JP2008503479A - Bax媒介性アポトーシスを調節する方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、米国国立保健研究所からの助成金番号GM068072;AG19719 及び AG19972 を受けてなされた。政府は本発明の特定の権利を有するものである。
本出願は、引用をもってその内容をここに特に援用することとする、2004年6月16日出願の米国仮出願 No. 60/580,169号に基づく権利を主張するものである。
腫瘍抑制の鍵となる機序はアポトーシスによる細胞死である。このプロセスでかぎとなる調節ステップは、アポトーシス促進因子Baxの活性化である。Baxが細胞損傷により活性化される機序は依然、不明であるが、いくつかの下流の事象が解明されている。Baxは、その活性化後に外側のミトコンドリア膜に移動してオリゴマー化し、膜を透過性にして、チトクロームcを含むいくつかの細胞死促進因子を放出させる
(Scorrano and Korsmeyer, Biochem.
Biophys. Res. Commun. 304, 437-444 (2003))。
et al., Nat. Cell Biol. 5, 320-329 (2003)) 。更に、Ku70とBaxとの間の相互作用は紫外線損傷後に失われる。まとめると、これらの結果は、Ku70が、Bax媒介性アポトーシスの生理学的に重要な阻害剤であることを実証しているのである(Sawada et al., Nat. Cell Biol. 5, 320-329 (2003)) 。
412:607-614 (2000))。 Ku70 ノックアウトマウスは、電離性放射線に対して過敏であり (Ouyang et al., J. Exp. Med. 186, 921-929 (1997)) 、免疫無防備状態であり (Manis et al., J. Exp. Med. 187, 2081-2089 (1998)) 、そして胚発生中の高いアポトーシス性神経細胞死率を有する (Gu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
97: 2668-2673 (2000))。興味深いことに、Ku70ノックアウトマウス由来の細胞は、DNA損傷なしでもアポトーシスを促進するスタウロスポリン(STS)などの薬剤に対しても過敏である (Chechlacz et al., J. Neurochem. 78, 141-154 (2001))。このことは、DNA修復におけるその役割とは独立の、アポトーシスを抑制する上でのKu70の生理学的役割と一致する。Ku70
は主に核内たんぱく質であるが、それの細胞質側プールが少ないことが、Baxによる切り離しを担っているのではないかと考えられる (Sawada et al., Nat. Cell Biol. 5, 320-329 (2003)) 。DNA末端ジョイニングとアポトーシス抑制というKu70の二重の役割を考えると、それはおそらく、細胞生存とプログラムされた細胞死との間の決定によりDNA修復を調和させる中心的な因子であろう。
アミノ酸残基K317、K338、K539、K542、K544、K553 又は K556から成る群より選択されるアセチル化アミノ酸残基を含む、単離されたアセチル化Ku70たんぱく質及びその部分がここで提供される。単離された本Ku70 たんぱく質は、SEQ ID NO: 2に少なくとも95%同一なアミノ酸配列を含むと思われ、この場合、本Ku70 たんぱく質は、それがアセチル化していないときはBax又はアセチルトランスフェラーゼと、あるいは、アセチル化しているときには脱アセチル化酵素と、相互作用する。単離された本Ku70 たんぱく質は、SEQ ID
NO:2 又はその一部分を含むであろう。単離された本Ku70
たんぱく質又はその部分は、アセチル化残基K539
又はK542を含むであろう。
ヒストン脱アセチル化酵素及び/又はサーチュインなどの単離された脱アセチル化酵素とを含む。Ku70たんぱく質又はその部分はアミノ酸残基K539 又は K542を含むであろう。
又は PCAF あるいはこれらの生物学的活性部分に接触させるなどにより、Ku70のアミノ酸残基K539 又は K542 のアセチル化を調節する作用物質を特定するために用いてもよい。
又はK542 の脱アセチル化を調節する作用物質を特定する方法の一例は、(i)アセチル化アミノ酸残基K539
又は K542を含むKu70たんぱく質又はその部分を、ヒストン脱アセチル化酵素又はその生物学的活性部分に、検査化合物の存在下、かつ、K539又はK542の脱アセチル化が前記検査化合物の非存在下でも可能な条件下で、接触させるステップと、(ii)K539又はK542のアセチル化レベルを判定するステップとを含み、この場合、前記検査化合物の非存在下に比較したときの前記検査化合物の存在下でのK539又はK542のアセチル化レベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質のアミノ酸残基K539又はK542の脱アセチル化を調節する作用物質であることの指標である。
本発明は、アセチル化Ku70はBax媒介性アポトーシスを促進し、他方、脱アセチル化Ku70はアポトーシスを阻害することにより長寿を促進するという発見に少なくとも部分的に基づくものである。
便宜上、本明細書、実施例及び付属の請求項で用いられたいくつかの用語をここに集める。他に定義しない限り、ここで用いられた全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。
(SCR1) 及び単球性白血病亜鉛フィンガーたんぱく質(MOZ)がある。
及びNP_620118がある。ヒトBaxアイソフォームεのヌクレオチド及びアミノ酸配列の例には、それぞれNM_138764及びNP_620119がある。ヒトBaxアイソフォームσのヌクレオチド及びアミノ酸配列の例には、それぞれNM_138765 及びNP_620120がある。
受託番号 NT_011520 及びAC144560.3に見ることができる。マウスKu70のヌクレオチド及びアミノ酸配列の例は、GenBankTM受託番号:NM_010247、NP_034377、AH006747、及びNT_081922である。ラットKu70のヌクレオチド及びアミノ酸配列の例は、GenBankTM受託番号:NM_139080、NP_620780、AB066102、及びNW_047781である。Ku70/Ku80ヘテロ二量体は非相同末端ジョイニングによるDNA二本鎖破損の修復や、V(D)J組換えを通じた抗体及びT細胞受容体遺伝子の再編成に必須である (Featherstone et al., Mutat. Res. 434:3-15 (1999))。
Brace & Co., San Diego社の一部門であるDoolittle,
Academic Press 社編集のMethods in
Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis
(1996)に解説されている。好ましくは、配列中のギャップを許容するアライメント・プログラムを用いて配列をアライメントするとよい。Smith-Watermanは、配列アライメントにおいてギャップを許容するアルゴリズムの一種である。Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997) を参照されたい。更に、 Needleman 及びWunsch アライメント法を用いたGAPプログラムも、配列をアライメントするために用いることができる。ある代替的な検索戦略は、MASPARコンピュータで作動するMPSRCHソフトウェアを用いるものである。MPSRCHはSmith-Waterman アルゴリズムを用いて、超並列処理コンピュータで配列を採点する。このアプローチは関係の遠い対合を取り出す能力を向上させるものであり、小さなギャップやヌクレオチド配列エラーに特に寛容である。核酸にコードされたアミノ酸配列を用いて、たんぱく質及びDNAの両方のデータベースを検索することができる。
ID NO:13 及び14)に相当する。他のファミリー・メンバーには、「HST 遺伝子」(homologues
of Sir two)と呼ばれる四つの更なる酵母
Sir2-様遺伝子HST1、HST2、HST3及びHST4、及び5つの他のヒト相同体hSIRT3バリアント(Genbank 受託番号 NM_012239 及びNP_036371に相当する;それぞれSEQ ID NO:15 及び16)、hSIRT3 バリアント b (GenBank 受託番号 NM_001017524 及びNP_001017524に相当する;それぞれSEQ ID NO:17 及び 18) hSIRT4 (Genbank 受託番号 NM_012240 及びNP_036372に相当する;それぞれSEQ ID NO:19 及び20)、hSIRT5 (バリアント1の場合Genbank 受託番号 NM_012241 及び NP_036373 (それぞれSEQ ID NO:21 及び22) に、そしてバリアント2の場合 NM_031244 及びNP_112534(それぞれSEQ ID NO:23 及び24)に相当する)、hSIRT6 (Genbank 受託番号 NM_016539 及びNP_057623に相当する; それぞれSEQ ID NO:25 及び26)及びhSIRT7 (Genbank 受託番号 NM_016538 及びNP_057622に相当する; それぞれSEQ ID NO:27 及び28) (Brachmann
et al. (1995) Genes Dev. 9:2888 and Frye et al. (1999) BBRC 260:273)、がある。好適なサーチュインは、例えばSIRT3が有するように、SIRT1に在ってSIR2には無いN末端配列の少なくとも一部分を有するメンバーなど、SIRT2に対してよりも、SIRT1、即ちhSIRT1、及び/又はSir2に対する方がより類似性の高いものである。
amu未満、又は約1000 amu未満、そして更には約500 amu未満の分子量を有する組成物を言う。低分子は、例えば核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ペプチドミメティック、糖、脂質又は他の有機(含炭素)又は無機分子である。多くの製薬企業が、ここで解説された検定のいずれかでスクリーニングすることのできる、しばしば真菌、細菌、又は海草抽出物である化学的及び/又は生物学的混合物の広範なライブラリを有する。用語「低分子」とは、しばしば有機又は医療用化合物であるとして同定される低分子を言い、核酸のみ、ペプチドのみ又はポリペプチドのみである分子を含まない。
Basis of Therapeuticsなどの公知の文献に解説されており、それらには、限定はしないが、医薬;ビタミン;ミネラル補助剤;疾患又は疾病の処置、防止、診断、治癒又は軽減に用いられる物質;身体の構造又は機能に影響する物質;又は、生理学的環境に置かれた後に生物学的に活性になる、又はより活性になる、プロドラッグ、がある。
vitroでの化学合成又は酵素合成による作製を言う。
Groups in Organic Synthesis, 2nd ed.; Wiley: New York, 1991)でGreene氏及びWuts氏cによりレビューがなされている。
Groups in Organic Chemistry 、第2章 (McOmie, ed., Plenum Press, New York, 1973)に論じられている。適した基の例には、アシル保護基、例えば、例示するなら、ホルミル、ダンジル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、スクシニル、メトキシスクシニル、ベンジル及び置換ベンジル、例えば3,4-ジメトキシベンジル、o-ニトロベンジル、及びトリフェニルメチル;式-COORのもの(但し式中、Rにはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、2,2,2-トリクロロエチル、1-メチル-1-フェニルエチル、イソブチル、t-ブチル、t-アミル、ビニル、アリル、フェニル、ベンジル、p-ニトロベンジル、o-ニトロベンジル、及び2,4-ジクロロベンジルなどの基が含まれる);アシル基及び置換アシル、例えばホルミル、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、及びp-メトキシベンゾイル;並びに他の基、例えばメタンスルホニル、p-トルエンスルホニル、p-ブロモベンゼンスルホニル、p-ニトロフェニルエチル、及びp-トルエンスルホニル-アミノカルボニル、がある。好適なアミノ遮断基はベンジル(-CH2C6H5)、アシル [C(O)R1] 又はSiR13 (但し式中、R1はC1-C4 アルキル、ハロメチル、又は2-ハロ-置換-(C2-C4 アルコキシ)である)、芳香族のウレタン保護基、例えばカルボニルベンジルオキシ(Cbz);並びに脂肪族のウレタン保護基、例えばt-ブチルオキシカルボニル(Boc)又は9-フルオレニルメトキシカルボニル(FMOC)、である。
Ku70たんぱく質又はその部分、例えばアセチル化アミノ酸残基を好ましくは含むペプチド、がここで提供される。Ku70たんぱく質は、例えばヒト又は非ヒト哺乳動物など、哺乳動物などのいずれかの生物由来であってもよい。Ku70たんぱく質は、例えばChan et al. (1989) J. Biol.
