6 | 0,3 | 6,3 |
Условия 8 | MOI 6,4E5 | 3 | 6 | 0,3 | 6,3 |
Условия 9 | MOI 1,28E6 | 3 | 6 | 0,3 | 6,3 |
Таблица 4. Пример расчетов для условий в таблице 3
Условия | Подсчитанных клеток на лунку | Геномов вектора, необходимых на лунку | # лунок | Всего необходимых гв | Партия вектора # | Титр (гв/мл) | Необходимый объем AAV (мл)* | Необходимый объем AAV (мкл) |
Условия 1 | 8,50E+05 | 8,50E+09 | 3 | 2,55E+10 | RVC0164-2 | 3,50E+13 | 7,29E-04 | 0,729 |
Условия 2 | 8,50E+05 | 1,70E+10 | 3 | 5,10E+10 | RVC0164-2 | 3,50E+13 | 1,46E-03 | 1,46 |
Условия 3 | 8,50E+05 | 3,40E+10 | 3 | 1,02E+11 | RVC0164-2 | 3,50E+13 | 2,91E-03 | 2,91 |
Условия 4 | 8,50E+05 | 5,10E+10 | 3 | 1,53E+11 | RVC0164-2 | 3,50E+13 | 4,37E-03 | 4,37 |
Условия 5 | 8,50E+05 | 6,80E+10 | 3 | 2,04E+11 | RVC0164-2 | 3,50E+13 | 5,83E-03 | 5,83 |
Условия 6 | 8,50E+05 | 1,36E+11 | 3 | 4,08E+11 | RVC0164-2 | 3,50E+13 | 1,17E-02 | 11,7 |
Условия 7 | 8,50E+05 | 2,72E+11 | 3 | 8,16E+11 | RVC0164-2 | 3,50E+13 | 2,33E-02 | 23,3 |
Условия 8 | 8,50E+05 | 5,44E+11 | 3 | 1,63E+12 | RVC0164-2 | 3,50E+13 | 4,66E-02 | 46,6 |
Условия 9 | 8,50E+05 | 1,09E+12 | 3 | 3,26E+12 | RVC0164-2 | 3,50E+13 | 9,33E-02 | 93,3 |
*необходимое количество гв, деленное на титр
14) Пометить 15 или 50 мл пробирки с использованием соответствующей номенклатуры, как показано в таблице 2.
15) Получить соответствующий объем обработанной AAV среды для обеспечения всех условий плюс ~5%, следуя форматам в таблицах 3 и 4.
16) Осторожно добавить 2 мл для соответствующей обработки в каждую из помеченных лунок. Добавить пустую полную среду в 3 лунки для планшетов NTC. 10 мл среды используют в 100 мм чашках.
17) Инкубировать планшеты в течение 2,5-3 суток.
18) Перед сбором клеток, получить изображения на микроскопе, чтобы показать жизнеспособность клеток после трансдукции.
19) Осадок клеток собирают посредством интенсивной промывки с использованием 1 мл пипетки, пока все клетки не диссоциируют с планшета, переносят в 15 мл пробирку и осаждают центрифугированием (1200 об./мин в течение 5 мин), среду отбирают, и осадки клеток замораживают при -80°C до использования.
Определение концентрации белка
1) Осадки клеток ресуспендируют (если они заморожены, их размораживают посредством ресуспедирования) в 100 мкл 1x реакционного буфера BTP-NaCl и переносят в 1,5 мл пробирку.
2) Затем лизаты переносят в генератор ультразвука. Устанавливают генератор ультразвука между уровнями 10 и 11, и на дистанционное управление. Наконечник промывают водой до и после обработки ультразвуком каждого образца. Наконечник генератора ультразвука помещают в образец, и кнопку на держателе наконечника нажимают дважды для получения кратких импульсов 2 раза.
3) Подготовить разведения 1:5 и 1:10 каждого из образцов в 1x реакционном буфере BTP-NaCl.
4) Подготовить стандарты разведенного альбумина (BSA) согласно инструкциям производителя (Thermo Scientific™ Pierce™, Coomassie (Bradford) Protein Assay, кат.# 23200).
5) Следуя инструкциям производителя, пипетировать 5 мкл каждого разведения стандартного и неизвестного образца в 96-луночный планшет. Выполнять все в двух повторах.
6) Добавить 250 мкл реагента Кумасси (нагретого до комнатной температуры; получить аликвоты по 40 мл в 40 мл флаконах из оранжевого стекла, чтобы избегать повторного нагрева реагента и нагревать только аликвоты до комнатной температуры 3 раза перед получением новой аликвоты) в каждую лунку.
7) Инкубировать планшет в течение 10 минут при комнатной температуре.
8) Измерить поглощение при 595 нм или около того с использованием FLUOstar OPTIMA, использовать способ при поглощении для Bradford_ZM.
a. Открыть программу OPTIMA-control → нажать test setup (установка параметров тестирования) в верхней части окна программы → нажать test protocol (протокол тестирования) → выбрать Absorbance (поглощение) слева и выбрать способ BRADFORD_ZM → нажать edit (редактирование) → выбрать layout (загрузка) и скорректировать загрузку планшета в соответствии с тем, как загружены образцы → нажать ok для сохранения изменений.
b. Выбрать measure (измерение) в верхней части окна программы → выбрать способ BRADFORD_ZM → нажать на Plate IDs tab (таблицу ID планшета) и заполнить в IDS (ID1: наименование проекта, ID2: инициалы, ID3: дата) → нажать Start Measurement (начало измерения) для считывания планшета.
9) Сохранить прогон и открыть программное обеспечение для анализа данных OPTIMA MARS. Нажать OPEN file (открытие файла) → выбрать файл для прогона на основании ID и дважды нажать для открытия → нажать на клетку рядом с Raw Data (необработанные данные) для отображения необработанных данных результатов в решетке планшета → нажать на клетку с символом «X» электронной таблицы Excel, и файл откроется в Excel → сохранить файл и немедленно обновить его в eQCM.
10) Анализ данных:
a. Из eQCM, открыть файл необработанных данных и шаблон для анализа Бредфорд (шаблон находится в процессе добавления в eQCM).
Таблица 5. Пример шаблона для расчета стандарта по Бредфорд
Флакон | Повтор 1 (единиц) | Повтор 2 (единиц) | Повтор 1, нормализованный (единиц) | Повтор 2, нормализованный (единиц) | Среднее (единиц) | Конечная концентрация BSA (мкг/мл) | |
A | 1,666 | 1,425 | 1,177 | 0,936 | 1,056 | 2000 | |
B | 1,323 | 1,342 | 0,834 | 0,853 | 0,843 | 1500 | |
C | 1,15 | 1,138 | 0,661 | 0,649 | 0,655 | 1000 | |
D | 0,983 | 1,054 | 0,494 | 0,565 | 0,529 | 750 | |
E | 0,852 | 0,831 | 0,363 | 0,342 | 0,352 | 500 | |
F | 0,722 | 0,715 | 0,233 | 0,226 | 0,229 | 250 | |
G | 0,602 | 0,585 | 0,113 | 0,096 | 0,104 | 125 | |
H | 0,533 | 0,523 | 0,044 | 0,034 | 0,039 | 25 | |
I (нуль) | 0,494 | 0,485 | |||||
I (нуль), среднее | 0,490 |
b. Копировать необработанные значения для стандартов и вставить их значения в верхнюю таблицу в таблице «Титрование по Бредфорд» (см. таблицу 5), так чтобы они выстроились рядом со столбцом с флаконами A-H. Поскольку их обрабатывают в двух повторах, присутствует столбец для «повтора 1 и повтора 2».
c. Скопировать и вставить значение из необработанных значений для нуля (флакон для стандарта I), и вставить их в ячейки рядом с «Нуль» в таблице.
d. «Среднее для нуля» рассчитывается автоматически, так же как значения «повторы 1 и 2, нормализованные», и «средние» значения.
e. Скопировать рассчитанные средние значения и вставить их в столбец «Считывание устройства» справа от «Стандартные значения» в таблицу, помеченную «Стандартная кривая». Это приведет к автоматическому расчету стандартной кривой.
f. Вернуться к таблице «Титрование по Бредфорд» и скопировать и вставить необработанные данные для неизвестных образцов в нижнюю таблицу (см. таблицу 6) для «повтора 1 и повтора 2». «Нормализованные значения для повторов 1 и 2» и «средние значения» рассчитываются автоматически. Наименования образцов необходимо изменять для анализа.
Таблица 6. Пример шаблона для расчета концентрации белка в неизвестных образцах
Образец | Повтор 1 (единиц) | Повтор 2 (единиц) | Повтор 1, нормализованный (единиц) | Повтор 2, нормализованный (единиц) | Среднее (единиц) | Конечная концентрация BSA (мкг/мл) | Кратность разведения | Концентрация неразведенного BSA |
09-20-16-1A | 0,884 | 0,918 | 0,395 | 0,429 | 0,412 | 576,70 | 10,00 | 5 |
09-20-16-1B | 0,86 | 0,873 | 0,371 | 0,384 | 0,377 | 519,91 | 10,00 | 5 |
09-20-16-1C | 0,927 | 0,915 | 0,438 | 0,426 | 0,432 | 610,17 | 10,00 | 6 |
09-20-16-1D | 0,894 | 0,903 | 0,405 | 0,414 | 0,409 | 572,55 | 10,00 | 5 |
09-20-16-1E | 0,897 | 0,919 | 0,408 | 0,430 | 0,419 | 588,37 | 10,00 | 5 |
09-20-16-1F | 0,863 | 0,872 | 0,374 | 0,383 | 0,378 | 521,54 | 10,00 | 5 |
g. Скопировать рассчитанные средние значения и вставить их в столбец «Считывание для неизвестных образцов» справа от стандартной кривой в таблице, помеченной «Стандартная кривая». Это приведет к автоматическому расчету значений «Рассчитанная концентрация».
h. Скопировать «Рассчитанные концентрации» и вставить значение результатов в столбец «Конечная концентрация BSA» нижней таблицы (таблицы 6) в «Таблице титрования по Бредфорд». Добавить кратность разведения в соответствующую колонку, и «Неразведенные концентрации» будут рассчитаны автоматически.
i. «Save As» (сохранить как) файл для простоты локализации местоположения и присвоить ему наименование с использованием даты анализа, анализа Бредфорд и информации о проекте. Немедленно обновить файл в eQCM.
j. Добавить результаты анализа по Бредфорд в показатель Бредфорд и регистрацию использования белка для будущего использования.
k. Вернуть образцы на -80°C до использования в анализе.
Подготовка образцов для анализа
1) Из eQCM, открыть «Шаблон протокола анализа» (шаблон находится в процессе добавления в eQCM) и результаты анализа по Бредфорд.
a. Скопировать и вставить ID образцов и соответствующие концентрации белка в верхнюю таблицу из таблицы «Протокол» (Таблица 7), и «Объем белка» будет рассчитан автоматически. Добавить данные по сбору в «Данные получения образцов».
Таблица 7. Пример шаблона для расчета объема белка, необходимого для анализа активности
Источник | ID образца | Концентрация белка для хранения (мкг/мкл) | Необходимое количество (мкг) | Общий объем (мкл) | Конечная концентрация белка (мкг/мкл) | Объем белка (мкл) | Дата получения образца |
ASLP | 100 | 200 | 0,5 | ||||
ASLP | 100 | 200 | 0,5 | ||||
ASLP | 100 | 200 | 0,5 | ||||
ASLP | 100 | 200 | 0,5 | ||||
ASLP | 100 | 200 | 0,5 | ||||
ASLP | 100 | 200 | 0,5 | ||||
ASLP | 100 | 200 | 0,5 | ||||
ASLP | 100 | 200 | 0,5 | ||||
ASLP | 100 | 200 | 0,5 |
b. Скопировать и вставить ID образцов в соответствующие ячейки в таблице 8 в таблице «Протокол». Скопировать и вставить рассчитанный «Объем белка» из таблицы 7 в соответствующие ячейки в столбце «Всего мкл белка (100 мкг)» таблицы 8. «Объем H2O» будет рассчитан автоматически.
