ES2350900T5 - Composición para el cuidado de la piel que contiene ácido cis-9, trans-11-linoleico - Google Patents

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

E99963409

19-12-2014

DESCRIPCIÓN

Composición para el cuidado de la piel que contiene ácido cis-9, trans-11-linoleico

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a composiciones tópicas para su aplicación a la piel humana y a su uso para mejorar el estado y el aspecto de la piel.

Antecedentes y técnica anterior

La piel está sometida a deterioro por trastornos dermatológicos, abuso medioambiental (viento, aire acondicionado, calefacción central) o por el proceso de envejecimiento normal (cronoenvejecimiento) que se puede acelerar por exposición de la piel al sol (fotoenvejecimiento). En los últimos años la demanda de composiciones cosméticas y procedimientos cosméticos para mejorar el aspecto y el estado de la piel ha crecido enormemente.

Los consumidores cada vez buscan más productos cosméticos “antienvejecimiento” que traten o retrasen los signos visibles del cronoenvejecimiento y el fotoenvejecimiento de la piel, como arrugas, líneas, pérdida de firmeza, hiperpigmentación y manchas debidas a la edad.

Los consumidores también buscan con frecuencia otros beneficios de los productos cosméticos además del antienvejecimiento. El concepto de “piel sensible” ha aumentado también la demanda del consumidor de productos cosméticos que mejoren el aspecto y el estado de la piel sensible, seca, áspera y/o escamosa y para aliviar la piel roja, irritada y/o pruriginosa. Los consumidores también desean productos cosméticos que traten las manchas, granos, imperfecciones, etc.

Las composiciones cosméticas para el cuidado de la piel y dermatológicas para mejorar el estado y el aspecto de la piel que comprenden ésteres de triglicéridos de cadena larga de ácidos grasos esenciales poliinsaturados, los ácidos libres y sus sales de álcali o amonio son conocidas en la técnica. Por ejemplo, la patente británica GB 2.181.349A describe entre otras cosas una composición compuesta por triglicéridos de ácido linoleico para mejorar la suavidad y elasticidad de la piel. Un producto comercial, “Linola Fett n” ex Dr. August Wolff Gmbh, está disponible para el tratamiento de enfermedades de la piel seca y dermatosis, que contiene entre otras cosas una mezcla de los isómeros 9,11 de ácido linoleico conjugado.

Se describen más preparaciones cosméticas que comprenden isómeros de ácidos linoleicos conjugados en la patente internacional WO 99/26588 (documento publicado posteriormente), la patente internacional WO 98/17269 y la patente de EE.UU. 4.393.043.

Continúan necesitándose sin embargo composiciones cosméticas eficaces alternativas para aplicación tópica a la piel para tratar/retrasar los signos visibles del envejecimiento y piel fotodañada tales como arrugas, líneas, pérdida de firmeza, hiperpigmentación y manchas debidas a la edad. Se desean en particular composiciones y procedimientos cosméticos que proporcionen otros beneficios para el cuidado de la piel además de antienvejecimiento tal como mejorar el aspecto y el estado de la piel seca, áspera y/o escamosa y aliviar la piel irritada y pruriginosa.

Los inventores han encontrado ahora sorprendentemente que el tratamiento y la prevención eficaz de lo estados de la piel normales debidos a cronoenvejecimiento o fotoenvejecimento, tales como arrugas, líneas, pérdida de firmeza, hiperpigmentación y manchas debidas a la edad y/o de piel sensible, seca, áspera, escamosa, roja, pruriginosa, irritada, se pueden obtener por la aplicación de composiciones cosméticas a la piel que se enriquecen específicamente en un isómero particular de ácido linoleico conjugado o derivados del mismo.

Sumario de la invención

De acuerdo con un primer aspecto la presente invención proporciona un procedimiento cosmético de tratamiento y/o prevención de afecciones de la piel, seleccionadas del grupo que consiste en arrugas, pérdida de firmeza, y manchas debidas a la edad, comprendiendo el procedimiento aplicar a la piel una composición tópica que comprende:

(a)

ácido linoleico conjugado y/o derivados del mismo que comprenden restos de ácido linoleico, en que al menos el 50% en peso del ácido linoleico conjugado y los restos está presente como isómero cis-9 trans-11;

(b)

uno o más adyuvantes cosméticos seleccionados de un perfume, un antioxidante, un opacificante, un conservante, un colorante o un tampón y

(c)

un vehículo dermatológicamente aceptable.

En un aspecto más, la invención también proporciona una composición tópica como se describió anteriormente para su uso como medicamento en el tratamiento y/o la prevención de piel fotodañada.

10

15

20

25

30

35

40

45

E99963409

19-12-2014

Las composiciones y procedimientos inventivos proporcionan así beneficios antienvejecimiento que dan como resultado la activación de piel suave y flexible con elasticidad mejorada y un aspecto reducido o retrasado de las arrugas y la piel envejecida con color de la piel mejorado. Se consigue una mejora general en el aspecto, textura y estado, en particular con respecto al aspecto radiante, la claridad y aspecto joven general de la piel. Así los procedimientos y composiciones inventivos proporcionan ventajosamente un amplio intervalo de beneficios para el cuidado de la piel.

El término “tratar” como se usa en la presente memoria incluye dentro de su ámbito reducir, retrasar y/o prevenir los estados de la piel ya mencionados tales como piel arrugada, envejecida, fotodañada, y mejorar su aspecto y textura mediante la prevención o reducción de las arrugas y aumentar la flexibilidad, firmeza, suavidad, flexibilidad y elasticidad de la piel. Las composiciones cosméticas, los procedimientos y los usos del ácido linoleico conjugado según la invención pueden ser útiles para tratar la piel que ya está en un estado arrugado, envejecido, fotodañado, o para tratar la piel joven para prevenir o reducir los cambios por deterioro mencionados debido al proceso de envejecimiento normal/fotoenvejecimiento.

Descripción detallada de la invención

Ácido linoleico conjugado enriquecido con isómero cis-9, trans-11

El ácido linoleico conjugado (de ahora en adelante referido como CLA) comprende un grupo de isómeros de posición y geométricos del ácido linoleico en que son posibles diversas configuraciones de dobles enlaces cis y trans en las posiciones (6, 8), (7, 9), (8, 10), (9, 11), (10, 12) u (11, 13). Así existen veinticuatro isómeros diferentes de CLA.

