CZ302773B6

CZ302773B6 - Topický prostredek obsahující cis 9, trans 11 kyselinu linolovou pro lécení kuže

Info

Publication number: CZ302773B6
Application number: CZ20012333A
Authority: CZ
Inventors: Alaluf@Simon; Richard Green@Martin; Roderick Harding@Clive; Hu@Heng-Long; Patrick McNeill@Gerald; Richard Powell@Jonathan; Vincent Rawlings@Anthony; Sarah Rogers@Julia; Watkinson@Allan
Original assignee: Unilever N. V.
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-03
Publication date: 2011-11-02
Also published as: AU767130B2; EP1140003A1; ATE482749T1; ES2350900T5; MXPA01006455A; EP1140003B1; DE69942807D1; CN1217651C; CA2355633A1; CN1335763A; PL200949B1; ES2350900T3; RU2253443C2; BR9916450B1; TWI250025B; CA2355633C; PL349446A1; CZ20012333A3; AU1972000A; JP2002532531A

Abstract

Topický prostredek obsahující a) úcinnou látku, jíž je konjugovaná kyselina linolová a/nebo její derivát obsahující zbytky konjugované kyseliny linolové, kde nejméne 50 % hmotnostních konjugované kyseliny linolové a/nebo jejích zbytku je prítomno jako cis 9, trans 11 izomer; b) jednu nebo více kosmetických prísad zvolených ze souboru sestávajícího z parfému, antioxidantu, matovacích cinidel, konzervacních látek, barvicích látek a pufru; a c) dermatologicky vhodný nosic. Použití výše uvedené konjugované kyseliny linolové a/nebo jejích derivátu pro výrobu topického prostredku pro lécení a/nebo prevenci poškození kuže zvoleného ze skupiny sestávající z vráscité kuže, ochablé kuže, kuže poškozené svetelným zárením, suché kuže, drsné kuže, šupinaté kuže, podráždené kuže, svedící kuže, citlivé kuže a/nebo pigmentových skvrn na starecké kuži.

Description

Topický prostředek obsahující cis 9, trans 11 kyselinu linolovou pro léčení kůže

Oblast techniky

Vynález se týká topického prostředku pro léčení a/nebo prevenci poškození lidské kůže zaměřeného na zlepšení její kvality a vzhledu. Pod označením „léčení“ se tedy rozumí jak léčení v pravém slova smyslu, tak zejména kosmetické ošetření.

io

Dosavadní stav techniky

Pokožka je vystavena poškozujícímu vlivu dermatologických onemocnění, zevního prostředí (větru, klimatizace, ústředního topení) a její kvalita se zhoršuje fyziologickým procesem stárnutí („chronoaging“), který je urychlován vlivem slunečního záření („photoaging“). V posledních letech výrazně stoupla poptávka po kosmetických přípravcích a způsobech ošetření pokožky, které by vedly ke zlepšení jejího vzhledu a kvality.

Spotřebitelé především vyhledávají kosmetické prostředky zabraňující stárnutí pokožky („anti20 aging“), které lečí nebo výrazně oddalují vznik viditelných příznaků stárnutí pokožky způsobených věkem a slunečním zářením - vrásek, rýh, ochabnutí pružnosti pokožky, hyperpigmentaci a hyperpigmentacních skvrn stárnoucí pokožky.

Kromě účinku bránícího stárnutí pokožky využívají spotřebitelé i jiné vlastnosti kosmetických produktů. Zavedením pojmu „citlivá pleť“ se zvýšila poptávka po kosmetických přípravcích zlepšujících vzhled a kvalitu citlivé, suché, drsné a/nebo šupinaté pokožky, a zmírňujících její podráždění, zarudnutí a/nebo svědění. Spotřebitelé vyhledávají prostředky, které by léčily skvrny, papulky a jiné kosmetické vady pokožky.

V oboru jsou známé kosmetické a dermatologické prostředky zlepšující kvalitu a vzhled pokožky, které obsahují estery triglyceridů s dlouhým řetězcem polynenasycených esenciálních mastných kyselin, volných kyselin a jejich zásad nebo amonných solí. Přihláška GB 2181349 A mimo jiné popisuje prostředek složený z triglyceridů obsahujících linoleovou kyselinu, který napomáhá vyhlazení pokožky a zlepšuje její pružnost. Na trhu dostupný produkt „Linola Fett n“ (Dr. August

Wolf Gmbh), který je určený k terapii suché pokožky a dermatóz, mimo jiné obsahuje směs 9,11 izomerů konjugované kyseliny linolové.

Z uvedeného vyplývá potřeba jiných účinných kosmetických prostředků k lokální aplikací na pokožku, které léčí nebo výrazně oddalují vznik viditelných příznaků stárnutí pokožky způsobe40 ných věkem a slunečním zářením - vrásek, rýh, ochabnutí pružnosti pokožky, hyperpigmentaci a hyperpigmentacních skvrn stárnoucí pokožky. Vyhledávanými jsou také prostředky a kosmetické způsoby terapie, které kromě vlivu proti stárnutí pokožky také zlepšují vzhled a kvalitu citlivé, suché, drsné a/nebo šupinaté pokožky, a které by zmírnily její podráždění, zarudnutí a/nebo svědění.

Objevili jsme účinnou terapii a ochranu zdravé pokožky proti účinkům stárnutí kůže způsobené věkem nebo slunečním zářením - vrásek, rýh, ochabnutí pružnosti pokožky, hyperpigmentaci a hyperpigmentacních skvrn stárnoucí pokožky a/nebo citlivé, suché, drsné, šupinaté, zarudlé, podrážděné a svědící pokožky, kterou je aplikace kosmetického prostředku na kůži, který je specificky obohacený o určitý izomer konjugované linolové kyseliny nebo jeho derivátem.

- 1 CZ 302773 B6

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je topický prostředek (prostředek pro lokální ošetření), který obsahuje:

a) konjugovanou kyselinu linolovou a/nebo její derivát obsahující zbytky konjugované kyseliny linolové, kde nejméně 50 % hmotnostních konjugované kyseliny linolové a/nebo jejích zbytků je přítomno jako cis 9, trans 11 izomer,

b) jednu nebo více kosmetických přísad zvolených ze souboru sestávajícího z parfémů, antiio oxidantu, matovacích činidel, konzervačních látek, barvicích látek a pufrů a

c) dermatologicky vhodný nosič.

V přednostním provedení obsahuje tento prostředek od 0,00001 % do 50 %, přednostně od i? 0,01 % do 10 % hmotnostních, vztaženo na prostředek, konjugované kyseliny linolové a/nebo jejích derivátů definovaných výše.

Předmětem vynálezu je také topický prostředek definovaný výše pro použití pro topické léčení a/nebo prevenci poškození kůže zvoleného ze skupiny sestávající z vrásčité kůže, ochablé kůže, kůže poškozené světelným zářením, suché kůže, drsné kůže, šupinaté kůže, podrážděné kůže, svědící kůže, citlivé kůže a/nebo pigmentových skvrn na stařecké kůži.