Таблица 8. Пример условий реакции для анализа. Количество повторов можно менять между анализами
# пробирки | ID образца | Всего мкл белка (100 мкг) | Объем H2O (мкл) | Объем 10x BSA (мкл) | Объем 10x реакционного буфера BTP (мкл) | Объем 10x NaCl (мкл) | Общий объем (мкл) | CRALBP* (180 мкг - 25 мкМ)(мкл) |
20 | 20 | 20 | 200 | |||||
20 | 20 | 20 | 200 | |||||
20 | 20 | 20 | 200 | |||||
20 | 20 | 20 | 200 | |||||
20 | 20 | 20 | 200 | |||||
20 | 20 | 20 | 200 | |||||
20 | 20 | 20 | 200 | |||||
20 | 20 | 20 | 200 |
c. Добавить концентрацию CRALBP, используемую в анализе, в затемненную клетку с черной рамкой ниже второй таблицы, и объемы «CRALBP* (180мкг - 25мкМ)(мкл)» будут рассчитаны автоматически в таблице.
d. Добавить числовые данные из рабочих журналов для полностью-транс-ретинола и 10 мМ BHT в метаноле в шаблон для ссылки, как только они будут получены из биоаналитической группы.
e. «Save As» (сохранить как) файл для простоты локализации местоположения и присвоить ему наименование с использованием даты, протокола анализа и информации о проекте. Немедленно обновить файл в eQCM. Распечатать копию для вставки в журнал для взятия в лабораторию.
2) Нагреть реагенты (10x BTP, 10x NaCl и 10x BSA) до комнатной температуры.
3) После подготовки шаблона, разморозить образцы и CRALBP, необходимые для анализа, при комнатной температуре. После размораживания образцов, повторно обработать их ультразвуком, следуя протоколу в разделе 7, стадии 2.
4) Пометить пробирки в соответствии с второй таблицей (Таблица 8) и добавить компоненты реакции в следующем порядке: dH2O, 10x BSA, 10x BTP, 10x NaCl, образец белка и затем CRALBP, следуя второй таблице (Таблица 8). Быстро перемешать на встряхивателе каждый компонент, за исключением белка, перед их добавлением в пробирку. Это можно проводить при свете.
5) Все с этого момента НЕОБХОДИМО проводить в темноте под тусклым желтым светом.
a. Перемешать на встряхивателе полностью-транс-ретинол, чтобы убедиться, что он хорошо перемешан, перед добавлением к образцам. Осторожно добавить 2 мкл 500 мкМ полностью-транс-ретинола в 100% DMF непосредственно в каждый образец, внимательно отслеживая наличие слишком большого остатка полностью-транс-ретинола на внешней части наконечника. Менять наконечники между образцами.
b. После добавления полностью-транс-ретинола во все образцы, быстро перемешать на встряхивателе все образцы и поместить их в инкубатор при 37°C на 2 часа (в идеале, с использованием черного штатива для пробирок для образцов).
c. Через 2 часа, реакцию останавливают добавлением 300 мкл 10 мМ BHT в метаноле, и образцы перемешивают на встряхивателе в течение 1 мин.
d. Поместить образцы в бокс и убедиться, что они хорошо защищены от света, до анализа.
Пример 2
Обобщение способа
[0105] Способ LC-MS/MS разработан для анализа 11-цис-ретинола в реакционной матрице. Образцы подготавливают с использованием LLE (жидкость-жидкостной экстракции). Аликвоту 200 мкл реакционной матрицы хорошо смешивают с 300 мкл MeOH с/10 мМ BHT (BHT: бутилированный гидрокситолуол), 20 мкл рабочих растворов STD или QC, 20 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта (500 нМ полностью-транс-ретинол-d5) и 300 мкл гексана. Образец интенсивно перемешивают на встряхивателе и центрифугируют. Верхний органический слой осторожно переносят в чистый 96-луночный планшет и выпаривают до сухости под слабым потоком N2. Образец разводят с использованием 75 мкл раствора для разведения (MeOH с/10 мМ BHT:вода, 3:2 об./об.). Анализ проводят с использованием системы UPLC-MS/MS посредством инъекции 10 мкл обработанного LLE образца. Всю подготовку образцов проводят при тусклом желтом свете.
[106] Хроматографию проводят на колонке Waters Acquity BEH C18, 1,7 мкм, 2,1×100 мм и анализируют посредством масс-спектрометрии с химической ионизацией при атмосферном давлении (APCI) в режиме определения положительных ионов. Изократические условия используют для элюции аналитов с использованием ацетонитрила:метанола:изопропилового спирта:воды (45:20:5:30, об./об./об./об.) в качестве подвижной фазы. При скорости потока 0,35 мл/мин, 11-цис-ретинол элюирует через приблизительно 8,8 минут, полностью-транс-ретинол - через приблизительно 9,6 минут, и внутренний стандарт (полностью-транс-ретинол-d5) элюирует через приблизительно 9,5 минут. Общее время анализа составляет приблизительно 11 минут. Диапазон анализа составляет 1-25 нМ для 11-цис-ретинола при использовании объема образца 200 мкл реакционной матрицы.
Оборудование
Колонка: Waters Acquity BEH C18, 1,7 мкм, 2,1×100 мм (P/N: 186002352)
Система LC-MS/MS
Масс-спектрометр Waters XEVO TQ-S
Waters Acquity UPLC
Общее лабораторное оборудование и материалы (можно заменять эквивалентным оборудованием)
Мерная стеклянная посуда, класса A
Сертифицированные пипетки Rainin, Rainin Instruments, Woburn, MA
Микровесы, Mettler AX205DR, Mettler Instruments
Встряхиватель-смеситель Multi-Max
Смеситель для планшетов Thermolyne
Холодильник, от 2 до 8°C, Revco
Морозильник, от -35°C до -20°C, Revco
Морозильник, -80oC,
Центрифуга Beckman GS-6R, или эквивалентная
Центрифуга Thermo Scientific Sorvaall T1, или эквивалентная
Испаритель, Zymark TurboVap 96, Zymark Corp., Hopkinton, MA
1,5 мл полипропиленовые микроампулы, VWR
Пробирки из боросиликатного стекла, 13×100 мм, VWR
15 мл полипропиленовые пробирки, VWR
50 мл полипропиленовые пробирки, VWR
4 мл флаконы из оранжевого стекла, VWR
96-луночные планшеты с глубокими лунками, VWR
Любое дополнительное общее лабораторное оборудование
Условия устройства
Условия LC
LC: Waters Acquity UPLC
Колонка: Waters Acquity BEH C18, 1,7 мкм, 2,1×100 мм (P/N: 186002352)
Температура колонки: 40°C
Подвижная фаза A (MPA): ацетонитрил:метанол:изопропиловый спирт:вода (45:20:5:30, об./об./об./об.)
Изократическая программа:
Время (мин) | Скорость потока (мл/мин) | %A | %B |
0,0 | 0,35 | 100 | 0 |
11,0 | 0,35 | 100 | 0 |
Скорость потока: 350 мкл/мин
Время прогона: ~ 11 минут
Периоды времени удержания: 11-цис-ретинол: ~ 8,8 мин
полностью-транс-ретинол: ~ 9,6 мин
полностью-транс-ретинол-d5 (IS): ~ 9,5 мин
Объем инъекции: 10 мкл
Температура автодозатора: ~ 2-8°C
Промывка автодозатора #1: MeCN:IPA:H2O:FA (3:3:3:0,1, об./об./об./об.)
Промывка автодозатора #2: 1% муравьиная кислота в воде
Условия MS
Примечание: параметры масс-спектрометра можно менять для различных систем
Масс-спектрометр: Waters XEVO TQ-S
Источник: APCI
Режим: мониторирование множественных реакций (MRM) с режимом определения положительных ионов
Соединение | Ион предшественника | Ион продукта | Задержка (с) | Конус (В) | CE (эВ) |
11-цис-ретинол или полностью-транс-ретинол | 269,2 | 93,1 | 0,163 | 36 | 22 |
полностью-транс-ретинол-d5 (IS) | 274,2 | 98,1 | 0,163 | 36 | 22 |
Настройки устройства:
Корона: 19 мкА
Корона: 4 кВ
Конус 12 В
Газ в конусе: 150 л/час
Газ десольватации: 300 л/час
Распыляющий газ: 4 бар (400 кПа)
Капиллярное напряжение: 3,1 кВ
Температура источника: 150°C
Температура пробы: 500°C
Газ для соударений: 0,15 мл/мин
Примечание: газ в конусе и газ десольватации представляют собой N2, в то время как газ для соударений представляет собой аргон.
Материалы
Примечание: замена на материалы сравнимой квалификации от различных поставщиков является приемлемой, если конкретно не указано иное
11-цис-ретинол, предварительно взвешенный, кат. # R252105, закуплен из Toronto Research Chemicals, Canada;
Полностью-транс-ретинол-d5, кат. # R252002, закуплен из Toronto Research Chemicals, Canada
Полностью-транс-ретинол, (синтетический, ≥95% по HPLC, кристаллический), кат. # R7632, закуплен из Sigma-Aldrich, MO;
2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол, (BHT, бутилированный гидрокситолуол), кат. # B1378-100G, Sigma-Aldrich, MO;
N,N-диметилформамид, DMF, (квалификации для HPLC, ≥99,9%), кат. # 270547-1L, Sigma-Aldrich, MO;
Гексан, (квалификации для HPLC, ≥98,5%), кат. # 293253-2L, Sigma-Aldrich, MO;
Ацетонитрил, MeCN или ACN, (квалификации для UHPLC), кат. # A955-4, Fisher Scientific, NJ;
Метанол, MeOH, (квалификации для UHPLC), кат. # A456-4, Fisher Scientific, NJ;
Изопропиловый спирт, IPA, (квалификации для HPLC), кат. # PX1838-1, EMD Millipore Co., MA;
Муравьиная кислота, FA (88%) (GR, квалификации для ACS), кат. # 0128-01, J.T. Baker, PA;
Вода, dH2O, собственного производства, деионизированная и фильтрованная (0,2 мкм) с использованием системы Millipore, Millipore Corp, Milford, MA;
Пустая реакционная матрица, подготовленная в биологической лаборатории
Подготовка реагентов
Примечание: взвешенные количества и/или объемы растворов можно масштабировать вверх или вниз в соответствии с необходимостью.
10 мМ BHT в MeOH
Взвесить приблизительно 89,04 мг BHT (бутилированный гидрокситолуол, M.W.= 220,36) и растворить в приблизительно 40,4 мл MeOH. Хранить при RT. Срок хранения 1 неделя.
Раствор для разведения (MeOH с/10 мМ BHT:вода, 3:2 об./об.)
Объединить 12 мл 10 мМ BHT в MeOH с 8 мл деионизированной воды. Хорошо перемешать. Хранить при RT. Использовать в те же сутки.
Подвижная фаза A (MPA) ацетонитрил:метанол:изопропиловый спирт:вода (45:20:5:30, об./об./об./об.)