Chem. 264:3651; Reeves et al. J.
Biol. Chem. (1989) 264:5047; Griffith et al. (1992) Mol. Biol. Rep. 16:91; 及び Tuteja et al. (1994) EMBO J.
13:4991に解説されている。
1に記載されたヌクレオチドなどにコードされた(それぞれGenBank 受託番号 NM_001469 及びNP_001460に相当する)ヒトKu70たんぱく質である。SEQ ID NO: 2 から成るアミノ酸配列を有するたんぱく質をここでは「野生型ヒトKu70」と言及する。SEQ ID NO: 1 の開放読み取り枠はヌクレオチド 656 から2485に相当する。Ku70のDNA結合ドメインは、SEQ ID NO: 1のヌクレオチド1484から1678にコードされており、SEQ ID NO: 2のアミノ酸277 から341 に相当する。SEQ ID NO: 1 のヌクレオチド758 から2242 は、SEQ ID NO: 2のアミノ酸 35 から 529をコードしており、中央のDNA結合ベータ・バレル、ポリペプチド環、及びC末端のアームを含む。SEQ ID NO: 1のヌクレオチド 2066 から2332 は、Ku70/Ku80 C末端アームに相当する、SEQ ID NO: 2のアミノ酸 471 から 559 をコードしている。SEQ ID NO: 1のヌクレオチド 1772 から 2101は、Ku80結合ドメインを含む、SEQ ID NO: 2のアミノ酸373 から 482 をコードしている。SEQ ID NO: 1のヌクレオチド 2270 から2335は、リンカ/核内移行シグナルを含む、SEQ ID NO: 2のアミノ酸 539 から 560 をコードしている。SEQ ID NO: 1のヌクレオチド 2387 から 2416 は、Bax結合ドメインを含む、SEQ ID NO: 2のアミノ酸 578 から 587 をコードしている。SEQ ID NO: 1のヌクレオチド 2372 から 2476 は、SAPドメインに相当する、SEQ ID NO: 2のアミノ酸 573 から 607をコードしている(例えば GenBank 受託番号 NM_001469の解説を参照されたい)。
I. 小さな脂肪族の、非極性又は僅かに極性の残基: Ala、Ser、Thr、Pro、Gly
II. 極性の、負に帯電した残基及びそれらのアミド: Asp、Asn、Glu、Gln
III. 極性の、正に帯電した残基: His、Arg.、Lys
IV. 大きな脂肪族の非極性の残基: Met、Leu、Ile、Val、Cys
V. 大きな芳香族の残基: Phe、Try、Trp
約2.0 x SSC の低ストリンジェンシーから約 0.2 x SSCの高ストリンジェンシーまでから選択することができる。加えて、洗浄ステップの温度を、低ストリンジェンシー条件の室温である約22℃から高ストリンジェンシー条件の約65℃まで増加させることができる。温度及び塩の両者ともを変更してもよく、あるいは塩濃度の温度を一定に維持して他方の変項を変更してもよい。好適な核酸は、SEQ ID NO: 1又はその一部分を含む核酸に、例えば65℃の0.2 x SSCでのハイブリダイゼーション及び洗浄条件など、ストリンジェンシーの高い条件下でハイブリダイズするものである。
Brace Jovanovich, San Diego (1990)などに解説されている。
HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9、及び
HDAC10 がある(Fischle, W., et al., J.
Biol. Chem, 274, 11713-11720
(1999))。
HDAC ヌクレオチド配列 アミノ酸配列 保存ドメイン
(アミノ酸中)
HDAC1 NM_004964 NP_004955 28-321
HDAC2 NM_001527 NP_001518 29-322
HDAC3 NM_003883 NP_003874 3-315
HDAC4 NM_006037 NP_006028 91-142;
653-994
HDAC5i1 NM_001015053 NP_001015053 683-1026
i2 NM_005474 NP_005465 682-1025
HDAC6 NM_006044 NP_006035 1132-1180;
883-1068;480-796;
84-404
HDAC7Ai1 NM_015401 NP_056216 519-829
i2 NM_016596 NP_057680 479-789
HDAC8 NM_018486 NP_060956 16-324
HDAC9i1 NM_014707 NP_055522
i2 NM_058176 NP_478056 633-974
i3
NM_058177 NP_478057 633-860
i4 NM_178423 NP_848510 633-974
i5 NM_178425 NP_848512 636-977
HDAC10 NM_032019 NP_114408 1-315
HDAC11 NM_024827 NP_079103 17-321
1(サイレント接合型情報調節2
相同体)1 は、SEQ ID NO: 10 に記載されたアミノ酸配列を有し、SEQ ID NO: 9 に記載されたヌクレオチド配列にコードされている(それぞれGenBank 受託番号 NP_036370 及び NM_012238にコードされている)。SEQ ID NO: 10 のコーディング領域はヌクレオチド54 から 2297に相当する。SEQ ID NO: 9のヌクレオチド 534 から 48は、サーチュイン5及び関連するクラスIIIサーチュイン(SIR2ファミリー)の保存ドメインに相当する、SEQ ID NO: 10のアミノ酸161 から 565 をコードしている。SEQ ID NO: 9のヌクレオチド 237 から 932は、NAD結合ドメインや基質結合ドメインを包含する、SEQ ID NO: 10のアミノ酸 62-293をコードしている。従って、この領域は時にはコアドメインと呼ばれることがある。しかしながら、SIRT1のコアドメインは、SEQ ID NO: 9のヌクレオチド834 から1394 にコードされた、SEQ ID NO: 10の約アミノ酸 261 から 447と言及されたり;SEQ ID NO: 9のヌクレオチド 777 から 1532 にコードされた、SEQ ID NO: 10の約アミノ酸 242 から 493と言及されたり;あるいは、SEQ ID NO: 9のヌクレオチド813 から 1538にコードされた、 SEQ ID NO: 10の約アミノ酸254から 495 と言及されることもある。SEQ ID NO: 9のヌクレオチド750 から 767 は、推定上の核内局在化シグナルをコードしている。サーチュインの構造は、更に例えばZhao et al. PNAS 101:8563
(2004) 及びそこで引用された参考文献や、 Bitterman et al. (2003) Microbiol.
Mol. Biol. Rev. 67:376に解説されている。
Sirt ヌクレオチド配列 アミノ酸配列 保存ドメイン
(アミノ酸)
SIRT1 NM_012238
NP_036370
431-536;
254-489
SIRT2 i1 NM_012237 NP_036369
77-331
i2 NM_030593 NP_085096 40-294
SIRT3 ia NM_012239
NP_036371
138-373
ib NM_001017524
NP_001017524
1-231
SIRT4 NM_012240
NP_036372 47-308
SIRT5 i1 NM_012241
NP_036373
51-301
i2 NM_031244 NP_112534 51-287
SIRT6 NM_016539
NP_057623
45-257
SIRT7 NM_016538
NP_057622
100-314
et al., 1985 In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,
Inc., pp. 77−96を参照されたい)及びファージ・ディスプレイ、がある。ヒトモノクローナル抗体は、ここで解説された方法の実施で用いられてもよく、また、ヒトハイブリドーマを用いる(Cote et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026を参照されたい)、 あるいはヒトB細胞をエプスタイン−バー−・ウィルスでin vitroで形質転換することでも、作製できよう(Cole et al. In: Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy,
Alan R. Liss, Inc., pp. 77−96 (1985) を参照されたい)。
癌に罹患しているなどの個体にとっての治療計画の効験を判断することができる。アセチル化又は脱アセチル化Ku70ポリペプチドのレベルは、例えば脳脊髄益試料又は羊水試料など、体液中の細胞から測定してもよく、あるいは、生検で生じるものなど、組織中で測定することもできる。
Ku70たんぱく質の活性を調節することで、アポトーシスを調節するなどする化合物を特定するためのスクリーニング法は、Ku70たんぱく質と結合たんぱく質(又は相互作用性分子)、例えばアセチルトランスフェラーゼ、脱アセチル化酵素、Bax又はKu80あるいはこれらの部分など、との間の相互作用を調節する化合物をスクリーニングするステップを含むであろう。例としてのスクリーニング法は、Ku70たんぱく質と、アセチルトランスフェラーゼ又は脱アセチル化酵素との間の相互作用を調節する化合物を特定するステップを含むものである。アセチルトランスフェラーゼはCBPでも、PCAFでも、又はp300でもよい。脱アセチル化酵素は、クラスI/IIヒストンデアセチラーゼでも、又は、サーチュインなどのクラスIIIデアセチラーゼでもよい。
少なくとも部分的に脱アセチル化しているとよい。例えば、Ku70たんぱく質又はその部分がリジンK539 及び/又は K542で脱アセチル化していることであり、好ましくは両者のアミノ酸で脱アセチル化しているとよい。反応が脱アセチル化酵素を含む場合、Ku70 たんぱく質又はその部分は、このKu70たんぱく質又はその部分が脱アセチル化酵素を相互作用することができるように、少なくとも部分的にアセチル化しているとよい。
Chemicals社、ビオチニレーション・キット)を用いて調製し、ストレプトアビジンで被膜した96ウェル・プレート(Pierce Chemical社)のウェル中に固定することができる。アセチル化又は脱アセチル化Ku70たんぱく質又はその部分のいずれかとは反応性であるが、Ku70たんぱく質又はその部分と結合たんぱく質との間の相互作用には好ましくは干渉しないような抗体を、プレートのウェルに誘導体化し、Ku70をこのウェルに抗体結合により捕獲することができる。上述したように、結合たんぱく質及び検査化合物の標品を、Ku70を容れたプレートのウェル内でインキュベートし、ウェルに捕獲された複合体の量を、定量することができる。このような複合体を検出する方法の例には、GST-固定化複合体に関して上述したものに加え、結合たんぱく質と反応性の、あるいは、Ku70たんぱく質に対して反応性で結合たんぱく質と競合する、抗体を用いた複合体の免疫検出;結合たんぱく質に伴う、固有又は外因性の活性である酵素活性を検出することに依拠する酵素結合検定法、がある。後者の場合、酵素を化学結合させるか、あるいは、結合たんぱく質との融合たんぱく質として提供することができる。実例を挙げると、結合たんぱく質を、西洋わさびペルオキシダーゼに、化学的に架橋させるか、又は遺伝子融合(それがポリペプチドである場合)させ、複合体に捕獲されたポリペプチドの量を、例えば3,3'-ジアミノ-ベンズアジンテトラヒドロクロリド又は4-クロロ-1-ナフトールなど、この酵素の色素産生性基質で評価することができる。同様に、当該ポリペプチド及びグルタチオン-S-トランスフェラーゼを含む融合たんぱく質を提供し、複合体形成を、1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼンを用いてGST活性を検出することにより、定量することができる(Habig et al (1974) J Biol Chem 249:7130)。
反応が脱アセチル化酵素を含む場合、Ku70たんぱく質又はその部分は、好ましくは、このKu70たんぱく質又はその部分が脱アセチル化できるように、少なくとも部分的にアセチル化しているとよい。
を用いても、アセチル化のレベルを判定できよう。
Biol. Chem. 277:18881; Bitterman et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:45099; Anderson et al. (2003) Nature 423:181 及び Howitz et al. (2003) Nature 425:191; Bitterman et al. (2003) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67:376に解説されている。C.エレガンスでの寿命の測定は、例えばGarigan
et al. Genetics (2002)161:1101;
Tissenbaum and Guarente (2001) Nature
410:227 及び Apfeld and
Kenyon et al. (1999) Nature 402:804で解説された通りに行うことができる。ドゥロソフィラでの寿命の測定は、例えば Marden et al. (2003) PNAS
100:3369で解説された通りに行うことができる。
更にここでは、例えば細胞のアポトーシスを調節するためなどの方法;細胞の寿命を調節する方法;及び腫瘍のサイズ又は成長を減らす方法も提供される。方法には、例えばKu70たんぱく質とアセチルトランスフェラーゼ又は脱アセチル化酵素との間の相互作用を調節する、あるいは、Ku70たんぱく質のアセチル化のレベルを調節する、などにより、Ku70たんぱく質とBaxとの間の相互作用を調節するステップを含めてもよい。
このような作用物質は、当業で公知の方法に従って、スクリーニング法で特定することができる。脱アセチル化酵素の活性の減少は、Luo et al. (2001) Cell
107:137などに解説されたSIRT1の変異型H363Yなど、脱アセチル化酵素のドミナント・ネガティブ変異体を細胞内に導入するか、又は細胞内で発現させることにより、達成されよう。
(2001) Cancer Chemother. Pharmacol. 48: S20, Johnstone et al. (2003) Cancer
Cell 4:13 and Mai et al.