Konečně je předmětem vynálezu také použití konjugované kyseliny linolové a/nebo jejích derivátů obsahujících zbytky konjugované kyseliny linolové, kde nejméně 50 % hmotnostních konjugo25 váné kyseliny linolové a/nebo jejích zbytků je přítomno jako cis 9, trans 11 izomer, pro výrobu topič kého prostředku pro léčení a/nebo prevenci poškození kůže zvoleného ze skupiny sestávající z vrásčité kůže, ochablé kůže, kůže poškozené světelným zářením, suché kůže, drsné kůže, šupinaté kůže, podrážděné kůže, svědící kůže, citlivé kůže a/nebo pigmentových skvrn na stařecké kůži.

Prostředky podle vynálezu jsou zvláště vhodné pro kosmetickou lokální aplikaci na lidskou kůži k léčení a/nebo prevenci kožních změn zvolených ze skupiny sestávající z vrásek, uvolněné pokožky, pokožky poškozené UV zářením, citlivé pokožky, suché pokožky, drsné pokožky, pokožky tvořící šupinky, zarudnutí, podráždění, svědění a pigmentových skvrn starších lidí. Pro35 středek je vhodný k aplikaci na kůži ke kosmetické terapii skvrn starších lidí. Prostředek je vhodný k aplikaci na kůži ke kosmetické terapii skvrn, papulek a jiných vad nebo jako kosmetický prostředek, který urychluje vyhojení pokožky a/nebo podporuje ukládání kolagenu v kůži.

Uvedené prostředky a postupy vedou ke zpomalení stárnutí pokožky, k vyhlazení a zlepšení pruž40 nosti pokožky a ke zmírnění nebo opoždění vrásek a stárnutí pokožky s úpravou barvy pokožky. Aplikací prostředku doporučených způsobem se dosáhlo všeobecného zlepšení vzhledu, struktury a kvality, především vzhledem k projasnění, čistotě a všeobecně mladistvého vzhledu pokožky. Uvedené prostředky a postupy účinně vyhlazují a zklidňují citlivou, suchou, drsnou, podrážděnou, zarudlou pokožku, pokožku tvořící šupiny a zamezují svědění pokožky. Postupy a prostřed45 ky, kterých se tento vynález týká mají širokou škálu pozitivních účinků v péči o pleť.

Termín „terapie“ označuje snížení výskytu, oddálení vzniku a/nebo prevenci shora uvedených vad (vrásek, stárnutí, poškození UV zářením, suché a/nebo podrážděné pokožky), zlepšení kvality kůže, jejího vzhledu a struktury prevenci nebo snížením tvorby vrásek a zvýšením její oheb50 nosti, pružnosti, pevnosti, vyrovnanosti a poddajnosti. Kosmetické prostředky, způsobu podání a použití konjugované kyseliny linoleové podle současného vynálezu lze také s výhodou použít k terapii pokožky již vrásčité, stárnoucí, poškozené UV zářením, suché a podrážděné nebo k terapii pokožky mladistvé jako prevence nebo oddálení shora uvedených nežádoucích změn způsobených fyziologickým procesem stárnutí / UV zářením.

Izomerem cis 9 trans 11 obohacená konjugované kyselina linolová:

Jako konjugovanou kyselinou linolovou (CLA) označujeme skupinu polohových a geometrických izomerů kyseliny linolové s různými konfiguracemi cis a trans daných dvojnou vazbou v pozicích (6,8), (7,9), (8,10), (9,11), (10,12) nebo (l 1,13). Existuje tak 24 izomerů CLA.

Základní účinnou látkou prostředku podle současného vynálezu je izomer cis 9, trans 11 (následně označovaný jako c9, til). Jde o izomer volné kyseliny následujícího vzorce 1:

Podstata současného vynálezu se týká také derivátů volné kyseliny, které obsahují molekuly konjugované kyseliny linolové. Preferovanými deriváty jsou deriváty vytvořené na karboxylové skupině kyseliny - estery (retinyl-estery, estery triglyceridové, monoglyceridové estery, diglyce15 ridové estery, fosfoestery), amidy (ceramidové deriváty), soli (soli alkalických kovů a soli alkalických zemin, amoniové soli) a/nebo deriváty odvozené substitucí na 08 uhlíkovém řetězci (alfahydroxy- a/nebo betahydroxy-deriváty).

V případě derivátů triglyceridových esterů jsou zahrnuty všechny polohové izomery substituentů konjugované kyseliny linolové (CLA) ne glycerolovém skeletu. Triglyceridy musí obsahovat nejméně jednu molekulu CLA. Pro příklad uvádíme, že na tri esterifikované pozice glycerolového skeletu lze esterifikaci navázat CLA v pozici 1 a 2 a jinou mastnou kyselinu v pozici 3 nebo alternativně lze CLA esterifikaci navázat v poloze 1 a 3 a jinou mastnou kyselinu v pozici 2,

Pokud uvádíme termín „konjugovaná linolová kyselina“ nebo „CLA“, pak tím rozumíme i její deriváty obsahující zbytky CLA. Jako „zbytky CLA“ označujeme mastné acylové podíl(y) konjugované kyseliny linolové přítomné v derivátu konjugované kyseliny linolové.

Termínem „izomerem c9 tl 1 obohacená konjugovaná kyselina linolová“ označujeme skutečnost, ao že nejméně 50 % hmotnostních celkové CLA a/nebo zbytků CLA v kosmetickém prostředku je ve formě cis 9, trans 11 izomerů. Preferujeme hodnotu nejméně 70 % hmotnostních, nejvíce preferujeme přítomnost nejméně 90 % hmotnostních celkové CLA a/nebo zbytků CLA ve formě cis

9, trans 11 izomerů.

Konjugovanou kyselinu linolovou (CLA) a/nebo její deriváty obsahující zbytky CLA podle současného vynálezu (obsažené v kosmetickém prostředku jako nejméně 50 % hmotnostních celkové konjugované kyseliny linolové (CLA) a/nebo zbytků CLA ve formě izomerů cis 9, trans 11) lze vyrobit podle postupu popsaného ve WO 97/18320. Preferovaným způsobem výroby je postupu podle následně uvedeného příkladu 1.

Izomerem c9 tl 1 obohacená konjugovaná kyselina linolová jako účinná látka kosmetického prostředku podle současného vynálezu je obsažena v účinném množství. Za běžné se považuje celkové množství účinné látky od 0,00001 % do 50% hmotnostních prostředku. Preferujeme množství od 0,01 % do 10 % a nejlépe od 0,1 % do 5 %, které optimalizuje poměr výše nákladů a velikosti účinku.

Dermatologicky vhodné základy;

Prostředek podle současného vynálezu také obsahuje dermatologicky / kosmeticky vhodná vehi50 kula (základy), která jsou zároveň ředidly, disperzními činidly a nosiči účinné látky, c9 tl 1 izomerem obohacené konjugované kyseliny linolové. Vehikulum obsahuje látky běžně používané v kosmetických prostředcích - vodu, kapalné nebo pevné změkčující látky, silikonové oleje,

-3CZ 302773 B6 emulzi fikační činidla, rozpouštědla, stabilizátory vlhkosti, zahušťovadla, prášky, hnací plyny a podobně.

