CN1327380A - 化妆组合物 - Google Patents

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Abstract

白藜芦醇是一种存在于常见可食用植物(包括花生和红葡萄)中成分,它是一种植物雌激素。白藜芦醇可以抑制皮肤表皮细胞(角质细胞)的增殖并且促使其分化。还发现白藜芦醇可以缓解由α－羟基酸引起的皮肤刺激性。白藜芦醇可以有效改善起皱、有纹路、干燥、薄片状、老化或光损伤皮肤的外观,并且改善皮肤厚度、弹性、柔韧性、光亮度、光泽和丰满度。

Description

化妆组合物
发明领域
本发明涉及含有白藜芦醇(resveratrol)的化妆组合物，以及通过将该组合物涂敷在皮肤上调理皮肤的美容方法，白藜芦醇是一种衍生自植物的天然雌激素。
发明背景
人体皮肤主要由两层构成，较厚的底层是真皮，较薄的顶层是表皮。真皮层为皮肤提供了强度、弹性和厚度。随着老化，真皮层的厚度减小，而且可以肯定在老化皮肤中皱纹的形成部分与此有关。赋予皮肤回弹性和屏蔽性的人体皮肤顶层或表皮是由多种不同类型的细胞构成。角质细胞是表皮细胞的主要种类(占人体表皮细胞总数的75-80％)。在表皮中，角质细胞存在于分化的四个不同阶段。表皮分化对于提供皮肤的基本功能，即提供对抗外界环境的保护屏障和防止机体失去水分，十分重要。角质化膜的形成是细胞分化的最后阶段。酶对角质化膜的形成起作用，转谷氨酰胺酶是表皮分化的标记。能够增加真皮层厚度并且增强表皮层内角质细胞分化的物质是产生皮肤调理和抗衰老益处的理想化合物。
已知雌激素以及起雌激素作用的合成化合物可以增加真皮层厚度并减少衰老皮肤中皱纹形成。皮肤的改变，如皮肤干燥、出现在绝经后的皮肤失去弹性和饱满性，均归因于雌激素生成不足。雌激素疗法可以预防或减缓许多与皮肤老化有关的变化(Creidi等人，共轭雌激素霜(Premarin)对面部衰老皮肤的作用，Maturitas，19，211-23页，1994)。一种合成雌激素-二乙基己烯雌酚具有如下结构：
Figure A9880738300041
该结构与天然雌激素雌二醇的结构极其不同：
近年来，植物雌激素(即具有雌激素氧活性并且在植物中发现的天然化合物)已被更多地用于治疗目的。某些被公开的用途是降胆甾醇和抗致动脉粥样化药，治疗具体如绝经后妇女中的心血管疾病，治疗中老年中的骨质疏松症，以及作为抗癌药，尤其是用作治疗妇女的乳腺癌、子宫内膜和子宫颈癌的抗癌药(Knight等人，植物雌激素-近期综述，Maturitas，22：167-75，1995)。
近年来消费者对“天然”型产品的需求在逐渐增长。消费者感到化学合成对环境不安全。化学合成的成分可能含有化学粗品。人们认为天然产品纯净、温和并且优于化学合成产品。然而，释放出植物原料的美容益处并不简单。为了获得“天然”原料的真实益处，不但需要识别植物或植物的一部分中所含有的特定活性物质，还需要确定植物提供实际美容益处的最小浓度和/或具体提取物。
一种已知的植物雌激素是植物茴香脑：
Figure A9880738300051
迄今未公开过植物茴香脑的局部或美容用途。
本发明至少部分是基于对白藜芦醇是一种抑制角质细胞增殖、增强角质细胞分化并减轻可能与使用α-羟基酸有关的刺激或刺痛的植物雌激素的发现。
白藜芦醇是一种可在多种植物中发现的化合物。迄今已公开了从不同植物分离并且定性白藜芦醇，例如从虎杖根部(Powell等人，植物化学35，335页，1994)，从葡萄酒和葡萄(Goldberg等人；农业、食品和化学杂志(J.Agric.Food Chem.)，43，1820页，1995和Cellotti等人，“从干燥Valpolicella葡萄获得的葡萄酒中的白藜芦醇含量”，Recioto&Amarone，色谱学杂志(J ChromatogrA)(Netherlands)730：47-52，1996)，以及从花生植物培养物(Kindl等人，美国专利5391724)中。红葡萄和红葡萄酒含有高含量的白藜芦醇，据称这种化合物是葡萄酒饮用者心血管健康的一个原因。此外，白藜芦醇是一种有效的癌症化学预防剂和抗炎药。另据报导，白藜芦醇可以诱发人体早幼粒细胞白血病细胞分化(Jang等人，衍生自葡萄的天然产物-白藜芦醇的癌症化学预防作用，科学275：218-220，1997)。Jang等人描述了白藜芦醇在培养物中作为致癌物处理小鼠皮肤细胞的抗癌药的用途。
