KR20150125714A - 치료 단백질의 연속적 정제 - Google Patents

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Abstract

치료 단백질 약물 물질을 생산하는 통합된 연속적 생물제조 방법이 본원에 제공된다. 또한, 치료 단백질 약물 물질을 연속적으로 생산할 수 있는 시스템이 제공된다.

Description

치료 단백질의 연속적 정제 {CONTINUOUS PURIFICATION OF THERAPEUTIC PROTEINS}
<관련 출원의 상호 참조>
본 출원은 2013년 3월 8일에 출원된 미국 특허 가출원 61/775,060, 및 2013년 7월 19일에 출원된 미국 특허 가출원 61/856,390을 우선권 주장하며, 이들 두 가출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 재조합 단백질의 생명공학 및 생물제조 방법에 관한 것이다.
재조합 단백질을 코딩하는 핵산을 함유하는 포유류 세포는 종종 치료용으로 또는 상업적으로 중요한 단백질을 생산하는데 사용된다. 다양한 생산 파이프라인의 통용되는 환경에서, 생명공학 회사들은 점점 더 치료 단백질 약물 물질을 고도로 유연하게 비용 효과적으로 제조하기 위한 혁신적인 해결책을 개발하고자 하였다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, 2개의 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템을 포함하는 통합된, 연속적인 시스템이 치료 단백질 약물 물질을 연속적으로 생산하는데 사용가능하다는 발견에 기초한다. 이러한 발견을 고려하여, 세포가 실질적으로 존재하지 않는 재조합 치료 단백질을 함유하는 액체 배양 배지를 제공하는데, 여기서 액체 배양 배지는 제1 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS1)으로 공급되고; MCCS1을 사용하여 액체 배양 배지 중의 재조합 치료 단백질을 포획하며, 여기서 재조합 치료 단백질을 함유하는 MCCS1의 용리액은 제2 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS2)으로 연속적으로 공급되고; MCCS2를 사용하여 재조합 치료 단백질을 정제하고 폴리싱(polishing)하는데, 여기서 MCCS2의 용리액이 치료 단백질 약물 물질인 것을 포함하는, 치료 단백질 약물 물질의 통합된 연속적 제조 방법이 본원에 제공되고; 상기 방법은 액체 배양 배지부터 치료 단백질 약물 물질인 MCCS2의 용리액까지 통합되고 연속적으로 전개된다. 또한, 본원에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위해 특수하게 설계된 시스템이 제공된다. 예를 들어, 유입구를 함유하는 제1 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS); 및 유출구를 함유하는 제2 MCCS를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 MCCS는 서로 유체 연통되는 것인 생물학적 제조 시스템이 본원에 제공되고, 상기 제조 시스템은 유체가 유입구로 들어가서, 제1 및 제2 MCCS를 거쳐, 유출구를 통해 제조 시스템에서 나올 수 있도록 구성된다.
(i) 세포가 실질적으로 존재하지 않는 재조합 치료 단백질을 함유하는 액체 배양 배지를 제공하는데, 여기서 액체 배양 배지는 제1 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS1)으로 공급되고; (ii) MCCS1을 사용하여 액체 배양 배지 중의 재조합 치료 단백질을 포획하며, 여기서 재조합 치료 단백질을 함유하는 MCCS1의 용리액은 제2 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS2)으로 연속적으로 공급되고; (iii) MCCS2를 사용하여 재조합 치료 단백질을 정제하고 폴리싱하는데, 여기서 MCCS2의 용리액이 치료 단백질 약물 물질인 것을 포함하는, 치료 단백질 약물 물질의 통합된 연속적 제조 방법이 본원에 제공되고; 상기 방법은 액체 배양 배지부터 치료 단백질 약물 물질인 MCCS2의 용리액까지 통합되고 연속적으로 전개된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 액체 배양 배지는 재조합 치료 단백질을 분비하는 포유류 세포의 배양물을 함유하는 관류 생물반응기로부터 제거된 액체 배양 배지, 재조합 치료 단백질을 분비하는 포유류 세포의 배양물을 함유하는 유가 배양 생물반응기로부터 제거된 액체 배양 배지, 및 재조합 치료 단백질을 분비하는 박테리아 또는 효모 세포 배양물로부터의 정화된 액체 배양 배지의 군으로부터 선택된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, MCCS1 및/또는 MCCS2는 2개 이상의 상이한 단위 조작을 수행한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, MCCS1 또는 MCCS2, 또는 이들 둘 모두의 사용은 칼럼 스위칭을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, MCCS1은 재조합 치료 단백질을 포획하고 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, MCCS2는 재조합 치료 단백질을 정제하고 폴리싱하는 단위 조작을 수행한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, MCCS1 및/또는 MCCS2는 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼을 이용한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, MCCS1 및/또는 MCCS2는 2개 이상의 크로마토그래피 막을 이용한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, MCCS1 및/또는 MCCS2는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 및 1개 이상의 크로마토그래피 막을 이용한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 액체 배양 배지는 재조합 치료 단백질을 분비하는 포유류 세포의 배양물을 함유하는 관류 생물반응기로부터 제거된 액체 배양 배지이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, MCCS1은 제1 주기적 향류 크로마토그래피 시스템 (PCCS1)이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, PCCS1은 4-칼럼 PCCS를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 4-칼럼 PCCS에서 4개의 칼럼 중 3개는 액체 배양 배지로부터 재조합 치료 단백질을 포획하는 단위 조작을 수행한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 포획은 친화 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 또는 분자체 크로마토그래피를 사용하여 수행된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 친화 크로마토그래피는 단백질 A-결합 포획 메카니즘, 기질-결합 포획 메카니즘, 항체- 또는 항체 단편-결합 포획 메카니즘, 앱타머(aptamer)-결합 포획 메카니즘, 및 보조인자-결합 포획 메카니즘의 군으로부터 선택된 포획 메카니즘으로 수행된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 친화 크로마토그래피는 단백질 A-결합 포획 메카니즘으로 수행되고, 재조합 치료 단백질은 항체 또는 항체 단편이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 4-칼럼 PCCS에서 4개의 칼럼 중 3개로부터의 재조합 치료 단백질을 함유하는 용리액은 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼으로 공급된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼은 바이러스 불활성화를 위해 재조합 치료 단백질을 함유하는 용리액을 낮은 pH에서 유지함으로써 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼은 바이러스 불활성화를 위해 재조합 치료 단백질을 함유하는 용리액을 낮은 pH에서 약 10분 내지 약 1.5시간의 기간 동안 유지한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, MCCS2는 제2 주기적 향류 (PCCS2) 크로마토그래피 시스템이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태는 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼으로부터의 용리액이 PCCS2로 공급되기 전에 인라인(in-line) 완충액 조정 저장소를 사용하여 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼으로부터의 용리액의 pH를 조정하는 것을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, PCCS2 크로마토그래피 시스템은 3개의 크로마토그래피 칼럼 및 크로마토그래피 막을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, PCCS2에서 3개의 크로마토그래피 칼럼은 PCCS1의 용리액으로부터의 재조합 치료 단백질을 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제하는 단위 조작을 수행한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, PCCS2에서 3개의 크로마토그래피 칼럼의 용리액은 PCCS2에서 크로마토그래피 막으로 공급된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, PCCS2에서 크로마토그래피 막은 PCCS2에서 3개의 크로마토그래피 칼럼의 용리액에 존재하는 재조합 치료 단백질을 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 폴리싱하는 단위 기능을 수행한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, PCCS2에서 크로마토그래피 막은 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 폴리싱하는 단위 기능을 수행한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 막의 통과액 및 세척액은 치료 단백질 약물 물질이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태는 치료 단백질 약물 물질을 제약 조성물로 제형화하는 것을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 재조합 치료 단백질은 항체 또는 항체 단편, 효소, 가공 단백질, 또는 면역원성 단백질 또는 단백질 단편이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태는 PCCS2에서 3개의 칼럼의 용리액이 PCCS2에서 크로마토그래피 막으로 공급되기 전에 인라인 완충액 조정을 이용하여 PCCS2에서 3개의 칼럼의 용리액의 이온 농도를 조정하는 것을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태는 PCCS1과 PCCS2의 사이에 브레이크 탱크(break tank) (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 브레이크 탱크)를 사용하는 것을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태는 PCCS1의 용리액이 PCCS2로 공급되기 전에 이 용리액을 여과하는 것을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태는 액체 배양 배지가 MCCS1로 공급되기 전에 이 액체 배양 배지를 여과하는 것을 추가로 포함한다.
또한, (i) 재조합 치료 단백질을 분비하는 포유류 세포를 액체 배양 배지를 함유하는 관류 생물반응기에서 배양하는데, 여기서 세포가 실질적으로 존재하지 않는 액체 배양 배지의 일정 부피는 관류 생물반응기로부터 연속적으로 또는 주기적으로 제거되어 제1 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS1)으로 공급되고; (ii) 제거된 액체 배양 배지 중의 재조합 치료 단백질을 MCCS1을 사용하여 포획하며, 여기서 재조합 치료 단백질을 함유하는 MCCS1의 용리액은 제2 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS2)으로 연속적으로 공급되고; (iii) MCCS1의 용리액 중의 치료 재조합 단백질을 MCCS2를 사용하여 정제하고 폴리싱하는데, 여기서 MCCS2의 용리액이 치료 단백질 약물 물질인 것을 포함하는, 치료 단백질 약물 물질의 통합된 연속적 제조 방법이 제공되고; 상기 방법은 제거된 액체 배양 배지부터 치료 단백질 약물 물질인 MCCS2의 용리액까지 통합되고 연속적으로 전개된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, MCCS1 및/또는 MCCS2는 2개 이상의 상이한 단위 조작을 수행한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, MCCS1 또는 MCCS2, 또는 이들 둘 모두의 사용은 칼럼 스위칭을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, MCCS1은 재조합 치료 단백질을 포획하고 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, MCCS2는 재조합 치료 단백질을 정제하고 폴리싱하는 단위 조작을 수행한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, MCCS1 및/또는 MCCS2는 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼을 이용한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, MCCS1 및/또는 MCCS2는 2개 이상의 크로마토그래피 막을 이용한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, MCCS1 및/또는 MCCS2는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 및 1개 이상의 크로마토그래피 막을 이용한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, MCCS1은 제1 주기적 향류 크로마토그래피 시스템 (PCCS1)이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, PCCS1은 4-칼럼 PCCS를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 4-칼럼 PCCS에서 4개의 칼럼 중 3개는 액체 배양 배지로부터 재조합 치료 단백질을 포획하는 단위 조작을 수행한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 포획은 친화 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 또는 분자체 크로마토그래피를 사용하여 수행된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 친화 크로마토그래피는 단백질 A-결합 포획 메카니즘, 기질-결합 포획 메카니즘, 항체- 또는 항체 단편-결합 포획 메카니즘, 앱타머-결합 포획 메카니즘, 및 보조인자-결합 포획 메카니즘의 군으로부터 선택된 포획 메카니즘으로 수행된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 친화 크로마토그래피는 단백질 A-결합 포획 메카니즘으로 수행되고, 재조합 치료 단백질은 항체 또는 항체 단편이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 4-칼럼 PCCS에서 4개의 칼럼 중 3개로부터의 재조합 치료 단백질을 함유하는 용리액은 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼으로 공급된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼은 바이러스 불활성화를 위해 재조합 치료 단백질을 함유하는 용리액을 낮은 pH에서 유지함으로써 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼은 바이러스 불활성화를 위해 재조합 치료 단백질을 함유하는 용리액을 낮은 pH에서 약 10분 내지 약 1.5시간의 기간 동안 유지한다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, MCCS2는 제2 주기적 향류 (PCCS2) 크로마토그래피 시스템이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태는 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼의 용리액이 PCCS2로 공급되기 전에 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼의 용리액의 pH를 인라인 완충액 조정 저장소를 사용하여 조정하는 것을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, PCCS2 크로마토그래피 시스템은 3개의 크로마토그래피 칼럼 및 크로마토그래피 막을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, PCCS2에서 3개의 크로마토그래피 칼럼은 PCCS1의 용리액으로부터의 재조합 치료 단백질을 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제하는 단위 조작을 수행한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, PCCS2에서 3개의 크로마토그래피 칼럼의 용리액은 PCCS2에서 크로마토그래피 막으로 공급된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, PCCS2에서 크로마토그래피 막은 PCCS2에서 3개의 크로마토그래피 칼럼의 용리액에 존재하는 재조합 치료 단백질을 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 폴리싱하는 단위 조작을 수행한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, PCCS2에서 크로마토그래피 막은 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 폴리싱하는 단위 기능을 수행한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 막의 통과액 및 세척액은 치료 단백질 약물 물질이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태는 치료 단백질 약물 물질을 제약 조성물로 제형화하는 것을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 재조합 치료 단백질은 항체 또는 항체 단편, 효소, 가공 단백질, 또는 면역원성 단백질 또는 단백질 단편이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태는 PCCS2에서 3개의 칼럼의 용리액이 PCCS2에서 크로마토그래피 막으로 공급되기 전에 PCCS2에서 3개의 칼럼의 용리액의 이온 농도를 인라인 완충액 조정을 이용하여 조정하는 것을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태는 PCCS1과 PCCS2의 사이에 브레이크 탱크 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 브레이크 탱크)를 사용하는 것을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태는 PCCS1의 용리액이 PCCS2로 공급되기 전에 이 용리액을 여과하는 것을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태는 액체 배양 배지가 MCCS1로 공급되기 전에 이 액체 배양 배지를 여과하는 것을 추가로 포함한다.
또한, 유입구를 포함하는 제1 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS); 및 유출구를 포함하는 제2 MCCS를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 MCCS는 서로 유체 연통되는 것인 생물학적 제조 시스템이 제공되고, 상기 제조 시스템은 유체가 유입구로 들어가서, 제1 및 제2 MCCS를 거쳐, 유출구를 통해 제조 시스템에서 나올 수 있도록 구성된다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태는 생물반응기를 추가로 포함하고, 여기서 생물반응기 및 유입구는 서로 유체 연통되고, 제조 시스템은 생물반응기에 존재하는 유체가 유입구로 들어갈 수 있도록 구성된다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 제1 MCCS 또는 제2 MCCS, 또는 이들 둘 모두는 2개 이상의 별개의 단위 조작을 수행하도록 구성된다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, MCCS1 또는 MCCS2, 또는 이들 둘 모두의 사용은 칼럼 스위칭을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 제1 MCCS는 재조합 치료 단백질을 포획하고 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행하도록 구성된다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 제2 MCCS는 재조합 치료 단백질을 정제하고 폴리싱하는 단위 조작을 수행하도록 구성된다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 제1 MCCS 또는 제2 MCCS, 또는 이들 둘 모두는 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼을 함유한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 제1 MCCS 또는 제2 MCCS, 또는 이들 둘 모두는 2개 이상의 크로마토그래피 막을 함유한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 제1 MCCS 또는 제2 MCCS, 또는 이들 둘 모두는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 및 1개 이상의 크로마토그래피 막을 함유한다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 제1 MCCS는 제1 주기적 향류 크로마토그래피 시스템 (PCCS1)이다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, PCCS1은 4-칼럼 PCCS를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 4-칼럼 PCCS에서 4개의 칼럼 중 3개는 액체 배양 배지로부터 재조합 치료 단백질을 포획할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 4-칼럼 PCCS에서 4개의 칼럼 중 3개는 친화 크로마토그래피 칼럼, 양이온 크로마토그래피 칼럼, 음이온 크로마토그래피 칼럼, 및 분자체 크로마토그래피 칼럼 중 1개 이상을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 4-칼럼 PCCS에서 4개의 칼럼 중 3개는 단백질 A-결합 포획 메카니즘, 기질-결합 포획 메카니즘, 항체- 또는 항체 단편-결합 포획 메카니즘, 앱타머-결합 포획 메카니즘, 및 보조인자-결합 포획 메카니즘의 군으로부터 선택된 포획 메카니즘을 이용하는 친화 크로마토그래피 칼럼 중 1개 이상을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼은 바이러스 불활성화를 위해 재조합 치료 단백질을 함유하는 4-칼럼 PCCS의 4개의 칼럼 중 3개의 용리액을 낮은 pH에서 유지할 수 있는 저장소 또는 칼럼이다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼은 바이러스 불활성화를 위해 4-칼럼 PCCS의 4개의 칼럼 중 3개의 재조합 치료 단백질을 함유하는 용리액을 낮은 pH에서 약 10분 내지 약 1.5시간의 기간 동안 유지할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 제2 MCCS는 제2 주기적 향류 크로마토그래피 시스템 (PCCS2)이다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태는 제1 MCCS와 제2 MCCS 사이에 배치된 유체 도관을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태는 제1 MCCS와 제2 MCCS 사이에 배치된 유체 도관과 유체 연통되고, 인라인 완충액 조정 저장소 내에 함유된 완충액이 제1 MCCS와 제2 MCCS 사이에 배치된 유체 도관에 존재하는 유체로 도입되되도록 구성된 인라인 완충액 조정 저장소를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태는 제1 MCCS와 제2 MCCS 사이의 유체 도관에 배치되고, 제1 MCCS와 제2 MCCS 사이의 유체 도관에 존재하는 유체로부터 미립자 물질을 제거할 수 있도록 구성된 필터를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, PCCS2는 3개의 크로마토그래피 칼럼 및 크로마토그래피 막을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 실시양태는 PCCS2의 3개의 크로마토그래피 칼럼과 PCCS2의 크로마토그래피 막 사이에 배치된 유체 도관을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태는 PCCS2의 3개의 크로마토그래피 칼럼과 PCCS2의 크로마토그래피 막 사이에 배치된 유체 도관과 유체 연통되고, 인라인 완충액 조정 저장소 내에 함유된 완충액이 PCCS2의 3개의 크로마토그래피 칼럼과 PCCS2의 크로마토그래피 막 사이에 배치된 유체 도관에 존재하는 유체에 도입되도록 구성된 인라인 완충액 조정 저장소를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, PCCS2에서 3개의 크로마토그래피 칼럼은 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 재조합 치료 단백질을 정제할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, PCCS2에서 크로마토그래피 막은 양이온 교환 크로마토그래피 막이다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태는 PCCS2의 크로마토그래피 막과 유출구 사이에 유체 도관을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태는 PCCS2의 크로마토그래피 막과 유출구 사이의 유체 도관에 배치되고, PCCS2의 크로마토그래피 막과 유출구 사이의 유체 도관에 존재하는 유체로부터 미립자 물질을 제거할 수 있도록 구성된 필터를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태는 유입구와 유체 연통되는 펌프 시스템을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 펌프 시스템은 유체를 유입구로 밀어낼 수 있는 펌프를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태는 펌프와 유입구 사이에 배치된 유체 도관을 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태는 펌프와 유입구 사이의 유체 도관에 배치되고, 펌프와 유입구 사이의 유체 도관에 존재하는 유체로부터 미립자 물질을 제거할 수 있도록 구성된 필터를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태는 펌프와 유입구 사이의 유체 도관에 배치되고, 펌프와 유입구 사이의 유체 도관과 유체 연통되며, 유입구에 들어갈 수 없는 유체 도관에 존재하는 임의의 유체를 저장할 수 있도록 구성된 브레이크 탱크 (예를 들어, 본원에 기재된 브레이크 탱크)를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 제1 MCCS 및 제2 MCCS는 스키드(skid) (예를 들어, 이동을 가능하게 하는 1개 이상의 구조를 포함하는 스키드) 상에 배치된다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 제1 MCCS는 제1 스키드 상에 배치된다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 제2 MCCS는 제2 스키드 상에 배치된다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 스키드는 각각 이동을 가능하게 하는 1개 이상의 구조를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 전체 시스템이 스키드 (예를 들어, 이동을 가능하게 하는 1개 이상의 구조를 포함하는 스키드) 상에 배치된다.
또한, 2개 이상의 서브시스템을 포함하는 생물학적 제조 시스템이 제공되고, 여기서 2개 이상의 서브시스템은 각각 (i) 유입구를 포함하는 제1 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS); 및 (ii) 유출구를 포함하는 제2 MCCS를 포함하고, 제1 및 제2 MCCS는 서로 유체 연통되며, 제조 시스템은 유체가 유입구로 들어가서, 제1 및 제2 MCCS를 거쳐, 유출구를 통해 제조 시스템에서 나올 수 있도록 구성되고; 2개 이상의 서브시스템은 이들이 각각 유체를 함유하는 단일 저장소와 유체 연통되고, 단일 저장소로부터의 유체가 2개 이상의 서브시스템의 유입구로 들어가도록 구성된다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 2개의 서브시스템은 각각 그 자체의 스키드 상에 배치된다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 스키드는 이동을 가능하게 하는 1개 이상의 구조를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 실시양태에서, 전체 시스템이 스키드 (예를 들어, 이동을 가능하게 하는 1개 이상의 구조를 포함하는 스키드) 상에 배치된다.
본원에서 사용된, 명사 앞의 "하나의"란 용어는 하나 이상의 특정 명사를 나타낸다. 예를 들어, "하나의 포유류 세포"라는 어구는 "하나 이상의 포유류 세포"를 나타낸다.
용어 "포유류 세포"는 임의의 포유동물 (예를 들어, 인간, 햄스터, 마우스, 녹색 원숭이, 래트, 돼지, 암소, 또는 토끼)로부터의 또는 그로부터 유래된 임의의 세포를 의미한다. 예를 들어, 포유류 세포는 불멸화 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유류 세포는 분화 세포이다. 일부 실시양태에서, 포유류 세포는 미분화 세포이다. 포유류 세포의 비제한적 예는 본원에 기재되어 있다. 포유류 세포의 추가 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
용어 "실질적으로 존재하지 않는"이란 특정된 물질 (예를 들어, 포유류 세포)이 적어도 또는 약 90% 존재하지 않는 (예를 들어, 적어도 또는 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 또는 약 99% 존재하지 않는, 또는 약 100% 존재하지 않는) 조성물 (예를 들어, 액체 배양 배지)을 의미한다.
용어 "0.5x 부피"는 부피의 약 50%를 의미한다. 용어 "0.6x 부피"는 부피의 약 60%를 의미한다. 마찬가지로, 0.7x, 0.8x, 0.9x, 및 1.0x는 각각 부피의 약 70%, 80%, 90%, 또는 100%를 의미한다.
용어 "배양" 또는 "세포 배양"은 물리적 조건의 조절된 세트하에서의 포유류 세포의 유지 또는 증식을 의미한다.
용어 "포유류 세포의 배양물"은 물리적 조건의 조절된 세트하에서 유지되거나 또는 증식되는 복수 개의 포유류 세포를 함유하는 액체 배양 배지를 의미한다.
용어 "액체 배양 배지"는 세포 (예를 들어, 포유류 세포)의 시험관내에서의 성장 또는 증식을 가능하게 하는 충분한 영양분을 함유하는 유체를 의미한다. 예를 들어, 액체 배양 배지는 아미노산 (예를 들어, 20종의 아미노산), 퓨린 (예를 들어, 히포크산틴), 피리미딘 (예를 들어, 티미딘), 콜린, 이노시톨, 티아민, 엽산, 비오틴, 칼슘, 니아신아미드, 피리독신, 리보플라빈, 티미딘, 시아노코발라민, 피루베이트, 리포산, 마그네슘, 글루코스, 나트륨, 칼륨, 철, 구리, 아연, 및 중탄산나트륨 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 액체 배양 배지는 포유동물로부터의 혈청을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 액체 배양 배지는 포유동물로부터의 혈청 또는 또 다른 추출물을 함유하지 않는다 (한정된 액체 배양 배지). 일부 실시양태에서, 액체 배양 배지는 미량 금속, 포유류 성장 호르몬 및/또는 포유류 성장 인자를 함유할 수 있다. 액체 배양 배지의 또 다른 예는 최소 배지 (예를 들어, 무기 염, 탄소원, 및 물만을 함유하는 배지)이다. 액체 배양 배지의 또 다른 예는 본원에 기재되어 있다. 액체 배양 배지의 추가 예는 관련 기술분야에 공지되어 있으며 시판되고 있다. 액체 배양 배지는 포유류 세포를 임의의 밀도로 함유할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 사용된 바와 같이, 생물반응기로부터 제거된 액체 배양 배지의 일정 부피는 포유류 세포가 실질적으로 존재하지 않을 수 있다.
