BR9810810B1

BR9810810B1 - composiÇço cosmÉtica para o cuidado da pele e processo cosmÉtico de melhorar ou previnir a aparÊncia da pele.

Info

Publication number: BR9810810B1
Application number: BRPI9810810-7A
Authority: BR
Inventors: Robert George Carson; Krupa Patel; Marieann Barratt; Carol Annette Bosko; Sreekumar Pillai
Priority date: 1997-07-25
Filing date: 1998-07-07
Publication date: 2010-12-14
Also published as: ID23932A; CZ2000283A3; CN1327380A; PL338451A1; AU730825B2; US6270780B1; CZ295608B6; KR20010022170A; AU8858498A; CA2299458C; JP2001510777A; WO1999004747A3; DE69815099D1; HK1024417A1; CA2299458A1; DE69815099T2; EP0980235A2; BR9810810A; ZA986039B; TW480178B

Description

"COMPOSIÇÃO COSMÉTICA PARA O CUIDADO DA PELE E PROCESSOCOSMÉTICO DE MELHORAR OU PREVENIR A APARÊNCIA DA PELE"

Campo Da Invenção

Composições cosméticas contendo resveratrol, um estrogênionatural derivado de plantas, e processos cosméticos de condicionar a pele pelaaplicação de tais composições à pele.

Fundamentos da Invenção

A pele humana consiste em duas camadas maiores, a camadade baixo mais densa, a derme e a camada de cima mais fina, a epiderme.Derme é a camada que provê a resistência, elasticidade e a espessura dapele. Com o tempo, a espessura da camada da derme é reduzida e se acreditaser parcialmente responsável pela formação das rugas na pele envelhecida. Acamada superior da pele humana ou a epiderme que provê a elasticidade e aspropriedades de barreira da pele é composta por muitos tipos de célulasdiferentes. Queratinócitos são o maior tipo de célula da epiderme (75-80% donúmero total de células na epiderme humana). Dentro da epiderme, osqueratinócitos residem em quatro distintas etapas de diferenciação. Adiferenciação epidérmica é importante por promover a função essencial dapele, isto é, para promover uma barreira de proteção contra o ambiente exteriore para prevenir a perda de água do corpo. Formação do invólucro cornificado éa etapa final da diferenciação dos queratinócitos. A enzima responsável pelaformação dos invólucros cornificados, transglutaminase, é um marcador dadiferenciação da epiderme. Agentes que aumentam a espessura da camadadérmica e que aumentam a diferenciação dos queratinócitos na camadaepidérmica deveriam, portanto, ser compostos ideais por promover ocondicionamento da pele e benefícios anti-envelhecimento.

Estrogênios e compostos sintéticos que atuam comoestrogênios são conhecidos por aumentar a espessura da camada da derme ereduzir a formação de rugas na pele envelhecida. Mudanças na pele, tais comosecura da pele, perda de elasticidade da pele e aspereza ocorrendo depois damenopausa, são atribuídos a falta de produção de estrogênios. Terapia deestrogênio previne ou reduz muitas das mudanças associadas com a peleenvelhecida (Creidi et al., Efeitos do creme estrogênio conjugado (Premarin®)na pele facial envelhecida, Maturitas, 19, p.211-23, 1994). Um estrogêniosintético, dietil estilbestrol, tem a seguinte estrutura:

Essa estrutura é muito diferente da estrutura natural doestrogênio, estradiol:

<formula>formula see original document page 3</formula>

Em recentes anos, fitoestrogênios (i.e, compostos naturais quetem atividade semelhante ao estrogênio e que são encontrados nas plantas)tem sido progressivamente usados para propósitos terapêuticos. Alguns dosusos descritos são como agentes hipocolesterolêmico e antiterogênico,tratamento de doenças cardiovasculares especialmente depois da menopausada mulher, tratamento para osteoporose nos idosos e como agente anti-câncerespecialmente contra câncer de mama, câncer endometrial e cervical na mulher(Knightetal., Phytoestrogens - um pequeno resumo, Maturitas, 22: 167-75,1995).A demanda do consumidor por produtos baseados em fontes"naturais" vem crescendo nos últimos anos. O consumidor percebe síntesequímica como ambientalmente insegura. Um ingrediente quimicamentesintetizado pode conter substancias químicas adstringentes. Produtos naturaissão percebidos como puro e suave e superior aos produtos sintetizadosquimicamente. Entretanto, liberar um benefício cosmético dos recursos dasplantas não é trivial. De modo a obter um real benefício de um recurso "natural"um ativo específico da planta, que verdadeiramente libera um benefíciocosmético, tem que ser identificado.

Um conhecido fitoestrogênio é fotoanetol:

<formula>formula see original document page 4</formula>

Fotoanetol não tem sido descrito para uso tópico ou cosmético.

A presente invenção é baseada pelo menos em parte nodesenvolvimento de que resveratrol é um fitoestrogênio, que ele inibe aproliferação dos queratinócitos, aumenta a diferenciação dos queratinócitos, ealivia a irritação ou ardência potencialmente associada com o uso de alfa-hidroxi ácidos.