已经公开了含有葡萄提取物的化妆品组合物。例如，参见日本专利申请06336421(“JP‘421”)摘要，其公开了化妆品组合物中0.5％葡萄提取物的用途。Scafildi等人(美国专利5683683)和Zabotto等人(美国专利5439672)公开了含有葡萄籽油的化妆品组合物。Griat等人(美国专利5171577)公开了含有美容性种子的化妆品泡沫。除了JP’421，这些公开文献中无一提及葡萄的用量。JP’421建议葡萄提取物的含量为0.5％。根据美国农业部农业研究司所述，白藜芦醇在全浆果中浓度约是15ppm。那么，白藜芦醇在0.5％葡萄籽提取物中的浓度是0.33微摩尔或0.0000075％(重量)。
上述现有技术没有公开白藜芦醇的皮肤护理用途或美容用途，没有提及白藜芦醇是一种植物雌激素，或者它可以抑制角质细胞增殖，或者它可以促进角质细胞分化，或者它可以调控由α羟基酸引起的皮肤刺激。
发明概述
本发明涉及含有0.00002-10％(重量)白藜芦醇和美容可接受赋形剂的皮肤护理组合物。
本发明还涉及改善或预防皮肤起皱、出现纹路、干燥、薄片状、老化或失去光泽的症状，并且可以提高皮肤的厚度、弹性、柔韧性、光亮度、光泽和丰满性的方法，该方法包括给皮肤涂敷本发明所述组合物。将本发明的组合物局部涂敷在哺乳动物的已经干燥、薄片状、有纹路、起皱、老化、失去光泽的皮肤上；或将本发明的组合物预防性地涂敷在正常健康的皮肤上以防止或减少衰变。
本发明还涉及向皮肤释放雌激素作用，抑制人体皮肤中角质细胞增殖并且提高角质细胞分化的方法。本发明还涉及一种控制由α-羟基酸引起的皮肤刺激、刺痛或炎症的美容方法。在这方面，本发明还涉及含有与α-羟基酸合用的白藜芦醇的美容组合物。发明详述
白藜芦醇(也称作5-对羟基苯乙烯基间苯二酚，或3，4，5’-芪三酚)是本发明组合物的基本组分。白藜芦醇具有以下结构：
白藜芦醇可以购自Sigma。
通常，白藜芦醇在本发明组合物中的含量范围是0.00002-10％(以组合物重量计)。为了降低成本并使作用最强，优选白藜芦醇含量为0.001％-5％，更优选0.1％-5％。
本发明的组合物还含有美容可接受赋形剂，它们在组合物中对白藜芦醇起稀释剂、分散剂或载体作用，目的是当组合物涂敷在皮肤上时更易于分布。
除了水之外，赋形剂可以包括液体或固体润肤剂、溶剂、保温剂、增稠剂和粉末。特别优选的非水载体是聚二甲基硅氧烷和/或聚二甲基苯基硅氧烷。本发明所述聚硅氧烷可以是那些在25℃时粘度为10-10 000 000mm2/s(厘沲)的聚硅氧烷。特别理想的是低粘度和高粘度聚硅氧烷的混合物。上述聚硅氧烷可购自通用电器公司以商标Vicasil、SE和SF出售的产品以及Dow Corning Company出售的200和550系列产品。在本发明组合物中，聚硅氧烷的用量是组合物重量的5％-95％，优选25％-90％。
美容可接受赋形剂通常是组合物重量的5％-99.9％(重量)，优选25％-80％(重量)，并且当不存在其它美容辅料时，占本发明组合物的余量。优选赋形剂至少80％(重量)是水，以赋形剂重量计。优选水至少是本发明组合物的50％(重量)，首选是组合物重量的60％-80％(重量)。
在本发明的一个实施方案中，本发明组合物还还含有α-羟基酸。
羟基酸类化合物在角质细胞中提高增殖并且增强神经酰胺的生物合成，增加表皮厚度，和促进正常皮肤脱落成光滑、新嫩的皮肤。
所述羟基酸选自α-羟基酸，β-羟基酸(例如水杨酸)，其它羟基羧酸(例如二羟基羧酸、羟基二羧酸，羟基三羧酸)，及其混合物，或其立体异构体(DL，D或L)的混合物。
首选含白藜芦醇抗刺激剂的本发明组合物含有乙醇酸和/或乳酸，因为已发现这些组分虽然具有引起刺激的作用，但它们对释放美容益处时特别有效。
优选的羟基酸选自具有如下通式结构(1)的α-羟基酸：
其中M是H或含有1-27个碳原子的饱和或不饱和，直链或支链烃链。
更优选的羟基酸选自：乳酸、2-羟基辛酸、羟基月桂酸、羟基乙酸及其混合物。当存在立体异构体时，首选L-异构体。
本发明组合物的一个具体优点是可以采用较高浓度的羟基酸但不引起皮肤刺激。羟基酸组分在本发明组合物的优选含量是0.01-20％(重量)，更优选2-12％(重量)，并且最优选4-12％(重量)。
应理解，根据组合物的pH，羟基酸可以以盐的形式存在，例如铵盐或钾盐或钠盐。
尽管本发明组合物可以是2.5-10通常范围内的任何值，但本发明组合物在酸性pH(尤其是若组合物含有羟基酸)，优选pH3-5，首选pH3-4下特别有效，因此此类组合物特别刺激。任选的皮肤有益原料和化妆品辅料
油或油性材料可以与乳化剂一起存在于组合物中，从而生成油包水乳状液或水包油乳状液，这很大地取决于所用乳化剂的平均亲水-亲油平衡值(HLB)。
优选本发明所述组合物中含有防晒剂。防晒剂包括那些常用于阻挡紫外线的材料。可例举的化合物是PABA，肉桂酸和水杨酸的衍生物。例如，可以采用甲氧基肉桂酸辛酯和2-羟基-4-甲氧基-二苯酮(也称为羟基甲氧基二苯甲酮)。市售甲氧基肉桂酸辛酯和2-羟基-4-甲氧基-二苯酮的商品名称分别是Parsol MCX和Benzophenone-3。防晒剂在乳状液中的精确用量随所需的防阳光UV辐射程度而变化。