(2005) Medicinal Res. Rev. 25:261) がある。
ヒストンデアセチラーゼの活性を阻害する化合物には、ニコチンアミド(NAM)、スラニム;スフィンゴシン;NF023 (Gたんぱく質アンタゴニスト);NF279
(プリン作動性受容体アンタゴニスト);Trolox(6-ヒドロキシ-2,5,7,8,テトラメチルクロマン-2-カルボン酸); (-)-エピガロカテキン (部位3,5,7,3’,4’, 5’に水酸基);(-)-エピガロカテキンガレート(水酸基部位 5,7,3’,4’,5’ 及びガレーとエステルは3);シアニジンクロリド (3,5,7,3’,4’-ペンタヒドロキシフラビリウムクロリド);デルフィニジンクロリド (3,5,7,3’,4’,5’-ヘキサヒドロキシフラビリウムクロリド);ミリセチン(カンナビセチン;3,5,7,3’,4’,5’-ヘキサヒドロキシフラボン);3,7,3’,4’,5’-ペンタヒドロキシブラボン;及びゴシペチン (3,5,7,8,3’,4’-ヘキサヒドロキシフラボン) がある(これらはすべて、Howitz et al. (2003) Nature 425:191に解説されている)。他の阻害剤は、WO 05/002672で解説された4-ヒドロキシ-trans-スチルベン;N-フェニル-(3,5-ジヒドロキシ)ベンズアミド;3,5-ジヒドロキシ-4’-ニトロ-trans-スチルベン; 4-メトキシ-trans-スチルベン;クロロテトラサイクリン、4-ブロモフェニル-3-クロロ-プロペノン及びメトトレキセートである。阻害剤はまたWO 05/026112にも解説されている。シルチノール及びスプリトミシンなどの他の阻害剤は Grozinger et al. (2001) J.
Biol. Chem. 276:38837, Dedalov et al. (2001) PNAS 98:15113 及び Hirao et al. (2003) J. Biol.
Chem 278:52773に解説されている。これらの化合物の類似対及び誘導体も用いることができる。
L は O、NR、又はSを表し;
R は H、アルキル、アリール、アラルキル、又はヘテロアリールを表し;
R’ はH、ハロゲン、NO2、SR、SO3、OR、NR2、アルキル、 アリール、又は カルボキシを表し;
a は1以上7以下の整数を表し;そして
b は1以上4以下の整数を表す;
L はO、NR、又は Sを表し;
R はH、アルキル、アリール、アラルキル、又はヘテロアラルキルを表し;
R’ はH、ハロゲン、NO2、SR、SO3、OR、NR2、アルキル、アリール、又はカルボキシを表し;
a は1以上7以下の整数を表し;そして
b は1以上4以下の整数を表す;
L はO、NR、又は Sを表し;
R はH、アルキル、アリール、アラルキル、又はヘテロアラルキルを表し;
R’ はH、ハロゲン、NO2、SR、SO3、OR、NR2、アルキル、アリール、又はカルボキシを表し;
a は1以上7以下の整数を表し;そして
bは1以上4以下の整数を表す;
R’ はH、ハロゲン、NO2、SR、OR、NR2、アルキル、アリール、アラルキル、又はカルボキシを表し;
R はH、アルキル、アリール、アラルキル、又はヘテロアラルキルを表し;そして
R” はアルキル、アルケニル、又はアルキニルを表す;
R2、R3、及び R4 はH、OH、又は O-アルキルであり;
R’3 はH 又は NO2であり;そして
A-B は一個のエテニレン又はアミド基である。
R、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、及びR8 は H、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハライド、アルコキシ、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルである。
R、R1、R2、及びR3 はH、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハライド、アルコキシ、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は一個の置換もしくは非置換
アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルである。
R、R1、R2、R6、及びR7 は H 又は 一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
R3、R4、及びR5 はH、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハライド、アルコキシ、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は
一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり;
L はO、NR、又はSであり;
m は0以上4以下の整数であり;そして
n 及び o は0以上6以下の整数である。
は Hであり、R2 はメチルであり、m は 0であり、そしてR4 はOHである)の化合物である。
はHであり、R2 はメチルであり、m は0であり、R4 はOHであり、そして R5 はOHである)の化合物である。
はメチルであり、m は 0であり、R4 は OHであり、R5 は OHであり、そしてR6 はHである)の化合物である。
は Hであり、R2 はメチルであり、m は 0であり、R4 は OHであり、R5 はOHであり、R6 は Hであり、そしてR7 はHである)の化合物である。
はメチルであり、m は0であり、R4 はOHであり、R5 は OHであり、R6 はHであり、R7
は Hであり、そして L はNHである)の化合物である。
はメチルであり、m は 0であり、R4 はOHであり、R5 はOHであり、R6 はHであり、R7
は Hであり、L は NHであり、n は 1であり、そして o は1である)の化合物である。
L はO、NR、又は Sであり;
R はアルキル、又はフェニルであり;
R1 は-NH2、-O-アルキル、-N(R)2、又は-NH(R)であり;そして
Het はヘテロアリール又はヘテロシクロアルキルである。
は-NH2であり、そしてHet はピリジンである)の化合物、がある。
L は O、NR、又はSであり;
R はアルキル、又はフェニルであり;
R1 は -NH2、-O-アルキル、-N(R)2、又は-NH(R)であり;
X はH、アルキル、-O-アルキル、OH、ハライド、又はNH2 であり;そして
n は1以上4以下の整数である。
は-NH2である)の化合物;式24及び付属の定義(但し式中、L は Oであり、X は Hであり、そしてn は 4である)の化合物;式24及び付属の定義(但し式中、R1 は -NH2であり、X は Hであり、そしてn は 4である)の化合物;式24及び付属の定義(但し式中、L は Oであり、R1 は -NH2であり、X は Hであり、そしてn は 4である)の化合物、がある。
ヒストンデアセチラーゼ及びクラス III ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の組み合わせに接触させるステップを含めてもよい。
又は細胞内で発現させることにより、細胞内で刺激又は維持できよう。特定の作用機序に制約されることを望む訳ではないが、これがアセチルトランスフェラーゼを滴定し、従って内因性Ku70たんぱく質のアセチル化を妨げるであろうと考えられる。
425:191に解説されており、その中には:。サーチュインを活性化する化合物の例は Howitz et al. (2003) Nature
425:191に解説されている。これらには、レスベラトロール (3,5,4’-トリヒドロキシ-trans-スチルベン)、ブテイン (3,4,2’,4’-テトラヒドロキシカルコン)、ピセアタンノール (3,5,3’,4’-テトラヒドロキシ-trans-スチルベン)、イソリキリチゲニン (4,2’,4’-トリヒドロキシカルコン)、フィセチン
(3,7,3’,4’-テトラヒドロキシフラボン)、ケルセチン (3,5,7,3’,4’-ペンタヒドロキシフラボン)、デオキシラポンチン (3,5-ジヒドロキシ4’-メトキシスチルベン 3-O-β-D-グルコシド); trans-スチルベン; ラポンチン (3,3’,5-トリヒドロキシ4’-メトキシスチルベン 3-O-β-D-グルコシド);cis-スチルベン; ブテイン (3,4,2’,4’-テトラヒドロキシカルコン); 3,4,2’4’6’-ペンタヒドロキシカルコン; カルコン; 7,8,3’,4’-テトラヒドロキシフラボン; 3,6,2’,3’-テトラヒドロキシフラボン; 4’-ヒドロキシフラボン; 5,4’-ジヒドロキシフラボン; 5,7-ジヒドロキシフラボン; モリン (3,5,7,2’,4’- ペンタヒドロキシフラボン); フラボン; 5-ヒドロキシフラボン; (-)-エピカテキン (水酸基部位: 3,5,7,3’,4’); (-)-カテキン (水酸基部位: 3,5,7,3’,4’); (-)-ガロカテキン (水酸基部位: 3,5,7,3’,4’,5’) (+)-カテキン (水酸基部位: 3,5,7,3’,4’); 5,7,3’,4’,5’-ペンタヒドロキシフラボン; ルテオリン (5,7,3’,4’-テトラヒドロキシフラボン); 3,6,3’,4’-テトラヒドロキシフラボン; 7,3’,4’,5’-テトラヒドロキシフラボン; カンフェロール (3,5,7,4’-テトラヒドロキシフラボン); 6-ヒドロキシアピゲニン (5,6,7,4’-テトラヒドロキシフラボン); スクテラレイン); アピゲニン (5,7,4’-トリヒドロキシフラボン); 3,6,2’,4’-テトラヒドロキシフラボン; 7,4’-ジヒドロキシフラボン; ダイゼイン (7,4’-ジヒドロキシイソフラボン); ゲニステイン (5,7,4’-トリヒドロキシフラバノン); ナリンゲニン (5,7,4’-トリヒドロキシフラバノン); 3,5,7,3’,4’-ペンタヒドロキシフラバノン; フラバノン; ペラルゴニジンクロリド (3,5,7,4’-テトラヒドロキシフラビリウムクロリド); ヒノキチオール (b-スジャプリシン; 2-ヒドロキシ-4-イソプロピル-2,4,6-シクロヘプタトリエン-1-オン); L-(+)-エルゴチオネイン ((S)-a-カルボキシ-2,3-ジヒドロ-N,N,N-トリメチル-2-チオキソ-1H-イミダゾール-4-エタナミニウム分子内塩); コーヒー酸フェニルエステル;MCI-186 (3-メチル-1-フェニル-2-ピラゾリン-5-オン); HBED (N,N’-Di-(2-ヒドロキシベンジル) エチレンジアミン-N,N’-二酢酸・H2O); アンブロキソール (trans-4-(2-アミノ-3,5-ジブロモベンジルアミノ) シクロヘキサン・HCl; 及び U-83836E ((-)-2-((4-(2,6-ジ-1-ピロリジニル-4-ピリミジニル)-1-ピペラザイニル(原語:piperzainyl))メチル)-3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2H-1-ベンゾピラン-6-オール・2HCl)、がある。これらの類似体及び誘導体も用いることができる。
R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5 は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルクアリール、ヘテロアラルキル、ハライド、NO2、SR、OR、N(R)2、又はカルボキシルを表し;
R はH、アルキル、又はアリールを表し;
M は O、NR、又は Sを表し;
A-B は一個の二価のアルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、スルホンアミド、ジアゾ、エーテル、アルキル、アミノ、アルキル、スルフィド、又はヒドラジン基を表し;そして
n は 0 又は 1であり;
但し条件としてもしnが 0であり;
もし R2
及び R4
が ORであり、そしてR1、R3、R5、R’1、R’2、R’4、及び R’5 が Hであり、そしてA-B がアルケニルである場合、R’3 が Cl、F、-CH3、-CH2CH3、-SMe、NO2、i-プロピル、-OMe、又は カルボキシルではなく;
もしA-B がアルキル、又はアミドである場合、R2 及びR4 は両者がOHであることはなく;
もしR3