Resveratrol é um composto encontrado em uma variedade deplantas. Isolamento e caracterização do resveratrol têm sido descritos por umavariedade de plantas, tais como as raízes de knotweed japonesas (Pocomcavidade et al., Phytochemistry 35, p.335,1994), do vinho e uvas (Goldberg etal; J.Agric. Food Chem, 43, p.1280, 1995 e Celloti et al., "Resveratrol content ofsome wines obtained from dried Valpolicella grapes" Recioto e Amarone., Jchromatogr A (Holanda) 730: 47-52, 1996) e pelas culturas de planta deamendoim (Kinndl et al., patente US 5391724). Uvas vermelhas e vinhovermelho contêm altas quantidades de resveratrol e esse composto éreivindicado como uma das razões para saúde cardiovascular nos bebedoresde vinho. Além disso, resveratrol tem sido mostrado por ser um potente agentequimiopreventivo do câncer e um agente anti-inflamatório. Resveratrol temtambém sido relatado por induzir diferenciação das células de leucemiapromielócitas humanas (Jang et al., atividade químiopreventiva do câncer doresveratrol, um produto natural obtido das uvas, Ciência 275: 218-220, 1997).Jang et al descreveu o uso de resveratrol como um agente anti-câncer contracélulas cancerígenas tratadas da pele do rato em cultura.

Composições cosméticas contendo extrato de uva têm sidodescritas. Veja por exemplo o resumo do pedido de patente japonês 06336421("JP "421"), revelando o uso de 0,5% de extrato de uva em composiçõescosméticas. Scafilfi et al (patente US 5.683.683) e Zabotto et al. (patente US5.439.672) revelando composições cosméticas contendo óleo da semente dauva. Griat et al (patente US 5.171.577) revela espumas cosméticas contendocaroços cosméticos. Nenhuma dessas revelações, exceto JP "421", mencionaalguma quantidade de uva a ser usada. JP "421" ensina a presença de 0,5%de extrato de uva. De acordo com o Serviço de Pesquisa Agrícola doDepartamento de Agricultura dos Estados Unidos, a concentração deresveratrol em todas as amoras é cerca de 15 ppm. Então, a concentração deresveratrol em 0,5% de extrato da semente da uva é 0,33 micromolar ou0,0000075% em peso.

A técnica discutida acima não descreve o uso do resveratrolpara o cuidado da pele ou o uso cosmético, não ensina que o resveratrol é umfitoestrogênio, ou que ele inibe a proliferação dos queratinócitos, ou que elepromove a diferenciação dos queratinócitos, ou que ele controla a irritação dapele causada pelos alfa-hidroxi ácidos.Descrição Resumida Da Invenção

A presente invenção inclui composição para o cuidado da peleque compreende resveratrol numa quantidade de cerca de 0,00002 a 10% empeso e um veículo cosmeticamente aceitável.

A presente invenção inclui também um processo de melhorarou prevenir a condição de pele rugosa, com linhas, seca, escamosa,envelhecida ou fotoprejudicada e melhorando a espessura da pele,elasticidade, flexibilidade, brilho, luminescência e rudeza, a qual o processoinclui aplicação para a pele a composição inventiva. Composições da invençãosão projetadas para aplicação tópica para pele mamífera que já é seca,escamosa, com linhas, rugosa, envelhecida, fotoprejudicada, ou ascomposições inventivas podem ser aplicadas profilaticamente para pelesaudável normal para prevenir ou reduzir as mudanças deteriorativas.

A presente invenção também inclui processos cosméticos deobtenção de atividade estrogênica para a pele, inibindo a proliferação doqueratinócito na pele humana e aumentando a diferenciação do queratinócito.A invenção ainda inclui um processo cosmético de controle da irritação da pele,aflição ou inflamação que pode ser causada pelos alfa-hidroxi ácidos. A esserespeito, a invenção também inclui composição cosmética contendo resveratrolem combinação com um alfa-hidroxi ácido.

Descrição Detalhada da Invenção

Resveratrol (também conhecido como 5-parahidroxiestirilresorcinol, ou 3,4'5- estilbenetriol) é um essencial ingrediente da composiçãoinventiva. Resveratrol tem a seguinte estrutura:

<formula>formula see original document page 6</formula>Resveratrol pode ser obtido comercialmente do Sigma.

Em geral, a quantidade de resveratrol nas composiçõesinventiva está na variação de 0,00002 a 10% em peso da composição.Preferivelmente, de modo a diminuir o custo e maximizar o efeito da quantidadede resveratrol, está na variação de 0,001% a 5% e mais preferivelmente está navariação de 0,1% a 5%.

A composição de acordo com a invenção também abrange umveículo cosmeticamente aceitável para atuar como diluente, dispersante ouveículo do resveratrol na composição, de modo a facilitar sua distribuiçãoquando a composição é aplicada à pele.

Outros veículos que ou em adição a água pode incluiremoüentes líquidos ou sólidos, solventes, umectantes, espessantes e pós. Umveículo não-aquoso especialmente preferido é um polidimetil siloxano e/ou umpolidimetil fenil siloxano. Silicones dessa invenção podem ser aqueles comvariação de viscosidade em qualquer lugar de cerca de 10 a 10.000.000 mm2/s(centistokes) a 25°C. Especialmente desejável são misturas de silicone de altae baixa viscosidade. Esses silicones estão disponíveis pela General ElectricCompany sob as marcas Vicasil, SE e pela Dow Corning Company das séries200 e 550. Quantidades de silicone, as quais podem ser usadas nacomposição dessa invenção, variam em qualquer lugar de 5% a 95%,preferivelmente de 25% a 90% em peso da composição.