本发明所述化妆品组合物中经常含有润肤剂。所述润肤剂的含量是组合物总重量的0.5％-50％(重量)，优选5％-30％(重量)。按照常规的化学分类，可以将润肤剂分为酯类化合物，脂肪酸类化合物和醇类，多元醇类和碳氢化合物。
所述酯类化合物可以是单酯或二酯类化合物。可接受的脂肪二酯例包括：己二酸二丁酯，癸二酸二乙酯，二聚(亚油)酸二异丙酯，和琥珀酸二辛酯。可接受的支链脂肪酯包括：肉豆蔻酸2-乙基-己酯，硬脂酸异丙酯和棕榈酸异硬脂基酯。可接受的三元酸酯包括：三亚油酸三异丙酯和柠檬酸三月桂基酯。可接受的直链脂肪酯包括：棕榈酸月桂基酯，乳酸肉豆蔻基酯，和油酸硬脂基酯。优选的酯类化合物包括：椰油-辛酸酯/癸酸酯(一种椰油辛酸酯和椰油癸酸酯的混合物)，醋酸丙二醇肉豆蔻基醚酯，己二酸二异丙酯和辛酸鲸蜡基酯。
适用的脂肪醇和酸包括那些含有10-20个碳原子的化合物。更优选例如鲸蜡基，肉豆蔻基，棕榈基和硬脂基的醇和酸。
在多元醇中起润肤剂作用是直链和支链烷基多羟基化合物。例如，优选丙二醇，山梨糖醇和甘油。也可以采用聚合多元醇，例如聚丙二醇和聚乙二醇。还特别优选丁二醇和丙二醇作为渗透促进剂。
具有润肤剂作用的碳氢化合物例如是那些具有12-30个碳原子的碳氢化合物。具体实例包括矿物油，矿脂，角鲨烯和异链烷烃。
本发明化妆品组合物中的另一类功能组分是增稠剂。增稠剂的含量通常是组合物的0.1-20％(重量)，优选约0.5-10％(重量)。可例举的增稠剂是B.F.Goodrich Company以商品名称Carbopol出售的交联聚丙烯酸酯材料。还可以使用树胶，如汉生胶、角叉菜胶、明胶、梧桐胶、果胶和刺槐豆胶。在某些情况下，用作聚硅氧烷或润肤剂的材料也可以起增稠作用。例如，粘度大于10厘沲的聚硅氧烷树胶和酯类化合物如硬脂酸甘油酯具有双重功能。
本发明化妆品组合物中可以掺有粉末。这些粉末包括白垩，滑石，高岭土，淀粉，绿土，化学改性的硅酸镁铝，有机改性的蒙脱石土，水合硅酸铝，煅制二氧化硅，淀粉辛烯基琥珀酸铝及其混合物。
在本发明化妆品组合物中还可以掺入其它次要辅料成分。这些组分包括着色剂，遮光剂和香料。其它这些次要辅料成分的含量是组合物的0.001％-20％(重量)。组合物的应用
本发明的组合物主要作为局部涂敷在人体皮肤上的产品，具体可作为调理、保湿和光滑皮肤，并且防止或减少皱纹、纹路或衰老皮肤出现的物质。
在使用中，从适当的容器中或在必要时用涂敷器具取少量的所述组合物，如1-100ml涂敷在皮肤的暴露部位，随后用手或手指或合适的装置将其分布和/或涂擦到皮肤内。产品的形式和包装
可以将本发明的局部皮肤护理组合物配制为乳液、膏霜或凝胶。组合物被包装在符合其粘度和用户所需用途的适当容器内。例如，将乳液或膏霜装在瓶或滚珠式涂敷器中，或装有适于手指操作泵的抛射剂驱动式气溶胶装置或容器内。当组合物是霜剂时，可以将其直接储存在不变形瓶内或压缩容器内，例如管或有盖子的罐内。还可以将组合物装在胶囊中，如美国专利5 063 507(在此引入作为参考)公开的胶囊。所以，本发明还提供了含有所述美容可接受组合物的封闭容器。
下列具体实施例进一步说明但不限定本发明。在所有实施例中，白藜芦醇购自Sigma。所有p值是用学生t试验计算的。
实施例1
本实施例举例说明了白藜芦醇是一种植物雌激素。
利用以下试验测定白藜芦醇是否具有雌激素样活性。
ZR75细胞系是一种导管性乳腺癌细胞系，最初分离自一名36岁白种妇女的恶性乳房上皮(Engel等人，连续培养中的人体乳腺癌细胞：综述，癌症研究(Cancer Res.)，38：4327-4339，1978)。该细胞系含有雌激素、孕酮和其它甾类激素的受体，但只对雌激素产生增强增殖作用的反应。该细胞系含有高亲和性雌激素特异性受体。所以，适合用该细胞系来测试雌激素样活性(Markiewicz等人，“非甾类植物雌激素的体内生物测定”，甾类化合物的生物化学，分子学和生物学杂志(J.Steroid Biochem.Molec.Biol.)，45：399-405，1993)。细胞内DNA合成速率的测定方法：
将3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入培养细胞中以测定细胞的增殖作用(ZR75细胞和角质细胞两者)。胸腺嘧啶脱氧核苷是DNA单体单元的一种四脱氧核苷。在体细胞进行细胞分裂前，经受细胞分裂的细胞的完全染色体组被复制。这其中包括细胞大规模地合成DNA，同时确保子代细胞获得与遗传物质相同的模板。当在为细胞分裂作DNA合成准备的细胞培养基中含有3H-胸腺嘧啶脱氧核苷时，标记的胸腺嘧啶脱氧核苷随后将被掺混到新合成的DNA中。细胞群内3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入程度与此细胞群的DNA合成速率成比例，因此它是细胞增殖作用的指征。
