CN109689033A - 病毒载体编码异构水解醇的相对效力测定 - Google Patents

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Abstract

提供了用于测定异构水解酶蛋白的功能和/或活性和/或效力的方法。

Description

病毒载体编码异构水解醇的相对效力测定
相关申请
本申请要求于2016年4月28日提交的美国临时专利申请No.62/328,916的优先权。前述申请的包括所有文本、表格、序列表和附图在内的全部内容通过引用并入本文。
引言
异构水解酶(isomerohydrolase)活性或效力可以通过定量由这些酶产生的反应产物来测量。本发明涉及测量异构水解酶活性和/或效力。
发明内容
本发明提供了用于测量和/或检测异构水解酶(isomerohydrolase)活性的方法。在某些实施方案中，方法包括使用非放射性异构水解酶底物或异构水解酶底物的前体，并检测通过异构水解酶转化产生的非放射性反应产物。在某些实施方案中，方法包括使用质谱法定量反应产物，从而测量和/或检测异构水解酶活性。
在特定的实施方案中，一种测量和/或检测异构水解酶活性的方法，其包括：(a)在允许细胞转导的条件下，使表达卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)的细胞(例如，真核细胞)与包含编码异构水解酶蛋白(例如，RPE65)的转基因的病毒载体(例如，腺相关病毒(AAV)载体)接触；在允许表达所编码的所述异构水解酶蛋白(例如，RPE65)的条件下孵育病毒载体转导的细胞；裂解转导的所述细胞以产生包含所编码的所述异构水解酶蛋白的提取物(例如细胞提取物)；将所述提取物(例如细胞提取物)与底物一起孵育一段时间，并在允许底物被异构水解酶蛋白转化为反应产物的条件下进行；将所述反应产物进行柱(液体)色谱法处理，从而产生柱(液体)色谱法纯化的反应产物；以及对所述柱(液体)色谱法纯化的反应产物进行质谱法处理，从而定量所述反应产物，其中所述反应产物的量反映异构水解酶活性，从而测量异构水解酶活性。
在多种实施方案中，所述异构水解酶蛋白包含视网膜色素上皮特异性蛋白65-KD(RPE65)。在多种实施方案中，所述异构水解酶蛋白包含野生型视网膜色素上皮特异性蛋白65-KD(RPE65)。在多种实施方案中，所述异构水解酶蛋白包含变体或突变体视网膜色素上皮特异性蛋白65-KD(RPE65)。在多种实施方案中，所述异构水解酶蛋白包含哺乳动物视网膜色素上皮特异性蛋白65-KD(RPE65)。在多种实施方案中，所述异构水解酶蛋白包含人视网膜色素上皮特异性蛋白65-KD(RPE65)。
在多种实施方案中，所转导的所述细胞包含哺乳动物细胞。在多种实施方案中，所转导的所述细胞包含人细胞。在多种实施方案中，所转导的所述细胞包含人胚肾(HEK)293细胞。
在多种实施方案中，所转导的所述细胞稳定或瞬时表达LRAT。在多种实施方案中，所转导的所述细胞稳定或瞬时表达CRALBP。在多种实施方案中，所转导的所述细胞稳定或瞬时表达LRAT和/或CRALBP。
在多种实施方案中，所述底物包含全反式视黄基酯。
在多种实施方案中，步骤(d)包括将所述底物的前体加入到所述提取物中，其中所述前体通过所表达的所述LRAT转化为所述底物。在多种实施方案中，步骤(d)包括向所述提取物中添加细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)和所述底物的前体，其中所述前体通过所表达的所述LRAT转化为所述底物。
在多种实施方案中，所添加的CRALBP的量介于约50和约500μg之间。
在多种实施方案中，所述前体包含全反式视黄醇或由其组成。在多种实施方案中，添加所述前体(例如所述全反式视黄醇)使得最终浓度为约1至约20mM。
在多种实施方案中，所述反应产物包含11-顺式-视黄醇或由其组成。
在多种实施方案中，步骤(d)、(e)和/或(f)在暗处、在昏暗光下或在暗黄色光下进行。
在多种实施方案中，所述底物、前体或反应产物是非放射性的。
在多种实施方案中，步骤(d)的时间为约30分钟至约240分钟。
在多种实施方案中，在步骤(d)之后但在步骤(e)之前停止或淬灭所述反应。在多种实施方案中，在步骤(d)之后但在步骤(e)之前加入醇。
在多种实施方案中，其中在步骤(d)之后但在步骤(e)之前提取所述反应产物。在多种实施方案中，其中在步骤(d)之后但在步骤(e)之前所述反应产物用有机溶剂提取，例如用己烷提取。
在多种实施方案中，所述方法的步骤(a)-(d)中的任何步骤如实施例1中所述进行。
在多种实施方案中，所述方法的步骤(e)-(f)中的任何步骤如实施例2中所述进行。
在多种实施方案中，所述腺相关病毒(AAV)载体包含衣壳蛋白序列或反向末端重复序列，所述衣壳蛋白序列或反向末端重复序列与选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAV10的任何血清型的衣壳蛋白序列或反向末端重复序列具有70％或更高的序列同一性。
在多种实施方案中，所述腺相关病毒(AAV)载体包含选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10的任何血清型的衣壳蛋白或反向末端重复序列。
在多种实施方案中，所述步骤(a)使细胞接触是使细胞与约500至约5百万个AAV载体颗粒/细胞的量接触。在多种实施方案中，所述步骤(a)使细胞接触是使细胞与约1,000至约1,000,000个AAV载体颗粒/细胞的量接触。在多种实施方案中，所述步骤(a)使细胞接触是使细胞与约2,000至约500,000个AAV载体颗粒/细胞的量接触。
在多种实施方案中，所述步骤(b)包括孵育所转导的所述细胞持续为约6小时至约96小时的时间段。
在多种实施方案中，(c)的所述裂解所转导的所述细胞是通过冻融、超声处理或其组合进行的。
在多种实施方案中，确定步骤(c)后产生的总细胞蛋白的量。在多种实施方案中，在步骤(c)之后产生的总细胞蛋白的量通过Bradford测定法确定。
在多种实施方案中，将所述前体与10-100％的DMF溶液混合。
在多种实施方案中，在收集细胞后但在步骤(c)裂解之前，将所收集的所述细胞重悬于缓冲液中。
在多种实施方案中，在步骤(c)裂解所收集的所述细胞以产生提取物后，将所述提取物稀释在缓冲液中。
在多种实施方案中，所述缓冲液是盐缓冲液。在多种实施方案中，所述缓冲液是NaCl缓冲液。
在多种实施方案中，通过步骤(c)产生的所述提取物包含约10μg至约2,000μg的总细胞蛋白或被调节到约10μg至约2,000μg的总蛋白。
在多种实施方案中，通过步骤(c)产生的所述提取物包含约50μg至约750μg的总细胞蛋白或被调节到约50μg至约750μg的总蛋白。
在多种实施方案中，其中所述步骤(d)孵育的温度为约30℃至约40℃。
在多种实施方案中，所述柱色谱法将11-顺式-视黄醇与9-顺式-视黄醇分离和/或将11-顺式-视黄醇与13-顺式-视黄醇分离。
在多种实施方案中，所述柱色谱法包括反相色谱法。在多种实施方案中，所述柱色谱法包括反相固定相。
在多种实施方案中，所述固定相包含C18链。在多种实施方案中，所述固定相包含亲水基团。在多种实施方案中，所述亲水基团包括氨基甲酸酯基团。在多种实施方案中，所述固定相包含C18链内的亲水氨基甲酸酯基团。在多种实施方案中，固定相包含甲硅烷基氨基甲酸酯基团。
在多种实施方案中，所述方法是线性的，从每个细胞约1×104至约2×106个AAV载体基因组。
在多种实施方案中，所述方法中的确定系数(R2)大于约0.85。
附图说明
图1显示了视觉循环中RPE65功能的概述。
图2总结了基于总体载体的RPE65效力测定。用己烷萃取11-顺式-视黄醇，随后通过液相色谱/质谱法分析。
图3显示了通过液相色谱法的11-顺式-视黄醇的标准曲线(上图)和洗脱轮廓。
图4显示了通过评估各种浓度来优化CRALBP和所有反式视黄醇(atROL)。在该测定中，最佳CRALBP为10μM，并且最佳的atROL为1.0μM。
图5显示了具有RPE65的总共9次测定的测定的再现性。
图6显示了随着AAV-RPE65MOI增加，11-顺式-视黄醇产生增加。评估了8种不同的MOI。BLOQ＝低于定量水平。SD＝标准偏差。CV＝系数变量。
图7显示了来自五种不同MOI的两种不同AAV-RPE65载体批次的11-顺式-视黄醇分析。
图8显示了来自测定14的AAV2-hRPE65v2参考标准(深色)和制剂缓冲液(浅色)的特异性样品的PLA3.0剂量响应曲线。
图9显示了稀释线性：符号代表表11中列出的13种测定的估计相对效力值，其针对其各自的靶效力值绘制。拟合回归线是PLA报告的相对效力(RP)v3.0＝-0.112815+1.1649975*目标水平。
图10显示了9个MOI的分析物1(或分析物2)，制备1，实施例板图，分析参考标准品与样品(测试物品)(水平100％准确度)。
图11显示了9个MOI的分析物1(或分析物2)，制备1，实施例板图，分析参考标准品与样品(测试物品)(水平50％准确度)。
图12显示了9个MOI的分析物1(或分析物2)，制备1，实施例板图，分析参考标准品与样品(测试物品)(水平150％准确度)。
图13显示了针对表11中的每个目标水平估计的相对偏差(点)及其90％置信区间。
图14显示了来自测定1的AAV2-hRPE65v2参考标准品(深色)和测试物品第1天，分析物1,50％(浅色)的PLA 3.0剂量响应曲线。
图15显示了来自测定2重复的AAV2-hRPE65v2参考标准品(深色)和测试物品第1天，分析物2，50％(浅色)的PLA3.0剂量响应曲线。
图16显示了来自测定5的AAV2-hRPE65v2参考标准品(深色)和测试物品第1天，分析物1，100％(浅色)的PLA 3.0剂量响应曲线。
图17显示了来自测定6重复的AAV2-hRPE65v2参考标准品(深色)和测试物品第1天，分析物2，100％(浅色)的PLA3.0剂量响应曲线。
图18显示了来自测定9的AAV2-hRPE65v2参考标准(深色)和测试物品第1天，分析物1，150％(浅色)的PLA 3.0剂量响应曲线。
图19显示了来自测定10的AAV2-hRPE65v2参考标准(深色)和测试物品第1天，分析物2，150％(浅色)的PLA 3.0剂量响应曲线。
具体实施方式
本发明提供了用于测量和/或检测异构水解酶蛋白活性和/或功能的方法。在各种实施方案中，所述方法是特异性的(缓冲液的非干扰性)，具有稀释线性，是准确的并且在广泛的感染复数(MOI)范围内具有精确性。例如，标称方法浓度的50％至150％的范围，感染复数(MOI)1.00E+04,2.00E+04,4.00E+04,6.00E+04,8.00E+04,1.60E+05,3.20E+05,6.40E+05,1.28E+06个载体基因组(vg)/细胞由线性、准确度和精确度数据支持。
用于测量和/或检测本文所述的异构水解酶蛋白活性和/或功能的发明方法包括对于测试药物物质(DS)和药物产品(DP)两者都合格的方法。每个分析集都满足系统适用性标准。发明方法包括显示适合于其预期目的的方法。
可用于本发明的异构水解酶核酸和蛋白序列包括类视色素(retinoid)异构水解酶，例如视网膜色素上皮特异性65kDa蛋白(RPE65)。类视色素异构水解酶，也称为全反式视黄基-棕榈酸水解酶和视黄醇异构酶以及其他同义词，参与11-顺式-视黄醇的合成。(RPE65)是脊椎动物视觉循环的酶，其负责异构水解酶活性，或将全反式视黄基酯转化为11-顺式-视黄醇(Moiseyev,et.al.2005)。全反式视黄醇(atROL)被卵磷脂：视黄醇酰基转移酶(LRAT)酯化，然后将酯呈递给RPE65以用于异构化反应(Moiseyev,et.al.2003)。