El principio activo esencial de las composiciones según la presente invención es el isómero cis-9, trans-11 (de ahora en adelante referido como c9, t11). Este isómero particular del ácido libre presenta la estructura (I) mostrada a continuación:

imagen1

La invención también incluye derivados del ácido libre que comprenden así restos de ácido linoleico conjugado. Los derivados preferibles incluyen los derivados de la sustitución del grupo carboxilo del ácido, tal como ésteres (por ejemplo, retinol ésteres de retinilo, ésteres de triglicéridos, ésteres de monoglicéridos, ésteres de diglicéridos, fosfoésteres), amidas, (por ejemplo, derivados de ceramida), sales (por ejemplo, sales de metal alcalino y de metal alcalino-térreo, sales de amonio) y/o los derivados de la sustitución de la cadena carbonada C18, tal como derivados alfahidroxi y/o betahidroxi.

En el caso de derivados de ésteres de triglicéridos, están incluidos todos los isómeros de posición de sustituyentes de CLA en la cadena carbonada de glicerol. Los triglicéridos deben contener al menos un resto de CLA. Por ejemplo, de las tres posiciones esterificables en la cadena carbonada de glicerol, las posiciones 1 y 2 pueden ser esterificadas con CLA y por otro lípido en la posición 3 o como alternativa, la cadena carbonada de glicerol podía ser esterificada por CLA en las posiciones 1 y 3 con otro lípido en la posición 2.

Siempre que se use la expresión “ácido linoleico conjugado” o “CLA” en esta memoria descriptiva se tiene que entender que también están incluidos los derivados del mismo que comprenden restos CLA. “Restos de CLA” se refiere a la porción o las porciones acílicas grasas de CLA de un derivado de CLA.

Por “CLA enriquecido con isómero c9 t11” se quiere decir que al menos el 50% en peso de los restos de CLA totales (y/o CLA) presentes en la composición está en la forma del isómero 9-cis, 11-trans. De preferencia, al menos el 70%, lo más de preferencia al menos el 90% en peso del CLA total y/o restos de CLA presentes en la composición, está en forma del isómero c9, t11.

El CLA y/o los derivados del mismo que comprenden restos de CLA según la presente invención (en que al menos el 50% en peso del CLA total y/o de los restos de CLA presentes en la composición está en la forma del isómero 9-cis, 11-trans) se puede preparar según el procedimiento descrito en la patente internacional WO 97/18320. Un procedimiento preferido de preparación se describe en el Ejemplo 1 a continuación.

El principio activo, CLA enriquecido con isómero c9-t11, que se tiene que emplear según la presente invención está presente en la composición tópica en una cantidad eficaz. Normalmente la cantidad total del principio activo está presente en una cantidad entre 0,00001% y 50% en peso de la composición. Más de preferencia la cantidad es de 0,01% a 10% y lo más de preferencia de 0,1% a 5% para maximizar los beneficios a un coste mínimo.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

E99963409

19-12-2014

Vehículo dermatológicamente aceptable

La composición según la invención también comprende un vehículo dermatológicamente/cosméticamente aceptable para actuar como diluyente, dispersante o vehículo para el principio activo, CLA enriquecido en isómero c9, t11. El vehículo puede comprender materiales empleados comúnmente en productos para el cuidado de la piel tales como agua, emolientes líquidos o sólidos, aceites de silicona, emulsionantes, disolventes, humectantes, espesantes, polvos, propelentes y similares.

El vehículo formará normalmente de 5% a 99,9%, de preferencia de 25% a 80% en peso de la composición y puede formar, en ausencia de otros adyuvantes cosméticos, el equilibrio de la composición.

Materiales para beneficio de la piel opcionales y adyuvantes cosméticos

Además del principio activo, CLA enriquecido en isómero c9, t11 también se pueden incluir otros principios activos beneficiosos para la piel, específicos, tales como filtros solares, agentes iluminadores de la piel, agentes bronceadores de la piel. La composición incluye adyuvantes seleccionados de perfumes, antioxidantes, opacificantes, conservantes, colorantes y tampones.

Preparación de producto, forma, uso y envasado

Para preparar la composición tópica según la presente invención se puede emplear la manera usual para preparar productos para el cuidado de la piel. Los componentes activos se incorporan en general en un vehículo dermatológicamente aceptable de manera convencional. Los componentes activos se pueden disolver primero adecuadamente o dispersar en una porción del agua u otro disolvente o liquido que se incorpore a la composición. Las composiciones preferidas son emulsiones de aceite en agua o agua en aceite.

La composición puede estar en forma de productos para el cuidado de la piel convencionales tales como una crema, gel o loción o similar. La composición también puede estar en forma de un producto denominado “de aclarado” por ejemplo un gel de baño o ducha, conteniendo posiblemente un sistema de distribución para que los ingredientes activos fomenten la adherencia a la piel durante el enjuague. Lo más de preferencia el producto es un producto “para no retirarlo”; un producto que se tiene que aplicar a la piel sin una etapa de enjuague deliberada inmediatamente después de su aplicación a la piel.

La composición se puede envasar de cualquier manera adecuada tal como en una jarra, un bote, tubo, roll-ball o similar, de la manera convencional.

El procedimiento de la presente invención se puede realizar una o más veces al día en la piel que requiere tratamiento. La mejora en el aspecto de la piel llegará a estar visible normalmente después de 3 a 6 meses, dependiendo del estado de la piel, la concentración de los componentes activos usados en el procedimiento inventivo, la cantidad de composición usada y la frecuencia con que se aplique. En general, se aplica a la piel una pequeña cantidad de la composición, por ejemplo de 0,1 a 5 ml, desde un envase o aplicador adecuado y se extiende y/o se frota en la piel usando las manos o los dedos o un dispositivo adecuado. Una etapa de enjuague puede ira continuación opcionalmente dependiendo de si la composición se formula como producto “que no se retira” o “no se retira enjuagando”.

Para que se pueda entender más fácilmente la presente invención, se dan los siguientes ejemplos sólo como ilustración.