令ZR75细胞(得自American Type Culture Collection，Rockville，Maryland)在RPMI1640培养基(得自Gibco LifeTechnologies)中生长，所述RPMI1640培养基中含有10％胎牛血清(FBS)，100单位/ml青霉素和100单位/ml链霉素。所有接种均在37℃下的5％CO2中进行。该培养基不含有酚红(一种弱效拟雌激素物质)。细胞的接种密度为1,000,000/75cm2瓶。为了试验，将细胞接种在24孔平板上，密度为100,000细胞/ml/孔。
生长24小时后，除去培养基，用PBS(磷酸盐缓冲盐水，0.01M磷酸钠，0.138M氯化钠，0.0027M氯化钾，pH7.4)洗涤细胞并加入1ml不含有血清(但含有链霉素和青霉素)的RPMI 1640。制备白藜芦醇在二甲基亚砜(DMSO)中的储备液，制备雌二醇在水中的储备液。随后将不同浓度的白藜芦醇和雌二醇(如表1所示)直接施用给每个细胞。又一个24小时之后，向各孔中加入1μCi〔甲基-3H〕胸腺嘧啶脱氧核苷。24小时后除去培养基。细胞用PBS洗涤1次，除去全部PBS，并且将细胞残留在冰上，用1ml/孔的10％TCA(三氯乙酸)孵育30分钟。将平板用5％TCA洗涤3次以彻底洗去未掺入到细胞内的痕量胸腺嘧啶脱氧核苷。在各孔内加入500μl的0.1M氢氧化钠并且将平板在室温下至少保温30分钟。将250μl各样本转移到闪烁管内，在加入5ml计数流体后，在测定氚的设置条件下对各管瓶计数5分钟。与没有加入白藜芦醇或雌二醇的对照孔进行比较，计算出一式四份孔中的胸腺嘧啶脱氧核苷掺杂百分比值。将数据表示为四份孔的平均值+/-标准偏差。
所得结果概括于表1中。
表1
化合物(μM) 实验1DNA合成(对照物的％) 实验1p值 实验2DNA合成(对照物的％) 实验2p值
对照物(水) 100±20.4    --  100±1.9    --
雌二醇(1nM) 220±11 0.00059 133.4±29 0.062
10nM 210±9.7   0.00079  152±17.7   0.0011
100nM 205±15.6   0.0016  156±11.7   0.00008
1000nM 190±24.5   0.0068  142±18.3   0.0039
对照物(DMSO) 100±7.0    --  100±.08    --
白藜芦醇(0.5μM) 69.7±10.0 56.8±4.2
1μM 58.8±9.0  60.5±3.6
5μM  158.8±4.1   0.000008
10μM 207.8±32.5   0.0026  163±13.7   0.00029
15μM  119±2.5   0.00009
20μM 134.8±21.4   0.612  68±3.9
40μM 60.8±26.4
50μM 4.1±1.4
试验1的对照3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺杂值是71513cpm，试验2的对照值为114958cpm。
表1中的结果证明，正如所预期的，雌二醇(一种已知的雌激素)可以刺激ZR 75细胞的增殖。浓度在5-20μM的白藜芦醇可以提高ZR75细胞的增殖作用。
实施例2
本实施例证明白藜芦醇可以抑制角质细胞的增殖作用。1.令分离自新生儿包皮的、经胰蛋白酶处理的正常人体角质细胞在Dulbecco改进Eagle(DME)培养基/5％胎牛血清中生长，该培养基中存在经丝裂霉素C处理的3T3小鼠成纤维细胞，目的是建立分裂的角质细胞群。角质细胞在上述条件下生长直至其第三传代出现。2.为了测试，将第三代角质细胞置于平板上并且将平板放置在含有0.09mM钙的无血清角质细胞生长培养基(KGM-得自Clonetics，SanDiego，CA)中。在6孔细胞培养板的每个孔内加入约30 000个细胞并且使其生长5天，直至细胞达到约40％融合。3.将培养基更新(KBM-得自Clonetics)，并且从DMSO(二甲基亚砜)储备液将不同浓度的白藜芦醇(如表2所示)加入到培养基中。培养物中DMSO的终浓度为0.1％。对照培养物未加入白藜芦醇但加有0.1％DMSO。分别在三个孔中测试每种浓度。4小时后，在每个孔中向每1ml培养基中加入1μCi的3H胸腺嘧啶脱氧核苷(Amersham Corp.，Sp活性40 Ci/mmol)。