TW201920230A - 治療性蛋白質藥物物質之整合連續製造 - Google Patents

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Abstract

本發明提供生產治療性蛋白質藥物物質的整合連續生物製造方法。亦提供能夠連續生產治療性蛋白質藥物物質的系統。

Description

治療性蛋白質藥物物質之整合連續製造 相關申請案的交叉引用
本申請案請求於2013年3月8日提申之美國臨時專利申請案序號61/775,060號，以及於2013年7月19日提申之美國臨時專利申請案第61/856,390號的優先權，這兩件申請案的全部內容併入本文做為參考資料。
本發明是有關於生物技術以及生物製造重組蛋白質的方法。
含有編碼重組蛋白質之核酸的哺乳動物細胞常用於生產在治療上或商業上重要的蛋白質。在多樣產品管路的現有環境中，生物技術公司逐漸被迫發展出以高度靈活且價廉的方式來製造治療性蛋白質藥物物質的創新解決方案。
至少在某個程度上，本發明是基於發現到包括兩個多管柱層析系統的整合連續系統可用於連續生產治療性蛋白質藥物物質。由於這個發現，本文提供用於製造治療性蛋白質藥物物質的整合與連續方法，其包括提供含有重組治療性蛋白質之基本上無細胞 的液體培養基，其中該液體培養基被饋送至第一多管柱層析系統(MCCS1)中；使用MCCS1捕獲液體培養基中的重組治療性蛋白質，其中含有該重組治療性蛋白質之MCCS1的洗出液被連續饋送至第二多管柱層析系統(MCCS2)中；以及使用MCCS2純化並精煉該重組治療性蛋白質，其中MCCS2的洗出液是治療性蛋白質藥物物質；且其中該方法被整合且由液體培養基連續地運行成MCCS2的洗出液，該洗出液為治療性蛋白質藥物物質。亦提供特別被設計成施行本文所述方法任一者的系統。例如，本文提供生物製造系統，其包括：含有一入口的第一多管柱層析系統(MCCS)；以及含有一出口的第二MCCS，其中該第一MCCS與第二MCCS彼此流體連通，且其中該製造系統被建構成液體可通入該入口、通經該第一MCCS與第二MCCS，並且經由該出口離開該製造系統。
本文提供用以製造治療性蛋白質藥物物質的整合與連續方法，其包括：(i)提供含有重組治療性蛋白質之基本上無細胞的液體培養基，其中該液體培養基被饋送至第一多管柱層析系統(MCCS1)中；(ii)使用MCCS1補獲液體培養基中的重組治療性蛋白質，其中含有該重組治療性蛋白質的MCCS1的洗出液被連續饋送至第二多管柱層析系統(MCCS2)中；以及(iii)使用MCCS2純化並精煉該重組治療性蛋白質，其中MCCS2的洗出液為治療性蛋白質藥物物質；且其中該方法被整合且由液體培養基連續地運行成MCCS2的洗出液，該洗出液為治療性蛋白質藥物物質。在本文所述方法任一者的一些具體例中，該液體培養基是選自下列之群：由含有哺乳動物細胞之培養物的灌注生物反應器移除的液體培養基(該等哺乳動物細胞分泌重組治療性蛋白質)、由含有哺乳動物細胞之培養物的饋料 批次生物反應器移除的液體培養基(該等哺乳動物細胞分泌重組治療性蛋白質)，以及分泌該重組治療性蛋白質之細菌或酵母菌細胞之培養物的經澄清液體培養基。
在本文所述方法任一者的一些具體例中，MCCS1及/或MCCS2施行至少兩個不同的單元操作。在本文所述方法任一者的一些具體例中，MCCS1或MCCS2或兩者的使用涉及管柱切換。在本文所述方法任一者的一些具體例中，MCCS1施行捕獲重組治療性蛋白質以及不活化病毒的單元操作。在本文所述方法任一者的一些具體例中，MCCS2施行純化並精煉重組治療性蛋白質的單元操作。在本文所述方法任一者的一些具體例中，MCCS1及/或MCCS2採用至少兩個層析管柱。在本文所述方法任一者的一些具體例中，MCCS1及/或MCCS2採用至少兩個層析膜。在本文所述方法任一者的一些具體例中，MCCS1及/或MCCS2採用至少一個層析管柱以及至少一個層析膜。在本文所述方法任一者的一些具體例中，該液體培養基為由含有分泌該重組治療性蛋白質之哺乳動物細胞培養物的灌注生物反應器移除的液體培養基。
在本文所述方法任一者的一些具體例中，MCCS1為第一週期性對流層析系統(PCCS1)。在本文所述方法任一者的一些具體例中，該PCCS1包括四管柱PCCS。在本文所述方法任一者的一些具體例中，在該四管柱PCCS的四個管柱中的三個施行從液體培養基捕獲重組治療性蛋白質的單元操作。在本文所述方法任一者的一些具體例中，使用親和力層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析或分子篩層析來施行捕獲。在本文所述方法任一者的一些具體例中，親和力層析是使用選自下列之群的捕獲機制來施行：蛋白質A-結合 捕獲機制、受質-結合捕獲機制、抗體-或抗體片段-結合捕獲機制、適體-結合捕獲機制，以及輔因子-結合捕獲機制。在本文所述方法任一者的一些具體例中，親和力層析是使用蛋白質-A結合捕獲機制來施行，而重組治療性蛋白質為抗體或抗體片段。在本文所述方法任一者的一些具體例中，來自四管柱PCCS之四個管柱中的三個之含有重組治療性蛋白質的洗出液被饋送至四管柱PCCS的第四個管柱中。在本文所述方法任一者的一些具體例中，四管柱PCCS的第四個管柱藉由將含有重組治療性蛋白質的洗出液維持在低pH下以供病毒不活化而施行不活化病毒的單元操作。在本文所述方法任一者的一些具體例中，四管柱PCCS的第四個管柱將含有重組治療性蛋白質的洗出液維持在低pH下歷時一段約10分至約1.5小時的期間以供病毒不活化。
在本文所述方法任一者的一些具體例中，MCCS2為第二週期性對流(PCCS2)層析系統。本文所述方法任一者的一些具體例進一步包括使用線上緩衝劑調整貯器在洗出液由四管柱PCCS的第四個管柱被饋送至PCCS2之前調整來自四管柱PCCS的第四個管柱之洗出液的pH。在本文所述方法任一者的一些具體例中，PCCS2層析系統包括三個層析管柱以及一個層析膜。在本文所述方法任一者的一些具體例中，PCCS2的三個層析管柱透過陽離子或陰離子交換層析施行純化來自PCCS1之洗出液的重組治療性蛋白質的單元操作。在本文所述方法任一者的一些具體例中，PCCS2的三個層析管柱的洗出液被饋送至PCCS2的層析膜中。在本文所述方法任一者的一些具體例中，PCCS2的層析膜透過陽離子或陰離子交換層析施行精煉存在於PCCS2之三個層析管柱之洗出液中的重組治療性蛋白質 的單元功能。在本文所述方法任一者的一些具體例中，PCCS2的層析膜透過陽離子交換層析施行精煉的單元功能。在本文所述方法任一者的一些具體例中，層析膜的溢流與洗滌物為治療性蛋白質藥物物質。本文所述方法任一者的一些具體例進一步包括將該治療性蛋白質藥物物質調配成醫藥組合物。
在本文所述方法任一者的一些具體例中，該重組治療性蛋白質為抗體或抗體片段、酵素、經工程化蛋白質或免疫原性蛋白質或蛋白質片段。本文所述方法任一者的一些具體例進一步包括在PCCS2的三個管柱的洗出液被饋送至PCCS2的層析膜中之前使用線上緩衝劑調整來調整PCCS2的三個管柱的洗出液的離子濃度。本文所述方法任一者的一些具體例進一步包括在PCCS1與PCCS2之間使用斷流箱(break tan)(例如本文所述斷流箱任一者)。本文所述方法任一者的一些具體例進一步包括在PCCS1的洗出液被饋送至PCCS2中之前將其過濾。本文所述方法任一者的一些具體例進一步包括在液體培養基被饋送至MCCS1中之前將其過濾。
亦提供用以製造治療性蛋白質藥物物質的整合與連續方法，其包括：(1)在含有液體培養基的灌注生物反應器中培養分泌重組治療性蛋白質的哺乳動物細胞，其中連續地或週期性地由灌注生物反應器移除某一體積之基本上無細胞的液體培養基並且饋送至第一多管柱層析系統(MCCS1)中；(ii)使用MCCS1捕獲被移除的液體培養基中的重組治療性蛋白質，其中含有重組治療性蛋白質的MCCS1的洗出液被連續地饋送至第二多管柱層析系統(MCCS2)中；以及(iii)使用MCCS2純化並精煉MCCS1的洗出液中的治療性重組蛋白質，其中MCCS2的洗出液為治療性蛋白質藥物物質；其中該 方法被整合且從被移除之液體培養基連續地運行成MCCS2的洗出液(其為治療性蛋白質藥物物質)。
在本文所述方法任一者的一些具體例中，MCCS1及/或MCCS2施行至少兩個不同的單元操作。在本文所述方法任一者的一些具體例中，MCCS1或MCCS2或兩者的使用涉及管柱切換。在本文所述方法任一者的一些具體例中，MCCS1施行捕獲重組治療性蛋白質以及不活化病毒的單元操作。在本文所述方法任一者的一些具體例中，MCCS2施行純化與精煉重組治療性蛋白質的單元操作。在本文所述方法任一者的一些具體例中，MCCS1及/或MCCS2採用至少兩個層析管柱。在本文所述方法任一者的一些具體例中，MCCS1及/或MCCS2採用至少兩個層析膜。在本文所述方法任一者的一些具體例中，MCCS1及/或MCCS2採用至少一個層析管柱以及至少一個層析膜。
在本文所述方法任一者的一些具體例中，MCCS1為第一週期性對流層析系統(PCCS1)。在本文所述方法任一者的一些具體例中，該PCCS1包括四管柱PCCS。在本文所述方法任一者的一些具體例中，在該四管柱PCCS的四個管柱中的三個施行從液體培養基捕獲重組治療性蛋白質的單元操作。在本文所述方法任一者的一些具體例中，使用親和力層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析或分子篩層析來施行捕獲。在本文所述方法任一者的一些具體例中，親和力層析是使用選自下列之群的捕獲機制來施行：蛋白質A-結合捕獲機制、受質-結合捕獲機制、抗體-或抗體片段-結合捕獲機制、適體-結合捕獲機制，以及輔因子-結合捕獲機制。在本文所述方法任一者的一些具體例中，親和力層析是使用蛋白質-A結合捕獲機制 來施行，而重組治療性蛋白質為抗體或抗體片段。在本文所述方法任一者的一些具體例中，來自四管柱PCCS之四個管柱中的三個之含有重組治療性蛋白質的洗出液被饋送至四管柱PCCS的第四個管柱中。在本文所述方法任一者的一些具體例中，四管柱PCCS的第四個管柱藉由將含有重組治療性蛋白質的洗出液維持在低pH下以供病毒不活化而施行不活化病毒的單元操作。在本文所述方法任一者的一些具體例中，四管柱PCCS的第四個管柱將含有重組治療性蛋白質的洗出液維持在低pH下歷時一段約10分至約1.5小時的期間以供病毒不活化。
在本文所述方法任一者的一些具體例中，MCCS2為第二週期性對流(PCCS2)層析系統。本文所述方法任一者的一些具體例進一步包括使用線上緩衝劑調整貯器在洗出液由四管柱PCCS的第四個管柱被饋送至PCCS2之前調整來自四管柱PCCS的第四個管柱之洗出液的pH。在本文所述方法任一者的一些具體例中，PCCS2層析系統包括三個層析管柱以及一個層析膜。在本文所述方法任一者的一些具體例中，PCCS2的三個層析管柱透過陽離子或陰離子交換層析施行純化來自PCCS1之洗出液的重組治療性蛋白質的單元操作。在本文所述方法任一者的一些具體例中，PCCS2的三個層析管柱的洗出液被饋送至PCCS2的層析膜中。在本文所述方法任一者的一些具體例中，PCCS2的層析膜透過陽離子或陰離子交換層析施行精煉存在於PCCS2之三個層析管柱之洗出液中的重組治療性蛋白質的單元功能。在本文所述方法任一者的一些具體例中，PCCS2的層析膜透過陽離子交換層析施行精煉的單元功能。在本文所述方法任一者的一些具體例中，層析膜的溢流與洗滌物為治療性蛋白質藥物 物質。本文所述方法任一者的一些具體例進一步包括將該治療性蛋白質藥物物質調配成醫藥組合物。在本文所述方法任一者的一些具體例中，重組治療性蛋白質為抗體或抗體片段、酵素、經工程化蛋白質，或免疫原性蛋白質或蛋白質片段。
本文所述方法任一者的一些具體例進一步包括在PCCS2的三個管柱的洗出液被饋送至PCCS2的層析膜中之前使用線上緩衝劑調整來調整PCCS2的三個管柱的洗出液的離子濃度。本文所述方法任一者的一些具體例進一步包括在PCCS1與PCCS2之間使用斷流箱(break tan)(例如本文所述斷流箱任一者)。本文所述方法任一者的一些具體例進一步包括在PCCS1的洗出液被饋送至PCCS2中之前將其過濾。本文所述方法任一者的一些具體例進一步包括在液體培養基被饋送至MCCS1中之前將其過濾。
亦提供生物製造系統，其包括：包括一入口的第一多管柱層析系統(MCCS)；以及包括一出口的第二MCCS，其中該第一MCCS與第二MCCS彼此流體連通，且其中該製造系統被建構成液體可通入該入口、通經該第一MCCS與第二MCCS，並且經由該出口離開該製造系統。本文所述系統任一者的一些具體例進一步包括生物反應器，其中該生物反應器與該入口彼此流體連通，且其中該製造系統被建構成存在於生物反應器中的液體可通入該入口。在本文所述系統任一者的一些具體例中，該第一MCCS或該第二MCCS或兩者被建構成施行至少兩種個別的單元操作。在本文所述系統任一者的一些具體例中，使用該MCCS1或該MCCS2或兩者涉及管柱切換。
在本文所述系統任一者的一些具體例中，該第一MCCS被建構成施行捕獲重組治療性蛋白質以及不活化病毒的單元 操作。在本文所述系統任一者的一些具體例中，該第二MCCS被建構成施行純化並精煉重組治療性蛋白質的單元操作。在本文所述系統任一者的一些具體例中，該第一MCCS或該第二MCCS或兩者含有至少兩個層析管柱。在本文所述系統任一者的一些具體例中，該第一MCCS或該第二MCCS或兩者含有至少兩個層析膜。在本文所述系統任一者的一些具體例中，該第一MCCS或該第二MCCS或兩者含有至少一個層析管柱以及至少一個層析膜。
在本文所述系統任一者的一些具體例中，該第一MCCS為第一週期性對流層析系統(PCCS1)。在本文所述系統任一者的一些具體例中，該PCCS1包括四管柱PCCS。在本文所述系統任一者的一些具體例中，在四管柱PCCS的四個管柱中的三個能夠從液體培養基捕獲重組治療性蛋白質。在本文所述系統任一者的一些具體例中，在該四管柱PCCS的四個管柱中的三個包括一或多個親和力層析管柱、陽離子層析管柱、陰離子層析管柱，以及分子篩層析管柱。在本文所述系統任一者的一些具體例中，在該四管柱PCCS的四個管柱中的三個包括一或多個使用選自下列之群的捕獲機制的親和力層析管柱：蛋白質A-結合捕獲機制、受質-結合捕獲機制、抗體-或抗體片段-結合捕獲機制、適體-結合捕獲機制，以及輔因子-結合捕獲機制。在本文所述系統任一者的一些具體例中，該四管柱PCCS的第四個管柱是能夠將含有重組治療性蛋白質之四管柱PCCS的四個管柱中的三個的洗出液維持在低pH下以供病毒不活化之貯器或管柱。在本文所述系統任一者的一些具體例中，該四管柱PCCS的第四個管柱能夠將含有重組治療性蛋白質之四管柱PCCS的四個管柱中的三個的洗出液維持在低pH下歷時一段約10分至約1.5小時的期間 以供病毒不活化。
在本文所述系統任一者的一些具體例中，該第二MCCS為第二週期性對流層析系統(PCCS2)。本文所述系統任一者的一些具體例進一步包括設置在第一MCCS與第二MCCS之間的流體管。本文所述系統任一者的一些具體例進一步包括與設置在第一MCCS和第二MCCS之間的該流體管彼此流體連通，且被建構成使得線上緩衝劑調整貯器中所含的緩衝劑被引入至存在於設置在第一MCCS與第二MCCS之間的該流體管中的液體的線上緩衝劑調整貯器。本文所述系統任一者的一些具體例進一步包括設置在介於第一MCCS與第二MCCS之間的流體管中，且被建構成使其能夠將顆粒物質從存在於介於第一MCCS與第二MCCS之間的流體管中之液體移除的過濾器。
在本文所述系統任一者的一些具體例中，該PCCS2包括三個層析管柱以及一個層析膜。本文所述方法任一者的一些具體例進一步包括設置在PCCS2的三個層析管柱與PCCS2的層析膜之間的流體管。本文所述系統任一者的一些具體例進一步包括與設置在PCCS2的三個層析管柱和PCCS2的層析膜之間的該流體管彼此流體連通，且被建構成使得線上緩衝劑調整貯器中所含的緩衝劑被引入至存在於設置在PCCS2的三個層析管柱與PCCS2的層析膜之間的該流體管中的液體的線上緩衝劑調整貯器。
在本文所述系統任一者的一些具體例中，PCCS2的三個層析管柱能夠透過陽離子或陰離子交換層析純化重組治療性蛋白質。在本文所述系統任一者的一些具體例中，PCCS2的層析膜為陽離子交換層析膜。
本文所述系統任一者的一些具體例進一步包括介於PCCS2的層析膜以及出口之間的流體管。本文所述系統任一者的一些具體例進一步包括設置在介於PCCS2的層析膜與出口之間的流體管中，並被建構成使其能夠將顆粒物質從存在於介於PCCS2的層析膜與出口之間的流體管中之液體移除的過濾器。本文所述系統任一者的一些具體例進一步包括與該入口流體連通的泵系統。在本文所述系統任一者的一些具體例中，該泵系統包括能夠將液體推入該入口的泵。本文所述系統任一者的一些具體例進一步包括設置在該泵以及該入口之間的流體管。本文所述系統任一者的一些具體例進一步包括設置在介於該泵以及該入口之間的流體管中，且被建構成使其能夠將顆粒物質從存在於該泵以及該入口之間的流體管中之液體移除的過濾器。本文所述系統任一者的一些具體例進一步包括設置在介於該泵以及該入口之間的流體管中的斷流箱(例如本文所述斷流箱任一者)，其被建構成該斷流箱與介於該泵以及該入口之間的該流體管流體連通，且能夠儲存無法進入該入口之流體管中所存在的任何液體。
在本文所述系統任一者的一些具體例中，該第一MCCS以及該第二MCCS設置在滑架(例如包括一或多個使移動成為可能的結構的滑架)上。在本文所述系統任一者的一些具體例中，該第一MCCS設置在第一滑架上。在本文所述系統任一者的一些具體例中，該第二MCCS設置在第二滑架上。在本文所述系統任一者的一些具體例中，該第一滑架與第二滑架各自包括一或多個使移動成為可能的結構。在本文所述系統任一者的一些具體例中，整個系統設置在一滑架(例如包括一或多個使移動成為可能的結構的滑架) 上。
亦提供包括兩個或更多個子系統的生物製造系統，其中該兩個或更多個子系統各自包括：(i)包含一入口的第一多管柱層析系統(MCCS)；以及(ii)包含一出口的第二MCCS，其中該第一MCCS以及該第二MCCS彼此流體連通，且其中該製造系統被建構成液體可通入該入口、通經該第一MCCS與第二MCCS，並且經由該出口離開該製造系統；其中該兩個或更多個子系統被建構成它們各自與一個含有液體的單一貯器流體連通，而該單一貯器的液體通入該兩個或更多個子系統的入口。在本文所述系統任一者的一些具體例中，該兩個或更多個子系統各自設置在其自身的滑架上。在本文所述系統任一者的一些具體例中，該滑架包括一或多個使移動成為可能的結構。在本文所述系統任一者的一些具體例中，整個系統是設置在一滑架(例如包括一或多個使移動成為可能的結構的滑架)上。
如本文所用，單詞”一”在名詞前表示一或多個特定名詞。例如，片語”一哺乳動物細胞”代表”一或多個哺乳動物細胞”。
術語”哺乳動物細胞”表示衍生自任一種哺乳動物(例如人類、倉鼠、小鼠、綠猴、大鼠、豬、牛或兔)的任何細胞。例如，哺乳動物細胞可以是不朽細胞。在一些具體例中，該哺乳動物細胞為已分化細胞。在一些具體例中，該哺乳動物細胞為未分化細胞。本文說明哺乳動物細胞的非限制性實例。哺乳動物細胞的其他實例為技藝中已知。
術語”基本上無”代表一種組合物(例如液體培養基)，其至少或約90%無(例如至少或約95%、96%、97%、98%或至少或約99%無，或約100%無)指定物質(例如哺乳動物細胞)。
術語”0.5x體積”表示約50%的體積。術語"0.6x體積"表示約60%的體積。同樣的，0.7x、0.8x、0.9x、以及1.0x分別表示約70%、80%、90%或100%體積。
術語”培養”或”細胞培養”表示在控制設定的物理條件下維持或增殖哺乳動物細胞。
術語”哺乳動物細胞的培養物”表示含有在控制設定的物理條件下維持或增殖之複數哺乳動物細胞的液體培養基。
術語”液體培養基”表示一種液體，其含有充分營養素以容許細胞(例如哺乳動物細胞)在活體外生長或增殖。例如，液體培養基可含有下列一或多者：胺基酸(例如20種胺基酸)、嘌呤(例如次黃嘌呤)、嘧啶(例如胸苷)、膽鹼、肌醇、硫胺素、葉酸、生物素、鈣、菸鹼醯胺、吡哆醇、核黃素、胸苷、氰鈷胺、丙酮酸、硫辛酸、鎂、葡萄糖、鈉、鉀、鐵、銅、鋅，及碳酸氫鈉。在一些具體例中，液體培養基可含有哺乳動物的血清。在一些具體例中，液體培養基不含有哺乳動物的血清或另一種萃取物(限定液體培養基)。在一些具體例中，液體培養基可含有微量金屬、哺乳動物生長激素，及/或哺乳動物生長因子。液體培養基的另一個實例是基本培養基(minimal medium)(例如只含有無機鹽類、碳源以及水的培養基)。本文說明液體培養基的非限制性實例。液體培養基的其他實例為技藝中已知且為商業上可購得。液體培養基可含有任何密度的哺乳動物細胞。例如，如本文所用，由生物反應器移除的某個體積的液體培養基可以是基本上無哺乳動物細胞。
術語”無動物衍生組分的液體培養基”表示不含有任何衍生自哺乳動物之組分(例如蛋白質或血清)的液體培養基。
術語”無血清液體培養基”表示不含有哺乳動物血清的液體培養基。
術語”含血清液體培養基”表示含有哺乳動物血清的液體培養基。
術語”化學限定液體培養基”是技藝用術語且表示其中所有化學組分均為已知的液體培養基。例如，化學限定液體培養基不含有胎牛血清、牛血清白蛋白，或人類血清白蛋白，因為這些製品通常含有白蛋白與脂質的複合混合物。
術語”無蛋白質液體培養基”表示不含有任何蛋白質(例如任何可偵測到的蛋白質)的液體培養基。
術語”攪動”表示攪拌或以其他方式移動生物反應器中的部分液體培養基。這樣施行以例如增加生物反應器中液體培養基的溶解O2濃度。攪動可以使用任何技藝已知方法來施行，例如儀器或螺槳。可用以施行攪動生物反應器中的部分液體培養基的例示性裝置以及方法為技藝中已知。
術語”治療性蛋白質藥物物質”表示一種重組蛋白質(例如免疫球蛋白、蛋白質片段、經工程化蛋白質或酵素)，其經充分純化或從污染性蛋白質、脂質與核酸(例如存在於液體培養基中或來自宿主細胞(例如來自哺乳動物、酵母菌或細菌宿主細胞)的汙染性蛋白質、脂質與核酸)，與生物汙染物(例如病毒和細菌汙染物)中被單離出來且可被調配成藥劑而不需要任何進一步實質純化及/或去汙染步驟。
術語”整合方法”表示一種方法，其是使用相配合地施行功能而達到特定結果(例如由液體培養基產生治療性蛋白質藥物 物質)的結構元件來施行。
術語”連續方法”表示一種方法，其透過系統的至少一部分連續地饋送液體。例如，在本文所述例示性連續生物製造系統任一者中，含有重組治療性蛋白質的液體培養基被連續地饋送至系統中，同時其正在運行中且治療性蛋白質藥物物質被饋出該系統。在另一個實例中，連續方法是一種方法，其從生物反應器透過第一MCCS連續地饋送含有重組治療性蛋白質知液體培養基。連續方法的另一個實例是一種方法，其從生物反應器透過第一MCCS以及第二MCCS連續地饋送含有重組治療性蛋白質的液體培養基。其他實例包括透過第一MCCS連續地饋送含有重組治療性蛋白質的液體培養基的方法、透過第一MCCS與第二MCCS連續地饋送含有重組治療性蛋白質的液體培養基的方法，或透過第二MCCS連續地饋送含有重組治療性蛋白質的液體的方法。
術語”免疫球蛋白”表示一種多肽，其含有免疫球蛋白蛋白質(例如可變域序列、骨架序列或恆定域序列)的至少15個胺基酸(例如至少20、30、40、50、60、70、80、90或100個胺基酸)的胺基酸序列。免疫球蛋白可例如包括至少輕鏈免疫球蛋白的至少15個胺基酸、例如重鏈免疫球蛋白的至少15個胺基酸。免疫球蛋白可以是經單離抗體(例如IgG、IgE、IgD、IgA或IgM)。免疫球蛋白可以是IgG的亞型(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。免疫球蛋白可以是抗體片段，例如Fab片段、F(ab’)2片段，或scFv片段。免疫球蛋白也可以是雙特異性抗體或三特異性抗體，或二聚體、三聚體或集合體蛋白，或雙鏈抗體、Affibody®，或Nanobody®。免疫球蛋白也可以是含有至少一個免疫球蛋白結構域的經工程化蛋白質(例如融合蛋白質)。 本文說明免疫球蛋白的非限制性實例且免疫球蛋白的其他實例為技藝中已知。
術語”蛋白質片段”或”多肽片段”表示多肽序列的一部分，其在長度上為至少或約4個胺基酸、至少或約5個胺基酸、至少或約6個胺基酸、至少或約7個胺基酸、至少或約8個胺基酸、至少或約9個胺基酸、至少或約10個胺基酸、至少或約11個胺基酸、至少或約12個胺基酸、至少或約13個胺基酸、至少或約14個胺基酸、至少或約15個胺基酸、至少或約16個胺基酸、至少或約17個胺基酸、至少或約18個胺基酸、至少或約19個胺基酸，或至少或約20個胺基酸，或在長度上超過20個胺基酸。重組蛋白質片段可以使用本文所述方法任一者來生產。