용어 "동물-유래 성분 무함유 액체 배양 배지"는 포유동물로부터 유래된 임의의 성분 (예를 들어, 단백질 또는 혈청)을 함유하지 않는 액체 배양 배지를 의미한다.
용어 "혈청-무함유 액체 배양 배지"는 포유류 혈청을 함유하지 않는 액체 배양 배지를 의미한다.
용어 "혈청-함유 액체 배양 배지"는 포유류 혈청을 함유하는 액체 배양 배지를 의미한다.
용어 "화학적으로 한정된 액체 배양 배지"는 관련 기술분야의 용어로서, 모든 화학적 성분이 공지된 액체 배양 배지를 의미한다. 예를 들어, 화학적으로 한정된 액체 배양 배지는 소 태아 혈청, 소 혈청 알부민, 또는 인간 혈청 알부민을 함유하지 않는데, 그 이유는 이들 제제가 전형적으로 알부민 및 지질의 복합 혼합물을 함유하기 때문이다.
용어 "단백질-무함유 액체 배양 배지"는 임의의 단백질 (예를 들어, 임의의 검출가능한 단백질)을 함유하지 않는 액체 배양 배지를 의미한다.
용어 "교반"은 생물반응기에서 일정 분량의 액체 배양 배지를 섞거나 또는 움직이게 하는 것을 의미한다. 이는 예를 들어, 생물반응기에서 액체 배양 배지 중의 용해 O2 농도를 증가시키기 위해 수행된다. 교반은 임의의 관련 기술분야에서 공지된 방법, 예를 들어 기구 또는 프로펠러를 사용하여 수행될 수 있다. 생물반응기에서 일정 분량의 액체 배양 배지의 교반을 수행하기 위해 사용될 수 있는 예시적 장치 및 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
용어 "치료 단백질 약물 물질"은 오염 단백질, 지질, 및 핵산 (예를 들어, 액체 배양 배지에 존재하거나 또는 숙주 세포 (예를 들어, 포유류, 효모, 또는 박테리아 숙주 세포)로부터의 오염 단백질, 지질, 및 핵산) 및 생물학적 오염물 (예를 들어, 바이러스 및 박테리아 오염물)로부터 충분히 정제되거나 단리된 재조합 단백질 (예를 들어, 면역글로불린, 단백질 단편, 가공 단백질, 또는 효소)을 의미하며, 임의의 추가 실질적인 정제 및/또는 오염제거 단계 없이 제약 제제로 제형화될 수 있다.
용어 "통합 공정"은 특정 결과 (예를 들어, 액체 배양 배지로부터 치료 단백질 약물 물질의 생성)를 달성하기 위해 공동으로 기능하는 구조적 요소들을 사용하여 수행되는 공정을 의미한다.
용어 "연속적 공정"은 시스템의 적어도 일부를 통해 유체를 연속적으로 공급하는 공정을 의미한다. 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 예시적 연속적 생물학적 제조 시스템에서, 재조합 치료 단백질을 함유하는 액체 배양 배지는 작동 중인 동안에 시스템으로 연속적으로 공급되고, 치료 단백질 약물 물질은 시스템 밖으로 공급된다. 또 다른 예에서, 연속적 공정은 재조합 치료 단백질을 함유하는 액체 배양 배지를 생물반응기로부터 제1 MCCS를 통해 연속적으로 공급하는 공정이다. 연속적 공정의 또 다른 예는 재조합 치료 단백질을 함유하는 액체 배양 배지를 생물반응기로부터 제1 및 제2 MCCS를 통해 연속적으로 공급하는 공정이다. 추가 예는 재조합 치료 단백질을 함유하는 액체 배양 배지를 제1 MCCS를 통해 연속적으로 공급하는 공정, 재조합 치료 단백질을 함유하는 액체 배양 배지를 제1 및 제2 MCCS를 통해 연속적으로 공급하는 공정, 또는 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체를 제2 MCCS를 통해 연속적으로 공급하는 공정을 포함한다.
용어 "면역글로불린"은 면역글로불린 단백질의 적어도 15개의 아미노산 (예를 들어, 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개의 아미노산)의 아미노산 서열 (예를 들어, 가변 도메인 서열, 프레임워크 서열, 또는 불변 도메인 서열)을 함유하는 폴리펩티드를 의미한다. 면역글로불린은 예를 들어, 15개 이상의 아미노산의 경쇄 면역글로불린, 예를 들어 15개 이상의 아미노산의 중쇄 면역글로불린을 포함할 수 있다. 면역글로불린은 단리된 항체 (예를 들어, IgG, IgE, IgD, IgA, 또는 IgM)일 수 있다. 면역글로불린은 IgG의 하위클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)일 수 있다. 면역글로불린은 항체 단편, 예를 들어 Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 scFv 단편일 수 있다. 면역글로불린은 또한 이중-특이적 항체 또는 삼중-특이적 항체, 또는 이량체, 삼량체, 또는 다량체 항체, 또는 디아바디(diabody), 아피바디(Affibody)®, 또는 나노바디(Nanobody)®일 수 있다. 면역글로불린은 또한 1개 이상의 면역글로불린 도메인을 함유하는 가공 단백질 (예를 들어, 융합 단백질)일 수 있다. 면역글로불린의 비제한적 예는 본원에 기재되어 있으며, 면역글로불린의 추가 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
용어 "단백질 단편" 또는 "폴리펩티드 단편"은 적어도 또는 약 4개의 아미노산, 적어도 또는 약 5개의 아미노산, 적어도 또는 약 6개의 아미노산, 적어도 또는 약 7개의 아미노산, 적어도 또는 약 8개의 아미노산, 적어도 또는 약 9개의 아미노산, 적어도 또는 약 10개의 아미노산, 적어도 또는 약 11개의 아미노산, 적어도 또는 약 12개의 아미노산, 적어도 또는 약 13개의 아미노산, 적어도 또는 약 14개의 아미노산, 적어도 또는 약 15개의 아미노산, 적어도 또는 약 16개의 아미노산, 적어도 또는 약 17개의 아미노산, 적어도 또는 약 18개의 아미노산, 적어도 또는 약 19개의 아미노산, 또는 적어도 또는 약 20개의 아미노산 길이, 또는 20개 초과의 아미노산 길이인 폴리펩티드 서열의 일부를 의미한다. 재조합 단백질 단편은 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여 생산할 수 있다.
용어 "가공 단백질"은 유기체 (예를 들어, 포유동물) 내에 존재하는 내생성 핵산에 의해 자연적으로 코딩되지 않는 폴리펩티드를 의미한다. 가공 단백질의 예는 효소 (예를 들어, 가공 효소의 안정성 및/또는 촉매 활성의 증가를 초래하는 1개 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입, 또는 부가에 의한 것), 융합 단백질, 항체 (예를 들어, 2가 항체, 3가 항체, 또는 디아바디), 및 1개 이상의 재조합 스캐폴딩 서열을 함유하는 항원-결합 단백질을 포함한다.
용어 "다중 칼럼 크로마토그래피 시스템" 또는 "MCCS"는 총 2개 이상의 상호연결 또는 스위칭 크로마토그래피 칼럼 및/또는 크로마토그래피 막의 시스템을 의미한다. 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템의 비제한적 예는 총 2개 이상의 상호연결 또는 스위칭 크로마토그래피 칼럼 및/또는 크로마토그래피 막을 함유하는 주기적 향류 크로마토그래피 시스템 (PCC)이다. 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템의 추가 예는 본원에 기재되어 있으며 관련 기술분야에 공지되어 있다.
용어 "포획"은 액체 배양 배지 또는 희석 액체 배양 배지에 존재하는 1종 이상의 다른 성분 (예를 들어, 배양 배지 단백질 또는 포유류 세포에 존재하거나 또는 그로부터 분비되는 1종 이상의 다른 성분 (예를 들어, DNA, RNA, 또는 다른 단백질))으로부터 재조합 치료 단백질을 부분적으로 정제 또는 단리하고 (예를 들어, 중량 기준으로 적어도 또는 약 5%, 예를 들어 적어도 또는 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 또는 약 95%의 순도), 농축시키고, 또한 안정화시키기 위해 수행되는 단계를 의미한다. 전형적으로, 포획은 재조합 치료 단백질과 결합하는 수지를 사용하여 (예를 들어, 친화 크로마토그래피를 사용함으로써) 수행된다. 액체 배양 배지 또는 희석 액체 배양 배지로부터 재조합 치료 단백질을 포획하는 비제한적 방법은 본원에 기재되어 있으며 다른 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 재조합 치료 단백질은 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 및/또는 크로마토그래피 막 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 크로마토그래피 칼럼 및/또는 크로마토그래피 막)을 사용하여 액체 배양 배지로부터 포획될 수 있다.
용어 "정제"는 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체에 존재하는 1종 이상의 다른 불순물 (예를 들어, 벌크 불순물) 또는 성분 (예를 들어, 액체 배양 배지 단백질 또는 포유류 세포에 존재하거나 또는 그로부터 분비되는 1종 이상의 다른 성분 (예를 들어, DNA, RNA, 다른 단백질, 내독소, 바이러스 등))으로부터 재조합 치료 단백질을 단리하기 위해 수행되는 단계를 의미한다. 예를 들어, 정제는 초기 포획 단계 동안에 또는 그 후에 수행될 수 있다. 정제는 재조합 치료 단백질 또는 오염물과 결합하는 수지, 막, 또는 임의의 다른 고체 지지체를 사용하여 (예를 들어, 친화 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 또는 분자체 크로마토그래피를 사용함으로써) 수행될 수 있다. 재조합 치료 단백질은 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 및/또는 크로마토그래피 막 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막)을 사용하여 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체로부터 정제될 수 있다.
용어 "폴리싱"은 관련 기술분야의 용어로서, 최종 바람직한 순도에 근접한 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체로부터 잔류하는 미량의 또는 소량의 오염물 또는 불순물을 제거하기 위해 수행되는 단계를 의미한다. 예를 들어, 폴리싱은 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체를, 표적 재조합 치료 단백질 또는 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체에 존재하는 소량의 오염물 또는 불순물과 선택적으로 결합하는 크로마토그래피 칼럼(들) 또는 막 흡수제(들)를 통해 통과시킴으로써 수행될 수 있다. 이러한 예에서, 크로마토그래피 칼럼(들) 또는 막 흡수제(들)의 용리액/여과물은 재조합 치료 단백질을 함유한다.
용어 "용리액/여과물"은 관련 기술분야의 용어로서, 검출가능한 양의 재조합 치료 단백질을 함유하는 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막으로부터 방출되는 유체를 의미한다.
용어 "여과"는 액체 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 시스템 또는 방법에 존재하는 액체 배양 배지 또는 유체)로부터 바람직하지 않은 생물학적 오염물 (예를 들어, 포유류 세포, 박테리아, 효모 세포, 바이러스, 또는 마이코박테리아) 및/또는 미립자 물질 (예를 들어, 침전 단백질)의 적어도 일부 (예를 들어, 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)의 제거를 의미한다.
용어 "분비 단백질" 또는 "분비 재조합 단백질"은 원래 함유되었던 1개 이상의 분비 신호 서열이 포유류 세포 내에서 번역될 때, 또한 적어도 부분적으로 포유류 세포에서 분비 신호 서열의 효소적 절단을 통해 적어도 부분적으로 세포외 공간 (예를 들어, 액체 배양 배지)으로 분비되는 단백질 (예를 들어, 재조합 단백질)을 의미한다. 통상의 기술자라면 "분비" 단백질이 분비 단백질로 간주되기 위해 세포로부터 완전히 해리될 필요는 없다는 것을 이해할 것이다.
용어 "관류 생물반응기"는 제1 액체 배양 배지에 복수 개의 세포 (예를 들어, 포유류 세포)를 함유하는 생물반응기를 의미하고, 여기서 생물반응기에 존재하는 세포의 배양은 제1 액체 배양 배지를 주기적으로 또는 연속적으로 제거함과 동시에 또는 그 직후에, 실질적으로 동일한 부피의 제2 액체 배양 배지를 생물반응기에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 배양 기간 동안에 점진적 증가 기간 (예를 들어, 약 24시간의 기간, 약 1분 내지 약 24시간의 기간, 또는 24시간 초과의 기간)에 걸쳐서 제거되고 첨가되는 제1 액체 배양 배지의 부피에 있어서 점진적 변화 (예를 들어, 증가 또는 감소)가 있다 (예를 들어, 1일 기준의 배양 배지 재공급 속도). 매일 제거되고 대체되는 배지의 분획은 배양되는 특정 세포, 초기 시딩 밀도, 및 특정 시점에서의 세포 밀도에 따라 달라질 수 있다. "RV" 또는 "반응기 부피"는 배양 공정의 초기에 존재하는 배양 배지의 부피를 의미한다 (예를 들어, 시딩 후에 존재하는 배양 배지의 총 부피).
용어 "유가 배양 생물반응기"는 관련 기술분야의 용어로서, 제1 액체 배양 배지에 복수 개의 세포 (예를 들어, 포유류 세포)를 함유하는 생물반응기를 의미하고, 여기서 생물반응기에 존재하는 세포의 배양은 세포 배양물로부터 제1 액체 배양 배지 또는 제2 액체 배양 배지의 실질적인 또는 상당한 제거 없이, 제2 액체 배양 배지를 제1 액체 배양 배지에 주기적으로 또는 연속적으로 첨가하는 것을 포함한다. 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지와 동일할 수 있다. 유가 배양 배양물의 일부 예에서, 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지의 농축 형태이다. 유가 배양 배양물의 일부 예에서, 제2 액체 배양 배지는 건조 분말로서 첨가된다.
용어 "정화된 액체 배양 배지"는 박테리아 또는 효모 세포가 실질적으로 존재하지 않는 (예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 99% 존재하지 않는), 박테리아 또는 효모 세포 배양물로부터 수득된 액체 배양 배지를 의미한다.
용어 "단위 조작"은 관련 기술분야의 용어로서, 액체 배양 배지로부터 치료 단백질 약물 물질을 제조하는 방법에서 수행될 수 있는 기능적 단계를 의미한다. 예를 들어, 단위 조작은 여과 (예를 들어, 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체로부터 오염물 박테리아, 효모 바이러스, 또는 마이코박테리아, 및/또는 특정 물질의 제거), 포획, 에피토프 태그 제거, 정제, 유지 또는 저장, 폴리싱, 바이러스 불활성화, 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체의 이온 농도 및/또는 pH의 조정, 및 원치않는 염의 제거일 수 있다.
"비 생산율" 또는 "SPR"은 관련 기술분야의 용어로서, 본원에서 사용된 바와 같이 포유류 세포 당 1일 생산되는 재조합 치료 단백질의 질량 또는 효소 활성을 나타낸다. 재조합 치료 항체의 SPR은 통상적으로 질량/세포/일로서 측정된다. 재조합 치료 효소의 SPR은 통상적으로 단위/세포/일 또는 (단위/질량)/세포/일로서 측정된다.
"부피 생산율" 또는 "VPR"은 관련 기술분야의 용어로서, 본원에서 사용된 바와 같이 배양물의 부피 당 (예를 들어, 생물반응기, 용기, 또는 튜브 부피 1 L 당) 1일 생산되는 재조합 치료 단백질의 질량 또는 효소 활성을 나타낸다. 재조합 치료 항체의 VPR은 통상적으로 질량/L/일로서 측정된다. 재조합 치료 효소의 VPR은 통상적으로 단위/L/일 또는 질량/L/일로서 측정된다.
"스키드"는 관련 기술분야의 용어로서, 본원에서 사용된 바와 같이 본원에 기재된 시스템을 위한 플랫폼 또는 지지체로서 작용할 수 있는 3차원 고체 구조를 나타낸다. 스키드는 이동을 가능하게 하는 1개 이상의 구조 (예를 들어, 바퀴, 롤러 등)를 포함한다면, 시스템 또는 그의 일부에 이동성을 제공할 수 있다. 스키드의 비제한적 예는 본원에 기재되어 있다. 스키드의 추가 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에 사용되는 방법 및 물질은 본원에 기재되어 있고; 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 방법 및 물질이 또한 사용될 수 있다. 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시하는 것이며, 제한하려는 것이 아니다. 본원에서 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 엔트리, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충하는 경우에, 정의를 포함하여 본 명세서가 우위에 있을 것이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명 및 도면, 및 청구범위로부터 자명할 것이다.
도 1은 재조합 단백질 약물 물질을 연속적으로 생산하는데 사용가능한 예시적 통합 시스템을 도시하는 개략도이다.
도 2는 생물반응기로부터 수득된 세포 배양 배지에 존재하는 재조합 치료 단백질을 포획하는데 사용가능한 관류 세포 배양 생물반응기에 연결된 단일 PCC 시스템의 도면이다.
도 3은 3개의 크로마토그래피 칼럼을 함유하는 PCC 시스템 사이클의 도면이다. 사이클의 초기에, 공급물 용액이 칼럼 1에 로딩되고, 생성물 누출이 발생할 때까지 통과액이 폐기물로 이동한다 (단계 1). 생성물 누출 발생 시점에, 칼럼 1로부터의 통과액은 칼럼 2로 향하여 칼럼 1로부터의 비결합 재조합 치료 단백질이 포획된다 (단계 2). 칼럼 1이 완전히 로딩되면, 공급물은 이제 칼럼 2로 향하여 로딩되고, 그 동안에 칼럼 1은 다음 사이클을 위해 세척, 용리, 재생, 및 재평형화된다 (단계 3 및 4). 칼럼 2는 이제 칼럼 1에 대한 단계 1-3과 동일한, 단계 3-5를 거친다. 최종적으로, 칼럼 3은 칼럼 1 및 2와 마찬가지로 단계 5-6을 거친다. 3개의 칼럼이 모두 이들 단계를 완료하면, 사이클이 칼럼 1로 재시작된다.
도 4는 ΔUV에 기초한 칼럼 스위칭의 원리를 보여주는 개략도이다. T1은 ΔUV가 미리 결정된 역치 수준에 도달한 시점을 나타낸다. 이 역치 수준에 도달하였을 때, 칼럼 1로부터의 통과액은 폐기물이 아닌, 칼럼 2로 향한다. T2는 칼럼이 생성물로 포화된 시점을 나타낸다. T1 및 T2에서의 ΔUV 값은 둘다 공정 특이적이다.
도 5a는 재조합 치료 항체를 생산하는 생물반응기 배양물의 시간의 경과에 따른 세포 밀도 프로파일 그래프이다. 생물반응기 배양물의 평균 세포 밀도는 50-60 x 106개 세포/mL였다.
도 5b는 재조합 치료 항체를 생산하는 생물반응기 배양물의 시간의 경과에 따른 부피 생산율 그래프이다.
도 6은 총 30일, 38회의 단일 PCC 시스템 사이클, 및 110회의 칼럼 조작 동안에 단일 PCC 시스템으로부터 용리된 재조합 치료 단백질의 회수율 (%), 응집 (%), 효능 (대조군과 비교), 잔류 단백질 A 농도 (ng/mg), 및 숙주 세포 단백질 농도 (ng/mg)를 보여주는 그래프 세트이다. 3개의 ELISA 분석 (회수율, 잔류 단백질 A, 및 숙주 세포 단백질)과 관련된 변동성은 ± 20%였다. 도시된 모든 데이터는 분석 변동성 이내에 포함된다.
도 7a는 재조합 치료 인간 효소를 생산하는 생물반응기 배양물의 시간의 경과에 따른 세포 밀도 프로파일 그래프이다. 19일 후에 생물반응기 배양물의 평균 세포 밀도는 50-60 x 106개 세포/mL였다.
도 7b는 재조합 치료 인간 효소를 생산하는 생물반응기 배양물의 시간의 경과에 따른 부피 생산율 그래프이다. 48-49일쯤에 측정된 2개의 낮은 역가 값은 이 기간 동안에 세포 밀도, 관류 속도, 또는 대사의 변화가 없었으므로 분석 변동성 때문인 것으로 생각된다.
도 8은 총 9일, 41회의 단일 PCC 시스템 사이클, 및 164회의 칼럼 조작 동안에 단일 PCC 시스템으로부터 용리된 재조합 치료 인간 효소의 회수율 (%), 비활성도 (단위/mg), 응집 (%), 효능 (대조군과 비교), 중요 품질 특성 (Critical Quality Attribute; CQA) #1, CQA #2, CQA #3, 및 CQA #4를 보여주는 그래프 세트이다. CQA #3 및 #4는 제한된 데이터 포인트를 가지나, 전체 작동 기간을 나타낸다. CQA의 표준 편차는 1 내지 9%의 범위에 있다.
도 9는 치료 단백질 약물 물질의 연속적 제조를 초래하는 관류 배양 생물반응기와 연결된 2-PCCS 제조 시스템을 도시하는 개략도이다.
도 10은 재조합 치료 단일클론 항체를 생산하는 생물반응기 배양물의 시간의 경과에 따른 생존 세포 밀도 프로파일 그래프이다. 생물반응기 배양물의 평균 세포 밀도는 50-60 x 106개 세포/mL였다.
도 11은 재조합 치료 단일클론 항체를 생산하는 생물반응기 배양물의 시간의 경과에 따른 부피 생산율 그래프이다.
도 12는 제한된 시간창 동안의 단백질 A 포획 칼럼의 실시간 UV 프로파일 그래프이다. 3개의 피크마다 모든 제3 피크는 칼럼 1 유출구 UV 흡광도를 나타내고, 3개의 피크마다 모든 제2 피크는 칼럼 2 UV 유출구 흡광도를 나타내며, 3개의 피크마다 모든 제1 피크는 칼럼 3 UV 흡광도를 나타낸다.
도 13은 제한된 시간창 동안의 캅토(Capto)-S 칼럼의 실시간 UV 프로파일 그래프이다. 검은색 파선은 공급물 UV 흡광도를 나타내고, 3개의 피크마다 모든 제3 피크는 칼럼 1 유출구 UV 흡광도를 나타내며, 3개의 피크마다 모든 제2 피크는 칼럼 2 UV 유출구 흡광도를 나타내며, 3개의 피크마다 모든 제1 피크는 칼럼 3 UV 흡광도를 나타낸다.
도 14는 제한된 시간창 동안의 사토바인드(Sartobind) Q-막의 실시간 UV 프로파일 그래프이다.
도 15는 기준 양의 재조합 단일클론 항체 (레인 1), 및 생산한지 1, 10, 15, 20, 25, 30, 또는 31일째에 수득된 2-PCC 시스템의 용리액 (각각 레인 3-9)의 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 전기영동 겔이다.
도 16은 총 31일 및 25개의 이중 시스템 배치 동안에 2-PCC 시스템으로부터 용리된 생성물의 단백질 농도 (mg/mL), 응집 (%), 효능 (대조군과 비교), 잔류 단백질 A 농도 (ng/mg), 및 숙주 세포 단백질 농도 (ng/mg)를 보여주는 그래프 세트이다. 응집 및 잔류 단백질 A 측정과 관련된 변동성은 비최적화된 Q 막 조작 때문이었다. 그러나, 배치 및 연속적 작동 사이의 경향은 유사하였다. 상기의 모든 결과는 분석 변동성 이내에 포함된다.