与Rpe65缺乏有关的疾病包括，例如，Leber先天性黑蒙和色素性视网膜炎(Leber’s Congenital Amaurosis and Retinitis Pigmentosa)20。
代表性的人RPE65蛋白如下：
另外的RPE65蛋白包括变体，例如WO2016018816A1中公开的那些，该专利通过引用并入本文。
术语“载体”是指小载体核酸分子、质粒、病毒(例如AAV载体)、或可以通过插入或掺入核酸来操作的其他载体。载体可用于遗传操作(即“克隆载体”)，以将多核苷酸引入/转移到细胞中，以及在细胞中转录或翻译插入的多核苷酸。“表达载体”是含有具有在宿主细胞中表达所需的必需调节区的基因或核酸序列的载体。载体核酸序列通常包含至少一个用于在细胞中增殖的复制起点和任选的其他元件，例如异构水解酶核酸序列、表达控制元件(例如，启动子、增强子)、内含子、反向末端重复序列(ITR)、可选的选择标记、多腺苷酸化信号。
AAV载体衍生自腺相关病毒。AAV载体可用作基因治疗载体，因为它们可以穿透细胞并引入核酸/遗传物质，使得核酸/遗传物质可以稳定地保持在细胞中。此外，这些病毒可以将核酸/遗传物质引入特定位点，例如19号染色体上的特定位点。由于AAV与人类的致病性疾病无关，因此AAV载体能够传递异源核酸序列(例如，治疗性蛋白和药剂)给人类患者而不引起实质性AAV发病机理或疾病。
作为载体的修饰物，例如rAAV载体，以及序列的修饰物，例如重组多核苷酸和多肽，术语“重组”意指组合物已经被以通常不在自然界中发生的方式操纵(即，工程化)。重组AAV载体的具体示例会是通常在野生型AAV基因组中不存在的核酸(例如异构水解酶)插入病毒基因组中的情形。尽管在本文提及AAV载体以及序列诸如多核苷酸时，不总是使用术语“重组”，但包括AAV载体、多核苷酸、异构水解酶等在内的重组形式明确地被包括，虽然存在任何此类省略。
通过使用分子方法从AAV基因组中移除野生型基因组，并用非天然(异源)核酸(例如编码异构水解酶的核酸)替代而由病毒(例如AAV)的野生型基因组衍生出“rAAV载体”。通常，对于AAV而言，AAV基因组中的一个或两个反向末端重复(ITR)序列保留在rAAV载体中。rAAV区别于AAV基因组，因为AAV基因组的全部或一部分已用关于AAV的基因组核酸的非天然序列(例如用编码异构水解酶的异源核酸)替代。因此，并入非天然序列将AAV定义为“重组”AAV载体，其可被称为“rAAV载体”。
重组AAV载体序列可以被包装-在本文中称为“颗粒”，其用于随后在离体、体外或体内感染(转导)细胞。当重组载体序列被衣壳化或包装到AAV颗粒中时，该颗粒也可以称为“rAAV”或“rAAV颗粒”或“rAAV病毒粒子”。这样的rAAV、rAAV颗粒和rAAV病毒体包括衣壳化或包装载体基因组的蛋白。在AAV的情况下，具体示例包括衣壳蛋白。
载体“基因组”指重组质粒序列的部分，其最终被包装或衣壳化以形成rAAV颗粒。在使用重组质粒构建或制造重组AAV载体的情况下，AAV载体基因组不包含“质粒”的不对应于重组质粒的载体基因组序列的部分。这种重组质粒的非载体基因组部分被称为“质粒骨架”，其对于质粒的克隆和扩增(其是繁殖和重组病毒生产所需的过程)而言是重要的，但其本身不被包装或衣壳化成rAAV颗粒。因此，载体“基因组”是指由rAAV包装或衣壳化的核酸。
“AAV辅助功能”涉及AAV衍生的编码序列(蛋白)，其可以被表达以提供AAV基因产物和AAV载体，其反过来起反式作用以进行增殖性的AAV复制和包装。因此，AAV辅助功能包括主要的AAV开放阅读框(ORF)、rep和cap。Rep表达产物已被证明具有许多功能，尤其包括：DNA复制的AAV起源的识别、结合和切口；DNA解旋酶活性；和来自AAV(或其他异源)启动子的转录调节。Cap表达产品(衣壳)提供必要的包装功能。AAV辅助功能用于补充反式中AAV载体基因组中缺失的AAV功能。
“AAV辅助构建体”通常是指包括从AAV载体缺失的提供AAV功能的核苷酸序列的核酸序列，该核酸序列用于例如通过对受试者进行基因治疗的方式产生用于递送感兴趣的核酸序列的转导AVV载体。AAV辅助构建体通常用于提供AAV rep和/或cap基因的瞬时表达，以补充缺失的对于AAV载体复制所必需的AAV功能。辅助构建体通常缺乏AAV ITR，既不能自我复制也不能自我包装。AAV辅助构建体可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒粒子的形式。已经描述了许多AAV辅助构建体，例如编码Rep和Cap表达产物的质粒pAAV/Ad和pIM29+45(参见，例如，Samulski et al.(1989)J.Virol.63:3822-3828；和McCarty et al.(1991)J.Virol.65:2936-2945)。已经描述了许多编码Rep和/或Cap表达产物的其他载体(参见，例如，美国专利No.5,139,941和No.6,376,237)。
术语“补充功能”是指非AAV衍生的病毒和/或细胞功能，AAV依赖于该功能进行复制。该术语包括AAV复制中所需的蛋白和RNA，包括参与激活AAV基因转录、阶段特异性AAVmRNA剪接、AAV DNA复制、Cap表达产物的合成和AAV衣壳包装的部分。基于病毒的补充功能可以衍生自任何已知的辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒(除了单纯疱疹病毒1型)和痘苗病毒。
“补充功能载体”通常是指包含提供补充功能的多核苷酸序列的核酸分子。此类序列可以在补充功能载体上，并转染到合适的宿主细胞中。补充功能载体能够通过宿主细胞维持rAAV病毒粒子的产生。补充功能载体可以是质粒、噬菌体、转座子或粘粒的形式。此外，补充功能不需要齐全的腺病毒基因。例如，据报道，不能进行DNA复制和晚期基因合成的腺病毒突变体允许AAV复制(Ito et al.,(1970)J.Gen.Virol.9:243；Ishibashi et al,(1971)Virology 45:317)。类似地，已显示E2B和E3区内的突变体支持AAV复制，表明E2B和E3区可能不涉及提供辅助功能(Carter et al.,(1983)Virology126:505)。E1区缺陷或具有缺失E4区的腺病毒不能支持AAV复制。因此，E1A和E4区似乎是AAV复制直接或间接必需的(Laughlin et al.,(1982)J.Virol.41:868；Janik et al.,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1925；Carter et al.,(1983)Virology 126:505)。其他表征的腺病毒突变体包括：E1B(Laughlin et al.,(1982)，同上；Janik et al.,(1981)，同上；Ostrove et al.,(1980)Virology104:502)；E2A(Handa et al.,(1975)J.Gen.Virol.29:239；Strauss et al.,(1976)
J.Virol.17:140；Myers et al.,(1980)J.Virol.35:665；Jay et al.,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2927；Myers et al.,(1981)J.Biol.Chem.256:567)；E2B(Carter,Adeno-Assoc iated Virus Helper Functions,in I CRC Handbook ofParvoviruses(P.Tijssen ed.,1990))；E3(Carter et al.(1983),同上)；和E4(Carter etal.(1983),同上；Carter(1995))。由在E1B编码区中具有突变的腺病毒提供的补充功能的研究产生了相互矛盾的结果，但是E1B55k可能是AAV病毒粒子产生所必需的，而E1B19k则不是(Samulski et al.,(1988)J.Virol.62:206-210)。另外，国际公开WO 97/17458和Matshushita et al.,(1998)Gene Therapy5:938-945描述了编码各种腺病毒基因的补充功能载体。示例性的补充功能载体包括腺病毒VA RNA编码区，腺病毒E4ORF6编码区，腺病毒E2A 72kD编码区，腺病毒E1A编码区和缺乏完整E1B55k编码区的腺病毒E1B区。例如，在国际公开号WO 01/83797中描述了这种补充功能载体
如本文所使用的，术语“血清型”是区别点，其用于指具有在血清学上与其它AAV血清型不同的衣壳的AAV。血清学特殊性基于与另一种AAV相比，对一种AAV缺乏抗体之间的交叉反应性来确定。此类交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的不同(例如，由于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)导致。
在传统定义下，血清型意指感兴趣的病毒已经针对对于所有现存和已表征的血清型具有特异性的血清进行了中和活性的测试，并且未发现中和感兴趣的病毒的抗体。随着更多的自然出现的病毒分离物被发现和/或衣壳突变体生成，可能存在或可能不存在与当前存在的血清型中任一种的血清学差异。因此，在新病毒(例如AAV)不具有血清学差异的情况下，这种新病毒(例如AAV)将是相应血清型的亚组或变体。在许多情况下，中和活性的血清学测试尚未对具有衣壳序列修饰的突变病毒进行，以根据传统血清型定义确定它们是否是另一种血清型。因此，为了方便和避免重复，术语“血清型”广义上是指血清学上不同的病毒(例如AAV)以及可能在给定血清型的亚群或变体内的，不是血清学上不同的病毒(例如AAV)。
rAAV载体包括任何病毒株系或血清型。作为非限制性示例，rAAV质粒或载体基因组或颗粒(衣壳蛋白)可基于任何AAV血清型，例如AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11。此类载体可以基于相同的株系或血清型(或亚组或变体)，或彼此不同。作为非限制性示例，基于一种血清型基因组的rAAV质粒或载体基因组或颗粒(衣壳)可以与包装载体的衣壳蛋白中的一种或多种相同。另外，rAAV质粒或载体基因组可以基于AAV(例如，AAV2)血清型基因组，其不同于包装载体基因组的衣壳蛋白中的一种或多种，在这种情况下，三种衣壳蛋白中的至少一种可以是例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10，AAV11或其变体。因此，rAAV载体包括与特定血清型以及混合血清型特征的基因/蛋白序列相同的基因/蛋白序列。
在各种示例性实施方案中，rAAV载体包含与一种或多种AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11衣壳蛋白具有至少70％或更多(例如，75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等)同一性的衣壳序列或由其组成。在各种示例性实施方案中，rAAV载体包含与一种或多种AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11反向末端重复序列(ITR)具有至少70％或更多(例如，75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等)的序列或由其组成。