術語”經工程化蛋白質”表示一種多肽，其不是由存在於生物體(例如哺乳動物)中的內源性核酸所天然編碼。經工程化蛋白質的實例包括酵素(例如帶有一或多個胺基酸置換、刪除、插入或添加，使得經工程化酵素的穩定性及/或催化活性增強)、融合蛋白質、抗體(例如二價抗體、三價抗體或雙鏈抗體)，以及含有至少一個重組骨架序列的抗原-結合蛋白質。
術語”多管柱層析系統”或”MCCS”表示一種具有總計兩個或更多個彼此連結或轉接之層析管柱及/或層析膜的系統。多管柱層析系統的非限制性實例為週期性對流層析系統(PCC)，其含有總計兩個或更多個彼此連結或轉接之層析管柱及/或層析膜。本文說明多管柱層析系統的其他實例且為技藝中已知。
術語”捕獲”表示一個被施行與來自存在於液體培養基或經稀釋液體培養基中之一或多種其他組分(例如培養基蛋白質)或 存在於哺乳動物細胞或被哺乳動物細胞分泌之一或多種其他組分(例如DNA、RNA或其他蛋白質)部分純化或單離(例如以重量計至少或約5%，例如至少或約10%、15%、20%、25%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%，或至少或約95%純的)、濃縮並穩定重組治療性蛋白質之步驟。通常，捕獲是使用結合重組治療性蛋白質的樹脂來施行(例如透過使用親和力層析)。本文說明用以從液體培養基或經稀釋液體培養基捕獲重組治療性蛋白質的非限制性方法且為其他方法技藝中已知。重組治療性蛋白質可以由液體培養基使用至少一個層析管柱及/或層析膜(例如本文所述層析管柱及/或層析膜任一者)而被捕獲。
術語”純化”表示被施行來將重組治療性蛋白質從存在於含有重組治療性蛋白質之液體中的一或多種其他不純物(例如巨大不純物)或組分(例如液體培養基蛋白質或一或多種存在於哺乳動物細胞或自哺乳動物細胞分泌的其他組分，例如DNA、RNA、其他蛋白質、內毒素、病毒等)單離出來的步驟。例如，純化可以在初始捕獲步驟期間或在初始捕獲步驟之後施行。純化可以使用結合重組治療性蛋白質或汙染物的樹脂、膜或任何其他固體擔體來施行(例如透過使用親和力層析、疏水性交互作用層析、陰離子或陽離子交換層析，或分子篩層析)。重組治療性蛋白質可以由含有該重組治療性蛋白質的液體使用至少一個層析管柱及/或層析膜(例如本文所述層析管柱或層析膜任一者)來進行純化。
術語”精煉”是一個技藝用術語並表示被施行來從接近最終所要純度之含有重組治療性蛋白質的液體中移除剩餘微量或少量汙染物或不純物的步驟。例如，精煉可以藉由使含有該重組治療 性蛋白質的液體流過選擇性地結合至存在於含有重組治療性蛋白質之液體中的目標重組治療性蛋白質或少量汙染物或不純物之層析管柱(等)或膜吸收材料(等)來施行。在此一實例中，層析管柱(等)或膜吸收材料(等)的洗出液/濾液含有該重組治療性蛋白質。
術語”洗出液/濾液”是一個技術用術語並表示一種由層析管柱或層析膜被排出的液體，其含有可偵測量的重組治療性蛋白質。
術語”過濾”表示由液體(例如存在於本文所述系統或方法任一者中的液體培養基或液體)移除至少一部分(例如至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)非所要生物汙染物(例如哺乳動物細胞、細菌、酵母菌細胞、病毒或分枝桿菌)及/或顆粒物質(例如沉澱蛋白質)。
術語”分泌的蛋白質”或”分泌的重組蛋白質”表示一種蛋白質(例如重組蛋白質)，其當在哺乳動物細胞內被轉譯時原先含有至少一個分泌訊號序列，且至少在某個程度上透過酵素在哺乳動物細胞中切割分泌訊號序列，該蛋白質至少一部分被分泌至細胞外空間(例如液體培養基)。習於技藝者將理解”分泌的”蛋白質不需要與細胞完全解離才會被視為是分泌的蛋白質。
術語”灌注生物反應器”表示一種在第一液體培養基中含有複數個細胞(例如哺乳動物細胞)的生物反應器，其中培養存在於該生物反應器中的細胞包括週期性或連續移除第一液體培養基並同時或之後馬上添加基本上相等體積的第二液體培養基至該生物反應器。在一些實例中，於培養期期間(例如每日培養基再饋送率)在漸增期間(例如約24小時期間、介於約1分與約24小時期間，或大於 24小時的期間)被移除與添加之第一液體培養基於體積方面的漸行變化(例如增加或減少)。每天被移除並取代的培養基分量可能依據培養的特定細胞、初始接種密度，以及特定時間的細胞密度而改變。”RV”或”反應器體積”表示在培養程序開始之時存在的培養基體積(例如在接種之後存在的培養基總體積)。
術語”饋料-批次生物反應器”是一個技術用術語並表示在第一液體培養基中含有複數個細胞(例如哺乳動物細胞)的生物反應器，其中培養存在於生物反應器中的細胞包括週期性或連續添加第二液體培養基至第一液體培養基而基本上或明顯沒有從細胞培養物移除第一液體培養基或第二培養基。第二液體培養基可以與第一液體培養基相同。在饋料批次培養的一些實例中，第二液體培養基是第一液體培養基的濃縮形式。在饋料批次培養中，第二液體培養基是以乾粉被添加。
術語”經澄清的液體培養基”表示得自於細菌或酵母菌細胞培養物的液體培養基，其基本上無(例如至少80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%或99%無)細菌或酵母菌細胞。
術語”單元操作”是技藝用術語並表示可在從液體培養基製造治療性蛋白質藥物物質的方法中施行的功能性步驟。例如，操作的一個單元可以是對含有重組治療性蛋白質的液體進行過濾(例如由含有重組治療性蛋白質的液體移除汙染細菌、酵母菌病毒，或分枝桿菌，及/或顆粒物質)、捕獲、表位標誌移除、純化、容納或儲存、精煉、病毒不活化、調整離子濃度及/或pH，並且移除不想要的鹽類。
“比生產率”或”SPR”是技藝用術語且如本文所用意指 每天每個哺乳動物細胞所生產的重組治療性蛋白質質量或酵素活性。重組治療性抗體的SPR通常是測量為質量/細胞/天。重組治療性酵素的SPR通常測量為單位/細胞/天或(單位/質量)/細胞/天。
“體積生產率”或VPR”是技藝用術語且如本文所用意指每天每個培養物體積(例如每L生物反應器、容器或管體積)所生產的重組治療性蛋白質的質量或酵素活性。重組治療性抗體的VPR通常測量為質量/L/天。重組治療性酵素的VPR通常測量為單位/L/天或質量/L/天。
”滑架”是技藝用術語且如本文所用意指可用作為本文所述系統的平台或支撐體的三維固體結構。若滑架包含一或多個使移動成為可能的結構(例如輪、滑輪或類似物)，則其可對系統或系統一部分賦予移動性。本文說明滑架的非限制性實例。滑架的其他實例為技藝中已知。
除非另有定義，否則本文使用的所有技術與科學術語具有與本發明所屬技藝中具有通常知識者一般所理解的相同意思。本文說明用於本發明中的方法與材料；亦可使用技藝中已知的其他適宜方法與材料。材料、方法以及實例僅供說明之用且不意欲具有限制性。本文提及的所有公開案、專利申請案、專利案、序列、數據庫入口以及其他參考資料以其整體併入做為參考資料。若有衝突，本說明書(包括定義)佔上風。
本發明的其他特徵以及優點將依據下列詳細說明與圖式還有申請專利範圍而變得明白無誤。
1‧‧‧系統
2‧‧‧四管柱MCCS
3‧‧‧管柱
4‧‧‧管柱
5‧‧‧管柱
6‧‧‧管柱
7‧‧‧入口
8‧‧‧PCCS
9‧‧‧層析管柱
10‧‧‧層析管柱
11‧‧‧層析管柱
12‧‧‧層析膜
13‧‧‧流體管
14‧‧‧線上緩衝劑調整貯器
15‧‧‧出口
16‧‧‧流體管
17‧‧‧線上緩衝劑調整貯器
18‧‧‧過濾器
19‧‧‧斷流箱
20‧‧‧泵系統
21‧‧‧泵
22‧‧‧流體管
23‧‧‧過濾器
24‧‧‧斷流箱
25‧‧‧生物反應器
26‧‧‧流體管
27‧‧‧過濾系統
圖1是簡圖，顯示可用於連續生產重組蛋白質藥物物 質的例示性整合系統。
圖2是連結至灌注細胞培養生物反應器之單一PCC系統的圖，該PCC系統可用於捕獲存在於得自該生物反應器之細胞培養基中的重組治療性蛋白質。
圖3是含有三個層析管柱的PCC系統循環的圖。在循環開始之時，饋料溶液被加載至管柱1上，且溢流浪費直到產物貫流開始(步驟1)。在此時，來自管柱1的溢流被導向管柱2以捕獲來自管柱1之未結合的重組治療性蛋白質(步驟2)。在管柱1完全加載之後，饋料現被導向加載至管柱2上，同時將管柱1洗滌、沖提、在生並再平衡供下一個循環用(步驟3與4)。管柱2現在進行步驟3-5，與管柱1的步驟1-3相同。最後，管柱3進行步驟5-6，與管柱1和2相同。在所有三個管柱完成這些步驟之後，重新以管柱1開始循環。
圖4是說明基於△UV的管柱切換原則的簡圖。T1表示當△UV已達到預定閾值程度時的時間。在達到這個閾值程度之後，管柱1的溢流被導向管柱2而不是廢料。T2表示當管柱經產物飽和時的時間。T1以及T2的△UV為程序特異性。
圖5A為隨著時間在生產重組治療性抗體之生物反應器培養物中的細胞密度概況圖。生物反應器培養物中的平均細胞密度為50-60 x106細胞/mL。
圖5B為隨著時間生產重組治療性抗體之生物反應器培養物的體積生產率的圖。
圖6是一組圖，顯示於總計30天、38個單一PCC系統循環以及110個管柱操作從單一PCC系統沖提出的重組治療性蛋白質的回收百分比、聚集百分比、效力(相較於對照)、殘餘蛋白質A濃度 (ng/mg)，及宿主細胞蛋白質濃度(ng/mg)。與三個ELISA分析有關的變異性(回收、殘餘蛋白質A以及宿主細胞蛋白質)為±20%。所有顯示數據在分析變異性內。
圖7A為隨著時間在生產重組治療性人類酵素之生物反應器培養物中的細胞密度概況圖。在第19天後生物反應器培養物中的平均細胞密度為50-60 x106細胞/mL。
圖7B為隨著時間生產重組治療性人類酵素之生物反應器培養物的體積生產率的圖。在約第48-49天測得之兩個低滴定濃度值咸信是因為分析變異性，因為在這整個期間的細胞密度、灌注率或代謝沒有改變。
圖8是一組圖，顯示於總計9天、41個單一PCC系統循環以及164個管柱操作從單一PCC系統沖提出的重組治療性人類酵素的回收百分比、比活性(單位/mg)、聚集百分比、效力(相較於對照)、主要品質屬性(CQA)#1、CQA#2、CQA#3與CQA#4。CQA#3與CQA#4的數據點有限，但代表整個操作持續期間。CQA的標準偏差在1-9%的範圍內。
圖9是簡略顯示兩個PCCS製造系統與一個灌注培養生物反應器連結而能連續製造治療性蛋白質藥物物質。
圖10為隨著時間在生產重組治療性單株抗體之生物反應器培養物中的活細胞密度概況圖。在生物反應器培養物中的平均細胞密度為50-60 x106細胞/mL。
圖11為隨著時間生產重組治療性單株抗體之生物反應器培養物的體積生產率的圖。
圖12為蛋白質A捕獲管柱在一段有限時間窗內的即時 UV概況圖。每三個峰的每第三個峰代表管柱1出口UV吸光度，每三個峰的每第二個峰代表管柱2 UV出口吸光度，每三個峰的每第一個峰代表管柱3 UV吸光度。
圖13是Capto-S管柱在一段有限時間窗內的即時UV概況圖。黑色虛線代表饋料UV吸光度，每三個峰的每第三個峰代表管柱1出口UV吸光度，每三個峰的每第二個峰代表管柱2 UV出口吸光度，而每三個峰的每第一個峰代表管柱3 UV吸光度。
圖14是Sartobind Q-膜在一段有限時間窗內的即時UV概況圖。
圖15是參考量之重組單株抗體(道1)，以及在生產第1、10、15、20、25、30或31天(分別為道3-9)所得之兩個PCC系統的洗出液的十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺電泳凝膠。
圖16為一組圖，顯示於總計31天以及25個雙系統批次兩個PCC系統沖提出之產物的蛋白質濃度(mg/mL)、聚集百分比、效力(相較於對照)、殘餘蛋白質A濃度(ng/mg)，以及宿主細胞蛋白質濃度(ng/mg)。與聚集以及殘餘蛋白質A測量有關的變異性是因為未經最佳化Q膜操作。但是，批次與連續操作之間的趨勢相當。上面所有結果在分析變異性內。
本文提供用以製造治療性蛋白質藥物物質的整合及完全連續方法。該等方法包括，例如提供含有重組治療性蛋白質之基本上無細胞的液體培養基，接著將液體培養基饋送至第一多管柱層析系統(MCCS1)中。下一個步驟是有關於使用MCCS1捕獲液體培養基中的重組治療性蛋白質。下一個步驟涉及將含有重組治療性蛋 白質的MCCS1的洗出液連續地饋送至第二多管柱層析系統(MCCS2)中，以及使用MCCS2純化並精煉蛋白質。所得來自MCCS2的洗出液被認為是治療性蛋白質藥物物質。該等方法被整合且可以由液體培養基連續地運行成MCCS2的洗出液，其為治療性蛋白質藥物物質。本文亦提供可用來施行此等方法的例示性生物製造系統。
生物製造系統
本說明書提供用於施行本文所述方法的例示性生物製造系統。例如，可供使用的系統可包括第一多管柱層析系統(MCCS)以及第二MCCS，該第一MCCS包括一入口，該第二MCCS包括一出口。在此等系統中，該第一MCCS以及該第二MCCS彼此流體連通。該等系統也被建構成液體可通入該入口、通經該第一MCCS與第二MCCS，並且經由該出口離開該製造系統。
提供本文所述系統用以連續並有效率地由液體培養基生產治療性藥物物質。舉例而言，在將含有治療性蛋白質的液體(例如液體培養基)饋送至第一MCCS中以及由該第二MCCS的出口沖提出治療性蛋白質藥物物質(含有治療性蛋白質)之間經過的時間可以是例如介於約4小時與約48小時，包括例如介於約4小時與約40小時、介於約4小時與約35小時、介於約4小時與約30小時、介於約4小時與約28小時、介於約4小時與約26小時、介於約4小時與約24小時、介於約4小時與約22小時、介於約4小時與約20小時、介於約4小時與約18小時、介於約4小時與約16小時、介於約4小時與約14小時、介於約4小時與約12小時、介於約6小時與約12小時、介於約8小時與約12小時、介於約6小時與約20小時、介於約6小時與約18小時、介於約6小時與約14小時、介於約8小時與約16小時、介於約8 小時與約14小時、介於約8小時與約12小時、介於約10小時與約20小時、介於約10小時與約18小時、介於約10小時與約16小時、介於約10小時與約14小時、介於約12小時與約14小時、介於約10小時與約40小時、介於約10小時與約35小時、介於約10小時與約30小時、介於約10小時與約25小時、介於約15小時與約40小時、介於約15小時與約35小時、介於約15小時與約30小時、介於約20小時與約40小時、介於約20小時與約35小時，或介於約20小時與約30小時在內。在其他實例中，在將含有治療性蛋白質的液體(例如液體培養基)饋送至第一MCCS中以及由該第二MCCS的出口沖提出治療性蛋白質藥物物質(含有治療性蛋白質)之間經過的時間可以是例如大於約4小時並小於約40小時，包括例如大於約4小時並小於約39小時、約38小時、約37小時、約36小時、約35小時、約34小時、約33小時、約32小時、約31小時、約30小時、約29小時、約28小時、約27小時、約26小時、約25小時、約24小時、約23小時、約22小時、約21小時、約20小時、約19小時、約18小時、約17小時、約16小時、約15小時、約14小時、約13小時、約12小時、約11小時、約10小時、約9小時、約8小時、約7小時、約6小時、約5小時，或約4.5小時在內。
一些例示性系統不含有斷流箱。在其他系統中，該系統在整個系統中可含有最多1、2、3、4，或5個斷流箱。本文所述系統任一者在整個系統中可含有例如最多1、2、3、4，或5個斷流箱，其中各個斷流箱僅容納治療性蛋白質歷時例如介於約5分與約6小時的總時間期間，包括例如介於約5分與約5小時、約4小時、約3小時、約2小時、約1小時或約30分鐘在內。本文所述斷流箱可具有介於1mL與約300mL的容量，包括介於約1mL與約280mL、約260mL、 約240mL、約220mL、約200mL、約180mL、約160mL、約140mL、約120mL、約100mL、約80mL、約60mL、約40mL、約20mL，或約10mL在內。設置在系統中以使得液體在進入MCCS1之前進入斷流箱的任一斷流箱可具有介於1mL與MCCS1之第一管柱的負載體積約100%的容量，包括例如介於約1mL與MCCS1之第一管柱的負載體積約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約10%，或約5%在內。設置在系統中以使得液體在進入MCCS2之前(以及在離開MCCS1之後)進入斷流箱的任一斷流箱可具有介於1mL與MCCS2之第一管柱的負載體積約100%的容量，包括例如介於約1mL與MCCS2之第一管柱的負載體積約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約10%，或約5%在內。
例示性系統
圖1中提供用於本發明的系統1的非限制性實例。系統1包括第一MCCS，亦即四管柱PCCS 2，在該四管柱PCCS 2中四個管柱中的三個3、4與5施行從含有重組治療性蛋白質之液體(例如基本上無哺乳動物細胞的液體培養基)捕獲重組治療性蛋白質的單元操作，而PCCS 2中的一個管柱6施行不活化存在於來自含有重組治療性蛋白質之PCCS 2的管柱3、4與5之洗出液中的病毒的單元操作。管柱3、4與5可含有採用蛋白質A-結合捕獲機制的樹脂。管柱6能夠將液體維持在pH為約3.75下歷時約1小時。PCCS 2也具有一入口7。入口7可以是例如容許液體進入PCCS 2的孔洞。
系統1也包括第二MCCS，其為包括三個層析管柱9、10與11以及一個層析膜12的PCCS 8。PCCS 8的管柱9、10與11可含 有陽離子交換樹脂。PCCS 8的層析膜12可含有陽離子交換樹脂。PCCS 8也具有一設置在PCCS 8之管柱9、10和11與PCCS 8之層析膜12之間的流體管13。PCCS 8也具有一與該流體管13流體連通，且被建構成使得其中所含的緩衝劑被引入至存在於該流體管13中的液體的線上緩衝劑調整貯器14。PCCS 8亦包括一出口15。出口15可以是例如容許液體從PCCS 8離開的孔洞。
系統1可進一步包括設置在PCC1 2與PCC2 8之間的流體管16。系統1亦可包括與該流體管16流體連通且被建構成使得其中所含的緩衝劑可被引入至存在於該流體管16中的液體的線上緩衝劑調整貯器17。系統1亦包括設置在該流體管16中以過濾存在於流體管16中的液體的過濾器18。系統1亦可包括設置在流體管16中且被建構成容納無法饋送至PCCS 8之流體管11中的任何液體的第二第一斷流箱19。
系統1可進一步包括與入口7液體流通的泵系統20。泵系統20可包括用以將液體泵入該入口7的泵21。系統1亦可包括設置在泵21與入口7之間的流體管22。系統1亦可包括設置在流體管22中以過濾存在於流體管22中的液體(例如液體培養基)的過濾器23。系統1亦可包括設置在流體管22且被建構成斷流箱24與流體管22流體連通並能夠儲存無法進入入口7之存於在流體管22之任何液體的斷流箱24。
系統1亦可包括生物反應器25以及設置在生物反應器25與泵21之間的流體管26。過濾系統27可設置在流體管26中以過濾(例如移除細胞)存在於流體管26中的液體培養基。
其他例示性系統結構以及特徵
第一MCCS包括一入口，液體(例如基本上無細胞的液體培養基)透過該入口可通入第一MCCS。該入口可以是技藝中已知用於此用途的任何結構。其可包括容許流體管被插入而使得在流體管插入該入口後液體透過該入口而沒有液體明顯滴露至入口以外的情況下進入該第一MCCS的例如螺紋、肋材，或密封件。可用於本系統中的非限制性入口為已知且為習於技藝者所理解。
第一MCCS
第一MCCS包括至少兩個層析管柱、至少兩個層析膜，或至少一個層析管柱與至少一個層析膜，以及一個入口。例如，第一MCCS可包括總計四個層析管柱，或三個層析管柱和一個層析膜，或本文所述其他例示性MCCS任一者，或具有本文所述一或多個MCCS的例示性特徵任一者(呈任何組合)。存在於第一MCCS中的層析管柱及/或層析膜可具有一或多個本文所述例示性外型、尺寸、體積(柱床體積)，及/或單元操作任一者。
存在於第一MCCS中的層析管柱及/或層析膜可含有一或多個本文所述或技藝中已知的例示性樹脂任一者。例如，存在於第一MCCS中的一或多個層析管柱及/或層析膜中所含樹脂可以是採用捕獲機制(例如蛋白質A-結合捕獲機制、蛋白質G-結合捕獲機制、抗體-或抗體片段-結合捕獲機制、受質-結合捕獲機制、輔因子-結合捕獲機制、適體-結合捕獲機制，及/或標誌-結合捕獲機制)的樹脂。第一MCCS的層析管柱及/或層析膜的一或多者中所含樹脂可以是陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂、分子篩樹脂，或疏水性交互作用樹脂，或其任何組合。可用來純化重組治療性蛋白質之樹脂的其他實例為技藝中已知，且可包含在存在於第一MCCS中之層析管 柱及/或層析膜的一或多者。存在於第一MCCS中的層析管柱及/或層析膜可含有相同及/或不同樹脂(例如本文所述或技藝中已知用於重組蛋白質純化之樹脂任一者)。
存在於第一MCCS中的兩個或更多個層析管柱及/或層析樹脂可施行一或多個單元操作(例如捕獲重組治療性蛋白質、純化重組治療性蛋白質、精煉重組治療性蛋白質、不活化病毒、調整含有重組治療性蛋白質之液體的離子濃度及/或pH，或過濾含有重組治療性蛋白質的液體)。在非限制性實例中，第一MCCS可施行從液體(例如液體培養基)捕獲重組治療性蛋白質以及不活化存在於含有該重組治療性蛋白質之液體中之病毒的單元操作。該第一MCCS可施行本文所述或技藝中已知兩個或更多個單元操作的任何組合。
存在於第一MCCS中的層析管柱及/或層析膜可藉由切換機制(例如管柱切換機制)彼此相對連結或搬動。第一MCCS亦可包括一或多個(例如兩個、三個、四個或五個)泵(例如自動，例如自動蠕動泵)。管柱切換可以藉由偵測通過該第一MCCS之液體(例如進入第一MCCS之層析管柱及/或層析膜中一或多者的饋入物及/或來自第一MCCS之層析管柱及/或層析膜中一或多者的洗出液)中之對應某個濃度重組治療性蛋白質的UV吸光度所測得之重組治療性蛋白質濃度、特定體積的液體(例如緩衝劑)或經過的特定時間而引起。管柱切換通常代表MCCS中的至少兩個不同層析管柱及/或層析膜(例如存在於MCCS(例如第一或第二MCCS)中兩個或更多個不同層析管柱及/或層析膜)藉由該機制而容許以基本上相同的時間在該方法的至少一部份期間通過不同階段(例如平衡、加載、沖提或洗滌)。
第一MCCS可以是週期性對流層析系統(PCCS)。例如，本身為第一MCCS的該PCCS可包括四個層析管柱，其中前三個管柱施行從液體(例如液體培養基)捕獲重組治療性蛋白質的單元操作，而PCCS的第四個管柱施行不活化含有該重組治療性蛋白質之液體中的病毒的單元操作。本身為第一MCCS的該PCCS系統可採用管柱切換機制。該PCC系統可採用能夠運行至多例如四個、五個、六個、七個或八個管柱或更多管柱的經修改ÄKTA系統(GE Healthcare,Piscataway,NJ)。
第一MCCS可配備：一或多個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)UV監測器、一或多個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)閥、一或多個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)pH計，及/或一或多個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)電導計。第一MCCS亦可配備採用用來感應當管柱切換應當發生(例如基於UV吸光度、液體體積或經過時間)並使(引起)管柱切換發生之軟體(例如以Unicorn為基礎的軟體，GE Healthcare,Piscataway,NJ)的操作系統。在MCCS包括一或多個UV偵測器的實例中，該等UV偵測器可以視情況置放在第一MCCS的一或多個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)層析管柱及/或層析膜的入口處，及/或第一MCCS的一或多個層析管柱及/或層析膜的出口處。
第一MCCS可進一步包括一或多個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個、十六個、十七個、十八個、十九個、二 十個、二十一個、二十二個、二十三個或二十四個)線上緩衝劑調整貯器及/或緩衝劑貯器。在其他實例中，第一MCCS可包括一或多個(例如兩個、三個、四個、五個或六個)斷流箱，其可容納無法通入第一MCCS之一或多個層析管柱及/或層析膜的液體。本文所述系統在第一及/或第二MCCS中可含有一或多個斷流箱(例如本文所述之斷流箱)。本文所述系統的其他實例在第一MCCS或該第二MCCS中不包括斷流箱，或在整個系統中不包括斷流箱。本文所述系統的其他實例在整個系統中含有最多一個、兩個、三個、四個或五個斷流箱(例如本文所述任一斷流箱)。
第二MCCS