Vehikulum tvoří obvykle od 5 % do 99,9%, především od 25 % do 80% hmotnostních prostředku, a pokud neobsahuje další kosmetické přísady, doplňuje složení prostředku.

Eventuální kosmetické látky a přísady:

Kromě účinné látky, c9 tl 1 izomerem obohacené konjugované kyseliny linolové lze použít i další specifické kosmeticky účinné přísady (sluneční faktory, činidla zesvětlující pokožku, činidla ztmavující pokožku). Vehikulum kosmetického prostředku může obsahovat vonné látky, antioxidanta, matovací činidla, konzervační látky, barviva a pufry.

Výroba kosmetického prostředku, forma podání, použití a balení:

Při výrobě lokálního prostředku podle současného vynálezu lze použít v oboru běžné postupy pro výrobu kosmetických prostředků. Do dermatologicky vhodného nosiče se zavedou účinné látky podle běžných postupů. Účinnou látku lze nejprve rozpustit nebo uvést do disperze v dílu vody nebo jiného rozpouštědla nebo kapaliny, které jsou součástí prostředku. Preferovanými typy kosmetického prostředku jsou emulze typu olej ve vodě nebo voda v oleji.

Prostředky mohou být ve formě běžných kosmetických prostředků - krému, gelu, lotion a podobně. Prostředek lze vyrobit v tzv. „wash-off' formě, respektive jako mycí nebo sprchový gel, obsahující systém napomáhající adherenci účinné látky k pokožce během smývání gelu z pokožky. Především preferujeme tzv. „leave-on“ formu produktu, který se nanáší na pokožku bez následného smývání po jeho aplikaci.

Prostředek lze balit vhodným způsobem do nádobek, lahviček, tubiček, nádobek s aplikační kuličkou a podobně.

Terapie kosmetickým prostředkem podle současného vynálezu vyžaduje jeho aplikaci jedenkrát nebo několikrát denně na postiženou pokožku. Zlepšení vzhledu pokožky se projeví obvykle po 3 až 6 měsících terapie, podle stavu pokožky, koncentrace účinných látek podle současného vynálezu, množství použitého prostředku a frekvenci aplikace. Kosmetický prostředek se z vhodné zásobní nádoby nebo aplikátorem obvykle nanáší v malém množství od 0,1 do 5 ml na pokožku, roztírá se a/nebo vtírá do pokožky rukou nebo prsty nebo vhodnými prostředky. Podle zvolené formy prostředku („leave-on“ nebo „rinse-off¹’) lze přistoupit ke smývání prostředku.

Následuje podrobný popis vynálezu. Příklady provedení vynálezu mají pouze ilustrativní význam a nejsou limitujícími.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příklad popisuje výrobu konjugované kyseliny linolové (CLA) zahrnující výrobu:

1) směsi c9,111 izomerů a 110, c 12 izomerů v poměru 1:1,

2) 93 % hmotnostních c9 til izomerů CLA z celkového množství zbytků CLA (sloučenina podle současného vynálezu),

-4CZ 302773 B6

3) 80,5 % hmotnostních tlO c!2 izomerů CLA z celkového množství zbytků CLA (sloučenina není zahrnuta do současného vynálezu).

Směs izomerů konjugované kyseliny linolové (CLA) c9, tl 1 a tlO, 112 se ve stejném množství získá z oleje světlice (safloru) působením zásadou při vysoké teplotě. Konjugovaná kyselina linolová (CLA) obohacená izomerem c9, til se ze směsi získá selektivní esterifikaci laurylalkoholem za použití Geotrichum c andidum jako katalyzátoru. Izomerem c9, til obohacená konjugovaná kyselina li no lová (CLA) se hydrolyzuje a přemění na triglycerid. Po esterifikaci a oddělení se zbylé volné CLA obohatí izomerem tlO, cl2 CLA.

1. Výroba směsi izomerů konjugované kyseliny linolové (CLA)

V 6 kg propylenglykolu farmaceutické kvality se mícháním a zahříváním na teplotu 80 až 85 °C rozpustí 0,6 kg hydroxidu sodného („Analar Reagent“ (AR)). Vzorek se zchladí a přidají se 2 kg oleje světlice barvířské (safloru). Za použití vybavení pro výrobu ve velkém měřítku se za stálého míchání směr refluxuje 3 hodiny při teplotě 170 °C. Reakční směs se zchladí na teplotu přibližně 95 °C, rychlost míchání se nastaví na střední rychlost a směs se při teplotě 90 °C neutralizuje 1,280 I 35,5% kyseliny chlorovodíkové rozpuštěné v 8 I demineralizované vody. Reakční směs se nechá ustát a vodný podíl se odstraní. Fáze oleje se dvakrát promyje 1 1 5% roztoku AR soli a dvakrát 1 l demineralizované vody při teplotě 90 °C. Jakákoliv příměs mýdla se odstraní. Olej obohacené konjugované kyseliny linolenové (CLA) se ve vakuu suší při teplotě 100 °C, vypustí se pri teplotě 50 °C a filtruje se na Biichnerově systému obsahující filtr Whatman a tenkou vrstvu tzv. Celíte—hyflofíltrátu. Směs izomerů CLA jako olej se skladuje pod dusíkem při teplotě -25 °C. Složení oleje připraveného touto metodou je shrnuto v tabulce L

Tabulka 1

typy mastných kyselin	% hmotnostní mastných kyselin v prostředku
c9,t11 CLA	34,1 (47 %z celkové CLA)
t10, C12CLA	34,1 (47 % z celkové CLA)
c9, c11 & c10, c12 CLA	2,3
t9, t11 & Π0, t12 CLA	0.7
ostatní CLA	1,4
celková CLA	72,6
16:0	7,0
16:1	0,8
18:0	2,5
18:1	13,3
18:2 (non-CLA)	3,3
ostatní mastné kyseliny	0,5 J

-5 CZ 302773 B6

2. Výroba konjugované linolové kyseliny (CLA) obohacené c9 tl l izomerem

I) Výroba laurylesteru

2,0 kg CLA připravené ze světlice barvířské (satloru) se přidá k množství odpovídajícímu dvakrát molárním ekvivalentům 98 % laurylalkoholu (1—dodekanolu, Aldrich Chemicals) společně s 5,96 kg demineralizované vody. Teplota směsi se přivede na 25 °C a do směsi se přidá 1 % hmotnostních (jeotrichum candidum (Amano Pharmaceuticals, Japonsko), které se předem rozmíchá s trochou vody. Reakční směs se energicky 44 hodin míchá, a následně se reakce ukončí. Reakční nádoba se zahřeje na teplotu 80 až 90 °C, vodný podíl se odvede z reakční nádoby a olej se promyje demineralízovanou vodou a suší se 30 minut ve vakuu při teplotě 100 °C. Po zchlazení na teplotu 50 °C se olej filtruje se na Bůchlerově systému obsahujícím filtr Whatman a tenkou vrstvu celit-hyfio filtru.