Объединить 450 мл of MeCN, 200 мл MeOH, 50 мл IPA и 300 мл деионизированной воды. Хорошо перемешать. Хранить при комнатной температуре. Срок хранения 1 месяц.
Раствор для промывки автодозатора #1: MeCN:IPA:H2O:FA (3:3:3:0,1, об./об./об./об.)
Объединить 300 мл MeCN, 300 мл IPA, 300 мл деионизированной воды и 10 мл муравьиной кислоты. Хорошо перемешать. Хранить при комнатной температуре. Срок хранения 1 месяц.
Раствор для промывки автодозатора #2: 1% муравьиная кислота в воде (об./об.)
Объединить 10 мл муравьиной кислоты с 1000 мл деионизированной воды. Хорошо перемешать. Хранить при RT. Срок хранения 1 месяц.
Раствор для хранения 11-цис-ретинола (2,5 мМ)
При тусклом желтом свете, добавить 1,46 мл DMF в оригинальный флакон из оранжевого стекла, содержащий предварительно взвешенные 1,110 мг 11-цис-ретинола (M.W.= 286,45, чистота 94,12%). Перемешать на встряхивателе, и он легко растворится. Хранить при -80°C. Срок хранения подлежит определению.
Раствор для хранения полностью-транс-ретинола (2,5 мМ)
При тусклом желтом свете, взвесить приблизительно 2,97 мг полностью-транс-ретинола (M.W.= 286,45, чистота 99,4%) и растворить в приблизительно 4,12 мл DMF. Перемешать на встряхивателе, и он легко растворится. Хранить при -80°C. Срок хранения подлежит определению.
Раствор для хранения полностью-транс-ретинола-d5 (1 мМ)
При тусклом желтом свете, добавить 1,63 мл DMF в оригинальный флакон из оранжевого стекла, содержащий 0,5 мг полностью-транс-ретинола-d5 (M.W.= 291,48, чистота 95%). Перемешать на встряхивателе, и он легко растворится. Хранить при -80°C. Срок хранения подлежит определению.
Рабочий Раствор IS: 500 нМ полностью-транс-ретинол-d5
При тусклом желтом свете, добавить 5,0 мкл 1 мМ полностью-транс-ретинола-d5 в DMF в 10 мл раствора для разведения. Хорошо перемешать. Хранить при -80°C. Срок хранения подлежит определению.
Образец для проверки применимости системы (эквивалентный экстрагированному для среднего QC: конечный 26,7 нМ 11-цис-ретинол/133 нМ полностью-транс-ретинол-d5)
При тусклом желтом свете, в 96-луночный планшет перенести 40 мкл Рабочего Раствора QC-M (100 нМ 11-цис-ретинол в Растворе для разведения), 40 мкл Рабочего Раствора IS (500 нМ полностью-транс-ретинол-d5) и 70 мкл раствора для разведения. Хорошо перемешать.
Другой вариант: экстрагированный образец для среднего QC можно использовать в качестве «образца для проверки применимости системы».
Дозы растворов для анализов активности изомерoгидролазы
Примечание: объемы растворов можно масштабировать вверх или вниз в соответствии с необходимостью.
Всю подготовку проводят при тусклом желтом свете.
100 мкМ полностью-транс-ретинол в DMF
В 4-мл флаконе из оранжевого стекла, объединить 160 мкл 2,5 мМ полностью-транс-ретинола в DMF с 3,84 мл DMF. Хорошо перемешать.
40 мкМ полностью-транс-ретинол в DMF
В 4-мл флаконе из оранжевого стекла, объединить 64 мкл 2,5 мМ полностью-транс-ретинола в DMF с 3,94 мл DMF. Хорошо перемешать.
20 мкМ полностью-транс-ретинол в DMF
В 4-мл флаконе из оранжевого стекла, объединить 2,00 мл 40 мкМ полностью-транс-ретинола в DMF с 2,00 мл DMF. Хорошо перемешать.
10 мкМ полностью-транс-ретинол в DMF
В 4-мл флаконе из оранжевого стекла, объединить 2,00 мл 20 мкМ полностью-транс-ретинола в DMF с 2,00 мл DMF. Хорошо перемешать.
30% DMF
Объединить 6,0 мл DMF с 14 мл деионизированной воды. Хорошо перемешать. Хранить при RT. Срок хранения 1 месяц.
40 мкМ полностью-транс-ретинол в 30% DMF
В 4-мл флаконе из оранжевого стекла, объединить 64 мкл 2,5 мМ полностью-транс-ретинола в DMF с 3,94 мл 30% DMF. Хорошо перемешать.
16 мкМ полностью-транс-ретинол в 30% DMF
В 4-мл флаконе из оранжевого стекла, объединить 1,00 мл 40 мкМ полностью-транс-ретинола с 1,50 мл 30% DMF. Хорошо перемешать.
8 мкМ полностью-транс-ретинол в 30% DMF
В 4-мл флаконе из оранжевого стекла, объединить 1,00 мл 16 мкМ полностью-транс-ретинола с 1,00 мл of 30% DMF. Хорошо перемешать.
Проверка специфических реагентов
Примечание: объемы растворов можно масштабировать вверх или вниз в соответствии с необходимостью.
Рабочий стандарт и подготовка для QC
Примечание: объемы можно масштабировать в соответствии с необходимостью.
Всю подготовку проводят при тусклом желтом свете.
Подготовить набор рабочих растворов посредством серийных разведений с использованием схем, показанных в таблице ниже. Все рабочие растворы получают с использованием раствора для разведения (MeOH с/10 мМ BHT:вода, 3:2 об./об.) и хранят при -80°C.
Таблица 9. Подготовка стандарта 11-цис-ретинола и рабочих растворов для QC
STD/QC | Источник | Объем источника (мкл) | * Объем разбавителя (мкл) | Общий объем (мкл) | Конц. рабочего раствора (нМ) | Конц. в матрице (нМ) |
WS-INT1 | Раствор для хранения (2,5 мМ в DMF) | 80 | 920 мкл DMF | 1000 | 200000 | NA |
WS-INT2 | WS-INT1 | 80 | 920 мкл DMF | 1000 | 16000 | NA |
WS-INT3 | WS-INT2 | 60 | 900 мкл | 960 | 1000 | NA |
WS 1 | WS-INT3 | 250 | 750 | 1000 | 250 | 25 |
WS 2 | WS-INT3 | 200 | 800 | 1000 | 200 | 20 |
WS 3 | WS-INT3 | 150 | 850 | 1000 | 150 | 15 |
WS 4 | WS-INT3 | 100 | 900 | 1000 | 100 | 10 |
WS 5 | WS-INT3 | 75 | 925 | 1000 | 75 | 7,5 |
WS 6 | WS-INT3 | 50 | 950 | 1000 | 50 | 5 |
WS 7 | WS 2 | 100 | 900 | 1000 | 20 | 2 |
WS 8 | WS 4 | 100 | 900 | 1000 | 10 | 1 |
QC-INT1 | Раствор для хранения (2,5 мМ в DMF) | 80 | 920 мкл DMF | 1000 | 200000 | NA |
QC-INT2 | QC-INT1 | 80 | 920 мкл DMF | 1000 | 16000 | NA |
QC-INT3 | QC-INT2 | 60 | 900 мкл | 960 | 1000 | NA |
QC-H | QC-INT3 | 200 | 800 | 1000 | 200 | 20 |
QC-M | QC-INT3 | 100 | 900 | 1000 | 100 | 10 |
QC-L | QC-H | 100 | 900 | 1000 | 20 | 2 |
QC-LL | QC-M | 100 | 900 | 1000 | 10 | 1 |
* Разбавитель=Раствор для разведения=(MeOH с/5 мМ BHT):H2O, 3:2 об./об.
Применимость системы
- Применимость системы является необязательной, но рекомендованной
- Уравновесить систему UPLC-MS/MS в течение приблизительно 10 минут.
- Инъецировать образцы для проверки применимости системы (N=5).
- Рассчитать RSD (%) для RT и площади пика.
Подготовка образцов
LLE для стандарта/ образцов для QC (вся подготовка при тусклом желтом свете):
1) Добавить 20 мкл рабочего стандарта или раствора для QC в ампулы Eppendorf (1,5-мл). Добавить 20 мкл раствора для разведения к этим «нулевым» образцам.
2) Пипетировать 200 мкл реакционной матрицы.
3) Пипетировать 300 мкл MeOH с/10 мМ BHT, осторожно перемешать на встряхивателе ~ 3 секунд.
4) Добавить 20 мкл ISWS (500 нМ полностью-транс-ретинола-d5 в растворе для разведения).
5) Добавить 300 мкл гексана в каждую ампулу с образцом.
6) Закрыть крышку и интенсивно перемешивать на встряхивателе в течение ~ 5 минут, центрифугировать при 13000 об./мин в течение ~5 минут.
7) Осторожно перенести (~250 мкл) верхний органический слой в чистый 96-луночный планшет.
8) Выпарить образцы до сухости при 40°C под слабым потоком N2 с использованием TurboVap (или эквивалентного). Образцы должны высохнуть за ~30 минут. Начинать с установки потока газа на ~25.
9) Добавить 75 мкл раствора для разведения и Хорошо перемешать. Центрифугировать при 3000 об./мин в течение ~2 минут.
10) Анализировать с использованием UPLC-MS/MS посредством инъекции 10 мкл образца.
LLE для исследуемые образцов (вся подготовка при тусклом желтом свете):
a) Добавить 20 мкл раствора для разведения, 20 мкл ISWS (500 нМ полностью-транс-ретинол-d5 в растворе для разведения), и 300 мкл гексана в каждую ампулу с образцом (в 1,5-мл ампуле Eppendorf: после 2-часовой инкубации, 200 мкл образец реакционной матрицы обрабатывали 300 мкл MeOH с/10 мМ BHT для гашения реакции).
b) Затем следовать вышеуказанным стадиям 6-10 подготовки «стандарта/образцов для QC».
Обработка данных
Обработать данные с использованием программного обеспечения Waters MassLynx V4.1. Расчеты для стандартов, QC и образцов проводят с использованием отношений площади пика к внутреннему стандарту. В способе анализа используют модель квадратичной регрессии с взвешиванием 1/x2.
Критерии приемлемости
Критерии приемлемости для аналитических партий описаны ниже для проверок и для анализа образца.
Пример 3
Обобщение проверки
[0107] Квалификацию анализа активности изомерoгидролазы проводили, как описано выше, если не указано иное. Анализ сертифицировали для тестирования как лекарственной субстанции (DS), так и продукта лекарственного средства (DP), поскольку оба имеют одинаковый состав. Оценивали следующие параметры:
- Приемлемость системы и приемлемость образца
- Специфичность (отсутствие влияния буфера для получения состава)
- Линейность разведения
- Точность (внутрилабораторная воспроизводимость)
- Относительная точность
- Диапазон
Из всех описанных исследований заключили:
- Анализ активности изомерoгидролазы является специфическим, линейным, точным и воспроизводимым.
- Критерии приемлемости системы соблюдались для каждого аналитического множества.
- Диапазон от 50% до 150% номинальных концентраций для способа, множественность инфекции (MOI) 1,00E+04, 2,00E+04, 4,00E+04, 6,00E+04, 8,00E+04, 1,60E+05, 3,20E+05, 6,40E+05, 1,28E+06 AAV геномов вектора (гв) на клетку, поддерживаются линейностью, точностью и воспроизводимостью данных.
Показано, что способ является приемлемым для предназначенной для него цели.