Ejemplos

Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra la síntesis de CLA que comprende (1) una mezcla de isómero c9, t11 e isómero t10, c12 en una relación 1:1; (2) 93% de isómero c9 t11 en peso de restos de CLA totales, un compuesto incluido en las composiciones inventivas y (3) 80,5% de isómero t10, c12 en peso de restos de CLA totales, un compuesto fuera del ámbito de la presente invención.

Se preparan isómeros de CLA mezclados por tratamiento con álcali a alta temperatura de aceite de cártamo, generando CLA con cantidades iguales de los isómeros c9, t11 y t10, c12. Se separa de la mezcla CLA enriquecido en el CLA c9, t11 por esterificación selectiva con alcohol laurílico usando Geotrichum Candidum como catalizador. El CLA c9 t11 enriquecido se hidroliza y se convierte en el triglicérido. Después de la etapa de esterificación y separación los ácidos libres de CLA restantes se enriquecen en CLA t10, c12.

1. Producción de Isómeros Mixtos de CLA

Se disolvió hidróxido de sodio “Reactivo Analar” (RA) (0,6 kg) en 6 kg de propilenglicol de grado farmacéutico por mezclamiento y calentamiento a 80-85ºC. Se enfrió la mezcla y se añadieron 2 kg de aceite de cártamo. Usando equipo de escala piloto estándar se calentó la mezcla para hacerla hervir a reflujo durante 3 horas con agitación rápida a 170ºC. Se enfrió la mezcla de reacción a aproximadamente 95ºC, se redujo el agitador a una velocidad

10

15

20

25

30

E99963409

19-12-2014

intermedia y se neutralizó la mezcla usando 1,280 litros de ácido clorhídrico al 35,5% disueltos en agua desmineralizada (8 litros), manteniendo la temperatura a aproximadamente 90ºC. Se dejó que la mezcla de reacción sedimentara y se retiró la fase acuosa. Se lavó la fase oleosa con 2 x 1 litro de disolución de sal de RA al 5% y por 2x1 litro de agua desmineralizada a 90ºC, desechándose el material jabonoso. Se secó el aceite enriquecido en CLA a 100ºC a vacío antes de drenado a aproximadamente 50ºC y se filtró por un sistema buchner que contenía un filtro Whatman y una capa delgada de adyuvante de filtración celite-hyflo. Se almacenó el aceite de CLA de isómeros mezclados en nitrógeno a –25ºC hasta que se requirió. La composición del aceite producido por este procedimiento se explica en la tabla 1 dada a continuación:

TABLA 1

Composición de ácidos grasos de CLA mezclados (% en peso):

Porcentaje relativo de lípidos de ácidos grasos totales

c9, t11

34,1 (47% de CLA total)

t10, c12

34,1 (47% de CLA total)

c9, c11 y c10, c12

2,3

t9, t11t y t10, 12t

0,7

Otro CLA

1,4

CLA Total

72,6

16:0

7,0

16:1

0,8

18:0

2,5

18:1

13,3

18:2 (no CLA)

3,3

Otro ácido graso

0,5

2. Producción de CLA enriquecido en isómero c9 t11

(I) Preparación de ésteres laurílicos:

Se añadió CLA preparado a partir de cártamo (2,0 kg) a 2 x equivalentes molares de alcohol laurílico (1-dodecanol; 98% de productos químicos ex Aldrich) junto con 5,96 kg de agua desmineralizada. Se ajustó la temperatura a 25ºC y se añadió 1% (p/p) de Geotrichum Candidum (ex Amano Pharmaceuticals, Japón) premezclado con un poco de agua y se mezcló vigorosamente. Se detuvo la reacción a las 44 horas. Se calentó el recipiente a 80-90ºC, se drenó la capa acuosa y se lavó el aceite con agua desmineralizada y se secó a 100ºC a vacío durante 30 minutos. Se enfrió el aceite a 50ºC y se filtró por un sistema buchner que contenía un filtro Whatman y una capa delgada de adyuvante de filtración celite-hyflo.

(II) Separación de los ésteres enriquecidos en CLA c9, t11:

Se retiró el alcohol laurílico residual a 130ºC a 25-35 ml por minuto por destilación molecular. El residuo se separó de manera tosca en los ésteres laurílicos (enriquecidos en CLA c9, t11) y ácidos libres (enriquecidos en CLA t10, c12) por evaporación a 158ºC a un caudal de 25-35 ml por minuto. Se redujeron los ácidos libres restantes en el resto de éster laurílico mediante una destilación adicional a 171ºC a un caudal de 30-40 ml por minuto. Se neutralizaron a 90ºC 2.790 g de residuo de éster laurílico, usando 330 ml de hidróxido de sodio RA 4 M, seguido de separación del aceite del a fase acuosa, lavados x 3 del aceite en agua caliente desmineralizada, un lavado con álcali 0,1 M adicional y dos lavados con agua caliente. Se secó la muestra de aceite de éster laurílico enriquecido como antes.

(III) Saponificación de los ésteres laurílicos enriquecidos en CLA c9, t11:

Los ésteres laurílicos de CLA enriquecido en c9, t11 se saponificaron usando hidróxido de sodio RA/etanol de grado alimentario al 96% y se volvió a acidificar usando ácido clorhídrico concentrado RA. La mezcla de reacción que contiene los ácidos grasos libres enriquecidos en CLA se secó a 100ºC y se filtró como antes a aproximadamente 50ºC. Se separó por evaporación el alcohol laurílico a 132ºC a 25-30 ml por minuto. Para retirar el alcohol laurílico

E99963409

19-12-2014

residual, se esterificaron los alcoholes libres a los ácidos grasos presentes en la mezcla de reacción, usando lipasa de Mucor miehei SP392 (5%, lote lux 0110 ex Novo Nordisk). Los ácidos grasos que contienen CLA enriquecido en C9 t 11 se separaron de los ésteres laurílicos usando destilación molecular a vacío a 155ºC a 15-20 ml por minuto.