치료 단백질 약물 물질의 통합되고 완전히 연속적인 제조 방법이 본원에 제공된다. 이러한 방법은 예를 들어, 세포가 실질적으로 존재하지 않는 재조합 치료 단백질을 함유하는 액체 배양 배지를 제공하고, 그 후에 액체 배양 배지를 제1 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS1)에 공급하는 것을 포함한다. 다음 단계는 MCCS1을 사용하여 액체 배양 배지 중의 재조합 치료 단백질을 포획하는 것을 포함한다. 다음 단계는 재조합 치료 단백질을 함유하는 MCCS1의 용리액을 제2 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS2)에 연속적으로 공급하고, MCCS2를 사용하여 단백질을 정제하고 폴리싱하는 것을 포함한다. 그에 따른 MCCS2의 용리액이 치료 단백질 약물 물질로 간주된다. 상기 방법은 액체 배양 배지부터 치료 단백질 약물 물질인 MCCS2의 용리액까지 통합되고 연속적으로 전개될 수 있다. 또한, 이러한 방법을 수행하는데 사용될 수 있는 예시적 생물학적 제조 시스템이 본원에 제공된다.
생물학적 제조 시스템
본 명세서는 본원에 기재된 방법을 수행하는데 유용한 예시적 생물학적 제조 시스템을 제공한다. 예를 들어, 유용한 시스템은 유입구를 포함하는 제1 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS) 및 유출구를 포함하는 제2 MCCS를 포함할 수 있다. 이러한 시스템에서, 제1 및 제2 MCCS는 서로 유체 연통된다. 시스템은 또한 유체가 유입구로 들어가서, 제1 및 제2 MCCS를 거쳐, 유출구를 통해 제조 시스템에서 나올 수 있도록 구성된다.
본원에 기재된 시스템은 액체 배양 배지로부터 치료 약물 물질의 연속적이고 시간-효율적인 제조를 제공한다. 예를 들어, 치료 단백질을 함유하는 유체 (예를 들어, 액체 배양 배지)를 제1 MCCS에 공급하고 치료 단백질 약물 물질 (치료 단백질을 함유함)을 제2 MCCS의 유출구로부터 용리하는 사이의 경과 시간은 예를 들어, 약 4시간 내지 약 48시간 (언급된 한계값 포함), 예를 들어 약 4시간 내지 약 40시간, 약 4시간 내지 약 35시간, 약 4시간 내지 약 30시간, 약 4시간 내지 약 28시간, 약 4시간 내지 약 26시간, 약 4시간 내지 약 24시간, 약 4시간 내지 약 22시간, 약 4시간 내지 약 20시간, 약 4시간 내지 약 18시간, 약 4시간 내지 약 16시간, 약 4시간 내지 약 14시간, 약 4시간 내지 약 12시간, 약 6시간 내지 약 12시간, 약 8시간 내지 약 12시간, 약 6시간 내지 약 20시간, 약 6시간 내지 약 18시간, 약 6시간 내지 약 14시간, 약 8시간 내지 약 16시간, 약 8시간 내지 약 14시간, 약 8시간 내지 약 12시간, 약 10시간 내지 20시간, 약 10시간 내지 18시간, 약 10시간 내지 16시간, 약 10시간 내지 14시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 10시간 내지 약 40시간, 약 10시간 내지 약 35시간, 약 10시간 내지 약 30시간, 약 10시간 내지 약 25시간, 약 15시간 내지 약 40시간, 약 15시간 내지 약 35시간, 약 15시간 내지 약 30시간, 약 20시간 내지 약 40시간, 약 20시간 내지 약 35시간, 또는 약 20시간 내지 약 30시간 (언급된 한계값 포함)일 수 있다. 다른 예에서, 치료 단백질을 함유하는 유체 (예를 들어, 액체 배양 배지)를 제1 MCCS에 공급하고 치료 단백질 약물 물질 (치료 단백질을 함유함)을 제2 MCCS의 유출구로부터 용리하는 사이의 경과 시간은 예를 들어, 약 4시간을 초과하고 약 40시간 미만이며 (언급된 한계값 포함), 예를 들어 약 4시간 초과 내지 약 39시간, 약 38시간, 약 37시간, 약 36시간, 약 35시간, 약 34시간, 약 33시간, 약 32시간, 약 31시간, 약 30시간, 약 29시간, 약 28시간, 약 27시간, 약 26시간, 약 25시간, 약 24시간, 약 23시간, 약 22시간, 약 21시간, 약 20시간, 약 19시간, 약 18시간, 약 17시간, 약 16시간, 약 15시간, 약 14시간, 약 13시간, 약 12시간, 약 11시간, 약 10시간, 약 9시간, 약 8시간, 약 7시간, 약 6시간, 약 5시간, 또는 약 4.5시간 미만 (언급된 한계값 포함)이다.
일부 예시적 시스템은 브레이크 탱크를 함유하지 않는다. 다른 예에서, 시스템은 전체 시스템에서 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 브레이크 탱크(들)를 함유할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 시스템은 전체 시스템에서 예를 들어, 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 브레이크 탱크(들)를 함유할 수 있고, 여기서 각각의 브레이크 탱크는 단지 치료 단백질을, 예를 들어 약 5분 내지 약 6시간 (언급된 한계값 포함), 예를 들어 약 5분 내지 약 5시간, 약 4시간, 약 3시간, 약 2시간, 약 1시간, 또는 약 30분 (언급된 한계값 포함)의 총 기간 동안 유지한다. 본원에 기재된 브레이크 탱크(들)는 1 mL 내지 약 300 mL (언급된 한계값 포함), 약 1 mL 내지 약 280 mL, 약 260 mL, 약 240 mL, 약 220 mL, 약 200 mL, 약 180 mL, 약 160 mL, 약 140 mL, 약 120 mL, 약 100 mL, 약 80 mL, 약 60 mL, 약 40 mL, 약 20 mL, 또는 약 10 mL (언급된 한계값 포함)의 용량을 가질 수 있다. 유체가 MCCS1에 들어가기 전에 브레이크 탱크(들)에 들어가도록 시스템에 배치된 임의의 브레이크 탱크(들)는 1 mL 내지 MCCS1의 제1 칼럼의 로딩 부피의 약 100% (언급된 한계값 포함), 예를 들어 약 1 mL 내지 MCCS1의 제1 칼럼의 로딩 부피의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 또는 약 5% (언급된 한계값 포함)의 용량을 가질 수 있다. 유체가 MCCS2에 들어가기 전에 (또한 MCCS1에서 나온 후에) 브레이크 탱크(들)에 들어가도록 시스템에 배치된 임의의 브레이크 탱크(들)는 예를 들어, 1 mL 내지 MCCS2의 제1 칼럼의 로딩 부피의 약 100% (언급된 한계값 포함), 예를 들어 약 1 mL 내지 MCCS2의 제1 칼럼의 로딩 부피의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 또는 약 5% (언급된 한계값 포함)의 용량을 가질 수 있다.
예시적 시스템
본 발명에서 유용한 시스템(1)의 비제한적 예가 도 1에 제공되어 있다. 시스템(1)은 제1 MCCS, 즉 4-칼럼 PCCS(2)를 포함하고, 여기서 4-칼럼 PCCS(2)에서 4개의 칼럼 중 3개(3, 4, 및 5)는 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체 (예를 들어, 포유류 세포가 실질적으로 존재하지 않는 액체 배양 배지)로부터 재조합 치료 단백질을 포획하는 단위 조작을 수행하고, PCCS(2)에서 칼럼 중 하나(6)는 재조합 치료 단백질을 함유하는 PCCS(2)의 칼럼(3, 4, 및 5)으로부터의 용리액에 존재하는 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행한다. 칼럼(3, 4, 및 5)은 단백질 A-결합 포획 메카니즘을 이용하는 수지를 함유할 수 있다. 칼럼(6)은 유체를 약 3.75의 pH에서 약 1시간 동안 유지할 수 있다. PCCS(1)는 또한 유입구(7)를 갖는다. 유입구(7)는 예를 들어, 유체의 PCCS(1)에의 유입을 허용하는 오리피스일 수 있다.
시스템(1)은 또한 3개의 크로마토그래피 칼럼(9, 10, 및 11) 및 1개의 크로마토그래피 막(12)을 포함하는 PCCS(8)인 제2 MCCS를 포함한다. PCCS(8)의 칼럼(9, 10, 및 11)은 양이온 교환 수지를 함유할 수 있다. PCCS(8)의 크로마토그래피 막(12)은 양이온 교환 수지를 함유할 수 있다. PCCS(8)는 또한 PCCS(8)의 칼럼(9, 10, 및 11)과 PCCS(8)의 크로마토그래피 막(12) 사이에 배치된 유체 도관(13)을 갖는다. PCCS(8)는 또한 유체 도관(13)과 유체 연통되고, 인라인 완충액 조정 저장소(14) 내에 함유된 완충액이 유체 도관(13)에 존재하는 유체에 도입되도록 구성된 인라인 완충액 조정 저장소(14)를 갖는다. PCCS(8)는 또한 유출구(15)를 포함한다. 유출구(15)는 예를 들어, 유체의 PCCS(8)로부터의 배출을 허용하는 오리피스일 수 있다.
시스템(1)은 PCC1(2)과 PCC2(8) 사이에 배치된 유체 도관(16)을 추가로 포함할 수 있다. 시스템(1)은 또한 유체 도관(16)과 유체 연통되고, 인라인 완충액 조정 저장소(17) 내에 함유된 완충액이 유체 도관(16)에 존재하는 유체에 도입될 수 있도록 구성된 인라인 완충액 조정 저장소(17)를 포함할 수 있다. 시스템(1)은 또한 유체 도관(16)에 존재하는 유체를 여과하기 위해 유체 도관(16)에 배치된 필터(18)를 포함할 수 있다. 시스템(1)은 또한 유체 도관(16)에 배치되고 PCCS(8)에 용이하게 공급될 수 없는 유체 도관(16) 내의 임의의 유체를 유지하도록 구성된 제2 제1 브레이크 탱크(19)를 포함할 수 있다.
시스템(1)은 유입구(7)와 유체 연통되는 펌프 시스템(20)을 추가로 포함할 수 있다. 펌프 시스템(20)은 유체를 유입구(7)로 밀어내기 위한 펌프(21)를 포함할 수 있다. 시스템(1)은 또한 펌프(21)와 유입구(7) 사이에 배치된 유체 도관(22)을 포함할 수 있다. 시스템(1)은 또한 유체 도관(22)에 존재하는 유체 (예를 들어, 액체 배양 배지)를 여과하기 위해 유체 도관(22)에 배치된 필터(23)를 포함할 수 있다. 시스템(1)은 또한 유체 도관(22)에 배치되고, 유체 도관(22)과 유체 연통되며, 유입구(7)에 들어갈 수 없는 유체 도관(22)에 존재하는 임의의 유체를 저장할 수 있도록 구성된 브레이크 탱크(24)를 포함할 수 있다.
시스템(1)은 또한 생물반응기(25) 및 생물반응기(25)와 펌프(21) 사이에 배치된 유체 도관(26)을 포함할 수 있다. 여과 시스템(27)은 유체 도관(26)에 존재하는 액체 배양 배지를 여과하기 위해 (예를 들어, 그로부터 세포를 제거하기 위해) 유체 도관(26)에 배치될 수 있다.
추가 예시적 시스템 구조 및 특징
제1 MCCS는 유체 (예를 들어, 세포가 실질적으로 존재하지 않는 액체 배양 배지)가 그를 통해 제1 MCCS로 들어갈 수 있는 유입구를 포함한다. 유입구는 이러한 목적을 위해 관련 기술분야에 공지된 임의의 구조일 수 있다. 이는 예를 들어, 유체 도관의 삽입을 허용하여, 유체 도관의 유입구에의 삽입 후에, 유입구 밖으로의 유체의 상당한 누수 없이 유체가 유입구를 통해 제1 MCCS에 들어가도록 할 나사구조(threading), 리브구조(ribbing), 또는 실링구조(seal)를 포함할 수 있다. 본 발명의 시스템에 사용될 수 있는 비제한적 유입구는 공지되어 있으며 통상의 기술자에게 이해될 것이다.
제1 MCCS
제1 MCCS는 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼, 2개 이상의 크로마토그래피 막, 또는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 및 1개 이상의 크로마토그래피 막, 및 유입구를 포함한다. 예를 들어, 제1 MCCS는 총 4개의 크로마토그래피 칼럼, 또는 3개의 크로마토그래피 칼럼 및 1개의 크로마토그래피 막, 또는 본원에 기재된 임의의 다른 예시적 MCCS를 포함할 수 있거나, 또는 본원에 기재된 MCCS의 예시적 특징 중 하나 이상 (임의로 조합됨)을 가질 수 있다. 제1 MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들)은 본원에 기재된 예시적 형상, 크기, 부피 (층 부피), 및/또는 단위 조작(들) 중 하나 이상을 가질 수 있다.
제1 MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들)은 본원에 기재되었거나 관련 기술분야에서 공지된 예시적 수지 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 예를 들어, 제1 MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들) 중 1개 이상에 함유된 수지는 포획 메카니즘 (예를 들어, 단백질 A-결합 포획 메카니즘, 단백질 G-결합 포획 메카니즘, 항체- 또는 항체 단편-결합 포획 메카니즘, 기질-결합 포획 메카니즘, 보조인자-결합 포획 메카니즘, 앱타머-결합 포획 메카니즘, 및/또는 태그-결합 포획 메카니즘)을 이용하는 수지일 수 있다. 제1 MCCS의 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들) 중 1개 이상에 함유된 수지는 양이온 교환 수지, 음이온 교환 수지, 분자체 수지, 또는 소수성 상호작용 수지, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 재조합 치료 단백질을 정제하는데 사용가능한 수지의 추가 예는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 제1 MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들) 중 1개 이상에 함유될 수 있다. 제1 MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막은 동일하고/거나 상이한 수지 (예를 들어, 재조합 단백질 정제에 사용되는 것으로 본원에 기재되었거나 관련 기술분야에서 공지된 임의의 수지)를 함유할 수 있다.
제1 MCCS에 존재하는 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 수지(들)는 1개 이상의 단위 조작 (예를 들어, 재조합 치료 단백질의 포획, 재조합 치료 단백질의 정제, 재조합 치료 단백질의 폴리싱, 바이러스의 불활성화, 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체의 이온 농도 및/또는 pH 조정, 또는 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체의 여과)을 수행할 수 있다. 비제한적 예에서, 제1 MCCS는 유체 (예를 들어, 액체 배양 배지)로부터 재조합 치료 단백질을 포획하고 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체에 존재하는 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행할 수 있다. 제1 MCCS는 본원에 기재되었거나 관련 기술분야에서 공지된 2개 이상의 단위 조작을 임의로 조합하여 수행할 수 있다.
제1 MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들)은 스위칭 메카니즘 (예를 들어, 칼럼-스위칭 메카니즘)에 의해 서로에 대하여 연결되거나 또는 이동할 수 있다. 제1 MCCS는 또한 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 또는 5개)의 펌프 (예를 들어, 자동식, 예를 들어 자동식 연동 펌프)를 포함할 수 있다. 칼럼-스위칭 사건은 제1 MCCS를 통과하는 유체 (예를 들어, 제1 MCCS의 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막 중 1개 이상으로의 투입액 및/또는 그로부터의 용리액) 중의 재조합 치료 단백질의 특정 수준에 상응하는 UV 흡광도, 액체 (예를 들어, 완충액)의 특정 부피, 또는 경과된 특정 시간에 의해 검출되는 재조합 치료 단백질의 검출 수준에 의해 촉발될 수 있다. 칼럼 스위칭은 일반적으로 MCCS의 2개 이상의 상이한 크로마토그래피 칼럼 및/또는 크로마토그래피 막 (예를 들어, MCCS (예를 들어, 제1 또는 제2 MCCS)에 존재하는 2개 이상의 상이한 크로마토그래피 칼럼 및/또는 크로마토그래피 막)이 공정의 적어도 일부 동안에 실질적으로 동시에 상이한 단계 (예를 들어, 평형화, 로딩, 용리, 또는 세척)를 통과하도록 허용하는 메카니즘을 의미한다.
제1 MCCS는 주기적 향류 크로마토그래피 시스템 (PCCS)일 수 있다. 예를 들어, 제1 MCCS인 PCCS는 4개의 크로마토그래피 칼럼을 포함할 수 있고, 여기서 처음 3개의 칼럼은 유체 (예를 들어, 액체 배양 배지)로부터 재조합 치료 단백질을 포획하는 단위 조작을 수행하고, PCCS의 제4 칼럼은 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체 중의 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행한다. 제1 MCCS인 PCCS는 칼럼-스위칭 메카니즘을 이용할 수 있다. PCC 시스템은, 예를 들어 4, 5, 6, 7, 또는 8개, 또는 그 초과의 칼럼까지 전개할 수 있는 변형된 AKTA 시스템 (지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 이용할 수 있다.
제1 MCCS는 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 UV 모니터, 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 밸브, 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 pH 미터, 및/또는 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 전도도 측정기가 설치될 수 있다. 제1 MCCS는 또한 칼럼-스위칭이 발생해야 하는 시점을 감지하고 (예를 들어, UV 흡광도, 액체의 부피, 또는 경과 시간에 기초함) 칼럼-스위칭 사건에 영향을 미치는 (촉발하는) 소프트웨어 (예를 들어, 유니콘(Unicorn)-기반 소프트웨어, 지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 이용하는 작동 시스템이 설치될 수 있다. MCCS가 1개 이상의 UV 검출기를 포함하는 예에서, UV 검출기는 임의로 제1 MCCS의 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들) 중 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 유입구 및/또는 제1 MCCS의 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들) 중 1개 이상의 유출구에 위치할 수 있다.
제1 MCCS는 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24개)의 인라인 완충액 조정 저장소(들) 및/또는 완충액 저장소(들)를 추가로 포함할 수 있다. 다른 예에서, 제1 MCCS는 제1 MCCS의 크로마토그래피 칼럼 및/또는 크로마토그래피 막 중 1개 이상으로 용이하게 들어갈 수 없는 유체를 보유할 수 있는 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 브레이크 탱크를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 시스템은 제1 및/또는 제2 MCCS에 1개 이상의 브레이크 탱크 (예를 들어, 본원에 기재된 브레이크 탱크)를 함유할 수 있다. 본원에 기재된 시스템의 다른 예는 제1 MCCS 또는 제2 MCCS에 브레이크 탱크를 포함하지 않거나, 또는 전체 시스템에 브레이크 탱크를 포함하지 않는다. 본원에 기재된 시스템의 다른 예는 전체 시스템에 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 브레이크 탱크(들) (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 브레이크 탱크(들))를 함유한다.
제2 MCCS
제2 MCCS는 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼, 2개 이상의 크로마토그래피 막, 또는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼(들) 및 1개 이상의 크로마토그래피 막(들), 및 유출구를 포함한다. 예를 들어, 제2 MCCS는 총 4개의 크로마토그래피 칼럼, 3개의 크로마토그래피 칼럼 및 1개의 크로마토그래피 막, 또는 본원에 기재된 임의의 다른 예시적 MCCS를 포함할 수 있거나, 또는 본원에 기재된 MCCS의 예시적 특징 중 하나 이상 (임의로 조합됨)을 가질 수 있다. 제2 MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들)은 본원에 기재된 임의의 형상, 크기, 부피 (층 부피), 및/또는 단위 조작 중 하나 이상을 가질 수 있다. 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들)은 본원에 기재되었거나 관련 기술분야에서 공지된 임의의 예시적 수지를 함유할 수 있다. 예를 들어, 제2 MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들) 중 1개 이상에 함유된 수지는 포획 메카니즘 (예를 들어, 단백질 A-결합 포획 메카니즘, 단백질 G-결합 포획 메카니즘, 항체- 또는 항체 단편-결합 포획 메카니즘, 기질-결합 포획 메카니즘, 보조인자-결합 포획 메카니즘, 태그-결합 포획 메카니즘, 및/또는 앱타머-결합 포획 메카니즘)을 이용하는 수지일 수 있다. 유용한 수지는 예를 들어, 양이온 교환 수지, 음이온 교환 수지, 분자체 수지, 및 소수성 상호작용 수지를 포함한다. 수지의 추가 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 제2 MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막은 동일하고/거나 상이한 수지 (예를 들어, 재조합 단백질 정제에 사용되는 것으로 본원에 기재되었거나 관련 기술분야에서 공지된 임의의 수지)를 함유할 수 있다.
제2 MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들)은 1개 이상의 단위 조작 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 단위 조작 또는 본원에 기재된 단위 조작의 임의의 조합)을 수행할 수 있다. 비제한적 예에서, 제2 MCCS는 유체로부터 재조합 치료 단백질을 정제하고, 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체에 존재하는 재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행할 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 제2 MCCS는 유체에 존재하는 재조합 치료 단백질을 정제하고, 유체에 존재하는 재조합 치료 단백질을 폴리싱하고, 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체를 여과하는 단위 조작을 수행할 수 있다. 또 다른 예에서, 제2 MCCS는 유체에 존재하는 재조합 치료 단백질을 정제하고, 유체에 존재하는 재조합 치료 단백질을 폴리싱하고, 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체를 여과하고, 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체의 이온 농도 및/또는 pH를 조정하는 단위 조작을 수행할 수 있다. 제2 MCCS는 본원에 기재되었거나 관련 기술분야에서 공지된 2개 이상의 단위 조작을 임의로 조합하여 수행할 수 있다.
제2 MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들)은 스위칭 메카니즘 (예를 들어, 칼럼-스위칭 메카니즘)에 의해 서로에 대하여 연결되거나 또는 이동할 수 있다. 제2 MCCS는 또한 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 또는 5개)의 펌프 (예를 들어, 자동식, 예를 들어 자동식 연동 펌프)를 포함할 수 있다. 칼럼-스위칭 사건은 제2 MCCS를 통과하는 유체 (예를 들어, 제2 MCCS의 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막 중 1개 이상으로의 투입액 및/또는 그로부터의 용리액) 중의 재조합 치료 단백질의 특정 수준에 상응하는 UV 흡광도, 액체 (예를 들어, 완충액)의 특정 부피, 또는 경과된 특정 시간에 의해 검출되는 재조합 치료 단백질의 검출 수준에 의해 촉발될 수 있다.
제2 MCCS는 주기적 향류 크로마토그래피 시스템 (PCCS)일 수 있다. 예를 들어, 제2 MCCS인 PCCS는 유체로부터 재조합 치료 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행하는 3개의 칼럼, 및 유체에 존재하는 재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는 크로마토그래피 막을 함유할 수 있다. 예를 들어, 유체로부터 재조합 치료 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행하는 3개의 칼럼은 예를 들어, 양이온 교환 수지를 함유할 수 있고, 폴리싱 단위 조작을 수행하는 크로마토그래피 막은 양이온 교환 수지를 함유할 수 있다. 제2 MCCS인 PCCS는 칼럼-스위칭 메카니즘을 이용할 수 있다. PCC 시스템은, 예를 들어 4, 5, 6, 7, 또는 8개, 또는 그 초과의 칼럼까지 전개할 수 있는 변형된 AKTA 시스템 (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 이용할 수 있다.
제2 MCCS는 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 UV 모니터, 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 밸브, 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 pH 미터, 및/또는 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 전도도 측정기가 설치될 수 있다. 제2 MCCS는 또한 칼럼-스위칭 사건이 발생해야 하는 시점을 감지하고 (예를 들어, UV 흡광도, 액체의 부피, 또는 경과 시간에 기초함) 칼럼-스위칭 사건에 영향을 미치는 소프트웨어 (예를 들어, 유니콘-기반 소프트웨어, 지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 이용하는 작동 시스템이 설치될 수 있다. 제2 MCCS가 1개 이상의 UV 검출기를 포함하는 예에서, UV 검출기는 임의로 제2 MCCS의 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들) 중 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 유입구, 및/또는 제2 MCCS의 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들) 중 1개 이상의 유출구에 위치할 수 있다.
제2 MCCS는 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24개)의 인라인 완충액 조정 저장소(들) 및/또는 완충액 저장소(들)를 추가로 포함할 수 있다. 다른 예에서, 제2 MCCS는 제2 MCCS의 크로마토그래피 칼럼 및/또는 크로마토그래피 막 중 1개 이상으로 용이하게 들어갈 수 없는 유체를 보유할 수 있는 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 브레이크 탱크 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 브레이크 탱크)를 포함할 수 있다.