II) Oddělení izomerem c9, tl 1 CLA obohacených esterů

Laurylalkohol se odstraní molekulární destilací rychlostí 25 až 35 ml/min při teplotě 130°C. Zbytek se nahrubo rozdělí na laury lestery (obohacené izomerem c9, til CLA) a volné kyseliny (obohacené izomerem tlO, cl2 CLA) odpařováním při teplotě 158 °C rychlostí průtoku 25 až 35 ml/min. Jakékoli množství příměsi volných kyselin ve zbytku laury lesteru se odstraní následnou destilací při teplotě 171 °C a rychlostí průtoku 30 až 40 ml/min. Při teplotě 90 °C se 2790 g laury [esterového zbytku neutralizuje při teplotě 90 °C přidáním 330 ml 4M AR roztoku hydroxidu sodného. Po oddělení olejové fáze od vodné fáze se olej třikrát promyje demineralízovanou horkou vodou 0,lM zásadou a dvakrát horkou vodou. Vzorek obohaceného oleje laurylesteru se suší podle shora uvedeného postupu.

IH) Saponifikace izomerem c9, tl 1 obohacených laurylesterů CLA

Izomery c9, tl 1 obohacené laury lestery konjugované kyseliny linolové (CLA) se saponífíkují za použití směsi AR hydroxidu sodného a 96% ethanolu a znovu se okyselí koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou AR. Reakční směs obsahující volné mastné kyseliny obohacené CLA se suší při teplotě 100 °C a filtruje se shora uvedeným způsobem při teplotě přibližně 50 °C. Laurylalkohol se odpaří při teplotě 132 °C rychlostí 25 až 35 ml/min. K úplnému odstranění příměsi laurylalkoholu se volné alkoholy esterifikují s mastnými kyselinami přítomnými v reakční směsi za použití SP392 Mucor miehei lipázy (5%, šarže: lux 0110, Novo Nordisk). Izomerem c9 tl 1 obohacená CLA obsahující mastné kyseliny se z laurylesterů separuje za použití molekulární destilace ve vakuu při teplotě 155 °C rychlostí 15 až 20 ml/min. Produkt obsahující konjugovanou kyselinu linolovou obohacenou izomerem c9 tl 1 má složení uvedené v tabulce 2:

-6CZ 302773 B6

Tabulka 2

typy mastných kyselin	% hmotnostní mastných kyselin v prostředku
c9,t11 CLA	66,1 (93 %z celkové CLA)
t10, c12 CLA	4,1
c9, c11 & c10, c12 CLA	0,3
t9, t11 & t10, Í12 CLA	0,4
ostatní CLA	0,2
celková CLA	71,1
16:0	1,6
16:1	-
16:0	0,4
16:1	22,3
18:2 (non-CLA)	4,5
ostatní mastné kyseliny	0,1

3. Výroba konjugované kyseliny linolové (CLA) obohacené izomerem 110, cl2

Volná CLA získaná v části II) se znovu destiluje při teplotě 160 až 165 °C rychlostí 20 až 30 ml/min k odstranění příměsi esteru. Obsah laury(alkoholu se sníží následnou destilací pri teplo lote 131 °C rychlostí 25 až 30 ml/min. Zbylý laurylalkohol se odstraní re-esterifikací popsanou v části III) pro izomery c9, tl 1 za použití lipázy Mucor miehei SP392. Jakákoli příměs vytvořených laurylesterů se odstraní destilací popsanou pro izomer c9, tl 1. Vznikne produkt konjugované kyseliny linolové (CLA) obohacené izomerem tlO, cl 2, jehož složení je uvedené v následující tabulce 3:

-7CZ 302773 B6

Tabulka 3

typy mastných kyselin	% hmotnostní mastných kyselin v prostředku
c9, t11 CLA	8,3
ťlO, C12CLA	53,9 (80,5% z celkové CLA)
c9, c11 &c10,c12CLA	2,9
t9. t11 &t1O,t12CLA	1,1
ostatní CLA	07
celková CLA	66,9
16:0	13,6
16:1	!
18:0	4,6
18:1	10,3
18:2 (non-CLA)	3,1
ostatní mastné kyseliny	1,5

Příklad 2

Výroba triglyceridů konjugované kyseliny linolové obohacené izomerem c9, tl 1 io

S 5,55 g (10,1%) glycerolu (Pricerine 9083 glycerine CP, firmy Ellis and Everards) se smísí 55 g konjugované kyseliny linolové (CLA) obohacené izomerem c9, til připravené podle postupu příkladu 1 a do směsi se přidají 3 g (přibližně 5 %) nespecifické lipázy Mucor meihie SP392 (Mucor Meihie, Novo Nordisk, šarže: Lux 0110). Směs se míchá v rotační odparce ve vakuu při is teplotě místnosti pod slabým proudem dusíku.

Po 24 hodinách se množství volných mastných kyselin sníží na 12,7 %, a následně se přidá 0,15 g glycerolu. Po 48 hodinách se hladina volných mastných kyselin sníží na 3,4 % a reakce se ukončí filtrací směsi přes tenkou vrstvu celite-super—cel filtru na Biíchnerově filtračním systému. Získá se olejová fáze obsahující triglycerid obsahující CLA. Složení produktu je přehledné uvedeno v tabulce 4:

-8CZ 302773 B6

Tabulka 4

typy mastných kyselin	% hmotnostní mastných kyselin v prostředku
c9,t11 CLA	64,9 (93 % z celkové CLA)
t10, c12CLA	3,9
c9,c11 &c10,c12CLA	0,4
t9, t11 &t10,t12CLA	0,6
ostatní CLA	-
celková CLA	69,8
16:0	1,7
16:1	0,9
18:0	0,5
18:1 I	22,4
18:2 (non-CLA)	4,5
ostatní mastné kyseliny	0,2

Příklad 3

Příklad znázorňuje účinky konjugované kyseliny linolové (CLA) obohacené izomerem c9, tl 1 io zpomalující proces stárnutí.

Určení in vivo regulace nahoru prokolagenu-I a dekorinu přítomného v kůži a následná porovnání s lokálním působením kyselinou retinovou

Kolagen jako hlavní protein kožní tkáně především dodává kůži pevnost v tahu. Dekorin je důležitým proteoglykanem, který kontroluje a upravuje ukládání kolagenu do extracelulámích prostorů kožní tkáně. V oboru je známé, že hladiny kolagenu a dekorinu jsou signifikantně snížené v kůži starších lidí a/nebo v kůži poškozené UV zářením. Mezi studie, které dokazují snížení hladiny kolagenu typu I v kůži ve stárnoucí kůži a kůži poškození UV zářením patří studie: R. Lav20 ker J. Inv. Derm., (1979), 73, 79-66; Griffith a spol., N. Eng. J. Med. (1993), 329, 530-535.

Ve studií Bernsteina a spol. (Lab. Invest. (1995), 72, 662—669) bylo v kůži poškozené UV zářením prokázáno snížení exprese mRNA a exprese proteoglykanu in vitro. Snížení množství těchto kožních proteinů je spojeno se snížením pevnosti v tahu kůže, které je důvodem tvorby vrásek a uvolnění pokožky.