が ORである場合、R’1、R’2、R’3、R’4、又はR’5 のうちの少なくとも一つは Hではなく;そして
R4 はカルボキシルではない。
R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、R’5、及びR” は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハリド、NO2、SR、OR、N(R)2、又は カルボキシルを表し;
R は H、アルキル、又はアリールを表し;
M は H2、O、NR、又は Sを表し;
Z は CR、O、NR、又は Sを表し;そして
X は CR 又は Nを表し;そして
Y はCR 又は Nを表す。
R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、R’5、及び R”1 は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハリド、NO2、SR、OR、N(R)2、又はカルボキシルを表し;
R は H、アルキル、又はアリールを表し;
M は H2、O、NR、又はSを表し;
Z は CR、O、NR、又は Sを表し;そして
X は CR 又は Nを表し;そして
Y は CR 又は Nを表す。
R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及びR’5、は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハリド、NO2、SR、OR、N(R)2、又はカルボキシルを表し;
R” は存在しないか、あるいは、H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハリド、NO2、SR、OR、N(R)2、又はカルボキシルを表し;
R はH、アルキル、又はアリールを表し;
M は H2、O、NR、又は Sを表し;
Z は CR、O、NR、又は Sを表し;そして
X は、R” が存在しない場合にCR 又は Nを表し、あるいは、R” が存在する場合にCを表す。
及び R’3
はOHであり;そして R1、R2、R3、R’1、R’2、R’4、及び R’5 は Hである)で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式31及び付属の定義(但し式中、X は CHであり;R” は存在せず;Z は Oであり;M は Oであり;R2 及び R4 は OHであり;そして R1、R3、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5 は Hである)で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式31及び付属の定義(但し式中、X は Cであり;R” は OHであり;Z は Oであり;M は Oであり;R2、R4、R’1、及び R’3 は OHであり;そして R1、R3、R’2、R’4、及び R’5 は Hである)で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式31及び付属の定義(但し式中、X は CHであり;R” は存在せず; Z は Oであり;M は Oであり;R4 は OHであり;そして R1、R2、R3、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5 は Hである)で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式31及び付属の定義(但し式中、X はCでり;R” は OHであり;Z はOであり;M は Oであり;R2、R4、R’2、R’3、及び R’4 は OHであり;そして R1、R3、R’1、及び R’5 は Hである)で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式31及び付属の定義(但し式中、X は Cであり;R” は OHであり;Z は Oであり;M は Oであり;R2、R’2、R’3、及び R’4 は OHであり;そして R1、R3、R4、R’1、及び R’5 はHである)で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式31及び付属の定義(但し式中、X は Cであり;R” は OHであり;Z は Oであり;M は Oであり;R1、R2、R4、R’2、及び R’3 は OHであり;そして R3、R’1、R’4、及びR’5 は Hである)で示される通りの化合物である。
R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5、は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハライド、NO2、SR、OR、N(R)2、又は カルボキシルを表し;
R” は存在しないか、又は、H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハライド、NO2、SR、OR、N(R)2、又はカルボキシルを表し;
R は H、アルキル、又は アリールを表し;
M は H2、O、NR、又は Sを表し;
Z は CR、O、NR、又は Sを表し;そして
Y は、R''が存在しない場合は CR 又は N、あるいはR''が存在する場合はCを表す。
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R’2、R’3、R’4、R’5、及び R’6 は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルクアリール、ヘテロアラルキル、ハライド、NO2、SR、OR、N(R)2、又は カルボキシルを表し;
R は H、アルキル、又は アリールを表し;そして
A- は以下: Cl-、Br-、又は I-から選択される一個の陰イオンを表す。
M は存在しないか、又はOであり;
R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5 は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルクアリール、ヘテロアラルキル、ハライド、NO2、SR、OR、N(R)2、又は カルボキシルを表し;
Ra は H を表すか、あるいは、二つのRa が一個の結合を形成し;
R は H、アルキル、又は アリールを表し;そして
n は 0 又は 1であり;
但し条件としてn が0であり;
R2 及びR4 がORであり、そしてR1、R3、R5、R’1、R’2、R’4、及びR’5 が Hである場合、R’3 はCl、F、-CH3、-CH2CH3、-SMe、NO2、i-プロピル、-OMe、又は カルボキシルではなく;
R3 が ORである場合、R’1、R’2、R’3、R’4、又は R’5 のうちの少なくとも一つは Hではなく;そして
R4 はカルボキシルではない。
が一個の結合を形成する)で示される通りの化合物である。
は Hであり;R5 は Hであり;R1、R3、及び R’3 は OHであり;そしてR2、R4、R’1、R’2、R’4、及び R’5 は Hである)で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本活性化性化合物は、式34及び付属の定義(但し式中、n は 1であり;M は存在せず; Ra は Hであり;R5 は Hであり;R2、R4、R’2、及び R’3 はOHであり;そしてR1、R3、R’1、R’4、及びR’5 は Hである)で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本活性化性化合物は、式34及び付属の定義(但し式中、n は 1であり;M は Oであり;二つのRa が一個の結合を形成し;R5 は OHであり;R2、R’2、及び R’3 は OHであり;そしてR1、R3、R4、R’1、R’4、及び R’5 は H.である)で示される通りの化合物である。
R = H、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、又はヘテロアリール
R’ = H、ハロゲン、NO2、SR、OR、NR2、アルキル、アリール、又はカルボキシ
R = H、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、又はヘテロアリール
R’ = H、ハロゲン、NO2、SR、OR、NR2、アルキル、アリール、又は
カルボキシ
R = H、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、又はヘテロアリール
から成る群より選択される式を有する化合物がある。
(例えば米国特許第6,414,037号を参照されたい)を形成するためなど、糖とのこれらの結合体がある。ピセイド又はレスベラトロール3-O-ベータ-D-グルコピラノシドとも言及されるグルコシドポリダチンも用いることができる。化合物を結合させてもよい糖には、グルコース、ガラクトース、マルトース及びスクロースがある。糖付加されたスチルベンは、更に、Regev-Shoshani et al. Biochemical J. (4/16/03 にBJ20030141として公開) に解説されている。ここで解説された化合物の他の誘導体は、エステル、アミド及びプロドラッグである。レスベラトロールのエステルは、例えば米国特許第6,572,882号に解説されている。レスベラトロール及びその誘導体は、例えば米国特許第6,414,037号;第6,361,815号;第6,270,780号;第6,572,882号;及びBrandolini et al. (2002) J. Agric. Food. Chem.50:7407など、当業で解説された通りに調製することができる。ヒドロキシフラボンの誘導体は、例えば米国特許第4,591,600号に解説されている。レスベラトロール及び他の化合物は、例えばSigma社からなど、市販のものを得ることもできる。
neuron death--Deckwerth, et al. Neuron. 17:401-411, 1996; Martin, et al., J.
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(Picard et al. (2004) Nature 430:921)に少なくとも基づくと、Ku70-Bax相互作用を刺激又は維持する作用物質を、肥満や、それが原因で起きるいずれかの状態を治療したり、あるいは代謝性疾患などの体重増加を減らしたりするためなど、脂肪動員を刺激するためにも用いてもよいだろう。Ku70-Bax相互作用を刺激又は維持する作用物質を、インシュリン耐性、あるいは、II型糖尿病、III型糖尿病又はこれらの合併症などの他の前駆症状など、代謝性疾患を治療するために投与してもよい。方法は、対象のインシュリン感受性を増す、あるいはインシュリン・レベルを減らすものかも知れない。このような治療を必要とする対象は、インシュリン耐性又はII型糖尿病の他の前駆症状を有する対象、II型糖尿病を有する対象、あるいは、これらの状態のいずれかを発症しそうな対象、であろう。例えば、対象は、高脂血症、脂質生成不全、高コレステロール血症、糖寛容不全、高血糖レベル、X症候群、アテローム性硬化症及び脂肪異栄養症の他の症状など、高循環中レベルのインシュリン及び/又は関連する状態を有するなどのインシュリン耐性を有する対象であってもよい。
疱疹、HIV、アデノウィルス、及びHTLV-1随伴性の悪性及び両性の異常などのウィルス感染も、ここで解説された作用物質の投与により、治療することができる。代替的には、細胞を対象から得、ex vivoで処理して癌細胞などの特定の望ましくない細胞を取り除き、同じ又は異なる対象に投与して戻すことができる。