제2 MCCS는 치료 단백질 약물 물질이 그를 통해 시스템에서 배출될 수 있는 유출구를 포함한다. 유출구는 예를 들어, 유체 도관의 삽입을 허용하는 나사구조, 리브구조, 또는 실링구조 또는 치료 단백질 약물 물질을 함유하거나 또는 저장하도록 설계된 바이알을 포함할 수 있다. 유출구는 재조합 단백질 약물 생성물이 멸균 바이알 또는 저장 용기로 직접 유동하도록 하기 위해, 멸균 바이알 또는 다른 이러한 저장 용기를 유출구에 실링하는데 사용될 수 있는 표면을 함유할 수 있다. 본 발명의 시스템에 사용가능한 비제한적 유출구는 공지되어 있으며 통상의 기술자에게 이해될 것이다.
본원에 기재된 시스템은 또한 제1 MCCS와 제2 MCCS 사이에 배치된 유체 도관을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 유체 도관은, 예를 들어 폴리에틸렌, 폴리카르보네이트, 또는 플라스틱으로 제조된, 예를 들어 튜브일 수 있다. 제1 MCCS와 제2 MCCS 사이에 배치된 유체 도관은 하기 중 하나 이상을 임의로 조합하여 추가로 포함할 수 있다: 유체 도관과 유체 연통되고, 인라인 완충액 조정 저장소(들) 내에 저장된 완충액이 유체 도관에 존재하는 유체에 첨가되도록 위치하는 1개 이상의 인라인 완충액 조정 저장소; 유체 도관과 유체 연통되고, 제2 MCCS에 용이하게 공급될 수 없는 유체 도관에 존재하는 임의의 초과량의 유체를 보유할 수 있도록 위치하는 브레이크 탱크 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 브레이크 탱크(들)); 및 유체 도관에 존재하는 유체를 여과할 수 있도록 (예를 들어, 박테리아를 제거할 수 있도록) 유체 도관에 배치된 1개 이상의 필터. 임의의 인라인 완충액 조정 저장소는 예를 들어, 약 0.5 L 내지 50 L의 완충액 부피를 함유할 수 있다 (예를 들어, 25℃, 15℃, 또는 10℃ 이하의 온도에서).
본원에 기재된 시스템은 임의로 제2 MCCS의 최종 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막과 유출구 사이에 배치된 유체 도관을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 시스템은 제2 MCCS의 최종 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막과 유출구 사이에 배치된 유체 도관과 유체 연통되어, 제2 MCCS의 최종 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막과 유출구 사이에 배치된 유체 도관에 존재하는 유체로부터, 예를 들어 침전 물질, 미립자 물질, 또는 박테리아를 제거할 수 있는 1개 이상의 필터를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 제공된 시스템의 일부 예는 또한 제1 MCCS의 유입구와 유체 연결되는 생물반응기를 포함한다. 본원에 기재되었거나 관련 기술분야에서 공지된 임의의 예시적 생물반응기가 본 발명의 시스템에 사용될 수 있다.
본원에 제공된 시스템의 일부 예는 또한 펌프 시스템을 포함한다. 펌프 시스템은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 펌프 (예를 들어, 본원에 기재되었거나 관련 기술분야에서 공지된 임의의 펌프), 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 또는 5개)의 필터 (예를 들어, 본원에 기재되었거나 관련 기술분야에서 공지된 임의의 필터), 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 UV 검출기, 및 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 또는 5개)의 브레이크 탱크 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 브레이크 탱크). 본원에 제공된 시스템의 일부 예는 펌프와 제1 MCCS의 유입구 사이에 배치된 유체 도관 (예를 들어, 본원에 기재되었거나 관련 기술분야에서 공지된 임의의 예시적 유체 도관)을 추가로 포함한다. 일부 예에서, 이러한 특정 유체 도관은 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 또는 4개)의 펌프 (예를 들어, 본원에 기재되었거나 관련 기술분야에서 공지된 임의의 펌프) 및/또는 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 또는 4개)의 브레이크 탱크 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 예시적 브레이크 탱크)를 포함할 수 있고, 여기서 이러한 펌프(들) 및/또는 브레이크 탱크(들)는 유체 도관에 존재하는 유체와 유체 연결된다.
본원에 기재된 시스템의 일부 예는 펌프와 유입구 사이의 유체 도관에 연결된 추가 유체 도관을 추가로 포함하고, 여기서 추가 유체 도관의 한쪽 단부는 생물반응기와 유체 연결되고 다른 쪽 단부는 펌프와 유입구 사이의 유체 도관에 유체 연결된다. 이러한 추가 유체 도관은 생물반응기 (예를 들어, ATF 세포 보류 시스템)로부터 제거된 액체 배양 배지로부터 세포를 제거할 수 있는 필터를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 시스템은 치료 단백질 약물 물질의 연속적 제조를 가능하게 한다. 예를 들어, 본원에 제공된 시스템은 약 70% 초과, 약 80% 초과, 약 82% 초과, 약 84% 초과, 약 86% 초과, 약 88% 초과, 약 90% 초과, 약 92% 초과, 약 94% 초과, 약 96% 초과, 또는 약 98% 초과의 (출발 물질, 예를 들어 출발 액체 배양 배지로부터의) 재조합 치료 단백질의 수율 (%)을 허용한다. 본원에 기재된 시스템은 또한 약 80% 내지 약 90%, 약 82% 내지 약 90%, 약 84% 내지 약 90%, 약 84% 내지 약 88%, 약 84% 내지 약 94%, 약 82% 내지 약 92%, 또는 약 85% 내지 약 95%의 (출발 물질, 예를 들어 출발 액체 배양 배지로부터의) 재조합 치료 단백질의 수율 (%)을 초래할 수 있다.
본원에 기재된 시스템은 또한 약 1.0 mg/mL 초과, 약 1.5 mg/mL 초과, 약 2.0 mg/mL 초과, 약 2.5 mg/mL 초과, 약 3.0 mg/mL 초과, 약 3.5 mg/mL 초과, 약 4.0 mg/mL 초과, 약 4.5 mg/mL 초과, 약 5.0 mg/mL 초과, 약 5.5 mg/mL 초과, 약 6.0 mg/mL 초과, 약 6.5 mg/mL 초과, 약 7.0 mg/mL 초과, 약 7.5 mg/mL 초과, 약 8.0 mg/mL 초과, 약 8.5 mg/mL 초과, 약 9.0 mg/mL 초과, 약 10.0 mg/mL 초과, 약 12.5 mg/mL 초과, 또는 약 15.0 mg/mL 초과의 재조합 치료 단백질 농도를 함유하는 치료 단백질 약물 물질의 제조를 초래할 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 시스템은 치료 단백질 약물 물질의 주기적 용리를 제공할 수 있다. 치료 단백질 약물 물질은 본원에 기재된 임의의 시스템으로부터, 예를 들어 제1 및 제2 MCCS에 사용된 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들)에 따라, 예를 들어 약 30초 내지 약 5시간 (예를 들어, 약 1분 내지 약 4시간, 약 1분 내지 약 3시간, 약 1분 내지 약 2시간, 약 1분 내지 약 1.5시간, 약 1분 내지 약 1시간, 약 1분 내지 약 30분)의 기간 동안, 예를 들어 약 1분 내지 약 6시간 (예를 들어, 약 1분 내지 약 5시간, 약 1분 내지 약 4시간, 약 1분 내지 약 3시간, 약 1분 내지 2시간, 약 1분 내지 1시간, 또는 약 1분 내지 30분)의 빈도로 용리될 수 있다.
본원에 기재된 시스템은 또한 약 5일 이상, 약 10일 이상, 약 15일 이상, 약 20일 이상, 약 25일 이상, 약 30일 이상, 약 35일 이상, 약 40일 이상, 약 45일 이상, 약 50일 이상, 약 55일 이상, 약 60일 이상, 약 65일 이상, 약 70일 이상, 약 75일 이상, 약 80일 이상, 약 85일 이상, 약 90일 이상, 약 95일 이상, 약 100일 이상, 약 110일 이상, 약 120일 이상, 약 130일 이상, 약 140일 이상, 약 150일 이상, 약 160일 이상, 약 170일 이상, 약 180일 이상, 약 190일 이상, 약 200일 이상, 약 210일 이상, 약 220일 이상, 약 230일 이상, 약 240일 이상, 약 250일 이상, 약 260일 이상, 약 270일 이상, 약 280일 이상, 약 290일 이상, 약 300일 이상, 약 310일 이상, 약 320일 이상, 약 330일 이상, 약 340일 이상, 약 350일 이상, 또는 약 365일 이상의 연속 기간 동안 약 5 g/일 이상, 약 6 g/일 이상, 약 7 g/일 이상, 약 8 g/일 이상, 약 9 g/일 이상, 약 10 g/일 이상, 약 11 g/일 이상, 약 12 g/일 이상, 약 13 g/일 이상, 약 14 g/일 이상, 약 15 g/일 이상, 약 16 g/일 이상, 약 17 g/일 이상, 약 18 g/일 이상, 약 19 g/일 이상, 약 20 g/일 이상, 약 25 g/일 이상, 약 30 g/일 이상, 약 35 g/일 이상, 또는 약 40 g/일 이상의 치료 단백질 약물 물질 중 재조합 치료 단백질의 순 수율을 초래할 수 있다.
본원에 기재된 시스템은 또한 상당히 개선된 비 생산율을 갖는 (상이한 방법 또는 시스템에 의해 제조된 다른 재조합 단백질 약물 물질과 비교하여), 재조합 치료 단백질을 함유하는 재조합 단백질 약물 물질을 연속적으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 시스템은 상이한 방법 또는 시스템 (예를 들어, 배치 정제 방법 또는 통합되지 않고/거나 연속적이지 않은 방법)을 사용하여 제조된 재조합 단백질 약물 물질의 비 생산율보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 110배, 120배, 130배, 140배, 150배, 160배, 170배, 180배, 190배, 또는 200배 더 높은 비 생산율 (재조합 단백질 약물 물질의)을 달성할 수 있다. 본 발명의 시스템에 의해 달성되는 재조합 단백질 약물 물질의 생산성은 10,000 단위/L (제1 및/또는 제2 액체 배양 배지) 이상, 15,000 단위/L 이상, 약 20,000 단위/L 이상, 약 25,000 단위/L 이상, 약 30,000 단위/L 이상, 약 35,000 단위/L 이상, 또는 약 40,000 단위/L 이상일 수 있다. 본 발명의 시스템에 의해 달성되는 재조합 단백질 약물 물질의 생산성은 1 g/L 이상, 1.5 g/L 이상, 2.0 g/L 이상, 2.5 g/L 이상, 3.0 g/L 이상, 4.0 g/L 이상, 4.5 g/L 이상, 또는 5.0 g/L 이상일 수 있다.
2개 이상의 서브시스템을 갖는 생물학적 제조 시스템
(i) 유입구를 함유하는 제1 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS) (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 예시적 제1 MCCS); 및 (ii) 유출구를 함유하는 제2 MCCS (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 예시적 제2 MCCS)를 각각 포함하고, 여기서 제1 및 제2 MCCS는 서로 유체 연통되는 것인 2개 이상의 서브시스템을 포함하는 생물학적 제조 시스템이 또한 제공되고, 여기서 제조 시스템은 유체가 유입구로 들어가서, 제1 및 제2 MCCS를 거쳐, 유출구를 통해 제조 시스템에서 나올 수 있도록 구성되고; 2개 이상의 서브시스템은 이들이 각각 유체를 함유하는 단일 저장소 (예를 들어, 생물반응기)와 유체 연통되고, 단일 저장소로부터의 유체가 2개 이상의 서브시스템의 유입구로 들어가도록 구성된다.
서브시스템은 각각 액체 배양 배지로부터 치료 약물 물질의 연속적이고 시간-효율적인 제조를 제공할 수 있다. 예를 들어, 각각의 서브시스템에 있어서, 치료 단백질을 함유하는 유체 (예를 들어, 액체 배양 배지)를 (서브시스템의) 제1 MCCS에 공급하고 치료 단백질 약물 물질 (치료 단백질을 함유함)을 (서브시스템의) 제2 MCCS의 유출구로부터 용리하는 사이의 경과 시간은 예를 들어, 약 4시간 내지 약 48시간 (언급된 한계값 포함), 예를 들어 약 4시간 내지 약 40시간, 약 4시간 내지 약 35시간, 약 4시간 내지 약 30시간, 약 4시간 내지 약 28시간, 약 4시간 내지 약 26시간, 약 4시간 내지 약 24시간, 약 4시간 내지 약 22시간, 약 4시간 내지 약 20시간, 약 4시간 내지 약 18시간, 약 4시간 내지 약 16시간, 약 4시간 내지 약 14시간, 약 4시간 내지 약 12시간, 약 6시간 내지 약 12시간, 약 8시간 내지 약 12시간, 약 6시간 내지 약 20시간, 약 6시간 내지 약 18시간, 약 6시간 내지 약 14시간, 약 8시간 내지 약 16시간, 약 8시간 내지 약 14시간, 약 8시간 내지 약 12시간, 약 10시간 내지 20시간, 약 10시간 내지 18시간, 약 10시간 내지 16시간, 약 10시간 내지 14시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 10시간 내지 약 40시간, 약 10시간 내지 약 35시간, 약 10시간 내지 약 30시간, 약 10시간 내지 약 25시간, 약 15시간 내지 약 40시간, 약 15시간 내지 약 35시간, 약 15시간 내지 약 30시간, 약 20시간 내지 약 40시간, 약 20시간 내지 약 35시간, 또는 약 20시간 내지 약 30시간 (언급된 한계값 포함)일 수 있다. 다른 예에서, 각각의 서브시스템에 있어서, 치료 단백질을 함유하는 유체 (예를 들어, 액체 배양 배지)를 (서브시스템의) 제1 MCCS에 공급하고 치료 단백질 약물 물질 (치료 단백질을 함유함)을 (서브시스템의) 제2 MCCS의 유출구로부터 용리하는 사이의 경과 시간은 예를 들어, 약 4시간을 초과하며 약 40시간 미만이고 (언급된 한계값 포함), 예를 들어 약 4시간 초과 내지 약 39시간, 약 38시간, 약 37시간, 약 36시간, 약 35시간, 약 34시간, 약 33시간, 약 32시간, 약 31시간, 약 30시간, 약 29시간, 약 28시간, 약 27시간, 약 26시간, 약 25시간, 약 24시간, 약 23시간, 약 22시간, 약 21시간, 약 20시간, 약 19시간, 약 18시간, 약 17시간, 약 16시간, 약 15시간, 약 14시간, 약 13시간, 약 12시간, 약 11시간, 약 10시간, 약 9시간, 약 8시간, 약 7시간, 약 6시간, 약 5시간, 또는 약 4.5시간 미만 (언급된 한계값 포함)이다.
시스템의 일부 예시적 서브시스템(들)은 브레이크 탱크를 포함하지 않는다. 시스템의 다른 예시적 서브시스템(들)은 전체 서브시스템에 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 브레이크 탱크를 포함한다. 임의의 서브시스템(들)은 전체 서브시스템에 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 브레이크 탱크(들)를 포함할 수 있고, 여기서 각각의 브레이크 탱크는 단지, 예를 들어 약 5분 내지 약 6시간 미만 (언급된 한계값 포함), 예를 들어 약 5분 내지 약 5시간, 약 4시간, 약 3시간, 약 2시간, 약 1시간, 또는 약 30분 (언급된 한계값 포함)의 총 기간 동안 치료 단백질을 보유한다. 본원에 기재된 브레이크 탱크(들)는, 예를 들어 1 mL 내지 약 300 mL (언급된 한계값 포함), 예를 들어 1 mL 내지 약 280 mL, 약 260 mL, 약 240 mL, 약 220 mL, 약 200 mL, 약 180 mL, 약 160 mL, 약 140 mL, 약 120 mL, 약 100 mL, 약 80 mL, 약 60 mL, 약 40 mL, 약 20 mL, 또는 약 10 mL (언급된 한계값 포함)의 용량을 가질 수 있다. 유체가 (서브시스템의) MCCS1에 들어가기 전에 브레이크 탱크(들)에 들어가도록 서브시스템에 배치된 임의의 브레이크 탱크(들)는, 예를 들어 1 mL 내지 (서브시스템의) 제1 MCCS의 제1 칼럼의 로딩 부피의 약 100% (언급된 한계값 포함), 예를 들어 1 mL 내지 (서브시스템의) 제1 MCCS의 제1 칼럼의 로딩 부피의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 또는 약 5% (언급된 한계값 포함)의 용량을 가질 수 있다. 유체가 (임의의 서브시스템(들)의) MCCS2에 들어가기 전에 (또한 유체가 서브시스템의 MCCS1에서 나온 후에) 브레이크 탱크(들)에 들어가도록 서브시스템에 배치된 임의의 브레이크 탱크(들)는, 예를 들어 1 mL 내지 (서브시스템의) 제2 MCCS의 제1 칼럼의 로딩 부피의 약 100% (언급된 한계값 포함), 예를 들어 1 mL 내지 (서브시스템의) 제2 MCCS의 제1 칼럼의 로딩 부피의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 또는 약 5% (언급된 한계값 포함)의 용량을 가질 수 있다.
상기에 기재된 제1 MCCS 및 제2 MCCS 시스템의 특징 (예를 들어, 크로마토그래피 칼럼의 유형 및 개수, 크로마토그래피 막의 유형 및 개수, 부피, 크기, 수지, 및 단위 조작(들), 유량, 펌프, 인라인 완충액 조정, UV 검출기, 1개 이상의 필터, 및 칼럼-스위칭 메카니즘)의 임의의 조합이 2개 이상의 서브시스템의 제1 MCCS 및 제2 MCCS에 사용될 수 있다. 예를 들어, 2개 이상의 서브시스템의 제1 MCCS 및 제2 MCCS는 실질적으로 동일할 수 있다. 다른 예에서, 2개 이상의 서브시스템은 실시예에 기재된 시스템과 실질적으로 동일하다.
스키드
본원에 기재된 임의의 생물학적 제조 시스템은 스키드 상에 배치될 수 있다. 예를 들어, 적어도 생물반응기, 제1 MCCS, 및 제2 MCCS를 포함하는 시스템이 단일 스키드 상에 배치될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 다른 예에서, 제1 MCCS는 제1 스키드 상에 배치될 수 있고, 제2 MCCS는 제2 스키드 상에 배치될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 추가 예는 단일 스키드 상에 배치된 제1 MCCS 및 제2 MCCS, 또는 단일 스키드 상에 배치된 전체 시스템을 포함한다.
본원에 기재된 생물학적 제조 시스템의 일부 예는 (i) 유입구를 함유하는 제1 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS) (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 예시적 제1 MCCS); 및 (ii) 유출구를 함유하는 제2 MCCS (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 예시적 제2 MCCS)를 각각 포함하고, 여기서 제1 및 제2 MCCS는 서로 유체 연통되는 것인 2개 이상의 서브시스템을 포함하고, 여기서 제조 시스템은 유체가 유입구로 들어가서, 제1 및 제2 MCCS를 거쳐, 유출구를 통해 제조 시스템에서 나올 수 있도록 구성되고; 2개 이상의 서브시스템은 이들이 각각 유체를 함유하는 단일 저장소 (예를 들어, 생물반응기)와 유체 연통되고, 단일 저장소로부터의 유체가 2개 이상의 서브시스템의 유입구로 들어가도록 구성된다. 이러한 시스템에서, 전체 시스템이 스키드 상에 배치될 수 있거나; 저장소 및 1개 이상의 서브시스템이 단일 스키드 상에 배치될 수 있거나; 2개 이상의 서브시스템이 각각 그 자체를 위한 스키드 상에 배치되거나; 또는 2개 이상의 서브시스템이 단일 스키드 상에 배치될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 시스템에서, 저장소 (예를 들어, 플라스틱 백), 브레이크 탱크 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 브레이크 탱크), 또는 재조합 치료 단백질을 함유하는 액체 배양 배지를 함유하는 생물반응기는 그 자체를 위한 스키드 상에 배치될 수 있다.
스키드의 비제한적 예는 이동을 가능하게 하는 1개 이상의 구조로서, 2개 이상의 바퀴, 롤러, 슬레드(sled), 또는 스키(ski)를 포함한다. 통상의 기술자가 이해하고 있는 바와 같이, 스키드는 임의의 고체 물질 (예를 들어, 목재, 금속, 또는 플라스틱)로 구성될 수 있다. 적합한 스키드는 운데리히-말렉 (Wunderlich-Malec; 미국 미네소타주 미네통카 소재) 및 렌프로우 브라더즈 (Renfrow Brothers; 미국 사우스캐롤라이나주 스파턴버그 소재)로부터 입수가능하다. 1개 초과의 스키드를 이용하는 시스템에서, 스키드는 함께 맞춤형으로 설계될 수 있다 (예를 들어, 걸쇠, 턴키(turn-key), 나사, 또는 클램프(clamp) 장치를 통해 함께 맞춤제작됨).
치료 단백질 약물 물질의 통합된 연속적 제조 방법
치료 단백질 약물 물질의 통합된 연속적 제조 방법이 본원에 제공된다. 이러한 방법은 세포가 실질적으로 존재하지 않는 재조합 치료 단백질을 함유하는 액체 배양 배지를 제공하는데, 여기서 액체 배양 배지는 제1 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS1)에 공급되고; MCCS1을 사용하여 액체 배양 배지 중의 재조합 치료 단백질을 포획하며, 여기서 재조합 치료 단백질을 함유하는 MCCS1의 용리액은 제2 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS2)에 연속적으로 공급되고; MCCS2를 사용하여 재조합 치료 단백질을 정제하고 폴리싱하는데, 여기서 MCCS2의 용리액이 치료 단백질 약물 물질인 것을 포함하고, 상기 방법은 액체 배양 배지부터 치료 단백질 약물 물질인 MCCS2의 용리액까지 통합되고 연속적으로 전개된다.
본원에 기재된 방법은 액체 배양 배지로부터 치료 약물 물질의 연속적이고 시간-효율적인 제조를 제공한다. 예를 들어, 치료 단백질을 함유하는 유체 (예를 들어, 액체 배양 배지)를 제1 MCCS에 공급하고 치료 단백질 약물 물질 (치료 단백질을 함유함)을 제2 MCCS로부터 용리하는 사이의 경과 시간은 예를 들어, 약 4시간 내지 약 48시간 (언급된 한계값 포함), 예를 들어 약 4시간 내지 약 40시간, 약 4시간 내지 약 35시간, 약 4시간 내지 약 30시간, 약 4시간 내지 약 28시간, 약 4시간 내지 약 26시간, 약 4시간 내지 약 24시간, 약 4시간 내지 약 22시간, 약 4시간 내지 약 20시간, 약 4시간 내지 약 18시간, 약 4시간 내지 약 16시간, 약 4시간 내지 약 14시간, 약 4시간 내지 약 12시간, 약 6시간 내지 약 12시간, 약 8시간 내지 약 12시간, 약 6시간 내지 약 20시간, 약 6시간 내지 약 18시간, 약 6시간 내지 약 14시간, 약 8시간 내지 약 16시간, 약 8시간 내지 약 14시간, 약 8시간 내지 약 12시간, 약 10시간 내지 20시간, 약 10시간 내지 18시간, 약 10시간 내지 16시간, 약 10시간 내지 14시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 10시간 내지 약 40시간, 약 10시간 내지 약 35시간, 약 10시간 내지 약 30시간, 약 10시간 내지 약 25시간, 약 15시간 내지 약 40시간, 약 15시간 내지 약 35시간, 약 15시간 내지 약 30시간, 약 20시간 내지 약 40시간, 약 20시간 내지 약 35시간, 또는 약 20시간 내지 약 30시간 (언급된 한계값 포함)일 수 있다. 다른 예에서, 치료 단백질을 함유하는 유체 (예를 들어, 액체 배양 배지)를 MCCS1에 공급하고 치료 단백질 약물 물질 (치료 단백질을 함유함)을 MCCS2로부터 용리하는 사이의 경과 시간은 예를 들어, 약 4시간 초과 내지 약 40시간 미만 (언급된 한계값 포함), 예를 들어 약 4시간 초과 내지 약 39시간, 약 38시간, 약 37시간, 약 36시간, 약 35시간, 약 34시간, 약 33시간, 약 32시간, 약 31시간, 약 30시간, 약 29시간, 약 28시간, 약 27시간, 약 26시간, 약 25시간, 약 24시간, 약 23시간, 약 22시간, 약 21시간, 약 20시간, 약 19시간, 약 18시간, 약 17시간, 약 16시간, 약 15시간, 약 14시간, 약 13시간, 약 12시간, 약 11시간, 약 10시간, 약 9시간, 약 8시간, 약 7시간, 약 6시간, 약 5시간, 또는 약 4.5시간 미만 (언급된 한계값 포함)이다.