rAAV，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11，以及变体，杂合和嵌合序列，可以使用本领域技术人员已知的重组技术构建，以包括与一个或多个功能性AAV ITR序列侧接的异源多核苷酸(异构水解酶序列)。这些载体具有一个或多个全部或部分缺失的野生型AAV基因，但保留至少一个功能性侧接ITR序列，这是将重组载体拯救、复制和包装到rAAV载体颗粒中所必需的。因此，rAAV载体基因组将包括顺式复制和包装所需的序列(例如，功能性ITR序列)。
本领域已知用于产生rAAV病毒粒子的方法。例如，使用AAV载体和AAV辅助序列进行转染，结合用AAV辅助病毒(例如腺病毒、疱疹病毒或痘苗病毒)共感染，或用重组AAV载体、AAV辅助载体和补充功能载体进行转染。用于产生rAAV病毒体的非限制性方法描述于，例如，美国专利No.6,001,650和No.6,004,797中。在重组rAAV载体产生(即细胞培养系统中的载体产生)后，rAAV病毒体可以从宿主细胞和细胞培养上清液中获得，并任选地进行纯化。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，以指称所有形式的核酸、寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。核酸包括基因组DNA、cDNA和反义DNA、以及剪接或未剪接的mRNA、rRNA、tRNA和抑制性DNA或RNA(RNAi，例如小或短发夹(sh)RNA、微RNA(miRNA)、小或短干扰(si)RNA、反式剪接RNA或反义RNA)。核酸包括天然存在的、合成的和有意修饰或改变的多核苷酸。核酸可以为单链、双链或三链的、线性或环状的，并且可以具有任何长度。在讨论核酸时，可以根据在5'至3'方向上提供序列的惯例在本文中描述具体多核苷酸的序列或结构。
“宿主细胞”表示例如微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，其可以或已经用作AAV载体质粒、AAV辅助构建体、补充功能载体或其他转移DNA的受体。这个术语包括已被转染的原始细胞的后代。因此，“宿主细胞”通常是指已用外源DNA序列转染的细胞。应理解，由于天然的、偶然的或有意的突变，在形态学或在基因组或总DNA补体方面，单亲代细胞的后代不一定与原始亲本完全相同。示例性宿主细胞包括人胚肾(HEK)细胞如HEK293细胞。
“转导细胞”是其中已引入转基因(例如，异构水解酶序列)的细胞。因此，“转导的”细胞意指在外源分子例如核酸(例如转基因)并入细胞中之后，细胞中的基因变化。“转导的”还包括其后代。细胞可以繁殖(培养)，并且表达引入的蛋白(例如，异构水解酶序列)，或者由细胞产生载体，例如rAAV。在培养细胞的情况下，可以在多个细胞传代过程中维持已插入染色体的核酸序列，例如异源核酸序列、或质粒或载体。
“细胞系”是指在适宜的培养条件下能够连续或延长生长并在体外分裂的细胞群。细胞系可以但不必然是来自单个祖细胞的克隆群。在细胞系中，在这种克隆群体的储存或转移期间以及在组织培养中的延长传代期间，核染色中会发生自发或诱导的变化。因此，源自细胞系的后代细胞可能与祖先细胞或培养物不完全相同。适用于本发明的活化方法的示例性细胞系是HEK293，例如HEK-LRAT细胞。
“表达控制元件”是指影响可操作地连接的核酸的表达的核酸序列。控制元件，包括本文所述的表达控制元件，诸如启动子和增强子，rAAV载体可包括一个或多个“表达控制元件”。通常，包括此类元件以有利于适当的异源多核苷酸转录和适当情况下的翻译(例如，启动子、增强子、内含子的剪接信号、维持基因的正确阅读框以允许mRNA的框内翻译和终止密码子等)。这些元件通常以顺式作用，其被称为“顺式作用”元件，但也可以反式作用。
表达控制可以在转录、翻译、剪接、信息稳定性等水平下实现。通常，调节转录的表达控制元件靠近转录核酸的5'端(即“上游”)并置。表达控制元件也可位于转录序列的3'末端(即“下游”)处或转录物内(例如在内含子中)。表达控制元件可以邻近或远离转录序列定位(例如，距多核苷酸1-10个、10-25个、25-50个、50-100个、100-500个或更多个核苷酸)，甚至以相当远的距离定位。然而，由于rAAV载体的长度限制，表达控制元件通常在距离转录核酸1至1000个核苷酸内。
在功能上，可操作地连接的核酸的表达至少部分地可由元件(例如启动子)控制，使得元件调节核酸的转录以及适当时调节转录物的翻译。表达控制元件的具体示例是启动子，其通常位于转录序列的5'端。与不存在启动子时表达的量相比，启动子通常增加从可操作地连接的核酸表达的量。
如本文所用的“增强子”可以指邻近核酸序列，例如可选择标记，或异源核酸序列定位的序列。增强子元件通常位于启动子元件的上游，但也在序列的下游或序列内起作用且能位于序列的下游或序列内。因此，增强子元件可位于上游或下游，例如，在可选择标记和/或编码治疗性蛋白或多核苷酸序列的异源核酸的100个碱基对、200个碱基对、或300个或更多个碱基对内。增强子元件通常使可操作连接的核酸的表达增加高于由启动子元件提供的表达。
术语“可操作地连接”是指将核酸序列表达所必需的调控序列置于相对于该序列的适当位置，以便实现核酸序列的表达。有时将相同的定义施用于表达载体(例如rAVV载体)中核酸序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)的排列。
在与核酸可操作连接的表达控制元件的示例中，所述关系使得控制元件调节核酸的表达。更具体地，例如，可操作地连接的两个DNA序列意指两个DNA以使得至少一个DNA序列能够对另一个序列施加生理效应的这样的关系(顺式或反式)排列。
因此，载体的附加元件包括但不限于表达控制(例如启动子/增强子)元件、转录终止信号或终止密码子、侧接序列(如AAV ITR序列中的一个或多个拷贝)的5'或3'非翻译区(例如聚腺苷酸化(polyA)序列)、或内含子。
其他元件包括例如填料或填充物多核苷酸序列，例如以改善包装并减少污染核酸的存在。AAV载体通常接受具有一般为约4kb至约5.2kb或略多的尺寸范围的DNA插入片段。因此，对于较短的序列而言，包含填充物或填料以便将长度调整至对于包装入rAAV颗粒的载体中而言可接受的病毒基因组序列的正常大小或接近正常大小。在各种实施方案中，填料/填充物核酸序列是核酸的未翻译(非蛋白编码)区段。对于小于4.7Kb的核酸序列，填料或填充物多核苷酸序列具有当与该序列组合(例如插入载体中)时具有介于约3.0-5.5Kb之间、或介于约4.0-5.0Kb之间、或介于约4.3-4.8Kb之间的总长度的长度。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料，但本文描述了适宜的方法和材料。
本文引用的所有申请、出版物、专利和其它参考文献、基因库(GenBank)引用和ATCC引文以参考形式全文并入。在冲突的情况下，说明书(包括定义)将起控制作用。
本文公开的所有特征可以以任何组合进行组合。说明书中公开的每个特征结构可由用于相同、等同或相似用途的另选的特征结构替代。因此，除非另有明确说明，否则公开的特征结构(例如，异构水解酶序列、载体、rAAV载体等)是具有等同或相似特征结构的示例。
如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提及“AAV载体”或“AAV颗粒”包括多个这样的AAV载体和AAV颗粒，并且提及“一细胞”或“宿主细胞”包括多个细胞和宿主细胞。
本文所用的术语“约”是指在参考值的±10％内的值。
如本文所用的，除非上下文另有明确指示，否则所有数值或数值范围包括此类范围内的整数和值后带小数的数或范围内的整数。因此，为了说明，提及80％或更多的同一性，包括81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％等，以及81.1％、81.2％、81.3％、81.4％、81.5％等，82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％等等。
提及具有更多(更大)或更少的整数分别包括大于或小于参考数值的任何数值。因此，例如，提及小于100，包括99、98、97等，一路下降到数值一(1)；并且小于10，包括9、8、7等，一路下降到数值一(1)。
如本文所使用的，所述的数值或范围都是包含端值的。此外，除非上下文另有明确指示，否则所有数值或范围包括此类范围内的值和整数后带小数的数，以及此类范围内的整数后带小数的数。因此，为了说明，提及数值范围，诸如1-10包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等等。因此提及1-50的范围包括11、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等，最多至并包括50，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等。
提及一系列范围包括将该系列内的不同范围的界限的值组合的范围。因此，为了说明提及的一系列范围，例如范围1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5500-6000、6000-7000、7000-8000、或8000-9000，包括范围10-50、50-100、100-1000、1000-3000、2000-4000等。
本文通常使用肯定语言描述多个实施方案和方面来公开本发明。本发明还具体地包括其中全部或部分排除特定主题，诸如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序的实施方案。例如，在本发明的某些实施方案或方面中，排除了材料和/或方法步骤。因此，尽管本发明在本文中一般不就本发明不包括的内容进行表达，但本发明中未明确排除的方面在本文中公开。
已经描述了本发明的多个实施方案。然而，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可对本发明进行各种改变和修改，以使其适应各种用途和条件。因此，以下实施例旨在说明而不是以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1
方案概要
已经开发了用于具有卵磷脂视黄醇酰基转移酶(HEK-LRAT)的人胚肾293细胞的细胞培养以及RPE65(AAV2-hRPE65v2)的相应病毒转导到HEK-LRAT细胞中的方案。该方案之后是随后在异构酶/异构水解酶活性测定中使用从细胞转导获得的蛋白。
HEK-LRAT细胞在铺板前在培养基中生长，并让其在转导前生长3天。在转导当天，计数一个孔的细胞以确定细胞计数。基于细胞计数和期望的MOI计算转导的病毒要求。转导后，将细胞培养1-3天，然后收获细胞用于分析。收获细胞后，将沉淀在100μl反应缓冲液(10mM BTP，用10N HCl，100mM NaCl调节的pH8.0)中匀浆，并通过Bradford测定法确定蛋白浓度。计算获得100μg总蛋白所需的裂解液体积，通过加入BTP(pH 8.0)、NaCl、BSA、CRALBP和水使最终体积达到200μl，使得组分的最终浓度分别为10mM，100mM，0.5％和25μM。从这时开始保护不受光影响，加入2μL全反式视黄醇(在100％DMF中制备)，得到5μM的终浓度，并将样品在37℃孵育2小时。2小时后，通过在甲醇中加入300μL 10mM BHT并涡旋1分钟来终止(猝灭)反应。然后用己烷萃取样品并分析。