第二MCCS包括至少兩個層析管柱、至少兩個層析膜，或至少一個層析管柱與至少一個層析膜，以及一出口。例如，第二MCCS可包括總計四個層析管柱、三個層析管柱與一個層析膜，或本文所述其他例示性MCCS任一者，或可具有一或多個本文所述MCCS的其他例示性MCCS任一者(呈任何組合)。存在於第二MCCS中的層析管柱及/或層析膜可具有下列一或多者：本文所述外型、尺寸、體積(柱床體積)，及/或單元操作任一者。該等層析管柱及/或層析膜可含有本文所述或技藝中已知的例示性樹脂任一者。例如，存在於第二MCCS中的一或多個層析管柱及/或層析膜中所含樹脂可以是採用捕獲機制(例如蛋白質A-結合捕獲機制、蛋白質G-結合捕獲機制、抗體-或抗體片段-結合捕獲機制、受質-結合捕獲機制、輔因子-結合捕獲機制、標誌-結合捕獲機制，及/或適體-結合捕獲機制)的樹脂。可供使用的樹脂包括，例如陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂、分子篩樹脂，及疏水性交互作用樹脂。樹脂的其他實例為 技藝中已知。存在於第二MCCS中的層析管柱及/或層析膜可含有相同及/或不同樹脂(例如本文所述或技藝中已知用於重組蛋白質純化之樹脂任一者)。
存在於第二MCCS中的層析管柱及/或層析膜可施行一或多個單元操作(例如本文所述單元操作任一者或本文所述單元操作的任何組合)。在非限制性實例中，第二MCCS可施行純化來自液體之重組治療性蛋白質以及精煉存在於含有該重組治療性蛋白質之液體中的該重組治療性蛋白質的單元操作。在其他非限制性實例中，第二MCCS可施行純化存在於液體中之重組治療性蛋白質、精煉存在於液體中之重組治療性蛋白質，以及過濾含有重組治療性蛋白質的液體的操作單元。在另一個實例中，第二MCCS可施行純化存在於液體中之重組治療性蛋白質、精煉存在於液體中之重組治療性蛋白質、過濾含有重組治療性蛋白質之液體，以及調整含有重組治療性蛋白質之液體的離子濃度及/或pH的單元操作。第二MCCS可施行本文所述或技藝中已知更多單元操作之任一種兩者組合。
存在於第二MCCS中的層析管柱及/或層析膜可藉由切換機制(例如管柱切換機制)彼此相對連結或搬動。第二MCCS亦可包括一或多個(例如兩個、三個、四個或五個)泵(例如自動，例如自動蠕動泵)。管柱切換可以藉由偵測通過該第二MCCS之液體(例如進入第二MCCS之層析管柱及/或層析膜中一或多者的饋入物及/或來自第二MCCS之層析管柱及/或層析膜中一或多者的洗出液)中之對應某個濃度重組治療性蛋白質的UV吸光度所測得之重組治療性蛋白質濃度、特定體積的液體(例如緩衝劑)或經過的特定時間而引起。
第二MCCS可以是週期性對流層析系統(PCCS)。例 如，本身為第二MCCS的該PCCS可含有三個管柱施行純化來自液體之重組治療性蛋白質的單元操作，以及一個層析膜施行精煉存在於液體中之重組治療性蛋白質的單元操作。例如，施行來自液體之重組治療性蛋白質之單元操作的三個管柱可包含例如陽離子交換樹脂，而施行精煉之單元操作的層析膜可含有陽離子交換樹脂。本身為第二MCCS的PCCS可採用管柱切換機制。PCC系統可採用能夠運行至多例如四個、五個、六個、七個或八個管柱或更多管柱的經修改ÄKTA系統(GE Healthcare,Piscataway,NJ)。
第二MCCS可配備：一或多個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)UV監測器、一或多個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)閥、一或多個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)pH計，及/或一或多個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)電導計。第二MCCS亦可配備採用用來感應當管柱切換應當發生(例如基於UV吸光度、液體體積或經過時間)並使(引起)管柱切換發生之軟體(例如以Unicorn為基礎的軟體，GE Healthcare,Piscataway,NJ)的操作系統。在第二MCCS包括一或多個UV偵測器的實例中，該等UV偵測器可以視情況置放在該第二MCCS的一或多個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)層析管柱及/或層析膜的入口處，及/或第二MCCS的一或多個層析管柱及/或層析膜的出口處。
第二MCCS可進一步包括一或多個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個、十六個、十七個、十八個、十九個、二 十個、二十一個、二十二個、二十三個或二十四個)線上緩衝劑調整貯器及/或緩衝劑貯器。在其他實例中，第二MCCS可包括一或多個(例如兩個、三個、四個、五個或六個)斷流箱(例如本文所述斷流箱任一者)，其可容納無法通入第二MCCS之一或多個層析管柱及/或層析膜的液體。
第二MCCS包括一出口，治療性蛋白質藥物物質可透過該出口離開該系統。該出口可包括容許流體管被插入或小瓶被設置成容納或儲存該治療性蛋白質藥物物質的例如螺紋、肋材，或密封件。出口可含有被用來將無菌小瓶或其他儲存容器密封在出口上以容許重組蛋白質藥物產品直接流入該無菌小瓶或儲存容器中的表面。可用於本系統中的非限制性出口為已知且為習於技藝者所理解。
本文所述系統亦包括設置在該第一MCCS與該第二MCCS之間的流體管。本文所述流體管任一者可以是例如由(例如)聚乙烯、聚碳酸酯或塑膠製成的管。設置在該第一MCCS與該第二MCCS之間的流體管可進一步包括更多種呈下列任一組合的任一者：一或多種線上緩衝劑調整貯器，其與該流體管流體連通且被定位成貯存於該線上緩衝劑調整貯器中的緩衝劑被添加至存在於該流體管中的液體；斷流箱(本文所述斷流箱任一者)，其與流體管流體連通且被定位成其可容納存在於流體管中而無法被饋入至第二MCCS的過量液體；以及一或多個過濾器，其被設置在該流體管中而使得它們能夠過濾(例如移除細菌)存在於該流體管中的液體。線上緩衝劑調整貯器任一者可含有例如介於約0.5L至50L緩衝劑的體積(在25℃、15℃或10℃或低於25℃、15℃或10℃的溫度下)。
本文所述系統可視情況包括設置在第二MCCS之最終 層析管柱或層析膜與該出口之間的流體管。本文所述系統可進一步包括一或多個與設置在第二MCCS之最終層析管柱或層析膜與該出口之間的流體管流體連通的過濾器，使得該過濾器可從存在於設置在該第二MCCS之層析管柱或層析膜與該出口之間的流體管中的液體移除例如沉澱物質、顆粒物質或細菌。
本文提供之系統的一些實例亦包括與該第一MCCS的入口流體連通的生物反應器。本文所述或技藝中已知的例示性生物反應器任一者可用於本系統中。
本文提供之系統的一些實例亦包括一泵系統。泵系統可包括一或多個下者：一或多個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)泵(例如本文所述或技藝中已知的泵任一者)、一或多個(例如兩個、三個、四個或五個)過濾器(例如本文所述或如技藝中已知的過濾器任一者)、一或多個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)UV偵測器，及一或多個(例如兩個、三個、四個或五個)斷流箱(例如本文所述斷流箱任一者)。本文提供之系統的一些實例進一步包括設置在該泵與第一MCCS之入口之間的流體管(例如本文所述或技藝中已知的例示性流體管任一者)。在一些實例中，此特定流體管可包括一或多個(例如兩個、三個或四個)泵(例如本文所述或技藝中已知的泵任一者)及/或一或多個(例如兩個、三個或四個)斷流箱(例如本文所述例示性斷流箱任一者)，其中該等泵及/或斷流箱與存在於該流體管中的液體流體連通。
本文所述系統的一些實例進一步包括又一個與介於該泵與該入口之間的流體管連通的流體管，其中該又一流體管的一 端與生物反應器流體連通而另一端與介於該泵與該入口之間的流體管流體連通。此又一流體管可包括一過濾器，其能夠將細胞自從生物反應器(例如ATF細胞留滯系統)被移除的液體培養基予以移除。
本文提供的系統容許連續生產治療性蛋白質藥物物質。例如，本文提供的系統容許重組治療性蛋白質的產量百分比(由起始材料而來，例如起始液體培養基)大於約70%、大於約80%、大於約82%、大於約84%、大於約86%、大於約88%、大於約90%、大於約92%、大於約94%、大於約96%或大於約98%。本文所述系統亦可提供介於約80%至約90%、介於約82%至約90%、介於約84%至約90%、介於約84%至約88%、介於約84%至約94%、介於約82%至約92%，或介於約85%至約95%的重組治療性蛋白質(由起始材料而來，例如起始液體培養基)產量百分比。
本文所述系統亦可生產治療性蛋白質藥物物質，其含有大於約1.0mg/mL、大於約1.5mg/mL、大於約2.0mg/mL、大於約2.5mg/mL、大於約3.0mg/mL、大於約3.5mg/mL、大於約4.0mg/mL、大於約4.5mg/mL、大於約5.0mg/mL、大於約5.5mg/mL、大於約6.0mg/mL、大於約6.5mg/mL、大於約7.0mg/mL、大於約7.5mg/mL、大於約8.0mg/mL、大於約8.5mg/mL、大於約9.0mg/mL、大於約10.0mg/mL、大於約12.5mg/mL，或大於約15.0mg/mL的重組治療性蛋白質濃度。如技藝中已知，該等系統可提供週期性沖提治療性蛋白質藥物物質。治療性蛋白質藥物物質可以由本文所述系統任一者沖提出來，以例如介於約1分與約6小時的頻率(例如介於約1分與約5小時、介於約1分與約4小時、介於約1分與約3小時、介於約1分與約2小時、介於約1分與約1小時，或介於約1分與約30分)歷 時例如介於約30秒與約5小時之間的持續期間(例如介於約1分與約4小時、介於約1分與約3小時、介於約1分與約2小時、介於約1分或約1.5小時、介於約1分與約1小時、介於約1分與約30分)，端視例如該第一MCCS與該第二MCCS中所用的層析管柱及/或層析膜而定。
本文所述系統亦可在至少約5天、至少約10天、至少約15天、至少約20天、至少約25天、至少約30天、至少約35天、至少約40天、至少約45天、至少約50天、至少約55天、至少約60天、至少約65天、至少約70天、至少約75天、至少約80天、至少約85天、至少約90天、至少約95天、至少約100天、至少約110天、至少約120天、至少約130天、至少約140天、至少約150天、至少約160天、至少約170天、至少約180天、至少約190天、至少約200天、至少約210天、至少約220天、至少約230天、至少約240天、至少約250天、至少約260天、至少約270天、至少約280天、至少約290天、至少約300天、至少約310天、至少約320天、至少約330天、至少約340天、至少約350天或至少約365天的連續期間內提供重組治療性蛋白質淨產量為至少約5g/天、至少約6g/天、至少約7g/天、至少約8g/天、至少約9g/天、至少約10g/天、至少約11g/天、至少約12g/天、至少約13g/天、至少約14g/天、至少約15g/天、至少約16g/天、至少約17g/天、至少約18g/天、至少約19g/天、至少約20g/天、至少約25g/天、至少約30g/天、至少約35g/天，或至少約40g/天的治療性蛋白質藥物物質。
本文所述系統亦可連續地生產含有重組治療性蛋白質的重組蛋白質藥物物質，其具有比生產率明顯地增加(相較於由不同方法或系統所製備的其他重組蛋白質藥物物質)。例如，本系統可 達到比使用不同方法或系統(例如批次純化方法或不是整合及/或連續的方法)所生產之重組蛋白質藥物物質的比生產率還高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍、180倍、190倍或200倍的比生產率(在重組蛋白質藥物物質方面)。本系統所達到的重組蛋白質藥物物質生產力可以是至少10,000單位/L、至少15,000單位/L、至少約20,000單位/L、至少約25,000單位/L、至少約30,000單位/L、至少約35,000單位/L或至少約40,000單位/L(在第一及/或第二液體培養基中)。本系統所達致的重組蛋白質藥物物質生產力可以是至少1g/L、至少1.5g/L、至少2.0g/L、至少2.5g/L、至少3.0g/L、至少4.0g/L、至少4.5g/L或至少5.0g/L。
具有兩個或更多個子系統的生物製造系統
亦提供包括兩個或更多個子系統的生物製造系統，其各自包括：(i)含有一入口的第一多管柱層析系統(MCCS)(例如本文所述例示性第一MCCS任一者)；以及(ii)含有一出口的第二MCCS(例如本文所述例示性第二MCCS任一者)，其中第一MCCS與第二MCCS彼此流體連通，且其中該製造系統被建構成液體可通入該入口、通經第一MCCS與第二MCCS，並且經由該出口離開該製造系統；其中該兩個或更多個子系統被建構成它們各自與含有液體的單一貯器(例如生物反應器)流體連通，且來自該單一貯器的液體通入該兩個或更多個子系統的入口。
子系統的每一者可提供連續並有效率地由液體培養基生產治療性藥物物質。舉例而言，對於各個子系統來說，將含有 治療性蛋白質之液體(例如液體培養基)饋送至(子系統的)第一MCCS並從(子系統的)第二MCCS之出口沖提出(含有治療性蛋白質之)治療性蛋白質藥物物質之間所經過的時間可以是例如介於約4小時與約48小時，包括例如介於約4小時與約40小時、介於約4小時與約35小時、介於約4小時與約30小時、介於約4小時與約28小時、介於約4小時與約26小時、介於約4小時與約24小時、介於約4小時與約22小時、介於約4小時與約20小時、介於約4小時與約18小時、介於約4小時與約16小時、介於約4小時與約14小時、介於約4小時與約12小時、介於約6小時與約12小時、介於約8小時與約12小時、介於約6小時與約20小時、介於約6小時與約18小時、介於約6小時與約14小時、介於約8小時與約16小時、介於約8小時與約14小時、介於約8小時與約12小時、介於約10小時與約20小時、介於約10小時與約18小時、介於約10小時與約16小時、介於約10小時與約14小時、介於約12小時與約14小時、介於約10小時與約40小時、介於約10小時與約35小時、介於約10小時與約30小時、介於約10小時與約25小時、介於約15小時與約40小時、介於約15小時與約35小時、介於約15小時與約30小時、介於約20小時與約40小時、介於約20小時與約35小時，或介於約20小時與約30小時在內。在其他實例中，對於各個子系統來說，將含有治療性蛋白質的液體(例如液體培養基)饋送至(子系統的)第一MCCS以及由(子系統的)該第二MCCS的出口沖提(含有治療性蛋白質之)治療性蛋白質藥物物質之間經過的時間可以是例如大於約4小時並小於約40小時，包括例如大於約4小時並小於約39小時、約38小時、約37小時、約36小時、約35小時、約34小時、約33小時、約32小時、約31小時、約30小時、約29小時、約28小時、 約27小時、約26小時、約25小時、約24小時、約23小時、約22小時、約21小時、約20小時、約19小時、約18小時、約17小時、約16小時、約15小時、約14小時、約13小時、約12小時、約11小時、約10小時、約9小時、約8小時、約7小時、約6小時、約5小時，或約4.5小時在內。
一些例示性系統子系統不含有斷流箱。其他者在整個子系統中可包含最多1、2、3、4，或5個斷流箱。子系統任一者在整個子系統中可包括最多1、2、3、4，或5個斷流箱，其中各個斷流箱僅容納治療性蛋白質歷時例如介於約5分與少於約6小時的總時間期間，包括例如介於約5分與約5小時、約4小時、約3小時、約2小時、約1小時或約30分在內。本文所述斷流箱可具有介於1mL與約300mL的容量，包括例如介於1mL與約280mL、約260mL、約240mL、約220mL、約200mL、約180mL、約160mL、約140mL、約120mL、約100mL、約80mL、約60mL、約40mL、約20mL，或約10mL在內。設置在子系統中以使得液體在進入(子系統的)MCCS1之前進入斷流箱的任一斷流箱可具有例如介於1mL與(子系統的)第一MCCS之第一管柱的負載體積100%的容量，包括例如介於1mL與(子系統)第一MCCS之第一管柱的負載體積約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約10%，或約5%在內。設置在子系統中以使得液體在進入(子系統任一者的)MCCS2之前(以及在液體離開子系統的MCCS1之後)進入斷流箱的任一斷流箱可具有介於1mL與(子系統的)第二MCCS之第一管柱的負載體積100%的容量，包括例如介於1mL與(子系統的)第二MCCS之第一管柱的負載體積約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、 約10%，或約5%在內。
上述第一MCCS以及第二MCCS系統的特徵(例如層析管柱類型和數量、層析膜類型和數量、體積、尺寸、樹脂與單元操作、流速、泵、線上緩衝劑調整、UV偵測器、一或多個過濾器以及管柱切換機制)的任一種組合可用於兩個或更多個子系統的第一MCCS與第二MCCS中。例如，兩個或更多個子系統的第一MCCS與第二MCCS基本上可以是相同的。在其他實例中，兩個或更多個子系統與說明實例之系統中所述者相同。
滑架
本文所述生物製造系統任一者可設置在一滑架上。例如，包括至少一生物反應器、第一MCCS，以及第二MCCS的系統可以設置在一個單獨滑架上。在本文所述系統任一者的其他實例中，第一MCCS可以設置在第一滑架上而第二MCCS可以設置在第二滑架上。本文所述系統任一者的其他實例包括設置在一個單獨滑架上第一MCCS以及第二MCCS，或整個系統設置在一個單獨滑架上。
本文所述生物製造系統的一些實例包括兩個或更多個子系統，其各自包括：(i)含有一入口的第一多管柱層析系統(MCCS)(例如本文所述例示性第一MCCS任一者)；以及(ii)含有一出口的第二MCCS(例如本文所述例示性第二MCCS任一者)，其中該第一MCCS與第二MCCS彼此流體連通，且其中該製造系統被建構成液體可通入該入口、通經該第一MCCS與第二MCCS，並且經由該出口離開該製造系統；其中該兩個或更多個子系統被建構成它們各自與含有液體的單一貯器(例如生物反應器)流體連通，且來自該貯器的液體通入該兩個或更多個子系統的入口。在該等系統中，整個系統 可以設在滑架上；貯器與一或多個子系統可以在一個單獨滑架上；兩個或更多個子系統的每一者可各自設在其本身的滑架上；或兩個或更多個子系統可設置在一個單獨滑架上。在本文所述系統任一者中，含有包含重組治療性蛋白質之液體培養基的貯器(例如塑膠袋)、斷流箱(例如本文所述斷流箱任一者)，或生物反應器可設置在其本身的滑架上。
滑架的非限制性實例包括兩個或更多個輪、滑輪、運輸板或滑板，其為使得移動成為可能的一或多個結構。如同為習於技藝者所知，滑架可設置在任何固體材料(例如木材、金屬或塑膠)上。適當的滑架可得自於Wunderlieh-Malec(Minnetonka,MN)以及Renfrow Brothers(Spartenburg,SC)。在採用超過一個滑架的系統中，該等滑架可以設計成安裝在一起(例如經由栓、轉鑰、螺栓或嵌夾裝置而安裝在一起)。
用以製造治療性蛋白質藥物物質的整合及連續方法
本文提供用以製造治療性蛋白質藥物物質的整合及連續方法。此等方法包括提供含有重組治療性蛋白質之基本上無細胞的液體調配物，其中該液體培養基被饋送至第一多管柱層析系統(MCCS1)；使用MCCS1捕獲液體培養基中的重組治療性蛋白質，其中含有重組治療性蛋白質的MCCS1的洗出液被連續地饋送至第二多管柱層析系統(MCCS2)中；以及使用MCCS2純化並精煉重組治療性蛋白質，其中來自MCCS2的洗出液為治療性蛋白質藥物物質，且該方法被整合且由液體培養基連續地運行成MCCS2的洗出液，而洗出液為治療性蛋白質藥物物質。
本文所述方法提供連續並有效率地由液體培養基生 產治療性藥物物質。舉例而言，在將含有治療性蛋白質的液體(例如液體培養基)饋送至第一MCCS以及由該第二MCCS沖提出治療性蛋白質藥物物質(含有治療性蛋白質)之間經過的時間可以是例如介於約4小時與約48小時，包括例如介於約4小時與約40小時、介於約4小時與約35小時、介於約4小時與約30小時、介於約4小時與約28小時、介於約4小時與約26小時、介於約4小時與約24小時、介於約4小時與約22小時、介於約4小時與約20小時、介於約4小時與約18小時、介於約4小時與約16小時、介於約4小時與約14小時、介於約4小時與約12小時、介於約6小時與約12小時、介於約8小時與約12小時、介於約6小時與約20小時、介於約6小時與約18小時、介於約6小時與約14小時、介於約8小時與約16小時、介於約8小時與約14小時、介於約8小時與約12小時、介於約10小時與約20小時、介於約10小時與約18小時、介於約10小時與約16小時、介於約10小時與約14小時、介於約12小時與約14小時、介於約10小時與約40小時、介於約10小時與約35小時、介於約10小時與約30小時、介於約10小時與約25小時、介於約15小時與約40小時、介於約15小時與約35小時、介於約15小時與約30小時、介於約20小時與約40小時、介於約20小時與約35小時，或介於約20小時與約30小時在內。在其他實例中，在將含有治療性蛋白質的液體(例如液體培養基)饋送至第一MCCS中以及由該第二MCCS沖提出治療性蛋白質藥物物質(含有治療性蛋白質)之間經過的時間是例如約大於4小時並小於約40小時，包括例如大於約4小時並小於約39小時、約38小時、約37小時、約36小時、約35小時、約34小時、約33小時、約32小時、約31小時、約30小時、約29小時、約28小時、約27小時、約26小時、約25小時、約24小時、 約23小時、約22小時、約21小時、約20小時、約19小時、約18小時、約17小時、約16小時、約15小時、約14小時、約13小時、約12小時、約11小時、約10小時、約9小時、約8小時、約7小時、約6小時、約5小時，或約4.5小時在內。
一些例示性方法不採用容納步驟(例如在整個方法中不使用貯器(例如斷流箱))。其它者在整個系統中可採用最多1、2、3、4，或5個貯器(例如斷流箱)。本文所述方法任一者在整個系統中可採用最多1、2、3、4，或5個貯器(例如斷流箱)，其中各個斷流箱僅容納治療性蛋白質歷時例如介於約5分且小於約6小時的總時間期間，包括例如介於約5分與約5小時、約4小時、約3小時、約2小時、約1小時或約30分在內。本文所述方法中使用的貯器任一者(例如斷流箱)可具有介於1mL與約300mL的容量，包括例如介於1mL與約280mL、約260mL、約240mL、約220mL、約200mL、約180mL、約160mL、約140mL、約120mL、約100mL、約80mL、約60mL、約40mL、約20mL，或約10mL(在內)。在液體進入第一MCCS之前，容納液體的任一貯器(例如使用的斷流箱(在本文所述方法任一者中))可具有例如介於1mL與第一MCCS之第一管柱的負載體積約100%的容量，包括例如介於1mL與第一MCCS之第一管柱的負載體積約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約10%，或約5%在內。在液體進入第二MCCS之前(以及在液體離開第一MCCS之後)，容納液體的任一貯器(例如使用的斷流箱(在本文所述方法任一者中))可具有例如介於1mL與第二MCCS之第一管柱的負載體積約100%的容量，包括例如介於1mL與第二MCCS之第一管柱的負載體積約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、 約40%、約30%、約20%、約10%，或約5%在內。
下面詳細說明此等方法的各種其他態樣並可呈本文提供方法中任何組合來使用而沒有限制。下面說明所提供方法的例示性態樣；但習於技藝者將理解到，可增加額外步驟至本文所述方法且其他材料可用於施行本文所述方法的任一步驟。
液體培養基
含有重組治療性蛋白質之基本上無細胞的液體培養基可衍生自任何來源。例如，液體培養基可以得自於重組細胞培養物(例如重組細菌、酵母菌或哺乳動物細胞培養物)。液體培養基可得自於饋料批次細胞(例如哺乳動物細胞)培養物(例如含有分泌重組治療性蛋白質之哺乳動物細胞培養物的饋料批次生物反應器)或灌注細胞(例如哺乳動物細胞)培養物(例如含有分泌重組治療性蛋白質之哺乳動物培養物的灌注生物反應器)。液體培養基也可以是來自分泌重組治療性蛋白質之細菌或酵母菌細胞培養物的經澄清液體培養基。