일부 예시적 방법은 보유 단계를 이용하지 않는다 (예를 들어, 전체 공정에서 저장소 (예를 들어, 브레이크 탱크)를 사용하지 않음). 다른 예시적 방법은 전체 공정에서 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 저장소(들) (예를 들어, 브레이크 탱크(들))를 사용할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법은 전체 공정에서 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 저장소(들) (예를 들어, 브레이크 탱크(들))를 이용할 수 있고, 여기서 각각의 브레이크 탱크는 단지 치료 단백질을, 예를 들어 약 5분 내지 약 6시간 미만 (언급된 한계값 포함), 예를 들어 약 5분 내지 약 5시간, 약 4시간, 약 3시간, 약 2시간, 약 1시간, 또는 약 30분 (언급된 한계값 포함)의 총 기간 동안 보유한다. 본원에 기재된 방법에 사용되는 임의의 저장소(들) (예를 들어, 브레이크 탱크(들))는, 예를 들어 1 mL 내지 약 300 mL (언급된 한계값 포함), 예를 들어 1 mL 내지 약 280 mL, 약 260 mL, 약 240 mL, 약 220 mL, 약 200 mL, 약 180 mL, 약 160 mL, 약 140 mL, 약 120 mL, 약 100 mL, 약 80 mL, 약 60 mL, 약 40 mL, 약 20 mL, 또는 약 10 mL (언급된 한계값 포함)의 용량을 가질 수 있다. 유체가 제1 MCCS에 들어가기 전에 유체를 보유하기 위해 (본원에 기재된 임의의 방법에) 사용되는 임의의 저장소(들) (예를 들어, 브레이크 탱크(들))는, 예를 들어 1 mL 내지 제1 MCCS의 제1 칼럼의 로딩 부피의 약 100% (언급된 한계값 포함), 예를 들어 1 mL 내지 제1 MCCS의 제1 칼럼의 로딩 부피의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 또는 약 5% (언급된 한계값 포함)의 용량을 가질 수 있다. 유체가 제2 MCCS에 들어가기 전에 (또한 유체가 제1 MCCS에서 나온 후에) 유체를 보유하기 위해 (본원에 기재된 임의의 방법에) 사용되는 임의의 저장소(들) (예를 들어, 브레이크 탱크(들))는, 예를 들어 1 mL 내지 제2 MCCS의 제1 칼럼의 로딩 부피의 약 100% (언급된 한계값 포함), 예를 들어 1 mL 내지 제2 MCCS의 제1 칼럼의 로딩 부피의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 또는 약 5% (언급된 한계값 포함)의 용량을 가질 수 있다.
이러한 방법의 다양한 추가 측면이 하기에 상세히 기재되고, 비제한적으로 본원에 제공된 방법에 임의로 조합되어 사용될 수 있다. 제공된 방법의 예시적 측면이 하기에 기재되지만; 통상의 기술자라면 추가 단계가 본원에 기재된 방법에 추가될 있고 본원에 기재된 방법의 임의의 단계를 수행하는데 다른 물질이 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
액체 배양 배지
세포가 실질적으로 존재하지 않는 재조합 치료 단백질을 함유하는 액체 배양 배지는 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 액체 배양 배지는 재조합 세포 배양물 (예를 들어, 재조합 박테리아, 효모, 또는 포유류 세포 배양물)로부터 수득될 수 있다. 액체 배양 배지는 유가 배양 세포 (예를 들어, 포유류 세포) 배양물 (예를 들어, 재조합 치료 단백질을 분비하는 포유류 세포의 배양물을 함유하는 유가 배양 생물반응기) 또는 관류 세포 (예를 들어, 포유류 세포) 배양물 (예를 들어, 재조합 치료 단백질을 분비하는 포유류 세포의 배양물을 함유하는 관류 생물반응기)로부터 수득될 수 있다. 액체 배양 배지는 또한 재조합 치료 단백질을 분비하는 박테리아 또는 효모 세포 배양물로부터의 정화된 액체 배양 배지일 수 있다.
재조합 세포 배양물로부터 수득된 액체 배양 배지는 여과 또는 정화되어 세포 및/또는 바이러스가 실질적으로 존재하지 않는 액체 배양 배지를 수득할 수 있다. 세포를 제거하기 위해 액체 배양 배지를 여과 또는 정화하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 0.2 ㎛ 여과 및 교번 접선 유동 (Alternating Tangential Flow; ATF™) 시스템을 사용하는 여과). 재조합 세포는 또한 원심분리를 사용하고 세포가 실질적으로 존재하지 않는 액체 배양 배지인 상청액을 제거함으로써, 또는 세포를 중력에 의해 액체 배양 배지를 함유하는 용기 (예를 들어, 생물반응기)의 바닥으로 침강시키고 침강된 재조합 세포에서 멀어진 액체 배양 배지 (세포가 실질적으로 존재하지 않는 액체 배양 배지)를 제거함으로써 액체 배양 배지로부터 제거될 수 있다.
액체 배양 배지는 본원에 기재된 임의의 재조합 치료 단백질을 생산하는 재조합 세포 (예를 들어, 재조합 박테리아, 효모, 또는 포유류 세포)의 배양물로부터 수득될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 예는 재조합 치료 단백질을 생산하는 재조합 세포 (예를 들어, 재조합 박테리아, 효모, 또는 포유류 세포)를 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
액체 배양 배지는 본원에 기재되었거나 관련 기술분야에서 공지된 임의의 유형의 액체 배양 배지일 수 있다. 예를 들어, 액체 배양 배지는 동물-유래 성분 무함유 액체 배양 배지, 혈청-무함유 액체 배양 배지, 혈청-함유 액체 배양 배지, 화학적으로 한정된 액체 배양 배지, 및 단백질-무함유 액체 배양 배지의 군으로부터 선택될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 배양물로부터 수득된 액체 배양 배지는 제1 MCCS (예를 들어, 제1 PCCS)에 공급되기 전에 제2 유체 (예를 들어, 완충액)의 첨가에 의해 희석될 수 있다.
세포가 실질적으로 존재하지 않는 재조합 치료 단백질을 함유하는 액체 배양 배지는, 액체 배양 배지가 제1 MCCS (예를 들어, 제1 PCCS)에 공급되기 전에 적어도 1일 (예를 들어, 적어도 약 2일, 적어도 약 5일, 적어도 약 10일, 적어도 약 15일, 적어도 약 20일, 또는 적어도 약 30일) 동안, 예를 들어 약 15℃ 미만 (예를 들어, 약 10℃ 미만, 약 4℃ 미만, 약 0℃ 미만, 약 -20℃ 미만, 약 -50℃ 미만, 약 -70℃ 미만, 또는 약 -80℃ 미만)의 온도에서 저장될 수 있다. 별법으로, 일부 예에서 액체 배양 배지는 생물반응기로부터 직접적으로 제1 MCCS (예를 들어, 제1 PCCS)에 공급된다 (예를 들어, 여과 또는 정화 단계 후에 생물반응기로부터 직접적으로 제1 MCCS (예를 들어, 제1 PCCS)에 공급됨).
재조합 치료 단백질
본원에 제공된 방법에 의해 생산가능한 재조합 치료 단백질의 비제한적 예는 면역글로불린 (경쇄 및 중쇄 면역글로불린을 포함함), 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 항체 단편), 효소 (예를 들어, 갈락토시다제 (예를 들어, 알파-갈락토시다제), 미오자임(Myozyme), 또는 세레자임(Cerezyme)), 단백질 (예를 들어, 인간 에리트로포이에틴, 종양 괴사 인자 (TNF), 또는 인터페론 알파 또는 베타), 또는 면역원성 또는 항원성 단백질 또는 단백질 단편 (예를 들어, 백신에 사용하기 위한 단백질)을 포함한다. 재조합 치료 단백질은 1개 이상의 다기능성 재조합 단백질 스캐폴드를 함유하는 가공 항원-결합 폴리펩티드일 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gebauer et al., Current Opin . Chem . Biol . 13:245-255, 2009]; 및 미국 특허 출원 공보 2012/0164066 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 개시된 재조합 항원-결합 단백질 참조). 항체인 재조합 치료 단백질의 비제한적 예는 파니투무맙, 오말리주맙, 아바고보맙, 앱식시맙, 액톡수맙, 아달리무맙, 아데카투무맙, 아펠리모맙, 아푸투주맙, 알락시주맙, 알락시주맙, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 알투모맙, 아마툭시맙, 아마툭시맙, 아나투모맙, 안루킨주맙, 아폴리주맙, 아르시투모맙, 아티누맙, 토실리주맙, 바실리지맙, 벡투모맙, 벨리무맙, 베바시주맙, 베실레소맙, 베즐로톡수맙, 비시로맙, 카나키누맙, 세르톨리주맙, 세툭시맙, 식수투무맙, 다클리주맙, 데노수맙, 덴수맙, 에쿨리주맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에푼구맙, 에프라투주맙, 에르투맥소맙, 에타라시주맙, 피지투무맙, 골리무맙, 이브리투모맙 튜세탄, 이고보맙, 임가투주맙, 인플릭시맙, 이놀리모맙, 이노투주맙, 라베투주맙, 레브리키주맙, 목세투모맙, 나탈리주맙, 오비누투주맙, 오레고보맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 페르투주맙, 라니비주맙, 리툭시맙, 토실리주맙, 토시투모맙, 트랄로키누맙, 투코투주맙, 트라스투주맙, 벨투주맙, 잘루투무맙, 및 자툭시맙을 포함한다. 본원에 기재된 방법에 의해 생산가능한 재조합 치료 항체의 추가 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 본 발명의 방법에 의해 생산가능한 재조합 치료 단백질의 추가 비제한적 예는 알글루코시다제 알파, 라로니다제, 아바타셉트, 갈술파제, 루트로핀 알파, 항혈우병 인자, 아갈시다제 베타, 인터페론 베타-1a, 다르베포에틴 알파, 테넥테플라제, 에타네르셉트, 응고 인자 IX, 난포 자극 호르몬, 인터페론 베타-1a, 이미글루세라제, 도르나제 알파, 에포에틴 알파, 인슐린 또는 인슐린 유사체, 메카세르민, 인자 VIII, 인자 VIIa, 항트롬빈 III, 단백질 C, 인간 알부민, 에리트로포이에틴, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, 인터류킨-11, 라로니다제, 이두르술파제, 갈술파제, α-1-프로테이나제 억제제, 락타제, 아데노신 데아미나제, 조직 플라스미노겐 활성인자, 티로트로핀 알파 (예를 들어, 티로겐(Thyrogen)®) 및 알테플라제를 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 생산가능한 재조합 단백질의 추가 예는 산 α-글루코시다제, 알글루코시다제 알파 (예를 들어, 미오자임® 및 루미자임(Lumizyme)®), α-L-이두로니다제 (예를 들어, 알두라자임(Aldurazyme)®), 이두로네이트 술파타제, 헤파란 N-술파타제, 갈락토스-6-술파타제, 산 β-갈락토시다제, β-글루코로니다제, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제, α-N-아세틸갈락토스아미니다제, 산 리파제, 리소좀산 세라미다제, 산 스핑고미엘리나제, β-글루코시다제 (예를 들어, 세레자임® 및 세레다제(Ceredase)®), 갈락토실세라미다제, α-갈락토시다제-A (예를 들어, 파브라자임(Fabrazyme)®), 산 β-갈락토시다제, β-갈락토시다제, 뉴라미니다제, 헥소사미니다제 A, 및 헥소사미니다제 B를 포함한다.
분비된, 가용성 재조합 치료 단백질은 세포 (예를 들어, 포유류 세포)로부터 액체 배양 배지를 제거하거나 또는 물리적으로 분리함으로써 액체 배양 배지 (예를 들어, 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지)로부터 회수될 수 있다. 예를 들어 원심분리, 여과, 피펫팅, 및/또는 흡인을 포함하여, 세포 (예를 들어, 포유류 세포)로부터 액체 배양 배지를 제거하는 다양하게 상이한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이어서, 분비된 재조합 치료 단백질은 다양한 생화학적 기술, 예를 들어 다양한 유형의 크로마토그래피 (예를 들어, 친화 크로마토그래피, 분자체 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 또는 음이온 교환 크로마토그래피) 및/또는 여과 (예를 들어, 분자량 컷오프 여과)를 사용하여 액체 배양 배지로부터 회수되고 추가로 정제될 수 있다.
다중 칼럼 크로마토그래피 시스템
본원에 기재된 방법은 2개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS)을 사용하는 것을 포함한다. MCCS는 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼, 2개 이상의 크로마토그래피 막, 또는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼과 1개 이상의 크로마토그래피 막의 조합을 포함할 수 있다. 비제한적 예에서, MCCS (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 방법의 제1 및/또는 제2 MCCS)는 4개의 크로마토그래피 칼럼, 3개의 크로마토그래피 칼럼 및 크로마토그래피 막, 3개의 크로마토그래피 칼럼, 2개의 크로마토그래피 칼럼, 2개의 크로마토그래피 막, 및 2개의 크로마토그래피 칼럼 및 1개의 크로마토그래피 막을 포함할 수 있다. MCCS (예를 들어, 제1 및/또는 제2 MCCS)에 사용하기 위한 크로마토그래피 칼럼 및/또는 크로마토그래피 막 조합의 추가 예는 비제한적으로 통상의 기술자에 의해 고안될 수 있다. MCCS에 존재하는 개별 크로마토그래피 칼럼 및/또는 크로마토그래피 막은 동일할 수 있거나 (예를 들어, 동일한 형상, 부피, 수지, 포획 메카니즘, 및 단위 조작을 가짐), 또는 상이할 수 있다 (예를 들어, 상이한 형상, 부피, 수지, 포획 메카니즘, 및 단위 조작 중 하나 이상을 가짐). MCCS (예를 들어, 제1 및/또는 제2 MCCS)에 존재하는 개별 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들)은 동일한 단위 조작 (예를 들어, 포획, 정제, 또는 폴리싱의 단위 조작) 또는 상이한 단위 조작 (예를 들어, 포획, 정제, 폴리싱, 바이러스의 불활성화, 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체의 이온 농도 및/또는 pH의 조정, 및 여과의 군으로부터 선택된 상이한 단위 조작)을 수행할 수 있다.
MCCS에 존재할 수 있는 (예를 들어, 제1 및/또는 제2 MCCS에 존재할 수 있는) 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼(들)은, 예를 들어 약 2 mL 이상, 약 5 mL 이상, 약 10 mL 이상, 약 15 mL 이상, 약 20 mL 이상, 약 25 mL 이상, 약 30 mL 이상, 약 35 mL 이상, 약 40 mL 이상, 약 45 mL 이상, 약 50 mL 이상, 약 55 mL 이상, 약 60 mL 이상, 약 65 mL 이상, 약 70 mL 이상, 약 75 mL 이상, 약 80 mL 이상, 약 85 mL 이상, 약 90 mL 이상, 약 95 mL 이상, 또는 약 100 mL 이상의 수지 부피를 가질 수 있다. MCCS에 존재할 수 있는 (예를 들어, 제1 및/또는 제2 MCCS에 존재할 수 있는) 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼(들)은 약 2 mL 내지 약 100 mL, 약 2 mL 내지 약 90 mL, 약 2 mL 내지 약 80 mL, 약 2 mL 내지 약 70 mL, 약 2 mL 내지 약 60 mL, 약 2 mL 내지 약 50 mL, 약 5 mL 내지 약 50 mL, 약 2 mL 내지 약 45 mL, 약 5 mL 내지 약 45 mL, 약 2 mL 내지 약 40 mL, 약 5 mL 내지 약 40 mL, 약 2 mL 내지 약 35 mL, 약 5 mL 내지 약 35 mL, 약 2 mL 내지 약 30 mL, 약 5 mL 내지 약 30 mL, 약 2 mL 내지 약 25 mL, 약 5 mL 내지 약 25 mL, 약 15 mL 내지 약 60 mL, 약 10 mL 내지 약 60 mL, 약 10 mL 내지 약 50 mL, 및 약 15 mL 내지 약 50 mL의 수지 부피를 가질 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법에 사용되는 MCCS (예를 들어, 제1 및/또는 제2 MCCS)의 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼(들)은 실질적으로 동일한 수지 부피를 가질 수 있거나 또는 상이한 수지 부피를 가질 수 있다. MCCS (예를 들어, 제1 및/또는 제2 MCCS)의 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼(들)을 위해 사용되는 유량은 예를 들어, 약 0.2 mL/분 내지 약 25 mL/분 (예를 들어, 약 0.2 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.2 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 10 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 14 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 25.0 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 15.0 mL/분)일 수 있다.
MCCS (예를 들어, 제1 및/또는 제2 MCCS)의 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼(들)은 실질적으로 동일한 형상을 가질 수 있거나 또는 실질적으로 상이한 형상을 가질 수 있다. 예를 들어, MCCS (예를 들어, 제1 및/또는 제2 MCCS)의 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼(들)은 실질적으로 원형 실린더의 형상을 가질 수 있거나 또는 실질적으로 타원형 실린더의 동일한 형상을 가질 수 있다.
MCCS에 존재할 수 있는 (예를 들어, 제1 및/또는 제2 MCCS에 존재할 수 있는) 1개 이상의 크로마토그래피 막(들)은 예를 들어, 약 1 mL 내지 약 500 mL (예를 들어, 약 1 mL 내지 약 475 mL, 약 1 mL 내지 약 450 mL, 약 1 mL 내지 약 425 mL, 약 1 mL 내지 약 400 mL, 약 1 mL 내지 약 375 mL, 약 1 mL 내지 약 350 mL, 약 1 mL 내지 약 325 mL, 약 1 mL 내지 약 300 mL, 약 1 mL 내지 약 275 mL, 약 1 mL 내지 약 250 mL, 약 1 mL 내지 약 225 mL, 약 1 mL 내지 약 200 mL, 약 1 mL 내지 약 175 mL, 약 1 mL 내지 약 150 mL, 약 1 mL 내지 약 125 mL, 약 1 mL 내지 약 100 mL, 약 2 mL 내지 약 100 mL, 약 5 mL 내지 약 100 mL, 약 1 mL 내지 약 80 mL, 약 2 mL 내지 약 80 mL, 약 5 mL 내지 약 80 mL, 약 1 mL 내지 약 60 mL, 약 2 mL 내지 약 60 mL, 약 5 mL 내지 약 60 mL, 약 1 mL 내지 약 40 mL, 약 2 mL 내지 약 40 mL, 약 5 mL 내지 약 40 mL, 약 1 mL 내지 약 30 mL, 약 2 mL 내지 약 30 mL, 약 5 mL 내지 약 30 mL, 약 1 mL 내지 약 25 mL, 약 2 mL 내지 약 25 mL, 약 1 mL 내지 약 20 mL, 약 2 mL 내지 약 20 mL, 약 1 mL 내지 약 15 mL, 약 2 mL 내지 약 15 mL, 약 1 mL 내지 약 10 mL, 또는 약 2 mL 내지 약 10 mL)의 층 부피를 가질 수 있다.
1종 이상 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24종)의 상이한 완충액이 본원에 기재된 임의의 방법에서 2개 이상의 MCCS를 사용하는 동안에 이용될 수 있다. 관련 기술분야에서 공지된 바와 같이, 본원에 기재된 방법에서 사용되는 2개 이상의 MCCS에 사용되는 1종 이상의 완충액은 2개 이상의 MCCS (예를 들어, 제1 및 제2 MCCS)의 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들)에 존재하는 수지, 재조합 치료 단백질, 및 2개 이상의 MCCS의 특정 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막에 의해 수행되는 단위 조작 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 예시적 단위 조작)에 따라 달라질 것이다. 본원에 기재된 임의의 방법에서 2개 이상의 MCCS를 사용하는 동안에 이용되는 완충액의 부피 및 유형은 또한 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다 (예를 들어, 하기에 더욱 상세히 논의됨). 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 방법에서 2개 이상의 MCCS를 사용하는 동안에 이용되는 완충액의 부피 및 유형(들)은 재조합 단백질 약물 생성물에 있어서 하기 중 하나 이상을 최적화하도록 선택될 수 있다: 재조합 치료 단백질의 전체 수율, 재조합 치료 단백질의 활성, 재조합 치료 단백질의 순도 수준, 및 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체로부터의 생물학적 오염물의 제거 (예를 들어, 활성 바이러스, 마이코박테리아, 효모, 박테리아, 또는 포유류 세포의 부재).
제1 및/또는 제2 MCCS는 주기적 향류 크로마토그래피 시스템 (PCCS)일 수 있다. PCCS는 예를 들어, 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼으로부터 재조합 치료 단백질의 연속적인 용리를 허용하도록 스위칭되는 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼 (예를 들어, 3개의 칼럼 또는 4개의 칼럼)을 포함할 수 있다. PCCS는 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼, 2개 이상의 크로마토그래피 막, 또는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 및 1개 이상의 크로마토그래피 막을 포함할 수 있다. 칼럼 조작은 일반적으로 로딩, 세척, 용리, 및 재생 단계로 이루어진다. PCCS에서, 다수의 칼럼이 동일한 단계를 순환하는 방식으로 별도로 연속적으로 실행하는데 사용된다. 칼럼이 직렬로 조작되므로, 하나의 칼럼으로부터의 통과액 및 세척액은 또 다른 칼럼에 의해 포획된다. PCCS의 이러한 특이한 특징은 배치식 크로마토그래피 동안에 전형적인 동적 결합능 대신에, 정적 결합능에 근접한 수지의 로딩을 허용한다. 3개의 칼럼을 함유하는 PCCS에서 사용되는 3-칼럼 스위칭 기술의 예가 도 3에 도시되어 있다. 사이클은 칼럼-스위칭 기술에서 사용되는 3개의 칼럼 각각으로부터의 용리 풀을 초래하는 3개의 완료된 칼럼 조작으로서 정의된다. 사이클에서 모든 단계가 완료되었을 때, 사이클은 재시작된다. 연속적인 사이클 및 용리의 결과로서, PCCS에 들어가는 유체가 연속적으로 가공되고, 재조합 치료 단백질을 함유하는 용리액이 연속적으로 생성된다.
도 3에 도시된 예시적 사이클과 같은 PCCS 사이클에서 하나의 단계로부터 또 다른 단계로 진행하기 위해서, 칼럼-스위칭 전략이 이용된다. 칼럼 스위칭 방법은 도 3에 도시된 예시적 PCCS 시스템의 3개의 칼럼에서 칼럼 당 2개의 자동식 스위칭 작동을 이용하고, 그 중 첫번째 것은 초기 생성물 누출과 관련이 있고, 반면에 두번째 것은 칼럼 포화와 일치한다. 칼럼 스위칭 작동이 발생해야 하는 시점은 PCCS에 존재하는 각각의 크로마토그래피 칼럼으로부터의 용리액 중 재조합 치료 단백질의 농도를 모니터링함으로써 (예를 들어, UV 모니터링에 의해 수행되는 모니터링) 결정된다. 예를 들어, 칼럼 스위칭은 피드백 조절과 함께 생성물 농도를 인라인 측정할 수 있는 임의의 PAT 기구에 의해 결정될 수 있다. PAT 기구는 피드백 조절과 함께 생성물 농도를 실시간 인라인 측정할 수 있다.