设备和材料
一般实验室设备和材料(可替代等效设备)。
Rainin认证的移液器，Rainin Instruments,Woburn,MA
移液器电动(Pipet-aid,Drummond)
血清移液器，单独包装，VWR
微量天平，Mettler AX205DR,Mettler Instruments
pH计，Orion,Thermo Scientific
多功能酶标仪(FLUOstar OPTIMA),BMG Labtech
Forma 3100培养箱,Thermo Scientific
迷你涡旋混合器，VWR
水浴(Waterbath),VWR
冰箱,2℃至8℃Northland
冰冻机,-35℃至-20℃,Kenmore
冰冻机,,-80℃,Revco
净化器II级生物安全柜(BSC)，Delta系列，Labconco
Steri-Cycle CO2培养箱，Thermo Scientific
Countess自动细胞计数器，Invitrogen
CountessTM细胞计数室载玻片，Invitrogen，或同等物。
Eppendorf 5804R离心机
Virsonic 100超声波仪
Nikon Eclipse TE300显微镜
1.5mL聚丙烯微量瓶,VWR
15mL聚丙烯管,VWR
50mL聚丙烯管,VWR
4mL琥珀色玻璃小瓶,VWR
20mL玻璃小瓶,VWR
40mL琥珀色玻璃小瓶,VWR
150mL储存瓶,Corning,
96孔板,Thermo Scientific
细胞刮刀,Fisher
10cm Nunclon细胞培养皿,Thermo Scientific
6孔板,Fisher
T150 CellBind烧瓶,Corning
T75 CellBind烧瓶,Corning
CellPort软件,Absorption Systems
LN2Cryotank,2300Series,Custom Biogenic Systems
CryoElite 2mL Cryogenic Vials,Wheaton
二维矩阵条码插件(2D Matrix Barcode Insert),Wheaton
70％乙醇,VWR
台盼蓝染色(Trypan Blue stain)0.4％,Invitrogen
任何其他一般实验室设备
试剂
注意：除非另有特别说明，否则可以接受来自不同供应商的等级相当的替代材料。
人胚胎肾293细胞与卵磷脂视黄醇酰基转移酶(HEK-LRAT)全反式视黄醇(来自合成，≥95％HPLC，结晶)，Cat#R7632，购自Sigma-Aldrich，MO；
2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，(BHT，丁基化羟基甲苯)，Cat#B1378-100G，Sigma-Aldrich，MO；
N,N-二甲基甲酰胺，DMF，(HPLC级，≥99.9％)，Cat#270547-1L，Sigma-Aldrich，MO；
甲醇，MeOH，(UHPLC级)，Cat#A456-4，Fisher Scientific，NJ；
水，dH2O，室内供应，使用Millipore系统(Millipore Corp，Milford，MA)去离子和过滤(0.2μm)；
Dulbecco改良Eagle培养基(ModifiedEagleMedium)，DMEM高糖，Cat#11965-092，Thermo Scientific，MA；
青霉素-链霉素-谷氨酰胺(100X)，(Pen/Strep/L-Glut)，Cat#10378-016，ThermoScientific，MA；
胎牛血清，经认证，热灭活，美国原产，Cat#10082-147，Thermo Scientific，MA；
杀稻瘟素(Blasticidin)S HCl，10mg/ml，Cat#A11139-03，Thermo Scientific，MA；
0.25％胰蛋白酶-EDTA，Cat#25200.056，Thermo Scientific，MA；
PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲盐水，1X)，Cat#14190-144，Thermo Scientific，MA；
EDTA(0.5M)，Cat#15575-020，Thermo Scientific，MA；
37％盐酸发烟(HCl)，Cat#1003171000，Millipore；
BTP(1,3-双[三(羟甲基)甲氨基]丙烷)，Cat#：B6755-100G，Sigma；
NaCl，Cat#0241-2.5KG，Amresco；
BSA(白蛋白，牛血清)，Cat#126579-100GM，Millipore；
Thermo ScientificTMPierceTM考马斯(Bradford)蛋白试料，Cat#23200，ThermoScientific；
人CRALBP全长蛋白，EyeCRO；
人视网膜色素上皮的重组蛋白-特异性蛋白65kDa(RPE65)，Cat#TP310433，Origene；
试剂的制备
注意：可以根据需要按比率放大或缩小称量的量和/或溶液体积。
在MeOH中的10mM BHT
在DMF中的40μM全反式视黄醇
100mM BTP，10x储备溶液，pH8.0
称取约282.34mg BTP(1,3-双(三(羟甲基)甲氨基)丙烷(Bis-Tris Propane)，M.W.282.33)并溶于约9.5mL的dH2O中。用HCl调节至pH8.0，然后用dH2O使最终体积达到10mL。储存在4℃。1个月到期。
1M NaCl，10×储备溶液
称取约584.4mg NaCl(氯化钠，M.W.58.44)并溶于约10mL dH2O中。储存在4℃。1个月到期。
5％BSA，10×储料
称取约100.0mg BSA并溶于约2mL dH2O中。储存在4℃。3天到期。
BTP-NaCl反应缓冲液，1×溶液
将1mL 10×BTP与1mL 10×NaCl和8mL dH2O合并。充分混合。储存在4℃。1个月到期。
完全DMEM(DMEM Complete)
在使用无菌技术的生物安全柜(Biosafety cabinet)中，将56.2mL HI FBS和5.6mLPen/Strep/L-Glut添加到500mL的DMEM瓶中。倒置瓶子进行混合。在准备期间添加到CellPort软件中。2周到期。
含杀稻瘟素的完全DMEM
在使用无菌技术的生物安全柜中，将0.56mL杀稻瘟素添加到一整瓶的完全DMEM中(或以1：1000的比率添加杀稻瘟素至DMEM完全培养基)。倒置瓶子以混合。在准备期间添加到CellPort软件中。2周到期。
含EDTA的DPBS
在使用无菌技术的生物安全柜中，将2.5mL 0.5M EDTA添加到一整瓶dPBS中。倒置瓶子以混合。在准备期间添加到CellPort软件中。1个月到期。
细胞培养
1)所有细胞培养均应采用无菌技术处理。
2)建档：将试剂和活性记录在经验证的细胞培养软件中，并生成适当的条形码。在极少数软件无法访问的情况下，在实验室笔记本中记录数据，直到输入软件。
3)在37℃水浴中预热所有试剂(完全生长培养基，胰蛋白酶-EDTA，含EDTA的DPBS)。
4)用70％乙醇擦拭生物安全柜内部。将所有对紫外线不敏感的材料放入安全柜内，并在开始细胞培养前打开紫外线至少30分钟。
5)对于解冻，选择小瓶并在解冻前使用CellPort软件将其从制造冷冻库(Manufacturing Cryotank)中取出。
6)从冷冻罐中取出一个小瓶，在37℃水浴中解冻，用EtOH对小瓶喷雾，然后放入罩中。
7)将细胞(1mL，1.0×10E6细胞/mL)从小瓶转移至15mL管中，其中具有9mL完全DMEM。
8)通过移液和分配轻轻拌合细胞5至10次。
9)在室温下以1200RPM离心细胞5分钟，吸出，并重悬于10mL完全DMEM中。
10)将细胞接种到1Corning Cellbind T75中，加入10mL额外的完全DMEM(对于20mL总培养基)。
11)将烧瓶置于37℃和5％CO2下的培养箱中。
12)传代：
a.在37℃水浴中预热所有试剂(完全生长培养基，胰蛋白酶-EDTA，含EDTA的DPBS)。
b.用70％乙醇擦拭生物安全柜内部。将所有对紫外线不敏感的材料放入安全柜内，并在开始细胞培养前打开紫外线至少30分钟。
c.从培养瓶中吸出培养基。
d.根据细胞类型，用含EDTA的EDBS洗涤细胞一次或两次。从培养瓶中吸出所述含EDTA的EDBS。
e.加入足量的胰蛋白酶(0.25％，w/v)-EDTA(1mM)溶液以润湿单层表面(1mL用于T75，2mL用于T150)。
f.在室温下孵育烧瓶直至细胞开始分离。
g.当细胞开始分离时，用手轻轻敲打烧瓶以确保完全脱离。立即加入新鲜培养基以灭活蛋白酶反应。轻轻地上下移液5到10次，以确保完全失活并分离细胞团块。
h.取出一等份的细胞，用CountessTM自动细胞计数器计数细胞。
i.接种具有所需分流比率或细胞密度的烧瓶(以5.0×10E5接种T150烧瓶)。
j.按照下表，在烧瓶中加入足量的完全生长培养基：
表1.每烧瓶的体积介质。
k.将烧瓶置于37℃和5％CO2的培养箱中。
l.在软件无法访问的极少数情况下，给烧瓶贴标签，标签上带有来自经验证的细胞培养软件或细胞系的条形码、传代数、日期和您名字的首字母缩写。解冻后1代后，从这时开始使用含有杀稻瘟素的完全DMEM进行培养。
细胞转导
1)所有细胞培养均应采用无菌技术处理。
2)建档：将试剂和活性记录在经验证的细胞培养软件中，并生成适当的条形码。在极少数软件无法访问的情况下，在实验室笔记本中记录数据，直到输入软件。
3)细胞解离并按照12a-h部分中的步骤计数。
4)将细胞以1.0×10E6细胞/孔接种到6孔板(6孔板，Corning Vender#353046，FisherCat#08-772-1B)上或以1.0×10E6细胞/板接种到100mm板(100mm板，Nunclon Surface，Vender#150350，Fisher Cat#12565020)上以进行转导。铺板足够的孔/用于所有转导的板加1计数。
5)在接种后1天进行转导。
6)转导当天，温热培养基、胰蛋白酶和dPBS+EDTA。
7)根据eQCM，打开适用于正在使用的板类型的转换模板(正在添加到eQCM的模板)以用于计算。
8)从孔中吸出培养基进行计数。
9)向孔中加入0.5mL胰蛋白酶，孵育1-2分钟直至细胞释放，然后加入4.5mL dPBS进行计数。对于100毫米培养皿，将2毫升胰蛋白酶加入培养板中，孵育1-2分钟直至细胞释放，然后加入8毫升dPBS进行计数。
10)将所有溶液转移至15mL管中并涡旋以确保解离。
11)取出10μL并加入10μL台盼蓝，进行计数。
实施例：细胞/mL 体积(mL) 总细胞
1.7E+05 5 8.5E+05
12)病毒过程：用9个MOI和2个载体转导30个孔＝3个孔/MOI。转换数量和MOI可以变化，直到优化。
表2.转导条件和命名法的实施例列表。
13)根据细胞计数，可以计算AAV治疗量：
表3.基于表2中的实施例，每种条件所需的处理培养基的体积的示例
表4.对于表3中的条件的示例性计算
*通过滴度分开的所需的vg
14)标记15或50mL管，其具有适当的命名法，如表2所示。