O veículo cosmeticamente aceitável será usualmente formadode 5% a 99,9%, preferivelmente de 25% a 80% em peso da composição epode, na ausência de outros adjuntos cosméticos, formar o restante dacomposição. Preferivelmente, o veículo é pelo menos 80% em peso de água,em peso do veículo. Preferivelmente, água compreende pelo menos 50% empeso da composição inventiva, mais preferivelmente de 60 a 80% em peso, empeso da composição.Em uma modalidade da invenção, as composições inventivastambém incluem um alfa-hidroxi ácido.

Hidroxi ácidos intensificam a proliferação e aumentam abiosíntese de ceramida nos queratinócitos, a espessura epidérmica, e adescamação da pele normal, resultando em pele macia, com aspecto jovial.

O hidroxi ácido pode ser escolhido dos alfa-hidroxi ácidos,beta-hidroxi ácidos (ex. ácido salicílico), outros ácidos hidroxi carboxílicos (ex,ácido dihidroxi carboxílico, hidroxi-dicaroxílico, hidroxi tricarboxílico) e suasmisturas e combinações de seus estereoisômeros (DL, D ou L).

Composições inventivas mais preferidas contendo resveratrolanti-irritante incluem ácido glicólico e/ou ácido láctico, porque essesingredientes têm sido encontrados por ter potência! para causar irritação, alémde que eles eram encontrados para ser particularmente eficaz à obtenção debenefícios cosméticos.

Preferivelmente o hidroxi ácido é escolhido dos alfa-hidroxiácidos tendo a estrutura geral (1):

<formula>formula see original document page 8</formula>

onde M é hidrogênio ou uma cadeia de hidrocarboneto saturada ou insaturada,reta ou ramificada, contendo de 1 a 27 átomos de carbono.

Mais ainda preferivelmente o hidroxi ácido é escolhido do ácidoláctico, ácido 2- hidroxi octanóico, ácido hidroxi láurico, ácido glicólico, e suasmisturas. Quando os estereoisômeros existem, L-isômero é mais preferível.

Uma particular vantagem das composições inventivas é quealtas quantidades de hidroxi ácidos podem ser empregados sem causarirritação da pele. Preferivelmente a quantidade do componente hidroxi ácidopresente na composição de acordo com a invenção é de 0,01 a 20%, maispreferivelmente de 2 a 12% e mais ainda preferivelmente de 4 a 12% em peso.

É para ser entendido que dependendo do pH da composição,hidroxi ácido pode estar presente como um sal de amônio ou potássio ousódio.

Embora as composições inventivas possam ter qualquer pHem sua variação geral de 2,5 a 10, as composições inventivas sãoparticularmente úteis quando elas estão a um pH ácido (especialmente se elascontem um hidroxi ácido ), preferivelmente 3-5 e mais ainda preferivelmente aum pH de 3-4, porque tais composições são particularmente irritantes.

Materiais Opcionais para benefício da pele ε Adjuntos Cosméticos

Um oleo ou material oleoso pode estar presente, junto com umemulsificante para prover tanto uma emulsão água em óleo ou uma emulsãoóleo em água, dependendo largamente do balanço médio hidrofílico-lipofilíco(HLB) do emulsificante empregado.

A composição inventiva preferivelmente inclui protetor solar.Protetor solar inclui aqueles materiais comumente empregados para bloquear aluz ultravioleta. Compostos ilustrativos são derivados do PABA1 cinamato esalicilato. Por exemplo, o octil metoxcinamato e 2-hidroxi-4 metoxibenzofenona (também conhecido como oxibenzona) podem ser usados. Octilmetoxicinamato e 2-hidroxi-4metoxi benzofenona estão comercialmentedisponíveis sob a marca, Parsol MCX e Benzophenone-3, respectivamente. Aexata quantidade de protetor solar empregada nas emulsões pode variardependendo do grau de proteção desejado de radiação UV do sol.

Emolientes são freqüentemente incorporados em composiçõescosméticas da presente invenção. Níveis de tais emolientes podem variar de0,5% a 50%, preferivelmente entre 5% e 30% em peso da composição total.Emolientes podem ser classificados sob tais categorias químicas gerais comoésteres, ácidos graxos e álcoois, polióis e hidrocarbonetos.

Esteres podem ser mono- ou di-ésteres. Exemplos aceitáveis dedi-ésteres graxos incluem adipato de dibutila, sebacato de dietila, dimerato dediisopropila, e succinato de dioctila. Ésteres graxos aceitáveis de cadeiaramificada incluem miristato de 2-etil-hexila, estearato de isopropila e palmitatode isotearila. Ésteres de ácido tribásico aceitáveis incluem trilinoleato de tri-isopropila e citrato de trilaurila. Ésteres graxos de cadeia reta aceitáveis incluempalmitato de laurila, Iactato de miristila, e oleato de estearila. Ésteres preferidosincluem coco-caprilato/caprato (uma combinação de coco-caprilato e coco-caprato), acetato de propileno glicol miristil éter, adipato de di-isopropila eoctanoato de cetila.