将细胞保温2小时。按以下方法分析与角质细胞的细胞DNA有关的3H胸腺嘧啶脱氧核苷的量。4.吸出培养基，用1mlPBS洗涤各孔。随后通过加入1ml冰冷的10％TCA将平板细胞中的DNA和蛋白质沉淀出来。将平板在冰上放置30分钟以使沉淀过程达到完全。此后吸去TCA并且各孔用5％TCA洗涤4次。将孔中的细胞溶解在0.5ml的0.1N氢氧化钠中。随后取200μl转移到闪烁管中用于分析胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入情况，取25μl用下述BCA蛋白质测试剂进行蛋白质分析。取5ml闪烁流体(Scintiverse)加入到管瓶中剩余的溶液内，在闪烁计数器中对管瓶计数，测出各管瓶的放射性量。BCA(双金鸡宁酸)-蛋白质分析法
将25μl细胞悬浮液置于96孔平板中。再将溶于0.1N氢氧化钠中的标准BSA(牛血清白蛋白)一式三份移液到同一96孔平板中。加入Pierce BCA蛋白质测试剂(200μl/孔)并且在室温下将平板保温2小时。在Dynatech MR7000平板读数器上、于570nm的波长条件下读取吸光度。
随后，将DNA合成速率计算为各个孔中掺入到全部细胞DNA中的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的cpm/μg细胞蛋白质。还计算每组的平均值和标准偏差。上述数值也可以表达为对照孔的百分比。各数据点表达为三份孔的平均值±标准偏差。
所得结果概括在表2中。
p值小于0.5被认为标明具有统计学意义。表2
    白藜芦醇(μM)     DNA合成(cpm/μg蛋白质)     ％抑制     p值
    实验1
    0     29.52±4.44     0      --
    50     0.62±0.09     98     0.012
    实验2
    0     17.17±1.21     0      --
    0.78     11.57±1.7     33     0.053
    1.56     8.89±1.12     48     0.016
    3.12     5.11±0.27     70     0.0074
    6.25     2.45±0.56     86     0.0053
    12.5     1.07±0.11     94     0.003
    25     0.58±0.05     97     0.0029
    50     0.44±0.12     97     0.0028
从表2的结果可以看出，浓度低至1.56μM的白藜芦醇可以明显降低角质细胞的DNA合成。1.56μM白藜芦醇使角质细胞的增殖减少多达50％。在两个实验中，50μM白藜芦醇完全抑制DNA合成。
实施例3
用其它不同浓度的白藜芦醇重复实施例2。所得结果概括在表3中。
表3
低浓度白藜芦醇对角质细胞摄取胸腺嘧啶脱氧核苷的影响
白藜芦醇浓度 DNA合成(cpm/μg蛋白质) ％抑制    p值 统计学显著性(在p小于0.5下)
  0.0μM  63.4±5.2
  0.1μM  60.4±4.1     5     0.502     无
  0.2μM  56.3±3.0     12     0.079     无
  0.3μM  58.8±0.4     7     0.254     无
  0.4μM  54.2±1.2     14     0.051     无
  0.6μM  59.3±5.5     6     0.310     无
  0.8μM  44.4±2.6     30     0.00013     有
  1.0μM  37.7±4.0     40     ＜0.0001     有
  2.0μM  25.7±2.4     59     ＜0.0001     有
从表3的结果看出，当白藜芦醇浓度低于0.8μM(或0.000018％(重量))，其中包括极低浓度0.33μM(该浓度是JP6336421所公开的0.5％葡萄提取物中白藜芦醇的最大浓度)时不能有效降低角质细胞的增殖作用。
实施例4
本实施例证明白藜芦醇可以诱发角质细胞分化。转谷氨酰胺酶的测定方法：
在表皮分化末期过程中，在细胞外周的内表面上形成一个15nm厚的蛋白质层，它被称为角质化膜(CE)。CE是由多种不同的蛋白质交联在一起构成，这种交联是通过在至少两种不同的在表皮内所表达的转谷氨酰胺酶作用的催化下形成N’-((-谷氨酰基)赖氨酸异二肽键。转谷氨酰胺酶(TG-1)在已分化表皮层尤其是颗粒层中大量表达，但不存在于未分化基底表皮中。所以，TG-1是一种表皮角质细胞分化的有效标记物，当TG-1水平高时，表明处于强分化态。基于ELISA的TG-1测定方法采用TG-1抗体测定下列实施例中培养角质细胞的分化状态。