15)按照表3和表4的格式创建用以适应所有条件的适当体积的AAV处理过的培养基加上约5％。
16)轻轻地，向每个标记孔中加入2mL适当的处理剂。将普通的完全培养基加入3孔用于NTC板。在100mm培养皿中使用10mL培养基。
17)孵育板2.5至3天。
18)在收获细胞之前，在显微镜上拍照以显示转导后的细胞活力。
19)通过动力洗涤收集细胞沉淀，用1mL移液管洗涤，直至所有细胞从板上解离，转移至15mL管中，并离心(1200RPM，持续5min)，吸出培养基，并在-80℃冷冻细胞沉淀，直到使用。
蛋白浓度测定
1)将细胞沉淀重悬(如果冷冻，通过重悬浮解冻)于100μL的1×BTP-NaCl反应缓冲液中，并转移至1.5mL管中。
2)然后将裂解液带到超声波仪。将超声波仪设置在10级和11级之间以及遥控器上。在对每个样品进行超声处理之前和之后用水冲洗探针。将超声波仪探头放入样品中，按下探头手柄上的按钮两次，以快速脉冲2次。
3)制备每种样品在1×BTP-NaCl反应缓冲液中的1：5和1:10的稀释液。
4)根据制造商的说明书制备稀释的白蛋白(BSA)标准品(ThermoScientificTMPierceTM考马斯(Bradford)蛋白试料，Cat#23200)。
5)按照制造商的说明，在96孔板中移取5μL每种标准品和未知样品稀释液。全部重复运行。
6)向每个孔加入250μL考马斯(Coomassie)试剂(加热至室温；在40mL琥珀色小瓶中制备40mL等分试样以避免试剂反复升温，并且在制备新等分试样之前仅将等分试样升温至室温3次)。
7)在室温下孵育平板10分钟。
8)用FLUOstar OPTIMA测量595nm处或附近的吸光度，在Bradford_ZM的吸光度下使用所述方法。
a.打开OPTIMA控制程序→单击程序顶部的测试设置→单击测试方案→选择左侧的吸光度并选择方法BRADFORD_ZM→单击编辑→选择布局并根据样品的加载方式调整板的布局→单击确定以保存更改。
b.选择程序顶部的测量→选择方法BRADFORD_ZM→单击Plate ID选项卡并填写IDS(ID1：项目名称，ID2：姓名缩写，ID3：日期)→单击开始测量以读取板。
9)保存运行并打开OPTIMA MARS数据分析软件。单击OPEN文件→根据ID选择运行文件，然后双击打开→单击原始数据旁边的框以在板网格中显示原始数据结果→单击带有Excel电子表格'X'符号的框并且文件将在Excel中打开→保存文件并立即将其上传到eQCM。
10)数据分析：
a.根据eQCM，打开原始数据文件和Bradford分析模板(正在添加到eQCM的模板)。
表5.用于计算Bradford标准的模板的实施例。
b.复制标准品的原始值并接着将值粘贴到“Bradford滴定法”(“BradfordTitration”)选项卡的顶部表格中(参见表5)，以便它们与小瓶A-H的列对接。由于它们是重复运行的，因此有“重复1和重复2”的列。
c.复制并粘贴空白的原始值(标准小瓶I)并将其粘贴到表格中“空白”旁边的单元格中。
d.将自动计算“空白平均值”以及“重复1和2标准化”值和“平均”值。
e.复制计算出的平均值并将其粘贴到标签为“标准曲线”的选项卡上“标准值”右侧的“仪器读数”列中。这将自动计算标准曲线。
f.返回“Bradford滴定法”选项卡，将未知物的原始数据复制并粘贴到底部表格(参见表6)中，以获取“重复1和重复2”。将自动计算“重复1和重复2标准化值”和“平均值”。每次测定都需要更改样品名称。
表6.用于计算未知物的蛋白浓度的模板的示例。
g.复制计算出的平均值并将其粘贴到标有“标准曲线”选项卡上的标准曲线右侧的“未知读数”列中。这将自动计算“计算浓度”。
h.复制'计算浓度'并将结果值粘贴到'Bradford滴定法'选项卡底部表(表6)的'最终BSA浓度'列中。将稀释因子添加到适当的色谱柱中，将自动计算“未稀释浓度”。
i.将文件“保存”到易于找到的位置，并以分析日期、Bradford分析和项目信息将其命名。立即将文件上传到eQCM。
J.将Bradford结果添加到Bradford Index和蛋白使用记录中以备将来使用。
k.将样品返回至-80℃直至用于测定。
测定样品制备
1)根据eQCM，打开'测定方案模板'(正在添加到eQCM的模板)和Bradford结果。
a.将样品ID和相应的蛋白浓度复制并粘贴到“方案”选项卡的顶部表格中(表7)，并将自动计算“蛋白体积”。在“样品接收日期”中添加收集日期。
表7.用于计算活性测定所需蛋白的体积的模板的实施例。
b.将样品ID复制并粘贴到“方案”选项卡上的表8中的相应单元格中。将表7中计算的“蛋白体积”复制并粘贴到表8的“总μL蛋白(100μg)”列中的相应单元格中。将自动计算“H2O的体积”。
表8.用于测定的反应设置的实施例。重复的数量可以在不同测定之间变化。
c.将测定中使用的CRALBP浓度添加到第二个表下方的黑色边框中，并在表中自动计算“CRALBP*(180μg-25μM)(μL)”体积。
d.将全反式视黄醇和在甲醇中的10mM BHT的笔记本数字添加到模板中，以便在从生物分析组中收到它们后参考。
e.将文件“保存”到易于找到的位置，并用日期、测定方案和项目信息命名。立即将文件上传到eQCM。打印副本以粘贴到笔记本中以带到实验室。
2)将试剂(10×BTP，10×NaCl和10×BSA)加热至室温。
3)制备模板后，将样品和针对测定所需的CRALBP在室温下解冻。当样品解冻后，按照第7节第2步中的方案重新超声处理。
4)根据第二表(表8)标记管，并按照第二表(表8)按以下顺序添加反应组分：dH2O，10×BSA，10×BTP，10×NaCl，样品蛋白，然后CRALBP。在将蛋白添加到管中之前，快速涡旋除蛋白之外的每种成分。这可以在光线下完成。
5)从这时开始的一切都必须在昏暗的黄光下在黑暗中完成。
a.涡旋全反式视黄醇以确保在将其添加到样品之前充分混合。小心地在每个样品中直接加入2μL 500μM的在100％DMF中的全反式视黄醇，注意在喷嘴(tip)外侧上有来自全反式视黄醇的太多残留物。更改样品之间的喷嘴(tip)。
b.一旦将全反式视黄醇添加到所有样品中，快速涡旋所有样品并将它们置于37℃培养箱中持续2小时(对于样品使用黑色管架是理想的)。
c.在2小时后，通过在甲醇中加入300μL 10mM BHT终止反应，并将样品涡旋1分钟。
d.将样品放在盒子中，并确保在分析前它们能够很好地避光。
实施例2
方法概要
已开发出LC-MS/MS方法用于分析反应基质中的11-顺式-视黄醇。通过使用LLE(液-液萃取)制备样品。将200μL等份的反应基质与300μL MeOH w/10mM BHT(BHT：丁基化羟基甲苯)、20μL STD或QC工作溶液、20μL内标工作溶液(500nM全反式-混合-视黄醇-d5)和300μL己烷充分混合。将样品剧烈涡旋并离心。将上部有机层小心地转移到干净的96孔板中，并在温和的N2流下蒸发至干。用75μL重构溶液(MeOH w/10mM BHT：水，3：2v/v)重构样品。使用UPLC-MS/MS系统通过注射10μL经LLE处理的样品进行分析。所有样品制备均在昏暗的黄光下进行。
色谱法在沃特世(Waters)Acquity BEHC18，1.7μm，2.1×100mm柱上进行，并在正离子模式下通过大气压化学电离(APCI)质谱法分析。使用等度条件洗脱分析物，其中使用乙腈：甲醇：异丙醇：水(45：20：5：30，v/v/v/v)作为流动相。在流速为0.35mL/min时，11-顺式-视黄醇在约8.8分钟洗脱，全反式视黄醇在约9.6分钟洗脱，内标(全反式视黄醇-d5)在约9.5分钟洗脱。总运行时间约为11分钟。对于11-顺式-视黄醇，测定范围为1-25nM，同时使用200μL反应基质样品体积。
设备
柱：沃特世Acquity BEHC18，1.7μm，2.1×100mm(P/N：186002352)
LC-MS/MS系统
沃特世XEVO TQ-S质谱仪
沃特世Acquity UPLC
一般实验室设备(可替代等效设备)
容量玻璃器皿，A级
Rainin认证的移液器，Rainin仪器，Woburn，MA
微量天平，Mettler AX205DR，梅特勒(Mettler)仪器
Multi-Max涡旋混合器
Thermolyne板式搅拌机
冰箱，2至8℃Revco
冷冻机，-35℃至-20℃，Revco
冷冻机，-80℃，
Beckman GS-6R离心机，或同等产品
Thermo Scientific Sorvaall T1离心机或同等产品
蒸发器，Zymark TurboVap 96，Zymark Corp.，Hopkinton，MA
1.5mL聚丙烯微量瓶，VWR
硼硅酸盐玻璃管，13×100mm，VWR
15mL聚丙烯管，VWR
50mL聚丙烯管，VWR
4mL琥珀色玻璃小瓶，VWR
96孔，深孔板，VWR
任何其他一般实验室设备
仪器条件
LC条件
LC：沃特世Acquity UPLC
柱：沃特世Acquity BEH C18，1.7μm，2.1×100mm(P/N：186002352)
柱温：40℃
流动相A(MPA)：乙腈：甲醇：异丙醇：水(45：20：5：30，v/v/v/v)
等度计划：
时间(分钟) 流速(mL/min) ％A ％B
0.0 0.35 100 0
11.0 0.35 100 0
流速：350μL/min
运行时间：约11分钟
保留时间：11-顺式-视黄醇：约8.8分钟
全反式视黄醇：约9.6分钟
全反式视黄醇-d5(IS)：约9.5分钟
注射量：10μL
自动进样器温度：约2-8℃
自动进样器清洗#1：MeCN：IPA：H2O：FA(3：3：3：0.1，v/v/v/v)
自动进样器洗涤#2：1％甲酸水溶液
MS条件
注意：质谱仪参数可能因系统而异
质谱仪：沃特世XEVO TQ-S
资料来源：APCI
模式：具有正模式的多反应监测(MRM)
仪器设置：
电晕：19μA
电晕：4kV
锥：12V
锥形气体：150升/小时
去溶剂化气体：300升/小时
雾化器气体：4巴
毛细管电压：3.1kV
源温度：150℃
探针温度：500℃
碰撞气体：0.15mL/min
注意：锥形和去溶剂化气体是N2，而碰撞气体是氩气。
材料
注意：除非另有说明，否则可以接受来自不同供应商的相当等级的替代材料
11-顺式-视黄醇，预先称重，Cat#R252105，购自加拿大多伦多研究化学品公司(Toronto Research Chemicals,Canada)；
全反式视黄醇-d5 ，Cat#R252002，购自加拿大多伦多研究化学品公司
全反式视黄醇(来自合成，≥95％HPLC，结晶)，Cat#R7632，购自Sigma-Aldrich，MO；
2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，(BHT，丁基化羟基甲苯)，Cat#B1378-100G，Sigma-Aldrich，MO；
N,N-二甲基甲酰胺，DMF，(HPLC级，≥99.9％)，Cat#270547-1L，Sigma-Aldrich，MO；
己烷，(HPLC级，≥98.5％)，Cat#293253-2L，Sigma-Aldrich，MO；
乙腈，MeCN或ACN，(UHPLC级)，Cat#A955-4，Fisher Scientific，NJ；
甲醇，MeOH，(UHPLC级)，Cat#A456-4，Fisher Scientific，NJ；
异丙醇，IPA，(HPLC级)，Cat#PX1838-1，EMD Millipore Co.，MA；