得自於重組細胞培養物的液體培養基可以經過濾或澄清以獲得基本上無細胞及/或病毒的液體培養基。用以過濾或澄清液體培養基以移除細胞的方法為技藝中已知(例如0.2-μm過濾以及使用Alternating Tangential Flow(ATF)TM系統的過濾)。重組細胞亦可從液體培養基中使用離心而被移除並且移除基本上無細胞之液體培養基的上清液，或藉由容許細胞沉積至含有液體培養基之容器(例如生物反應器)的重力底部，並且移除與沉積重組細胞遠隔的液體培養基(基本上無細胞的液體培養基)。
液體培養基可得自於生產本文所述重組治療性蛋白 質任一者的重組細胞(例如重組細菌、酵母菌或哺乳動物細胞)培養物。本文所述方法任一者的一些實例可進一步包括培養生產重組治療性蛋白質之重組細胞(例如重組細菌、酵母菌或哺乳動物細胞)的步驟。
液體培養基可以是本文所述或技藝中已知任一類型的液體培養基。例如，液體培養基可選自下列之群：無動物衍生組分的液體培養基、無血清液體培養基、含血清液體培養基、化學限定液體培養基，以及無蛋白質液體培養基。在本文所述方法任一者中，得自於培養物的液體培養基可以在其被饋送至第一MCCS(例如第一PCCS)之前藉由添加第二液體(例如緩衝劑)而被稀釋。
含有重組治療性蛋白質之基本上無細胞的液體培養基可以在將液體培養基饋送至第一MCCS(例如第一PCCS)之前被儲存(例如在低於約15℃的溫度下(例如低於約10℃、低於約4℃、低於約0℃、低於約-20℃、低於約-50℃、低於約-70℃，或低於約-80℃)歷時至少1天(例如至少約2天、至少約5天、至少約10天、至少約15天、至少約20天，或至少約30天)。或者，在一些實例中，液體培養基直接從生物反應器被饋送至第一MCCS(例如第一PCCS)中(例如在過濾或澄清步驟之後直接從生物反應器饋送至第一MCCS(例如第一PCCS)中)。
重組治療性蛋白質
可藉由本文提供方法生產之重組治療性蛋白質的非限制性實例包括免疫球蛋白(包括輕鏈與重鏈免疫球蛋白、抗體，或抗體片段(例如本文所述抗體片段任一者))、酵素(例如半乳糖苷酶(例如α-半乳糖苷酶)、Myozyme或Cerezyme)、蛋白質(例如人類紅血 球生成素、腫瘤壞死因子(TNF)或干擾素α或β)，或免疫原性或抗原性蛋白質或蛋白質片段(例如用於疫苗中的蛋白質)。重組治療性蛋白質可以是經工程化抗原結合多肽，其含有至少一個多功能重組蛋白質骨架(參見例如Gebauer et al.,Current Opin.Chem.Biol.13：245-255,2009；以及美國專利申請公開案第2012/0164066號(以其整體併入本文做為參考資料)中所述的重組抗原-結合蛋白)。本身為抗體的重組治療性蛋白質的非限制性實例為：帕尼單抗、奧馬珠單抗、阿巴伏單抗、阿昔單抗、阿妥蘇單抗(actoxumab)、阿達木單抗、阿德木單抗、阿非莫單抗、阿托珠單抗、培化阿珠單抗、培化阿珠單抗、阿來組單抗、阿羅古單抗(alirocumab)、阿妥莫單抗、阿馬妥昔單抗(amatuximab)、阿馬妥昔單抗、安那莫單抗、安廬珠單抗、阿泊珠單抗、阿西莫單抗、提諾單抗(atinumab)、托珠單抗、巴昔李單抗(basiizimab)、貝妥莫單抗、貝利木單抗、貝伐單抗、貝西索單抗、貝羅托昔單抗(bezlotoxumab)、比西單抗、卡那單抗、賽妥珠單抗、西妥木單抗、達利珠單抗、地諾單抗、登蘇單抗(densumab)、依庠珠單抗、依決洛單抗、依法利珠單抗、依芬古單抗、依帕珠單抗、厄馬索單抗、埃達珠單抗、芬妥木單抗、戈利木單抗、替伊莫單抗、伊戈伏單抗、引戈妥單抗(imgatuzumab)、英利昔單抗、伊諾莫單抗、伊諾妥珠單抗(inotuzumab)、拉貝珠單抗、萊比其佐單抗(lebrikizumab)、美妥莫單抗(moxetumomab)、那他珠單抗、奧濱佐單抗(obinutuzumab)、奧戈伏單抗、帕利珠單抗、帕尼單抗、帕妥珠單抗、藍尼單抗、利妥昔單抗、托珠單抗、托西莫單抗、他洛奇諾單抗(tralokinumab)、圖可佐單抗(tucotuzumab)、曲妥珠單抗、維妥珠單抗、札魯木單抗，以及札妥昔單抗(zatuximab)。可由本文所述 方法生產之重組治療性抗體的其他實例為技藝中已知。可由本發明方法生產之重組治療性蛋白質的其他非限制性實例包括：重组阿葡糖苷酶α、拉隆酶(laronidase)、阿巴西普、加硫酶、促黃體素α、抗血友病因子、半乳糖苷酶β、干擾素β-1a、達貝泊汀α、替奈普酶、依那西普、凝血因子IX、濾泡刺激素、干擾素β-1a、依米格西酶、鏈道酶α、依伯汀α、胰島素或胰島素類似物、美卡舍明、因子VIII、因子VIIa、抗凝血酶III、蛋白質C、人類白蛋白、紅血球生成素、顆粒球群落刺激因子、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子、介白素-11、拉隆酶、艾杜硫酶、加硫酶、α-1-蛋白酶抑制劑、乳糖酶、腺苷去胺酶、組織胞漿原活化劑、甲狀腺促激素α(例如Thyrogen®)與阿替普酶。可由本發明方法生產之重組蛋白質的其他實例包括酸性α-葡萄糖苷酶、重组阿葡糖苷酶α(例如Myozyme®與Lumizyme®)、α-L-艾杜糖醛酸酶(例如Aldurazyme®)、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性β-半乳糖苷酶、β-葡萄醣醛酸酶、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶、α-N-乙醯基半乳糖胺酶、酸性脂酶、溶小體酸性神經醯胺酶、酸性鞘磷脂酶、β-葡萄糖苷酶(例如Cerezyme®與Ceredase®)、半乳糖基神經醯胺酶、α-半乳糖苷酶-A(例如Fabrazyme®)、酸性β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、神經胺酸酶、己醣胺酶A與己醣胺酶B。
經分泌可溶性重組治療性蛋白質可以由液體培養基(例如第一及/或第二液體培養基)藉由移除或以其他方式在物理上將液體培養基與細胞分離(例如哺乳動物細胞)而回收。用以將液體培養基從細胞(例如哺乳動物細胞)移除的各種不同方法為技藝中已知，包括例如離心、過濾、吸及/或抽吸。經分泌重組治療性蛋白質 接著可以被回收並進一步使用各種生化技術由液體培養基中純化出來，生化技術包括各種類型層析(例如親和力層析、分子篩層析、陽離子交換層析，或陰離子交換層析)及/或過濾(例如分子量截止過濾)。
多管柱層析系統
本文所述方法包括使用兩個或更多個(例如兩個、三個、四個、五個或六個)多管柱層析系統(MCCS)。MCCS可包括兩個或更多個層析管柱、兩個或更多個層析膜，或至少一個層析管柱與至少一個層析膜的組合。在非限制性實例中，MCCS(例如本文方法任一者中所述的第一及/或第二MCCS)可包括四個層析管柱、三個層析管柱與一個層析膜、三個層析管柱、兩個層析管柱、兩個層析膜，以及兩個層析管柱與一個層析膜。層析管柱及/或層析膜之組合的其他實例可被習於技藝者預見使用於MCCS(例如第一及/或第二MCCS)而不受到限制。存在於MCCS中的個別層析管柱及/或層析膜可以是相同(例如具有相同外型、體積、樹脂、捕獲機制以及單元操作)，或可以是不同(例如具有不同外型、體積、樹脂、捕獲機制以及單元操作之一或多者)。存在於MCCS(例如第一及/或第二MCCS)中的個別層析管柱及/或層析膜可以施行相同單元操作(例如捕獲、純化或精煉的單元操作)或不同單元操作(例如選自例如捕獲、純化、精煉、不活化病毒、調整含重組治療性蛋白質之液體的離子濃度及/或pH，以及過濾之群的不同單元操作)。
可存在於MCCS中(例如存在於第一及/或第二MCCS中)的一或多個層析管柱可具有例如至少約2mL、至少約5mL、至少約10mL、至少約15mL、至少約20mL、至少約25mL、至少約30 mL、至少約35mL、至少約40mL、至少約45mL、至少約50mL、至少約55mL、至少約60mL、至少約65mL、至少約70mL、至少約75mL、至少約80mL、至少約85mL、至少約90mL、至少約95mL，或至少約100mL的樹脂體積。存在於MCCS中(例如存在於第一及/或第二MCCS中)的一或多個層析管柱可具有介於約2mL與約100mL、介於約2mL與約90mL、介於約2mL與約80mL、介於約2mL與約70mL、介於約2mL與約60mL、介於約2mL與約50mL、介於約5mL與約50mL、介於約2mL與約45mL、介於約5mL與約45mL、介於約2mL與約40mL、介於約5mL與約40mL、介於約2mL與約35mL、介於約5mL與約35mL、介於約2mL與約30mL、介於約5mL與約30mL、介於約2mL與約25mL、介於約5mL與約25mL、介於約15mL與約30mL、介於約10mL與約60mL、介於約10mL與約50mL，以及介於約15mL與約50mL的樹脂體積。本文所述方法任一者中使用的MCCS(例如第一及/或第二MCCS)的一或多個層析管柱可具有基本上相同的樹脂體積或可具有不同樹脂體積。用於MCCS(例如第一及/或第二MCCS)的一或多個層析管柱的流速可以是例如介於約0.2mL/分至約25mL/分(例如介於約0.2mL/分至約20mL/分、介於約0.5mL/分至約20mL/分、介於約0.2mL/分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約10mL/分、介於約0.5mL/分與約14mL/分、介於約1.0mL/分與約25.0mL/分、介於約1.0mL/分與約15.0mL/分)。
MCCS(例如第一及/或第二MCCS)的一或多個層析管柱可具有基本上相同外型或可具有基本上不同外型。例如，MCCS中(例如第一及/或第二MCCS中)的一或多個層析管柱可具有基本上 為圓柱或可具有基本上橢圓柱的相同外型。
存在於MCCS中(例如存在於第一及/或第二MCCS中)的一或多個層析膜可具有例如介於約1mL至約500mL(例如介於約1mL至約475mL、介於約1mL至約450mL、介於約1mL至約425mL、介於約1mL至約400mL、介於約1mL至約375mL、介於約1mL至約350mL、介於約1mL至約325mL、介於約1mL至約300mL、介於約1mL至約275mL、介於約1mL至約250mL、介於約1mL至約225mL、介於約1mL至約200mL、介於約1mL至約175mL、介於約1mL至約150mL、介於約1mL至約125mL、介於約1mL至約100mL、介於約2mL至約100mL、介於約5mL至約100mL、介於約1mL至約80mL、介於約2mL至約80mL、介於約5mL至約80mL、介於約1mL至約60mL、介於約2mL至約60mL、介於約5mL至約60mL、介於約1mL至約40mL、介於約2mL至約40mL、介於約5mL至約40mL、介於約1mL至約30mL、介於約2mL至約30mL、介於約5mL至約30mL、介於約1mL與約25mL、介於約2mL與約25mL、介於約1mL與約20mL、介於約2mL與約20mL、介於約1mL與約15mL、介於約2mL與約15mL、介於約1mL與約10mL，或介於約2mL與約10mL)的柱床體積。
在使用本文所述方法任一者中兩個或更多個MCCS期間，可採用一或多種(例如三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種、十三種、十四種、十五種、十六種、十七種、十八種、十九種、二十種、二十一種、二十二種、二十三種或二十四種)不同類型的緩衝劑。如技藝中已知，用於本文所述方法中之兩個或更多個MCCS所用的一或多種類型緩衝劑將取決於存 在於兩個或更多個MCCS(例如第一與第二MCCS)之層析管柱及/或層析膜中的樹脂、重組治療性蛋白質及由兩個或更多個MCCS之特定層析管柱及/或層析膜所施行的單元操作(例如本文所述例示性單元操作任一者)。在使用本文所述方法任一者中兩個或更多個MCCS期間，所用緩衝劑的體積與類型亦將由習於技藝者所決定(例如在下面更詳細討論)。例如，在使用本文所述方法任一者中兩個或更多個MCCS期間，所用緩衝劑的體積與類型可以被選定以使得下列重組蛋白質藥物產物的一或多者最佳化：重組治療性蛋白質的總產量；重組治療性蛋白質的活性、重組治療性蛋白質的純度，以及將生物汙染物從含有重組治療性蛋白質的液體移除(例如不存在活性病毒、分枝桿菌、酵母菌、細菌或哺乳動物細胞)。
第一及/或第二MCCS可以是週期性對流層析系統(PCCS)。PCCS可以例如包括兩個或更多個層析管柱(例如三個管柱或四個管柱)，切換管柱以容許重組治療性蛋白質從兩個或更多個層析管柱的連續沖提。PCCS可包括兩個或更多個層析管柱、兩個或更多個層析膜，或至少一個層析管柱與至少一個層析膜。管柱操作大體上是由加載、洗滌、沖提，以及再生步驟所組成。在PCCS中，多管柱可用來以不連續與連續的循環形式進行相同步驟。因為管柱是串聯地操作，所以來自一個管柱的溢流以及洗滌物被另一個管柱所捕獲。PCCS的這個獨有特性容許樹脂的負載接近其靜態結合力而非動態結合力，如同通常在批次模式層析期間。在含有三個管柱之PCCS中所用的三管柱切換技術的實例顯示於圖3中。一個循環被定義為三個完整的管柱操作，得到在管柱切換技術中所用三個管柱每一者的沖提池。在循環中所有步驟完成之後，重新開始循環。因為 連續循環以及沖提，進入PCCS的液體被連續地處理，且連續地生成含有重組治療性蛋白質的洗出液。
為了在PCCS循環中從一個步驟推進到另一個步驟，諸如在圖3中所示的例示性循環，採用管柱切換策略。在圖3中所示例示性PCCS系統中，該管柱切換方法採用三個管柱的每個管柱兩種自動切換操作，其中第一個與起始產物貫流有關，而第二個與管柱飽和同時發生。決定管柱切換操作何時應發生的決定是依據監控PCCS中的各個層析管柱之洗出液中的重組治療性蛋白質濃度(例如藉由UV監控來施行監控)來決定。例如，管柱切換可以藉由能夠在回饋控制的情況下線上測量產物濃度的任一種PAT工具來決定。PAT工具能夠在回饋控制的情況下即時線上測量產物濃度。
圖4描述在饋料入口與管柱出口之間根據UV吸光度差異(△UV)之例示性PCCS中的管柱切換實例。例如，在管柱加載期間(步驟1；圖3)，當吸光度穩定時，PCC控制系統測定不純物基線位準。當產物貫穿時(步驟2；圖3)，出口UV訊號增加超過不純物基線。在這個時候，若△UV已達到預定閾值(例如產物的3%貫流)，則管柱1的溢流被導向管柱2而非廢料(t1；圖4)。當管柱1接近產物飽和且△UV已達到預定值(t2；圖4)，則饋料切換至管柱2。PCCS中所用管柱切換策略容許均勻加載管柱而與饋料產物濃度和容量無關。依據在來自各管柱之洗出液中所偵測的重組蛋白質位準，可設計類似的管柱切換。如技藝中已知，管柱切換也可以依據通過第一或第二MCCS中一或多個層析管柱及/或層析膜的時間或液體(例如緩衝劑)數量來設計。
在PCCS中，可以降低重組治療性蛋白質在存在於 PCCS中各層析管柱及/或層析膜的滯留時間(RT)而無需增加管柱/模尺寸，因為來自第一管柱/膜的貫流可以在PCCS中的另一個管柱/膜上被捕獲。可以設計連續處理系統藉由改變管柱/膜體積(V)以及RT使用等式V=D*RT來處理呈任何灌注率(D)的液體培養基。
本文所述方法中所用可由至少兩個MCCS(例如第一及/或第二MCCS)施行的一或多個單元操作包括例如捕獲重組治療性蛋白質、不活化存在於含有重組治療性蛋白質之液體中的病毒、純化重組治療性蛋白質、精煉重組治療性蛋白質、容納含有重組治療性蛋白質的液體(使用本文所述例示性斷流箱任一者)、由含有重組治療性蛋白值之液體過濾或移除顆粒物質及/或細胞，以及調整含有重組治療性蛋白質之液體的離子濃度及/或pH。
捕獲的單元操作可使用一或多個MCCS(例如第一及/或第二MCCS)來施行，該一或多個MCCS包括至少一個層析管柱及/或例如採用捕獲機制的層析樹脂。捕獲機制的非限制性實例包括蛋白質A-結合捕獲機制、抗體-或抗體片段-結合捕獲機制、受質-結合捕獲機制、適體-結合捕獲機制、標誌-結合捕獲機制(例如聚-His標誌為基礎的捕獲機制)，以及輔因子-結合捕獲機制。捕獲也可以使用可用來施行陽離子交換或陰離子交換層析的樹脂，或分子篩層析來施行。本文說明可用來捕獲重組治療性蛋白質的非限制性樹脂。可用來捕獲重組治療性蛋白質之樹脂的其他實例為技藝中已知。
不活化存在於含有重組治療性蛋白質之液體中的病毒的單元操作可以使用一或多個MCCS(例如第一及/或第二MCCS)來施行，該一或多個MCCS包括例如一個層析管柱、一個層析膜，或能夠在介於約3.0至5.0的pH(例如介於約3.5至約4.5、介於約3.5至 約4.25、介於約3.5至約4.0、介於約3.5至約3.8或約3.75)下培育含有重組治療性蛋白質之液體歷時至少30分期間(例如介於約30分至1.5小時期間、介於約30分至1.25小時期間、介於0.75小時至1.25小時期間，或約1小時期間)的容納箱。
純化重組蛋白質的單元操作可以使用一或多個MCCS(例如第一及/或第二MCCS)來施行，該一或多個MCCS包括例如含有樹脂(例如採用捕獲系統)的層析管柱或層析膜。捕獲機制的非限制性實例包括蛋白質A-結合捕獲機制、抗體-或抗體片段-結合捕獲機制、受質-結合捕獲機制、適體-結合捕獲機制、標誌-結合捕獲機制(例如聚-His標誌為基礎的捕獲機制)，以及輔因子-結合捕獲機制。純化也可以使用可用來施行陽離子交換或陰離子交換層析的樹脂，或分子篩層析來施行。本文說明可用來純化重組治療性蛋白質的非限制性樹脂。可用來純化重組治療性蛋白質之樹脂的其他實例為技藝中已知。
精煉重組蛋白質的單元操作可以使用一或多個MCCS(例如第一及/或第二MCCS)來施行，該一或多個MCCS包括例如含有樹脂的層析管柱或層析膜，例如其可用於施行陽離子交換、陰離子交換或分子篩層析。本文說明可用來精煉重組治療性蛋白質的非限制性樹脂。可用來精煉重組治療性蛋白質的樹脂的其他實例為技藝中已知。
容納含有重組治療性蛋白質的液體的單元操作可使用MCCS(例如第一及/或第二MCCS)來施行，該MCCS包括至少一貯器(例如斷流箱)或在第一與第二MCCS合併時包括至多1、2、3、4或5個貯器(例如斷流箱)。例如，貯器(等)(例如可用來達到此單元操 作之斷流箱可各自具有介於約1mL至約1L的體積(例如介於約1mL至約800mL、介於約1mL至約600mL、介於約1mL至約500mL、介於約1mL至約400mL、介於約1mL至約350mL、介於約1mL至約300mL、介於約10mL與約250mL、介於約10mL與約200mL、介於約10mL與約150mL以及介於約10mL至約100mL))。本文所述方法中所用貯器(例如斷流箱)可具有例如介於1mL與約300mL的容積，包括例如介於1mL與約280mL、約260mL、約240mL、約220mL、約200mL、約180mL、約160mL、約140mL、約120mL、約100mL、約80mL、約60mL、約40mL、約20mL或約10mL在內。在液體進入第一MCCS之前，(本文所述方法任一者中)用來容納液體之貯器(例如斷流箱)任一者可具有例如介於1mL與第一MCCS之第一管柱的負載體積約100%的容量，包括介於約1mL與第一MCCS之第一管柱的負載體積約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約10%，或約5%在內。在液體進入第二MCCS之前(以及在液體離開第一MCCS之後)，用來容納液體的貯器(例如斷流箱)任一者可具有例如介於1mL與第二MCCS之第一管柱的負載體積約100%的容量，包括介於約1mL與第二MCCS之第一管柱的負載體積約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約10%，或約5%在內。
貯器(例如斷流箱)可各自容納含有重組治療性蛋白質的液體歷時至少10分(例如至少20分、至少30分、至少1小時、至少2小時、至少4小時或至少6小時)。在其他實例中，貯器(例如斷流箱)僅容納治療性蛋白質歷時例如介於約5分且少於約6小時的總時間期間，包括例如介於約5分與約5小時、約4小時、約3小時、約2小時、 約1小時或約30分在內。貯器(例如斷流箱)可用來同時容納及冷藏(例如在低於25℃、低於15℃或低於10℃的溫度下)含有重組治療性蛋白質的液體。貯器可具有任一種外型，包括圓柱、橢圓柱，或大約矩形密封性且非可通透袋。
過濾含有重組治療性蛋白質之液體的單元操作可使用MCCS(例如第一及/或第二MCCS)來施行，MCCS包括例如過濾器，或含有分子篩樹脂的層析管柱或層析膜。如技藝中已知，廣泛不同的次微米過濾器(例如具有孔徑小於1μm、小於0.5μm、小於0.3μm、小於0.2μm、小於100nm、小於80nm、小於60nm、小於40nm、小於20nm，或小於10nm)的過濾器為技藝中可取得，其能夠移除任何沉澱物質及/或細胞(例如沉澱、未折疊蛋白質；沉澱、非所要宿主細胞蛋白質；沉澱脂質；細菌；酵母菌細胞；真菌細胞、分枝桿菌；及/或哺乳動物細胞)。具有孔徑約0.2μm或小於0.2μm的過濾器已知有效將細菌從含有重組治療性蛋白質的液體移除。如技藝中已知，含有分子篩樹脂的層析管柱或層析膜也可用於MCCS(例如第一及/或第二MCCS)中來施行過濾含有重組治療性蛋白質之液體的單元操作。
調整含有重組治療性蛋白質之液體的離子濃度及/或pH的單元操作可使用MCCS(例如第一及/或第二MCCS)來施行，MCCS包括並採用緩衝劑調整貯器(例如線上緩衝劑調整貯器)，其將新緩衝液添加至含有重組治療性蛋白質的液體中(例如介於單一MCCS的管柱間，或在倒數第二個MCCS(例如第一MCCS)的最後一個管柱與在含有重組治療性蛋白質的液體被饋送至下一個MCCS(例如第二MCCS)的第一個管柱之前)。如技藝中可預見，線上緩衝 劑調整貯器可以是任何尺寸(例如大於100mL)且可含有任何緩衝液(例如具有下列一或多者的緩衝液：相較於含有重組治療性蛋白質之液體pH增加或降低、相較於含有重組治療性蛋白質之液體離子(例如鹽類)濃度增加或降低，及/或與重組治療性蛋白質競爭結合至存在於MCCS(例如第一或第二MCCS)之至少一個層析管柱或至少一個層析膜中的樹脂的試劑濃度增加或降低)。
第一及/或第二MCCS可施行兩個或更多個單元操作。例如，第一及/或第二MCCS可各自施行至少下列單元操作：捕獲重組治療性蛋白質且不活化存在於含有該重組治療性蛋白質之液體中的病毒；捕獲重組治療性蛋白質、不活化存在於含有該重組治療性蛋白質之液體中的病毒，以及調整含有該重組治療性蛋白質之液體的離子濃度及/或pH；純化重組治療性蛋白質並精煉重組治療性蛋白質；純化重組治療性蛋白質、精煉重組治療性蛋白質以及過濾含有重組治療性蛋白質的液體或將沉澱物及/或顆粒物質從含有重組治療性蛋白質的液體移除；以及純化重組治療性蛋白質、精煉重組治療性蛋白質、過濾含有重組治療性蛋白質的液體或將沉澱物及/或顆粒物質從含有重組治療性蛋白質的液體移除，以及調整含有該重組治療性蛋白質之液體的離子濃度及/或pH。
捕獲重組治療性蛋白質
本發明方法包括使用第一MCCS捕獲重組治療性蛋白質的步驟。如在技藝中可預見，含有重組治療性蛋白質的液體培養基可以使用各種不同方法連續地饋送至第一MCCS上。例如，液體培養基可以被主動泵至第一MCCS中或液體培養基可以使用重力被饋送至第一MCCS中。在被饋送至第一MCCS中或在液體培養基可從 含有細胞(例如分泌重組治療性蛋白質至培養基中的哺乳動物細胞)培養物的生物反應器被主動泵至第一MCCS之前，液體培養基可以被儲存於貯器(例如容納箱)中。
液體培養基可以下列流速被饋送(加載)至第一MCCS中：介於約0.2mL/分至約25mL/分(例如介於約0.2mL/分至約20mL/分、介於約0.5mL/分至約20mL/分、介於約0.2mL/分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約10mL/分、介於約0.5mL分與約14mL/分、介於約1.0mL/分與約25.0mL/分、介於約1.0mL/分與約15.0mL/分)。含有重組治療性蛋白質的液體培養基可衍生自本文所述或技藝中已知例示性來源任一者。
一些實例進一步包括在液體培養基被饋送至第一MCCS上之前過濾液體培養基的選擇性步驟。過濾本文所述液體培養基或含有重組治療性蛋白質之液體的例示性方法任一者，或技藝中已知的任一種過濾方法，可用來在液體培養基被饋送至第一MCCS之前過濾含有重組治療性蛋白質的液體培養基。