急性リンパ芽球性白血病;急性リンパ芽球性白血病;急性骨髄性白血病;急性骨髄性白血病;副腎皮質癌;副腎皮質癌;AIDS-関連癌;AIDS-関連リンパ腫;肛門癌;星状細胞腫、小児小脳;星状細胞腫、小児、大脳;基底細胞癌、皮膚癌(非黒色腫)を参照されたい;胆管癌、肝臓外;膀胱癌;膀胱癌;骨の癌;骨肉腫/悪性線維性組織球腫;脳幹グリオーマ;脳腫瘍;脳腫瘍;脳幹グリオーマ;脳腫瘍、小脳星状細胞腫;脳腫瘍、大脳星状細胞腫/悪性グリオーマ;脳腫瘍、脳室上衣細胞腫;脳腫瘍、髄芽細胞腫;脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉腫瘍;脳腫瘍、視覚路及び視床下部グリオーマ;脳腫瘍;乳癌;乳癌及び妊娠;乳癌;乳癌、男性;気管支腺腫/カルチノイド;バーキットリンパ腫;カルチノイド腫瘍;カルチノイド腫瘍、胃腸管;未知の原発の癌腫;中枢神経系リンパ腫、原発性;小脳星状細胞腫;大脳星状細胞腫/悪性グリオーマ;子宮頸癌;小児癌;慢性リンパ球性白血病;慢性骨髄性白血病;慢性骨髄増殖性異常;結腸癌;結腸直腸癌;皮膚T細胞リンパ腫、菌状息肉腫及びセザリー症候群を参照されたい;子宮内膜癌;脳室上衣細胞腫;食道癌;食道癌;ユーイング類の腫瘍;頭蓋外胚細胞腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝臓外胆管癌;眼の癌、眼球内黒色腫;眼の癌、網膜芽細胞腫;胆嚢癌;胃(胃)癌;胃(胃)癌;胃腸管のカルチノイド腫瘍;胚細胞腫瘍、頭蓋外; 胚細胞腫瘍、性腺外;胚細胞腫瘍、卵巣;妊娠性絨毛性腫瘍;グリオーマ;グリオーマ、小児脳幹;グリオーマ、小児大脳星状細胞腫;グリオーマ、小児視覚路及び視床下部;ヘアリー細胞白血病;頭部及び頚部の癌;肝細胞(肝臓)癌;成人(原発);肝細胞(肝臓)癌、小児(原発);ホジキンリンパ腫;ホジキンリンパ腫;妊娠中のホジキンリンパ腫;下咽頭癌;視床下部及び視覚路のグリオーマ;眼球内黒色腫;島細胞癌腫(膵臓内分泌腺);カポジ肉腫;腎臓(腎細胞)癌;腎癌;
喉頭癌;喉頭癌;白血病、急性リンパ芽球性;白血病、急性リンパ芽球性;白血病、急性骨髄性;白血病、急性骨髄性;白血病、慢性リンパ球性;白血病;慢性骨髄性;白血病、ヘアリー細胞;口唇及び口腔癌;肝臓癌、成人(原発);肝臓癌、小児(原発);肺癌、非小細胞;肺癌、小細胞;リンパ腫、AIDS-関連;リンパ腫、バーキット;リンパ腫、皮膚T細胞、菌状息肉腫及びセザリー症候群を参照されたい;リンパ腫、ホジキン;リンパ腫、ホジキン;リンパ腫、妊娠中のホジキン型;リンパ腫、非ホジキン型;リンパ腫、非ホジキン型;リンパ腫、妊娠中の非ホジキン型;リンパ腫、原発性中枢神経系;マクログロブリン血症、ワルデンストローム;骨の悪性線維性組織球腫/骨肉腫;髄芽細胞腫;黒色腫;黒色腫、眼球内(眼);メルケル細胞癌腫;中皮腫、成人悪性;中皮腫;潜在性原発のある転移性扁平頸部癌;多発性内分泌腺新生症候群;多発性骨髄腫/プラズマ細胞新生、菌状息肉腫;脊髄形成異常性症候群;脊髄形成異常性/骨髄増殖性疾患;骨髄性白血病、慢性;骨髄性白血病、成人急性;骨髄性白血病、小児急性;骨髄腫、多発性;骨髄増殖性異常、慢性;鼻腔及び副鼻腔癌;鼻咽頭癌;鼻咽頭癌;神経芽細胞腫;非ホジキンリンパ腫;非ホジキンリンパ腫;妊娠中の非ホジキンリンパ腫;非小細胞肺癌;口腔癌;口腔癌、口唇及び;口咽頭癌;骨肉腫/骨の性線維性組織球腫;卵巣癌;卵巣上皮癌;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性潜在性腫瘍;膵臓癌;膵臓癌;膵臓癌、島細胞;副鼻腔及び鼻腔癌;副甲状腺癌;陰茎癌;クロム親和性細胞腫;松果体芽細胞腫及びテント上原始神経外胚葉
腫瘍;脳下垂体腫瘍;プラズマ細胞新生/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;妊娠及び乳癌;妊娠及びホジキンリンパ腫;妊娠及び非ホジキンリンパ腫;原発性中枢神経系リンパ腫;前立腺癌;直腸癌;腎細胞(腎臓)癌;腎細胞(腎臓)癌;腎盂及び尿管、移行細胞癌;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫;唾液腺癌;唾液腺癌;肉腫、ユーイング類の腫瘍;肉腫、カポジ;肉腫、軟組織:肉腫、軟組織;肉腫、子宮;セザリー症候群;皮膚癌(非黒色腫);皮膚癌;皮膚癌(黒色腫);皮膚癌腫、メルケル細胞;小細胞肺癌;小腸癌;軟組織肉腫;軟組織肉腫;扁平細胞癌腫、皮膚癌
(非黒色腫)を参照されたい;原発潜在性のある扁平頸部癌、転移性;胃(胃)癌;胃(胃)癌; テント上原始神経外胚葉腫瘍:T細胞リンパ腫、皮膚、菌状息肉腫及びセザリー症候群を参照されたい;精巣癌;胸腺腫;胸腺腫及び胸腺癌;甲状腺癌;甲状腺癌;腎盂及び尿管の移行細胞癌;絨毛性腫瘍、妊娠性;未知の原発部位の、癌腫;道の原発部位の、癌;小児のまれな癌;尿管及び腎盂、移行細胞癌;尿道癌;子宮癌、新旧内膜;子宮肉腫;膣癌;視覚路及び視床下部のグリオーマ;陰門癌;ワルデンストロームマクログロブリン血症;ウィルムス腫瘍;及び女性の癌(国立癌機関のリスト)。
アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、bcg、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエンストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、MESNA、メトトレキセート、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロン酸、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィメル、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及び
ビノレルビン、がある。.
カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イフォスファミド、メルファラン、メクロレタミン、ミトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルバジン、テニポシド、トリエチレンチオホスホールアミド及びエトポシド
(VP16));ダクチノマイシン (アクチノマイシン D)、ダウノルビシン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン(ミトラマイシン)及びミトマイシンなどの抗生物質;酵素(L-アスパラギンを合成的に代謝して、それら自体のアスパラギン合成能を有さない細胞を枯渇させるL-アスパラギナーゼ);ナイトロジェンマスタード(メクロレタミン、シクロホスファミド
及び類似体、メルファラン、クロラムブシル)、エチレンイミン及びメチルメラミン(ヘキサメチルメラミン及びチオテパ)、アルキルスルホネート-ブスルファン、ニトロソウレア(カルムスチン (BCNU) 及び類似体、ストレプトゾシン)、トラゼン-ダカルバジニン(DTIC)などの抗血小板剤;抗増殖性/抗有糸分裂性アルキル化剤; 葉酸類似体(メトトレキセート)などの抗増殖性/抗有糸分裂性抗代謝産物;プラチナ配位錯体(シスプラチン、カルボプラチン)、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド;ホルモン、ホルモン類似体(エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド)及びアロマターゼ阻害剤(レトロゾール、アナストロゾール);抗凝固剤(ヘパリン、合成ヘパリン塩及び他のトロンビン阻害剤);線維素溶解剤(例えば組織プラスミノーゲンアクチベータ、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ)アスピリン、COX-2阻害剤、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ;抗遊走剤;抗分泌剤(ブレベルジン);免疫抑制剤(シクロスポリン、タクロリムス(FK-506)、シロリムス(ラパマイシン)、アザチオプリン、ミコフェノレートモフェチル);抗血管新生性化合物(TNP-470、ゲニステイン)及び成長因子阻害剤(血管内皮細胞成長因子(VEGF)阻害剤、線維芽細胞成長因子(FGF)阻害剤、上皮成長因子(EGF)阻害剤);アンジオテンシン受容体遮断剤;酸化窒素供与体;アンチセンスオリゴヌクレオチド;抗体(トラスツズマブ);細胞周期阻害剤及び分化誘導剤(トレチノイン);mTOR 阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤(ドキソルビシン(アドリアマイシン)、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イリノテカン(CPT-11)及びミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン)、コルチコステロイド(コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、及びプレドニゾロン);成長因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤;ミトコンドリア機能不全誘導剤及びカスパーゼ活性家財;クロマチン破壊剤。
本方法に従って用いられる医薬組成物は、一つ以上の生理学的に許容可能な担体又は医薬品添加物を用いて、従来の態様で調合できよう。このように、化合物及びそれらの生理学的に許容可能な塩及び溶媒和化合物などの作用物質を、例えば注射、吸入又は通気(口腔又は鼻腔を通して)、又は経口、バッカル、非経口又は直腸投与などによる調合に向けて調合してもよい。ある実施態様では、罹患細胞などの標的細胞が存在する部位、即ち血中又は関節内に、作用物質を局所投与する。
PAに見られよう。全身投与の場合、筋肉内、静脈内、腹腔内、及び皮下を含め、注射が好ましい。注射の場合、作用物質を液体の溶液、好ましくはハンクス溶液又はリンガー液などの生理学的に適合性ある緩衝液、に入れて、調合することができる。加えて、作用物質を固形で調合し、使用直前に再溶解又は懸濁させてもよい。凍結乾燥型も含まれる。
1992), volume 9)。マイクロ乳濁液の調製に際しては、界面活性剤(乳化剤)、共界面活性剤(共乳化剤)、油相及び水相が必要である。適した界面活性剤には、例えばクリームの調製時に典型的に用いられる乳化剤など、乳液の調製に有用ないずれかの界面活性剤がある。共界面活性剤(又は「共乳化剤」)は、一般的には、ポリグリセロール誘導体、グリセロール誘導体及び脂肪アルコールから成る群より選択される。好適な乳化剤/共乳化剤の組み合わせは、必ずしもではないが一般的に、グリセリルモノステアレート及びポリオキシエチレンステアレート;ポリエチレングリコール及びエチレングリコールパルミトステアレート;並びにカプリル酸及びカプリン酸トリグリセリド及びオレオイルマクロゴルグリセリドから成る群より選択される。水相は、水だけでなく、典型的には緩衝剤、グルコース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、好ましくは低分子量ポリエチレングリコール(例えばPEG 300又はPEG 400)、及び/又はグリセロール等を含むが、油相は一般的には、例えば脂肪酸エステル、加工植物油、シリコーン油、モノ-、ジ-及びトリグリセリドの混合物、PEGのモノ-及びジ-エステル(例えばオレオイルマクロゴルグリセリド)等を含むであろう。
他の適したゲル化剤には、メチルヒドロキシセルロース、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン、ヒドロキシエチルセルロース及びゼラチンがある。ゲルは通常、水性の担体液体を用いるが、アルコール及び油類も、担体液体として用いることができる。
1.0重量%乃至10重量%の範囲の量、存在する。
Immunotherapy, by G. Morstyn & W. Sheridan eds, Cambridge University Press,
(1996); 及び
Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill
Livingstone, (2000)を参照されたい。
実施例1: Ku70/80 はin vivoでCBP 及びPCAF によりアセチル化する
アセチル化は、多くの非ヒストンたんぱく質が調節される重要な機序として浮かび上がってきている (Chan et al., Nat. Cell Biol. 3, 667-674 (2001); Gu
and Roeder. Cell 90, 595-606 (1997);
Liu et al., Mol. Cell. Biol. 19,1202-1209 (1999); Sakaguchi et al., Genes Dev. 12,2831-2841 (1998))。例えば、p53のC末端の三つのリジン(即ち、K373、K382、及びK320)の CBP、PCAF、又はp300 によるアセチル化で、このたんぱく質の安定性が増し、p53-依存的転写が増加することで、成長の停止及びアポトーシスが促進される(Grossman, Eur. J. Biochem.