La composición del CLA enriquecido en C9 t11 por el procedimiento anterior se explica en la tabla 2 a continuación:

TABLA 2

Composición de la preparación típica de ácidos grasos enriquecidos en CLA c9, t11 (% en peso):

Porcentaje relativo de lípidos de ácidos grasos totales

c9, t11

66,1 (93% de CLA total)

t10, c12

4,1

c9, c11 y c10, c12

0,3

t9, t11t y t10, 12t

0,4

Otro CLA

0,2

CLA Total

71,1

16:0

1,6

16:1

-

18:0

0,4

18:1

22,3

18:2 (no CLA)

4,5

Otro ácido graso

0,1

3. Aislamiento del CLA enriquecido en isómero t10, c12

Los ácidos libres de CLA de la etapa (II) anterior se destilaron de nuevo a 160-165ºC y 20-30 ml/min para reducir el contenido en éster. Se redujo el alcohol laurílico residual además mediante una destilación a 131ºC y 25-30 ml/min

10 de caudal. Se redujo todo el alcohol laurílico restante por esterificación de nuevo como se describió en la etapa (III) anterior para los isómeros c9, t11, usando lipasa de Mucor miehei SP392. Se retiraron todos los ésteres laurílicos formados por destilación como se describió para el isómero c9, t11, generando el CLA enriquecido en t10, c12, cuya composición se explica en la tabla 3 a continuación:

TABLA 3

Composición de la preparación típica de ácidos grasos enriquecidos en CLA t10, c12 (% en peso):

Porcentaje relativo de lípidos de ácidos grasos totales

c9, t11

8,3

t10, c12

53,9 (80,5% de CLA total)

c9, c11 y c10, c12

2,9

t9, t11t y t10, 12t

1,1

Otro CLA

0,7

CLA Total

66,9

16:0

13,6

16:1

-

18:0

4,6

E99963409

19-12-2014

18:1

10,3

18:2 (no CLA)

3,1

Otro ácido graso

1,5

Ejemplo 2

Preparación de triglicéridos de CLA c9, t11:

Se mezcló CLA enriquecido en c9, t11 (55 g) preparado según ejemplo 1 con 5, 55 g (10,1%) de glicerol (Pricerine

5 9083 glicerina CP de Ellis y Everards) y se añadieron 3 g (aproximadamente 5%) de lipasa no especifica de Mucor Meihie SP392 (Mucor Meihie Ex Novo Nordisk Lote Lux 0110). Los materiales mezclados se agitaron a vacío en un evaporador rotatorio a 60ºC con una ligera purga de nitrógeno.

Después de 24 horas, se redujo el nivel de ácido graso libre a 12,7% y se añadieron otros 0,15 g de glicerol. Después de 48 horas, se redujo el nivel de ácido graso libre a 3,4% y se detuvo la reacción por filtración de la

10 mezcla por una capa delgada de adyuvante de filtración de celite super-cel en un filtro buchner que recoge la fase oleosa de triglicéridos de CLA, cuya composición se explica en la tabla 4 a continuación:

TABLA 4

Composición de ácidos grasos de los triglicéridos

Porcentaje relativo de lípidos de ácidos grasos totales

c9, t11

64,9 (93% de CLA)

t10, c12

3,9

c9, c11 y c10, c12

0,4

t9, t11t y t10, 12t

0,6

Otro CLA

-

CLA Total

69,8

16:0

1,7

16:1

0,9

18:0

0,5

18:1

22,4

18:2 (no CLA)

4,5

Otro ácido graso

0,2

Ejemplo 3

15 Este ejemplo demuestra los beneficios antienvejecimiento de un CLA enriquecido en isómero c9 t11

Identificación de regulación por aumento de procolágeno I y decorina en la piel in vivo después del tratamiento con ácido retinoico tópico con fines comparativos

El colágeno, la proteína de la piel de matriz predominante es conocida por impartir resistencia a la tracción a la piel. La decorina es un proteoglucano que se sabe que es importante para la deposición controlada y correcta del 20 colágeno en la matriz extracelular de la piel. También se conoce en la técnica que los niveles de colágeno y decorina en la piel se reducen significativamente con la piel envejecida y/o fotodañada. Muchos estudios han demostrado que los niveles de colágeno de tipo I en la piel disminuye con la edad y/o con el fotodaño aumentado, (por ejemplo, Lavker, R. J. Inv. Derm., (1.979), 73, 79-66; Griffiths et al. N. Eng. J. Med. (1.993) 329, 530-535). En el caso de la decorina, se ha demostrado que la expresión del ARNm y la expresión del proteoglucano se reduce enormemente

25 en la piel fotodañada in vitro (Bernstein et al. Lab. Invest. (1.995) 72, 662-669): La reducción de los niveles de estas proteínas en la piel está de acuerdo con esto asociada a una disminución en la resistencia a l atracción de la piel que causa arrugas y laxitud.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E99963409

19-12-2014

Se sabe en la técnica que el ácido retinoico es un potente principio activo antienvejecimiento e induce la reparación dérmica de la piel fotodañada. Se ha demostrado que la desaparición de las arrugas y la reparación dérmica después de tratamiento tópico de la piel con ácido retinoico surge por una nueva deposición de colágeno y síntesis en la piel (por ejemplo, Griffiths et al. N. Eng. J. med. (1.993) 329, 530-535). Se acepta extensamente que el fortalecimiento de la matriz dérmica por reforzamiento del nivel de colágeno en la piel usando ácido retinoico proporciona beneficios de antienvejecimiento/reparación dérmica. El procolágeno I es un precursor de colágeno. La producción aumentada de procolágeno I como respuesta a una aplicación del compuesto de ensayo es un marcador de un nivel de colágeno aumentado.