도 4는 공급물 유입구와 칼럼 유출구 사이의 UV 흡광도 차이 (ΔUV)에 기초한 예시적 PCCS의 칼럼 스위칭 예를 도시한다. 예를 들어, 칼럼 로딩 (단계 1; 도 3) 동안에, PCC 조절 시스템은 흡광도가 안정화되었을 때 불순물 기준선 수준을 결정한다. 생성물이 누출될 때 (단계 2; 도 3), 유출구 UV 신호가 불순물 기준선보다 증가한다. ΔUV가 미리 결정된 역치 (예를 들어, 생성물의 3% 누출)에 도달하면, 칼럼 1로부터의 통과액이 폐기물 대신에 칼럼 2로 향한다 (t1; 도 4). 칼럼 1이 생성물로 거의 포화되고 ΔUV가 미리 결정된 값에 도달하면 (t2; 도 4), 공급물은 칼럼 2로 스위칭된다. PCCS에서 사용되는 칼럼-스위칭 전략은 공급 생성물 농도 및 용량과 상관없이 칼럼의 균일한 로딩을 허용한다. 각 칼럼으로부터의 용리액에서 검출되는 재조합 단백질 수준에 기초한 칼럼의 유사한 스위칭이 설계될 수 있다. 관련 기술분야에서 공지된 바와 같이, 칼럼 스위칭은 또한 제1 또는 제2 MCCS의 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막을 통과하는 유체 (예를 들어, 완충액)의 양 또는 시간에 기초하여 설계될 수 있다.
PCCS에서는 제1 칼럼/막으로부터의 누출이 또 다른 칼럼/막에 포획될 수 있으므로, PCCS에서, PCCS에 존재하는 각각의 크로마토그래피 칼럼 및/또는 크로마토그래피 막에서의 재조합 치료 단백질의 체류 시간 (RT)은 칼럼/막 크기의 증가 없이 감소할 수 있다. 연속적 공정 시스템은 V = D * RT의 방정식을 이용하여 칼럼/막 부피 (V) 및 RT를 변화시킴으로써 임의의 관류 속도 (D)로 액체 배양 배지를 가공하도록 설계될 수 있다.
본원에 기재된 방법에서 사용되는 2개 이상의 MCCS (예를 들어, 제1 및/또는 제2 MCCS)에 의해 수행가능한 1개 이상의 단위 조작은 예를 들어, 재조합 치료 단백질의 포획, 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체에 존재하는 바이러스의 불활성화, 재조합 치료 단백질의 정제, 재조합 치료 단백질의 폴리싱, 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체의 보유 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 예시적 브레이크 탱크(들)를 사용함), 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체로부터 미립자 물질 및/또는 세포의 여과 또는 제거, 및 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체의 이온 농도 및/또는 pH의 조정을 포함한다.
포획하는 단위 조작은 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 및/또는 크로마토그래피 수지를 포함하는, 예를 들어 포획 메카니즘을 이용하는 1개 이상의 MCCS (예를 들어, 제1 및/또는 제2 MCCS)를 사용하여 수행될 수 있다. 포획 메카니즘의 비제한적 예는 단백질 A-결합 포획 메카니즘, 항체- 또는 항체 단편-결합 포획 메카니즘, 기질-결합 포획 메카니즘, 앱타머-결합 포획 메카니즘, 태그-결합 포획 메카니즘 (예를 들어, 폴리-His 태그-기반 포획 메카니즘), 및 보조인자-결합 포획 메카니즘을 포함한다. 포획은 또한 양이온 교환 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 또는 분자체 크로마토그래피를 수행하는데 사용가능한 수지를 사용하여 수행될 수 있다. 재조합 치료 단백질을 포획하는데 사용가능한 비제한적 수지는 본원에 기재되어 있다. 재조합 치료 단백질을 포획하는데 사용가능한 수지의 추가 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
재조합 치료 단백질을 함유하는 유체에 존재하는 바이러스를 불활성화하는 단위 조작은, 예를 들어 크로마토그래피 칼럼, 크로마토그래피 막, 또는 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체를 약 3.0 내지 5.0 (예를 들어, 약 3.5 내지 약 4.5, 약 3.5 내지 약 4.25, 약 3.5 내지 약 4.0, 약 3.5 내지 약 3.8, 또는 약 3.75)의 pH에서 적어도 30분의 기간 (예를 들어, 약 30분 내지 1.5시간의 기간, 약 30분 내지 1.25시간의 기간, 약 0.75시간 내지 1.25시간의 기간, 또는 약 1시간의 기간) 동안 인큐베이션할 수 있는 보유 탱크를 포함하는 1개 이상의 MCCS (예를 들어, 제1 및/또는 제2 MCCS)를 사용하여 수행될 수 있다.
재조합 단백질을 정제하는 단위 조작은, 예를 들어 수지를 함유하는, 예를 들어 포획 시스템을 이용하는 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 포함하는 1개 이상의 MCCS (예를 들어, 제1 및/또는 제2 MCCS)를 사용하여 수행될 수 있다. 포획 메카니즘의 비제한적 예는 단백질 A-결합 포획 메카니즘, 항체- 또는 항체 단편-결합 포획 메카니즘, 기질-결합 포획 메카니즘, 앱타머-결합 포획 메카니즘, 태그-결합 포획 메카니즘 (예를 들어, 폴리-His 태그-기반 포획 메카니즘), 및 보조인자-결합 포획 메카니즘을 포함한다. 정제는 또한 양이온 교환 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 또는 분자체 크로마토그래피를 수행하는데 사용가능한 수지를 사용하여 수행될 수 있다. 재조합 치료 단백질을 정제하는데 사용가능한 비제한적 수지는 본원에 기재되어 있다. 재조합 치료 단백질을 정제하는데 사용가능한 수지의 추가 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
재조합 단백질을 폴리싱하는 단위 조작은, 예를 들어 수지를 함유하는, 예를 들어 양이온 교환, 음이온 교환, 또는 분자체 크로마토그래피를 수행하는데 사용가능한 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 포함하는 1개 이상의 MCCS (예를 들어, 제1 및/또는 제2 MCCS)를 사용하여 수행될 수 있다. 재조합 치료 단백질을 폴리싱하는데 사용가능한 비제한적 수지는 본원에 기재되어 있다. 재조합 치료 단백질을 폴리싱하는데 사용가능한 수지의 추가 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
재조합 치료 단백질을 함유하는 유체를 보유하는 단위 조작은 조합된 제1 및 제2 MCCS에 1개 이상의 저장소 (예를 들어, 브레이크 탱크) 또는 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 저장소(들) (예를 들어, 브레이크 탱크(들))를 포함하는 MCCS (예를 들어, 제1 및/또는 제2 MCCS)를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 이러한 단위 조작을 달성하는데 사용가능한 저장소(들) (예를 들어, 브레이크 탱크(들))는 각각 약 1 mL 내지 약 1 L (예를 들어, 약 1 mL 내지 약 800 mL, 약 1 mL 내지 약 600 mL, 약 1 mL 내지 약 500 mL, 약 1 mL 내지 약 400 mL, 약 1 mL 내지 약 350 mL, 약 1 mL 내지 약 300 mL, 약 10 mL 내지 약 250 mL, 약 10 mL 내지 약 200 mL, 약 10 mL 내지 약 150 mL, 및 약 10 mL 내지 약 100 mL)의 부피를 가질 수 있다. 본원에 기재된 방법에 사용되는 저장소(들) (예를 들어, 브레이크 탱크(들))는, 예를 들어 1 mL 내지 약 300 mL (언급된 한계값 포함), 예를 들어 1 mL 내지 약 280 mL, 약 260 mL, 약 240 mL, 약 220 mL, 약 200 mL, 약 180 mL, 약 160 mL, 약 140 mL, 약 120 mL, 약 100 mL, 약 80 mL, 약 60 mL, 약 40 mL, 약 20 mL, 또는 약 10 mL (언급된 한계값 포함)의 용량을 가질 수 있다. 유체가 제1 MCCS에 들어가기 전에 유체를 보유하기 위해 (본원에 기재된 임의의 방법에) 사용되는 임의의 저장소(들) (예를 들어, 브레이크 탱크(들))는, 예를 들어 1 mL 내지 제1 MCCS의 제1 칼럼의 로딩 부피의 약 100% (언급된 한계값 포함), 약 1 mL 내지 제1 MCCS의 제1 칼럼의 로딩 부피의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 또는 약 5% (언급된 한계값 포함)의 용량을 가질 수 있다. 유체가 제2 MCCS에 들어가기 전에 (또한 유체가 제1 MCCS에서 나온 후에) 유체를 보유하기 위해 사용되는 임의의 저장소(들) (예를 들어, 브레이크 탱크(들))는, 예를 들어 1 mL 내지 제2 MCCS의 제1 칼럼의 로딩 부피의 약 100% (언급된 한계값 포함), 예를 들어 약 1 mL 내지 제2 MCCS의 제1 칼럼의 로딩 부피의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 또는 약 5% (언급된 한계값 포함)의 용량을 가질 수 있다.
저장소(들) (예를 들어, 브레이크 탱크(들))는 각각 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체를 적어도 10분 (예를 들어, 적어도 20분, 적어도 30분, 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 4시간, 또는 적어도 6시간) 동안 보유할 수 있다. 다른 예에서, 저장소(들) (예를 들어, 브레이크 탱크(들))는 단지 치료 단백질을, 예를 들어 약 5분 내지 약 6시간 미만 (언급된 한계값 포함), 예를 들어 약 5분 내지 약 5시간, 약 4시간, 약 3시간, 약 2시간, 약 1시간, 또는 약 30분 (언급된 한계값 포함)의 총 기간 동안 보유한다. 저장소(들) (예를 들어, 브레이크 탱크(들))는 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체를 보유하고 냉장시키는데 (예를 들어, 25℃ 미만, 15℃ 미만, 또는 10℃ 미만의 온도에서) 사용될 수 있다. 저장소는 원형 실린더, 타원형 실린더, 또는 대략 직사각형의 실링된 불투과성 백을 포함하여, 임의의 형상을 가질 수 있다.
재조합 치료 단백질을 함유하는 유체를 여과하는 단위 조작은, 예를 들어 필터, 또는 분자체 수지를 함유하는 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 포함하는 MCCS (예를 들어, 제1 및/또는 제2 MCCS)를 사용하여 수행될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 임의의 침전 물질 및/또는 세포 (예를 들어, 침전된, 비접힘 단백질; 침전된, 원치않는 숙주 세포 단백질; 침전된 지질; 박테리아; 효모 세포; 진균 세포; 마이코박테리아; 및/또는 포유류 세포)를 제거할 수 있는, 매우 다양한 서브마이크론 필터 (예를 들어, 1 ㎛ 미만, 0.5 ㎛ 미만, 0.3 ㎛ 미만, 약 0.2 ㎛, 0.2 ㎛ 미만, 100 nm 미만, 80 nm 미만, 60 nm 미만, 40 nm 미만, 20 nm 미만, 또는 10 nm 미만의 세공 크기를 갖는 필터)가 관련 기술분야에서 이용가능하다. 약 0.2 ㎛ 또는 0.2 ㎛ 미만의 세공 크기를 갖는 필터는 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체로부터 박테리아를 효과적으로 제거하는 것으로 공지되었다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 분자체 수지를 함유하는 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막이 또한 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체를 여과하는 단위 조작을 수행하기 위해 MCCS (예를 들어, 제1 및/또는 제2 MCCS)에 사용될 수 있다.
재조합 치료 단백질을 함유하는 유체의 이온 농도 및/또는 pH를 조정하는 단위 조작은 새로운 완충액 용액을 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체에, 예를 들어 단일 MCCS 내의 칼럼 사이에서, 또는 끝에서 두번째의 MCCS (예를 들어, 제1 MCCS)의 마지막 칼럼 후 및 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체가 다음 MCCS (예를 들어, 제2 MCCS)의 제1 칼럼에 공급되기 전에 첨가하는 완충액 조정 저장소 (예를 들어, 인라인 완충액 조정 저장소)를 포함하고 이용하는 MCCS (예를 들어, 제1 및/또는 제2 MCCS)를 사용하여 수행될 수 있다. 관련 기술분야에서 이해될 수 있는 바와 같이, 인라인 완충액 조정 저장소는 임의의 크기를 가질 수 있고 (예를 들어, 100 mL 초과), 임의의 완충 용액 (예를 들어, 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체와 비교하여 증가하였거나 감소한 pH, 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체와 비교하여 증가하였거나 감소한 이온 (예를 들어, 염) 농도, 및/또는 MCCS (예를 들어, 제1 또는 제2 MCCS)의 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 1개 이상의 크로마토그래피 막에 존재하는 수지와의 결합에 대하여 재조합 치료 단백질과 경쟁하는 작용제의 증가하였거나 감소한 농도 중 하나 이상을 갖는 완충 용액)을 함유할 수 있다.
제1 및/또는 제2 MCCS는 2개 이상의 단위 조작을 수행할 수 있다. 예를 들어, 제1 및/또는 제2 MCCS는 각각 적어도 하기 단위 조작을 수행할 수 있다: 재조합 치료 단백질의 포획 및 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체에 존재하는 바이러스의 불활성화; 재조합 치료 단백질의 포획, 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체에 존재하는 바이러스의 불활성화, 및 재조합 치료 단백질을 함유하는 액체의 이온 농도 및/또는 pH의 조정; 재조합 치료 단백질의 정제 및 재조합 치료 단백질의 폴리싱; 재조합 치료 단백질의 정제, 재조합 치료 단백질의 폴리싱, 및 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체의 여과 또는 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체로부터 침전물 및/또는 특정 물질의 제거; 및 재조합 치료 단백질의 정제, 재조합 치료 단백질의 폴리싱, 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체의 여과 또는 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체로부터 침전물 및/또는 특정 물질의 제거, 및 재조합 치료 단백질을 함유하는 액체의 이온 농도 및/또는 pH의 조정.
재조합 치료 단백질의 포획
본 발명의 방법은 제1 MCCS를 사용하여 재조합 치료 단백질을 포획하는 단계를 포함한다. 관련 기술분야에서 이해될 수 있는 바와 같이, 재조합 치료 단백질을 함유하는 액체 배양 배지는 다양하게 상이한 수단을 사용하여 제1 MCCS에 연속적으로 공급될 수 있다. 예를 들어, 액체 배양 배지는 제1 MCCS에 능동 펌핑될 수 있거나 또는 액체 배양 배지는 중력을 이용하여 제1 MCCS에 공급될 수 있다. 액체 배양 배지는 제1 MCCS에 공급되기 전에 저장소 (예를 들어, 보유 탱크)에 저장될 수 있거나 또는 액체 배양 배지는 세포 (예를 들어, 재조합 치료 단백질을 배양 배지에 분비하는 포유류 세포)의 배양물을 함유하는 생물반응기로부터 제1 MCCS에 능동 펌핑될 수 있다.
액체 배양 배지는 약 0.2 mL/분 내지 약 25 mL/분 (예를 들어, 약 0.2 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.2 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 10 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 14 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 25.0 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 15.0 mL/분)의 유량으로 제1 MCCS에 공급 (로딩)될 수 있다. 재조합 치료 단백질을 함유하는 액체 배양 배지는 본원에 기재되었거나 관련 기술분야에서 공지된 임의의 예시적 공급원으로부터 유래될 수 있다.
일부 예는 액체 배양 배지가 제1 MCCS에 공급되기 전에 액체 배양 배지를 여과하는 임의적 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 액체 배양 배지 또는 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체를 여과하는 임의의 예시적 수단, 또는 관련 기술분야에서 공지된 임의의 여과 수단이 재조합 치료 단백질을 함유하는 액체 배양 배지가 제1 MCCS에 공급되기 전에 이 액체 배양 배지를 여과하는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 방법에서, 액체 배양 배지로부터 재조합 치료 단백질의 포획은 제1 MCCS를 사용하여 수행된다. 관련 기술분야에서 이해될 수 있는 바와 같이, 재조합 치료 단백질의 포획을 달성하기 위해, 제1 MCCS의 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 1개 이상의 크로마토그래피 막은 포획 메카니즘 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 예시적 포획 메카니즘)을 이용하는 수지를 함유해야 하거나, 또는 양이온 교환, 음이온 교환, 또는 분자체 크로마토그래피를 수행할 수 있는 수지를 함유한다. 예를 들어, 재조합 치료 단백질이 항체 또는 항체 단편이라면, 포획 시스템은 단백질 A-결합 포획 메카니즘 또는 항원-결합 포획 메카니즘일 수 있다 (여기서, 포획 항원은 재조합 치료 항체 또는 항체 단편에 의해 특이적이로 인식됨). 재조합 치료 단백질이 효소라면, 포획 메카니즘은 재조합 치료 효소를 포획하는 효소, 재조합 치료 효소를 포획하는 효소의 기질, 재조합 치료 효소를 포획하는 효소의 보조인자와 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 또는 재조합 치료 효소가 태그를 함유한다면, 재조합 치료 효소에 존재하는 태그와 특이적으로 결합하는 단백질, 금속 킬레이트, 또는 항체 (또는 항체 단편)를 사용할 수 있다. 재조합 치료 단백질을 포획하는데 사용가능한 비제한적 수지는 본원에 기재되어 있으며, 재조합 치료 단백질을 포획하는데 사용가능한 추가 수지는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 단백질 A-결합 포획 메카니즘을 이용하는 수지의 하나의 비제한적 예는 맵셀렉트 슈어(MabSelect SuRe) 수지 (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)이다.
재조합 치료 단백질을 포획하는데 사용가능한 제1 MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 또는 크로마토그래피 막(들)의 예시적 비제한적 크기 및 형상은 본원에 기재되어 있다. 제1 MCCS에 공급되는 (로딩되는) 액체 배양 배지는, 예를 들어 약 0.05 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 재조합 치료 단백질 (예를 들어, 약 0.1 mg/mL 내지 약 90 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 80 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 70 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 60 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 0.5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 또는 약 0.5 mg/mL 내지 약 10 mg/mL의 재조합 치료 단백질)을 함유할 수 있다. 재조합 치료 단백질이 포획 단위 조작을 수행하는데 사용되는 수지와 결합하기 위해 필요한 평균 시간은 예를 들어, 약 5초 내지 약 10분 (예를 들어, 약 10초 내지 약 8분, 약 10초 내지 약 7분, 약 10초 내지 약 6분, 약 10초 내지 약 5분, 약 30초 내지 약 5분, 약 1분 내지 약 5분, 약 10초 내지 약 4분, 약 30초 내지 약 4분, 또는 약 1분 내지 약 4분)일 수 있다.
관련 기술분야에서 이해될 수 있는 바와 같이, 제1 MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 또는 크로마토그래피 막(들)을 사용하여 재조합 치료 단백질을 포획하기 위해, 제1 MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 또는 크로마토그래피 막(들)을 로딩, 세척, 용리, 및 재생하는 순차적 크로마토그래피 단계가 수행되어야 한다. 본원에 기재된 각각의 순차적 크로마토그래피 단계에 대하여 할당된 임의의 예시적 유량, 완충액 부피, 및/또는 시간은 이러한 상이한 순차적 크로마토그래피 단계 중 하나 이상 (예를 들어, 재조합 치료 단백질을 포확하기 위해 사용되는 제1 MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 또는 크로마토그래피 막(들)을 로딩, 세척, 용리, 및 재생하는 순차적 크로마토그래피 단계 중 하나 이상)에서 사용될 수 있다. 제1 MCCS (예를 들어, 제1 PCC 시스템)의 포획 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들)을 위해 사용가능한 각각의 순차적 크로마토그래피 단계에 대하여 할당된 비제한적 유량, 완충액 부피, 및/또는 시간이 하기에 제공된다. 또한, 제1 MCCS에 사용가능한 예시적 용리 완충액이 하기에 기재된다.
포획 단위 조작을 수행할 수 있는 수지 (예를 들어, 본원에 기재된 포획을 위해 사용가능한 임의의 예시적 수지)를 함유하는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 및/또는 크로마토그래피 막을 함유하는 제1 MCCS에 상기에 기재된 임의의 로딩 유량 (공급량)을 사용하여 재조합 치료 단백질을 함유하는 액체 배양 배지가 로딩될 수 있다. 일부 예에서, 포획 단위 조작을 수행할 수 있는 수지를 함유하는 단일 크로마토그래피 칼럼 또는 단일 크로마토그래피 막은 예를 들어, 약 10분 내지 약 90분 (예를 들어, 약 15분 내지 약 90분, 약 20분 내지 80분, 약 30분 내지 80분, 약 40분 내지 약 80분, 약 50분 내지 약 80분, 및 약 60분 내지 80분) 이내에 로딩된다. 제1 MCCS가 직렬로 포획 단위 조작을 수행할 수 있는 수지를 함유하는 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼을 포함하는 일부 예에서, 직렬 크로마토그래피 칼럼 중 2개를 로딩하는데 필요한 시간은 예를 들어, 약 50분 내지 약 180분 (예를 들어, 약 60분 내지 약 180분, 약 70분 내지 약 180분, 약 80분 내지 약 180분, 약 90분 내지 약 180분, 약 100분 내지 약 180분, 약 110분 내지 150분, 및 약 125분 내지 약 145분)이다.
재조합 치료 단백질을 포획 단위 조작을 수행할 수 있는 수지를 함유하는 제1 MCCS의 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막에 로딩한 후에, 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막은 1종 이상의 세척 완충액으로 세척된다. 관련 기술분야에서 이해될 수 있는 바와 같이, 1종 이상 (예를 들어, 2, 3, 또는 4종)의 세척 완충액은 재조합 치료 단백질의 수지와의 상호작용을 방해하지 않으면서, 재조합 치료 단백질이 아닌 모든 단백질을 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막으로부터 용리하기 위한 것이다.
세척 완충액은 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 약 0.2 mL/분 내지 약 25 mL/분 (예를 들어, 약 0.2 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.2 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 10 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 14 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 25.0 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 15.0 mL/분)의 유량으로 통과할 수 있다. 사용되는 세척 완충액의 부피 (예를 들어, 1종 초과의 세척 완충액이 사용되는 경우에는, 사용되는 세척 완충액을 합친 총 부피)는 예를 들어, 약 1X 칼럼 부피 (CV) 내지 약 15X CV (예를 들어, 약 1X CV 내지 약 14X CV, 약 1X CV 내지 약 13X CV, 약 1X CV 내지 약 12X CV, 약 1X CV 내지 약 11X CV, 약 2X CV 내지 약 11X CV, 약 3X CV 내지 약 11X CV, 약 4X CV 내지 약 11X CV, 약 5X CV 내지 약 11X CV, 또는 약 5X CV 내지 약 10X CV)일 수 있다. 총 세척 시간은 예를 들어, 약 2분 내지 약 3시간 (예를 들어, 약 2분 내지 약 2.5시간, 약 2분 내지 약 2.0시간, 약 5분 내지 약 1.5시간, 약 10분 내지 약 1.5시간, 약 10분 내지 약 1.25시간, 약 20분 내지 약 1.25시간, 또는 약 30분 내지 약 1시간)일 수 있다.