甲酸，FA(88％)(GR，ACS级)，Cat#0128-01，J.T.Baker，PA；
水，dH2O，室内供应，使用Millipore系统(Millipore Corp，Milford，MA)去离子和过滤(0.2μm)；
空白反应基质，由生物实验室(Biological Lab)制备
试剂的制备
注意：可以根据需要按比率放大或缩小称量的量和/或溶液体积。
在MeOH中的10mM BHT
称取约89.04mg BHT(丁基化羟基甲苯，M.W.＝220.36)并溶于约40.4mL MeOH中。在RT存储。1周后到期。
重构溶液(MeOHw/10mM BHT：水，3：2v/v)
将12mL的10mM BHT的MeOH溶液与8mL去离子水合并。充分混合。在RT存储。在同一天使用它。
流动相A(MPA)乙腈：甲醇：异丙醇：水(45：20：5：30，v/v/v/v)
合并450mL MeCN，200mL MeOH，50mL IPA和300mL去离子水。充分混合。在室温下储存。1个月过期。
自动进样器清洗液#1：MeCN：IPA：H2O：FA(3：3：3：0.1，v/v/v/v)
将300mL MeCN、300mL IPA、300mL去离子水和10mL甲酸合并。充分混合。在室温下储存。1个月过期。
自动进样器清洗液#2：水中1％甲酸(v/v)
将10mL甲酸与1000mL去离子水合并。充分混合。在RT下存储。1个月过期。
11-顺式-视黄醇储备液(2.5mM)
在昏暗的黄光下，将1.46mL DMF加入含有预先称重的1.110mg 11-顺式-视黄醇(M.W.＝286.45，纯度94.12％)的原始琥珀色小瓶中。涡旋，慢慢(easily)溶解。储存在-80℃。到期待定。
全反式视黄醇储备液(2.5mM)
在昏暗的黄光下，称重约2.97mg全反式视黄醇(M.W.＝286.45，纯度99.4％)并溶于约4.12mL DMF中。涡旋，且慢慢(easily)溶解。储存在-80℃。到期待定。
全反式视黄醇-d5储备液(1mM)
在昏暗的黄光下，将1.63mL DMF加入含有0.5mg全反式视黄醇-d5的原始琥珀色小瓶中(M.W.＝291.48，纯度95％)。涡旋，慢慢(easily)溶解。储存在-80℃。到期待定。
IS工作溶液：500nM全反式视黄醇-d5
在昏暗的黄光下，在DMF中的10mL重构溶液中加入5.0μL1mM全反式视黄醇-d5。充分混合。储存在-80℃。到期待定。
系统适用性样品(相当于提取的中(Mid)QC：最终26.7nM 11-顺式-视黄醇/133nM全反 式视黄醇-d5)
在昏暗的黄光下，在96孔板中，转移40μL QC-M工作溶液(重组溶液中100nM 11-顺式-视黄醇)，40μL IS工作溶液(500nM全反式视黄醇-d5)和70μL重构溶液。充分混合。
另一种选择：提取的Mid QC样品可以用作“系统适应性样品”。
用于异构水解酶活性测定的剂量溶液
注意：溶液体积可以根据需要按比率放大或缩小。所有的制备都在昏暗的黄灯下进行。
在DMF中的100μM全反式视黄醇
在4mL琥珀(Amber)小瓶中，将在DMF中的160μL 2.5mM全反式视黄醇与3.84mL DMF合并。充分混合。
在DMF中的40μM全反式视黄醇
在4mL Amber小瓶中，将在DMF中的64μL 2.5mM全反式视黄醇与3.94mL DMF合并。充分混合。
在DMF中的20μM全反式视黄醇
在4mL Amber小瓶中，将在DMF中的2.00mL 40μM全反式视黄醇与2.00mL DMF合并。充分混合。
在DMF中的10μM全反式视黄醇
在4mL Amber小瓶中，将在DMF中的2.00mL 20μM全反式视黄醇与2.00mL DMF合并。充分混合。
30％DMF
将6.0mL DMF与14mL去离子水合并。充分混合。在RT下存储。1个月到期。
在30％DMF中的40μM全反式视黄醇
在4mL Amber小瓶中，将在DMF中的64μL 2.5mM全反式视黄醇与3.94mL 30％DMF合并。充分混合。
在30％DMF中的16μM全反式视黄醇
在4mL Amber小瓶中，将1.00mL 40μM全反式视黄醇与1.50mL 30％DMF合并。充分混合。
在30％DMF中的8μM全反式视黄醇
在4mL Amber小瓶中，将1.00mL的16μM全反式视黄醇与1.00mL的30％DMF合并。充分混合。
验证特定试剂
注意：溶液体积可以根据需要按比率放大或缩小。
工作标准和QC制备
注意：可以根据需要调整体积。
所有的制备都在昏暗的黄灯下进行。
使用下表中显示的方案，通过连续稀释制备成组的工作溶液。使用重构溶液(MeOH w/10mM BHT：水，3：2v/v)制备所有工作溶液并储存在-80℃。
表9. 11-顺式-视黄醇标准品和QC工作溶液的制备
*稀释剂＝重构溶液＝(MeOH w/5mM BHT):H2O,3:2v/v
系统适用性
·系统适用性是可选的，但建议使用
·平衡UPLC-MS/MS系统约10分钟。
·注入系统适用性样品(N＝5)。
·计算RT和峰面积的RSD(％)。
样品制备
LLE用于标准/QC样品(均在昏暗的黄光下制备)：
1)将20μL工作标准品或QC溶液加入Eppendorf小瓶(1.5mL)中。在这些“空白”样品中加入20μL重构溶液。
2)移取200μL反应基质。
3)移取300μL MeOH w/10mM BHT，轻轻涡旋约3秒。
4)加入20μL ISWS(在重构溶液中的500nM全反式视黄醇-d5)。
5)在每个样品小瓶中加入300μL己烷。
6)盖上盖子并剧烈涡旋约5分钟，以13,000rpm离心约5分钟。
7)小心地将(约250μL)上部有机层转移到干净的96孔板中。
8)在40℃通过使用TurboVap(或等效物)在平缓的N2流下将样品蒸发至干燥。样品应在约30分钟内干燥。开始时气流设置为约25。
9)加入75μL重构溶液并充分混合。以3,000rpm离心约2分钟。
10)通过注入10μL样品使用UPLC-MS/MS进行分析。
LLE，其用于产生的样品(均在昏暗的黄灯下制备)：
a)在每个样品小瓶中加入20μL重构溶液，20μL ISWS(重组溶液中的500nM全反式视黄醇-d5)和300μL己烷(在1.5mL Eppendorf小瓶中：2小时孵育的200μL反应基质样品用300μLMeOH w/10mM BHT处理以淬灭反应)。
b)然后，遵循上述“标准/QC样品”制备步骤6至10。
数据处理
使用沃特世MassLynx V4.1软件处理数据。标准品、QC和样品的计算将使用与内标的峰面积比进行。分析方法将使用具有1/x2加权的二次回归模型。
验收标准
在下面描述了分析批次的验收标准以进行验证和样品分析。
实施例3
验证概要
除非另有说明，否则如上所述进行异构水解酶活性测定法鉴定。该测定法被核准用于测试药物物质(DS)和药物产品(DP)，因为两者具有相同的配方。评估了以下参数：
-系统适用性和样品验收
-特异性(不干扰配方缓冲液)
-稀释线性
-精度(中级精度)
-相对准确度
-范围
所有描述的研究结论：
-异构水解酶活性测定法是特异性的、线性的、准确的和精确的。
-每个分析集符合系统适用性标准。
-标称方法浓度的50％至150％的范围，感染复数(MOI)1.00E+04,2.00E+04,4.00E+04,6.00E+04,8.00E+04,1.60E+05,3.20E+05,6.40E+05,1.28E+06的AAV载体基因组(vg)/细胞通过线性、准确度和精确度数据支持。
该方法显示出适合其预期目的。
缩写 说明
AAV2-hRPE65v2 药物物质或药物产品命名法
11cROL 11-顺式-视黄醇
CI 置信区间
CRALBP 细胞视黄醛结合蛋白
CV 变异系数
DP 药物物质
DS 药物产品
GCV 几何变异系数
HEK 人类胚胎肾脏
IP 中间精度
ln(RP) 相对效力的自然对数
LRAT 卵磷脂视黄醇酰基转移酶
MOI 感染复数
RS 参考标准
SOP 标准操作程序
SSQ 平方和
STD 参考标准(PLA软件)
TA 测试物品
UNK或UNK1 测试物品(PLA软件)
USP 美国药典
vg 载体基因组
分析参考标准
分析参考标准名称： AAV2-hRPE65v2药物物质
浓度: 4.86e12vg/mL
样品(测试物品)
样品名称： AAV2-hRPE65v2药物物质
浓度: 4.86e12vg/mL
细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)
样品名称： CRALBP
3.8mg/mL；平均2.675pmol 11cROL或4.0mg/mL；平均2.758pmol 11cROL
供应商: EyeCRO/Oklahoma City,OK
HEK293-LRAT细胞
样品名称: HEK293-LRAT细胞
AAV2-hRPE65v2制剂缓冲液
制剂缓冲液组合物：10mM磷酸钠，180mM氯化钠，0.001％普兰尼克(pluronic)F68，pH7.3。
验证的研究设计、结果概要和建议
评估并报告了系统适用性和样品验收标准的结果。未使用无效测定(不符合系统适用性标准)的结果。仅通过测定的结果用于评估特异性、相对准确度、精度、范围和稀释线性。表10总结了验证验收标准的参数、结果和建议的概要。
表10.验证的参数、结果和建议的概要
1.未包含在此鉴定中的参数包括：精度(重复性)，强制降级和稳健性。
系统适用性
定义
系统适用性测试是许多分析程序的组成部分。测试基于以下概念：待分析的设备、电子设备、分析操作和样品构成可以如此评估的整体系统。要为特定程序建立的系统适用性测试参数取决于合格程序的类型。
实验设计
如上所述对于每个分析集，进行系统适用性和样品验收。所有统计分析均由Tunnell Consulting(King of Prussia，PA)进行，并将数据提供给吸收系统以包含在报告中。
验收标准
结果、讨论和结论
对于每个分析集，满足合适的测定验收和样品验收标准。
在鉴定、测定6和测定2期间重复两次试验。测定6(中间精度，分析员2，第1天，100％)对于异常值不符合预定义的验收标准，并且未达到最大数量异常值的警告水平。异常值很可能是由于缺乏细胞溶解物同质性，从而导致如下所述的可变蛋白浓度测量结果。
在测定6中，样品12-2-16-9RS-C的蛋白浓度异常低。对样品12-2-16-9RS-C进行的一种酶测定产生了异常高浓度的11-顺式-视黄醇(11cROL)，这表明低蛋白读数可能不准确，导致比所要求的更多的蛋白被添加到酶活性测定中。对样品12-02-16-6RS-A和12-02-16-7RS-B进行了类似的观察，其中异常高的蛋白浓度导致异常低的11cROL浓度。这些样品或数据点被列为技术异常值，因为细胞溶解物样品在第一次超声处理步骤期间在进入Bradford测定之前，可能没有充分混合，从而导致蛋白读数不准确，因此添加到酶活性测定中的蛋白不准确。分析员2接受了再培训，测定6重复进行。重复测定6符合测定验收和样品验收标准。
在测定6的研究期间，决定还重复测定2。虽然测定2(中间精度，分析员2，第1天，50％)确实符合分析系统的适用性和样品验收标准，但数据的变化非常高，原因与分析6中确定的相同。分析员2进行了再培训，重复测定2。重复测定2符合测定验收和样品验收标准。
特异性
定义
特异性是在样品分析过程中可能预期存在的成分存在下明确评估测试物品(TA)响应的能力。通常，这些包括杂质、降解物和样品基质。
配方缓冲液的无干扰-实验设计
通过制备和分析AAV2-hRPE65v2制剂缓冲液来评估所述测定的特异性非干扰。使用与参考标准相同的稀释体积稀释制剂缓冲液，并对所有9个MOI(水平100％)进行类似于TA的处理。