Âlcoois graxos e ácidos adequados incluem aquelescompostos tendo de 10 a 20 átomos de carbono. Especialmente preferidos sãoos compostos, tal como álcool e ácidos de cetila, miristila, palmítico e estearila.

Entre os polióis que podem servir como emolientes estão oscompostos de alquil poli-hidroxila de cadeia linear e ramificada. Por exemplo,propileno glicol, sorbitol e glicerina são preferidos. Também úteis podem ser polióispoliméricos tais como poli-propileno glicol e polietileno glicol. Butileno e propilenoglicol são também especialmente preferidos como reforçadores de penetração.

Hidrocarbonetos exemplares que podem servir comoemolientes são aqueles tendo cadeias de hidrocarbonetos em qualquer lugarde 12 a 30 átomos de carbono. Exemplos específicos incluem óleo mineral,gelatina de petróleo, esqualeno e isoparafinas.

Outra categoria de ingredientes funcionais dentro dascomposições cosméticas da presente invenção são espessantes. Umespessante geralmente estará presente em uma quantidade em qualquer lugarde 0,1 a 20% em peso, preferivelmente de cerca de 0,5 a 10% em peso dacomposição. Espessantes exemplares são materiais de poliacrilato dereticulado disponível sob a marca registrada Carbopol da B.F GoodrichCompany. Gomas podem ser empregadas tal como xantano, musgo dairlanda, gelatina, karaya, pectina e goma de alfarroba. Sob certascircunstâncias a função de espessamento pode ser realizada por um materialtambém servindo como um silicone ou emoliente. Por exemplo, gomas desilicone em excesso de 10 centistokes (10"5 m2/s) e ésteres tal como estearatode glicerol tem dupla funcionalidade.

Pós podem ser incorporados na composição cosmética dainvenção. Esses pós incluem giz, talco, caulim, amido, argilas de esmectita,silicato de alumínio e magnésio quimicamente modificado, argila demontmorilonita organicamente modificada, silicato de alumínio hidratado, sílicaíumegaaa, succinaío de ocíeniia de amido e alumínio e suas misturas.

Outros componentes adjuntos menores podem serincorporados na composição cosmética. Esses ingredientes podem incluiragentes de coloração, opacificadores e perfumes. Quantidades desses outroscomponentes adjuntos menores podem variar em qualquer lugar de 0,001%até 20% em peso da composição.

Uso da composição

A composição de acordo com a invenção é projetadaprimeiramente como um produto de aplicação tópica para a pele humana,especialmente como um agente para condicionar, umedecer e suavizar a pele,e prevenir ou reduzir o aparecimento de linhas, rugas e pele envelhecida.

Em uso, uma pequena quantidade da composição, porexemplo, de 1 a 100 ml, é aplicado a áreas expostas da pele, de um recipienteadequado ou aplicador e, se necessário, ela é então espalhada sobre e/ouesfregada na pele usando a mão ou dedos ou mecanismo adequado.

Forma do produto ε Embalagem

Composição tópica de tratamento para a pele da invençãopode ser formulada como uma loção, um creme ou um gel. A composição podeser embalada em um recipiente adequado para ajustar sua viscosidade e o usoprojetado pelo consumidor. Por exemplo, uma loção ou creme pode serembalada em um frasco ou aplicador roll-on, ou um dispositivo de aerosol deacionamento dirigido ou um recipiente encaixado com uma bomba paraoperação com dedos. Quando a composição é um creme, ela podesimplesmente ser armazenada em um frasco não deformável ou um recipientepressionável, tais como um tubo ou uma jarra com tampa. A composição podetambém ser incluída em cápsulas tais como aquelas descritas na patente US5.063.507, incorporada aqui como referência. A invenção consequentementetambém provê um recipiente fechado contendo uma composiçãocosmeticamente aceitável como aqui definida.

Os seguintes exemplos específicos adicionalmente ilustram ainvenção, mas a invenção não é limitada a eles. Em todos os exemplos,resveratrol foi obtido de Sigma. Testes aplicados foram usados para calculartodos os valores de p.

ExemploI

Esse exemplo ilustra que resveratrol é um fitoestrogênio.

O teste seguinte foi empregado para determinar se resveratroltem uma atividade semelhante ao estrogênio.

A linha de célula ZR75 é uma linha de célula de carcinoma dopeito ductal, originalmente isolada do epitélio mamário maligno de uma fêmeaCaucasiana de 63 anos de idade (Engel et al., Células com carcinoma no peitohumano em cultua contínua: Uma revisão., Câncer Res., 38: 4327-4339, 1978).

Essa linha de célula contém receptores do estrogênio, progesterona e outroshormônios esteróides, mas respondem através de um aumento na proliferaçãosomente do estrogênio. A linha de célula contém alta afinidade com osreceptores específicos do estrogênio. Por conseqüência, essa linha de célula éusada para testar atividade tipo estrogênio. (Markiewicz et al., In vitro biossaysof non-steríodial phytoestrogens, J. Sterois Biochem. Molec. Biol1 45: 399-105,1993).