Сокращение | Описание |
AAV2-hRPE65v2 | Номенклатура лекарственной субстанции или продукта лекарственного средства |
11cROL | 11-цис-ретинол |
CI | Доверительный интервал |
CRALBP | Клеточный связывающий ретинальдегид белок |
CV | Коэффициент изменчивости |
DP | Продукт лекарственного средства |
DS | Лекарственная субстанция |
GCV | Геометрический коэффициент изменчивости |
HEK | Эмбриональная почка человека |
IP | Внутрилабораторная воспроизводимость |
ln(RP) | Натуральный log относительной активности |
LRAT | Лецитин:ретинол-ацилтрансфераза |
MOI | Множественность инфекции |
RS | Эталонный стандарт |
СОП | Стандартная операционная процедура |
SSQ | Сумма квадратов |
STD | Эталонный стандарт (программное обеспечение PLA) |
TA | Тестируемый препарат |
UNK или UNK1 | Тестируемый препарат (программное обеспечение PLA) |
USP | Фармакопея Соединенных Штатов Америки |
гв | Геномов вектора |
Аналитический эталонный стандарт
Наименование аналитического эталонного стандарта: Лекарственная субстанция AAV2-hRPE65v2
Концентрация: 4,86e12 гв/мл
Образец (Тестируемый препарат)
Наименование образца: Лекарственная субстанция AAV2-hRPE65v2
Концентрация: 4,86e12 гв/мл
Клеточный связывающий ретинальдегид белок (CRALBP)
Наименование образца: CRALBP
3,8 мг/мл; среднее 2,675 пмоль 11cROL
Или 4,0 мг/мл; среднее 2,758 пмоль 11cROL
Поставщик: EyeCRO/Oklahoma City, OK
Клетки HEK293-LRAT
Наименование образца: Клетки HEK293-LRAT
Буфер для получения состава AAV2-hRPE65v2
Состав буфера для получения состава: 10 мМ фосфат натрия, 180 мМ хлорид натрия, 0,001% плюроник F68, pH 7,3.
ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ, ОБОБЩЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПОДТВЕРЖДЕНИЯ
[0108] Результаты для критериев приемлемости системы и приемлемости образца оценивали и регистрировали. Результаты недействительных анализов (когда критерии приемлемости системы не были соблюдены) не использовали. Только результаты принятых анализов использовали для оценки специфичности, относительной точности, воспроизводимости, диапазона и линейности разведения. Обобщение параметров, результатов и рекомендаций для подтверждения критериев приемлемости приведено в таблице 10.
Таблица 10. Обобщение параметров, результатов и рекомендаций для подтверждения
Параметр | Способ | Протокол квалификации критериев приемлемости | Результаты | Рекомендации для подтверждения критериев приемлемости |
Приемлемость системы и приемлемость образца | Отчет о результатах | Критерии приемлемости системы и приемлемости образца соблюдались для каждого аналитического множества. | Оценить результаты в отношении способа определения критериев приемлемости системы. Отчет о результатах для критериев приемлемости системы и приемлемости образца. | |
Специфичность, отсутствие влияния | Отсутствие влияния буфера для получения состава, 9 MOI (уровень 100%) | Отчет о результатах | Не наблюдали зависимости от дозы буфера для получения состава для AAV2-hRPE65v2. | По сравнению с кривой зависимости от дозы ответа, вызванного стандартом, не наблюдали ответа в зависимости от дозы для буфера для получения состава AAV2-hRPE65v2. |
Критерий угла наклона кривой для образца не соответствовал критериям приемлемости способа. | Образец буфера для получения состава AAV2-hRPE65v2 должен не соответствовать критерию угла наклона кривой для образца | |||
Оценка параллельности по PLA v3,0 отклонена из-за отсутствия подбора соответствия данных. | Образец буфера для получения состава AAV2-hRPE65v2 должен не соответствовать тесту эквивалентности: различию критериев угла наклона по PLA. Альтернативно, оценка параллельности по PLA v3.0 может быть отклонена из-за отсутствия данных для обеспечения требуемого анализа. | |||
Линейность разведения | Линейнвая кривая (AAV2-hRPE65v2, аналитический эталонный стандарт) анализа 9 MOI (1,00E+04, 2,00E+04, 4,00E+04, 6,00E+04, 8,00E+04, 1,60E+05, 3,20E+05, 6,40E+05, 1,28E+06) | Отчет о результатах | Коэффициент детерминации (R2) составлял 0,91 | Коэффициент детерминации (R2) должен составлять ≥ 0,85 |
Воспроизводимость | Внутрилабораторная воспроизводимость от аналитика-к-аналитику (аналитик 1 и аналитик 2) и от суток к суткам. | Отчет о результатах | 50%: %IP=9,5% 100%: %IP=9,9% 150%: %IP=15,5% Объединенная: %IP=11,3% |
Внутрилабораторная воспроизводимость (IP) для каждого уровня концентрации для подтверждения должна составлять ≤ 30%. |
1. Один препарат аналитического эталонного стандарта | ||||
2. Один препарат тестируемого препарата (образца) | Объединенное значение внутрилабораторной воспроизводимости (IP) для данных, полученных при трех уровнях концентраций, должно составлять ≤ 30% | |||
3. RS (100%) и TA (50%, 100% или 150%) при 9 MOI на аналитика в сутки. Аналитический эталонный стандарт использовали в качестве тестируемого препарата (образца) | ||||
Относительная точность | Аналитический эталонный стандарт использовали в качестве тестируемого препарата (образца) и тестировали при трех различных концентрациях, или трех уровнях (50%, 100%, 150%), по сравнению с эталонным стандартом, подготовленным при 100% | Отчет о результатах | 50%: % ошибка=-0,6% 100%: % ошибка=+0,3% 150%: % ошибка=+10,0% | Относительная систематическая ошибка для каждого уровня точности должна составлять -25% ≤ x ≤ +25%. |
Диапазон | Результаты для воспроизводимости, линейности разведения и относительной точности | Отчет о результатах | От 50% до 150% номинальной концентрации для способа | Регистрация диапазона, поддерживаемого данными относительной точности, внутрилабораторной воспроизводимости и линейности разведения |
1. Параметрами, не включенными в эту квалификацию, являются: воспроизводимость (повторяемость), форсированная деградация и устойчивость.
ПРИЕМЛЕМОСТЬ СИСТЕМЫ
Определение
[0109] Тестирование приемлемости системы является составной частью многих аналитических способов. Это тестирование основано на концепции, что оборудование, электроника, аналитические операции и образцы, подлежащие анализу, составляют целостную систему, которую можно оценивать таким образом. Параметры тестирования приемлемости системы, подлежащие определению для конкретной процедуры, зависят от типа процедуры, подлежащей сертификации.
Дизайн эксперимента
[0110] Проверку приемлемости системы и приемлемости образца проводили для каждого аналитического множества, как описано выше. Все статистические анализы проводили посредством Tunnell Consulting (King of Prussia, PA), и данные предоставляли в Absorption Systems для включения в отчет.
Критерии приемлемости
Результаты, обсуждение и заключения
[0111] Критерии приемлемости анализа и приемлемости образца, когда это целесообразно, соблюдались для каждого аналитического множества.
[0112] Два анализа повторяли в ходе квалификации, анализ 6 и анализ 2. Анализ 6 (внутрилабораторная воспроизводимость, аналитик 2, сутки 1, 100%) не соответствовал предопределенным критериям приемлемости по выпадающим значениям и не соответствовал предупредительному уровню по максимальному количеству выпадающих значений. Выпадающие значения, наиболее вероятно, были обусловлены отсутствием гомогенности лизата клеток, приведшей к изменчивым измерениям концентрации белка, как описано ниже.
[0113] В анализе 6, концентрация белка являлась необычно низкой для образца 12-2-16-9RS-C. В анализе одного фермента, проведенном для образца 12-2-16-9RS-C, получили необычно высокую концентрацию 11-цис-ретинола (11cROL), показывающую, что низкое считывание количества белка могло быть неточным, что вызвало добавление большего количества белка для анализа активности фермента, чем необходимо. Сходное наблюдение получено для образцов 12-02-16-6RS-A и 12-02-16-7RS-B, в которых необычно высокие концентрации белка привели к необычно низким концентрациям 11cROL. Эти образцы или точки данных перечислены в качестве выпадающих по техническим причинам значений, поскольку образцы лизата клеток могли не являться достаточно перемешанными в ходе первой стадии обработки ультразвуком перед переходом к анализу Бредфорд, что привело к неточным считываниям количества белка и таким образом, к неточному количеству белка, добавленного для анализа активности фермента. Аналитик 2 прошел повторное обучение, и анализ 6 был повторен. Повтор анализа 6 соответствовал критериям приемлемости анализа и приемлемости образца.
[0114] В ходе исследования для анализа 6, было решено повторить также анализ 2. В то время как анализ 2 (внутрилабораторная воспроизводимость, аналитик 2, сутки 1, 50%) соответствовал критериям приемлемости системы и критериям приемлемости образца, данные являлись очень высоко изменчивыми по тем же причинам, какие идентифицированы анализа 6. Аналитик 2 прошел повторное обучение, и анализ 2 был повторен. Повтор анализа 2 соответствовал критериям приемлемости анализа и приемлемости образца.
СПЕЦИФИЧНОСТЬ
Определение
[0115] Специфичность представляет собой возможность однозначной оценки ответа тестируемого препарата (TA) в присутствии компонентов, которые, как можно ожидать, присутствуют во время анализа образца. Как правило, они включают примеси, продукты деградации и матрицу образца.
Отсутствие влияния буфера для получения состава - дизайн эксперимента
[0116] Специфичность анализа применительно к отсутствию влияния оценивали посредством подготовки и анализа буфера для получения состава AAV2-hRPE65v2. Буфер для получения состава разводили с использованием таких же объемов разведения, как для эталонного стандарта, и обрабатывали сходным образом с TA для всех 9 MOI (уровень 100%).
Критерии приемлемости
Результаты, обсуждение и заключения
[0117] Кривая зависимости ответа от дозы для буфера для получения состава показана на фигуре 8. По сравнению с зависимостью от дозы ответа, вызванного аналитическим эталонным стандартом, не наблюдали зависимости ответа от дозы для буфера для получения состава AAV2-hRPE65v2. В PLA v3.0 получена оценка относительной активности, по существу нуль. Образец буфера для получения состава AAV2-hRPE65v2 не соответствовал критерию угла наклона кривой для образца. Оценка параллельности в PLA v3.0 отклонена из-за отсутствия данных для обеспечения требуемого анализа. Это позволило заключить, что способ является специфическим для AAV2-hRPE65v2.
ЛИНЕЙНОСТЬ РАЗВЕДЕНИЯ
Определение
[0118] Линейность аналитического способа доказывает возможность получения результатов тестирования, которые являются прямо пропорциональными концентрации образца.
Дизайн эксперимента
[0119] Линейность показывали в диапазоне линейной кривой, с использованием аналитического эталонного стандарта AAV2-hRPE65v2, при следующих девяти MOI; 1,00E+04, 2,00E+04, 4,00E+04, 6,00E+04, 8,00E+04, 1,60E+05, 3,20E+05, 6,40E+05 и 1,28E+06.
Критерии приемлемости
Результаты, обсуждение и заключения
[0120] Описанные критерии приемлемости соблюдались. Коэффициент детерминации (R2) составлял 0,91. Линейность разведения для анализа подтверждена на фигуре 9, поскольку 95% доверительная граница на подобранной кривой включала линию идентичности. График линейности на фигуре 9 получен из значений для 13 анализов в таблице 11, и оцененные значения относительной активности нанесены на график против соответствующих им значений целевой активности.