TG-1的水平测定如下。按照实施例2所述方法得到角质细胞。为了测试，在6孔平板的每个孔内加入约30 000个细胞并且生长5天，直至细胞达到约20-30％融合。每天加入2ml/孔新鲜KGM并且其中含有2μl溶于DMSO中的2-50mM白藜芦醇，共3天。对照孔中也加入2μl DMSO。处理3天后，用PBS洗涤细胞2次并且在冰箱内放置2小时。随后使细胞融化2小时。用DNA结合的荧光团，双-苯并咪唑(Hoechst 33258)并且在450nm(在360nm激发)下测定DNA键合的荧光团的特定荧光，从而定量测出细胞中的DNA含量。
用TG-1特异性单克隆抗体(BC1)(第一抗体)(得自AmershamLife Sciences)和用过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG片段(第二抗体)测定孔内细胞的TG-1水平。平板用5％脱脂乳的TBS(Tris缓冲盐水，0.01MTris，0.150M氯化钠，pH8.0)液阻断平板1小时，随后在室温下用溶于1％牛奶/TBS的第一抗体(稀释1∶4000倍)保温2小时。用含有0.05％吐温20的1％牛奶/TBS将平板冲洗3次，在室温下用1∶4000倍稀释的第二抗体孵育2小时。用1％牛奶/TBS/吐温将平板冲洗3次并且再用TBS洗涤3次。用邻-苯二胺和过氧化氢保温后显色。用Ultrospec 3000分光光度计(Pharmacia Biotech)、在492nm下读取吸光度，以吸光度/DNA荧光计算出TG-1的水平。至少用3个独立孔计算出平均值±标准偏差，并且对数据进行统计学分析。数值表示为TG-1的吸光度/任意单位的三份孔的DNA荧光±标准偏差。结果表示为相对于对照物的百分比。
所得结果概括在表4中。
表4
    白藜芦醇(μM)  TG-1浓度/μgDNA 相对于对照物的百分比     p值
    实验1
    0μM     6.74±0.79      ---    ---
    10μM     8.49±1.77     126   0.1195
    25μM     10.92±2.29     162   0.0008
    50μM     22.2±1.50     329   0.0001
    试验2
    0μM     1.91±0.03     ---    ---
    2μM     3.42±0.42     179  ＜0.0001
    5μM     3.51±0.41     184  ＜0.0001
    10μM     3.61±0.1 7     189  ＜0.0001
    25μM     4.69±0.21     246  ＜0.0001
    50μM     4.65±0.46     243  ＜0.0001
10μM白藜芦醇与实验1中的对照物没有显著性差异，属于生物体系中的正常实验差异，但所有其它浓度均明显增加角质细胞的转谷氨酰胺酶表达，由此证明，白藜芦醇增强了角质细胞的分化。在实验2中，2μM和更高浓度的白藜芦醇明显增强了角质细胞的分化。
实施例5
本实施例证明了白藜芦醇具有减缓由α-羟基酸引起的皮肤炎症的作用。
已知白藜芦醇是一种环加氧酶抑制剂。对环加氧酶的抑制可以减少花生四烯酸转化为前炎症物质，如前列腺素，包括PGE2。虽然抑制环加氧酶应可以减轻炎症，但是不是所有的环加氧酶抑制剂皆可以减轻与化妆品组分如α-羟基酸潜在有关的刺激。
实施例5A刺激试验的方法：
四个暴露斑片试验：目的是比较经过重复斑片敷用后不同测试材料所产生的刺激水平。令测试材料在夹合条件下与皮肤保持接触。在被测成员的外上臂进行涂敷。用绷带式敷料(Scanpor型)使斑片(在直径18mmWebril垫盘上固定有25mm山顶形室)保持原位。用被测成员的两条上臂。斑片以平衡随机顺序贴敷。
在周一上午9：00时贴上斑片并且在周二上午9：00取下(暴露24小时)。在周二下午3：00时贴上新的斑片并且在周三上午9：00取下(暴露18小时)。在周3下午3：00时贴上第三套斑片并且在周四上午9：00取下(暴露18小时)。在周四下午3：00时贴上最后一套斑片并且在周五上午9：00取下(暴露18小时)。
每次取下斑片后，用热水漂洗斑片所在位置并且擦干。随后用外科皮肤标记笔标出测试位置以确定分级和下次贴斑片的位置。
在实验的周二、周三、周四和周五下午3：00时，在再贴斑片之前对试验位置进行评估。