在本文所述方法中，由液體培養基捕獲重組治療性蛋白質是使用第一MCCS來施行。如在技藝中可預見，為了要達到捕獲重組治療性蛋白質，第一MCCS的至少一個層析管柱或至少一個層析膜必須含有採用捕獲機制(例如本文所述例示性捕獲機制任一者)的樹脂，或含有能夠施行陽離子交換、陰離子交換或分子篩層析的樹脂。例如，若重組治療性蛋白質為抗體或抗體片段，則捕獲系統可以是蛋白質A-結合捕獲機制或抗原-結合捕獲機制(其中捕獲抗原被重組治療性抗體或抗體片段特異地辨識)。若重組治療性蛋白質為酵素，則捕獲機制可使用抗體或抗體片段(其特異地結合至酵素以 捕獲重組治療性酵素)、酵素的受質以捕獲重組治療性酵素、酵素的輔因子以捕獲重組治療性酵素，或若重組治療性酵素含有標誌，則蛋白質、金屬螯合物或抗體(或抗體片段)特異地結合至存在於重組治療性酵素中的標誌。本文說明可用於捕獲重組治療性蛋白質的非限制性樹脂且其他可用於捕獲重組治療性蛋白質的樹脂為技藝中已知。採用蛋白質A-結合捕獲機制之樹脂的一個非限制性實例是MabSelect SuRe樹脂(GE Healthcare,Piscataway,NJ)。
本文說明存在於第一MCCS之用於捕獲重組治療性蛋白質的層析管柱或層析膜的例示性非限制性尺寸與外型。饋送(加載)至第一MCCS中的液體培養基可含有例如介於約0.05mg/mL至約100mg/mL重組治療性蛋白質(例如介於約0.1mg/mL至約90mg/mL、介於約0.1mg/mL至約80mg/mL、介於約0.1mg/mL至約70mg/mL、介於約0.1mg/mL至約60mg/mL、介於約0.1mg/mL至約50mg/mL、介於約0.1mg/mL至約40mg/mL、介於約0.1mg/mL至約30mg/mL、介於約0.1mg/mL至約20mg/mL、介於約0.5mg/mL至約20mg/mL、介於約0.1mg/mL至約15mg/mL、介於約0.5mg/mL至約15mg/mL、介於約0.1mg/mL至約10mg/mL，或介於約0.5mg/mL至約10mg/mL重組治療性蛋白質)。重組治療性蛋白質結合至被用來施行捕獲單元操作之樹脂所需要的平均時間可以是例如介於約5秒至約10分(例如介於約10秒至約8分、介於約10秒至約7分、介於約10秒至約6分、介於約10秒至約5分、介於約30秒至約5分、介於約1分至約5分、介於約10秒至約4分、介於約30秒至約4分，或介於約1分至約4分)。
如技藝中可預見，為了使用存在於第一MCCS之層析 管柱或層析膜來捕獲重組治療性蛋白質，必須施行加載、洗滌、沖提以及再生存在於第一MCCS中之層析管柱或層析膜的連續層析步驟。本文所述各依序層析步驟的指定例示性流速、緩衝劑體積，及/或時間長度可用於一或多個此等不同順序層析步驟(例如加載、洗滌、沖提以及再生存在於第一MCCS中之用於捕獲重組治療性蛋白質的層析管柱或層析膜的依序層析步驟的一或多者)。下文提供用於第一MCCS(例如第一PCC系統)之捕獲層析管柱及/或層析膜之各依序層析步驟所指定的非限制性流速、緩衝劑體積及/或時間長度。此外，下文說明用於第一MCCS中的例示性緩衝劑沖提緩衝劑。
含有至少一包含施行捕獲單元操作之樹脂(本文所述可用於捕獲的例示性樹脂任一者)的層析管柱及/或層析膜的第一MCCS可使用上述加載流速(饋料速率)任一者而被加載含有重組治療性蛋白質的液體培養基。在一些實例中，含有能夠施行捕獲單元操作之樹脂的單一層析管柱或單一層析膜在例如介於約10分至約90分(例如介於約15分與約90分、介於約20分與80分、介於約30分與80分、介於約40分與約80分、介於約50分與約80分，以及介於約60分與80分)內被加載。在一些實例中，其中第一MCCS包括至少兩個含有能夠串聯施行捕獲單元操作之樹脂的層析管柱，加載兩個串聯層析管柱所需時間為例如介於約50分至約180分(例如介於約60分與約180分、介於約70分與約180分、介於約80分與約180分、介於約90分與約180分、介於約100分與約180分、介於約110分與約150分，以及介於約125分與約145分)。
在將重組治療性蛋白質加載至第一MCCS之含有能夠施行捕獲單元操作之樹脂的至少一層析管柱或層析膜上之後，以至 少一洗滌緩衝液洗滌該至少一層析管柱或層析膜。如在技藝中可預見，該至少一個(例如兩個、三個或四個)洗滌緩衝液表示將非重組治療性蛋白質的所有蛋白質從該至少一層析管柱或層析膜沖提出，同時不擾亂重組治療性蛋白質與樹脂的交互作用。
洗滌緩衝液可以介於約0.2mL/分至約25mL/分的流速(例如介於約0.2mL/分至約20mL/分、介於約0.5mL/分至約20mL/分、介於約0.2mL/分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約10mL/分、介於約0.5mL/分與約14mL/分、介於約1.0mL/分與約25.0mL/分、介於約1.0mL/分與約15.0mL/分)通過該至少一層析管柱或層析膜。所用洗滌緩衝液體積(例如當使用超過一種洗滌緩衝液時，所用洗滌緩衝液的合併總體積)可以是例如介於約1X管柱體積(CV)至約15X CV(例如介於約1X CV至約14X CV、約1X CV至約13X CV、約1X CV至約12X CV、約1X CV至約11X CV、約2X CV至約11X CV、約3X CV至約11X CV、約4X CV至約11X CV、約5X CV至約11X CV，或約5X CV至約10X CV)。洗滌總時間可以是例如介於約2分至約3小時(例如介於約2分至約2.5小時、介於約2分至約2.0小時、介於約5分至約1.5小時、介於約10分至約1.5小時、介於約10分至約1.25小時、介於約20分至約1.25小時，或介於約30分至約1小時)。
在洗滌第一MCCS之含有能夠施行捕獲單元操作之樹脂的至少一層析管柱或層析膜之後，藉由使沖提緩衝液流過第一MCCS之含有能夠施行捕獲單元操作之樹脂的該至少一層析管柱或層析膜，將重組治療性蛋白質從至少一層析管柱或層析膜沖提出。沖提緩衝液可以介於約0.2mL/分至約25mL/分的流速(例如介於約 0.2mL/分至約20mL/分、介於約0.5mL/分至約20mL/分、介於約0.2mL/分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約10mL/分、介於約0.5mL/分與約6.0mL/分、介於約1.0mL/分與約5.0mL/分、介於約0.5mL分與約14mL/分、介於約1.0mL/分與約25.0mL/分、介於約1.0mL/分與約15.0mL/分)通過含有能夠施行捕獲單元操作之樹脂的至少一層析管柱或層析膜。用於自含有能夠施行純化單元操作之樹脂的該至少一層析管柱或層析膜各者沖提出重組治療性蛋白質的沖提緩衝液體積可以是例如介於約1X管柱體積(CV)至約15X CV(例如介於約1X CV至約14X CV、約1X CV至約13X CV、約1X CV至約12X CV、約1X CV至約11X CV、約2X CV至約11X CV、約3X CV至約11X CV、約4X CV至約11X CV、約5X CV至約11X CV，或約5X CV至約10X CV)。沖提總時間可以是例如介於約2分至約3小時(例如介於約2分至約2.5小時、介於約2分至約2.0小時、介於2分至約1.5小時、介於約2分至約1.5小時、介於2分至約1.25小時、介於2分至約1.25小時、介於約2分至約1小時、介於約2分與約40分、介於約10分與約40分、介於約20分與約40分)。可用於此等方法中的沖提緩衝液的非限制性實例將取決於捕獲機制及/或治療性蛋白質。例如沖提緩衝液可含有不同濃度的鹽類(例如鹽類濃度增加)、不同pH(例如鹽類濃度增加或降低)，或與重組治療性蛋白質競爭結合能夠施行捕獲單元操作之樹脂的分子。用於本文所述各個例示性捕獲機制的此等沖提緩衝液實例為技藝中已知。
在從第一MCCS之含有能夠施行捕獲單元操作之樹脂的至少一層析管柱或層析膜沖提出重組治療性蛋白質之後，以及在下一個體積的液體培養基可以被加載至該至少一層析管柱或層析膜 上之前，該至少一層析管柱或層析膜必須使用再生緩衝液予以平衡。再生緩衝液可以例如介於約0.2mL/分至約25mL/分之間(例如介於約0.2mL/分至約20mL/分、介於約0.5mL/分至約20mL/分、介於約0.2mL/分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約10mL/分、介於約0.5mL/分至約6.0mL/分、介於約1.0mL/分至約5.0mL/分、介於約0.5mL分與約14mL/分、介於約1.0mL/分與約25.0mL/分、介於約5.0mL/分至約15.0mL/分，或介於約1.0mL/分與約15.0mL/分之間)的流速流過含有能夠施行捕獲單元操作之樹脂的該至少一層析管柱或層析膜。用於平衡含有能夠施行捕獲單元操作之樹脂的該至少一層析管柱或層析膜各者的再生緩衝液體積可以是例如介於約1X管柱體積(CV)至約15X CV(例如介於約1X CV至約14X CV、約1X CV至約13X CV、約1X CV至約12X CV、約1X CV至約11X CV、約2X CV至約11X CV、約3X CV至約11X CV、約2X CV至約5X CV、約4X CV至約11X CV、約5X CV至約11X CV，或約5X CV至約10X CV)。
在本文所述的一些方法中，第一MCCS包括一將含有重組治療性蛋白質的液體維持在低pH(例如低於4.6、低於4.4、低於4.2、低於4.0、低於3.8、低於3.6、低於3.4、低於3.2或低於3.0的pH)下歷時例如約1分至約1.5小時(例如約1小時)，並不活化存在於含有該重組治療性蛋白質之液體中的病毒的貯器。可用來施行不活化病毒單元操作的貯器的實例為攪拌瓶(例如500-mL攪拌瓶，例如具有程式化攪拌盤的500-mL攪拌瓶)，其能夠在含有重組治療性蛋白質的液體被饋送至第二MCCS中之前容納含有重組治療性蛋白質的液體歷時例如約1分至1.5小時。用於施行不活化病毒單元操作的貯器可以 是具有程式化攪拌盤的500-mL攪拌瓶(例如被程式化成在貯器中例如每4小時混合(例如週期性混合)的攪拌盤)。可用來施行不活化病毒單元操作的貯器的另一個實例是塑膠袋(例如500-mL塑膠袋)，其能夠在含有重組治療性蛋白質的液體被饋送至第二MCCS中之前容納含有重組治療性蛋白質的液體歷時例如約1分至1.5小時。在一些實例中，當被饋送至用來施行病毒不活化單元操作之貯器中時，含有重組治療性蛋白質的液體可能已具有低pH(例如低於4.6、低於4.4、低於4.2、低於4.0、低於3.8、低於3.6、低於3.4、低於3.2或低於3.0的pH)。如習於技藝者可預見，各種其他方式可用來施行不活化病毒的單元操作。例如含有重組治療性蛋白質的液體的UV輻射也可用來施行不活化病毒的單元操作。本文說明可用來施行不活化存在於含有重組治療性蛋白質之液體中的病毒的單元操作的貯器之非限制性實例。
該第一MCCS可包括含有四個層析管柱的PCCS，其中四個層析管柱的至少三個施行從液體培養基捕獲重組治療性蛋白質的單元操作(例如使用包括至少一含有能夠施行捕獲單元操作(例如本文所述彼等任一者)之樹脂的層析管柱任一者的第一MCCS)。在這些實例中，PCC的第四個管柱可施行不活化存在於含有重組治療性蛋白質之液體中的病毒的單元操作(例如可用以達到含有重組治療性蛋白質之液體的病毒不活化之本文所述例示性管柱任一者)。
含有重組治療性蛋白質的液體從第一MCCS(例如第一PCC系統)被連續地沖提，且被連續地饋送至第二MCCS中。在第一MCCS(例如第一PCC系統)的洗出液中所回收之重組治療性蛋白質百分比可以是例如至少70%、至少72%、至少74%、至少76%、至 少78%、至少80%、至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%，或至少98%)。第一MCCS(例如第一PCC系統)的洗出液可以使用技藝中已知各種方式(例如配管)被饋送至第二MCCS(例如第二PCC系統)中。第一MCCS(例如第一PCC系統)的洗出液可以例如介於約0.2mL/分至約25mL/分之間(例如介於約0.2mL/分至約20mL/分、介於約0.5mL/分至約20mL/分、介於約0.2mL/分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約10mL/分、介於約0.5mL/分與約6.0mL/分、介於約1.0mL/分與約5.0mL/分、介於約0.5mL/分與約14mL/分、介於約1.0mL/分與約25.0mL/分、介於約5.0mL/分與約15.0mL/分、介於約15mL/分與約36mL/分，或介於約1.0mL/分與約15.0mL/分之間)的流速被饋入第二MCCS(例如第二PCC系統)中。
本文所述一些方法可進一步包括在被饋送至第二MCCS(例如第二PCC系統)之前調整第一MCCS(例如第一PCC系統)的洗出液的離子濃度及/或pH之步驟。如本文所述，第一MCCS(例如第一PCC系統)的洗出液的離子濃度及/或pH可以藉由添加緩衝劑至洗出液(例如透過使用線上緩衝劑調整貯器)而(在其被饋送至第二MCCS中之前)予以調整。緩衝液可以例如介於約0.1mL/分至約15mL/分之間(例如介於約0.1mL/分至約12.5mL/分、介於約0.1mL/分至約10.0mL/分、介於約0.1mL/分至約8.0mL/分、介於約0.1mL/分至約6mL/分、介於約0.1mL/分至約4mL/分，或介於約0.5mL/分至約5mL/分)的流速被添加至第一MCCS的洗出液。
本文所述方法可進一步包括在將第一MCCS的洗出液饋送至第二MCCS中之前容納或儲存(且視情況可冷藏)第一MCCS 的洗出液的步驟。如本文所述，這個容納或儲存步驟可以使用本文所述貯器(例如備用箱)任一者來施行。
本文所述方法亦可包括在第一MCCS的洗出液被饋送至第二MCCS中之前過濾該洗出液的步驟。本文所述用於過濾之例示性過濾器或方法任一者可用於在第一MCCS的洗出液被饋送至第二MCCS中之前過濾該洗出液。
精煉及純化重組治療性蛋白質
本文所述方法包括使用第二MCCS純化並精煉重組治療性蛋白質的步驟，其中MCC2的洗出液是治療性蛋白質藥物物質。第二MCCS可包括至少一個(例如兩個、三個或四個)可用來施行純化重組治療性蛋白質之單元操作的層析管柱或層析膜，以及至少一個(例如兩個、三個或四個)可用來施行精煉重組治療性蛋白質之單元操作的層析管柱或層析膜。
可用來施行純化重組治療性蛋白質之單元操作的該至少一層析管柱或層析膜可含有採用捕獲機制(例如本文所述或技藝中已知捕獲機制任一者)的樹脂，或可用來施行陰離子交換、陽離子交換，或分子篩層析的樹脂。可用來施行精煉重組治療性蛋白質之單元操作的該至少一層析管柱或層析膜可含有可用來施行陰離子交換、陽離子交換，或分子篩層析的樹脂(例如本文所述或技藝中已知用來施行陰離子交換、陽離子交換或分子篩層析的例示性樹脂任一者)。
可用來施行純化重組治療性蛋白質之單元操作的該至少一層析管柱或層析膜的尺寸、外型與體積，及/或可用來施行精煉重組治療性蛋白質之單元操作的該至少一層析膜的尺寸與外型可 以是本文所述層析管柱或層析膜之例示性尺寸、外型與體積的任一組合。如習於技藝者可預見，純化或精煉重組治療性蛋白質的步驟可以例如包括加載、洗滌、沖提以及平衡該至少一用以施行純化或精煉重組治療性蛋白質之單元操作的層析管柱或層析膜的步驟。通常，來自用以施行純化單元操作的層析管柱或層析膜的沖提緩衝液含有該重組治療性蛋白質。通常，來自用以施行精煉單元操作的層析管柱或層析膜的加載及/或洗滌緩衝液含有重組治療性蛋白質。
例如，可用來施行純化重組治療性蛋白質之單元操作的至少一層析管柱或層析膜的尺寸可具有例如介於約2.0mL至約200mL(例如介於約2.0mL至約180mL、介於約2.0mL至約160mL、介於約2.0mL至約140mL、介於約2.0mL至約120mL、介於約2.0mL至約100mL、介於約2.0mL至約80mL、介於約2.0mL至約60mL、介於約2.0mL至約40mL、介於約5.0mL至約40mL、介於約2.0mL至約30mL、介於約5.0mL至約30mL，或介於約2.0mL至約25mL)的體積。當含有重組治療性蛋白質的液體被加載至可用來施行純化重組治療性蛋白質之單元操作的該至少一層析管柱或至少一層析時，含有重組治療性蛋白質的液體的流速可以是例如介於約0.1mL/分至約25mL/分(例如介於約0.1mL/分至約12.5mL/分、介於約0.1mL/分至約10.0mL/分、介於約0.1mL/分至約8.0mL/分、介於約0.1mL/分至約6mL/分、介於約0.1mL/分至約4mL/分、介於約0.1mL/分至約3mL/分、介於約0.1mL/分至約2mL/分，或約0.2mL/分至約4mL/分)。被加載至可用來施行純化重組治療性蛋白質之單元操作的至少一層析管柱或層析膜上的液體中的重組治療性蛋白質濃度可以是例如介於0.05mg/mL至約100mg/mL重組蛋白質(例如介於 約0.1mg/mL至約90mg/mL、介於約0.1mg/mL至約80mg/mL、介於約0.1mg/mL至約70mg/mL、介於約0.1mg/mL至約60mg/mL、介於約0.1mg/mL至約50mg/mL、介於約0.1mg/mL至約40mg/mL、介於約0.1mg/mL至約30mg/mL、介於約0.1mg/mL至約20mg/mL、介於約0.5mg/mL至約20mg/mL、介於約0.1mg/mL至約15mg/mL、介於約0.5mg/mL至約15mg/mL、介於約0.1mg/mL至約10mg/mL，或介於約0.5mg/mL至約10mg/mL重組治療性蛋白質)。用來施行純化之單元操作的該至少一層析管柱或層析膜中的樹脂可以是可用來施行陰離子交換或陽離子交換層析的樹脂。用來施行純化之單元操作的該至少一層析管柱或層析膜中的樹脂可以是陽離子交換樹脂(例如Capto-S樹脂，GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ)。
在將重組治療性蛋白質加載至第二MCCS之可用來施行純化重組治療性蛋白質之單元操作的至少一層析管柱或層析膜之後，以至少一種洗滌緩衝液洗滌該至少一層析管柱或層析膜。如技藝中可預見，該至少一種(例如兩種、三種或四種)洗滌緩衝液表示將非重組治療性蛋白質的所有蛋白質從該至少一層析管柱或層析膜沖提出，同時不擾亂重組治療性蛋白質與樹脂的交互作用或以其他方式沖提出重組治療性蛋白質。
洗滌緩衝液可以介於約0.2mL/分至約25mL/分的流速(例如介於約0.2mL/分至約20mL/分、介於約0.5mL/分至約20mL/分、介於約0.2mL/分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約10mL/分、介於約0.5mL/分與約14mL/分、介於約1.0mL/分與約25.0mL/分、介於約1.0mL/分與約15.0mL/分)通過該至少一層析管柱或層析膜。所用洗滌緩衝液體積(例如當 使用超過一種洗滌緩衝液時，所用洗滌緩衝液的合併總體積)可以是例如介於約1X管柱體積(CV)至約15X CV(例如介於約1X CV至約14X CV、約1X CV至約13X CV、約1X CV至約12X CV、約1X CV至約11X CV、約2X CV至約11X CV、約3X CV至約11X CV、約4X CV至約11X CV、約2.5X CV至約5.0X CV、約5X CV至約11X CV，或約5X CV至約10X CV)。洗滌總時間可以是例如介於約2分至約3小時(例如介於約2分至約2.5小時、介於約2分至約2.0小時、介於約5分至約1.5小時、介於約10分至約1.5小時、介於約10分至約1.25小時、介於約20分至約1.25小時、介於約30分至約1小時、介於約2分與10分、介於約2分與15分，或介於約2分與30分)。
在洗滌可用來施行純化重組治療性蛋白質之單元操作的第二MCCS的至少一層析管柱或層析膜之後，藉由使沖提緩衝液通過可用來施行純化重組治療性蛋白質之單元操作的第二MCCS的至少一層析管柱或層析膜將重組治療性蛋白質從該至少一層析管柱或層析膜沖提出。沖提緩衝液可以介於約0.2mL/分至約25mL/分的流速(例如介於約0.2mL/分至約20mL/分、介於約0.5mL/分至約20mL/分、介於約0.2mL/分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約10mL/分、介於約0.5mL/分與約6.0mL/分、介於約1.0mL/分與約5.0mL/分、介於約0.5mL分與約14mL/分、介於約1.0mL/分與約25.0mL/分、介於約1.0mL/分與約15.0mL/分)通過可用來施行純化重組治療性蛋白質之單元操作的該至少一層析管柱或層析膜。用於自可用來施行純化重組治療性蛋白質之單元操作的各個至少一層析管柱或層析膜沖提出重組治療性蛋白質的沖提緩衝液體積可以是例如介於約1X管柱體積(CV)至約25X CV (例如介於約1X CV至約20X CV、介於約15X CV與約25X CV、介於約1X CV至約14X CV、約1X CV至約13X CV、約1X CV至約12X CV、約1X CV至約11X CV、約2X CV至約11X CV、約3X CV至約11X CV、約4X CV至約11X CV、約5X CV至約11X CV，或約5X CV至約10X CV)。沖提總時間可以是例如介於約2分至約3小時(例如介於約2分至約2.5小時、介於約2分至約2.0小時、介於約2分至約1.5小時、介於約2分至約1.5小時、介於約2分至約1.25小時、介於約2分至約1.25小時、介於約2分至約1小時、介於約2分與40分、介於約10分與約40分、介於約20分與約40分，或介於約30分與1.0小時)。可用於此等方法中的沖提緩衝液的非限制性實例將取決於樹脂及/或治療性蛋白質。例如，沖提緩衝液可含有不同濃度的鹽類(例如鹽類濃度增加)、不同pH(例如鹽類濃度增加或降低)，或會與該重組治療性蛋白質競爭結合至樹脂的分子。用於本文所述例示性捕獲機制任一者的沖提緩衝液實例為技藝中已知。
在從可用來施行純化重組治療性蛋白質之單元操作的第二MCCS的至少一層析管柱或層析膜沖提出重組治療性蛋白質之後，以及在下一個含有重組治療性蛋白質的液體體積可被加載至該至少一層析管柱或層析膜上之前，該至少一層析管柱或層析膜必須使用再生緩衝液予以平衡。再生緩衝液可以介於約0.2mL/分至約25mL/分的流速(例如介於約0.2mL/分至約20mL/分、介於約0.5mL/分至約20mL/分、介於約0.2mL/分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約10mL/分、介於約0.5mL/分與約6.0mL/分、介於約1.0mL/分與約5.0mL/分、介於約0.5mL/分與約14mL/分、介於約1.0mL/分與約25.0mL/分、介於約5.0mL/ 分與約15.0mL/分，或介於約1.0mL/分與約15.0mL/分)通過可被用來施行純化該重組治療性蛋白質的單元操作的該至少一層析管柱或層析膜。用來平衡含有可用來施行純化該重組治療性蛋白質之單元操作之樹脂的該至少一層析管柱或層析膜的再生緩衝液體積可以是例如介於約1X管柱體積(CV)至約15X CV(例如介於約1X CV至約14X CV、介於約1X CV至約13X CV、介於約1X CV至約12X CV、介於約1X CV至約11X CV、介於約2X CV至約11X CV、介於約3X CV至約11X CV、介於約2X CV至約5X CV、介於約2.5X CV至約7.5X CV、介於約4X CV至約11X CV、介於約5X CV至約11X CV，或介於約5X CV至約10X CV)。在可被用來施行純化該重組治療性蛋白質之單元操作的該至少一層析管柱或層析膜的洗出液中的重組治療性蛋白質濃度可以是例如介於約0.05mg/mL至約100mg/mL重組治療性蛋白質(例如介於約0.1mg/mL至約90mg/mL、介於約0.1mg/mL至約80mg/mL、介於約0.1mg/mL至約70mg/mL、介於約0.1mg/mL至約60mg/mL、介於約0.1mg/mL至約50mg/mL、介於約0.1mg/mL至約40mg/mL、介於約2.5mg/mL與約7.5mg/mL、介於約0.1mg/mL至約30mg/mL、介於約0.1mg/mL至約20mg/mL、介於約0.5mg/mL至約20mg/mL、介於約0.1mg/mL至約15mg/mL、介於約0.5mg/mL至約15mg/mL、介於約0.1mg/mL至約10mg/mL，或介於約0.5mg/mL至約10mg/mL重組治療性蛋白質)。
可用來施行精煉重組治療性蛋白質之單元操作的該至少一層析管柱或層析膜可含有可用來施行陽離子交換、陰離子交換或分子篩層析的樹脂。如在技藝中可預見，使用在第二MCCS中可用來施行精煉重組治療性蛋白質之單元操作的該至少一層析管柱 或層析膜來精煉重組治療性蛋白質可包括例如加載、追蹤以及再生可被用來施行精煉該重組治療性蛋白質之單元操作的該至少一層析管柱或層析的步驟。例如，當加載、追蹤或再生的步驟被用來施行精煉時，重組治療性蛋白質在第二MCCS中被用來施行精煉該重組治療性蛋白質之單元操作的該至少一層析管柱或層析膜中不結合樹脂，且該重組治療性蛋白質在加載與追蹤步驟時從該至少一層析管柱或層析膜被沖提出，而再生步驟被用來在含有重組治療性蛋白質的其他液體被加載至該至少一層析管柱或層析膜之前從該至少一層析管柱或層析膜移除不純物。下文說明用於加載、追蹤及再生步驟中每一者的例示性流速與緩衝液體積。