Se reclutaron dos grupos de mujeres con grados idénticos o casi idénticos de fotodaño de leve a moderado en cada uno de los antebrazos externos. Se les suministró ácido retinoico al 0,05% en una base hidratante (Retinova) y también con una crema hidratante ajustada de color igualado con características sensoriales similares (loción Dermacare) pero sin ingredientes activos como control de placebo. A cada participante de los dos grupos se aplicó Retinova a un antebrazo externo y placebo (Dermacare) al otro antebrazo externo. El Grupo 1 se aplicó los productos diariamente en los antebrazos externos durante 14 semanas y el Grupo 2 se aplicó los productos a sus antebrazos externos durante 28 semanas. Al final de los estudios se tomaron dos biopsias en sacabocados de espesores completos de 4 mm de las áreas tratadas de cada antebrazo. El análisis inmunohistoquímico del tejido de la biopsia tomado de los participantes se realizó para identificar el efecto del tratamiento con ácido retinoico sobre la expresión de los componentes decorina y procolágeno-I de la matriz extracelular de la piel cuando se compara con los antebrazos tratados con placebo. Se siguió el siguiente procedimiento:

Materiales

El tampón de dilución de anticuerpo para secciones de cera estaba compuesto por Disolución Salina Tamponada con Tris (TBS), albúmina de suero bovino al 3% (BSA), Tritón X-100 al 0,05% y azida de sodio al 0,05%. Se obtuvieron anticuerpos primarios para procolágeno-I (con terminaciones amino) de Chemicon International Inc. (cat MAB 1912, IgG1 de rata) y se usaron en secciones de cera a una dilución de 1:800, durante la noche a 4ºC después de que la sección se hubiese tratado previamente con tripsina (0,5 mg/ml, 25 minutos, 37ºC). Los anticuerpos primarios para decorina se obtuvieron en Biogénesis (policlonal de conejo) y se usaron en secciones de cera a una dilución de 1:800, durante la noche a 4ºC. Se obtuvieron anticuerpos secundarios biotinilados antirata de DAKO (cat E0468, policlonal de conejo) se aplicó a secciones de cera a una dilución de 1:400. Se obtuvieron anticuerpos secundarios biotinilados anticonejo de Amersham (cat RPN 1004, policlonal de asno) se aplicó a secciones de cera a una dilución de 1:400. Se obtuvo fosfatasa alcalina conjugada de estreptavidina de Zymed (cat 43-4322) y se usó en una concentración de 1:2.500. Se obtuvo cromógeno Rojo Rápido de DAKO (cat K597). Se obtuvo contratinción nuclear con Hematoxilina Gills 3 de Sigma (cat GHS-3), se filtró y se usó sin dilución. Se obtuvo tripsina de Sigma (cat T-7186) y se montaron extensiones con Glycergel de DAKO (cat C563).

Procedimientos

Se montaron secciones de cera del tejido de biopsia sobre extensiones recubiertas de silano y se cocieron durante 18 horas a 55ºC. Las extensiones se desparafinaron por xileno y alcohol y se pusieron en agua y después se transfirieron a TBS. Se usó bolígrafo DAKO para marcar con un círculo las secciones. Las secciones se trataron para la recuperación de antÍgeno usando tripsina en el caso de que fuera necesario, como se indicó para cada anticuerpo. Cuando fue necesaria la recuperación de antígeno, se incubaron las extensiones durante 25 minutos a 35ºC con tripsina a 0,5 mg/ml (Sigma Cat T-7186). La proteasa se separó por enjuague con posterioridad (2 x 2 minutos) con TBS. A continuación de la recuperación de antÍgeno, si era necesario o directamente de otro modo después de marcar con un círculo las secciones, se bloqueó la unión de anticuerpo no específico con disoluciones al 5% de suero de huésped de anticuerpo secundario en TBS/BSA al 0,5%/azida de sodio al 0,1% como la disolución de bloqueo durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente en una cámara húmeda. La disolución de bloqueo en exceso se separó por drenado, pero no se permitió que se secaran las secciones. Después se incubaron las secciones con el anticuerpo primario (apropiadamente diluido como se indicó anteriormente) en una cámara húmeda durante la noche a 4ºC. El anticuerpo se drenó con posterioridad de las secciones, sin permitir que se secaran. Después se lavaron las extensiones con TBS para retirar anticuerpo primario no unido -un enjuague de un minuto seguido por tres lavados de cinco minutos -y después se incubaron con el anticuerpo secundario apropiado (diluido de manera apropiada como se indicó anteriormente) en una cámara húmeda durante 1 hora a temperatura ambiente. La disolución de anticuerpo se drenó con posterioridad de las extensiones sin permitir que se secara la sección. Se lavaron las extensiones en TBS, un enjuague de un minuto seguido por 4 x lavados de 5 min., para retirar el anticuerpo secundario no unido. Para el anticuerpo secundario biotinilado, las secciones se incubaron con posterioridad con conjugado de estreptavidina durante 45 minutos a 37ºC y después se lavaron en TBS para retirar el conjugado de estreptavidina no unido. Se añadió el cromógeno y se desarrolló el color con observación para evitar hipertinción. Después se contratiñeron las secciones y se montaron.

Las diferencias en la expresión de procolágeno-I y decorina entre los sitios tratados con ácido retinoico (Retinova) y placebo (Dermacare) se determinaron por valoración visual de las secciones teñidas inmunohistoquímicamente usando microscopia óptica.

Este análisis identificó la regulación hacia arriba marcada de tanto procolágeno-I como decorina en la piel

5

10

15

20

25

30

35

40

45

E99963409

19-12-2014

fotodañada después de aplicación tópica de ácido retinoico (Retinova), como se dispone en la Tabla 5 dada a continuación.

TABLA 5

Efecto del tratamiento con ácido retinoico en la expresión de procolágeno I y decorina en la piel In Vivo

Nº Total de Participantes

Nº de Participantes que muestra un aumento notable en la expresión de procolágeno-I Nº de Participantes que muestra un aumento notable en la expresión de decorina

Grupo 1 después de 14 semanas

16 9 10

Grupo 2 después de 28 semanas

15 10 15

Los componentes de la matriz extracelular de procolágeno I y decorina son así marcadores claramente identificables de reparación dérmica inducida por ácido retinoico.

Procedimiento para medir la síntesis de decorina en fibroblastos dérmicos humanos

Preparación de Medio de Acondicionamiento de Fibroblastos Dérmicos

Se recogieron fibroblastos de prepucio humano primarios en el pase 2 (P2) en placas de 12 pozos a 10.000 células/cm2 y se mantuvieron durante 24 horas en una atmósfera de dióxido de carbono al 5% y oxígeno al 4% en Medio Eagles Modificado (DMEM) Dulbeccos enriquecidos con suero fetal bovino al 10%. Después de esta vez se lavaron las células con DMEM sin suero y después se incubaron en DMEM sin suero fresco durante otras 60 horas. Las monocapas de fibroblastos se lavaron después de nuevo con DMEM sin suero. Los reactivos de ensayo y controles de vehículo se añadieron a las células por triplicado en un volumen final de 0,4 ml/pozo de DMEM sin suero fresco y se incubaron durante otras 24 horas. Este medio acondicionado de fibroblastos o se analizó inmediatamente o se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó –70ºC para análisis futuro. Después se contaron las células y los datos del análisis dot-blot estandarizado con posterioridad para el número de células.