Metodologia usada para determinar a taxa de síntese do DNA nas células:

A incorporação de 3H-timidina pela cultura de células foi usadacomo uma prova da proliferação celular (ambos para células ZR75 e paraqueratinócitos). Timidina é um dos quatros desoxinucleosídeos que sãounidades monoméricas do DNA. Antes da divisão celular de uma célulasomática, um genoma completo da célula que sofre uma divisão celular éreplicado. Isso envolve uma larga escala de síntese de DNA pela célula epermite que ambas as células-filhas recebam cópias idênticas do materialgenético. Quando 3H-timidina é incluída no meio de cultura celular que estãosintetizando DNA em preparação para divisão da célula, a timidina rotulada éincorporada no DNA sintetizado recentemente. O alcance da incorporação de3H-timidina em uma população de células é proporcional a taxa de síntese deDNA por essa população de células e, logo, uma indicação da proliferaçãocelular.

Células ZR75 (da American Type Culture Collection, Rockville,Maryland) foram crescidas em meio RPM11640 (da Gibco Life Technologies)com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 unidades de penicilina por ml e 100unidades de estreptomicina por ml. Todas as incubações foram realizadas a37°C em 5% de CO2. O meio não contém Fenol Red (um fraco estrogêniomimético). As células foram semeadas a uma densidade de um milhão por 75cm2 de frasco. Para o experimento, as células foram semeadas em 24 placasde poço com 100.000 células por ml por poço.

Depois de crescerem por 24 horas, o meio foi removido, ascélulas foram lavadas com PBS (fosfato tamponado salino, fosfato de sódio0,01 Μ, cloreto de sódio 0,138M, cloreto de potássio 0.0027M, pH 7,4) e 1mlde RPMI 1640 sem soro (mas com estreptomicina e penicilina) foi adicionado.Soluções estocadas de resveratrol em sulfóxido de dimetila (DMSO) e estradiolem água foram preparadas. Variadas concentrações de resveratrol e estradiol,como indicado na tabela 1, foram dosadas diretamente em cada poço. Depoisde outras 24 horas, um μΟί de (metil-3H) timidina foi adicionada a cada poço.O meio foi removido após 24 horas. As células foram lavadas uma vez emPBS1 PBS foi removido completamente e as células foram deixadas no gelopara incubar com 1ml por poço de 10% de TCA (ácido tricloroacético) por 30minutos. As placas foram lavadas três vezes com 5% de TCA para removertodos os traços de timidina que não foram incorporados nas células. 500 μΙ dehidróxido de sóuio 0,1 M foram adicionados a cada poço e as placas foramincubadas a temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos. 250 μΙ de cadaamostra foi transferido para um frasco de cintilação e depois adicionando 5 mlde um fluido de contagem, os frascos foram contados por 5 minutos cada emuma composição de trítio. Dados dos poços quadruplicados foram calculadoscomo porcentagem de incorporação de timidina em DNA comparada a aquelade poços controle que não receberam qualquer resveratrol ou estradiol.Valores foram expressos como meio dos desvios padrão das fontesquadruplicadas +/-.

Os resultados que foram obtidos estão resumidos na tabela 1.

Tabela 1

<table>table see original document page 14</column></row><table><table>table see original document page 15</column></row><table>

O valor da incorporação do controle de 3H timidina para oexperimento 1 foi de 71513 cpm e o controle para o experimento 2 foi de 114958cpm.

Os resultados na tabela 1 demonstram que estradiol, umestrogênio conhecido, estimulou a proliferação de células ZR 75, como esperado.Resveratrol aumentou a proliferação de células ZR 75 a uma concentração de 5 a20 μΜ.

Exemplo 2

Esse exemplo demonstra que o resveratrol inibe a proliferaçãode queratinócitos.

1. Queratinócitos humanos normais isolados do prepúcio neonatal pelotratamento da tripsina foram produzidos em meio de Eagle modificado deDulbecco (DME)/5% de soro fetal do bezerro na presença de mitomicinaC tratada por 3T3 fibroblastos do rato para estabelecer a divisão dascolônias de queratinócitos. Queratinócitos foram produzidos sob acondição acima até a sua terceira passagem.

2. Para os experimentos, a terceira passagem dos queratinócitos foramlaminados em um meio de crescimento livre de soro de queratinócitos(KGM; obtido pela Clonetics, San Diego, Califórnia) contendo cálcio 0,09mM. Cerca de 30.000 células foram laminadas em cada poço de 6 placasde cultura de poço de célula e crescida por 5 dias, até as célulasalcançarem cerca de 40% de confluência.

3. O meio foi mudado para meio fresco (KBM; obtido pela Clonetics) eresveratrol em várias concentrações, como indicados na tabela 2, foiadicionado ao meio de uma solução de estoque de DMSO (sulfóxido dedimetila). A concentração final de DMSO nas culturas foi de 0,1%.Culturas de controle não receberam resveratrol, mas foram dosados com0,1% de DMSO. Cada concentração foi testada em três poços separados.Depois de quatro horas, 1 μοΐ de H-timidina (American Corp, atividade Spde 40 Ci/mmol) foi adicionado a 1 ml de meio em cada poço. As célulasforam incubadas por 2 horas. A quantidade de 3H-tirnidina associada como DNA celular dos queratinócitos foi acessada, como descrito abaixo.