[0121] В таблице 11 представлена оцененная относительная активность, зарегистрированная посредством PLA v3.0, для каждого из 13 анализов с целевыми уровнями относительной активности 0,5, 1,0 или 1,5. Натуральный log относительной активности («ln(RP)») также представлен и использован в таблицах 16 и 17. Следует отметить, что все уравнения, использованные в расчетах в таблицах 11, 16 и 17, также приведены в USP<1033>. Анализ 14 (обсуждаемый в разделе 8.1 под заголовком Специфичность) не включен в этот статистический анализ в настоящем описании, поскольку образец не содержал AAV2-hRPE65v2, и в результате, как и ожидали, тесты приемлемости по PLA v3.0 невозможно было рассчитать для данных этого анализа.
[0122] В таблице 12 представлены оценки 95% доверительного интервала точка пересечения и угол наклона кривой простой линейной регрессии из фигуры 9. Термин «целевой уровень» в таблице 12 относится к оценке угла наклона кривой регрессии. Доверительный интервал (т.е. между нижними 95% - верхними 95% в таблице 12) для точки пересечения включает 0, и доверительный интервал для угла наклона включает 1, как ожидали для линейности разведения. Значение p (вероятность>|t|) для угла наклона представляет собой статистическое тестирование того, что угол наклона является равным нулю. Тот факт, что наблюдаемое значение p является очень низким (<0,0001), является убедительным доказательством того, что угол наклона не составляет нуль.
[0123] В таблице 13 представлены некоторые дополнительные выходные статистические значения, ассоциированные с подобранной кривой на фигуре 9. R-квадрат, в частности, показывает, что 91,4% изменчивости индивидуальных значений на фигуре 9 обусловлено взаимосвязью с линейностью разведения.
[0124]
Таблица 11. Оцененная относительная активность для каждого из 13 квалификационных анализов с отличными от нуля целевыми уровнями
Анализ | Аналитик | Сутки | Целевой уровень | Относительная активность (RP), зарегистрированная посредством PLA v3.0 | ln(RP) |
1 | 1 | 1 | 0,5 | 0,48255 | -0,729 |
2-повтор | 2 | 1 | 0,5 | 0,44382 | -0,812 |
3 | 1 | 2 | 0,5 | 0,52168 | -0,651 |
4 | 2 | 2 | 0,5 | 0,54563 | -0,606 |
5 | 1 | 1 | 1 | 0,97626 | -0,024 |
6-повтор | 2 | 1 | 1 | 1,01627 | 0,016 |
7 | 1 | 2 | 1 | 1,14166 | 0,132 |
8 | 2 | 2 | 1 | 1,01849 | 0,018 |
13 | 1 | 3 | 1 | 0,87834 | -0,130 |
9 | 1 | 1 | 1,5 | 1,50490 | 0,409 |
10 | 2 | 1 | 1,5 | 1,55749 | 0,443 |
11 | 1 | 2 | 1,5 | 1,54618 | 0,436 |
12 | 2 | 2 | 1,5 | 2,04510 | 0,715 |
Таблица 12. Оценки точки пересечения и угла наклона («целевого уровня») из простой линейной регрессии на фигуре 9
Оценки параметра | ||||||
Термин | Оценка | Стандартная ошибка | t-коэффициент | Вероятность>|t| | Нижние 95% | Верхние 95% |
Точка пересечения | -0,112815 | 0,115601 | -0,98 | 0,3501 | -0,367252 | 0,1416214 |
Целевой уровень | 1,1649975 | 0,107619 | 10,83 | <0,0001* | 0,9281299 | 1,4018651 |
*Выход регрессии JMP автоматически помечает любое значение p < 0,05, просто чтобы отметить статистическую значимость. В этом случае ожидают увидеть статистическую значимость, так что число с * является приемлемым. По линии «целевого уровня» оценивают угол наклона. Значение с * показывает, что угол наклона является отличным от нуля. Доверительный интервал, между нижними 95% и верхними 95%, включает 1.
Таблица 13. Обобщение статистики из простой линейной регрессии на фигуре на фигуре 9
R-квадрат | 0,914187 |
Скорректированный R-квадрат | 0,906385 |
Средняя квадратичная ошибка | 0,152196 |
Средний ответ | 1,052182 |
Наблюдений (или сумма весов) | 13 |
ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ
Определение
[0125] По руководству ICH Q2 (R1), воспроизводимость аналитического способа выражает близость схождения (степень разброса) между сериями измерений, полученных при многократном отборе образцов из одного и того же гомогенного образца в предписанных условиях. Воспроизводимость аналитического способа обычно выражают как изменчивость, стандартное отклонение или коэффициент изменчивости серий измерений.
Внутрилабораторная воспроизводимость - определение
[0126] Внутрилабораторная воспроизводимость выражает изменчивость аналитического способа внутри лаборатории для: различных суток, различных аналитиков, различного оборудования и т.д.
Внутрилабораторная воспроизводимость - дизайн эксперимента
[0127] Внутрилабораторную воспроизводимость способа определяли с использованием анализа составляющих дисперсии, как описано в общей статье <1033> USP Подтверждение биологического анализа. Аналитический эталонный стандарт AAV2-hRPE65v2 использовали в качестве образца и тестировали в трех различных диапазонах концентраций или для трех различных наборов уровней MOI: 50%, 100% и 150%.
[0128] Получение разведений MOI документировано в лабораторном журнале, поскольку необходимый объем вектора зависит от количества клеток. Шаблон для MOI при трех различных уровнях представлен в таблице 14.
Таблица 14. Обобщение MOI при 50%, 100% и 150%
MOI# | MOI для 50% диапазона | MOI для 100% диапазона | MOI для 150% диапазона |
1 | 5,00E+03 | 1,00E+04 | 1,50E+04 |
2 | 1,00E+04 | 2,00E+04 | 3,00E+04 |
3 | 2,00E+04 | 4,00E+04 | 6,00E+04 |
4 | 3,00E+04 | 6,00E+04 | 9,00E+04 |
5 | 4,00E+04 | 8,00E+04 | 1,20E+05 |
6 | 8,00E+04 | 1,60E+05 | 2,40E+05 |
7 | 1,60E+05 | 3,20E+05 | 4,80E+05 |
8 | 3,20E+05 | 6,40E+05 | 9,60E+05 |
9 | 6,40E+05 | 1,28E+06 | 1,92E+06 |
[0129] Внутрилабораторную воспроизводимость определяли по результатам анализов, которые проведены двумя различными аналитиками, в течение двух различных суток, и при трех различных уровнях точности: 50%, 100% и 150%. Аналитик два, сутки три, включено для обеспечения третьего независимого препарата, необходимого для внутрилабораторной воспроизводимости.
[0130] Аналитик 1 и аналитик 2 представляли собой двух различных аналитиков. Аналитик 2 не был представлен множеством людей.
[0131] Один препарат аналитического эталонного стандарта и один препарат образца TA (аналитический эталонный стандарт использовали в качестве образца или TA) получали на MOI на аналитика на сутки тестирования.
[0132] Аналитик 1 (или аналитик 2), подготовили аналитические RS и TA при следующих девяти MOI для уровня 100% (см. фигуру 10): 1,00E+04, 2,00E+04, 4,00E+04, 6,00E+04, 8,00E+04, 1,60E+05, 3,20E+05, 6,40E+05 и 1,28E+06. Схема планшета по умолчанию для 50% и 150% уровней MOI, представлена на фигуре 11 и фигуре 12, соответственно.
Шаблон для определения внутрилабораторной воспроизводимости представлен в таблице 15.
Таблица 15. Внутрилабораторная воспроизводимость, обобщение экспериментов при трех различных уровнях точности: 50%, 100% и 150%
Аналитик | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | ||||||||
Сутки | 1 | 2 | 1 | 2 | 31 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | |
MOI или концентрации (%) при 3 уровнях точности | 50% | X | X | X | X | |||||||||
100% | X | X | X | X | X | |||||||||
150% | X | X | X | X |
1. Аналитик 2, сутки 3, обеспечивают третий независимый препарат, необходимый для внутрилабораторной воспроизводимости.
X: Указывает, какую обработку проводил конкретный Аналитик в конкретные сутки.
Способы, как описано выше, осуществляли для анализа образцов и данных.
Критерии приемлемости
Результаты, обсуждение и заключения
[0133] Критерии приемлемости соблюдались. Внутрилабораторная воспроизводимость (IP) для целевого уровня относительной активности 0,5 (50%), 1,0 (100%) и 1,5 (150%) для каждой квалификационной концентрации составляет 9,5%, 9,9% и 15,5%, соответственно, и составляет ≤ 30%. Объединенное значение внутрилабораторной воспроизводимости (IP), обозначенное как общая оценка %GCV, по данным, полученным при трех уровнях концентрации, составляет 11,3% и составляет ≤ 30%. Результаты IP опубликованы в таблице 16 и таблице 17.
[0134] Точечные оценки и оценки 90% доверительного интервала относительной систематической ошибки представлены в последних 3 столбцах таблицы 16. Точечные оценки относительной систематической ошибки для трех целевых уровней все лежат в пределах +/- 25%, что является рекомендованным подтверждающим критерием приемлемости для относительной точности, приведенным в таблице 10. 90% доверительные интервалы включают нуль при всех трех целевых уровнях относительной активности. Таким образом, со статистической точки зрения, не присутствует доказательств ошибки при этих трех целевых уровнях. Оценки относительной систематической ошибки и ассоциированные с ними 90% доверительные интервалы показаны на фигуре 13. Все из 90% интервалов попадают в диапазон относительной систематической ошибки +/- 30%, что поддерживает (для каждого целевого уровня отдельно) статистические тесты при 95% доверительном уровне, что относительная систематическая ошибка лежит в пределах +/-30%.
[0135] Кривые зависимости от выбранной дозы по PLA 3.0 для эталонного стандарта AAV2-hRPE65v2 и тестируемого препарата для трех различных уровней (50%, 100% и 150%) для аналитика 1 и аналитика 2 показаны на фигуре 14 - фигуре 19.
Таблица 16. Оценка относительной систематической ошибки для каждого целевого уровня с использованием значений ln(RP) из таблицы 11
Целевой уровень | Средний ln(RP) | ln(RP) стандартного отклонения | 90% CI для среднего ln(RP) | Геометрическое среднее | 90% CI для геометрического среднего RP | Геометрический %CV (%GCV) | Относительная ошибка (%) (точечные оценки) | 90% CI для относительной систематической ошибки (%) | |||
0,5 | -0,699 | 0,091 | -0,81 | -0,59 | 0,50 | 0,45 | 0,55 | 9,5 | 0,6 | -10,7 | 10,6 |
1 | 0,003 | 0,094 | -0,09 | 0,08 | 1,00 | 0,92 | 1,08 | 9,9 | 0,3 | -8,4 | 8,3 |
1,5 | 0,501 | 0,144 | 0,33 | 0,64 | 1,65 | 1,39 | 1,89 | 15,5 | 10,0 | -7,1 | 26,2 |
Таблица 17. Оценка общего %GCV для всех трех целевых уровней на основании ln(RP) и целевых уровней в таблице 11
Анализ | ln(RP)-ln(целевой) |
1 | -0,036 |
2-повтор | -0,119 |
3 | 0,042 |
4 | 0,087 |
5 | -0,024 |
6-повтор | 0,016 |
7 | 0,132 |
8 | 0,018 |
13 | -0,130 |
9 | 0,003 |
10 | 0,038 |
11 | 0,030 |
12 | 0,310 |
Среднее по log шкале | 0,028 |
Стандартное отклонение по log шкале | 0,107 |
%GCV | 11,28 |
ОТНОСИТЕЛЬНАЯ ТОЧНОСТЬ
Определение
[0136] Точность аналитического способа представляет собой степень, до которой результаты теста, полученные посредством способа, согласуются с истинным значением. Точность выражает близость согласования между значением, принятым либо в качестве общепринятого истинного значения, либо в качестве принятого эталонного значения, и обнаруженного значения.