Ensayo de transferencia puntual para proteína decorina en medio de acondicionamiento de fibroblastos dérmicos

Se enriquecieron muestras de medio acondicionado de fibroblastos dérmicos tratados con vehículo (como control) o reactivos de ensayo, con ditiotreitol 20 mM (dilución 1:10 de disolución patrón 200 mM) y dodecilsulfato de sodio al 0,1% (dilución 1:100 de disolución patrón al 10%), se mezcló bien y después se incubó a 75ºC durante 2 minutos. Se generó un patrón para el ensayo por dilución en serie de medio de acondicionamiento de fibroblastos netos de los fibroblastos recogidos a 10.000 células/cm2 en un matraz de 175 cm2 y se mantuvo en DMEM sin suero como se describió anteriormente. Se aplicaron con posterioridad muestras de ensayo por triplicado a una lámina prehumedecida de membrana de transferencia Immobilon-P usando el Aparato Bio-Dot de 96 pozos de Bio-Rad como se describe en las directrices de los fabricantes. Se aplicaron aproximadamente 200 l de medio por pozo. Se dejó que el medio se filtrara por la membrana por gravedad (30 minutos) después de lo cual se lavó dos veces la membrana con PBS (200 l). Se dejó que estos lavados con PBS se filtraran la membrana por gravedad (2x15 minutos). El aparato Bio-Dot se unió después a un colector a vacío y se realizó un tercer y último lavado con PBS con succión. Se desmontó el aparato, se retiró la membrana y se cortó rápidamente como se requirió antes de que se pusiera en tampón de bloqueo durante la noche a 4ºC. Se bloquearon membranas preparadas para análisis de decorina con BSA al 3% (p/v)/Tween 20 al 0,1% (v/v) en PBS. Al día siguiente, se sondaron las membranas con dilución 1:10.000 de anticuerpos primarios para decorina humana (policlonal de conejo; Biogénesis) durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las membranas con posterioridad con TBS/Tween 20 al 0,05% (3 x 5 minutos) y se después se incubaron con dilución 1:1.000 de fragmentos F(ab)’2 anticonejo (Amersham) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de esto se lavaron de nuevo las tiras de Immobilon con TBS/Tween 20 (3 x 5 minutos) antes de que se permitiera que se secara al aire a temperatura normal. Se envolvieron las membranas secas en celofán y se expusieron a una criba de fósforo de almacenamiento Molecular Dynamics durante 16-18 horas. Al cabo de este tiempo la criba expuesta se barrió por un fosforimager (Fosforimager Molecular Dynamics SF) usando el programa informático ImageQuant™. Se evaluó la intensidad de la mancha por análisis de la imagen asistida por ordenador usando las herramientas de cuantificación en ImageQuant™, estandarizado para el número de células y se determinaron los efectos de diversos reactivos de ensayo en la síntesis de decorina en relación con un valor de control tratado con vehículo de 100 unidades arbitrarias.

10

15

20

25

30

35

E99963409

19-12-2014

Ensayos

La tabla 6 a continuación indica los agentes para los que se evaluaron sus efectos en la síntesis de la decorina en fibroblastos dérmicos humanos y las cantidades en que se aplicaron. Para normalizar los resultados se determinaron los efectos de las sustancias de ensayo en relación con un valor de control tratado con vehículo de 100 unidades arbitrarias.

“CLA c9, t11” en la tabla se refiere a CLA en que el 93% en peso del CLA total es el isómero c9, t11, es decir, un agente activo que está dentro del ámbito de la presente invención. Esto se preparó, se describió en el ejemplo 1 anterior.

“CLA t10, c12” en la tabla se refiere a CLA en que el 80,5% en peso del CLA total es el isómero t10, c12, es decir, que tiene la estructura 2 a continuación:

imagen2

Este agente esta así fuera del ámbito de la presente invención. Se preparó como se describe en el ejemplo 1.

“Mezcla de CLA” en la tabla se refiere a una mezcla del isómero c9, t11 y el isómero t10, c12 en una proporción 1:1, en que está presente el 47% de cada isómero, en peso del CLA total. Este agente está así fuera del ámbito de la invención. Se preparó como se describe en el ejemplo 1.

Las pruebas realizadas con “CLA t10, c12” y “mezcla de CLA” se realizaron por fines comparativos.

También para comparación, se realizó una prueba con ácido retinoico para evaluar su efecto en la síntesis de la decorina en fibroblastos dérmicos humanos. Las concentraciones de reactivos usadas en las pruebas no tuvo influencia en la viabilidad celular.

TABLA 6

El efecto sobre la síntesis de la decorina por fibroblastos en respuesta al tratamiento con diversos compuestos de ensayo

Tratamiento

Decorina

Control (Vehículo)

100

CLA c9, t11 (10 M)

151,6  22,4 (p=0,01, n=3)

Mezcla de CLA (10 M)

81,5  4,3

CLA t10, c12 (10 M)

99,3  24,8

Los resultados en la tabla 6 indican que el CLA enriquecido en isómero c9, t11 regula hacia arriba significativamente la síntesis de la decorina en los fibroblastos dérmicos humanos cuando se compara con el control y cuando se compara con el CLA t10, c12 y el CLA.

El nivel de decorina en la piel está asociado con el estado y el aspecto mejorados de la piel. Aumentar el nivel de decorina en la piel es importante para la deposición controlada y correcta de colágeno en la piel, que se asocia con muchos beneficios de la piel tales como desaparición de las arrugas y reparación dérmica de piel fotodañada.

La prueba comparativa con ácido retinoico (1 m) demostró una regulación hacia arriba de la decorina, 138  14,0 (p=0,035, n= 4), cuando se determina en relación con un valor de control tratado con vehículo de 100 unidades arbitrarias. Sorprendentemente, los datos indican así además que la magnitud de la regulación hacia arriba de la síntesis de la decorina en fibroblastos dérmicos humanos efectuada por el isómero c9, t11 de ácido linoleico conjugado excede el del ácido retinoico, principio activo de reparación dérmica antienvejecimiento comparativa.