4. O meio foi aspirado, e os poços lavados com 1 ml de PBS. O DNA e asproteínas de cada célula na placa foram então precipitados pela adiçãode 1 ml de gelo em 10% de TCA. As placas foram deixadas no gelo por30 minutos para completar o processo de precipitação. TCA foi entãoaspirado e cada poço foi então lavado 4 vezes com TCA a 5 %. Ascélulas nos poços foram dissolvidas em 0,5 ml de hidróxido de sódio 0,1N. 200 μΙ foi então transferido para o frasco de cintilação para acessar aincorporação da timidina e 25 μΙ foi usado para o ensaio de proteínausando reagente de ensaio da proteína BCA como descrito abaixo. 5 mlde um fluido de cintilação (Scintiverse) foram adicionados ao resto dasolução em um frasco, e os frascos foram contados em um contador decintilação para determinar a quantidade de radioatividade em cada frasco.

BCA (Ácido Bicinconínico ) - Ensaio de proteína25 μΙ de suspensão da célula foram colocados em 96 placas depoço. Padrões de BSA (albumina de soro bovino) em hidróxido de sódio 0,1 Nforam também pipetadas em triplicata nos mesmos 96 poços de lâmina.Reagente de ensaio de fragmento de proteína BCA foi adicionado (200 μΙ/poço) e a placa foi incubada por 2 horas em temperatura ambiente.Absorbância foi lida a um comprimento de onda de 570 nm em uma leitora deplaca Dynatech MR7000.A taxa da síntese de DNA foi então calculada comocpm 3H-timidina incorporada em um total DNA/mg celular de células deproteína para cada poço individual. Desvio-padrão e médio para cada grupoforam também calculados. Esses números foram também expressos comopercentual de poço de controle. Cada ponto de dado é expresso como desviomédio de poços triplicados (desvio padrão). Os resultados que foram obtidosestão resumidos na tabela 2.

Valores ρ de menos que 0,5 foram considerados por indicarsignificância estatística.

Tabela 2

<table>table see original document page 17</column></row><table>

Como pode ser visto nos resultados na tabela 2,concentrações tão baixas quanto 1,56 μΜ de resveratrol diminuíramsignificantemente a síntese de DNA dos queratinócitos. 1,56 μΜ de resveratrolreduziu a proliferação dos queratinócitos por mais de 50%. Em ambos osexperimentos, 50 μΜ de resveratrol inibiu completamente a síntese de DNA.Exemplo 3

Exemplo 2 foi repetido a várias concentrações adicionais deresveratrol. Os resultados que foram obtidos estão resumidos na tabela 3.

Tabela 3

Efeito do resveratrol a baixas concentrações em timidina compreendidanos queratinócitos

<table>table see original document page 18</column></row><table>

Pode ser visto pelos resultados da tabela 3 que o resveratrolnão foi efetivo na redução da proliferação dos queratinócitos a umaconcentração mais baixa que 0,8 μΜ (ou 0,000018 % em peso), incluindo umaconcentração muito baixa de 0,33 μΜ que poderia ser a concentração máximapresente em 0,5% de extrato de uva revelada pelo JP 6336421.

Exemplo 4

Esse exemplo demonstra que resveratrol induz a diferenciaçãodos queratinócitos:

Metodologia para a medição da transglutaminase

Durante o processo de diferenciação terminal na epiderme,uma camada de 15 nm de espessura de proteína, conhecida como envoltóriocornificado (CE) é formada na superfície interna da periferia da célula. O CE écomposto de um número distinto de proteínas que tem sido reticulado juntopela formação de ligações de N - (- glutamil) Iisina isodipepdídeas catalisadaspela ação de pelo menos duas diferentes transglumitases expressas naepiderme. Transglumitase (TG-1) é expressa em abundância nas camadasdiferenciadas da epiderme, especialmente na camada granular, mas é ausentena epiderme indiferenciada basal. Assim, TG-1 é um útil marcador dediferenciação do queratinócito epidérmico com altos níveis de TG-1 indicandoum estado mais diferenciado. Um ensaio TG-1 com base em ELISA, usandoum anticorpo TG-1, foi usado para acessar o estado de diferenciação dosqueratinócitos em cultura nos exemplos que se seguem.

O nível de TG-1 foi medido como se segue. Queratinócitosforam obtidos como descrito no Exemplo 2. Para o experimento, cerca de30.000 células foram laminadas em cada poço de 6 lâminas de poço ecrescidas por 5 dias, até que as células alcancem quase 20-30% deconfluência. 2ml/poço de KGN fresco foram adicionados diariamente com 2 μΜde 2-50 mM de resveratrol em DMSO por 3 dias. Poços de controle tambémreceberam 2 μΜ de DMSO. Após 3 dias de tratamento, células foram lavadasduas vezes com PBS e colocadas em um freezer por duas horas. Célulasforam então descongeladas por 2 horas. O teor de DNA das células foiquantificado usando ligação de fluoróforo de DNA, bis-benzimidazol (Hoechst33258) e medindo a fluorescência específica da ligação fluoróforo de DNA a450 nm (excitação a 360 nm).