验收标准
结果、讨论和结论
配方缓冲液的剂量响应曲线如图8所示。当与分析参考标准引发的剂量反应相比时，使用AAV2-hRPE65v2配方缓冲液未观察到剂量反应。PLA v3.0确实提供了相对效力的估计，基本上为零。AAV2-hRPE65v2配方缓冲液样品未通过样品斜率标准。由于缺乏支持所需分析的数据，PLA v3.0并行性评估被拒绝。这得出结论该方法特异于AAV2-hRPE65v2。
稀释线性
定义
分析方法的线性证明了获得与样品浓度成正比的测试结果的能力。
实验设计
在以下9个MOI中，使用AAV2-hRPE65v2分析参考标准，在线性曲线的范围内证明了线性：1.00E+04,2.00E+04,4.00E+04,6.00E+04,8.00E+04,1.60E+05,3.20E+05,6.40E+05和1.28E+06。
验收标准
结果、讨论和结论
符合所述的验收标准。确定系数(R2)为0.91。在图9中证实了测定的稀释线性，因为拟合线上限定的95％置信度包括同一性的线。图9中的线性图由表11中的13个测定的值产生，并且估计的相对效力值相对于它们各自的靶效力值作图。
表11提供了针对13种测定中的每一种的PLA v3.0报告的估计的相对效力，其中靶相对效力水平为0.5、1.0或1.5。还提供了相对效力的自然对数(“ln(RP)”)并在表16和17中使用。注意，表11、16和17中的计算中使用的所有方程式在USP<1033>中给出。此处的统计分析中不包括测定14(在8.1节在特异性下所讨论的)，因为样品不含AAV2-hRPE65v2，因此，如预期的那样，无法计算该测定数据的PLA v3.0适用性测试。
表12提供了来自图9的简单线性回归的截距和斜率的95％置信区间估计。表12中的“目标水平”项目指的是回归斜率的估计。截距的置信区间(即，表12中的下95％-上95％)包括0，并且斜率的置信区间包括1，如对稀释线性所预期的。斜率的p值(Prob>|t|)表示斜率等于零的统计测试。观察到的p值非常低(<.0001)的事实是斜率不为零的有力证据。
表13提供了与图9中拟合线相关的一些附加统计输出。特别是R方(RSquare)表示图9中各个值的91.4％的方差由稀释线性关系解释。
表11.具有非零目标水平的13种鉴定分析中的每一种的估计相对效力
表12.来自图9中的简单线性回归的截距和斜率(“目标水平”)估计
*JMP回归输出自动标记任何p值<0.05，只是为了记录统计显著性。预计这里将显示统计显著性，因此带*的数字是可接受的。“目标水平”线估计斜率。带*的值表示斜率不等于零。置信区间介于下95％和上95％之间，括号为1。
表13.来自图9中的简单线性回归的汇总统计
R方 0.914187
调整的R方 0.906385
根均方误差 0.152196
响应的平均值 1.052182
观察(或总和权重) 13
精度
定义
根据ICH指南Q2(R1)，分析程序的精度表示在规定条件下从同一样品的多次取样获得的一系列测量值之间的一致性(散射程度)的接近程度。分析程序的精确度通常表示为一系列测量的方差、标准偏差或变异系数。
中级精度-定义
中间精度表示在分析方法的实验室变化范围内：不同的天数、不同的分析员、不同的设备等。
中间精度-实验设计
使用方差分量分析确定方法的中间精度，如美国药典总章<1033>生物测定验证(USP General Chapter<1033>Biological Assay Validation)中所述。使用AAV2-hRPE65v2分析参考标准品作为样品，并在三种不同浓度范围或三组不同MOI水平下测试：50％、100％和150％。
MOI稀释液的制备记录在实验室笔记本中，因为所需的载体量取决于细胞计数。表14中提供了三种不同水平的MOI基质。
表14.MOI在50％、100％和150％的总结
中间精密度由两位不同分析员、在不同的两天内、以三种不同的精度水平：50％、100％和150％进行的测定的结果确定。分析员二，第三天被包括在内以支持中间精度所需的第三次独立的制备。
分析员1和分析员2是两位不同的分析员。分析员2没有由多人代表。
每个分析人员每天测试按照MOI制备一种分析参考标准品和一份TA样品制剂(分析参考标准品用作样品或TA)。
分析员1(或分析员2)，在以下9个MOI中为100％水平制备了分析RS和TA(见图10)：1.00E+04,2.00E+04,4.00E+04,6.00E+04,8.00E+04,1.60E+05,3.20E+05,6.40E+05和1.28E+06。图11和图12分别提供了50％和150％MOI水平的默认板图。
表15中提供了用于确定中间精度的基质(matrix)。
表15.三种不同准确度水平：50％、100％和150％下的中间精度实验总结。
1.分析员2，第3天支持中间精度所需的第三次独立的制备。
X：表示特定分析员在特定日期执行哪个处理。
对样品和数据分析进行如上所述的方法。
验收标准
结果、讨论和结论
符合验收标准。各标准浓度目标水平相对效力0.5(50％)，1.0(100％)和1.5(150％)的中间精度(IP)分别为9.5％、9.9％和15.5％，并且≤30％。来自三个浓度水平产生的数据的合并的中间精度(IP)值(也称为％GCV的总体估计值)为11.3％，并且≤30％。IP结果报告在表16和表17中。
在表16的最后3列中提供了相对偏差的点和90％置信区间估计。三个目标水平的相对偏差的点估计都在+/-25％之内，这是表10中给出了相对准确度的建议的验证验收标准。90％置信区间在所有三个目标水平相对效力下均为零。因此，从统计学的角度来看，没有证据表明这三个目标水平有偏差。相对偏差估计值及其相关的90％置信区间显示在图13中。所有90％区间均在+/-30％的相对偏差范围内，这(对于每个目标水平分别)提供相对偏差范围在+/-30％内的在95％的置信水平下的统计测试。
对于分析人员1和分析人员2的三种不同水平(50％，100％和150％)的AAV2-hRPE65v2参考标准品和测试品的PLA 3.0选择剂量响应曲线如图14至图19所示。
表16.使用表11中的ln(RP)值估算每个目标水平的相对偏差。
表17.基于表11中的ln(RP)和目标水平估算所有三个目标水平的总
GCV％
相对准确度
定义
分析方法的准确度是该方法产生的测试结果与真实值一致的程度。准确度表示作为常规真实值或可接受参考值接受的值与实测值之间的一致性的接近程度。
实验设计
使用从中间精度测试获得的相对效力值，计算在每种浓度下的相对准确度(作为相对偏差计算)。
验收标准
结果、讨论和结论
符合验收标准。表16中报告了相对准确度结果。在表16的最后3列中提供了相对偏差的点和90％置信区间估计。
每个目标水平相对效力0.5(50％)、1.0(100％)和1.5(150％)的相对偏差的点估计值分别为-0.6％、+0.3％和+10.0％，并且均在+/-25％或-25％≤x≤+25％范围内，这是表10中给出的相对准确度的推荐验证验收标准。
所有三个90％置信区间均包括零；因此，从统计的角度来看，没有证据表明这三个目标水平有任何偏差。图13显示了相对偏差估计值及其相关的90％置信区间。所有90％区间均在+/-30％的相对偏差范围内，这(分别为每个目标水平)从在95％置信水平下的相对偏差在+/-30％之内的两个单侧统计检验提供证据。
范围
定义
分析方法的范围描述了上下浓度之间的区间，已经证明分析方法具有适当水平的精度、准确度和线性度。
实验设计
通过评估中间精度、相对准确度和稀释线性得出的分析和结论用于确定可以可靠报告结果的范围。
验收标准
结果、讨论和结论
标称方法浓度的50％至150％范围，9个MOI(1.00E+04,2.00E+04,4.00E+04,6.00E+04,8.00E+04,1.60E+05,3.20E+05,6.40E+05,1.28E+06)由线性度、准确度和精度数据支持。支持该范围的结果在本报告的相对准确度、中间精度和稀释线性部分中报告。
关于改变数据分析的建议
在异构水解酶活性测定鉴定后，重新检查PLA测定和样品适用性限值(边际)。表18基于表11中的13个鉴定测定和4个额外的鉴定前测定(测定16、19、20和21)提供了对PLA适用性测试和限值的评价，这些鉴定前测定以与用于鉴定分析的MOI的数量和水平相同的MOI的数量和水平运行，并使用与用于鉴定分析的PLA模板相同的PLA模板进行分析。
表18.重新检查PLA测定和样品适用性限值(边际)
表18列出了在17种测定中的每一种中分析的18种PLA测试名称和以下分析：
1.观察每个测试统计量的统计最小值和最大值。
2.鉴定研究期间应用的每个测试的“严重性级别”和边际。
3.基于单侧下限和上限95％置信区间限值推荐的每个测试的“严重性级别”和边际，以包含99.73％的未来测试统计值。
表18中的严重性代码给出了基于在测试失败时采取的措施：
Inf＝仅仅是信息，不采取任何行动，
警告＝发出警告，
Rej＝样品/测定被拒绝，没有发布报告。
由于分析错误，测定2和6需要重新运行。这些在表11中表示为“2-重复”和“6-重复”。原始测定2和6不包括在本适用性测试边际重新检查中。
在鉴定研究期间使用的适用性测试边际(限值)是基于有限数量的鉴定前测定而建立的。鉴定数据以及来自代表性鉴定前测定的数据提供了更丰富和更可靠的基础，其可用于估计未来适当的适用性测试余量。
通过鉴定前测定16，当前PLA分析中移除了最高MOI(256K)以反应鉴定方案。对于这4个鉴定前测定的观察到的适用性测试的检查表明，它们与鉴定测定显示出基本相同的观察到的测试统计数据分布。包括这4个额外的测定应该导致关于PLA适应性测试的任何调整的更明智和可靠的决定。
所有13个鉴定测定和4个额外的代表性的鉴定前测定都通过了用于相对效力估计的PLA模板中的鉴定测定和样品适用性标准(即表18中的鉴定边际)。
未来有效的测定应通过推荐的适用性测试，因为测试限值基于17种测定，其：a)没有已知的分析异常，b)相对效力目标水平在0.5到1.5之间，以及c)有来自相同材料的标准和测试样品，因此测试样品根据定义是合适的。基于最后2列中的容差界限的边际是PLA限值的保守估计，其应该提供仅仅因为数据的随机波动而意外地没有通过测定或样品的合理低概率。
表18中的所有等效性测试在95％置信水平下进行，采用90％置信区间。表18的最后2列中的推荐边际基于来自17个测定的关键测试统计的容差界限。容差区间基于观察到的下或观察到的上90％置信区间。对于额外的测试，容差区间基于相应测试参数的点估计。
在设置表18中的建议边际时，某些测试被认为是多余的，不推荐使用。基于参数比率的测试对于基于差异的那些测试是多余的，并且没有任何用途。类似地，对非平行度的SSQ的测试被认为是多余的，因为希尔(Hill)系数和上渐近线的等价测试已经存在。基于UNK的C参数的测试被认为是不必要的，因为它与UNK的相对效力直接相关，UNK的测定可报告结果由产品验收限值控制。
在大多数情况下，表18中的建议边际与鉴定研究中使用的边际差别不大。一些具体意见如下：
-表18中的最后2项测试补充了相对效力估计，并不是真正的适用性测试。因此，它们仅供参考。
-建议不允许更改允许的最大异常值数(5)。
-“斜率”的等效测定适用性测试没有变化。(此处注意PLA使用单词“斜率”来表示希尔(Hill)系数，该系数相关于但不等于EC50处的轮廓的斜率。
-当应该严格为正(例如，斜率)的统计量的单侧下容差界限为负时，选择合理的正下边际。例如，保留了用于鉴定的斜率(0.23)的建议下边际。
-由于参考样品和测试样品预计具有相同的上渐近线、斜率和回归R方，因此通过在所有17种测定中组合两种样品类型的统计数据来获得这些的边际。