268, 2773-2778 (2001)にレビュー)。DNA損傷シグナル後にアセチル化すると思われる更なる因子を特定するために、p53のC末端のアセチル化部位の二つのクラスタ(aa 302-326 及び 367-392)に対して相同性を持つたんぱく質を探した。最も近い対合の一つは、その見かけの柔軟性のために構造的に定義することが困難なKu70のC末端リンカ領域に対してであった (Zhang et al., J. Biol. Chem. 276, 38231-38236 (2001)) (図1A)。Ku70/p53 をアライメントすると潜在的なコンセンサス配列 [(T)KRKX3-5-
SGSX2KK] が示唆され、この潜在的なコンセンサス配列は、フラップ・エンドヌクレアーゼFEN1、転写因子 GATA1、及び転写開始因子 EFIIEβ(図1B)の公知のアセチル化ドメインともアライメントした。このアライメントに基づき、我々は、Ku70のC末端リンカドメインリンカのリジンが、in vivoでのアセチル化のターゲットであろうと予測した。
天然CBP及び Ku70間の相互作用を検出できたが、Ku80ではできなかった(図1E)。このCBP-Ku70相互作用は、DNAインターカレート剤エチジウムブロミド(50μg/ml)では損なわれなかったことから、このたんぱく質相互作用は、DNAにより架橋されるのではないことが示唆された。PCAF 及びKu70 間では弱い相互作用がIPで観察されたが、p300 及び Ku70間では何の相互作用も検出できなかった。
次に、我々は、Ku70/80
複合体がCBP、PCAF、又はp300の基質として働くのかどうかをin vitro アセチル化検定を用いて調べた。組換えKu70/80 複合体を昆虫細胞から精製し、[3H]-acetyl-CoA及びCBP、PCAF、又はp300のヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)ドメインと一緒にインキュベートした。次にその反応性生物をSDS-PAGEで分離し、オートラジオグラフィで分析した。図2Aに示すように、Ku70の大きさに相当する強力に標識された一本のバンドが、完全なアセチルトランスフェラーゼ反応(レーン4−6)のそれぞれで観察されたが、組換えKu70/80を欠く反応(レーン1−3)又はアセチルトランスフェラーゼを欠く反応(レーン7)では観察されなかった。Ku80に相当する弱いバンドも観察された(レーン4−6)。これらの条件下では、これらの酵素の基質として作用することが公知のp53コントロールペプチドは、同様な程度、CBP、PCAF、及びp300により標識された (Liu et al., 1999, Mol. Cell. Biol. 19:1202)。これらの結果は、Ku70がこれら三つのアセチルトランスフェラーゼすべての効率的な基質として働くことができることを実証している。バンドの輝度に基づくと、CBP はKu70に対して最も優れた結合性を有し、in vivoでのKu70とCBPとの間の強力な相互作用と一致した。
Ku70のC末端リンカがin vivoでアセチル化するのかどうかを調べるために、Ku70のアミノ酸537-557を、GFPへの融合体 (pEGFP-Ku70537-557)としてして発現させた (Bertinato et al., J. Cell Sci. 114, 89-99 (2001))。この融合ペプチドをHeLa細胞から抗GFP抗体を用いて免疫沈降させ、アセチル化をウェスタン分析によりpanAc-Kポリクローナル抗体を用いて評価した。図2Eに示すように、panAc-K 抗体はGFPKu70537-557 融合体を強く認識したが、タグを付けていないGFPコントロールは認識せず、このKu70リンカ領域が、in vivoではアセチル化のターゲットであることが示唆された。
In vivoでのたんぱく質アセチル化レベルは、アセチルトランスフェラーゼと対抗する脱アセチル化酵素の活性間の動的平衡の結果である。ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)は、それらの相同性、基質要件、及び特定の阻害剤に対するそれらの感受性に基づき、三つのクラスに分類することができる。クラスI/IIデアセチラーゼは阻害剤トリコスタチンA(TSA)に感受性であるが、NAD+依存的サーチュイン・ファミリーのクラスIIIデアセチラーゼは、ニコチンアミド(NAM)により特異的に阻害される (NAM) (Bitterman et al., J. Biol. Chem. 277:45099-45107 (2002); Landry et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.
278:685-690 (2000); Luo et al., Cell 107, 137-148 (2001); Yoshida and
Horinouchi, Ann. N Y Acad. Sci. 886,
23-36 (1999))。
Ku70のC末端リンカ・ドメインがin vitroでCBP及びPCAFのターゲットであり、それはBax相互作用ドメインの隣にあるということに基づき、我々は、この領域のアセチル化が、Ku70のアポトーシス抑制能を調節する上で役割を果たしているという仮説をたてた。ヒト胚腎細胞(293T) にBax-YFP 発現コンストラクトをトランスフェクトし、YFP陽性細胞を24時間後に、よく特徴付けられたアポトーシス表現型である核の断片形成について評価した(Sawada et al., Nat. Cell Biol. 5, 320-329 (2003))。以前の報告と一致して、完全長Ku70の過剰発現は、Baxによるアポトーシス誘導を抑制した(図4B)。
阻害剤 NAM及び/又はTSAの存在下で行った。図4Bに示すように、細胞をNAM 又は TSAで処理すると、Ku70のアポトーシス抑制能が損なわれた。TSAの場合、アポトーシス抑制は完全に遮断された。両方の阻害剤で同時に処理したところ、アポトーシスに対して相加的な効果があり(図4B)、細胞死は未処理細胞よりも僅かに高く、アセチル化したKu70は、アポトーシスを促進する上で付加的な役割を果たすという可能性が浮かび上がった。細胞を、HDAC阻害剤で、Baxトランスフェクトなしで処理したところ
アポトーシスに対して何ら認められる効果はなかった。
Ku70のアセチル化が、そのBax抑制能を調節している可能性を更に検査するために、我々は、CBP 及びPCAFを過剰発現している細胞内でのBax誘導性アポトーシスを調べた。TSA/NAM結果と一致して、CBP 又はPCAFのいずれかが過剰発現するとKu70のアポトーシス抑制能が失われるが、Ku70の非存在下でCBP又はPCAFが過剰発現しても、認められる効果は何もなかった(図5A及び図5B)。CBP又はPCAF が単独で過剰発現しても、やはり何の効果もなかった。
Martinou, Nat. Cell Biol. 5, 281-283
(2003)) 、我々の実験では、全体的なKu70レベルの減少は検出されなかった(図6A)。興味深いことに、Ku70アセチル化の増加は、CBPの細胞質ゾルへの移動と相関した(図6B)。この観察は、細胞損傷後にCBPが核から細胞質ゾルに移行することが、Bax媒介性アポトーシスにおける鍵となる調節ステップと思われることを示唆している。
これらの結果の最も簡単な説明は、アセチル化はKu70の抗アポトーシス機能を、それがミトコンドリアからBaxを隔絶する能力に干渉することで調節するというものである。このモデルを調べるために、我々は、Ku70アセチル化を増加するものであることを以前に我々が示した条件であるTSA/ NAMで処理した293T細胞で、内因性Ku70-Bax相互作用を調べた(図4Aを参照されたい)。細胞をこの阻害剤で12時間、処理し、そのKu70-Bax 相互作用を、Ku70を免疫沈降させてからBaxの免疫複合体をプローブすることで評価した。図6Cに示すように、TSA 及びNAMによる処理で、Ku70に結び付くBax量が著しく減少した。逆IP実験では、TSA及びNAM で抗Bax抗体のKu70免疫沈降能を完全に失われた。これらの結果に基づき、我々は、アセチル化したKu70は、Baxに結合してBax隔絶することができないためにアポトーシスを阻害しないのであると結論した。
Cell. Physiol. 181: 218-230 (1999)) 。この研究で我々は、
(1)Ku70リンカ領域は、他のたんぱく質公知のアセチル化部位のクラスタとアライメントすること;(2)Ku70 は、DNA結合ドメイン及び柔軟性のリンカ領域の残基を含め、in vitro 及びin vivoで複数の部位でアセチル化すること;(3)in vitro 及びin vivoで、CBP及びPCAFはKu70と結び付いてKu70をアセチル化の標的とすること;(4)内因性Ku70のBax媒介性アポトーシス抑制能はKu80からは独立であること;(5)この機能は、細胞をHDAC阻害剤で処理するか、あるいはCBP又はPCAFを過剰発現させることにより、Ku70アセチル化を増す処理により、阻害することができること;(6)Ku70のうちのC末端リンカ領域中の2つの重要案リジン(K539およびK542)のアセチル化を模倣する変異があれば、Ku70の抗アポトーシス機能を遮断するには充分であること;(7)細胞をHDAC阻害剤で処理することでKu70アセチル化のレベルを増すと、Ku70とBaxとの間の相互作用が失われること;そして(8)Ku70のアセチル化レベルは紫外線処理後に増加し、これは、核から細胞質ゾルへのCBPの移行と一致すること、を示す。まとめると、これらの結果は、CBP及び/又はPCAF によるKu70のアセチル化は、アポトーシス・シグナル後の細胞の運命を決定する上で枢軸的な役割を果たすことを示している。
Cell 4, 13-18 (2003))。なぜ、癌細胞はクラス I/II HDAC阻害剤に対して感受性であるのに正常細胞は感受性でないのかは不明である。これを説明するために、癌治療におけるクラスI/II HDAC阻害剤の主なターゲットは転写ではないと思われることが示唆されている(Johnstone and Licht, 2003)。我々の発見は、このような化合物の効験がKu70の活性阻害を原因とするものと考えられることを示唆しており、このたんぱく質を、抗癌療法の魅力的なターゲットとして特定している。TSA、TPX、及び酪酸ナトリウムなどの阻害剤を抗癌剤として用いた多くの研究が文献で報告されてきた (Rahman et al., Blood 101, 3451-3459 (2003); Yoshida et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 48:S20-S26 (2001))。ニコチンアミド及びTSAの組み合わせにより、BaxのKu70依存的阻害が完全に遮断されるという我々の結果に基づき、我々は、クラスI/II HDAC阻害剤をニコチンアミドなどのクラスIII 阻害剤と組み合わせると、化学療法薬としてのHDAC阻害剤の効験が増強されるはずであると提案する。
細胞及び培地
細胞を37℃の20% 02
及び5% CO2 の存在下で加湿したチャンバ内で成長させた。ヒト上皮癌 (HeLa)、ヒト胚性腎 (HEK 293)、293T、マウス Ku70+/+ 線維芽細胞(Sawada et al., Nat. Cell Biol. 5:320-329 (2003) )、マウスKu70 -/- 線維芽細胞 (Sawada et al., Nat Cell Biol.