Kyselina retinová je v oboru známá jako velmi účinná látka působící proti stárnutí a způsobující hojení pokožky poškozené UV zářením. Bylo prokázáno, že po lokálním působení kyselinou retinovou dochází k vyhlazení vrásek a úpravě kvality kůže zvýšením syntézy a ukládání nového kolagenu v kůži (Griffiths a spol., N. Eng. J. Med. (1993), 329, 530-535).

-9CZ 302773 B6

Je ověřeno, že posilování kožní tkáně zvyšováním hladiny kolagenu v kůži působením kyselinou retinovou vede ke zpomalení procesu stárnutí a k úpravě kvality kůže. Zvýšení tvorby prokolagenu I jako prekurzoru kolagenu jako odpověď na podání zkoumané látky je markérem zvýšení hladiny kolagenu.

Byly vybrány dvě skupiny žen se stejným nebo podobným slabým až mírným stupněm poškození UV zářením kůže zevního předloktí. Účastnice studie obdržely 0,05% kyselinu retinovou v hydratačním základu (Ret i nova“) a barevně shodný hydratační krém s téměř stejnými smyslovými charakteristikami (Dermacare® lotion), který neobsahuje žádnou účinnou látku, jako placebo kontrolu. Každá zúčastnit aplikovala Retinova® najedno zevní předloktí a placebo (Dermacare “) na druhé předloktí. Skupina 1 aplikovala produkty na zevní předloktí denně po dobu 14 týdnů, skupina 2 aplikovala produkty na zevní předloktí denně po dobu 28 týdnů. Na končí studie se biopsií nabodnutím odebraly dva vzorky celé šířky kůže o průměru 4 mm z léčených oblastí předloktí. Účinek působení kyselinou retinovou na expresi dekorinu a prokolagenu I jako složek extracelulámí matrix kůže se ve srovnání s placebo účinkem hodnotil imunohistochemickou analýzou tkáně získané biopsií. Postup byl následující:

Materiál:

Jako protilátky ředící pufr aplikovaný na voskové řezy se použil pufr složení: fyziologický roztok s Tris pufrem (TBS), 3% albumin hovězího séra (BSA), 0,05% Triton X-l00 a 0,05% azid sodný.

Primární protilátky pro kolagenu-I (aminoterminál) se získaly od Chemicon International lne. (kat. č. MAB 1912, IgGl krysy). Voskové řezy se nejprve 25 minut zpracovávaly 0,5 mg/ml trypsinu pri teplotě 37 °C, a následně se na ně přes noc působilo primárními protilátkami prokolagenu-I ředěného 1:800 při teplotě 4 °C.

Primární protilátky dekorinu se získaly od firmy Biogenesis (polyklonální králičí) a použily se v ředění 1:800, přes noc při teplotě 4 °C.

Sekundární biotinylované protilátky proti krysím protilátkám se získaly od firmy DAKO (kat. č. E0468, králičí polyklonální) a aplikovaly se na voskové řezy v ředění 1:400.

Sekundární biotinylované protilátky proti králičím protilátkám se získaly od firmy Amersham (kat. Č. RPN1004, oslí polyklonální) a aplikovaly se na voskové řezy v ředění 1:400.

Streptavidinem konjugovaná alkalická fosfatáza se získala od firmy Zymed (kat. č. 43-4322) a použila se v koncentraci 1:2500.

Fest Red se získal od firmy DAKO (kat.č.K597).

Kontrastní barvivo buněčných jader, Gills #3 Haematoxylin se získalo od firmy Sigma (kat.Č. T7186).

Sklíčka se zalila Glycergelem od firmy DAKO (kat.č.C563).

Postup

Voskové řezy tkáně získané biopsií, zalité na silanizinovaných mikroskopických sklíčkách se hodin vyhřívají při teplotě 55 °C. Ze sklíčka se vosk odstraní xylenem a alkoholem a sklíčka se přenesou do vody, a následně do roztoku TBS. Za použití DAKO® pera se řezy označí. Řezy se zpracují k získání antigenu za eventuálního použití trypsinu, jak je určeno pro každou protilátku. Pokud je nutné získání antigenu, pak se sklíčka inkubují 25 minut pri teplotě 35 °C

- 10CZ 302773 B6

0,5 mg/ml trypsinu (Sigma kat.č. T-7186). Proteáza se následně odstraní oplachem dvakrát 2 minuty TBS roztokem. Následně po eventuálním získání antígenu nebo jinak přímo po označení řezů se vazby nespecifických protilátek 20 minut blokují působením 5% roztokem sekundárních protilátek hostitelského séra v blokačním roztoku složeném z TBS, 5% BSA a 0,1 azidu sodného ve vlhké komoře při teplotě místnosti. Přebytek blokačního roztoku se odčerpá, ale řezy se nenechají vyschnout. Řezy se následně inkubují pres noc při teplotě 4°Cs primárními protilátkami (přibližně ředěnými shora uvedeným způsobem) ve vlhké komoře. Protilátky se následně z řezů odstraní, ale řezy se nenechají vyschnout, promyjí se roztokem TBS k odstranění nenavázaných primárních protilátek (1 minuta oplaeh, a následně 3 minuty promývání). Řezy se pak inkubují ío při teplotě místnosti ve vlhké komoře 1 hodinu s odpovídajícími sekundárními protilátkami. Roztok protilátek se následně z řezů odčerpá při zamezení jejich vyschnutí, promyjí se roztokem TBS (1 minuta oplaeh, a následně čtyřikrát 5 minut promývání) k odstranění nenavázaných sekundárních protilátek. Pro bíoti nyl ovane sekundární protilátky se řezy následně inkubují s konjugo váným streptavidinem 45 minut při teplotě 37 °C a k odstranění nevázaného konjugo váného strep15 tavidinu se promyjí roztokem TBS. Přidá se barvivo Fast Red a vytváření barvy se sledovalo k zabránění příliš intenzivního zbarvení. Řezy se následně dobarví a uzavřou.

Rozdíly exprese prokolagenu-I a dekorinu v místech pod vlivem kyseliny réti nové (Retinova®) a placeba (Dermacare®) se hodnotily světelnou mikroskopií z imunohistochemicky barvených řezů.

Z analýzy vyplývá, že dochází k regulaci nahoru prokolagenu-I a dekorinu v kůži poškozené UV zářením způsobené lokální aplikací kyseliny retinové (Retinova®). Výsledky jsou přehledně uvedeny v tabulce 5:

Tabulka 5

Účinek působení kyselinou retinovou in vivo na expresi prokolagenu-l a dekorinu v kůži

	Celkový počet účastnic zkoušky	-, Počet účastnic s projevy výrazného zvýšení exprese prokoiagenu-l	-i Počet účastnic s projevy výrazného zvýšeni exprese dekorinu
Skupina 1 po 14 týdnech	16	9	10
Skupina 2 po 28 týdnech	15	10	15 I

Složky extracelulámí tkáně - prokolagen—Ϊ a dekorin jsou vhodné, snadno identifikovatelné markéry úpravy kvality dermální tkáně způsobené působením kyselinou retinovou.