Дизайн эксперимента
[0137] Относительную точность (рассчитанную как относительная систематическая ошибка), рассчитывали при каждой концентрации, с использованием значений относительной активности, полученных при тестировании внутрилабораторной воспроизводимости.
Критерии приемлемости
Результаты, обсуждение и заключения
[0138] Критерии приемлемости соблюдались. Результаты для относительной точности приведены в таблице 16. Точечные оценки и оценки 90% доверительного интервала относительной систематической ошибки представлены в последних 3 столбцах таблицы 16.
[0139] Точечные оценки относительной систематической ошибки для каждого целевого уровня относительной активности 0,5 (50%), 1,0 (100%) и 1,5 (150%) составляют -0,6%, +0,3% и +10,0% соответственно и все лежат в пределах +/- 25% или -25% ≤ x ≤ +25%, что является рекомендованным подтверждающим критерием приемлемости для относительной точности, приведенным в таблице 10.
[0140] Все три 90% доверительных интервала включают нуль; таким образом, с статистической точки зрения, не присутствует доказательств ошибки при этих трех целевых уровнях. Оценки относительной систематической ошибки и ассоциированные с ними 90% доверительные интервалы показаны на фигуре 13. Все из 90% интервалов попадают в диапазон относительной систематической ошибки +/- 30%, что обеспечивает доказательство (для каждого целевого уровня отдельно) по двум односторонним статистическим тестам при 95% доверительном уровне, что относительная систематическая ошибка лежит в пределах +/-30%.
ДИАПАЗОН
Определение
[0141] Диапазон аналитического способа описывает между верхней и нижней концентрации, для которых показано, что аналитический способ имеет приемлемый уровень воспроизводимости, точности и линейности.
Дизайн эксперимента
[0142] Анализ и заключения, выведенные из оценки внутрилабораторной воспроизводимости, относительной точности и линейности разведения, использовали для установки диапазона, на протяжении которого можно надежно регистрировать результаты.
Критерии приемлемости
Результаты, обсуждение и заключения
[0143] Диапазон от 50% до 150% номинальных концентраций для способа, 9 MOI (1,00E+04, 2,00E+04, 4,00E+04, 6,00E+04, 8,00E+04, 1,60E+05, 3,20E+05, 6,40E+05, 1,28E+06) поддерживаются линейностью, точностью и воспроизводимостью данных. Результаты, поддерживающие этот диапазон, опубликованы в разделах Относительная точность, Внутрилабораторная воспроизводимость и Линейность разведения этого сообщения.
РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ИЗМЕНЕНИЙ АНАЛИЗА ДАННЫХ
[0144] Пределы (границы) анализа PLA и приемлемости образца повторно проверяли после квалификации анализа активности изомерoгидролазы. В таблице 18 представлена оценка тестов и пределов PLA приемлемости на основании как 13 квалификационных анализов в таблице 11, так и 4 дополнительных предквалификационных анализов (анализы 16, 19, 20 и 21), которые проводили с использованием такого же количества и уровня MOI и анализировали с использованием такого же шаблона PLA, какой использовали для квалификационных анализов.
Таблица 18. Повторная проверка пределов (границ) анализа PLA и приемлемости образца
Диапазон значений, наблюдаемых для 13 квалификационных и 4 предквалификационных тестов приемлемости анализа | Границы, принятые для квалификационных анализов | Границы, рекомендованные на основании 95% доверительной односторонней толерантной границы, для содержания 99,73% будущих значений | |||||||
Тип теста | Тест приемлемости PLA |
Мин. | Макс. | Серьезность | Нижняя | Верхняя | Серьезность | Нижняя | Верхняя |
Тесты приемлемости образца | Тест эквивалентности (различие оценок параметра): верхняя асимптота, UNK1, STD | -1,61 | 1,01 | Инф. | -2,6 | 2,6 | Отклонен | -2,8 | 2,8 |
Тест эквивалентности (различие оценок параметра): угол наклона UNK1, STD | -1,96 | 2,48 | Предупр. | -7,1 | 7,1 | Отклонен | -3,6 | 3,6 | |
Тест эквивалентности (соотношение оценок параметра): углы наклона, UNK1, STD | 0,59 | 3,69 | Инф. | 0,23 | 4,20 | Не использовали | |||
Тест эквивалентности (соотношение оценок параметра): верхняя асимптота, UNK1, STD | 0,79 | 1,14 | Инф. | 0,71 | 1,40 | Не использовали | |||
Дополнительный тест: сумма квадратов для непараллельности, UNK1, STD | 15,44 | Инф. | 22,3 | Не использовали | |||||
Тесты приемлемости анализа | Тест эквивалентности (один параметр): угол наклона, STD | 0,78 | 5,42 | Инф. | 0,23 | 9,00 | Отклонен | 0,23 | 9,00 |
Тест эквивалентности (один параметр): C-параметр нелинейной модели, STD | 4,31 | 5,00 | Предупр. | 3,9 | 5,5 | Отклонен | 3,4 | 5,9 | |
Тест эквивалентности (один параметр): верхняя асимптота, STD | 6,34 | 11,16 | Инф. | 2,8 | 13,6 | Отклонен | 3,4 | 13,6 | |
Дополнительный тест: максимальное количество выпадающих значений, STD | 2 | Предупр. | 5 | Отклонен | 5 | ||||
Дополнительный тест: минимальный R² (элемент анализа), STD | 0,84 | Инф. | 0,74 | Инф. | 0,74 | ||||
Тест эквивалентности (один параметр): угол наклона, UNK1 | 0,83 | 5,92 | Инф. | 0,23 | 9,00 | Отклонен | 0,23 | 9,00 | |
Тест эквивалентности (один параметр): верхняя асимптота, UNK1 | 5,59 | 10,64 | Инф. | 2,8 | 13,6 | Отклонен | 3,4 | 13,6 | |
Тест эквивалентности (один параметр): C-параметр нелинейной модели, UNK1 | 4,00 | 5,27 | Инф. | 3,9 | 5,5 | Не использовали | |||
Дополнительный тест: максимальное количество выпадающих значений, UNK1 | 2 | Предупр. | 5 | Отклонен | 5 | ||||
Дополнительный тест: минимальный R² (элемент анализа), UNK1 | 0,79 | Инф. | 0,74 | Инф. | 0,74 | ||||
Дополнительный тест: сумма квадратов для нелинейности, UNK1, STD | 61,73 | Инф. | 135 | Отклонен | 90 | ||||
Дополнительный тест: диапазон относительной активности (%), UNK1, ширина 90% CI по отношению к точечной оценке) | 37,81% | Инф. | 40% | Инф. | 60% | ||||
Оценка активности | Относительная активность UNK1 STD (90% CI по отношению к точечной оценке) | 82,9% | 120,7% | Инф. | Инф. | 76% | 130% |
[0145] В таблице 18 перечислены наименования 18 тестов PLA, анализированных в каждом из 17 анализов, и следующий анализ:
1. Наблюдаемые значения статистического минимума и максимума для каждой тестовой статистики
2. «Уровень серьезности» и границы для каждого теста, используемого в ходе квалификационного исследования.
3. «Уровень серьезности» и границы для каждого теста, рекомендованные на основании односторонних нижнего и верхнего 95% доверительных толерантных пределов, для содержания 99,73% будущих значений тестовой статистики.
[0146] Коды серьезности в таблице 18 дают действие, которое необходимо предпринять на основании неудачи теста:
Инф.=Только Информация и отсутствие предпринятых действий,
Предупр.=Выдача предупреждения,
Откл.= Отклонение Образца/анализа без выдачи отчета.
[0147] Из-за аналитических ошибок, анализы 2 и 6 необходимо было повторить. Они обозначены «2-повтор» и «6-повтор» в таблице 11. Исходные анализы 2 и 6 не включены в настоящую повторную проверку границ теста.
[0148] Границы (пределы) теста приемлемости, использованные в ходе квалификационного исследования, устанавливали на основании ограниченного количества предквалификационных анализов. Квалификационные данные, плюс данные из репрезентативных предквалификационных анализов, обеспечивают более богатую и more более надежную основу, из которой вытекает определение надлежащих границ теста приемлемости.
[0149] С использованием предквалификационного анализа 16, наивысшую MOI (256000) удаляли из настоящего анализа PLA для отражения протокола квалификации. Проверка наблюдаемых тестов приемлемости для этих 4 предквалификационных анализов показала, что они обладают в основном таким же распределением наблюдаемых значений тестовой статистики, как квалификационные анализы. Включение этих 4 дополнительных анализов должно приводить к более информированному и надежному решению относительно каких-либо корректировок тестов приемлемости PLA.
[0150] Все 13 квалификационных анализов и 4 дополнительных репрезентативных предквалификационных анализов соответствовали критериям квалификационного анализа и приемлемости образца в шаблоне PLA, используемом для оценки относительной активности (т.е., границ квалификации в таблице 18).
[0151] Будущие подтвержденные анализы должны удовлетворять рекомендованным тестам приемлемости, поскольку пределы тестов были основаны на 17 анализах, которые: a) не были подвержены известным аналитическим исключениям, b) имели целевые уровни относительной активности в пределах от 0,5 до 1,5 и c) имели стандартные и тестируемые образцы, происходящие из одного и того же материала, и таким образом, тестируемый образец является, по определению, приемлемым. Границы на основании толерантных границ в последних 2 столбцах представляют собой консервативные оценки пределов по PLA, которые должны обеспечивать целесообразно низкую вероятность случайной ошибки для анализа или образца просто из-за случайных колебаний данных.
[0152] Все тесты эквивалентности в таблице 18 проводят при 95% доверительном уровне с использованием 90% доверительных интервалов. Рекомендованные границы в последних 2 столбцах таблицы 18 основаны на толерантных границах ключевой значений тестовой статистики из 17 анализах. Толерантные интервалы основаны либо на наблюдаемой нижней границе, либо на наблюдаемой верхней границе 90% доверительного интервала. Для дополнительных тестов, толерантные интервалы основаны на точечных оценках соответствующего тестируемого параметра.
[0153] В условиях рекомендованных границ в таблице 18, некоторые тесты сочтены избыточными и не рекомендованы. Тесты, основанные на соотношениях параметрах, являлись дублирующими для тестов, основанных на различиях, и не имеют цели. Подобным образом, тест SSQ для непараллельности считают избыточным, поскольку эквивалентные тесты для коэффициентов Хилла и верхних асимптот уже присутствуют. Тест, основанный на C-параметре UNK, сочтен необязательным, поскольку он напрямую связан с относительной активностью UNK, подлежащим регистрации результатом анализа, контролируемым пределами приемлемости продукта.
[0154] По большей части, рекомендованные границы в таблице 18 сильно не отличаются от границ, использованных в квалификационном исследовании. Ниже следуют некоторые конкретные комментарии:
- Последние 2 теста в таблице 18 дополняют оценку относительной активности и в действительности не являются тестами приемлемости. Они, таким образом, включены только для информации.
- Не рекомендовано изменений разрешенного максимального количества выпадающих значений (5).
- Нет изменений в тесте приемлемости в анализе эквивалентности для «угла наклона». (В настоящем описании следует отметить, что в PLA используют выражение «угол наклона» для указания коэффициента Хилла, который является связанным с углом наклона профиля при EC50, но не равным ему).