鉴定概要
所有描述的实验都符合所有SOP中描述的系统适用性和样品验收标准。该方法显示出适合其预期目的。

Claims (55)

1.一种测量异构水解酶活性的方法，其包括：
(a)在允许细胞转导的条件下，使表达卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)的细胞与包含编码异构水解酶蛋白的转基因的腺相关病毒(AAV)载体接触；
(b)在允许表达所编码的所述异构水解酶蛋白的条件下孵育转导的细胞；
(c)收集并裂解转导的所述细胞以产生包含所编码的所述异构水解酶蛋白的提取物；
(d)将所述提取物与底物一起孵育一段时间，并在允许所述底物被所述异构水解酶蛋白转化为反应产物的条件下进行；
(e)将所述反应产物进行柱色谱法处理，从而产生柱色谱法纯化的反应产物；以及
(f)对所述柱色谱法纯化的反应产物进行质谱法处理，从而定量所述反应产物，其中所述反应产物的量反映异构水解酶活性，从而测量异构水解酶活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述异构水解酶蛋白包含视网膜色素上皮特异性蛋白65-KD(RPE65)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述异构水解酶蛋白包含野生型视网膜色素上皮特异性蛋白65-KD(RPE65)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述异构水解酶蛋白包含变体或突变体视网膜色素上皮特异性蛋白65-KD(RPE65)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述异构水解酶蛋白包含哺乳动物视网膜色素上皮特异性蛋白65-KD(RPE65)。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述异构水解酶蛋白包含人视网膜色素上皮特异性蛋白65-KD(RPE65)。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述细胞包含哺乳动物细胞。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述细胞包含人细胞。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述细胞包含人胚肾(HEK)293细胞。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述细胞稳定或瞬时表达LRAT。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述底物包含全反式视黄基酯。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括将所述底物的前体加入到所述提取物中，其中所述前体通过所表达的所述LRAT转化为所述底物。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括向所述提取物中添加细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)和所述底物的前体，其中所述前体通过所表达的所述LRAT转化为所述底物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所添加的CRALBP的量介于约50和约500μg之间。
15.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述细胞还稳定或瞬时表达细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的方法，其中所述前体包含全反式视黄醇或由其组成。
17.根据权利要求16所述的方法，其中添加所述全反式视黄醇使得最终浓度为约1至约20mM。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述反应产物包含11-顺式-视黄醇或由其组成。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中步骤(d)、(e)和/或(f)在暗处、在昏暗光下或在暗黄色光下进行。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述底物、前体或反应产物是非放射性的。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中步骤(d)的时间为约30分钟至约240分钟。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中在步骤(d)之后但在步骤(e)之前停止或淬灭所述反应。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中在步骤(d)之后但在步骤(e)之前加入醇。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中步骤(d)还包括提取所述反应产物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述反应产物用有机溶剂提取。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述反应产物用己烷提取。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中步骤(a)-(d)中的任何步骤如实施例1中所述进行。
28.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中步骤(e)-(f)中的任何步骤如实施例2中所述进行。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述腺相关病毒(AAV)载体包含衣壳蛋白序列或反向末端重复序列，所述衣壳蛋白序列或反向末端重复序列与选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAV10的任何血清型的衣壳蛋白序列或反向末端重复序列具有70％或更高的序列同一性。
30.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述腺相关病毒(AAV)载体包含选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10的任何血清型的衣壳蛋白或反向末端重复序列。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述(a)使细胞接触是使细胞与约500至约5百万个AAV载体颗粒/细胞的量接触。
32.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述(a)使细胞接触是使细胞与约1,000至约1,000,000个AAV载体颗粒/细胞的量接触。
33.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中(a)使细胞接触是使细胞与约2,000至约500,000个AAV载体颗粒/细胞的量接触。
34.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述(b)孵育所转导的所述细胞的时间为约6小时至约96小时。
35.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中(c)的所述裂解所转导的所述细胞是通过冻融、超声处理或其组合进行的。
36.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中确定步骤(c)后产生的总细胞蛋白的量。
37.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中在步骤(c)之后产生的总细胞蛋白的量通过Bradford测定法确定。
38.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中将所述前体与10-100％的DMF溶液混合。
39.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中在收集细胞后但在(c)裂解之前，将所收集的所述细胞重悬于缓冲液中。
40.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中在(c)裂解所转导的所述细胞以产生提取物后，将所述提取物稀释在缓冲液中。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述缓冲液是盐缓冲液。
42.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述缓冲液是NaCl缓冲液。
43.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中步骤(c)产生的所述提取物包含约10μg至约2,000μg的总细胞蛋白或被调节到约10μg至约2,000μg的总蛋白。
44.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中通过步骤(c)产生的所述提取物包含约50μg至约750μg的总细胞蛋白或被调节到约50μg至约750μg的总蛋白。
45.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述(d)孵育的温度为约30℃至约40℃。
46.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述柱色谱法将11-顺式-视黄醇与9-顺式-视黄醇分离和/或将11-顺式-视黄醇与13-顺式-视黄醇分离。
47.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述柱色谱法包括反相色谱法。
48.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述柱色谱法包括反相固定相。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述固定相包含C18链。
50.根据权利要求48所述的方法，其中所述固定相包含亲水基团。
51.根据权利要求48所述的方法，其中所述亲水基团包括氨基甲酸酯基团。
52.根据权利要求48所述的方法，其中所述固定相包含C18链内的亲水氨基甲酸酯基团。
53.根据权利要求48所述的方法，其中所述固定相包含甲硅烷基氨基甲酸酯基团。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述方法是线性的，从每个细胞约1×104至约2×106个AAV载体基因组。
55.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中确定系数(R2)大于约0.85。
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