Postup měření syntézy dekorinu v lidských dermálních fibroblastech:

Výroba kondici ováného živného prostředí pro dermální fibroblasty:

Primární lidské fibroblasty získané z předloktí a z druhé pasáže po přeočkování (P2) se naočkují do ploten s 12 prohlubněmi v koncentraci 10000 buněk /cm² a 24 hodin se udržují v atmosféře

5% oxidu uhličitého a 4% kyslíku v médiu DMEM (Dulbeccem modifikované Eaglovo médium)

- 11 CZ 302773 Β6 doplněného 10% fetálním telecím sérem. Buňky se následně promyjí DMEM neobsahujícím sérum, a pak se 60 hodin ínkubují v Čerstvém DMEM neobsahujícím sérum. Jednoduché vrstvy fibroblastů se znovu promyjí DMEM neobsahujícím sérum. Zkoumaná činidla a vehikula jako kontroly se přidají k buňkám ve třech paralelkách ke konečnému objemu 0,4 ml/prohlubeň DMEM neobsahujícího čerstvé sérum a inkubace probíhá dalších 24 hodin. Tyto fibroblasty kondicionované médium se buď ihned analyzuje nebo se rychle zmrazí kapalným dusíkem a uskladní se pri -70 °C k budoucí analýze. Buňky se pak počítají a výsledky tečkové hybrid i zace jsou vztaženy k počtu buněk.

Zkouška tečkovou hybrídizaci na dekorinový protein v médiu kondiciovaném dermálními fibroblasty

Vzorky kondiciovaného média dermálními fibroblasty, na které se působí vehikulem (jako kontrolou) nebo zkoumanou látkou se doplní 20 mM dithiothreitolem (ředění 200 mM zásobního roztoku 1; 10) a 0,1% dodecy(sulfátem (ředění 10% zásobního roztoku 1:100), důkladně se promíchá a 2 minuty se inkubuje pri teplotě 75 °C. Standardní vzorky pro zkoušku se připraví sériovým ředěním média kondiciovaného čistými fibroblasty naočkovanými v koncentraci 10000 buněk/cm² ve 175 cm² nádobě při zachování DMEM neobsahujícího sérum. Zkoumané vzorky se následně ve třech paralelkách aplikují na předem zvlhčený list přenosové membrány Immobilon— P za použití zařízení Bio-Dot s 96 prohlubněmi (firma Bio-Rad) postupem popsaným v manuálu výrobců. Do každé prohlubně se aplikovalo přibližně 200μΙ média. Médium se nechalo 30 minut filtrovat přes membránu působením gravitace, a následně se membrána dvakrát promyla 200 μΐ PBS. Tyto promývací poddíly PBS se nechaly dvakrát 15 minut filtrovat přes membránu za působení gravitace. Zařízení Bio-Dot se následně připojilo k vakuu a třetí a závěrečné promytí se provedlo za odsávání. Zařízení se rozmontuje, membrána se odstraní a rychle podle pokynů odřízne a umístí se přes noc do blokačního pufru pri teplotě 4 °C. Membrány připravené pro analýzu dekorinu se blokují směsí roztoků 3% hmotnostně/objemových BSA a 0,1% objemových Tween 20 v PBS. Následují den se na membrány 2 hodiny působí primárními protilátkami lidského dekorinu ředěnými 1:10 000 (králičí polyklonální protilátky, firma Biogenesis) při tepiotě místnosti. Membrány se promývají třikrát 5 minut směsí TBS a 0,05% roztoku Tween 20, a pak se 1 hodinu Ínkubují pri teplotě místnosti s F(ab')2 fragmenty (protikráličí, firma Amersham). Jednotlivé membrány Immobilonu se znovu třikrát 5 minut promývají směsí TBS a Tween 20, a následně se suší vzduchem pri teplotě místnosti. Po sušení se membrány zabalí do celofánu a na 16 až 18 hodin se umístí do permanentní fluorescenční desky („storage phosphor sereen“) firmy Molecular Dynamics. Exponovaná deska se odečítá na detekčním zařízení Phosphorimager (Molecular Dynamics Phosphorimager SF) za použití softwarového programu ImageQuant™. Intensita teček se stanoví z obrazu sestaveného digitálním přenosem do počítače za použití výpočtů softwarového programu ImageQuant , její hodnota je vztažena k počtu buněk a účinek rozdílných zkoumaných látek na syntézu dekorinu se zhodnotí vzhledem k hodnotě 100 arbitrárních jednotek daných kontrolní hodnotu vehikula.

Zkoušky

V tabulce 6 jsou uvedena jednotlivá zkoumaná činidla, u nichž se hodnotil jejich vliv na syntézu dekorinu v lidských dermálních fibroblastech ajejich použité množství. Za účelem normalizace výsledků jsou hodnoty účinku jednotlivých zkoumaných látek vztaženy na kontrolní hodnotu vehikula podle stupnice se 100 arbitrárními jednotkami.

Označení „CLA c9, tl I“ v tabulce znamená konjugovanou kyselinu linolovou (CLA), která z celkové CLA obsahuje 93 % hmotnostních izomerů c9, tl 1, který je účinnou látkou patřící k podstatě tohoto vynálezu. Výroba tohoto produktu je popsána v příkladě 1.

Označení „CLA tlO, cl2“ v tabulce znamená konjugovanou kyselinu linolovou (CLA), která z celkové CLA obsahuje 80,5 % hmotnostních izomerů tlO, cl2 s následující strukturou:

- 12CZ 302773 B6

Tento produkt není součástí podstaty tohoto vynálezu. Výroba tohoto produktu je popsána v příkladě 1.

„CLA směs“ znamená v tabulce směs c9, til izomerů a tlO, c!2 izomerů v poměru 1:1, která obsahuje vždy 47 % jednotlivého izomerů z celkové CLA. Tento produkt není součástí podstaty současného vynálezu ajeho výroba je popsána v příkladě 1.

io Produkty „CLA tlO, cl2“ a „CLA směs“ jsou uvedeny pro porovnání.

Zkoušky s kyselinou retinovou k vyhodnocení jejího účinku na syntézu dekorinu v lidských dermálních fíbroblastech jsou provedeny pro porovnání. Koncentrace jednotlivých činidel použité během zkoušek nemají vliv na životnost buněk.

Tabulka 6

Účinek jednotlivých zkoumaných sloučenin na syntézu dekorinu fibroblasty

Zkoumaná látka	Dekorin
kontrola (vehikulum)	100
CLA c9, t11 (10 μΜ)	151,6 ±22,4 (p=0,01, n=3)
CLA směs (10 μΜ)	81,5±4,3
CLA t10,c12 (10 μΜ)	99,3±24,8

Výsledky shrnuté v tabulce 6 dokazují, že konjugovaná kyselina li no lová (CLA) obohacená izomerem c9, til významně zvyšuje syntézu dekorinu v lidských fíbroblastech ve srovnání s kontrolou nebo s konjugovanou kyselinou tinolovou (CLA) obohacenou izomerem tlO, cl2 nebo s konjugovanou kyselinou linolovou (CLA).

Hladina dekorinu v kůži je spojena se zlepšením kvality a vzhledu kůže. Zvýšený obsah dekorinu v kůži je důležitým pro kontrolu a úpravu ukládání kolagenu v kůži a je spojen řadou kladných účinků na pokožku jako je vyhlazení vrásek a úprava kvality kožní tkáně poškozené slunečním světlem.