- Когда односторонняя нижняя толерантная граница для статистического значения, которое должно являться строго положительным (например, угол наклона), являлась отрицательной, выбирали целесообразную положительную нижнюю границу. В качестве примера, сохранили рекомендованную нижнюю границу для угла наклона, использованную для квалификации (0,23).
- Поскольку ожидают, что эталонный и тестируемый образец имеют одинаковые верхние асимптоты, углы наклона и регрессионные R-квадраты, границы для них получали посредством объединения статистических данных для обоих типов образцов на протяжении всех 17 анализов.
ОБОБЩЕНИЕ КВАЛИФИКАЦИИ
[0155] Все описанные эксперименты соответствовали критериям приемлемости системы и приемлемости образца, описанным во всех СОП. Показано, что способ является пригодным для предназначенной для него цели.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> SPARK THERAPEUTICS, INC.
COUTO, Linda
<120> АНАЛИЗ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ВИРУСНОГО ВЕКТОРА, КОДИРУЮЩЕГО ИЗОМЕРOГИДРОЛАЗЫ
<130> 023637-0452137
<140> PCT/US2017/030254
<141> 2017-04-28
<150> 62/328,916
<151> 2016-04-28
<160> 1
<170> PatentIn версии 3.5
<210> 1
<211> 533
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ser Ile Gln Val Glu His Pro Ala Gly Gly Tyr Lys Lys Leu Phe
1 5 10 15
Glu Thr Val Glu Glu Leu Ser Ser Pro Leu Thr Ala His Val Thr Gly
20 25 30
Arg Ile Pro Leu Trp Leu Thr Gly Ser Leu Leu Arg Cys Gly Pro Gly
35 40 45
Leu Phe Glu Val Gly Ser Glu Pro Phe Tyr His Leu Phe Asp Gly Gln
50 55 60
Ala Leu Leu His Lys Phe Asp Phe Lys Glu Gly His Val Thr Tyr His
65 70 75 80
Arg Arg Phe Ile Arg Thr Asp Ala Tyr Val Arg Ala Met Thr Glu Lys
85 90 95
Arg Ile Val Ile Thr Glu Phe Gly Thr Cys Ala Phe Pro Asp Pro Cys
100 105 110
Lys Asn Ile Phe Ser Arg Phe Phe Ser Tyr Phe Arg Gly Val Glu Val
115 120 125
Thr Asp Asn Ala Leu Val Asn Val Tyr Pro Val Gly Glu Asp Tyr Tyr
130 135 140
Ala Cys Thr Glu Thr Asn Phe Ile Thr Lys Ile Asn Pro Glu Thr Leu
145 150 155 160
Glu Thr Ile Lys Gln Val Asp Leu Cys Asn Tyr Val Ser Val Asn Gly
165 170 175
Ala Thr Ala His Pro His Ile Glu Asn Asp Gly Thr Val Tyr Asn Ile
180 185 190
Gly Asn Cys Phe Gly Lys Asn Phe Ser Ile Ala Tyr Asn Ile Val Lys
195 200 205
Ile Pro Pro Leu Gln Ala Asp Lys Glu Asp Pro Ile Ser Lys Ser Glu
210 215 220
Ile Val Val Gln Phe Pro Cys Ser Asp Arg Phe Lys Pro Ser Tyr Val
225 230 235 240
His Ser Phe Gly Leu Thr Pro Asn Tyr Ile Val Phe Val Glu Thr Pro
245 250 255
Val Lys Ile Asn Leu Phe Lys Phe Leu Ser Ser Trp Ser Leu Trp Gly
260 265 270
Ala Asn Tyr Met Asp Cys Phe Glu Ser Asn Glu Thr Met Gly Val Trp
275 280 285
Leu His Ile Ala Asp Lys Lys Arg Lys Lys Tyr Leu Asn Asn Lys Tyr
290 295 300
Arg Thr Ser Pro Phe Asn Leu Phe His His Ile Asn Thr Tyr Glu Asp
305 310 315 320
Asn Gly Phe Leu Ile Val Asp Leu Cys Cys Trp Lys Gly Phe Glu Phe
325 330 335
Val Tyr Asn Tyr Leu Tyr Leu Ala Asn Leu Arg Glu Asn Trp Glu Glu
340 345 350
Val Lys Lys Asn Ala Arg Lys Ala Pro Gln Pro Glu Val Arg Arg Tyr
355 360 365
Val Leu Pro Leu Asn Ile Asp Lys Ala Asp Thr Gly Lys Asn Leu Val
370 375 380
Thr Leu Pro Asn Thr Thr Ala Thr Ala Ile Leu Cys Ser Asp Glu Thr
385 390 395 400
Ile Trp Leu Glu Pro Glu Val Leu Phe Ser Gly Pro Arg Gln Ala Phe
405 410 415
Glu Phe Pro Gln Ile Asn Tyr Gln Lys Tyr Cys Gly Lys Pro Tyr Thr
420 425 430
Tyr Ala Tyr Gly Leu Gly Leu Asn His Phe Val Pro Asp Arg Leu Cys
435 440 445
Lys Leu Asn Val Lys Thr Lys Glu Thr Trp Val Trp Gln Glu Pro Asp
450 455 460
Ser Tyr Pro Ser Glu Pro Ile Phe Val Ser His Pro Asp Ala Leu Glu
465 470 475 480
Glu Asp Asp Gly Val Val Leu Ser Val Val Val Ser Pro Gly Ala Gly
485 490 495
Gln Lys Pro Ala Tyr Leu Leu Ile Leu Asn Ala Lys Asp Leu Ser Glu
500 505 510
Val Ala Arg Ala Glu Val Glu Ile Asn Ile Pro Val Thr Phe His Gly
515 520 525
Leu Phe Lys Lys Ser
530
<---
Claims (59)
1. Способ измерения активности изомерoгидролазы, включающий:
(a) приведение клеток, экспрессирующих лецитин:ретинол-ацилтрансферазу (LRAT), в контакт с аденоассоциированным вирусным (AAV) вектором, содержащим трансген, кодирующий белок изомерoгидролазу, в условиях, позволяющих трансдукцию клеток;
(b) инкубацию трансдуцированных клеток в условиях, позволяющих экспрессию кодированного белка изомерoгидролазы;
(c) сбор и лизис трансдуцированных клеток для получения экстракта, содержащего кодированный белок изомерoгидролазу;
(d) инкубацию указанного экстракта с субстратом, причем субстрат содержит полностью-транс-ретиниловый сложный эфир или предшественник полностью-транс-ретинилового сложного эфира, в течение периода времени и в условиях, обеспечивающих превращение субстрата посредством белка изомерoгидролазы в продукт реакции, причем продукт реакции содержит 11-цис-ретинол;
(e) колоночную хроматографию указанного продукта реакции с получением, таким образом, очищенного колоночной хроматографией продукта реакции; и
(f) масс-спектрометрию указанного очищенного колоночной хроматографией продукта реакции с осуществлением, таким образом, количественной оценки продукта реакции, где количество продукта реакции отражает активность изомерoгидролазы, таким образом, измерения активности изомерoгидролазы.
2. Способ по п. 1, где белок изомерoгидролаза содержит специфический для пигментного эпителия сетчатки белок, 65-кДа (RPE65).
3. Способ по п. 1, где белок изомерoгидролаза содержит специфический для пигментного эпителия сетчатки белок дикого типа, 65-кДа (RPE65).
4. Способ по п. 1, где белок изомерoгидролаза содержит вариант или мутант специфического для пигментного эпителия сетчатки белка, 65-кДа (RPE65).
5. Способ по любому из пп. 1-4, где белок изомерoгидролаза содержит специфический для пигментного эпителия сетчатки белок млекопитающего, 65-кДа (RPE65).
6. Способ по любому из пп. 1-5, где белок изомерoгидролаза содержит специфический для пигментного эпителия сетчатки белок человека, 65-кДа (RPE65).
7. Способ по любому из пп. 1-6, где клетки содержат клетки млекопитающих.
8. Способ по любому из пп. 1-7, где клетки содержат клетки человека.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где клетки содержат клетки эмбриональной почки человека (HEK) 293.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где клетки экспрессируют LRAT, стабильно или временно.
11. Способ по любому из пп. 1-10, где стадия (d) включает добавление предшественника субстрата в экстракт, где предшественник превращается в указанный субстрат посредством экспрессированной LRAT.
12. Способ по любому из пп. 1-11, где стадия (d) включает добавление клеточного связывающего ретинальдегид белка (CRALBP) и предшественника субстрата в экстракт, где предшественник превращается в указанный субстрат посредством экспрессированной LRAT.
13. Способ по п. 12, где количество добавленного CRALBP составляет между приблизительно 50 и приблизительно 500 мкг.
14. Способ по любому из пп. 1-11, где клетки также стабильно или временно экспрессируют клеточный связывающий ретинальдегид белок (CRALBP).
15. Способ по любому из пп. 1-14, где предшественник содержит полностью-транс-ретинол или состоит из него.
16. Способ по п. 15, где полностью-транс-ретинол добавляют таким образом, что конечная концентрация составляет от приблизительно 1 до приблизительно 20 мМ.
17. Способ по любому из пп. 1-16, где стадию (d), (e) и/или (f) проводят в темноте, при тусклом свете или при тусклом желтом свете.
18. Способ по любому из пп. 1-17, где субстрат, предшественник или продукт реакции является нерадиоактивным.
19. Способ по любому из пп. 1-18, где период времени на стадии (d) составляет от приблизительно 30 минут до приблизительно 240 минут.
20. Способ по любому из пп. 1-19, где после стадии (d), но до стадии (e), реакцию останавливают или гасят.
21. Способ по любому из пп. 1-20, где после стадии (d), но до стадии (e), добавляют спирт.
22. Способ по любому из пп. 1-21, где стадия (d) дополнительно включает экстракцию указанного продукта реакции.
23. Способ по п. 22 где указанный продукт реакции экстрагируют органическим растворителем.
24. Способ по п. 22, где указанный продукт реакции экстрагируют гексаном.
25. Способ по любому из пп. 1-24, где любую из стадий (a)-(d) осуществляют, как указано в примере 1.
26. Способ по любому из пп. 1-24, где любую из стадий (e)-(f) осуществляют, как указано в примере 2.
27. Способ по любому из пп. 1-26, где аденоассоциированный вирусный (AAV) вектор содержит белковую последовательность капсида или последовательность инвертированного концевого повтора, имеющие 70% или более идентичности последовательности с белковой последовательностью капсида или с последовательностью инвертированного концевого повтора любого серотипа, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 и AAV10.
28. Способ по любому из пп. 1-26, где аденоассоциированный вирусный (AAV) вектор содержит белок капсида или инвертированный концевой повтор из любого серотипа, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10.
29. Способ по любому из пп. 1-28, где (a) приведение клеток в контакт проводят с количеством от приблизительно 500 до приблизительно 5 миллионов частиц вектора AAV/клетку.
30. Способ по любому из пп. 1-28, где (a) приведение клеток в контакт проводят с количеством от приблизительно 1000 до приблизительно 1000000 частиц вектора AAV/клетку.
31. Способ по любому из пп. 1-28, где (a) приведение клеток в контакт проводят с количеством от приблизительно 2000 до приблизительно 500000 частиц вектора AAV/клетку.
32. Способ по любому из пп. 1-28, где (b) инкубация трансдуцированных клеток происходит в течение периода времени от приблизительно 6 часов до приблизительно 96 часов.