可以预料到试验位置出现皮肤刺激如中度发红、干燥和/或瘙痒。试验位置可能会溶胀。若在任何评估中试验位置出现中度红色或肿胀，不在该被测位置重新贴斑片。
在常规光线下，由两名训练有素的试验人员对每条手臂上的被测位置目测分级。按照严重程度的顺序将被测位置分级。在第一评估阶段对反应进行分级的试验人员连续在整个试验中的每1天对被测位置进行分级。
在反应分级中，反应最严重的被测位置所得的分值最低。反应的严重程度为其次的被测位置获得第二低的分值，依此类推。不强制分级。若两个或更多位置没有反应或反应相同(被测位置间没有差别)，可以赋予平均等级值。若被测位置因刺激程度的不同而不连续时，该位置仍保留其接受不连续给药时的等级。统计学分析：
采用非参数统计法将斑片处理所得的分级结果进行统计学比较。将含有抗刺激剂的试验材料与只含有羟基酸的相应空白对照比较，用被测人员在各个评估点处的弗里德曼级数和(Friedman’s RankSum)作为数据块(即，每名被测成员接受各种试验处理)。p值小于0.10时被认为具有统计学意义。
利用刺激试验法对所含组分如表5A所示的组合物进行测试。20人接受测试。所得结果概括在表5A中。级数之和越高，刺激作用越小。
基础配方
CFTA命名的化学全称 商品名称和％活性  重量％
去离子水  46.54
EDTA二钠 Sequesterene Na2  0.05
硅酸镁铝 Veegum Ultra  0.6
对羟基苯甲酸甲酯 对羟基苯甲酸甲酯  0.15
聚甲基硅氧烷(simethicone) DC抗泡沫乳状液  0.01
1，3-丁二醇 1，3-丁二醇  3.0
羟乙基纤维素 Natrosol 250HHR  0.5
甘油，USP 甘油USP  2.0
汉生胶 Keltrol 1000  0.2
三乙醇胺 三乙醇胺99(％)  1.2
硬脂酸 Pristerene 4911  3.0
对羟基苯甲酸丙酯NF 对羟基苯甲酸丙酯NF  0.1
氢化硬脂酸甘油酯 Naturechem GMHS  1.5
硬脂基醇 Lanette 18DEO  1.5
棕榈酸异硬脂基酯 Protachem ISP  6.0
辛酸C12-15醇酯 Hetester FAO  3.0
聚二甲基硅氧烷 聚硅氧烷流体200(50cts)  1.0
胆甾醇NF 胆甾醇NF  0.5
硬脂酸脱水山梨糖醇酯 硬脂酸脱水山梨糖醇酯  1.0
丁基化羟基甲苯 Embanox BHT  0.05
乙酸生育酚酯 乙酸维生素E酯  0.1
PEG-100硬脂酸酯 MYRJ 59  2.0
硬脂酰基乳酸钠 Pationic SSL  0.5
棕榈酸视黄酯 棕榈酸维生素A酯84％  0.06
羟基辛酸 羟基辛酸  0.1
去离子水 适量至99.80
α-没药醇 α-没药醇  0.2
pH  7-8
表5A
组合物     组分 级数之和(第1天)  级数之和(第4天)
    1 基础配方   65.5     79.5
    2 基础配方+8％羟基乙酸   63     72
    3 组合物#2+0.1％白藜芦醇   85a     66
a： 刺激性明显小于组合物2。
从表5A的结果可以看出，白藜芦醇(组合物3)极大地减小了由在第1天与组合物#2(含有8％羟基乙酸)初步相接触所引起的刺激。对比实施例5B
利用实施例5A中的刺激试验方法对所含组分如表5B所示的组合物进行测试。22人接受测试。所得结果概括在表5B中。级数之和越高，刺激作用越小。
表5B
组合物     组分 级数之和(第1天)   级数之和(第4天)
    1 基础配方   81     90.5
    2 基础配方+8％羟基乙酸   75     73.5
    4 组合物#2+5％布洛芬   71.5     65.5
从表5B所示结果可以看出，布洛芬(一种已知的抗炎成分)(组合物#4)不能减轻含有8％羟基乙酸的配方(组合物#2)所引起的刺激性。对比实施例5C
利用实施例5A中的刺激试验法对所含组分如表5C所示的组合物进行测试。19人接受测试。所得结果概括在表5C中。级数之和越高，刺激作用越小。
表5C
组合物     组分 级数之和(第1天) 级数之和(第4天)
    2 基础配方+8％羟基乙酸   70   62.5
    5 组合物#2+1％消炎痛   53.5   52.5
从表5C的结果可以看出，消炎痛(一种已知的环加氧酶抑制剂和抗炎药成分)(组合物#5)不能减轻含有8％羟基乙酸的配方(组合物#2)所引起的刺激性。
实施例6-11举例说明本发明的皮肤护理组合物。可以以常规方式加工这些组合物。它们适宜于美容用途。特别是，适合将这些组合物涂敷在起皱的、有纹路的、粗糙的、干燥的、薄片状的、衰老的和/或紫外损伤的皮肤上，从而改善其外观和感觉，也可以将组合物涂敷在健康皮肤上以预防或延缓其衰变。所述组合物还特别适用于减轻与使用α-羟基酸有关的刺激、刺痛或炎症。实施例6