Srovnávací zkouška s kyselinou retinovou (l|im) prokázala zvýšení syntézy dekorinu 138±14,0 (p=0,035, n=4), a to vzhledem ke kontrolní hodnotě vehikula podle stupnice se 100 arbitrámími stupni. Z údajů překvapivě vyplývá, že míra regulace nahoru syntézy dekorinu v lidských fíbroblastech způsobená konjugovanou kyselinou linolovou (CLA) obohacenou izomerem c9, tl 1 překračuje účinek kyseliny ret i nové na úpravu kvality kožní tkáně.

- 13CZ 302773 B6

Příklad 4

Účinek zkoumaných produktů na keratinocytovou toxicitu dodecyl sul fátu sodného

Keratinocyty se pěstovaly na plotnách s 96 prohlubněmi do vytvoření 80% souvislé vrstvy buněk na růstovém médiu pro keratinocyty (KGM), které se následně na 24 až 48 hodin vymění za KGM bez hydrokortizonu. Na buňky se působí takovou koncentrací dodecy(sulfátu sodného (SDS), který vede k přibližně 50% životnosti buněk (5μΛπ1). K buňkám se aplikují zkoumané sloučeniny v koncentracích uvedených v tabulce 3. Zkoumané sloučeniny „c9 tl 1 CLA“ a „tlO cl 2 CLA“ uvedené v tabulce 7 jsou stejnými činidly jako popsaná činidla v příkladě 3. Kontrola neobsahuje žádnou zkoumanou sloučeninu. Po 24 hodinách inkubace se médium odstraní a životaschopnost se určí metodou s neutrální červení („Neutrál Red method“). Pri této metodě se buňky 3 hodiny inkubují v KGM obsahujícím 25 μ§/τη1 neutrální červeně, médium se následně odstraní a buňky se 30 minut extrahují 1 ml 1 % objemových kyseliny octové, 50 % objemových ethanolu. Po stanovení absorbance extraktu při 562 nm se životnost vyhodnotí vzhledem k referenční hodnotě prohlubní, které neobsahují ani SDS ani zkoumanou sloučeninu. Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 7.:

'Tabulka 7

Zkoumaná sloučenina (koncentrace)	% SDS kontroly (průměr)	směrodatná odchylka (sd)	počet(n)
SDS 5pg/ml kontrola	100,0	16,6	8
50μΜ CLA c9 t11 + SDS 5 pg/ml	134,8	27,2	8
50μΜ CLA t10 c12 + SDS 5 pg/ml	69,2	16,3	8

Výsledky jsou vyjádřeny jako % z hodnoty životnosti po aplikaci 5 μ^πιΙ SDS.

Výsledky shrnuté v tabulce 7 potvrzují, že konjugovaná kyselina línolová (CLA) obohacená izomerem c9, tl 1 významně zvyšuje životnost buněk ve srovnání s hodnotou 5 μg/ml SDS, což bylo potvrzeno jednocestnou analýzou variance (ANOVA) mnohonásobným srovnáním metodou Student-Neumann-Kuels, p < 0,05.

Konjugovaná kyselina línolová (CLA) obohacená izomerem tlO cl2 (sloučenina, která není součástí podstaty tohoto vynálezu) nezvyšuje vzhledem k SDS kontrole životnost buněk.

Z metodiky vyplývá, že keratinová toxicita dráždivého činidla závisí na jeho dráždivém účinku in vivo (J.N. Lawrence, S. Starkey, F. M. Díckson & D.J. Benford, Use of human and rat keratinocyte cultures to assess skin irritation potential, Toxicol. In Vitro 10, 331-340 (1996)).

Zjistili jsme, že působení konjugovanou kyselinou linolovou (CLA) obohacenou izomerem c9, tl 1 signifikantně snižuje toxické účinky SDS na keratinocyty a má tedy ochranné účinky proti dráždivýtn účinkům, zatímco konjugovaná kyselina línolová (CLA) obohacená izomerem 110 c 12 významně neovlivňuje toxické účinky SDS na tyto buňky a proto nemá žádoucí ochranný účinek.

- 14CZ 302773 B6

Příklad 5

Příklad popisuje schopnost zkoumaných sloučenin vyvolat diferenciaci keratinocytů. Diferenciace je důležitou součástí procesu, který vede k vytvoření plnohodnotného stratům corneum. Plno5 hodnotné stratům corneum je důležitou bariérou kůže, která má preventivní účinek před vznikem suché a drsné pokožky. Indikátorem diferenciace je tvorba zrohovatělého obalu (CE) a aktivita transglutammázového enzymu. Zrohovatělý obal je odpovědný za tvar, pevnost a strukturální integritu komeocytů ve stratům corneum. Aktivita transglutaminázy je bezpodmínečný pro správné vytvoření zrohovatělého obalu.

Zkouška diferenciace keratinocytů

Buněčná kultura:

Za použití odpovídající techniky se získá lidská epidermis oddělená zjuvenilní předkožky, která se dále pěstuje na růstovém médiu keratinocytů neobsahujícího sérum („KGM“, Clonetics). Ve všech zkouškách se použijí keratinocyty z třetí pasáže po přeočkování, které se naočkují na plotny (Costar) s 96 prohlubněmi v koncentraci 4000 buněk/prohlubeň. Keratinocyty rostou 3 dny pri teplotě 37 °C, a následně se na ně působí KGM obsahujícím 30μΜ vápníku Ca*.

Na buňky se 48 hodin působí buď zkoumanou sloučeninou nebo vehikulem (dimethylsulfoxid) a buňky se seberou. Zkoumané sloučeniny „c9 tl 1 CLA“ a „t 10 c 12 CLA“ uvedené v tabulce 8 jsou stejnými činidly jako popsaná činidla v příkladě 3.

Kvantifikace DNA:

Po působení zkoumanými látkami nebo kontrolou se buňky třikrát promyjí fyziologickým roztokem obsahujícím fosfátový pufr (PBS), a následně se extrahují 100μ1 roztoku Triton X-l00 v 50 mM Tris/HCI (pH 8,0) obsahující 20 μΜ pepstatinu a 20 μΜ leupeptinu (extrakční pufr DNA). Vzorek o objemu 15 μΐ tohoto extraktu se vyhodnocuje na obsah DNA za použití metody

Pico Green (Molecular Probes, 4849 Pichford Avenue, Eugene, Oregon, USA) podle manuálu výrobců.

Aktivita partikulované transglutaminázy (tgase)

Po působení extrakčním pufrem DNA se buňky rychle promyjí čerstvým pufrem, a pak se inkubují s kadaverinem Texas Red (Molecular Probes) jako fluorescenční substrátem transglutamináty. Na buňky se 16 hodin působí při teplotě 37 °C 15 μΜ kadaverinem Texas Red v 50 mM Tris/HCI (pH 8,0), 150 mM chloridu sodného obsahujícího 5 mM dithiothreitolu, 50 mM chloridu vápenatého, dvakrát se promyjí destilovanou vodou a fluorescence se měří za použití Cyto40 fluor Fluorimetru s exitací při 590 nm a emisí při 645 nm. Aktivita transglutaminázy se vyjádří jako fluorescenční jednotky / ng DNA.