포획 단위 조작을 수행할 수 있는 수지를 함유하는 제1 MCCS의 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 세척한 후에, 재조합 치료 단백질은 포획 단위 조작을 수행할 수 있는 수지를 함유하는 제1 MCCS의 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 통해 용리 완충액을 통과시킴으로써 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막으로부터 용리된다. 용리 완충액은 약 0.2 mL/분 내지 약 25 mL/분 (예를 들어, 약 0.2 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.2 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 10 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 6.0 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 5.0 mg/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 14 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 25.0 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 15.0 mL/분)의 유량으로 포획 단위 조작을 수행할 수 있는 수지를 함유하는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 통과할 수 있다. 정제 단위 조작을 수행할 수 있는 수지를 함유하는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막 각각으로부터 재조합 치료 단백질을 용리하는데 사용되는 용리 완충액의 부피는 예를 들어, 약 1X 칼럼 부피 (CV) 내지 약 15X CV (예를 들어, 약 1X CV 내지 약 14X CV, 약 1X CV 내지 약 13X CV, 약 1X CV 내지 약 12X CV, 약 1X CV 내지 약 11X CV, 약 2X CV 내지 약 11X CV, 약 3X CV 내지 약 11X CV, 약 4X CV 내지 약 11X CV, 약 5X CV 내지 약 11X CV, 또는 약 5X CV 내지 약 10X CV)일 수 있다. 총 용리 시간은 예를 들어, 약 2분 내지 약 3시간 (예를 들어, 약 2분 내지 약 2.5시간, 약 2분 내지 약 2.0시간, 약 2분 내지 약 1.5시간, 약 2분 내지 약 1.5시간, 약 2분 내지 약 1.25시간, 약 2분 내지 약 1.25시간, 약 2분 내지 약 1시간, 약 2분 내지 약 40분, 약 10분 내지 약 40분, 약 20분 내지 약 40분)일 수 있다. 이러한 방벙에서 사용가능한 용리 완충액의 비제한적 예는 포획 메카니즘 및/또는 치료 단백질에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 용리 완충액은 상이한 농도의 염 (예를 들어, 증가한 염 농도), 상이한 pH (예를 들어, 증가하였거나 감소한 염 농도), 또는 포획 단위 조작을 수행할 수 있는 수지와의 결합에 대하여 재조합 치료 단백질과 경쟁할 분자를 함유할 수 있다. 본원에 기재된 각각의 예시적 포획 메카니즘을 위한 이러한 용리 완충액의 예는 본원에 기재되어 있으며 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
포획 단위 조작을 수행할 수 있는 수지를 함유하는 제1 MCCS의 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막으로부터 재조합 치료 단백질을 용리한 후에, 또한 후속 부피의 액체 배양 배지가 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막에 로딩될 수 있기 전에, 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막은 재생 완충액을 사용하여 평형화되어야 한다. 재생 완충액은, 예를 들어 약 0.2 mL/분 내지 약 25 mL/분 (예를 들어, 약 0.2 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.2 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 10 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 6.0 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 5.0 mg/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 14 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 25.0 mL/분, 약 5.0 mL/분 내지 약 15.0 mL/분, 또는 약 1.0 mL/분 내지 약 15.0 mL/분)의 유량으로 포획 단위 조작을 수행할 수 있는 수지를 함유하는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 통과할 수 있다. 포획 단위 조작을 수행할 수 있는 수지를 함유하는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 평형화하는데 사용되는 재생 완충액의 부피는 예를 들어, 약 1X 칼럼 부피 (CV) 내지 약 15X CV (예를 들어, 약 1X CV 내지 약 14X CV, 약 1X CV 내지 약 13X CV, 약 1X CV 내지 약 12X CV, 약 1X CV 내지 약 11X CV, 약 2X CV 내지 약 11X CV, 약 3X CV 내지 약 11X CV, 약 2X CV 내지 약 5X CV, 약 4X CV 내지 약 11X CV, 약 5X CV 내지 약 11X CV, 또는 약 5X CV 내지 약 10X CV)일 수 있다.
본원에 기재된 일부 방법에서, 제1 MCCS는 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체를 낮은 pH에서 (예를 들어, 4.6 미만, 4.4 미만, 4.2 미만, 4.0 미만, 3.8 미만, 3.6 미만, 3.4 미만, 3.2 미만, 또는 3.0 미만의 pH), 예를 들어 약 1분 내지 1.5시간 (예를 들어, 약 1시간) 동안 보유하고, 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체에 존재하는 바이러스를 불활성화하는 저장소를 포함한다. 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 저장소의 예는 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체가 제2 MCCS에 공급되기 전에, 예를 들어 약 1분 내지 1.5시간 동안 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체를 보유할 수 있는 교반 플라스크 (예를 들어, 500 mL들이 교반 플라스크, 예를 들어 프로그램된 교반 플레이트를 갖는 500 mL들이 교반 플라스크)이다. 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행하는데 사용되는 저장소는 프로그램된 교반 플레이트 (예를 들어, 저장소 내의 유체를, 예를 들어 4시간마다 혼합 (주기적으로 혼합)하도록 프로그램된 교반 플레이트)를 갖는 500 mL들이 교반 플라스크일 수 있다. 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 저장소의 또 다른 예는 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체가 제2 MCCS에 공급되기 전에, 예를 들어 약 1분 내지 1.5시간 동안 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체를 보유할 수 있는 플라스틱 백 (예를 들어, 500 mL들이 플라스틱 백)이다. 일부 예에서, 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체는 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행하는데 사용되는 저장소에 공급될 때 이미 낮은 pH (예를 들어, 4.6 미만, 4.4 미만, 4.2 미만, 4.0 미만, 3.8 미만, 3.6 미만, 3.4 미만, 3.2 미만, 또는 3.0 미만의 pH)를 가질 수 있다. 통상의 기술자가 이해할 수 있는 바와 같이, 바이러스를 불활성화는 단위 조작을 수행하기 위해 다양한 다른 수단이 사용될 수 있다. 예를 들어, 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체의 UV 조사가 또한 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행하는데 사용될 수 있다. 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체에 존재하는 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 저장소의 비제한적 예는 본원에 기재되어 있다.
제1 MCCS는 4개의 크로마토그래피 칼럼을 함유하는 PCCS를 포함할 수 있고, 여기서 4개의 크로마토그래피 칼럼 중 3개 이상이 액체 배양 배지로부터 재조합 치료 단백질을 포획하는 단위 조작을 수행한다 (예를 들어, 포획 단위 조작을 수행할 수 있는 수지를 함유하는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 것들)을 포함하는 제1 MCCS를 사용함). 이러한 예에서, PCC의 제4 칼럼은 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체 중의 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행할 수 있다 (예를 들어, 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체의 바이러스 불활성화를 달성하는데 사용가능한 본원에 기재된 임의의 예시적 칼럼).
재조합 치료 단백질을 함유하는 유체는 제1 MCCS (예를 들어, 제1 PCC 시스템)로부터 연속적으로 용리되고, 제2 MCCS에 연속적으로 공급된다. 제1 MCCS (예를 들어, 제1 PCC 시스템)의 용리액에서 회수되는 재조합 치료 단백질의 백분율은 예를 들어, 70% 이상, 72% 이상, 74% 이상, 76% 이상, 78% 이상, 80% 이상, 82% 이상, 84% 이상, 86% 이상, 88% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 96% 이상, 또는 98% 이상일 수 있다. 제1 MCCS (예를 들어, 제1 PCC 시스템)의 용리액은 관련 기술분야에 공지된 다양한 수단 (예를 들어, 배관)을 사용하여 제2 MCCS (예를 들어, 제2 PCC 시스템)에 공급될 수 있다. 제1 MCCS (예를 들어, 제1 PCC 시스템)의 용리액은, 예를 들어 약 0.2 mL/분 내지 약 25 mL/분 (예를 들어, 약 0.2 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.2 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 10 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 6.0 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 5.0 mg/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 14 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 25.0 mL/분, 약 5.0 mL/분 내지 약 15.0 mL/분, 약 15 mL/분 내지 약 25 mL/분, 또는 약 1.0 mL/분 내지 약 15.0 mL/분)의 유량으로 제2 MCCS (예를 들어, 제2 PCC 시스템)에 공급될 수 있다.
본원에 기재된 일부 방법은 제1 MCCS (예를 들어, 제1 PCC 시스템)의 용리액이 제2 MCCS (예를 들어, 제2 PCC 시스템)에 공급되기 전에 이 용리액의 이온 농도 및/또는 pH를 조정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 제1 MCCS (예를 들어, 제1 PCC 시스템)의 용리액의 이온 농도 및/또는 pH는 완충액을 용리액에 첨가함으로써 (예를 들어, 인라인 완충액 조정 저장소의 사용을 통해) 조정될 수 있다 (제2 MCCS에 공급되기 전에). 완충액은, 예를 들어 약 0.1 mL/분 내지 약 15 mL/분 (예를 들어, 약 0.1 mL/분 내지 약 12.5 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 약 10.0 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 약 8.0 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 약 6 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 4 mL/분, 또는 약 0.5 mL/분 내지 약 5 mL/분)의 유량으로 제1 MCCS의 용리액에 첨가될 수 있다.
본원에 기재된 방법은 제1 MCCS의 용리액이 제2 MCCS에 공급되기 전에, 제1 MCCS의 용리액을 보유하거나 또는 저장하는 (또한 임의로 냉장시키는) 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 보유 또는 저장 단계는 본원에 기재된 임의의 저장소 (예를 들어, 백업 탱크(back-up tank))를 사용하여 수행될 수 있다.
본원에 기재된 방법은 또한 제1 MCCS의 용리액을 이 용리액이 제2 MCCS에 공급되기 전에 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 여과를 위한 임의의 예시적 필터 또는 방법이 제1 MCCS의 용리액을 이 용리액이 제2 MCCS에 공급되기 전에 여과하는데 사용될 수 있다.
재조합 치료 단백질의 폴리싱 및 정제
본원에 기재된 방법은 제2 MCCS를 사용하여 재조합 치료 단백질을 정제하고 폴리싱하는 단계를 포함하고, 여기서 MCC2의 용리액은 치료 단백질 약물 물질이다. 제2 MCCS는 재조합 치료 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 또는 4개)의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막, 및 재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 또는 4개)의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 포함할 수 있다.
재조합 치료 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막은 포획 메카니즘 (예를 들어, 본원에 기재되었거나 관련 기술분야에서 공지된 임의의 포획 메카니즘)을 이용하는 수지, 또는 음이온 교환, 양이온 교환, 또는 분자체 크로마토그래피를 수행하는데 사용가능한 수지를 함유할 수 있다. 재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막은 음이온 교환, 양이온 교환, 또는 분자체 크로마토그래피를 수행하는데 사용가능한 수지 (예를 들어, 본원에 기재되었거나 관련 기술분야에서 공지된 음이온 교환, 양이온 교환, 또는 분자체 크로마토그래피를 수행하기 위한 임의의 예시적 수지)를 함유할 수 있다.
재조합 치료 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막의 크기, 형상, 및 부피 및/또는 재조합 막을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 막의 크기 및 형상은 본원에 기재된 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막의 예시적 크기, 형상, 미 부피의 임의의 조합일 수 있다. 통상의 기술자가 이해할 수 있는 바와 같이, 재조합 치료 단백질을 정제하거나 또는 폴리싱하는 단계는 예를 들어, 재조합 치료 단백질을 정제하거나 또는 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는데 사용되는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 로딩, 세척, 용리, 및 평형화하는 단계를 포함할 수 있다. 전형적으로, 정제 단위 조작을 수행하는데 사용되는 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막으로부터의 용리 완충액은 재조합 치료 단백질을 함유한다. 전형적으로, 폴리싱 단위 조작을 수행하는데 사용되는 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막으로부터의 로딩 및/또는 세척 완충액은 재조합 치료 단백질을 함유한다.
예를 들어, 재조합 치료 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막의 크기는, 예를 들어 약 2.0 mL 내지 약 200 mL (예를 들어, 약 2.0 mL 내지 약 180 mL, 약 2.0 mL 내지 약 160 mL, 약 2.0 mL 내지 약 140 mL, 약 2.0 mL 내지 약 120 mL, 약 2.0 mL 내지 약 100 mL, 약 2.0 mL 내지 약 80 mL, 약 2.0 mL 내지 약 60 mL, 약 2.0 mL 내지 약 40 mL, 약 5.0 mL 내지 약 40 mL, 약 2.0 mL 내지 약 30 mL, 약 5.0 mL 내지 약 30 mL, 또는 약 2.0 mL 내지 약 25 mL)의 부피를 가질 수 있다. 재조합 치료 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 1개 이상의 크로마토그래피 막에 로딩되는, 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체의 유량은 예를 들어, 약 0.1 mL/분 내지 약 25 mL/분 (예를 들어, 약 0.1 mL/분 내지 약 12.5 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 약 10.0 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 약 8.0 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 약 6 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 4 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 약 3 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 약 2 mL/분, 또는 약 0.2 mL/분 내지 약 4 mL/분)일 수 있다. 재조합 치료 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막에 로딩되는 유체 중 재조합 치료 단백질의 농도는 예를 들어, 약 0.05 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 재조합 단백질 (예를 들어, 약 0.1 mg/mL 내지 약 90 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 80 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 70 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 60 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 0.5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 또는 약 0.5 mg/mL 내지 약 10 mg/mL의 재조합 치료 단백질)일 수 있다. 정제 단위 조작을 수행하는데 사용되는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막의 수지는 음이온 교환 또는 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는데 사용가능한 수지일 수 있다. 정제 단위 조작을 수행하는데 사용되는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막의 수지는 양이온 교환 수지 (예를 들어, 캅토-S 수지, 지이 헬쓰케어 라이프 사이언시즈(GE Healthcare Life Sciences), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)일 수 있다.
재조합 치료 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 제2 MCCS의 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막에 재조합 치료 단백질을 로딩한 후에, 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막은 1종 이상의 세척 완충액으로 세척된다. 관련 기술분야에서 이해될 수 있는 바와 같이, 1종 이상 (예를 들어, 2, 3, 또는 4종)의 세척 완충액은 재조합 치료 단백질의 수지와의 상호작용을 방해하지 않거나 또는 재조합 치료 단백질을 용리하지 않으면서, 재조합 치료 단백질이 아닌 모든 단백질을 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막으로부터 용리하기 위한 것이다.
세척 완충액은 약 0.2 mL/분 내지 약 25 mL/분 (예를 들어, 약 0.2 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.2 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 10 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 14 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 25.0 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 15.0 mL/분)의 유량으로 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 통과할 수 있다. 사용되는 세척 완충액의 부피 (예를 들어, 1종 초과의 세척 완충액이 사용되는 경우에는, 사용되는 세척 완충액을 합친 총 부피)는 예를 들어, 약 1X 칼럼 부피 (CV) 내지 약 15X CV (예를 들어, 약 1X CV 내지 약 14X CV, 약 1X CV 내지 약 13X CV, 약 1X CV 내지 약 12X CV, 약 1X CV 내지 약 11X CV, 약 2X CV 내지 약 11X CV, 약 3X CV 내지 약 11X CV, 약 4X CV 내지 약 11X CV, 약 2.5X CV 내지 약 5.0X CV, 약 5X CV 내지 약 11X CV, 또는 약 5X CV 내지 약 10X CV)일 수 있다. 총 세척 시간은 예를 들어, 약 2분 내지 약 3시간 (예를 들어, 약 2분 내지 약 2.5시간, 약 2분 내지 약 2.0시간, 약 5분 내지 약 1.5시간, 약 10분 내지 약 1.5시간, 약 10분 내지 약 1.25시간, 약 20분 내지 약 1.25시간, 약 30분 내지 약 1시간, 약 2분 내지 10분, 약 2분 내지 15분, 또는 약 2분 내지 30분)일 수 있다.
재조합 치료 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 제2 MCCS의 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 세척한 후에, 재조합 치료 단백질은 재조합 치료 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 제2 MCCS의 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 통해 용리 완충액을 통과시킴으로써 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막으로부터 용리된다. 용리 완충액은 약 0.2 mL/분 내지 약 25 mL/분 (예를 들어, 약 0.2 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.2 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 10 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 6.0 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 5.0 mg/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 14 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 25.0 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 15.0 mL/분)의 유량으로 재조합 치료 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 통과할 수 있다. 재조합 치료 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막 각각으로부터 재조합 치료 단백질을 용리하는데 사용되는 용리 완충액의 부피는 예를 들어, 약 1X 칼럼 부피 (CV) 내지 약 25X CV (예를 들어, 약 1X CV 내지 약 20X CV, 약 15X CV 내지 약 25X CV, 약 1X CV 내지 약 14X CV, 약 1X CV 내지 약 13X CV, 약 1X CV 내지 약 12X CV, 약 1X CV 내지 약 11X CV, 약 2X CV 내지 약 11X CV, 약 3X CV 내지 약 11X CV, 약 4X CV 내지 약 11X CV, 약 5X CV 내지 약 11X CV, 또는 약 5X CV 내지 약 10X CV)일 수 있다. 총 용리 시간은 예를 들어, 약 2분 내지 약 3시간 (예를 들어, 약 2분 내지 약 2.5시간, 약 2분 내지 약 2.0시간, 약 2분 내지 약 1.5시간, 약 2분 내지 약 1.5시간, 약 2분 내지 약 1.25시간, 약 2분 내지 약 1.25시간, 약 2분 내지 약 1시간, 약 2분 내지 약 40분, 약 10분 내지 약 40분, 약 20분 내지 약 40분, 또는 약 30분 내지 1.0시간)일 수 있다. 이러한 방법에서 사용가능한 용리 완충액의 비제한적 예는 수지 및/또는 치료 단백질에 따라 다라질 것이다. 예를 들어, 용리 완충액은 상이한 농도의 염 (예를 들어, 증가한 염 농도), 상이한 pH (예를 들어, 증가하였거나 감소한 염 농도), 또는 수지와의 결합에 대하여 재조합 치료 단백질과 경쟁할 분자를 함유할 수 있다. 본원에 기재된 각각의 예시적 포획 메카니즘을 위한 이러한 용리 완충액의 예는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
재조합 치료 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 제2 MCCS의 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막으로부터 재조합 치료 단백질을 용리한 후에, 또한 재조합 치료 단백질을 함유하는 후속 부피의 유체가 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막에 로딩될 수 있기 전에, 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막은 재생 완충액을 사용하여 평형화되어야 한다. 재생 완충액은, 예를 들어 약 0.2 mL/분 내지 약 25 mL/분 (예를 들어, 약 0.2 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.2 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 10 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 6.0 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 5.0 mg/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 14 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 25.0 mL/분, 약 5.0 mL/분 내지 약 15.0 mL/분, 또는 약 1.0 mL/분 내지 약 15.0 mL/분)의 유량으로 재조합 치료 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 통과할 수 있다. 재조합 치료 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 수지를 함유하는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 평형화하는데 사용되는 재생 완충액의 부피는 예를 들어, 약 1X 칼럼 부피 (CV) 내지 약 15X CV (예를 들어, 약 1X CV 내지 약 14X CV, 약 1X CV 내지 약 13X CV, 약 1X CV 내지 약 12X CV, 약 1X CV 내지 약 11X CV, 약 2X CV 내지 약 11X CV, 약 3X CV 내지 약 11X CV, 약 2X CV 내지 약 5X CV, 약 2.5X CV 내지 약 7.5X CV, 약 4X CV 내지 약 11X CV, 약 5X CV 내지 약 11X CV, 또는 약 5X CV 내지 약 10X CV)일 수 있다. 재조합 치료 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막의 용리액 중 재조합 치료 단백질의 농도는 예를 들어, 약 0.05 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 재조합 치료 단백질 (예를 들어, 약 0.1 mg/mL 내지 약 90 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 80 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 70 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 60 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 2.5 mg/mL 내지 약 7.5 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 0.5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 또는 약 0.5 mg/mL 내지 약 10 mg/mL의 재조합 치료 단백질)일 수 있다.
재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막은 양이온 교환, 음이온 교환, 또는 분자체 크로마토그래피를 수행하는데 사용가능한 수지를 함유할 수 있다. 관련 기술분야에서 이해될 수 있는 바와 같이, 제2 MCCS에서 재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 사용하여 재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 것은 예를 들어, 재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막의 로딩, 체이싱(chasing), 및 재생 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 로딩, 체이싱, 및 재생 단계가 폴리싱을 수행하기 위해 사용되는 경우에, 재조합 치료 단백질은 재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는데 사용되는 제2 MCCS의 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막에서 수지와 결합하지 않으며, 재조합 치료 단백질이 로딩 및 체이싱 단계에서 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막으로부터 용리되고, 재조합 치료 단백질을 함유하는 추가 유체가 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막에 로딩될 수 있기 전에 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막으로부터 임의의 불순물을 제거하기 위해 재생 단계가 사용된다. 로딩, 체이싱, 및 재생 단계 각각에서 사용되는 예시적 유량 및 완충액 부피가 하기에 기재된다.
재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막의 크기, 형상, 및 부피, 및/또는 재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 막의 크기 및 형상은 본원에 기재된 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막의 예시적 크기, 형상, 및 부피의 임의의 조합일 수 있다. 예를 들어, 재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막의 크기는, 예를 들어 약 0.5 mL 내지 약 200 mL (예를 들어, 약 0.5 mL 내지 약 180 mL, 약 0.5 mL 내지 약 160 mL, 약 0.5 mL 내지 약 140 mL, 약 0.5 mL 내지 약 120 mL, 약 0.5 mL 내지 약 100 mL, 약 0.5 mL 내지 약 80 mL, 약 0.5 mL 내지 약 60 mL, 약 0.5 mL 내지 약 40 mL, 약 5.0 mL 내지 약 40 mL, 약 0.5 mL 내지 약 30 mL, 약 5.0 mL 내지 약 30 mL, 약 0.5 mL 내지 약 25 mL, 약 0.2 mL 내지 약 10 mL, 또는 약 0.2 mL 내지 약 5 mL)의 부피를 가질 수 있다. 재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막에 로딩되는 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체의 유량은 예를 들어, 약 0.1 mL/분 내지 약 25 mL/분 (예를 들어, 약 0.1 mL/분 내지 약 12.5 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 약 10.0 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 약 8.0 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 약 6 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 4 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 약 3 mL/분, 약 2 mL/분 내지 약 6 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 약 2 mL/분, 또는 약 0.2 mL/분 내지 약 4 mL/분)일 수 있다. 재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막에 로딩되는 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체의 총 부피는 예를 들어, 약 1.0 mL 내지 약 250 mL (예를 들어, 약 1.0 mL 내지 약 225 mL, 약 1.0 mL 내지 약 200 mL, 약 1.0 mL 내지 약 175 mL, 약 1.0 mL 내지 약 150 mL, 약 100 mL 내지 약 125 mL, 약 100 mL 내지 약 150 mL, 약 1.0 mL 내지 약 150 mL, 약 1.0 mL 내지 약 125 mL, 약 1.0 mL 내지 약 100 mL, 약 1.0 mL 내지 약 75 mL, 약 1.0 mL 내지 약 50 mL, 또는 약 1.0 mL 내지 약 25 mL)일 수 있다. 폴리싱을 수행하는데 사용되는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막의 수지는 음이온 교환 또는 양이온 교환 수지일 수 있다. 폴리싱 단위 조작을 수행하는데 사용되는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막의 수지는 양이온 교환 수지 (예를 들어, 사토바인드® Q 수지, 사토리우스(Sartorius), 독일 괴팅겐 소재)일 수 있다.