本实施例举例说明掺有本发明组合物的高内相油包水乳状液。
    ％w/w
    白藜芦醇     0.5
 1，3-二甲基-2-咪唑啉酮     0.2
    Brij 92*     5
    皂土 38     0.5
    MgSO4 7H2O     0.3
    丁基化羟基甲苯     0.01
    香料     适量
    水     至100
*Brij 92是聚氧乙烯(2)油基醚。
实施例7
本实施例举例说明掺有本发明组合物的水包油膏霜。
    ％w/w
    白藜芦醇     2
    羟基乙酸     8
    矿物油     4
 1，3-二甲基-2-咪唑啉酮     1
    Brij 56*     4
    Alfol 16RD*     4
    三乙醇胺     0.75
    丁烷-1，3-二醇     3
    汉生胶     0.3
    香料     适量
    丁基化羟基甲苯     0.01
          水     至100
*Brij 56为鲸蜡基醇POE(10)*Alfol 16RD是鲸蜡基醇实施例8
本实施例举例说明掺有本发明组合物的醇性洗液。
    ％w/w
        白藜芦醇     5
 1，3-二甲基-2-咪唑啉酮     0.1
          乙醇     40
          香料     适量
    丁基化羟基甲苯     0.01
          水     至100
实施例9
本实施例举例说明含有本发明组合物的另一种醇性洗液。
    ％w/w
    白藜芦醇     10
 1，3-二甲基-2-咪唑啉酮     0.01
    乙醇     40
    抗氧剂     0.1
    香料     适量
    水     至100
实施例10
本实施例举例说明掺有本发明组合物的防晒霜。
  ％w/w
    白藜芦醇     2
  1，3-二甲基-2-咪唑啉酮     0.2
    硅油200cts     7.5
    甘油单硬脂酸酯     3
    十六醇十八醇混合物     1.6
  聚氧乙烯-(20)-鲸蜡基醇     1.4
    汉生胶     0.5
    Parsol 1789     1.5
甲氧基肉桂酸辛酯(PARSOLMCX)     7
     香料     适量
    着色剂     适量
      水     至100
实施例11
本实施例举例说明掺有本发明组合物的非水护肤组合物。
    ％w/w
    白藜芦醇     5
  1，3-二甲基-2-咪唑啉酮     1
    硅胶SE-301     10
    聚硅氧烷流体3452     20
    聚硅氧烷流体3443     50.26
    角鲨烯     10
    亚油酸     0.01
    胆甾醇     0.03
    2-羟基-正-辛酸     0.7
    维生素E亚油酸酯     0.5
    中草药油     0.5
    乙醇     2
1一种二甲基硅氧烷聚合物，分子量至少为50 000，并且25℃时的粘度至少为10 000厘沲，购自GEC；2环状二甲基硅氧烷五聚物，购自Dow Corning Corp.；3二甲基硅氧烷四聚物，购自Dow Corning Corp.。

Claims (7)

1.一种护肤组合物，其含有0.00002-10％(重量)的白藜芦醇和美容可接受的赋形剂。
2.一种将植物雌激素输送到人体皮肤的美容方法，该方法包括将含有0.00002-10％(重量)的白藜芦醇和美容可接受赋形剂的组合物涂敷在皮肤上。
3.一种改善起皱、有纹路、干燥、薄片状、老化或光损伤皮肤的外观并且改善皮肤厚度、弹性、柔韧性和丰满度的美容方法，该方法包括将权利要求1所述的组合物涂敷在皮肤上。
4.一种增强人体皮肤中角质细胞分化的美容方法，该方法包括将权利要求1所述的组合物涂敷在皮肤上。
5.一种抑制人体皮肤中角质细胞增殖的美容方法，该方法包括将权利要求1所述的组合物涂敷在皮肤上。
6.一种护肤组合物，其含有：
(a)0.00002-10％(重量)的白藜芦醇；
(b)0.01％-20％(重量)的羟基酸；和
(c)美容可接受的赋形剂。
7.权利要求7所述的组合物，其中羟基酸的含量为2％-12％。
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