可用來施行精煉重組治療性蛋白質之單元操作的該至少一層析管柱或層析膜的尺寸、外型與體積，及/或可用來施行精煉重組治療性蛋白質之單元操作的該至少一層析膜的尺寸與外型可以是本文所述層析管柱或層析膜之例示性尺寸、外型與體積的任一組合。例如，可用來施行精煉重組治療性蛋白質之單元操作的該至少一層析管柱或層析膜的尺寸可具有例如介於約0.5mL至約200mL(例如介於約0.5mL至約180mL、介於約0.5mL至約160mL、介於約0.5mL至約140mL、介於約0.5mL至約120mL、介於約0.5mL至約100mL、介於約0.5mL至約80mL、介於約0.5mL至約60mL、介於約0.5mL至約40mL、介於約5.0mL至約40mL、介於約0.5mL至約30mL、介於約5.0mL至約30mL、介於約0.5mL至約25mL、介於約0.2mL至約10mL，或介於約0.2mL至約5mL)的體積。當被加載至可用來施行精煉重組治療性蛋白質之單元操作的該至少一層析管柱或層析膜上時，含有重組治療性蛋白質的液體的流速可以是例 如介於0.1mL/分至約25mL/分(例如介於約0.1mL/分至約12.5mL/分、介於約0.1mL/分至約10.0mL/分、介於約0.1mL/分至約8.0mL/分、介於約0.1mL/分至約6mL/分、介於約0.1mL/分至約4mL/分、介於約0.1mL/分至約3mL/分、介於約2mL/分與約6mL/分、介於約0.1mL/分至約2mL/分，或約0.2mL/分至約4mL/分)。被加載至可用來施行精煉重組治療性蛋白質之單元操作的至少一層析管柱或層析膜上的含有重組治療性蛋白質的液體總體積可以是例如介於約1.0mL至約250mL(例如介於約1.0mL至約225mL、介於約1.0mL至約200mL、介於約1.0mL至約175mL、介於約1.0mL至約150mL、介於約100mL至約125mL、介於約100mL至約150mL、介於約1.0mL至約150mL、介於約1.0mL至約125mL、介於約1.0mL至約100mL、介於約1.0mL至約75mL、介於約1.0mL至約50mL，或介於約1.0mL至約25mL)。用來施行精煉之至少一層析管柱或層析膜中的樹脂可以是陰離子交換或陽離子交換樹脂。用來施行精煉之單元操作的該至少一層析管柱或層析膜中的樹脂可以是陽離子交換樹脂(例如Sartobind® Q樹脂，Sartorius，Goettingen，Germany)。
在加載步驟之後，第二MCCS中可用來施行精煉重組治療性蛋白質之單元操作的該至少一層析管柱或層析膜進行追蹤步驟(例如追蹤緩衝液通過該至少一層析膜或層析膜以收集基本上不結合至該至少一層析管柱或層析膜的重組治療性蛋白質)。在這些實例中，追蹤緩衝液可以介於約0.2mL/分至約50mL/分的流速(例如介於約1mL/分至約40mL/分、介於約1mL/分至約30mL/分、介於約5mL/分至約45mL/分、介於約10mL/分至約40mL/分、介於約0.2mL/分至約20mL/分、介於約0.5mL/分至約20mL/分、介於約0.2mL/ 分至約15mL/分、介於約0.5mL分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約10mL/分、介於約0.5mL分與約14mL/分、介於約1.0mL/分與約25.0mL/分、介於約1.0mL/分與約15.0mL/分)通過該至少一層析管柱或層析膜。所用追蹤緩衝液的體積可以是例如介於約1X管柱體積(CV)至約100X CV(例如介於約1X CV至約90X CV、介於約1X CV至約80X CV、介於約1X CV至約70X CV、介於約1X CV至約60X CV、介於約1X CV至約50X CV、介於約1X CV至約40X CV、介於約1X CV至約30X CV、介於約1X CV至約20X CV、介於約1X CV至約15X CV、介於約5X CV至約20X CV、介於約5X CV至約30X CV、介於約1X CV至約14X CV、約1X CV至約13X CV、約1X CV至約12X CV、約1X CV至約11X CV、約2X CV至約11X CV、約3X CV至約11X CV、約4X CV至約11X CV、約2.5X CV至約5.0X CV、約5X CV至約11X CV，或約5X CV至約10X CV)。追蹤總時間可以是例如介於約1分至約3小時(例如介於約1分至約2.5小時、介於約1分至約2.0小時、介於1分至約1.5小時、介於約2分至約1.5小時、介於1分至約1.25小時、介於2分至約1.25小時、介於約1分至約5分、介於約1分至約10分、介於約2分至約4分、介於約30分至約1小時、介於2分與10分、介於約2分與15分，或介於約2分與30分)。在加載步驟以及追蹤步驟中，存在於通過管柱之洗出液中的重組治療性蛋白質的合併濃度可以是例如介於約0.1mg/mL至約100mg/mL重組蛋白質(例如介於約0.1mg/mL至約90mg/mL、介於約0.1mg/mL至約80mg/mL、介於約0.1mg/mL至約70mg/mL、介於約0.1mg/mL至約60mg/mL、介於約0.1mg/mL至約50mg/mL、介於約0.1mg/mL至約40mg/mL、介於約2.5mg/mL至約7.5mg/mL、介於約0.1mg/mL至約30mg/mL、介於約 0.1mg/mL至約20mg/mL、介於約0.5mg/mL至約20mg/mL、介於約0.1mg/mL至約15mg/mL、介於約0.5mg/mL至約15mg/mL、介於約0.1mg/mL至約10mg/mL、介於約0.5mg/mL至約10mg/mL，或介於約1mg/mL與約5mg/mL重組治療性蛋白質)。
在追蹤步驟之後以及在下一個體積之含有重組治療性蛋白質的液體被加載至可用來施行精煉之單元操作的該至少一層析管柱或層析膜之前，該至少一層析管柱或層析膜必須使用再生緩衝液予以再生。再生緩衝液可以例如介於約0.2mL/分至約50mL/分的流速(例如介於約1mL/分至約40mL/分、介於約1mL/分至約30mL/分、介於約5mL/分至約45mL/分、介於約10mL/分至約40mL/分、介於約0.2mL/分至約20mL/分、介於約0.5mL/分至約20mL/分、介於約0.2mL/分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約15mL/分、介於約0.5mL/分至約10mL/分、介於約0.5mL分與約14mL/分、介於約1.0mL/分與約25.0mL/分、介於約1.0mL/分與約15.0mL/分)通過該可用來施行精煉重組治療性蛋白質之單元操作的該至少一層析管柱或層析膜。用來再生可用來施行精煉之單元操作的該至少一層析管柱或層析膜的再生緩衝液體積可以示例如介於約1X管柱體積(CV)至約500X CV(例如介於約1X CV至約450X CV、介於約1X CV至約400X CV、介於約1X CV至約350X CV、介於約1X CV至約300X CV、介於約1X CV至約250X CV、介於約1X CV至約200X CV、介於約1X CV至約150X CV、介於約1X C至約100X CV、介於約1X CV至約90X CV、介於約1X CV至約80X CV、介於約1X CV至約70X CV、介於約1X CV至約60X CV、介於約1X至約50X CV、介於約1X CV至約40X CV、介於約1X CV至約30X CV、介於約1X CV 至約20X CV、介於約1X CV至約15X CV、介於約5X CV至約20X CV、介於約5X CV至約30X CV、介於約1X CV至約14X CV、約1X CV至約13X CV、約1X CV至約12X CV、約1X CV至約11X CV、約2X CV至約11X CV、約3X CV至約11X CV、約4X CV至約11X CV、約2.5X CV至約5.0X CV、約5X CV至約11X CV，或約5X CV至約10X CV)。
在其他實例中，用來施行精煉之單元操作的該一或多個層析管柱及/或層析膜含有選擇性地結合或留滯存在於含有重組治療性蛋白質之液體中的不純物的樹脂，且已達到或基本上接近達到樹脂在一或多個管柱及/或膜中的結合力時，置換一或多個管柱及/或膜(例如置換成基本上相似的管柱及/或膜)來代替再生該一或多個管柱及/或膜。
在此等製程的一些實例中，第二MCCS包括含有三個層析管柱及一個層析膜的PCCS，例如其中PCCS的三個層析管柱施行純化重組治療性蛋白質的單元操作(使用可用來施行純化蛋白質之單元操作的至少一層析管柱)，而PCCS的層析膜施行精煉重組治療性蛋白質的單元操作。在這些實例中，PCCS中可用來施行精煉重組治療性蛋白質之單元操作的層析膜可以是本文所述可用來施行精煉重組治療性蛋白質之單元操作的例示性層析膜任一者。本文所述管柱切換方法任一者可用來在本實例中決定何時可切換PCCS中前三個層析管柱以及層析膜。
在洗出液被饋送至PCCS的層析膜中之前，本實例的一些具體例可進一步包括調整來自PCCS之三個層析管柱之洗出液的離子濃度及/或pH。如本文所述，(在本實例中洗出液被饋送至PCCS的層析膜中之前)可以藉由將緩衝劑添加至PCCS之三個層析管柱的 洗出液來調整PCCS之三個層析管柱之洗出液的離子濃度及/或pH(例如透過使用線上緩衝劑調整貯器)。緩衝劑可以例如介於約0.1mL/分至約15mL/分的流速(例如介於約0.1mL/分至約12.5mL/分、介於約0.1mL/分至約10.0mL/分、介於約0.1mL/分至約8.0mL/分、介於約0.1mL/分至約6mL/分、介於約0.1mL/分至約4mL/分，或介於約0.5mL/分至約5mL/分)被添加至洗出液。
於本實例中，在將洗出液饋送至層析膜(可用來施行精煉重組治療性蛋白質之單元操作的層析膜)中之前，此等實例可進一步包括容納或儲存來自PCCS之三個層析管柱的洗出液的步驟。如本文所述，此容納或儲存步驟可以使用本文所述貯器(例如備用箱)來施行。
此等實例亦可包括過濾來自例示性PCCS系統之層析膜的洗出液(可用來施行精煉重組治療性蛋白質之單元操作的層析膜的洗出液)的步驟。本文所述用以過濾之例示性過濾器或方法任一者可用來過濾來自此例示性PCCS之層析膜的洗出液(可用來施行精煉重組治療性蛋白質之單元操作的層析膜的洗出液)。
如習於技藝者可預見，治療性蛋白質藥物物質可週期性地使用本文所述方法任一者由第二MCCS被沖提出。例如，本文所述方法任一者可以例如介於約1分與約6小時(例如介於約1分與約5小時、介於約1分與約4小時、介於約1分與約3小時、介於約1分與2小時、介於約1分與1小時，或介於約1分與30分)的頻率沖提治療性蛋白質藥物物質歷時例如介約30秒與約5小時(例如介於約1分與約4小時、介於約1分與約3小時、介於約1分與約2小時、介於約1分或約1.5小時、介於約1分與約1小時、介於約1分與約30分)的持續期間， 取決於例如第一及第二MCCS中所用的層析管柱及/或層析膜。
培養方法
本文所述的一些方法進一步包括在含有液體培養基的生物反應器(例如灌注或饋料批次生物反應器)中培養分泌重組治療性蛋白質之細胞(例如重組哺乳動物細胞)的步驟，其中某個體積之基本上無細胞(例如哺乳動物細胞)的液體培養基被連續地或週期性地從灌注生物反應器移除並且被饋送至第一多管柱層析系統(MCC1)中。生物反應器可具有例如介於約1L至約10,000L(例如介於約1L至約50L、介於約50L至約500L、介於約500L至約1000L、介於500L至約5000L、介於約500L至約10,000L、介於約5000L至約10,000L、介於約1L與約10,000L、介於約1L與約8,000L、介於約1L與約6,000L、介於約1L與約5,000L、介於約100L與約5,000L、介於約10L與約100L、介於約10L與約4,000L、介於約10L與約3,000L、介於約10L與約2,000L，或介於約10L與約1,000L)的體積。存在於生物反應器中的液體培養基數量可以是例如介於約0.5L至約5,000L(例如介於約0.5L至約25L、介於約25L至約250L、介於約250L至約500L、介於250L至約2500L、介於約250L至約5,000L、介於約2500L至約5,000L、介於約0.5L與約5,000L、介於約0.5L與約4,000L、介於約0.5L與約3,000L、介於約0.5L與約2,500L、介於約50L與約2,500L、介於約5L與約50L、介於約5L與約2,000L、介於約5L與約1,500L、介於約5L與約1,000L，或介於約5L與約500L)。可以例如使用饋料批次生物反應器或灌注生物反應器來施行培養細胞。下文說明培養細胞(例如培養哺乳動物細胞)的非限制性實例與不同態樣且可以任何組合來使用。
細胞
在本文所述一些方法中培養的細胞可以是細菌(例如革蘭氏陰性細菌)、酵母菌(例如啤酒酵母、畢斥酵母、多形漢遜酵母、乳酸克魯維酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母或Arxula adeninivorans)，或哺乳動物細胞。哺乳動物細胞可以是在懸浮液中生長的細胞或附著性細胞。可在本文所述方法任一者中培養的哺乳動物細胞的非限制性實例包括：中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(例如CHO DG44細胞或CHO-K1s細胞)、Sp2.0骨髓瘤細胞(例如NS/0)、B細胞、融合瘤細胞、T細胞、人類胚腎(HEK)細胞(例如HEK 293E與HEK 293F)、非洲綠猴腎上皮細胞(Vero)細胞，以及馬丁-達比犬(Cocker Spaniel)腎上皮細胞(MDCK)細胞。在培養附著性細胞的一些實例中，培養物可包含複數微載體(例如含有一或多個孔洞的微載體)。可於本文所述方法任一者中培養的其他哺乳動物細胞為技藝中已知。
哺乳動物細胞可含有重組核酸(例如被穩定地併入哺乳動物細胞基因組中的核酸)，該重組核酸編碼重組治療性蛋白質。下文說明編碼例示性重組治療性蛋白質之重組核酸的非限制性實例，例示性重組治療性蛋白質為如同可使用本文所述方法生產的重組治療性蛋白質。在一些情況下，培養在生物反應器(例如本文所述生物反應器任一者)中的哺乳動物細胞是衍生自較大的培養物。
使用在分子生物學以及分子遺傳學中已知的廣泛多種方法將編碼重組治療性蛋白質的核酸引入哺乳動物細胞中。非限制性實例包括轉染(例如脂轉染)、轉導(例如慢病毒、腺病毒或逆轉錄病毒感染)，以及電穿孔。在一些情況下，編碼重組治療性蛋白質 的核酸不會被穩定地併入哺乳動物細胞的染色體中(暫時轉染)，而在其他情況下核酸被併入哺乳動物細胞的染色體中。或者或另外，編碼重組治療性蛋白質的核酸可以質體及/或哺乳動物人工染色體(例如人類人工染色體)的形式存在。或者或另外，該核酸可使用病毒載體(例如慢病毒、逆轉錄病毒或腺病毒載體)被引入細胞中。該核酸可以被可操作地連結至啟動子序列(例如強啟動子，諸如β-肌動蛋白啟動子與CMV啟動子，或誘導型啟動子)。含有核酸的載體(若需要的話)亦可含有可篩選標記(例如賦予哺乳動物細胞潮黴素、嘌呤黴素或新黴素抗性的基因)。
在一些情況下，重組治療性蛋白質為經分泌蛋白質且被哺乳動物細胞釋放至細胞外介質(例如第一及/或第二液體培養基)中。例如，編碼可溶性重組治療性蛋白質的核酸序列可在重組治療性蛋白質的N端或C端處含有編碼分泌訊號肽的序列，該分泌訊號肽被存在於哺乳動物細胞中的酵素所切割，且之後被釋放至細胞外介質(例如第一及/或第二液體培養基)。
培養基
液體培養基為技藝中已知。液體培養基(例如第一及/或第二組織培養基)可補充哺乳動物血清(例如胎牛血清與牛血清)，及/或生長激素或生長因子(例如胰島素、運鐵蛋白及表皮生長因子)。或者或另外，液體培養基(例如第一及/或第二液體培養基)可以是化學限定液體培養基、無動物衍生組分液體培養基、無血清液體培養基，或含血清液體培養基。化學限定液體培養基、無動物衍生組分液體培養基、無血清液體培養基，及含血清液體培養基的非限制性實例為商業上可購得。
液體培養基通常含有能量來源(例如碳水化合物，諸如葡萄糖)、必須胺基酸(例如二十種胺基酸加上半胱胺酸的基本組合)、維生素及/或以低濃度需要的有機化合物、游離脂肪酸，及/或微量元素。液體培養基(例如第一及/或第二液體培養基)可(若需要的話)補充例如哺乳動物激素或生長因子(例如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽類和緩衝劑(例如鈣、鎂與磷酸鹽)、核苷與鹼基(例如腺苷、胸苷與次黃嘌呤)、蛋白質與組織水解物，及/或此等添加物的任何組合。
可用於在本文所述方法任一者中培養細胞(例如哺乳動物細胞)的廣泛各種不同液體培養基為技藝中已知。可用於本方法中的培養基組分包括，但不限於化學限定(CD)水解物，例如CD腖、CD多肽(兩個或更多胺基酸)，以及CD生長因子。液體組織培養基與培養基組分的其他實例為技藝中已知。
技藝從事者將能理解本文所述第一液體培養基與第二液體培養基可以是相同類型培養基或不同培養基。
例示性生物反應器的其他特徵
本文所述生物反應器任一者的內表面具有至少一層塗料(例如至少一層明膠、膠原蛋白、聚-L-鳥胺酸、聚苯乙烯與層黏蛋白塗料)，且如同技藝中已知一或多個用以將O2、CO2與N2吹入液體培養基的吹口，以及用以攪動該液體培養基的攪拌機制。該生物反應器可在受控濕化氣氛(例如大於20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的溼度或100%的濕度)中培育細胞培養物。生物反應器也可配備能夠將某個體積的液體培養基從生物反應器移除的機械裝置以及視情況於液體培養基轉移出生物反應 器的過程期間在機械裝置中將細胞從液體培養基移除的過濾器(例如ATF系統)。
溫度
培養哺乳動物細胞的步驟可以在約31℃至約40℃的溫度下施行。技藝從事者將理解溫度可以在培養步驟期間的特定時間點之時被改變，例如以小時或天為基礎。例如，在生物反應器初始接種細胞(例如哺乳動物細胞)之後約一天、兩天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十四天、十五天、十六天、十七天、十八天、十九天或約二十天或更多天時改變或切換溫度(例如增加或降低)。例如溫度可以被向上切換(例如改變至多達或約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或至多或約20度C)。例如，溫度可以被向下切換(例如改變至多達或約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或至多達或約20℃)。
CO 2
本文所述培養步驟可進一步包括將生物反應器中的液體培養基暴露於含有至多或約15% CO2(例如至多或約14% CO2、12% CO2、10% CO2、8% CO2、6% CO2、5% CO2、4% CO2、3% CO2、2% CO2或至多或約1% CO2)的氣氛中。
灌注生物反應器
本文所述培養步驟可使用灌注生物反應器來施行。在 灌注生物反應器中培養細胞(例如哺乳動物細胞)包括從生物反應器移除第一體積的第一液體培養基(例如含有任何濃度之哺乳動物細胞，例如基本上無細胞的第一體積之第一液體培養基)，以及添加第二體積之第二液體培養基至第一液體培養基。移除與添加可以同時或依序，或兩者組合來施行。此外，移除與添加可以在任何預定時間期間(例如在24小時期間、在約1小時至約24小時的漸增時間期間，或在大於24小時的漸增時間期間內)連續地施行(例如以移除與置換介於0.1%至800%之生物反應器體積或第一液體培養基體積的體積比率(例如介於1%與700%、介於1%與600%、介於1%與500%、介於1%與400%、介於1%與350%、介於1%與300%、介於1%與250%、介於1%與100%、介於100%與200%、介於5%與150%、介於10%與50%、介於15%與40%、介於8%與80%，以及介於4%與30%))或週期性地施行(例如每三天一次、每隔一天一次、一天一次、一天兩次、一天三次、一天四次，或一天五次)，或其任何組合。若週期性地施行時，被移除或置換的體積(例如在約24小時期間、在約1小時至約24小時的漸增時間期間，或在大於24小時的漸增時間期間內)可以是例如介於0.1%至800%之生物反應器體積或第一液體培養基體積(例如介於1%與700%、介於1%與600%、介於1%與500%、介於1%與400%、介於1%與300%、介於1%與200%、介於1%與100%、介於100%與200%、介於5%與150%、介於10%與50%、介於15%與40%、介於8%與80%，以及介於4%與30%)。在整個或部分培養期間，被移除之第一體積的第一液體培養基與被添加的第二體積的第二液體培養基在一些情況下可以在各24小時期間(或，或者約1小時至約24小時的漸增時間期間或大於24小時的漸增時間期間)維持大約相同。如技藝 中已知，第一體積的第一液體培養基被移除的速率(體積/單位時間)以及第二體積的第二液體培養基被添加的速率(體積/單位時間)可能有所改變。第一體積的第一液體培養基被移除的速率(體積/單位時間)以及第二體積的第二液體培養基被添加的速率(體積/單位時間)可能大約相同或可能不同。
在培養期期間，或者，被移除與被添加的體積可能在各24小時期間(或或者介於1小時與約24小時的漸增時間期間或大於24小時的漸增時間期間)內有所改變(例如逐漸增加)。例如，在各24小時期間(或或者介於約1小時與超過24小時的漸增時間期間或大於24小時的漸增時間期間)內被移除的第一液體培養基體積以及被添加的第二液體培養基體積可在培養期間內而從介於生物反應器體積或第一液體培養基體積的0.5%至約20%的體積增加至生物反應器體積或第一液體培養基體積的約25%至約150%(例如逐漸地或交錯漸增)。
技藝從事者將理解第一液體培養基與第二液體培養基可以是相同類型的培養基。在其他情況下，第一液體培養基與第二液體培養基可以是不同的。
第一體積的第一液體培養基可以例如藉由可將第一體積之第一液體培養基從生物反應器移除的機械系統(例如基本上無來自生物反應器之細胞的第一體積的第一液體培養基)而被移除。或者或另外，第一體積的第一液體培養基可以藉由第一體積之第一液體培養基以排除細胞(例如哺乳動物細胞)的分子量截止滲漏或重力流動透過無菌膜而被移除。
第二體積的第二液體培養基可以自動的方式例如藉 由灌注泵被添加第一液體培養基中。
在一些情況下，移除第一體積的第一液體培養基(例如基本上無哺乳動物細胞的第一體積的第一液體培養基)以及將第二體積之第二液體培養基添加至第一液體培養基不會在將生物反應器接種哺乳動物細胞的至少1小時內發生(例如在2小時內、在3小時內、在4小時內、在5小時內、在6小時內、在7小時內、在8小時內、在9小時內、在10小時內、在12小時內、在14小時內、在16小時內、在18小時內、在24小時內、在36小時內、在48小時內、在72小時內、在96小時內或在96小時後)。
饋料批次生物反應器
本文所述培養步驟可以使用饋料批次生物反應器來施行。在饋料批次生物反應器中培養細胞包括在大多數培養期間內添加第二體積的第二液體培養基至第一液體培養基。添加第二液體培養基可在任何預定時間期間(例如在24小時期間、在約1小時至約24小時的漸增時間期間，或在大於24小時的漸增時間期間)內連續施行(例如以添加介於0.1%至300%之生物反應器體積或第一液體培養基體積的體積比率(例如介於1%與250%、介於1%與100%、介於100%與200%、介於5%與150%、介於10%與50%、介於15%與40%、介於8%與80%，以及介於4%與30%))或週期性地施行(例如每三天一次、每隔一天一次、一天一次、一天兩次、一天三次、一天四次，或一天五次)，或其任何組合。若週期性地施行時，被添加的體積(例如在約24小時期間內、在約1小時至約24小時的漸增時間期間內，或在大於24小時的漸增時間期間內)可以是例如介於0.1%至300%之生物反應器體積或第一液體培養基體積(例如介於1與200%、介於1%與 100%、介於100%與200%、介於5%與150%、介於10%與50%、介於15%與40%、介於8%與80%，以及介於4%與30%)。添加之第二體積的第二液體培養基可以在一些情況下於各24小時期間內(或或者約1小時至約24小時的漸增時間期間或大於24小時的漸增時間期間)在整個或部分培養期間維持大致相同。如技藝中已知，第二體積之第二液體培養基被添加的速率(體積/單位時間)可能在整個或部分培養期間有所改變。例如，添加之第二液體培養基的體積可能於各24小時期間(或或者介於1小時與約24小時的漸增時間期間或大於24小時的漸增時間期間)在培養期間會改變(例如漸增)。例如，添加之第二液體培養基的體積可能於各24小時期間內(或或者介於約1小時與約24小時的漸增時間期間或大於24小時的漸增時間期間)在培養期間會增加(例如逐漸或透過交錯增加)而從介於生物反應器體積或第一液體培養基體積的0.5%至約20%的體積增加至生物反應器體積或第一液體培養基體積的約25%至約150%。第二體積之第二液體培養基被添加的速率(體積/單位時間)在整個或部分培養期間可能大約相同。