5:320-329 (2003)) 、及びハムスター Ku80-/- 線維芽細胞t (V15B) (Bertinato et al.,
J. Cell Sci. 114:89-99 (2001)) を、FBS (10%) 、グルタミン (1 %) 、及びペニシリン/ストレプトマイシン (1 %) を加えたDME中で成長させた。ヒト胚性腎 293 (HEK 293) 細胞を37℃の20% O2 及び 5% CO2 の存在下で加湿したチャンバ内で、グルタミン (1% )、ペニシリン/ストレプトマイシン(1%)、及びALラット又はCRラット由来の10%血清を加えたDME中で48時間、成長させた。293T 細胞を、上述したようにALラット又はCRラット由来の10%血清を含有するDME培地中で成長させた。24時間後に細胞に1μgのYFP、1μgのYFP-Bax 又は1μgのYFP-Bax 及び2μgのKu70をトランスフェクトした (Sawada et al. (2003) Nat. Cell Biol. 5:352) 。レスベラトロール実験では、 293T 細胞に1μgのYFP 又は1μgのYFP-Bax 及び2μgのKu70をトランスフェクトした。このトランスフェクションから12時間後に、培地に様々な量のレスベラトロール (0、50 又は 100 nM) を添加し、アポトーシス性の核を持つYFP陽性細胞のパーセンテージをトランスフェクトから24時間後に採点した。siRNA 実験には、293 細胞に1μgの siRNA ベクタ又はsiRNA-SIRT1 ベクタのいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクトから24時間後に、この細胞に1μgのsiRNA ベクタ又はsiRNA-SIRT1を、1μgのYFP、1μgのYFP-Bax 又は1μgのYFP-Bax 及び2μgのKu70と一緒にトランスフェクトした。
たんぱく質アセチルトランスフェラーゼ検定を、50 mM HEPES (pH 8.0)、10% グリセロール、1 mM DTT、1 mM PMSF、10 mM Na-ブチレート、1μlの (3H]-アセチル-CoA、1μgの組換えKu70/80 複合体又はKu70 ペプチド、及び 100 ng の、p300、PCAF、もしくはCBPの組換え HAT ドメインを含有する30μlの反応緩衝液中で行った。反応液を30℃で1時間、インキュベートした後、SDS-PAGE (10%)で分離し、クーマシー・ブルーで染色し、EN3HANCE オートラジオグラフィ増強剤 (NEN)で処理し、乾燥させ、フィルムに3乃至7日間、露光させた。陽性コントロールとして用いられたp53ペプチドはp53315-3235 及び p53377-389だった。
Ku70の免疫沈降(IP)には、1mgのたんぱく質を、プロテインA/G セファロース・ビーズ (Santa Cruz社)とのインキュベートにより予め清澄させた。その上清を、アガロースに結合させたヒツジポリクローナル抗Ku70抗体 (Santa Cruz社)と一緒にインキュベートした後、1 % トリトンのPBS溶液で3回、洗浄した。 免疫複合体をSDS-PAGEで分離し、たんぱく質を、アセチル化したウサギ血清に対して生じたウサギポリクローナル抗pan-アセチル-リジン (panAc-K) 抗体で検出した。HeLa細胞由来の内因性Ku70及びCBPのCo-IPを、50μg/ml EtBr の存在下で行った(Lai and Her, 1992, PNAS 89:6958)。293T細胞由来の内因性Ku70及びBaxの Co-IPはChaps緩衝液中で行われた (Sawada et al., Nat. Cell Biol. 5:320-329 (2003))。
アポトーシスを以前に解説された通りに誘導した ((Sawada et al., Nat Cell Biol. 5:320-329 (2003))。すべてのアポトーシス実験において、完全長Ku70を発現させた。数値は少なくとも200個の細胞が計数された3つの実験の平均を表す。誤差棒は、平均値の中間偏差を表す。
293細胞に6xHIS-Ku80ベクタを安定にトランスフェクトした。10りっとの細胞からの細胞抽出物(180mgのたんぱく質)をNi-NTA セファロース・カラムに入れ、Ku70/Ku80 をイミダゾール (600 mM イミダゾール)で溶出させた。代替的には、大規模IPを、懸濁液で成長させた20リットルのHeLa MC118細胞に対して、500μgのアガロース結合ヤギポリクローナル抗Ku70 抗体 (Santa Cruz社)を用いて行った。両方の方法からの精製済みたんぱく質をSDS-PAGEで分離し、Ku70に相当するバンドを切り出し、MS/MSで分析した。
In-gel たんぱく質分解消化を基本的には解説された通りに行った(Kinter
and Sherman, Protein Sequencing
Identification Using Tandem Mass Spectrometry (New York : Wiley and Sons)
2000)。翻訳後修飾の分析には、トリプシン、キモトリプシン、AspN、及びGIuC (V8) を用いた (Roche社)。試料を、ピコフリット・カラム(75μm ID、10 cm、NewObjective社)を備えたナノフロー液体(LC)
クロマトグラフィ系
(Waters CapLC社) に、ナノティー (Waters社) 16/1 スプリット (初流速5.5μl/分)を用いて流速をほぼ150
nl/分にしてかけた。このLC 系はQTOF マイクロタンデム型質量分析計 (MS) (Micromass社、英国)に直接、接続した。調査スキャン・モードで解析を行い、輝度が7を超える親イオンを、MS/MS モードでMassLynx 4.0 ソフトウェア (Micromass社、英国)を用いて配列決定した。MS/MS
データを処理し、Swissprot,
TREMBL/ New (www.expasy.ch)にはProteinLynx Global Server 1.1 ソフトウェア (Micromass社、英国) を用いて、あるいはNCBI 非重複データベース (NCBInr) 又は Ku70 配列のみにはMascot (Matrixscience社) (Perkins et al., Electrophoresis 20:3551-3567 (1999)) を用いて、データベース検索をかけた。リジン残基に42の質量が加わり、126 及び143 MW のイモニウム・イオンが存在することで、アセチル化を判別した。
12月齢のオスのFisher
344 ラットに、NIH-31 標準飼料を適宜(AL)、与えるか、あるいはAL動物の食べるものの60%を毎日の飼料として割り当てる(離乳直後に開始して)生涯制限食を与えた
(CR)。水は両群ともに適宜、与えられた。動物をと殺後、肝臓、腎臓、脂肪組織の腹部パッド、及び脳からのたんぱく質抽出物を、補助資料に解説した通りに調製した。3匹のAL動物及び3匹のCR動物から採った各組織種の1mgの抽出物をSDS-PAGE で分離し、SIRT1に対するウサギポリクローナル抗体、又はβ-アクチンに対するモノクローナル抗体をプローブした。
多様な種で長寿を促進するSir2酵素の役割や、S.セレビジエでの酵母Sir2/3/4 複合体とKu70との 間の結び付きを念頭にして、我々は、SIRT1 は Ku70 を脱アセチル化のターゲットとすることで、細胞の対アポトーシス感受性を調節するのではないかと考えた。この仮説と一致して、我々が293T 細胞を、SIRT1の低分子活性化物質 (Howitz
et al. Nature 425, 191-6 (2003))であるレスベラトロールで処理した場合、又はこれらの細胞でSIRT1を過剰発現させた場合、我々はBas媒介性アポトーシスの用量依存的抑制を観察した(それぞれ図7A及び7B、C)。反対に、ドミナント・ネガティブSIRT1対立遺伝子 (H363Y) を過剰発現させると、当該細胞のBax媒介性アポトーシスに対する感受性が増し(図7D)、アポトーシスの下流マーカである、切断型ポリ-ADP-リボースポリメラーゼ (PARP)の量が著しく増加した(図7E)。SIRT1に対する低分子干渉性RNA (siRNA) は同様な効果を有していた(図7F及び図9)。
我々は最近、Ku70のうちで、アセチル化時にBax放出を促進する2つのリジン(K539 及び K542) を特定した(図8B)。野生型SIRT1を過剰発現させると、in vivoでのKu70の全体的アセチル化レベルが減少するが、
他方、SIRT1-H363Y
対立遺伝子を過剰発現させると反対の効果があった(図8C)。Ku70上のどのリジンがSIRT1による脱アセチル化のターゲットであるのかを特定するために、2つの異なる検定を行った。組換えSIRT1 を、アセチル化したKu70ペプチドと一緒にインキュベートし、残ったアセチル化レベルをpan-アセチル-リジン抗体を用いて確認した(図8D)。より定量的な検定は、SIRT1を、アセチル化したKu70蛍光発生性ペプチドと一緒にインキュベートし、前に解説された通りに検定した(Howitz
et al. Nature 425, 191-6 (2003)) (図8E)。リジン32でアセチル化したp53 ペプチドを陽性コントロールとして役立てた (Cheng
et al. Proc Natl Acad Sci U S A 100,
10794-9 (2003).)。両方での検定で同じ結果が出た:SIRT1は、Baxを調節する上で重要なKu70のC末端にある二つのリジンを効率的に脱アセチル化した(図8D、E)。
for Microbiology Press: 2002), Molecular
Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis
(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait
ed., 1984); Mullis et al. U.S. Patent No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds.
1984); Transcription And Translation
(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987);
Immobilized Cells And Enzymes (IRL
Press, 1986); B. Perbal, A Practical
Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells
(J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); and Methods
In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.)を参照されたい。細胞ソーティング及び細胞分析法は当業で公知であり、例えばThe
Handbook of Experimental Immunology, Volumes 1 to 4, (D. N. Weir, editor) 及びFlow Cytometry and Cell Sorting
(A. Radbruch, editor, Springer Verlag, 1992)に解説されている。
当業者であれば、ごく慣例的な実験を用いるのみで、ここに解説された本発明の具体的な実施例の均等物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このような均等物は以下の請求項の包含するところと意図されている。
Claims (68)
- アミノ酸残基K317、K338、K539、K542、K544、K553 又は K556から成る群より選択されるアミノ酸残基を含む単離されたKu70たんぱく質又はその部分と、単離された脱アセチル化酵素又はその生物学的活性部分とを含む、組成物。
- 前記脱アセチル化酵素がクラスI/II ヒストンデアセチラーゼである、請求項1に記載の組成物。
- 前記脱アセチル化酵素がサーチュインである、請求項1に記載の組成物。
- 前記サーチュインがSIRT1である、請求項3に記載の組成物。
- 前記Ku70たんぱく質又はその部分がアミノ酸残基K539 又は K542を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記アミノ酸残基がアセチル化している、請求項1に記載の組成物。
- 前記アミノ酸残基K539 又はK542 がアセチル化しており、前記脱アセチル化酵素がSIRT1である、請求項5に記載の組成物。
- 前記Ku70たんぱく質又はその部分と、前記脱アセチル化酵素又はその生物学的活性部分とが複合体を形成する、請求項6に記載の組成物。
- 前記Ku70たんぱく質又はその部分がアミノ酸残基K539 又は K542 を含み、そして前記脱アセチル化酵素がSIRT1である、請求項8に記載の組成物。
- Ku70たんぱく質と脱アセチル化酵素との間の相互作用を調節する作用物質を特定する方法であって、
(i)請求項6に記載の組成物を、検査化合物に、Ku70たんぱく質又はその部分と脱アセチル化酵素又はその生物学的活性部分との間の相互作用が前記検査化合物の非存在下でも可能な条件下で、接触させるステップと、
(ii)Ku70たんぱく質又はその部分と脱アセチル化酵素又はその生物学的活性部分との間の相互作用のレベルを判定するステップであって、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下でのKu70たんぱく質又はその部分と脱アセチル化酵素又はその生物学的活性部分との間の相互作用のレベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質と脱アセチル化酵素との間の相互作用を調節することの指標である、ステップとを含む、方法。 - 前記脱アセチル化酵素がクラス I/II ヒストンデアセチラーゼである、請求項10に記載の方法。
- 前記脱アセチル化酵素がサーチュインである、請求項10に記載の組成物。
- 前記サーチュインがSIRT1である、請求項3に記載の組成物。