Níveis de TG -1 das células nos poços foram determinadosusando o anticorpo monoclonal específico de TG-1 (BC1) (primeiro anticorpo)(obtido pela Amersham Life Science) e usando peroxidase rotulado defragmento IgG de anti-rato e coelho (segundo anticorpo). As placas forambloqueadas por 5% de leite sem gordura em TBS (Solução Tris salinatamponada, Tris 0,01 M, cloreto de sódio 0,150 M, pH 8,0) por uma horaseguida por duas horas incubadas com o primeiro anticorpo (1:4000 diluiçãouma vez) em 1% de leite/TBS à temperatura ambiente. Depois de enxaguar asplacas três vezes com 1% de leite/ Tween 20 contendo 0,05% de TBS, asplacas foram incubadas com 1:4000 de diluição do segundo anticorpo àtemperatura ambiente por duas horas. As placas foram enxaguadas por trêsvezes com 1% de leite/TBS/Tween e três vezes com TBS. Cor foi desenvolvidapela incubação com o-fenileno diamina e peróxido de hidrogênio. Aabsorbância foi lida a 492 nm em um espectrofotômetro Ultrospec 3000(Pharmacia Biotech) e níveis de TG-1 foram calculados como fluorescênciaAbs/DNA. O desvio médio (desvio-padrão de no mínimo 3 poços separados foiusado para cálculo e análise estatística dos dados. Valores foram expressoscom absorbância para o TG-1 por unidade arbitrária até a fluorescência doDNA de triplicar os poços ± desvio-padrão. Resultados foram tambémexpressados como porcentagem de controle.

Os resultados que foram obtidos estão resumidos na tabela 4.

Tabela 4

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10 μΜ de resveratrol não era significativamente diferente docontrole no Experimento 1 devido às variações experimentais normais nossistemas biológicos, mas todas as outras concentrações significativamenteaumentaram a expressão transglumitase dos queratinócitos, assim provandoque o resveratrol aumenta a diferenciação dos queratinócitos. No Experimento2, toda concentração de resveratrol de 2 μΜ e diferenciação maiorsignificativamente aumentada de queratinócitos.

Exemplo 5

Esse exemplo demonstra que o resveratrol alivia a inflamaçãoda pele que pode ser causada por alfa-hidroxi ácidos.

Resveratrol é um conhecido inibidor de ciclo-oxigenase.Inibição de ciclo-oxigenase reduz a conversão do ácido araquidônio parasubstâncias pró-inflamatória tais como prostaglandinas, incluindo PGE2.Enquanto a inibição de ciclo-oxigenase seria esperada para reduzir ainflamação, nem todos inibidores de ciclo-oxigenase reduzem a irritaçãopotencialmente associada com um ingrediente cosmético tais como alfa-hidroxiácidos.

Exemplo 5A

Processo do teste de irritação:

Teste de exposição de 4 adesivos: O objetivo era comparar onível de irritação produzido por vários materiais em teste depois das aplicaçõesrepetidas dos adesivos. Os materiais em teste foram mantidos em contato coma pele sob condições oclusivas. O braço de cima externo do panelista foidesignado como a área da aplicação. Curativo tipo bandagem (Scanpor tape)foi usado para segurar os adesivos (25 mm de Hill Top Chamber fixo com 18mm de diâmetro de um disco da Webril padding) no lugar. Ambos os braçosacima do panelista foram usados. Adesivos foram aplicados em ordemaleatória balanceada.

Adesivos foram aplicados às 9:00 horas da manhã de Segundae removidos às 9:00 horas da manhã de Terça-feira (24 horas de exposição).Um novo conjunto de adesivos foi aplicado às 3:00 horas da tarde de Terça-feira e removido na manhã de Quarta-feira às 9:00 horas (18 horas deexposição). Um terceiro conjunto de adesivos foi aplicado às 3:00 da tarde deQuarta-feira e removido na manhã de Quinta-feira às 9:00 horas (18 horas deexposição). Um conjunto final de adesivos foi aplicado às 3:00 horas na tardede Quinta-feira e removido na manhã de sexta-feira às 9:00 horas (18 horas deexposição).

A cada hora que os adesivos foram removidos, os locais foramenxaguados com água morna e seca com batidas leves. Os locais dos testesforam então marcados com uma caneta cirúrgica marcadora na pele paraassegurar a localização para nivelação e subsequente aplicações dosadesivos.

Os locais dos testes foram avaliados às 3:00 da tarde deTerça-feira, Quarta-feira, Quinta-feira, e Sexta-feira da pesquisa, antes dacolocação dos adesivos.

Irritação da pele tais como moderada vermelhidão, secura,e/ou coceira do local do teste é esperado. Inchação dos locais do teste erapossível. Se algum local do teste tinha uma moderada vermelhidão ou algumainchação a qualquer avaliação, nesse local particular do teste não foi colocadoos adesivos novamente.

Os locais dos testes em cada braço foram visualmentealinhados por dois examinadores treinados sob uma iluminação uniforme. Oslocais dos testes foram alinhados em ordem de severidade. O examinadoralinhando respostas no primeiro período de avaliação continuou alinhando oslocais cada dia durante toda a pesquisa.