技藝從事者將理解第一液體培養基與第二液體培養基可以是相同類型的培養基。在其他情況下，第一液體培養基與第二液體培養基可以是不同的。第二液體培養基的體積可以自動化方式(例如藉由灌注泵)被添加至第一液體培養基。
在一些情況下，將第二體積之第二液體培養基添加至第一液體培養基不會在將生物反應器接種哺乳動物細胞的至少1小時內發生(例如在2小時內、在3小時內、在4小時內、在5小時內、在6小時內、在7小時內、在8小時內、在9小時內、在10小時內、在12 小時內、在14小時內、在16小時內、在18小時內、在24小時內、在36小時內、在48小時內、在72小時內、在96小時內或在96小時後)。饋料批次培養物的細胞培養基通常在培養期結束時收取且被用於本文所述方法任一者中，但是饋料批次培養物的細胞培養基亦可在培養期期間於一或多個時間點之時收取且被用於本文所述方法任一者中。
技藝從事者將理解各種培養參數任一者(例如容器、體積、置換培養物體積的速率或頻率、攪動頻率、溫度、培養基及CO2濃度)可以任何組合來使用以施行此等方法。此外，本文所述或技藝中已知哺乳動物任一者可用來生產重組蛋白質。
例示性優點
本文所述方法可使存在於治療性蛋白質藥物物質中的重組治療性蛋白質的體積生產力實質增加。例如，本文所述方法可使存在於治療性蛋白質藥物物質中的重組治療性蛋白質的體積生產力增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍及10倍。重組治療性蛋白質的生物活性可以使用技藝中已知的各種方法來進行評估，且將取決於特定重組治療性蛋白質的活性。例如，本身為免疫球蛋白(例如抗體或抗體片段)之重組治療性蛋白質的生物活性可以藉由測量重組治療性抗體對其特異性表位結合的親和力來決定(例如使用Biocore或競爭性酵素連結免疫吸附分析)。重組治療性蛋白質可以是酵素(例如重組半乳糖苷酶，例如重組α-半乳糖苷酶)且生物活性可以藉由測量重組治療性酵素活性來決定(例如藉由測量可偵測受質濃度降低或可偵測產物濃度增加(例如使用分光光度法或光發射)來決定重組治療性酵素的催化速率常數)。例如，可以藉由 測量球形三醯神經醯胺(GL-3)或半乳糖二糖基神經醯胺含量降低或神經醯胺己糖苷或半乳糖含量增加來偵測重組治療性半乳糖苷酶的生物活性。
本文所述方法可使重組治療性蛋白質的回收百分比增加(例如在治療性蛋白質藥物物質方面，存在於液體培養基中之重組治療性蛋白質產量百分比增加)。例如，本發明方法可使重組治療性蛋白質產量百分比大於約70%、大於約80%、大於約82%、大於約84%、大於約86%、大於約88%、大於約90%、大於約92%、大於約94%、大於約96%，或大於約98%。本發明方法可使產量百分比介於約80%至約90%、介於約82%至約90%、介於約84%至約90%、介於約84%至約88%、介於約84%至約94%、介於約82%至約92%，或介於約85%至約95%。
存在於治療性蛋白質藥物物質中的重組治療性蛋白質濃度可大於約1.0mg/mL、大於約1.5mg/mL、大於約2.0mg/mL、大於約2.5mg/mL、大於約3.0mg/mL、大於約3.5mg/mL、大於約4.0mg/mL、大於約4.5mg/mL、大於約5.0mg/mL、大於約5.5mg/mL、大於約6.0mg/mL、大於約6.5mg/mL、大於約7.0mg/mL、大於約7.5mg/mL、大於約8.0mg/mL、大於約8.5mg/mL、大於約9.0mg/mL、大於約10.0mg/mL、大於約12.5mg/mL，或大於約15.0mg/mL。
本文所述方法可使治療性蛋白質藥物物質的重組治療性蛋白質淨產量在整個至少約5天、至少約10天、至少約15天、至少約20天、至少約25天、至少約30天、至少約35天、至少約40天、至少約45天、至少約50天、至少約55天、至少約60天、至少約65天、至少約70天、至少約75天、至少約80天、至少約85天、至少約90天、 至少約95天、至少約100天、至少約110天、至少約120天、至少約130天、至少約140天、至少約150天、至少約160天、至少約170天、至少約180天、至少約190天、至少約200天、至少約210天、至少約220天、至少約230天、至少約240天、至少約250天、至少約260天、至少約270天、至少約280天、至少約290天、至少約300天、至少約310天、至少約320天、至少約330天、至少約340天、至少約350天或至少約365天的連續期間為至少約5g/天、至少約6g/天、至少約7g/天、至少約8g/天、至少約9g/天、至少約10g/天、至少約11g/天、至少約12g/天、至少約13g/天、至少約14g/天、至少約15g/天、至少約16g/天、至少約17g/天、至少約18g/天、至少約19g/天、至少約20g/天、至少約25g/天、至少約30g/天、至少約35g/天、至少約40g/天。
本文所提供之方法可使比生產率明顯增進。例如，在重組蛋白質藥物物質中達到的比生產率比使用不同方法(例如批次純化方法或非整合及/或連續方法)所達到的比生產率高出至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍、180倍、190倍或200倍。本發明方法所達到之重組蛋白質藥物物質生產力可以是至少10,000單位/L、至少15,000單位/L、至少約20,000單位/L、至少約25,000單位/L、至少約30,000單位/L、至少約35,000單位/L或至少約40,000單位/L(在第一及/或第二液體培養基中)。本發明方法所達致的重組蛋白質藥物物質生產力可以是至少1g/L、至少1.5g/L、至少2.0g/L、至少2.5g/L、至少3.0g/L、至少4.0g/L、至少4.5g/L或至少5.0g/L。
本文所述方法亦為從液體培養基有效率地生產治療性藥物物質作準備。例如，在將含有治療性蛋白質之液體(例如液體培養基)饋送至第一MCCS中與從第二MCCS的出口沖提出治療性蛋白質藥物物質(含治療性蛋白質)之間所經過的時間是例如介於約4小時與約48小時，包括例如介於約4小時與約40小時、介於約4小時與約35小時、介於約4小時與約30小時、介於約4小時與約28小時、介於約4小時與約26小時、介於約4小時與約24小時、介於約4小時與約22小時、介於約4小時與約20小時、介於約4小時與約18小時、介於約4小時與約16小時、介於約4小時與約14小時、介於約4小時與約12小時、介於約6小時與約12小時、介於約8小時與約12小時、介於約6小時與約20小時、介於約6小時與約18小時、介於約6小時與約14小時、介於約8小時與約16小時、介於約8小時與約14小時、介於約8小時與約12小時、介於約10小時與約20小時、介於約10小時與約18小時、介於約10小時與約16小時、介於約10小時與約14小時、介於約12小時與約14小時、介於約10小時與約40小時、介於約10小時與約35小時、介於約10小時與約30小時、介於約10小時與約25小時、介於約15小時與約40小時、介於約15小時與約35小時、介於約15小時與約30小時、介於約20小時與約40小時、介於約20小時與約35小時、介於約20小時與約30小時在內。在其他實例中，在將含有治療性蛋白質之液體(例如液體培養基)饋送至第一MCCS中與從第二MCCS的出口沖提出治療性蛋白質藥物物質(含治療性蛋白質)之間所經過的時間為例如大於約4小時且小於約40小時，包括例如大於4小時且小於約39小時、約38小時、約37小時、約36小時、約35小時、約34小時、約33小時、約32小時、約31小時、約30小時、約29小時、 約28小時、約27小時、約26小時、約25小時、約24小時、約23小時、約22小時、約21小時、約20小時、約19小時、約18小時、約17小時、約16小時、約15小時、約14小時、約13小時、約12小時、約11小時、約10小時、約9小時、約8小時、約7小時、約6小時、約5小時或約4.5小時在內。
在下面實例中將進一步說明本發明，該等實例不會限制申請專利範圍中所述之本發明範疇。
實例 實例1.在連續流動式處理重組治療性蛋白質中使用單一週期性對流層析系統(PCCS)
施行一組初始實驗來測試在連續流動式處理重組治療性蛋白質中成功使用單一PCCS所必需的參數。
材料與方法 細胞培養
以灌注模式採用帶有聚醚磺0.2-μm過濾器之ATF(Refine Technologies)細胞留置系統來操作具有工作體積為12L的生物反應器(Broadley-James Corp.,Irvine,CA)。使用O2氣體的燒結噴嘴(20-μm)以維持溶解O2設定點，且使用N2氣體的鑽孔噴嘴(990-μm)以維持pCO2設定點。藉由離線測量(Vi-CELL,Beckman Coulter,Brea,CA)及/或經由線上容量探針(Futura,Aber Instruments,Grand Island,NY)監控細胞培養物中的細胞密度。
生物反應器細胞培養方法運行採用化學限定培養基以及分泌重組治療性抗體或重組治療性人類酵素的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株。在接種之後，生物反應器培養物中的細胞濃度馬上 為0.5 x 106細胞/mL。容許細胞生長至50-60 x 106細胞/mL。在培養物達到這個細胞密度之後，開始細胞擴散(cell-bleeding)方法以將細胞密度維持在穩態。細胞培養的灌注以1反應器體積/天始於接種後的第24小時，其中灌注速率與培養物中的細胞濃度成比例增加。將穩態細胞比灌注率維持於0.04-0.05nL/細胞-d。生物反應器中的溶解O2維持在超過30%飽和空氣。培養基中的pH是透過添加碳酸鈉而維持在介於6.8與6.95。將消泡劑(FoamAway,GIBCO,Grand Island,NY)添加至培養基中以控制起泡程度。在沒有額外澄清的情況下由生物反應器獲得的液體培養基被泵至單一PCCS上。
週期性對流(PCC)層析系統(PCCS)
此等實驗中使用的PCCS為訂製ÄKTA(GE Healthcare,Piscataway,NJ)系統，其能夠運行至多四個管柱。該系統配備有五個UV監測器(UV-900)、三個泵(P-900)、多個閥(PV-908、SV-903)、一個pH計與一個電導計(pH/C-900)，以及以Unicorn-為主的訂製軟體(GE Healthcare,Piscataway,NJ)。
貫穿曲線(breakthrough curves)
需要蛋白質貫穿曲線來決定單一PCCS的適當管柱切換策略。為了在捕獲條件下獲得貫穿曲線，施行前加載實驗。使用澄清收取物以及藉由UV吸光度(280nm)測量之貫穿型態評估動態結合力(DBC)作為滯留時間的函數。使用6.0-mL以及1.0-mL的管柱尺寸來分別測定重組治療性抗體與重組治療性人類酵素的DBC。選定滯留時間以使它們夠長到滿足結合力要求，同時也確保加載時間比管柱操作的其餘部分(洗滌、沖提、再生等)還長。因此，調整加載流速以達到就重組治療性抗體為2.5分的目標滯留時間而就重組 治療性人類酵素為4.8分的目標滯留時間。
單一PCCS整合至生物反應器
在PCCS中，蛋白質在管柱上的滯留時間(RT)於不增加管柱尺寸的情況下可能會降低，因為在系統中第一管柱的貫流可以在系統中的第二管柱上被捕獲。這個與眾不同的特徵被用來設計連續方法，使得培養收取物可以在任何灌注速率(D)下藉由改變管柱體積(V)和RT如等式1所示來進行處理：V=D * RT (1)
為了達到重組蛋白質的連續捕獲，單一PCCS如圖2中所示被直接連結到生物反應器。生物反應器/ATF的收取物是使用蠕動泵(Masterflex,Cole-Parmer,Vernon Hills,IL)被泵入作為小型緩衝容器的2-L可拋棄袋(Hyclone,Logan,UT)中。0.2-μm過濾器(Millipack 40,Millipore,Billerica,MA)被補充於生物反應器以及緩衝袋之間作為額外的無菌屏障。使用MabSelect SuRe(GE Healthcare,Piscataway,NJ)以及於XK16TM，1.6-cm x 6-cm(GE Healthcare)管柱中的疏水性交互作用層析(HIC)介質來分別捕獲重組治療性抗體以及重組治療性人類酵素。各個管柱的操作是由平衡、加載、洗滌、沖提，以及再生步驟所組成。因為實驗台規模單一PCCS的設計不容許封閉式操作，在線上將疊氮化鈉添加至方法流。
分析方法 重組治療性抗體
使用內部分析來定量宿主細胞白質(HCP)的滴定濃度、聚集、殘留蛋白質A，以及重組抗體的效力。使用蛋白質A管柱(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)來測量滴定濃度。藉由ELISA使 用內部生產的抗原和抗體來定量殘留蛋白質A及HCP。藉由HPLC-SEC使用TSK-GEL，G3000SWXL，7.8mM X 30cm，5-μm管柱(TOSO HAAS,King of Prussia,PA)來測量聚集。藉由活體外以細胞為主的分析測量重組治療性抗體效力。
重組治療性人類酵素活性分析
在管柱加載物以及洗出液中的重組治療性人類酵素的滴定濃度是藉由測量連結至p-硝基苯酚(pNP)(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)之合成受質的水解速率來決定。樣品(25-μL)與225μL的40μM受質一起在37℃下培育歷時15分。以250μL的0.3M甘胺酸，pH 10.5淬滅反應，並且在400nm下測量吸光度。一個活性單位定義為於限定分析條件下每分鐘將一微莫耳受質水解成pNP所需的重組治療性酵素數量。蛋白質濃度是藉由RP-HPLC使用POROS R2/H 2.1 X 30mM管柱(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)來測定。比活性表示為pNP(單位)/mg蛋白質。
內部分析被用於定量HCP、聚集以及純度。HCP是藉由ELISA使用專用試劑來分析。聚集(SEC-HPLC)分析使用TSK-GEL，G3000SWXL，7.8mM X 30cm，5-μm管柱(TOSO HAAS,King of Prussia,PA)，而RP-HPLC純度分析使用YMC Octyl 2mm X 100mM，5-μm管柱(Waters,Milford,MA)。
單一PCCS的基本概念
管柱操作大體上由加載、洗滌、沖提，以及再生步驟組成。在單一PCCS中，多管柱被用來不連續地以及連續地以循環方式運行相同的步驟。因為管柱是串聯地操作，來自一個管柱的溢流以及洗滌物被第二個管柱所捕獲。PCC系統這個與眾不同的特徵容 許樹脂負載接近其靜態結合力而非動態結合力，如同在批次模式層析期間典型的情況。僅為了簡化說明起見，3-管柱系統被用來說明PCCS操作的這個原則(圖3)。一個循環定義為產生三個分離沖提池的三個完整管柱操作。在一個循環的所有三個步驟完成之後，重新開始循環。因此，饋料流在操作中的PCC系統中被連續地處理，而重組治療性蛋白質從各個管柱的沖提是不連續且週期性的。
管柱切換策略
為了在PCCS循環中從一個步驟推進到另一個步驟(圖3)，採用管柱切換策略。在PCCS中，每個管柱需要有兩個自動化切換操作，其第一者是有關於初始重組治療性蛋白質貫流，而第二者是與管柱飽和同時發生。本實施例中所述的單一PCCS是使用控制策略採用動態UV監控來進行操作。大體上，管柱切換可以是由能夠在有回饋控制的情況下線上測量重組治療性蛋白質濃度的任一種製程分析技術(PAT)工具來決定。但是，即時操作的PAT工具(諸如UV)就提供管柱切換啟動訊號來說非常適合。
圖4描述在饋料入口與管柱出口之間根據UV吸光度差異(△UV)的管柱切換原理。在管柱加載期間(步驟1；圖3)，當吸光度穩定時，PCC控制系統測定不純物基線。當重組治療性蛋白質貫穿時(步驟2；圖3)，出口UV訊號增加超過不純物基線。在這個時候，若△UV已達到預定閾值(例如重組治療性蛋白質的3%貫流)，管柱1的溢流被導向管柱2而非廢料(t1；圖4)。當管柱1接近重組治療性蛋白質飽和且△UV已達到預定值(t2；圖4)，則饋料切換至管柱2。這個以△UV為主的管柱切換策略的一個重要優點在於其容許均勻加載管柱而與饋料重組治療性產物濃度和管柱容量無關。在合理範圍內， 該策略的收取物滴定濃度變異性是足夠的，從而增強系統可靠性。
基於饋料與管柱出口之間的UV吸光度差異，管柱切換時間的精確決定是單一PCCS即時控制策略的關鍵因素之一。這需要將所有五個UV偵測器(一個饋料偵測器與四個管柱出口偵測器)同步化在一個窄範圍內。UV偵測器是使用3%丙酮溶液來校正。偵測器路徑長度是手動調整，以使得所有五個吸光度值在另一者的0.5%內。路徑長度調整為≦10%。
使用重組抗體之概念的證明 細胞培養
這個研究的模型重組治療性抗體是在70天期間於12-L灌注生物反應器中在材料與方法中所述條件下連續地生產(圖5)。體積生產率在30天與40天之間達到1g/L-d，然後因為未經確認的理由而慢慢地下降。峰體積生產率比使用相同細胞株的饋料批次方法還高>5倍，其中連續方法有明顯向上趨勢。應注意到，研究目的是要證明整合連續系統的功能性。事實上，體積生產率改變容許測試單一PCCS的可靠性，且尤其是其應付收取物滴定濃度變異性的能力。
下游
在批次層析中，因為增加滯留時間(RT)以及之後過大化管柱而達到最大DBC。在PCCS中，可以降低RT而無需增加管柱尺寸，因為來自第一管柱的貫流可以在第二管柱上被捕獲。這個PCCS的優點容許較小的管柱尺寸與較短RT。為了使單一PCCS方法成為連續的，RT必須比方法其餘部分(平衡、洗滌、沖提、再生等)所花的合併時間還長。因此，與特定方法之PCCS一起使用的管柱尺 寸和數量取決於樹脂結合力，其指明加載步驟長度。重組抗體方法中的MabSelect SuReTM樹脂的高結合力使得加載步驟比管柱步驟其餘者合併還要長，容許使用含有三個管柱的PCCS進行連續重組治療性蛋白質捕獲。前加載實驗被用來決定重組抗體的不同滯留時間之時的貫穿曲線(數據未顯示)，而2.5分的滯留時間被發現為最佳。
為了測試單一PCCS的長期性能，連續地捕獲生物反應器收取物歷時30天，其對應於38個PCC循環以及110管柱操作，而沒有任何以時間為基礎的效能下降徵象。基於數個性能指標評估連續捕獲在研究持續期間的一致性，性能指標為例如層析概況、回收以及重組抗體主要品質屬性(CQA)。饋料流的UV概況在運行持續期間近乎為恆定，而3個管柱UV出口在不同循環之間可再現。針對捕獲洗出液分析的回收以及五個CQA在三個管柱之間相當，以及在整個連續收取捕獲期間相當(圖6)。這些結果證明，從灌注生物反應器的直接連續重組抗體捕獲的可行性，在整個長時間期間內產生一致的方法效能指標與CQA。
單一PCCS方法與現有單管柱批次層析系統就已建立層析管柱效應與原始材料消耗來說相當。具體而言，相較於批次模式純化，在單一PCCS中的層析介質容量利用率增加達20%，緩衝劑使用降低達25%，而個別管柱尺寸降低75倍。
使用重組人類酵素之概念的證明 細胞培養
這個研究的重組治療性人類酵素是70天連續培育於12-L生物反應器中在材料與方法中所述條件下生產(圖7)。體積生產率在約第25天達到0.4g/L-d，且在之後於CV為16%的情況下維持穩 定，大部分是與分析變異性有關。相較於製造相同分子的舊有方法，體積生產力為40倍高，其是因為高細胞密度及明顯增進細胞比生產率的協同影響。
下游
這個研究目的是決定捕獲管柱效能標、整個管柱以及循環的捕獲洗出液的CQA，和單一PCCS硬體和控制策略在長時間期間之可靠性的一致性。若HIC捕獲管柱的結合力低(1g/L樹脂)，則加載管柱所需時間比方法步驟其餘部分(洗滌、沖提、再生等)合併還短。這導致其中需要4個管柱而非3個管柱的單一PCCS來連續地處理收取物。因此，發展出單一4-管柱PCCS並用來連續地捕獲重組人類酵素。
這個研究分成兩個階段。第一階段是由方法開發所組成，其中先前收集的收取物由無菌可拋棄袋被饋送至單一PCCS。在第二階段期間，該單一PCCS直接與生物反應器合併供連續處理用，如圖2所概述。在這個研究的第一階段中，該單一PCCS連續地操作歷時9天以及41個單一PCCS循環或164個管柱操作。饋送的UV概況在整個運行期間是恆定的，而4個管柱出口UV訊號在4個管柱以及整個不同循環為合理一致的。單一PCCS操作在整個運行期間的一致性是藉由分析經捕獲之重組治療性蛋白質的額外管柱效能指標以及CQA所證實(圖8)。所分析的回收以及五個CQA與四個管柱在整個連續收取捕獲9天期間相當。
在本研究的第二階段中，重組治療性蛋白質從灌注生物反應器藉由將單一PCCS與生物反應器整合而被直接捕獲，如圖2中所示。主要目的是在高度複雜、非抗體蛋白質的情況下於長時間 期間證明連續生物處理平台的效能。管柱尺寸以及RT是依據等式1來按比例改變以達到生物反應器收取物的連續捕獲。整合的單一PCCS連續地操作歷時31天以及160個單一PCCS循環，其對應於640個單獨管柱操作，沒有以時間為主的效能下降徵象。饋送UV概況、4管柱出口UV概況與CQA就PCCS操作整個持續期間一致。因為數據實際上與在研究第一階段中所得數據相同，未顯示時間概況。
總結，這些數據指明單一PCCS可用來處理由哺乳動物細胞培養物生產的重組治療性蛋白質(重組治療性抗體以及重組治療性人類酵素均是)。
實例2.在連續流動式處理重組蛋白質中使用雙週期性對流層析系統(PCCS)
產生具有兩個不同PCCS的系統，其容許連續生物處理來自生物反應器之生物培養基的重組治療性抗體。含有重組治療性抗體的系統洗出液基本上可直接用於調配作為醫藥組合物且是未經調配的治療性蛋白質藥物物質。
材料與方法 細胞培養
以灌注模式使用帶有聚醚磺0.2-μm過濾器之ATF(Refine Technologies)細胞留置系統來操作具有工作體積為10L的生物反應器(Broadley-James Corp.,Irvine,CA)。使用O2氣體的燒結噴嘴(20-μm)以維持溶解O2設定點，且使用N2氣體的鑽孔噴嘴(990-μm)以維持培養基中pCO2設定點。藉由離線測量(Vi-CELL,Beckman Coulter,Brea,CA)及/或經由線上容量探針(Futura,Aber Instruments,Grand Island,NY)監控生物反應器中的細胞密度。生物反應器細胞 培養方法運行採用化學限定培養基以及生產重組治療性單株抗體的CHO細胞株。在接種之後，生物反應器在液體培養基中含有活細胞濃度為0.5 x 106細胞/mL。容許細胞生長至細胞密度為30-40 x 106細胞/mL。在細胞達到這個密度之後，開始細胞擴散方法以將細胞密度維持在穩態。灌注始於接種後24小時，且在生物反應器中被移除且被置換的液體培養基體積與細胞濃度成比例增加。將穩態細胞比灌注率維持於0.04-0.05nL/細胞-d。液體培養基中的溶解O2維持在超過30%飽和空氣。液體培養基的pH透過添加碳酸鈉而維持在介於6.8與6.95。使用消泡劑(FoamAway,GIBCO,Grand Island,NY)來控制生物反應器的起泡程度。在沒有額外澄清的情況下由生物反應器收取的液體培養基被泵至雙PCC系統上。
下游
為了要開發用以生產重組蛋白質藥物物質(DS)的整合且完全連續方法，使用兩個PCCS(PCCS1與PCCS2)(圖9)。除了容許使用週期性對流層析以供連續管柱操作以外，各個PCCS執行多個操作。因為實驗台規模PCCS的設計不容許封閉式操作，在線上將疊氮化鈉添加至方法流。小規模系統的限制可以成功地藉由適當設計大規模PCCS硬體來處理。
雙週期性對流(PCC)層析系統
此研究中使用的兩個PCCS為訂製ÄKTA(GE Healthcare,Piscataway,NJ)系統，其能夠運行至多四個管柱。各個系統配備有五個UV監測器(UV-900)、三個泵(P-900)、多個閥(PV-908、SV-903)、一個pH計與一個電導計(pH/C-900)，以及以Unicorn-為主的訂製軟體(GE Healthcare,Piscataway,NJ)。
生物反應器整合至PCCS1與PCCS2