- Ku70たんぱく質の脱アセチル化を調節する作用物質を特定する方法であって、
(i)請求項6に記載の組成物を、検査化合物に、前記Ku70たんぱく質又はその部分の脱アセチル化が前記検査化合物の非存在下でも可能な条件下で、接触させるステップと、
(ii)Ku70たんぱく質又はその部分の脱アセチル化のレベルを判定するステップであって、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下でのKu70たんぱく質又はその部分の脱アセチル化のレベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質の脱アセチル化を調節することの指標である、ステップと
を含む、方法。 - Ku70たんぱく質のアミノ酸残基K539又はK542の脱アセチル化を調節する作用物質を特定する方法であって、
(i)請求項7に記載の組成物を、検査化合物に、K539又はK542の脱アセチル化が前記検査化合物の非存在下でも可能な条件下で、接触させるステップと、
(ii)K539又はK542の脱アセチル化のレベルを判定するステップであって、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下でのK539又はK542の脱アセチル化のレベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質のアミノ酸残基K539又はK542の脱アセチル化を調節することの指標である、ステップと
を含む、方法。 - アポトーシスを調節する作用物質を特定するための、請求項10乃至15のいずれかに記載の方法であって、細胞のアポトーシスに対する前記作用物質の効果を判定するステップを更に含み、この場合、前記作用物質の非存在下に比較したときの、前記作用物質の存在下でのアポトーシスの増加又は減少は、前記作用物質がアポトーシスを調節することの指標である、方法。
- 腫瘍の成長又は腫瘍のサイズを阻害する又は減少させる作用物質を特定するための、請求項10乃至15のいずれかに記載の方法であって、腫瘍に対する前記作用物質の効果を判定するステップを更に含み、この場合、前記作用物質の非存在下に比較したときの、前記作用物質の存在下での腫瘍の成長又はサイズの減少は、前記作用物質が腫瘍の成長又は腫瘍のサイズを阻害する又は減少させることの指標である、方法。
- 寿命伸長を調節する作用物質を特定するための、請求項10乃至15のいずれかに記載の方法であって、細胞の寿命に対する前記作用物質の効果を判定するステップを更に含み、この場合、前記作用物質の非存在下に比較したときの、前記作用物質の存在下での寿命の増加又は減少は、前記作用物質が細胞の寿命を調節することの指標である、方法。
- アミノ酸残基K317、K338、K539、K542、K544、K553 又は K556から成る群より選択されるアミノ酸残基を含む単離されたKu70たんぱく質又はその部分と、単離されたアセチルトランスフェラーゼ又はその生物学的活性部分とを含む、組成物。
- 前記アセチルトランスフェラーゼがCREB結合たんぱく質(CBP)又はp300/CBP-関連因子 (PCAF)である、請求項19に記載の組成物。
- 前記Ku70たんぱく質又はその部分がアミノ酸残基K539 又はK542を含む、請求項19に記載の組成物。
- 前記Ku70たんぱく質又はその部分と、前記アセチルトランスフェラーゼ又はその生物学的活性部分とが複合体を形成する、請求項19に記載の組成物。
- Ku70たんぱく質とアセチルトランスフェラーゼとの間の相互作用を調節する作用物質を特定する方法であって、
(i)請求項19に記載の組成物を、検査化合物に、Ku70たんぱく質又はその部分とアセチルトランスフェラーゼ又はその生物学的活性部分との間の相互作用が前記検査化合物の非存在下でも可能な条件下で、接触させるステップと、
(ii)Ku70たんぱく質又はその部分とアセチルトランスフェラーゼ又はその生物学的活性部分との間の相互作用のレベルを判定するステップであって、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下でのKu70たんぱく質又はその部分とアセチルトランスフェラーゼ又はその生物学的活性部分との間の相互作用のレベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質とアセチルトランスフェラーゼとの間の相互作用を調節することの指標である、ステップと
を含む、方法。 - 前記アセチルトランスフェラーゼがCBP 又はPCAFである、請求項23に記載の方法。
- Ku70たんぱく質のアセチル化を調節する作用物質を特定する方法であって、
(i)請求項19に記載の組成物を、検査化合物に、Ku70たんぱく質のアセチル化が前記検査化合物の非存在下でも可能な条件下で、接触させるステップと、
(ii)Ku70たんぱく質又はその部分のアセチル化のレベルを判定するステップであって、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下でのKu70たんぱく質又はその部分のアセチル化のレベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質のアセチル化を調節することの指標である、ステップと
を含む、方法。 - 前記アセチルトランスフェラーゼがCBP 又はPCAFである、請求項25に記載の方法。
- Ku70のアミノ酸残基K539又はK542のアセチル化を調節する作用物質を特定する方法であって、
(i)請求項21に記載の組成物を、検査化合物に、K539又はK542のアセチル化が前記検査化合物の非存在下でも可能な条件下で、接触させるステップと、
(ii)アミノ酸残基K539又はK542のアセチル化のレベルを判定するステップであって、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下でのアミノ酸残基K539又はK542のアセチル化のレベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質のアミノ酸残基K539又はK542のアセチル化を調節することの指標である、ステップと
を含む、方法。 - Ku70たんぱく質のアミノ酸残基K539又はK542のアセチル化を調節する作用物質を特定する方法であって、
(i)請求項19に記載の組成物を含む細胞を、検査化合物及びアポトーシス性刺激に、前記アポトーシス性刺激が、Ku70たんぱく質又はその部分のK539又はK542のアセチル化を前記検査化合物の非存在下でも誘導する条件下で、接触させるステップと、
(ii)Ku70たんぱく質又はその部分のK539又はK542のアセチル化のレベルを判定するステップであって、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下でのK539又はK542のアセチル化のレベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質のアミノ酸残基K539又はK542のアセチル化を調節することの指標である、ステップと
を含む、方法。 - 前記アポトーシス性刺激が紫外線暴露、電離性放射線、又はスタウロスポリンである、請求項28に記載の方法。
- アポトーシスを調節する作用物質を特定するための、請求項23乃至29のいずれかに記載の方法であって、細胞のアポトーシスに対する前記作用物質の効果を判定するステップを更に含み、この場合、前記作用物質の非存在下に比較したときの前記作用物質の存在下でのアポトーシスの増加又は減少は、前記作用物質がアポトーシスを調節することの指標である、方法。
- 腫瘍の成長又は腫瘍のサイズを阻害する又は減少させるための作用物質を特定するための、請求項23乃至29のいずれかに記載の方法であって、腫瘍に対する前記作用物質の効果を判定するステップを更に含み、この場合、前記作用物質の非存在下に比較したときの前記作用物質の存在下での腫瘍の成長又はサイズの減少は、前記作用物質が腫瘍の成長又は腫瘍のサイズを阻害する又は減少させることの指標である、方法。
- 寿命の伸長を調節する作用物質を特定するための、請求項23乃至29のいずれかに記載の方法であって、細胞の寿命に対する前記作用物質の効果を判定するステップを更に含み、この場合、前記作用物質の非存在下に比較したときの前記作用物質の存在下での寿命の増加又は減少は、前記作用物質が細胞の寿命を調節することの指標である、方法。
- アミノ酸残基K317、K338、K539、K542、K544、K553 又は K556から成る群より選択されるアセチル化アミノ酸残基を含む、単離されたアセチル化Ku70たんぱく質又はその部分。
- SEQ ID NO: 2に少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の単離されたKu70たんぱく質であって、アセチル化していないときにはBax又はアセチルトランスフェラーゼと、あるいはアセチル化しているときには脱アセチル化酵素と、相互作用する、単離されたKu70たんぱく質。
- SEQ ID NO: 2を含む、請求項34に記載の単離されたKu70たんぱく質。
- アセチル化残基K539 又は K542を含む、請求項34に記載の単離されたKu70たんぱく質又はその部分。
- アミノ酸残基K317、K338、K539、K542、K544、K553 又は K556から成る群より選択されるアセチル化したアミノ酸を含むKu70たんぱく質又はその部分に特異的に結合する抗体。
- Ku70たんぱく質又はその部分がアセチル化した残基K539 又は K542を含む、請求項37に記載の抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項38に記載の抗体。
- K539、K542、K544、K553、及びK556 から成る群より選択されるリジン残基のアルギニンとの置換を含む変異型Ku70たんぱく質又はその部分をコードする核酸。
- リジン残基K539 及び/又は K542 のアルギニンとの置換を含む変異型Ku70たんぱく質又はその部分をコードする核酸。
- 請求項40に記載の核酸にコードされた変異型Ku70たんぱく質又はその部分。
- 請求項40に記載の核酸を含む細胞。
- 請求項43に記載の細胞を、変異型Ku70たんぱく質又はその部分が前記細胞で発現するような条件下で培養するステップと、前記変異型Ku70たんぱく質又はその部分を培養物から単離するステップとを含む、変異型Ku70たんぱく質又はその部分を調製する方法。
- アセチル化Ku70たんぱく質、その変異型、又はその部分、あるいはそれに特異的に結合する抗体、を含む、キット。
- 細胞内でKu70たんぱく質のK539 又は K542 のアセチル化を誘導する、又は、脱アセチル化を阻害する、ステップを含む、細胞内でアポトーシスを誘導する方法。
- Ku70たんぱく質のK539 又はK542 の脱アセチル化を阻害するステップを含む、請求項46に記載の方法。
- クラスI/IIデアセチラーゼのたんぱく質又は活性レベルを減少させるステップを含む、請求項47に記載の方法。
- サーチュインのたんぱく質又は活性レベルを減少させるステップを含む、請求項47に記載の方法。
- 細胞を、サーチュインの活性を阻害する作用物質に接触させるステップを含む、請求項49に記載の方法。
- 前記作用物質が、式15−24から成る群より選択される式を有する、請求項50に記載の方法。
- クラスI/IIデアセチラーゼのたんぱく質又は活性レベルを減少させる作用物質に細胞を接触させるステップを更に含む、請求項49に記載の方法。
- 細胞内のCBP 又は PCAF のたんぱく質又は活性レベルを増加させるステップを含む、請求項46に記載の方法。
- Ku70たんぱく質のK539又はK542のアセチル化を誘導する、又は、脱アセチル化を阻害する、作用物質を、必要のある対象に投与するステップを含む、対象の腫瘍の成長又はサイズを減らす方法。
- サーチュインのたんぱく質レベル又は活性を減らす作用物質を対象に投与するステップを含む、請求項54に記載の方法。
- クラスI/II デアセチラーゼのたんぱく質レベル又は活性を減らす作用物質を対象に投与するステップを更に含む、請求項54に記載の方法。
- 対象の細胞内のKu70たんぱく質のK539 又は K542 のアセチル化のレベルを判定するステップを更に含む、請求項54に記載の方法。
- 細胞内のKu70たんぱく質のK539又はK542のアセチル化を阻害する、又は、脱アセチル化を誘導する、ステップを含む、細胞のアポトーシスを阻害する方法。
- 細胞内のKu70たんぱく質のK539又はK542の脱アセチル化を誘導するステップを含む、請求項54に記載の方法。
- サーチュインのたんぱく質レベル又は活性を増加させる作用物質に細胞を接触させるステップを含む、請求項59に記載の方法。
- 作用物質が、式26乃至27及び30乃至37から成る群より選択される式を有する、請求項60に記載の方法。
- 細胞内のCBP 又はPCAF のたんぱく質又は活性レベルを減らすステップを含む、請求項59に記載の方法。
- クラスI/IIデアセチラーゼのたんぱく質レベル又は活性を増す作用物質に細胞を接触させるステップを更に含む、請求項60に記載の方法。
- Ku70たんぱく質のK539又はK542のアセチル化を阻害する、又は、脱アセチル化を誘導する、作用物質に細胞を接触させるステップを含む、哺乳動物細胞の寿命を伸長する方法。
- サーチュインのたんぱく質レベル又は活性を増す作用物質、及び、クラスI/IIデアセチラーゼのたんぱく質レベル又は活性を増す作用物質、に細胞を接触させるステップを含む、細胞の寿命を伸長する方法。
- Ku70たんぱく質のK539又はK542のアセチル化を誘導する、又は、脱アセチル化を阻害する、作用物質に細胞を接触させるステップを含む、哺乳動物細胞の寿命を減らす方法。
- サーチュインのたんぱく質レベル又は活性を減らす作用物質、及び、クラスI/IIデアセチラーゼのたんぱく質レベル又は活性を減らす作用物質、に細胞を接触させるステップを含む、細胞の寿命を減らす方法。
- サーチュイン阻害剤及びクラスI/IIデアセチラーゼ阻害剤を含む医薬組成物。
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