33. Способ по любому из пп. 1-28, где лизис трансдуцированных клеток из (c) проводят посредством замораживания-размораживания, обработки ультразвуком или их комбинации.
34. Способ по любому из пп. 1-28, где определяют общее количество клеточного белка, полученного после стадии (c).
35. Способ по любому из пп. 1-28, где общее количество клеточного белка, полученного после стадии (c), определяют посредством анализа Бредфорд.
36. Способ по любому из пп. 1-28, где предшественник смешивают с 10-100% раствором DMF.
37. Способ по любому из пп. 1-28, где после сбора клеток, но до лизиса (c), собранные клетки ресуспендируют в буфере.
38. Способ по любому из пп. 1-28, где после лизиса (c) трансдуцированных клеток для получения экстракта, экстракт разводят в буфере.
39. Способ по п. 37 или 38, где буфер представляет собой солевой буфер.
40. Способ по п. 37 или 38, где буфер представляет собой буфер NaCl.
41. Способ по любому из пп. 1-28, где указанный экстракт, полученный на стадии (c), включает от приблизительно 10 мкг до приблизительно 2000 мкг общего клеточного белка, или его доводят до от приблизительно 10 мкг до приблизительно 2000 мкг общего белка.
42. Способ по любому из пп. 1-28, где указанный экстракт, полученный на стадии (c), включает от приблизительно 50 мкг до приблизительно 750 мкг общего клеточного белка, или его доводят до от приблизительно 50 мкг до приблизительно 750 мкг общего белка.
43. Способ по любому из пп. 1-28, где указанная инкубация (d) происходит при температуре от приблизительно 30 до приблизительно 40°C.
44. Способ по любому из пп. 1-28, где колоночная хроматография отделяет 11-цис-ретинол от 9-цис-ретинола и/или отделяет 11-цис-ретинол от 13-цис-ретинола.
45. Способ по любому из пп. 1-28, где колоночная хроматография включает обращеннофазовую хроматографию.
46. Способ по любому из пп. 1-28, где колоночная хроматография включает обращеннофазовую стационарную фазу.
47. Способ по п. 46, где стационарная фаза содержит цепь C18.
48. Способ по п. 46, где стационарная фаза содержит гидрофильную группу.
49. Способ по п. 46, где гидрофильная группа содержит карбаматную группу.
50. Способ по п. 46, где стационарная фаза содержит гидрофильную карбаматную группу в цепи C18.
51. Способ по п. 46, где стационарная фаза содержит силилкарбаматную группу.
52. Способ по любому из пп. 1-51, где способ является линейным от приблизительно 1х104 до приблизительно 2х106 геномов вектора AAV на клетку.
53. Способ по любому из пп. 1-52, где коэффициент детерминации (R2) составляет более, чем приблизительно 0,85.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662328916P | 2016-04-28 | 2016-04-28 | |
US62/328,916 | 2016-04-28 | ||
PCT/US2017/030254 WO2017190081A1 (en) | 2016-04-28 | 2017-04-28 | Relative potency assay for viral vector encoding isomerhydrolases |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2018141675A RU2018141675A (ru) | 2020-05-29 |
RU2018141675A3 RU2018141675A3 (ru) | 2020-09-14 |
RU2756403C2 true RU2756403C2 (ru) | 2021-09-30 |
Family
ID=60161213
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018141675A RU2756403C2 (ru) | 2016-04-28 | 2017-04-28 | Анализ относительной активности вирусного вектора, кодирующего изомерогидролазы |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210348210A1 (ru) |
EP (1) | EP3448371A4 (ru) |
JP (1) | JP7067843B2 (ru) |
KR (2) | KR20190020661A (ru) |
CN (1) | CN109689033A (ru) |
AU (2) | AU2017258776B2 (ru) |
BR (1) | BR112018072268A2 (ru) |
CA (1) | CA3022386A1 (ru) |
CL (1) | CL2018003079A1 (ru) |
CO (1) | CO2018012509A2 (ru) |
IL (1) | IL262583B2 (ru) |
MX (1) | MX2018013205A (ru) |
MY (1) | MY194096A (ru) |
PE (1) | PE20190393A1 (ru) |
PH (1) | PH12018502291A1 (ru) |
RU (1) | RU2756403C2 (ru) |
SG (1) | SG11201809388SA (ru) |
WO (1) | WO2017190081A1 (ru) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20240060989A1 (en) | 2019-10-04 | 2024-02-22 | Novartis Ag | Methods for measuring cralbp activity |
WO2023099793A1 (en) * | 2021-12-03 | 2023-06-08 | Dsm Ip Assets B.V. | Novel compositions comprising retinoids |
KR20240119087A (ko) * | 2021-12-03 | 2024-08-06 | 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. | 트랜스 레티놀을 포함하는 신규한 조성물 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU873121A1 (ru) * | 1979-08-20 | 1981-10-15 | Институт биохимии АН ЛитССР | Способ определени активности гидролаз |
US20140357611A1 (en) * | 2009-12-08 | 2014-12-04 | Case Western Reserve University | Compounds and methods of treating ocular disorders |
WO2016018816A1 (en) * | 2014-07-31 | 2016-02-04 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | High isomerohydrolase activity mutants of mammalian rpe65 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3589469B2 (ja) * | 1996-09-27 | 2004-11-17 | ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ | レチノイン酸の皮膚に対する効果と類似の効果を有する化合物の組合せを含有するスキンケア組成物 |
US6071410A (en) * | 1998-11-16 | 2000-06-06 | Varian, Inc. | Recovery of organic solutes from aqueous solutions |
CN1997359A (zh) * | 2004-02-17 | 2007-07-11 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 包括黄斑变性在内的眼科疾病的处理 |
IN2012DN09335A (ru) * | 2004-06-18 | 2015-08-21 | Univ Washington | |
US20080249042A1 (en) * | 2004-09-09 | 2008-10-09 | University Of Washington | All-Trans-Retinol: All-Trans-13,14-Dihydroretinol Saturase and Methods of Its Use |
WO2011034551A2 (en) * | 2009-09-15 | 2011-03-24 | Qlt Inc. | Pharmaceutical formulations comprising 9-cis-retinyl esters in a lipid vehicle |
US11136557B2 (en) * | 2013-05-31 | 2021-10-05 | The Regents Of The University Of California | Adeno-associated virus variants and methods of use thereof |
WO2015184453A1 (en) | 2014-05-30 | 2015-12-03 | Case Western Reserve University | Retinylamine derivitives for treatment of ocular disorders |
GB201502137D0 (en) * | 2015-02-09 | 2015-03-25 | Ucl Business Plc | Treatment |
-
2017
- 2017-04-28 RU RU2018141675A patent/RU2756403C2/ru active
- 2017-04-28 MY MYPI2018001807A patent/MY194096A/en unknown
- 2017-04-28 KR KR1020187034586A patent/KR20190020661A/ko not_active IP Right Cessation
- 2017-04-28 AU AU2017258776A patent/AU2017258776B2/en active Active
- 2017-04-28 CN CN201780040688.8A patent/CN109689033A/zh active Pending
- 2017-04-28 CA CA3022386A patent/CA3022386A1/en active Pending
- 2017-04-28 BR BR112018072268-5A patent/BR112018072268A2/pt active Search and Examination
- 2017-04-28 PE PE2018002238A patent/PE20190393A1/es unknown
- 2017-04-28 MX MX2018013205A patent/MX2018013205A/es unknown
- 2017-04-28 US US16/096,673 patent/US20210348210A1/en active Pending
- 2017-04-28 WO PCT/US2017/030254 patent/WO2017190081A1/en active Application Filing
- 2017-04-28 KR KR1020247019006A patent/KR20240096795A/ko unknown
- 2017-04-28 IL IL262583A patent/IL262583B2/en unknown
- 2017-04-28 JP JP2018555878A patent/JP7067843B2/ja active Active
- 2017-04-28 SG SG11201809388SA patent/SG11201809388SA/en unknown
- 2017-04-28 EP EP17790597.3A patent/EP3448371A4/en active Pending
-
2018
- 2018-10-26 PH PH12018502291A patent/PH12018502291A1/en unknown
- 2018-10-29 CL CL2018003079A patent/CL2018003079A1/es unknown
- 2018-11-22 CO CONC2018/0012509A patent/CO2018012509A2/es unknown
-
2023
- 2023-06-22 AU AU2023203939A patent/AU2023203939A1/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU873121A1 (ru) * | 1979-08-20 | 1981-10-15 | Институт биохимии АН ЛитССР | Способ определени активности гидролаз |
US20140357611A1 (en) * | 2009-12-08 | 2014-12-04 | Case Western Reserve University | Compounds and methods of treating ocular disorders |
WO2016018816A1 (en) * | 2014-07-31 | 2016-02-04 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | High isomerohydrolase activity mutants of mammalian rpe65 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
KISER P.D. et al. Key enzymes of the retinoid (visual) cycle in vertebrate retina, Biochim Biophys Acta., 2012, Vol.1821, N1, pp.137-151. * |
MOISEYEV G. et al. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle, Proc Natl Acad Sci USA, 2005, Vol.102, N35, pp.12413-12418. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20190020661A (ko) | 2019-03-04 |
RU2018141675A (ru) | 2020-05-29 |
IL262583B2 (en) | 2023-10-01 |
US20210348210A1 (en) | 2021-11-11 |
RU2018141675A3 (ru) | 2020-09-14 |
MY194096A (en) | 2022-11-11 |
CA3022386A1 (en) | 2017-11-02 |
EP3448371A4 (en) | 2019-09-11 |
AU2017258776A1 (en) | 2018-11-29 |
BR112018072268A2 (pt) | 2019-02-12 |
EP3448371A1 (en) | 2019-03-06 |
CL2018003079A1 (es) | 2019-03-29 |
JP7067843B2 (ja) | 2022-05-16 |
KR20240096795A (ko) | 2024-06-26 |
SG11201809388SA (en) | 2018-11-29 |
IL262583A (en) | 2018-12-31 |
MX2018013205A (es) | 2019-06-24 |
PE20190393A1 (es) | 2019-03-13 |
AU2017258776B2 (en) | 2023-07-13 |
PH12018502291A1 (en) | 2019-07-08 |
CO2018012509A2 (es) | 2019-04-30 |
WO2017190081A1 (en) | 2017-11-02 |
JP2019514375A (ja) | 2019-06-06 |
CN109689033A (zh) | 2019-04-26 |
AU2023203939A1 (en) | 2023-09-14 |
IL262583B1 (en) | 2023-06-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2705249C2 (ru) | Вектор aav и анализ на нейтрализующие антитела против aav (аденоассоциированного вируса) | |
EP3497207B1 (en) | Methods for detecting aav | |
Mueller et al. | Production and discovery of novel recombinant adeno‐associated viral vectors | |
Grieger et al. | Production and characterization of adeno-associated viral vectors | |
AU2023203939A1 (en) | Relative potency assay for viral vector encoding isomerohydrolases | |
Tustian et al. | Assessment of quality attributes for adeno‐associated viral vectors | |
US20220011308A1 (en) | In vitro assay for detecting enhancers and inhibitors of adeno associated virus (aav) vector transduction and/or detecting or quantitating anti-aav binding antibodies | |
Ramsey et al. | Overview of analytics needed to support a robust gene therapy manufacturing process | |
Kontogiannis et al. | Characterisation of AAV Vectors: A Review of Analytical Techniques and Critical Quality Attributes | |
US12123880B2 (en) | Methods for detecting AAV | |
Aucoin | Characterization and optimization of the production of adeno-associated viral vectors using a baculovirus expression vector/insect cell system |