生物反應器/ATF的收取物是使用蠕動泵(Masterflex,Cole-Parmer,Vernon Hills,IL)被泵入作為小型緩衝容器的2-L可拋棄袋(Hyclone,Logan,UT)中。0.2-μm過濾器(Millipack 40,Millipore,Billerica,MA)被補充於生物反應器以及緩衝袋之間作為額外的無菌屏障。於XK16TM，1.6cm x 6cm管柱中使用MabSelect SuRe(GE Healthcare,Piscataway,NJ)層析介質來捕獲重組治療性單株抗體。各個蛋白質A管柱(pH 3.75)的洗出液以1小時的滯留時間被泵入250-mL玻璃攪拌貯器中以執行病毒不活化(VI)操作。0.2-μm過濾器(Millipack 100,Millipore,Billerica,MA)被添加至PCCS1與PCCS2之間以作為混合裝置並且用於下游管柱的顆粒屏障。
使用三個XK16TM，1.1cm x 7cm(GE Healthcare)Capto S(GE Healthcare,Piscataway,NJ)層析管柱以結合與沖提模式在PCCS2上進一步純化來自PCCS1之經調整加載材料。最後，使用直接連結至Capto-S管柱出口的7-mL SartoBind Q-膜(Sartorious XX)將Capto S洗出液精煉，以得到重組蛋白質藥物物質。此外，在加載至Capto-S以及SartoBind Q-膜之前需要分別使用PCCS1和PCCS2泵來進行線上稀釋(圖9)。各個管柱操作由平衡、加載、洗滌、沖提以及再生步驟組成。Sartobind Q-膜由平衡、加載、洗滌以及再生步驟組成。表1與表2顯示分別使用PCCS1及PCCS2施行之所有單元操作的方法參數。圖9也顯示被泵過兩個PCCS之液體的流速。
分析方法
使用內部分析來定量滴定濃度宿主細胞蛋白質(HCP)、聚集、殘留蛋白質A，以及重組單株抗體效力。使用蛋白質A管柱(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)來測量滴定濃度。藉由ELISA使用內部製造的抗原和抗體來定量殘留蛋白質A及HCP。藉由HPLC-SEC使用TSK-GEL，G3000SWXL，7.8mM X 30cm，5-μm管柱(TOSO HAAS,King of Prussia,PA)來測量聚集。藉由活體外以細胞為主的分析測量重組治療性單株抗體效力。
管柱切換策略
為了在PCCS循環中從一個步驟推進到另一個步驟(圖3)，採用管柱切換策略。在各個PCC中，每個管柱需要有兩個自動化切換操作，其第一者是有關於初始重組治療性蛋白質貫流，而第二者是與管柱飽和同時發生。本工作中所述的PCC系統是使用新穎控制策略採用動態UV監控以及以時間為基礎的切換來進行操作。大體上，管柱切換可以是由能夠在有回饋控制的情況下線上測量重組治療性蛋白質濃度的任一種PAT工具來決定。
圖4描述在饋料入口與管柱出口之間根據UV吸光度差異(△UV)的管柱切換原理。在管柱加載期間(步驟1；圖3)，當吸光度穩定時，PCC控制系統測定不純物基線。當重組治療性蛋白質貫穿時(步驟2；圖3)，出口UV訊號增加超過不純物基線。在這個時候，若△UV已達到預定閾值(例如重組治療性蛋白的3%貫流)，管柱1的溢流被導向管柱2而非廢料(t1；圖4)。當管柱1接近重組治療性蛋白質飽和且△UV已達到預定值(t2；圖4)，則饋料切換至管柱2。這個以△UV為主的管柱切換策略的一個重要優點在於其容許均勻加載管柱而與饋料重組治療性產物濃度和管柱容量無關。在合理範圍內，該策略的收取物滴定濃度變異性是足夠的，從而增強系統可靠性。
如上所討論，基於饋料以及管柱出口之間UV吸光度差異來精確決定管柱切換時機是PCC即時控制策略的關鍵因素之一。這需要將所有五個UV偵測器(一個饋料偵測器與四個管柱出口偵測器)同步化在一個窄範圍內。UV偵測器是使用3%丙酮溶液來校正。偵測器路徑長度是手動調整，以使得所有五個吸光度值在另一者的0.5%內。路徑長度調整為≦10%。
用於管柱切換的第二個策略是關於時間。因為重組治療性蛋白質滴定濃度在31天生產期間為半穩態，可基於預定閾值以及飽和所需時間來計算管柱切換。
結果與討論
為了測試雙PCC系統的長期效能，收取自生物反應器的液體培養基被連續地純化歷時31天，其對應於372個純化循環，或25個雙PCC系統生產批次，其中沒有基於時間的效能下降徵象。基於數個性能指標評估連續捕獲在研究持續期間的一致性，性能指標 為諸如層析概況、回收以及重組治療性單株抗體主要品質屬性(CQA)。饋料流的UV概況在運行持續期間近乎為恆定，而3個管柱UV出口在不同循環之間可再現。這些詳細內容以及循環至循環再現性在圖12-14中所示運行層析快照中被證實。針對捕獲洗出液分析的回收以及五個CQA與三個管柱之間相當，以及在整個連續收取捕獲期間相當(圖16)。這些結果證明，使用雙PCC系統從灌注生物反應器的直接連續重組治療性單株抗體捕獲的可行性，在長時間期間內產生一致的方法效能指標與CQA。模型重組治療性單株抗體被用來研究使用整合雙PCC系統之完全連續生物處理平台的可行性。
使用MAb之概念的證明 細胞培養
這個研究的模型重組治療性單株抗體是在59天期間於12-L灌注生物反應器中在材料與方法中所述條件下連續地生產。體積生產力從第10天至第59天維持在介於1.0-1.6g/L。峰體積生產力比使用相同細胞株的饋料批次方法還高~8倍，其中連續方法因為最佳化灌注率及/或增加穩態細胞密度而有明顯向上趨勢(圖11與12)。應注意到，研究目的是要證明整合連續方法的功能性。事實上，體積生產率改變容許測試PCC系統的可靠性，且尤其是其應付收取物滴定濃度變異性的能力。
下游
主要目的是要證明在重組治療性單株抗體的情況下，使用整合雙PCC系統在長時間期間連續生物處理平台的效能。蛋白質A及陽離子交換管柱的管柱/膜尺寸以及滯留時間按比例改變以達成將生物反應器收取物連續處理成未調配藥物物質(DS)。整合 系統連續地操作歷時31天，其對應於15個獨立未調配DS批次(批次定義為處理1.25天，15份Q-膜濾液或0.8g的DS)，其中沒有任何以時間為基礎的效能下降徵象。蛋白質A捕獲與Capto-S，以及Sartobind Q膜濾液的饋料UV概況、3-管柱出口概況在整合生物反應器-PCC1-PCC2操作持續期間是恆定的(圖12-14)。此外，未調配DS的所有CQA就整個PCC操作持續期間是一致的(圖15與16)。使用整合連續雙PCC系統用以生產重組治療性單株抗體相較於現有批次純化方法的優點包括增加體積生產力、增加層析介質容量利用、降低緩衝劑使用體積，以及降低個別管柱尺寸體積。
實施完全連續生物製造平台
目前，有兩種用於生醫製造的主要平台：(1)灌注生物反應器，以及(2)饋料批次生物反應器用於生產穩定蛋白質。在兩種情況下，本文所述非限制性例示性系統提供下有多個批次單元操作的生物反應器操作，多個批次單元操作包括澄清、捕獲、精煉、層析與容納步驟。本實例中所述例示性完全連續生產技術容許流線重組治療性蛋白質生產。如本實例中所證明，這個例示性系統與高生產株和化學限定培養基的組合可達到相當高的細胞密度以及體積生產力，同時在穩態下操作。因此，可以相對於習知方法(其中反應器規模超過10,000L)使用較小的生物反應器(<500L)達到充足的生產力。使用ATF細胞分離裝置排除澄清單元操作。最重要的是，完全連續生產的直接整合使收取物容納箱變得過時，並在連續系統中將大批次捕獲管柱取代為至多小了2個量級的較小管柱。此外，連續處理所收取的液體培養基賦予重組治療性蛋白質品質明顯益處。具體而言，消除收取物以及其他容納步驟會降低目標重組治療性蛋白質 暴露於酵素、化學及物理降解，且從而減輕重組治療性蛋白質穩定性風險。總結來說，成功開發呈小規模的完全連續生物處理平台用以製造重組單株抗體顯露其大規模工業建置的可能性。這些數據顯示，例示性整合完全連續生物處理系統就重組治療性蛋白質製造提供甚過傳統方法的獨特益處。例如，下表3與4列出一些本實例中所述例示性方法及系統提供的益處。
實例3. 包括500-L生物反應器的例示性雙-PCC系統
下述方法以及系統可用來施行連續生物處理自500-L生物反應器培養物收取的重組治療性蛋白質。
材料與方法 細胞培養
以灌注模式使用帶有聚醚磺0.2-μm過濾器之ATF(Refine Technologies)細胞留置系統來操作具有工作體積為500-L的生物反應器。使用O2氣體的燒結噴嘴(20-μm)以維持溶解O2設定點，且使用N2氣體的鑽孔噴嘴(990-μm)以維持pCO2設定點。藉由離線測量(Vi-CELL,Beckman Coulter,Brea,CA)及/或經由線上容量探針(Futura,Aber Instruments,Grand Island,NY)監控細胞培養物中的細胞密度。
生物反應器細胞培養方法運行採用化學限定培養基 以及分泌重組抗體或重組人類酵素的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株。在接種之後，生物反應器培養物中的細胞濃度馬上為0.5 x 106細胞/mL。容許細胞生長至50-60 x 106細胞/mL。在培養物達到這個細胞密度之後，開始細胞擴散方法以將細胞密度維持在穩態。細胞培養的灌注以1反應器體積/天始於接種後的第24小時，其中灌注速率與培養物中的細胞濃度成比例增加。將穩態細胞比灌注率維持於0.04-0.05nL/細胞-d。生物反應器中的溶解O2維持在超過30%飽和空氣。培養基中的pH透過添加碳酸鈉而維持在介於6.8與6.95。將消泡劑(FoamAway,GIBCO,Grand Island,NY)添加至液體培養基中以控制起泡程度。在沒有額外澄清的情況下由生物反應器獲得的液體培養基被泵至單一PCC系統上。
週期性對流(PCC)層析系統
此等實驗中使用的PCC系統為訂製ÄKTA(GE Healthcare,Piscataway,NJ)系統，其能夠運行至多四個管柱。該系統配備有五個UV監測器(UV-900)、三個泵(P-900)、多個閥(PV-908、SV-903)、一個pH計與一個電導計(pH/C-900)，以及以Unicorn-為主的訂製軟體(GE Healthcare,Piscataway,NJ)。第一PCCS為四管柱PCCS，其中前三個管柱含有蛋白質A結合樹脂並施行從液體捕獲重組治療性蛋白質的單元操作，而第四個管柱施行不活化存在於液體中之病毒的單元操作(例如能夠在pH 3.75下容納液體約1小時)。第二PCCS含有總計三個施行純化重組治療性蛋白質之單元操作的層析管柱(含有陽離子交換樹脂)以及一個施行精煉之單元操作的層析膜(含有陽離子交換樹脂)。用來連續生產重組蛋白質藥物物質之第一與第二PCC系統的比流速以及其他特性分別顯示於表5與6中。
貫穿曲線
需要蛋白質貫穿曲線來決定各個PCC系統的適當管柱切換策略。為了在捕獲條件下獲得貫穿曲線，施行前加載實驗。使用澄清收取物以及藉由UV吸光度(280nm)測量之貫穿型態評估動態結合力(DBC)作為滯留時間的函數。使用6.0-mL以及1.0-mL的管柱尺寸來分別測定重組治療性抗體與重組治療性人類酵素的DBC。選定滯留時間以使它們夠長到滿足結合力要求，同時也確保加載時間比管柱操作(洗滌、沖提、再生等)的其餘部分還長。
單一PCC系統整合至生物反應器
在PCC系統中，蛋白質在管柱上的滯留時間(RT)於不增加管柱尺寸的情況下可降低，因為在系統中第一管柱的貫流可以在第二管柱上被捕獲。這個與眾不同的特徵被用來設計連續方法，使得培養收取物可以在任何灌注速率(D)下藉由改變管柱體積(V)和RT如等式1所示來進行處理：V=D * RT (1)
為了達到重組蛋白質的連續捕獲，第一單一PCCS如圖2中所示被直接連結到生物反應器。生物反應器/ATF的收取物是使用蠕動泵(Masterflex,Cole-Parmer,Vernon Hills,IL)被泵入作為小型緩衝容器的2-L可拋棄袋(Hyclone,Logan,UT)中。0.2-μm過濾器(Millipack 40,Millipore,Billerica,MA)被補充於生物反應器以及緩衝袋之間作為額外的無菌屏障。使用MabSelect SuRe(GE Healthcare,Piscataway,NJ)管柱來捕獲重組治療性抗體以及重組治療性人類酵素。各個管柱的操作是由平衡、加載、洗滌、沖提，以及再生步驟所組成。因為實驗台規模單一PCC系統的設計不容許封閉式操作，在線上將疊氮化鈉添加至方法流。
分析方法 重組抗體
使用內部分析來定量宿主細胞白質(HCP)的滴定濃度、聚集、殘留蛋白質A，以及重組抗體的效力。使用蛋白質A管柱(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)來測量滴定濃度。藉由ELISA使用內部生產的抗原和抗體來定量殘留蛋白質A及HCP。藉由HPLC-SEC使用TSK-GEL，G3000SWXL，7.8mM X 30cm，5-μm管 柱(TOSO HAAS,King of Prussia,PA)來測量聚集。藉由活體外以細胞為主的分析測量重組抗體效力。
單一PCC系統的基本概念
管柱操作大體上由加載、洗滌、沖提，以及再生步驟組成。在各個PCC系統中，多管柱被用來不連續地以及連續地以循環方式運行相同的步驟。因為管柱是串聯地操作，來自一個管柱的溢流以及洗滌物被第二個管柱所捕獲。PCC系統這個與眾不同的特徵容許樹脂負載接近其靜態結合力而非動態結合力，如同在批次模式層析期間典型的情況。僅為了簡化說明起見，3-管柱系統被用來說明PCC系統操作的這個原則(圖3)。一個循環定義為產生三個分離沖提池的三個完整管柱操作。在一個循環的所有三個步驟完成之後，重新開始循環。因此，饋料流在操作中的PCC系統中被連續地處理，而重組治療性蛋白質從各個管柱的沖提是不連續且週期性的。
管柱切換策略
為了在PCC系統循環中從一個步驟推進到另一個步驟(圖3)，採用管柱切換策略。在PCC系統中，每個管柱需要有兩個自動化切換操作，其第一者是有關於初始重組治療性蛋白質貫流，而第二者是與管柱飽和同時發生。本實例中所述的各個單一PCC系統是使用控制策略採用動態UV監控來進行操作。大體上，管柱切換可以是由能夠在有回饋控制的情況下線上測量重組治療性蛋白質濃度的任一種製程分析技術(PAT)工具來決定。但是，即時操作的PAT工具(諸如UV)就提供管柱切換啟動訊號來說非常適合。
圖4描述在饋料入口與管柱出口之間根據UV吸光度差異(△UV)的管柱切換原理。在管柱加載期間(步驟1；圖3)，當吸光度 穩定時，PCC控制系統測定不純物基線。當重組治療性蛋白質貫穿時(步驟2；圖3)，出口UV訊號增加超過不純物基線。在這個時候，若△UV已達到預定閾值(例如重組治療性蛋白質的3%貫流)，管柱1的溢流被導向管柱2而非廢料(t1；圖4)。當管柱1接近重組治療性蛋白質飽和且△UV已達到預定值(t2；圖4)，則饋料切換至管柱2。這個以△UV為主的管柱切換策略的一個重要優點在於其容許均勻加載管柱而與饋料重組治療性蛋白質濃度和管柱容量無關。在合理範圍內，該策略的收取物滴定濃度變異性是足夠的，從而增強系統可靠性。
基於饋料與管柱出口之間的UV吸光度差異，管柱切換時機的精確決定是各個單一PCC系統即時控制策略的關鍵因素之一。這需要將所有五個UV偵測器(一個饋料偵測器而四個管柱出口偵測器)同步化在一個窄範圍內。UV偵測器是使用3%丙酮溶液來校正。偵測器路徑長度是手動調整，以使得所有五個吸光度值在另一者的0.5%內。路徑長度調整為≦10%。
其他具體例
應理解已結合本發明的詳細說明來說明本發明，前述說明意欲釋明而非限制發明範疇，發明範疇是由隨附申請專利範圍的範疇所界定。其他態樣、優點以及修飾落在以下申請專利範圍的範疇內。

Claims (37)

  1. 一種製造治療性蛋白質藥物物質之整合與連續方法，其包含：(i)在包含液體培養基的灌注生物反應器中使細胞分泌重組治療性蛋白質至培養基之條件下培養分泌重組治療性蛋白質的細胞，且其中該培養基至少90%不含細胞之體積由灌注生物反應器連續地或週期性地移除並饋入第一週期性對流層析系統(PCCS1)；(ii)使用PCCS1捕獲來自培養基的該重組治療性蛋白質，其中包含重組治療性蛋白質的PCCS1的洗出液被連續地饋送至第二週期性對流層析系統(PCCS2)中；以及(iii)使用PCCS2純化並精煉重組治療性蛋白質，其中純化係在PCCS2中使用樹脂進行，該樹脂相較於PCCS2中用以進行精煉之樹脂，具有不同之化學結構，且來自PCCS2的洗出液為治療性蛋白質藥物物質；及其中該方法被整合且從培養步驟連續地運行至純化與精煉步驟，且由饋送培養基至PCCS1與由PCCS2洗出治療性蛋白質藥物物質之間的經過時間為約4小時至約9小時。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中PCCS1施行至少兩個不同的單元操作。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中PCCS1或PCCS2或兩者的使用涉及管柱切換。
  4. 如申請專利範圍第2項之方法，其中PCCS1施行捕獲重組治療性蛋白質以及病毒失活化的單元操作。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中PCCS1或PCCS2或二者採用至少兩個層析管柱。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該PCCS1包括四個層析管柱，其中PCCS1中該四管柱的三個施行從培養基捕獲重組治療性蛋白質的單元操作。
  7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中使用親和力層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析或分子篩層析來施行捕獲。
  8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中親和力層析是使用選自下列組成之群組的捕獲機制來施行：蛋白質A-結合捕獲機制、受質-結合捕獲機制、抗體-或抗體片段-結合捕獲機制、適體-結合捕獲機制，以及輔因子-結合捕獲機制。
  9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中親和力層析是使用蛋白質-A結合捕獲機制來施行，而重組治療性蛋白質為抗體或抗體片段。
  10. 如申請專利範圍第6項之方法，其中來自PCCS1四個管柱中的三個之含有重組治療性蛋白質的洗出液被饋送至四管柱PCCS1的第四個管柱中。
  11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中PCCS1的第四個管柱藉由將來自PCCS1四個管柱中的三個之含有重組治療性蛋白質的洗出液培育在pH約3.0至5.0下而施行病毒失活化的單元操作。
  12. 如申請專利範圍第11項之方法，其進一步包括使用線上緩衝劑調整貯器在洗出液由PCCS1的第四個管柱被饋送至PCCS2之前調整來自PCCS1的第四個管柱之包含重組治療性蛋白質之洗出液的pH。
  13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中PCCS2包括三個層析管柱以及一個層析膜，其中PCCS2的三個層析管柱透過陽離子或陰離子交換層析施行純化來自PCCS1第四個管柱之洗出液的重組治療性蛋白質的單元操作，且來自PCCS2中三個層析管柱的包含重組蛋白質之洗出液被 饋送至PCCS2的層析膜中。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中PCCS2的層析膜透過陽離子或陰離子交換層析施行精煉存在於PCCS2之三個層析管柱之洗出液中的重組治療性蛋白質的單元功能。
  15. 如申請專利範圍第14項之方法，其中PCCS2的層析膜透過陽離子交換層析施行精煉的單元功能。
  16. 如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包括將該治療性蛋白質藥物物質調配成醫藥組合物。
  17. 如申請專利範圍第1項之方法，其中重組治療性蛋白質為抗體或抗體片段、酵素、經工程化蛋白質，或免疫原性蛋白質或蛋白質片段。
  18. 如申請專利範圍第1項之方法，其中整個方法不包括儲存重組治療性蛋白質於1、2或3個斷流箱(break tank)。
  19. 如申請專利範圍第1項之方法，其中整個方法包括儲存重組治療性蛋白質於斷流箱(break tank)。
  20. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該1、2或3個斷流箱用以儲存治療性蛋白質總計約5分鐘至約4小時之時段。
  21. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該1、2或3個斷流箱具1mL至約100mL之體積。
  22. 如申請專利範圍第1項之方法，其中由饋送培養基至PCCS1與由PCCS2洗出治療性蛋白質藥物物質之間的經過時間大於約4小時且小於約7小時。
  23. 如申請專利範圍第22項之方法，其中由饋送培養基至PCCS1與由PCCS2洗出治療性蛋白質藥物物質之間的經過時間大於約4小時且小於約6小時。
  24. 如申請專利範圍第23項之方法，其中由饋送培養基至PCCS1與由PCCS2洗出治療性蛋白質藥物物質之間的經過時間大於約4小時且小於約5小時。
  25. 一種製造治療性蛋白質藥物物質之整合且連續性方法，該方法包含：(i)在包含液體培養基的灌注生物反應器中使細胞分泌重組治療性蛋白質至培養基之條件下培養分泌重組治療性蛋白質的細胞，且其中該培養基至少90%不含細胞之體積由灌注生物反應器連續地或週期性地移除並饋入第一週期性對流層析系統(PCCS1)；(ii)使用PCCS1捕獲來自培養基的該重組治療性蛋白質，其中包含重組治療性蛋白質的PCCS1的洗出液被連續地饋送至第二週期性對流層析系統(PCCS2)中；以及(iii)使用PCCS2純化並精煉重組治療性蛋白質，其中純化係在PCCS2中使用樹脂進行，該樹脂相較於PCCS2中用以進行精煉之樹脂，具有不同之化學結構，且來自PCCS2的洗出液為治療性蛋白質藥物物質；其中：該方法被整合且從培養步驟連續地運行至純化與精煉步驟，整個方法包括儲存重組治療性蛋白質於最多1、2或3個斷流箱中，且該1、2或3個斷流箱儲存治療性蛋白質總計約5分鐘至少於約6小時之時段或具1mL至約100mL之體積。
  26. 如申請專利範圍25之方法，其中該1、2或3個斷流箱儲存治療性蛋白質總計約5分鐘至少於約6小時之時段。
  27. 如申請專利範圍26之方法，其中該1、2或3個斷流箱儲存治療性蛋白質總計約5分鐘至少於約4小時之時段。
  28. 如申請專利範圍27之方法，其中該1、2或3個斷流箱儲存治療性蛋白質總計約5分鐘至少於約2小時之時段。
  29. 如申請專利範圍25之方法，其中該1、2或3個斷流箱具1mL至約100mL之體積。
  30. 如申請專利範圍29之方法，其中該1、2或3個斷流箱具1mL至約60mL之體積。
  31. 如申請專利範圍30之方法，其中該1、2或3個斷流箱具1mL至約20mL之體積。
  32. 如申請專利範圍25之方法，其中該PCCS1進行至少二個不同之單元操作。
  33. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該PCCS1包括四個層析管柱，其中PCCS1中四管柱的三個施行從培養基捕獲重組治療性蛋白質的單元操作。
  34. 如申請專利範圍第33項之方法，其中來自PCCS1四個管柱中的三個之含有重組治療性蛋白質的洗出液被饋送至四管柱PCCS1的第四個管柱中，且PCCS1的第四個管柱藉由將來自PCCS1四個管柱中的三個之含有重組治療性蛋白質的洗出液培育在pH約3.0至5.0下而施行病毒失活化的單元操作。
  35. 如申請專利範圍第34項之方法，其中PCCS2包括三個層析管柱以及一個層析膜，其中PCCS2的三個層析管柱透過陽離子或陰離子交換層析施行純化來自PCCS1第四個管柱之洗出液的重組治療性蛋白質的單元操作，且來自PCCS2中三個層析管柱的包含重組蛋白質之洗出液被饋送至PCCS2的層析膜中。
  36. 如申請專利範圍第35項之方法，其中PCCS2的層析膜透過陽離子或陰離 子交換層析施行精煉存在於PCCS2之三個層析管柱之洗出液中的重組治療性蛋白質的單元功能。
  37. 如申請專利範圍第25項之方法，其進一步包括將該治療性蛋白質藥物物質調配成醫藥組合物。
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