Alinhando as reações, o local com a mais severa resposta deua mais baixa marca. O local com a Segunda mais severa resposta deu aSegunda mais baixa marca, etc. Não havia alinhamento forçado. Se dois oumais locais não tinham, resposta ou a mesma resposta (nenhuma diferençaentre os locais), uma média dos alinhamentos era marcada. Se um localtivesse sido interrompido, devido ao grau de irritação, o local reteria oalinhamento recebido no momento de dosagem era interrompido.

Análise estatística

Os resultados do alinhamento dos tratamentos dos adesivosforam estatisticamente comparados por processos estatísticos não-paramétricos. Os materiais de teste contendo os anti-irritantes foramcomparados com o controle correspondente contendo somente hidroxi ácido,usando Firedman's Rank Sum em cada ponto de avaliação atuando como umbloco (isto é, cada panelista foi testado com cada teste de tratamento). Umíndice-p de menos que 0,10 foi considerado para indicar significânciaestatística.

Composições contendo ingredientes como indicado na tabela5A, foram testados usando o processo de teste de irritação. Vinte (20) matériasforam testadas. Os resultados que foram obtidos estão resumidos na tabela 5AQuanto maior a soma dos alinhamentos, menor é a irritação.

Fórmula Base

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Tabela 5A

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a: significativamente menos irritante que a composição 2.

Pode ser visto pelos resultados na tabela 5A que o resveratrol(composição 3) significativamente reduziu a irritação induzida pela composição#2 (contendo 8% de ácido glicólico) no dia 1, após a exposição inicial paracomposição #2.

Exemplo Comparativo 5B

Composições contendo ingredientes como indicados na tabela5B, foram testados usando o processo de teste de irritação descrito noexemplo 5A. Vinte e duas (22) matérias foram testadas. Os resultados queforam obtidos estão resumidos na tabela 5B. Quanto mais alto a soma dosalinhamentos, menor é a irritação.

Tabela 5B

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Pode ser visto pelos resultados na tabela 5B, que ibuprofen,um conhecido ingrediente anti-inflamatório (composição #4) não reduziu airritação da Fórmula que contem 8% de ácido glicólico. (composição#2).

Exemplo Comparativo 5C

Composições contendo ingredientes como indicado na tabela5C, foram testados usando o processo de teste de irritação, como descrito no

Exemplo 5A Dezenove (19) matérias foram testadas. Os resultados que foramobtidos estão resumidos na tabela 5C. Quanto mais alto a soma dosalinhamentos, menor é a irritação.

Tabela 5 C

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Pode ser visto pelos resultados na tabela 5C, que indometacin,um conhecido inibidor de ciclo-oxigenase e ingrediente anti-inflamatório(composição#5) não reduziu a irritação da Fórmula que contem 8% de ácidoglicólico (composição#2).

Exemplos 6-11 ilustram composições para cuidado da pele deacordo com a presente invenção. As composições podem ser processadas damaneira convencional. Elas são adequadas para o uso cosmético. Emparticular, as composições são adequadas para aplicação em pele rugosa,com linhas, áspera, seca, escamosa, envelhecida e/ou prejudicada pelos raiosUV para melhorar a aparência e sua sensação como também para aplicaçãopara pele saudável para prevenir ou retardar sua deterioração. Ascomposições são também particularmente adequadas para reduzir a irritação,ardência, ou inflamação que podem ser associados com o uso dos alfa-hidroxiácidos.

Exemplo 6

Esse exemplo ilustra uma emulsão alta interna de fase águaem óleo incorporando a composição inventiva.

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Exemplo 8

Esse exemplo ilustra uma loção alcóolica incorporando acomposição de acordo com a invenção.

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Exemplo 10

Esse exemplo ilustra um creme de proteção solar incorporandoa composição da invenção:

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Exemplo 11

Esse exemplo ilustra uma composição não-aquosa paracuidado da pele incorporando a combinação inventiva.

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1 Um polímero de dimetil silicone tendo um peso molecular de pelo menos50.000 e uma viscosidade de pelo menos 10.000 centistokes à 25°C,disponível pela GEC.

2 Pentâmero de dimetil de siloxano cíclico, disponível pela Dow CorningCopr.

3 Tetrâmero de diemtil siloxano, disponível pela Dow Corning Corp.

Claims

1. COMPOSIÇÃO COSMÉTICA PARA O CUIDADO DAPELE, caracterizada pelo fato de compreender:(a) resveratrol em uma quantidade de 0,00002 a 10% em peso dacomposição;(b) hidroxi ácido em uma quantidade de 0,01% a 20% em pesoda composição; e(c) um veículo cosmeticamente aceitável.

2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a quantidade do hidroxi ácido é de 2% a 12%.

3. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizada pelo fato de que o pH da composição é de 3 a 5.

4. PROCESSO COSMÉTICO DE MELHORAR OUPREVENIR A APARÊNCIA DA PELE, rugosa, com linhas, seca, escamosa,envelhecida e melhorar a espessura, elasticidade, flexibilidade, limunescência,brilho e rudeza da pele, caracterizado pelo fato de compreender aplicar à peleuma composição cosmética compreendendo: (a) resveratrol em umaquantidade de 0,00002 a 10% em peso da composição, (b) hidroxi ácido emuma quantidade de 0,01% a 20% em peso da composição, e (c) um veículocosmeticamente aceitável.