Ejemplo 4

Este ejemplo mide el efecto de diversos compuestos de ensayo en la toxicidad de los queratinocitos de dodecilsulfato de sodio (SDS).

Ensayo de viabilidad de queratinocitos SDS

10

15

20

25

30

35

40

45

E99963409

19-12-2014

Metodología

Se cultivaron queratinocitos en placas de 96 pozos a aproximadamente 80% de confluencia en medio de cultivo de queratinocitos (KGM) que se reemplazó después con KGM sin hidrocortisona durante 24-48 horas. Después se trataron las células con una concentración de dodecilsulfato de sodio (SDS) que producirá viabilidad celular de aproximadamente 50% (5/ml). Después se dosificaron las células con compuestos de ensayo que se usaron en una concentración indicada en la tabla 3 a continuación. Los compuestos de ensayo “CLA c9 t11” y “CLA t10 c12” en la tabla 7 son los mismos que los agentes descritos anteriormente en el Ejemplo 3. El control no contenía ningún compuesto de ensayo. Después de incubación durante 24 horas se retiró el medio y se determinó la viabilidad por el procedimiento Rojo Neutro. Con este procedimiento se incubaron las células durante 3 horas en KGM con 25 g/ml de rojo neutro después de lo cual se retiró el medio y después se extrajeron las células con 1 ml de ácido acético al 1% (v/v), 50% (v/v) de etanol durante 30 minutos. La absorbancia del extracto a 562 nm se determinó y se evaluó la viabilidad por referencia a los pozos que no contenían ni SDS ni compuestos de ensayo. Los resultados que se obtuvieron se resumen en la tabla 7 a continuación:

TABLA 7

Compuesto de ensayo (concentración)

% de control de SDS medio de n

CONTROL 5 g/ml SDS

100,0 16,6 8

CLA c9 t11 50 M + 5 g/ml de SDS

134,8 27,2 8

CLA t10 c12 50 M + 5 g/ml de SDS

69,2 16,3 8

Los resultados se expresan como un % del valor de viabilidad de SDS de 5 g/ml.

El CLA c9 t11 (un agente dentro del ámbito de la presente invención) aumenta significativamente la viabilidad comparado con el valor de SDS de 5 g/ml cuando se determina mediante ANOVA de 1 cola con comparación múltiple de Student-Neumann-Kuels, p < 0,05. El CLA t10 c12 (un agente fuera del ámbito de la presente invención) no aumentó la viabilidad celular comparado con el control de SDS.

Esta metodología ha demostrado que la toxicidad de los queratinocitos de un irritante se refiere al efecto irritante del agente in vivo (Lawrence, JN, Starkey, S., Dickson, FM & Benford, DJ. Uso de cultivos de queratinocitos humanos y de rata para evaluar la irritación potencial de la piel. Toxicol. In Vitro 10, 331-340 (1.996).) Así en la presente descripción demostramos que ese tratamiento con “CLA c9 t11” reduce significativamente los efectos tóxicos de SDS en los queratinocitos y de acuerdo con esto tiene una funcionalidad antiirritante mientras que el “CLA t10 c12” no modificó significativamente la toxicidad de SDS en estas células y así no presenta un efecto antiirritante.

Ejemplo 5

Este ejemplo ilustra la capacidad de los compuestos de ensayo para inducir la diferenciación en los queratinocitos, siendo la diferenciación parte del proceso que es fundamental para la formación de una capa córnea madura. Una capa córnea madura es importante para la función barrera de la piel y ayuda a evitar que la piel llegue a estar seca y áspera. Se midió la formación de envoltura cornificada (CE) y la actividad de la enzima transglutaminasa como indicadores de diferenciación. La envoltura cornificada es responsable de la forma, resistencia e integridad estructural de los corneocitos dentro de la capa córnea y la enzima transglutaminasa es vital para la correcta formación de la envoltura cornificada.

Ensayo de diferenciación de queratinocitos

Metodologías

Cultivo celular

Se aisló epidermis humana de prepucios juveniles usando técnicas convencionales y crecimiento en medio de cultivo de queratinocitos sin suero (“KGM”; Clonetics). Se usaron queratinocitos del tercer pase, sembrados a 4.000 células/pozo en placas de 96 pozos (Costar) en todos los estudios. Se cultivaron queratinocitos durante 3 días a 37ºC previamente al tratamiento en KGM que contenía Ca2+ 30 uM. Las células se trataron o con compuestos de ensayo o con vehículo solo (dimetilsulfóxido) durante 48 horas previamente a la recogida. Los compuestos de ensayo “CLA c9 t11” y “CLA t10 c12” en la tabla 8 son los mismos que los agentes descritos anteriormente en el Ejemplo 3.

Cuantificación de ADN

10

15

20

25

30

35

40

E99963409

19-12-2014

Se lavaron células de tratamiento después x3 en disolución salina tamponada de fosfato (PBS) y después se extrajeron en 100 ul de Tritón X-100, Tris 50 mM/HCl pH 8,0 con pepestatina 20 uM y leupeptina 20 uM (tampón de extracción de ADN) 15 ul en este extracto se ensayó el contenido en ADN usando el ensayo Pico Green (Molecular Probes, 4.849 Pichford Avenue, Eugene, Oregon, USA) exactamente como describieron los fabricantes.

Actividad de transglutaminasa (tgasa) en forma de partículas.

Después de tratamiento con tampón de extracción de ADN, se lavaron brevemente las células en tampón fresco y después se incubaron con el sustrato tgasa fluorescente, cadaverina Rojo Texas (Sondas Moleculares). Se trataron células durante 16 horas a 37ºC en cadaverina rojo Texas 15 uM en Tris 50 mM/HCl pH 8,0, NaCl 150 mM que contiene Ditiotreitol 5 mM, CaCl2 50 mM, se lavaron x2 en agua destilada y se midió la fluorescencia usando un fluorímetro Cytofluor con excitación a 590 nm y emisión a 645 nm.

Se expresó la actividad tgasa como unidades fluorescentes/ng de ADN.