Tvorba zrohovatělého obalu

Tvorba zrohovatělého obalu (CE) se zjistí kvantifikací nerozpustného proteinu v SDS zbývajícího v prohlubních ploten s 24 prohlubněmi s keratinocytovými kulturami. Po odstranění extrakčního Triton pufru (shora popsaného) se prohlubně promyjí karbonátovým pufrem (Sigma) o pH 9,6. Každá prohlubeň se následně inkubuje s N-hydroxysukcinimidem vázaným na biotin (zásobní roztok upravený na koncentraci 10 mg/ml v DMSO) v 0,1 mg/ml karbonátového pufru (200 μΙ/prohlubeň). Plotny se inkubují 60 minut se současnou agitací pri teplotě místnosti. Po přidání 50 μΙ/prohlubeň 10% SDS, lOOmM DTT se plotny inkubují dalších 60 minut pri teplotě °C. Obaly se filtrují (s promytím v TBS~Tween) přes PVDF membrány (předem blokované v TBS-0,5% Tween) za použití zařízení pro analýzu tečkovou hybridizací. Membrány se důkladně označí streptavidinem-HRP (Zymed) ředěným 1:1000, a to 60 minut při teplotě místnosti,

- 15CZ 302773 B6 promyjí se roztokem TBSTween a 2 minuty inkubují se s ECL substrátem (Pierce). Membrány se zabalí do „cling-filmu“ a exponují se RTG záření k vizualizaci proteinu. Intenzita záření jednotlivých bodů se kvantifikuje skenováním a Phoretixovou analýzou. Výsledky jsou shrnuté v následující tabulce 8. Výsledky jsou vyjádřeny jako procento kontrolní hodnoty pro každý měřený parametr.

Tabulka 8

Zkoumaná sloučenina (koncentrace)	Aktivita trans- glutaminázy (%kontroly)	sd I	n	tvorba zrohov. obalu (CE) (%kontroly)	sd	n
kontrola	100,0	15	6	100	30	6
1ΟμΜ “c9t11 CLA“	166*	20	6	515*	28	6
10μΜ „t10cl2CLA“	101	14	6	107	43	6

Výsledky shrnuté v tabulce 8 potvrzují, že konjugované kyselina línolová (CLA) obohacená izomerem c9, tl 1 (sloučenina, která patří do podstaty současného vynálezu) významně (p<0,01) zvyšuje aktivitu transglutaminázy a tvorbu zrohovatělého obalu (CE) ve srovnání s kontrolou (na kterou se pouze působí DMSO).

Konjugovaná kyselina línolová (CLA) obohacená izomerem tlO c 12 (sloučenina, která není součástí podstaty tohoto vynálezu) nezvyšuje vzhledem ke kontrole ani jeden sledovaný parametr diferenciace keratinocytu.

Z uvedeného vyplývá, že působení konjugovanou kyselinou linolovou (CLA) obohacenou izomerem c9, tl 1 signifikantně zvyšuje diferenciaci keratinocytů in vitro a má tedy účinek na podporu diferenciace, zatímco konjugovaná kyselina línolová (CLA) obohacená izomerem tlO cl2 signifikantně neovlivňuje průběh diferenciace keratinocytů a nepodporuje ji.

Konjugovaná kyselina linolová (CLA) obohacená izomerem c9, tli je vhodná pro prevenci vytváření suché a drsné pokožky, a dále k vyhlazení a hydrataci pokožky jíž suché a drsné.

Příklad 6

Následně uvedený prostředek je krémem typu olej ve vodě, který obsahuje sloučeninu, která je zahrnutá do podstaty tohoto vynálezu. Uvedená procenta jsou procenta hmotnostní prostředku, pokud není uvedeno jinak.

- 16 CZ 302773 B6

	% hmotnostní
minerální olej	4
CI_A triglycerid (93 % hmotnostních c9,t11 izomer z celkového množství zbytků CLA) připravený podle přikladu 2	1,15
Brlj 56*	4
Alfol 16RD*	4
Triethanolamin	0,75
Butan-1,3-diol	3
xanthanová guma	0,3
parfém	qs
butylovaný hydroxytoluen	0,01
voda	do 100

*Brij 56 je cetylalkohol POE(IO)

Alťol 16RD je cetylalkohol

Příklad 7 io Následně uvedený prostředek je krémem typu voda v oleji, který obsahuje sloučeninu, která je zahrnutá do podstaty tohoto vynálezu. Uvedená procenta jsou procenta hmotnostní prostředku, pokud není uvedeno jinak.

	%hmotnostni
úplně hydrogenovaný kokosový olej	9,9
CLA triglycerid (93 % hmotnostních c9,t11 izomer z celkového množství zbytků CLA) připravený podle přikladu 2	2
Brij 92*	5
Bontone 38	0,5
MgSO₄ 7H₂	0,5
Butylovaný hydroxytoluen	0,01
Parfém	qs
Voda	do 100 í I

*Brij 92 je polyoxyethylen(2)-oleylether

- 17CZ 302773 B6

Oba kosmetické prostředky pro lokální podání popsané v příkladech 6 a 7 mají doložený kosmetický účinek zlepšující vzhled vrásčité, stárnoucí, slunečním zářením poškozené a/nebo podrážděné pokožky. Má preventivní účinek nebo způsobuje výrazné opoždění nástupu projevů stárnutí pokožky a jiných nežádoucích změn. Prostředek lze vyrobit podle obecně platných a v oboru známých postupů.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Topický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje:

b) jednu nebo více kosmetických přísad zvolených ze souboru sestávajícího z parfémů, antioxidantů, matovacích činidel, konzervačních látek, barvicích látek a pufrů a

c) dermatologicky vhodný nosič.

2. Topický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje od 0,00001 % do 50 %, přednostně od 0,01 % do 10 % hmotnostních, vztaženo na prostředek, konjugované kyseliny linolové a/nebo jejích derivátů definovaných v nároku 1.

3. Topický prostředek podle nároku 1 nebo 2 pro použití pro topické léčení a/nebo prevenci poškození kůže zvoleného ze skupiny sestávající z vrásčité kůže, ochablé kůže, kůže poškozené světelným zářením, suché kůže, drsné kůže, šupinaté kůže, podrážděné kůže, svědící kůže, citlivé kůže a/nebo pigmentových skvrn na stařecké kůži.

4. Použití konjugované kyseliny linolové a/nebo jejích derivátů obsahujících zbytky konjugované kyseliny linolové, kde nejméně 50 % hmotnostních konjugované kyseliny linolové a/nebo jejích zbytků je přítomno jako cis 9, trans 11 izomer, pro výrobu topického prostředku pro léčení a/nebo prevenci poškození kůže zvoleného ze skupiny sestávající z vrásčité kůže, ochablé kůže, kůže poškozené světelným zářením, suché kůže, drsné kůže, šupinaté kůže, podrážděné kůže, svědící kůže, citlivé kůže a/nebo pigmentových skvrn na stařecké kůži.