Formación de envoltura cornificada

Se evaluó la formación de envoltura cornificada (CE) mediante la cuantificación de proteína insoluble en SDS restante en los pozos de cultivos de queratinocitos en placas de 24 pozos. Después de la eliminación de tampón de extracción de Tritón (descrito anteriormente) se lavaron los pozos con tampón de carbonato/bicarbonato (Sigma) pH 9,6. Después se incubó cada pozo con N-hidroxisuccinamida acoplada a biotina (patrón disuelto a 10 mg/ml en DMSO) en el tampón de carbonato y bicarbonato a 0,1 mg/ml (200 ul/pozo). Se incubaron las placas con agitación durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 50 ul/pozo de SDS al 10%, DTT 100 mM y se incubaron las placas a 60ºC durante unos 60 minutos más. Las envolturas se filtraron (con lavado en TBS-Tween)) en membrana de PVDF (bloqueada previamente en TBS Tween al 0,5%) usado un aparato dot blot. La membrana se sondeó cuidadosamente con estreptavidina-HRP (Zymed) diluida 1/1.000 durante 60 minutos a temperatura ambiente, se lavó (TBS-Tween) y se incubó con sustrato ECL (Pierce) durante 2 minutos. Se envolvieron las membranas en “film transparente” y se expusieron a película de rayos X para visualizar la proteína. Se cuantificó la intensidad de la mancha mediante barrido y análisis Phoretix.

Los resultados se resumen en la tabla 8 a continuación. Los resultados se expresan como un porcentaje del valor de control para cada parámetro medido.

TABLA 8

Compuesto de Ensayo (concentración)

Actividad tgasa (% control) de n Formación CE (% control) de n

CONTROL

100,0 15 6 100 30 6

“CLA c9 t11“ 10 M

166* 20 6 515* 28 6

“CLA t10 c12“ 10 pM

101 14 6 107 43 6

*p<0,01

El “CLA c9 t11” (un agente dentro del ámbito de la presente invención) aumenta significativamente (p<0,01) la actividad de la transglutaminasa y la formación de CE comparado con el control (DMSO tratado solo). El “CLA t10 c12” (un agente fuera del ámbito de la presente invención) no elevó ninguno de estos dos parámetros de diferenciación de queratinocitos comparado con el control.

Así se demuestra que el tratamiento con “CLA c9 t11” aumenta significativamente la diferenciación de los queratinocitos in vitro y de acuerdo con esto que presenta una funcionalidad de mejora de la diferenciación mientras que el “CLA t10 c12” no modifica significativamente el estado de diferenciación de los queratinocitos y así no presenta un efecto de mejora de la diferenciación. El “CLA c9 t11” es útil de acuerdo con esto para la prevención de estados de la piel seca y áspera y para el suavizado e hidratación de la piel ya en un estado seco y áspero.

Ejemplo 6

La formulación a continuación describe un aceite en crema acuosa que incorpora la composición inventiva que es adecuada para los procedimientos y usos de acuerdo con la presente invención. Los porcentajes indicados son en peso de la composición a menos que se indique de otro modo.

E99963409

19-12-2014

% en peso

Aceite de Parafina

4

Triglicérido de CLA (93% de isómero c9, t11 en peso de los restos de CLA total) preparado según el Ejemplo 2

1,15

Brij 56*

4

Alfol 16RD*

4

Trietanolamina

0,75

Butano-1,3-diol

3

Goma xantana

0,3

Perfume

cs

Hidroxitolueno butilado

0,01

Agua

hasta 100

*Brij 56 es alcohol cetílico POE (10) Alfol 16RD es alcohol cetílico

Ejemplo 7

La formulación a continuación describe una emulsión de agua en aceite que incorpora la composición inventiva que es adecuada para los procedimientos y los casos de acuerdo con la presente invención. Los porcentajes indicados son en peso de la composición a menos que se indique de otro modo.

% en peso

Aceite de coco totalmente hidrogenado

9,9

Triglicérido de CLA (93% de isómero C9, t11 en peso de los restos de CLA total) preparado según el Ejemplo 2

2

Brij 92*

5

Bentona 38

0,5

Mg SO4 7H2

0,5

Hidroxitolueno butilado

0,01

Perfume

cs

Agua

hasta 100

*Brij 92 es oleil éter de polioxietileno (2)

Las dos composiciones tópicas anteriores del ejemplo 6 y 7 proporcionan un tratamiento cosmético eficaz para mejorar el aspecto de la piel arrugada, envejecida, fotodañada y/o irritada, cuando se aplica a la piel que se ha deteriorado por el envejecimiento o el fotoenvejecimiento o cuando se aplica a piel joven para ayudar a prevenir o

10 retrasar dichos cambios deteriorativos. Las composiciones se pueden elaborar de manera convencional.

Claims (3)

1. E99963409

   19-12-2014

   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento cosmético de tratamiento y/o prevención de afecciones de la piel seleccionadas del grupo que consiste en arrugas, pérdida de firmeza, y manchas debidas a la edad, comprendiendo el procedimiento aplicar a la piel una composición tópica que comprende:

   5 (a) ácido linoleico conjugado y/o derivados del mismo que comprenden restos de ácido linoleico, en que al menos el 50% en peso del ácido linoleico conjugado y los restos está presente como el isómero cis 9 trans 11;

   (b) uno o más adyuvantes cosméticos seleccionados de un perfume, un antioxidante, un opacificante, un conservante, un colorante o un tampón y

   10 (c) un vehículo dermatológicamente aceptable.
2. 2. Una composición tópica para su uso como medicamento en el tratamiento y/o la prevención de piel fotodañada, comprendiendo la composición tópica:

   (a) ácido linoleico conjugado y/o derivados del mismo que comprenden restos de ácido linoleico, en

   que al menos el 50% en peso del ácido linoleico conjugado y los restos está presente como el 15 isómero cis 9 trans 11;

   (b)

   uno o más adyuvantes cosméticos seleccionados de un perfume, un antioxidante, un opacificante, un conservante, un colorante o un tampón y

   (c)

   un vehículo dermatológicamente aceptable

3. 3. Un procedimiento cosmético según la reivindicación 1 o una composición tópica de acuerdo con la

   20 reivindicación 2, en los que la composición tópica comprende de 0,00001% a 50%, preferentemente de 0,01% a 10% en peso de la composición de dicho ácido linoleico conjugado y/o derivados.

   14