재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 제2 MCCS의 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막의 로딩 단계 후에, 체이싱 단계가 수행된다 (예를 들어, 체이싱 완충액은 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 통과하여, 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막에 실질적으로 결합되지 않은 재조합 치료 단백질을 수집함). 이러한 예에서, 체이싱 완충액은 약 0.2 mL/분 내지 약 50 mL/분 (예를 들어, 약 1 mL/분 내지 약 40 mL/분, 약 1 mL/분 내지 약 30 mL/분, 약 5 mL/분 내지 약 45 mL/분, 약 10 mL/분 내지 약 40 mL/분, 약 0.2 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.2 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 10 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 14 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 25.0 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 15.0 mL/분)의 유량으로 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 통과할 수 있다. 사용되는 체이싱 완충액의 부피는 예를 들어, 약 1X 칼럼 부피 (CV) 내지 약 100X CV (예를 들어, 약 1X CV 내지 약 90X CV, 약 1X CV 내지 약 80X CV, 약 1X CV 내지 약 70X CV, 약 1X CV 내지 약 60X CV, 약 1X 내지 약 50X CV, 약 1X CV 내지 약 40X CV, 약 1X CV 내지 약 30X CV, 약 1X CV 내지 약 20X CV, 약 1X CV 내지 약 15X CV, 약 5X CV 내지 약 20X CV, 약 5X CV 내지 약 30X CV, 약 1X CV 내지 약 14X CV, 약 1X CV 내지 약 13X CV, 약 1X CV 내지 약 12X CV, 약 1X CV 내지 약 11X CV, 약 2X CV 내지 약 11X CV, 약 3X CV 내지 약 11X CV, 약 4X CV 내지 약 11X CV, 약 2.5X CV 내지 약 5.0X CV, 약 5X CV 내지 약 11X CV, 또는 약 5X CV 내지 약 10X CV)일 수 있다. 총 체이싱 시간은 예를 들어, 약 1분 내지 약 3시간 (예를 들어, 약 1분 내지 약 2.5시간, 약 1분 내지 약 2.0시간, 약 1분 내지 약 1.5시간, 약 2분 내지 약 1.5시간, 약 1분 내지 약 1.25시간, 약 2분 내지 약 1.25시간, 약 1분 내지 약 5분, 약 1분 내지 약 10분, 약 2분 내지 약 4분, 약 30분 내지 약 1시간, 약 2분 내지 10분, 약 2분 내지 15분, 또는 약 2분 내지 30분)일 수 있다. 로딩 단계 및 체이싱 단계에서 칼럼을 통해 나오는 용리액에 존재하는 치료 재조합 단백질의 합친 농도는 예를 들어, 약 0.1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 재조합 단백질 (예를 들어, 약 0.1 mg/mL 내지 약 90 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 80 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 70 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 60 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 2.5 mg/mL 내지 약 7.5 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 0.5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 또는 약 1 mg/mL 내지 약 5 mg/mL의 재조합 치료 단백질)일 수 있다.
체이싱 단계 후에, 또한 재조합 치료 단백질을 함유하는 후속 부피의 유체가 폴리싱 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막에 로딩될 수 있기 전에, 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막은 재생 완충액을 사용하여 재생되어야 한다. 재생 완충액은, 예를 들어 약 0.2 mL/분 내지 약 50 mL/분 (예를 들어, 약 1 mL/분 내지 약 40 mL/분, 약 1 mL/분 내지 약 30 mL/분, 약 5 mL/분 내지 약 45 mL/분, 약 10 mL/분 내지 약 40 mL/분, 약 0.2 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 20 mL/분, 약 0.2 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 15 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 10 mL/분, 약 0.5 mL/분 내지 약 14 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 25.0 mL/분, 약 1.0 mL/분 내지 약 15.0 mL/분)의 유량으로 재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 통과할 수 있다. 폴리싱 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막을 재생시키는데 사용되는 재생 완충액의 부피는 예를 들어, 약 1X 칼럼 부피 (CV) 내지 약 500X CV (예를 들어, 약 1X CV 내지 약 450X CV, 약 1X CV 내지 약 400X CV, 약 1X CV 내지 약 350X CV, 약 1X CV 내지 약 300X CV, 약 1X CV 내지 약 250X CV, 약 1X CV 내지 약 200X CV, 약 1X CV 내지 약 150X CV, 약 1X CV 내지 약 100X CV, 약 1X CV 내지 약 90X CV, 약 1X CV 내지 약 80X CV, 약 1X CV 내지 약 70X CV, 약 1X CV 내지 약 60X CV, 약 1X 내지 약 50X CV, 약 1X CV 내지 약 40X CV, 약 1X CV 내지 약 30X CV, 약 1X CV 내지 약 20X CV, 약 1X CV 내지 약 15X CV, 약 5X CV 내지 약 20X CV, 약 5X CV 내지 약 30X CV, 약 1X CV 내지 약 14X CV, 약 1X CV 내지 약 13X CV, 약 1X CV 내지 약 12X CV, 약 1X CV 내지 약 11X CV, 약 2X CV 내지 약 11X CV, 약 3X CV 내지 약 11X CV, 약 4X CV 내지 약 11X CV, 약 2.5X CV 내지 약 5.0X CV, 약 5X CV 내지 약 11X CV, 또는 약 5X CV 내지 약 10X CV)일 수 있다.
다른 예에서, 폴리싱 단위 조작을 수행하는데 사용되는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막은 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체에 존재하는 불순물과 선택적으로 결합하거나 또는 그를 유지하는 수지를 함유하고, 1개 이상의 칼럼(들) 및/또는 막(들)의 수지의 결합능에 도달하였거나 또는 실질적으로 거의 도달할 때, 1개 이상의 칼럼(들) 및/또는 막(들)을 재생시키는 대신에, 1개 이상의 칼럼(들) 및/또는 막(들)이 대체된다 (예를 들어, 실질적으로 유사한 칼럼(들) 및/또는 막(들)으로 대체됨).
이러한 방법의 일부 예에서, 제2 MCCS는 3개의 크로마토그래피 칼럼 및 1개의 크로마토그래피 막을 함유하는 PCCS를 포함하고, 여기서 예를 들어, PCCS의 3개의 크로마토그래피 칼럼은 재조합 치료 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행하고 (예를 들어, 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼(들)을 사용함), PCCS의 크로마토그래피 막은 재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행한다. 이러한 예에서, 재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 PCCS의 크로마토그래피 막은 재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한, 본원에 기재된 임의의 예시적 크로마토그래피 막일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 칼럼 스위칭 방법이 이러한 예에서 PCCS의 처음 3개의 크로마토그래피 칼럼 및 크로마토그래피 막이 스위칭될 수 있는 시점을 결정하는데 사용될 수 있다.
이러한 예의 일부 실시양태는 용리액이 PCCS의 크로마토그래피 막에 공급되기 전에, PCCS의 3개의 크로마토그래피 칼럼 용리액의 이온 농도 및/또는 pH를 조정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, PCCS의 3개의 크로마토그래피 칼럼 용리액의 이온 농도 및/또는 pH는 완충액을 PCCS의 3개의 크로마토그래피 칼럼의 용리액에 첨가함으로써 (예를 들어, 인라인 완충액 조정 저장소의 사용을 통해) 조정될 수 있다 (이러한 예에서 PCCS의 크로마토그래피 막에 공급되기 전에). 완충액은, 예를 들어 약 0.1 mL/분 내지 약 15 mL/분 (예를 들어, 약 0.1 mL/분 내지 약 12.5 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 약 10.0 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 약 8.0 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 약 6 mL/분, 약 0.1 mL/분 내지 4 mL/분, 또는 약 0.5 mL/분 내지 약 5 mL/분)의 유량으로 용리액에 첨가될 수 있다.
이러한 예는 이러한 예에서 PCCS의 3개의 크로마토그래피 칼럼의 용리액을, 용리액이 크로마토그래피 막 (재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 크로마토그래피 막)에 공급되기 전에 보유하거나 또는 저장하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 보유 또는 저장 단계는 본원에 기재된 임의의 저장소 (예를 들어, 백업 탱크)를 사용하여 수행될 수 있다.
이러한 예는 또한 예시적 PCCS 시스템의 크로마토그래피 막의 용리액 (재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 크로마토그래피 막의 용리액)을 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 여과를 위한 임의의 예시적 필터 또는 방법이 이러한 예시적 PCCS의 크로마토그래피 막의 용리액 (재조합 치료 단백질을 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는데 사용가능한 크로마토그래피 막의 용리액)을 여과하는데 사용될 수 있다.
통상의 기술자가 이해할 수 있는 바와 같이, 치료 단백질 약물 물질은 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여 제2 MCCS로부터 주기적으로 용리될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 방법은, 예를 들어 제1 및 제2 MCCS에 사용되는 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들)에 따라, 예를 들어 약 30초 내지 약 5시간 (예를 들어, 약 1분 내지 약 4시간, 약 1분 내지 약 3시간, 약 1분 내지 약 2시간, 약 1분 내지 약 1.5시간, 약 1분 내지 약 1시간, 약 1분 내지 약 30분)의 기간 동안, 예를 들어 약 1분 내지 약 6시간 (예를 들어, 약 1분 내지 약 5시간, 약 1분 내지 약 4시간, 약 1분 내지 약 3시간, 약 1분 내지 2시간, 약 1분 내지 1시간, 또는 약 1분 내지 30분)의 빈도로 치료 단백질 약물 물질을 용리할 수 있다.
배양 방법
본원에 기재된 일부 방법은 액체 배양 배지를 함유하는 생물반응기 (예를 들어, 관류 또는 유가 배양 생물반응기)에서 재조합 치료 단백질을 분비하는 세포 (예를 들어, 재조합 포유류 세포)를 배양하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 세포 (예를 들어, 포유류 세포)가 실질적으로 존재하지 않는 액체 배양 배지의 일정 부피가 관류 생물반응기로부터 연속적으로 또는 주기적으로 제거되어 제1 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCC1)에 공급된다. 생물반응기는, 예를 들어 약 1 L 내지 약 10,000 L (예를 들어, 약 1 L 내지 약 50 L, 약 50 L 내지 약 500 L, 약 500 L 내지 약 1000 L, 500 L 내지 약 5000 L, 약 500 L 내지 약 10,000 L, 약 5000 L 내지 약 10,000 L, 약 1 L 내지 약 10,000 L, 약 1 L 내지 약 8,000 L, 약 1 L 내지 약 6,000 L, 약 1 L 내지 약 5,000 L, 약 100 L 내지 약 5,000 L, 약 10 L 내지 약 100 L, 약 10 L 내지 약 4,000 L, 약 10 L 내지 약 3,000 L, 약 10 L 내지 약 2,000 L, 또는 약 10 L 내지 약 1,000 L)의 부피를 가질 수 있다. 생물반응기에 존재하는 액체 배양 배지의 양은 예를 들어, 약 0.5 L 내지 약 5,000 L (예를 들어, 약 0.5 L 내지 약 25 L, 약 25 L 내지 약 250 L, 약 250 L 내지 약 500 L, 250 L 내지 약 2500 L, 약 250 L 내지 약 5,000 L, 약 2500 L 내지 약 5,000 L, 약 0.5 L 내지 약 5,000 L, 약 0.5 L 내지 약 4,000 L, 약 0.5 L 내지 약 3,000 L, 약 0.5 L 내지 약 2,500 L, 약 50 L 내지 약 2,500 L, 약 5 L 내지 약 50 L, 약 5 L 내지 약 2,000 L, 약 5 L 내지 약 1,500 L, 약 5 L 내지 약 1,000 L, 또는 약 5 L 내지 약 500 L)일 수 있다. 세포 배양은 예를 들어, 유가 배양 생물반응기 또는 관류 생물반응기를 사용하여 수행될 수 있다. 세포 배양 (예를 들어, 포유류 세포 배양)의 비제한적 예 및 상이한 측면이 하기에 기재되며, 임의로 조합되어 사용될 수 있다.
세포
본원에 기재된 일부 방법에서 배양되는 세포는 박테리아 (예를 들어, 그람 음성 박테리아), 효모 (예를 들어, 사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 피히아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 또는 아륵술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans)), 또는 포유류 세포일 수 있다. 포유류 세포는 현탁되어 성장하는 세포 또는 부착 세포일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법에서 배양가능한 포유류 세포의 비제한적 예는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (예를 들어, CHO DG44 세포 또는 CHO-K1s 세포), Sp2.0, 골수종 세포 (예를 들어, NS/0), B-세포, 히브리도마 세포, T-세포, 인간 배아 신장 (HEK) 세포 (예를 들어, HEK 293E 및 HEK 293F), 아프리카 녹색 원숭이 신장 상피 세포 (베로(Vero) 세포), 및 마딘-다르비(Madin-Darby) 개과 (코커 스패니얼(Cocker Spaniel)) 신장 상피 세포 (MDCK 세포)를 포함한다. 부착 세포가 배양되는 일부 예에서, 배양물은 또한 복수 개의 마이크로캐리어 (예를 들어, 1개 이상의 세공을 함유하는 마이크로캐리어)를 함유할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법에서 배양가능한 추가 포유류 세포는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
포유류 세포는 재조합 치료 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 (예를 들어, 포유류 세포의 게놈에 안정적으로 통합된 핵산)을 함유할 수 있다. 본원에 기재된 방법을 사용하여 생산가능한 재조합 치료 단백질과 같은, 예시적 재조합 치료 단백질을 코딩하는 재조합 핵산의 비제한적 예가 하기에 기재된다. 일부 예에서, 생물반응기 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 생물반응기)에서 배양되는 포유류 세포는 보다 대용량의 배양물로부터 유래된다.
재조합 치료 단백질을 코딩하는 핵산은 분자 생물학 및 분자 유전학에서 공지된 매우 다양한 방법을 사용하여 포유류 세포에 도입될 수 있다. 비제한적 예는 형질감염 (예를 들어, 리포펙션), 형질도입 (예를 들어, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 또는 레트로바이러스 감염), 및 전기천공을 포함한다. 일부 예에서, 재조합 치료 단백질을 코딩하는 핵산은 포유류 세포의 염색체에 안정적으로 통합되지 못하지만 (일시적 형질감염), 다른 예에서는 핵산이 통합된다. 선택적으로 또는 추가적으로, 재조합 치료 단백질을 코딩하는 핵산은 플라스미드 및/또는 포유류 인공 염색체 (예를 들어, 인간 인공 염색체)에 존재할 수 있다. 선택적으로 또는 추가적으로, 핵산은 바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 또는 아데노바이러스 벡터)를 사용하여 세포에 도입될 수 있다. 핵산은 프로모터 서열 (예를 들어, 강력한 프로모터, 예컨대 β-액틴 프로모터 및 CMV 프로모터, 또는 유도성 프로모터)에 작동적으로 연결될 수 있다. 핵산을 함유하는 벡터는, 필요에 따라, 선택 표지 (예를 들어, 포유류 세포에 히그로마이신, 퓨로마이신, 또는 네오마이신 내성을 제공하는 유전자)를 또한 함유할 수 있다.
일부 예에서, 재조합 치료 단백질은 분비 단백질이며, 포유류 세포에 의해 세포외 배지 (예를 들어, 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지)로 유리된다. 예를 들어, 가용성 재조합 치료 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 재조합 치료 단백질의 N- 또는 C-말단에서 분비 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 함유할 수 있고, 이는 포유류 세포에 존재하는 효소에 의해 절단된 다음, 세포외 배지 (예를 들어, 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지)로 유리된다.
배양 배지
액체 배양 배지는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 액체 배양 배지 (예를 들어, 제1 및/또는 제2 조직 배양 배지)는 포유류 혈청 (예를 들어, 소 태아 혈청 및 소 혈청), 및/또는 성장 호르몬 또는 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 및 상피 성장 인자)로 보충될 수 있다. 선택적으로 또는 추가적으로, 액체 배양 배지 (예를 들어, 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지)는 화학적으로 한정된 액체 배양 배지, 동물-유래 성분 무함유 액체 배양 배지, 혈청-무함유 액체 배양 배지, 또는 혈청-함유 액체 배양 배지일 수 있다. 화학적으로 한정된 액체 배양 배지, 동물-유래 성분 무함유 액체 배양 배지, 혈청-무함유 액체 배양 배지, 및 혈청-함유 액체 배양 배지의 비제한적 예는 시판되고 있다.
액체 배양 배지는 전형적으로 에너지원 (예를 들어, 탄수화물, 예컨대 글루코스), 필수 아미노산 (예를 들어, 20종의 아미노산 + 시스테인의 기본 세트), 비타민 및/또는 저농도로 요구되는 다른 유기 화합물, 유리 지방산, 및/또는 미량 원소를 함유한다. 액체 배양 배지 (예를 들어, 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지)는, 필요에 따라, 예를 들어 포유류 호르몬 또는 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 또는 상피 성장 인자), 염 및 완충액 (예를 들어, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트 염), 뉴클레오시드 및 염기 (예를 들어, 아데노신, 티미딘, 및 히포크산틴), 단백질 및 조직 가수분해물, 및/또는 이들 첨가제의 임의의 조합으로 보충될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서 세포 (예를 들어, 포유류 세포)를 배양하는데 사용가능한 매우 다양하게 상이한 액체 배양 배지는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 본 발명의 방법에서 또한 유용할 수 있는 배지 성분은 화학적으로 한정된 (CD) 가수분해물, 예를 들어 CD 펩톤, CD 폴리펩티드 (2개 이상의 아미노산), 및 CD 성장 인자를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 액체 조직 배양 배지 및 배지 성분의 추가 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
통상의 기술자라면 본원에 기재된 제1 액체 배양 배지 및 제2 액체 배양 배지가 동일한 유형의 배지이거나 또는 상이한 배지일 수 있다는 것을 이해할 것이다.
예시적 생물반응기의 추가 특징
본원에 기재된 임의의 생물반응기의 내부 표면은 하나 이상의 코팅물 (예를 들어, 젤라틴, 콜라겐, 폴리-L-오르니틴, 폴리스티렌, 및 라미닌의 하나 이상의 코팅물), 및 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, O2, CO2, 및 N2의 액체 배양 배지로의 분사를 위한 1개 이상의 포트(port), 및 액체 배양 배지를 교반하기 위한 교반 메카니즘을 가질 수 있다. 생물반응기는 세포 배양물을 조절된 가습 분위기 (예를 들어, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 초과의 습도, 또는 100%의 습도)에서 인큐베이션할 수 있다. 생물반응기는 또한 생물반응기로부터 액체 배양 배지의 일정 부피를 제거할 수 있는 기계식 장치, 및 임의로, 생물반응기 밖으로 액체 배양 배지를 전달하는 공정 중에 (예를 들어, ATF 시스템) 액체 배양 배지로부터 세포를 제거하는 기계식 장치 내의 필터가 설치될 수 있다.
온도
포유류 세포를 배양하는 단계는 약 31℃ 내지 약 40℃의 온도에서 수행될 수 있다. 통상의 기술자라면 온도가 배양 단계 중 특정한 시점(들)에, 예를 들어 시간 단위로 또는 하루 단위로 변화할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 온도는 생물반응기에 세포 (예를 들어, 포유류 세포)를 초기 시딩한 후 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 또는 약 20일에 또는 그 이후에 변화하거나 변동될 수 있다 (예를 들어, 증가하거나 감소함). 예를 들어, 온도는 상향 변동될 수 있다 (예를 들어, 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19℃ 이하, 또는 약 20℃ 이하의 변화). 예를 들어, 온도는 하향 변동될 수 있다 (예를 들어, 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19℃ 이하, 또는 약 20℃ 이하의 변화).
CO 2
본원에 기재된 배양 단계는 생물반응기에서 액체 배양 배지를 약 15% 이하의 CO2 (예를 들어, 약 14% 이하의 CO2, 12% 이하의 CO2, 10% 이하의 CO2, 8% 이하의 CO2, 6% 이하의 CO2, 5% 이하의 CO2, 4% 이하의 CO2, 3% 이하의 CO2, 2% 이하의 CO2, 또는 약 1% 이하의 CO2)를 함유하는 분위기에 노출시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
관류 생물반응기
본원에 기재된 배양 단계는 관류 생물반응기를 사용하여 수행될 수 있다. 관류 생물반응기에서 세포 (예를 들어, 포유류 세포)를 배양하는 것은 생물반응기로부터 제1 액체 배양 배지의 제1 부피 (예를 들어, 임의의 농도의 포유류 세포를 함유하는, 예를 들어 세포가 실질적으로 존재하지 않는 제1 액체 배양 배지의 제1 부피)를 제거하고, 제1 액체 배양 배지에 제2 액체 배양 배지의 제2 부피를 첨가하는 것을 포함한다. 제거 및 첨가는 동시에 또는 순차적으로, 또는 이들 두 방식이 조합되어 수행될 수 있다. 추가로, 제거 및 첨가는 연속적으로 (예를 들어, 생물반응기 부피 또는 제1 액체 배양 배지 부피의 0.1% 내지 800% (예를 들어, 1% 내지 700%, 1% 내지 600%, 1% 내지 500%, 1% 내지 400%, 1% 내지 350%, 1% 내지 300%, 1% 내지 250%, 1% 내지 100%, 100% 내지 200%, 5% 내지 150%, 10% 내지 50%, 15% 내지 40%, 8% 내지 80%, 및 4% 내지 30%)의 부피를 주어진 기간 동안에 (예를 들어, 24시간의 기간 동안에, 약 1시간 내지 약 24시간의 점진적 증가 기간 동안에, 또는 24시간 초과의 점진적 증가 기간 동안에) 제거하고 대체하는 속도로) 또는 주기적으로 (예를 들어, 3일에 1번, 2일에 1번, 하루에 1번, 하루에 2번, 하루에 3번, 하루에 4번, 또는 하루에 5번), 또는 이들이 임의로 조합되어 수행될 수 있다. 주기적으로 수행되는 경우에, (예를 들어, 약 24시간의 기간 이내에, 약 1시간 내지 약 24시간의 점진적 증가 기간 이내에, 또는 24시간 초과의 점진적 증가 기간 이내에) 제거되거나 대체되는 부피는 예를 들어, 생물반응기 부피 또는 제1 액체 배양 배지 부피의 0.1% 내지 800% (예를 들어, 1% 내지 700%, 1% 내지 600%, 1% 내지 500%, 1% 내지 400%, 1% 내지 300%, 1% 내지 200%, 1% 내지 100%, 100% 내지 200%, 5% 내지 150%, 10% 내지 50%, 15% 내지 40%, 8% 내지 80%, 및 4% 내지 30%)일 수 있다. 제거되는 제1 액체 배양 배지의 제1 부피 및 첨가되는 제2 액체 배양 배지의 제2 부피는 일부 경우에 전체 배양 기간 동안에 또는 일부 배양 기간 동안에 각 24시간의 기간 (또는 별법으로, 약 1시간 내지 약 24시간의 점진적 증가 기간 또는 24시간 초과의 점진적 증가 기간)에 걸쳐서 대략 동일하게 유지될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 제1 액체 배양 배지의 제1 부피가 제거되는 속도 (부피/단위 시간) 및 제2 액체 배양 배지의 제2 부피가 첨가되는 속도 (부피/단위 시간)는 달라질 수 있다. 제1 액체 배양 배지의 제1 부피가 제거되는 속도 (부피/단위 시간) 및 제2 액체 배양 배지의 제2 부피가 첨가되는 속도 (부피/단위 시간)는 대략 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다.
별법으로, 제거되고 첨가되는 부피는 배양 기간 동안에 각 24시간의 기간 (또는 별법으로, 1시간 내지 약 24시간의 점진적 증가 기간 또는 24시간 초과의 점진적 증가 기간)에 걸쳐서 변화할 수 있다 (예를 들어, 서서히 증가함). 예를 들어, 배양 기간 동안에 각 24시간의 기간 (또는 별법으로, 약 1시간 내지 24시간 초과의 점진적 증가 기간 또는 24시간 초과의 점진적 증가 기간) 이내에 제거되는 제1 액체 배양 배지의 부피 및 첨가되는 제2 액체 배양 배지의 부피는 배양 기간 동안에 생물반응기 부피 또는 제1 액체 배양 배지 부피의 0.5% 내지 약 20%의 부피에서 생물반응기 부피 또는 제1 액체 배양 배지 부피의 약 25% 내지 약 150%로 증가할 수 있다 (예를 들어, 서서히 또는 시차가 있는 증가를 통해).
통상의 기술자라면 제1 액체 배양 배지 및 제2 액체 배양 배지가 동일한 유형의 배지일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 다른 예에서, 제1 액체 배양 배지 및 제2 액체 배양 배지는 상이할 수 있다.
제1 액체 배양 배지의 제1 부피는 예를 들어, 생물반응기로부터 제1 액체 배양 배지의 제1 부피 (예를 들어, 생물반응기로부터의 세포가 실질적으로 존재하지 않는 제1 액체 배양 배지의 제1 부피)를 제거할 수 있는 기계식 시스템에 의해 제거될 수 있다. 선택적으로 또는 추가적으로, 제1 액체 배양 배지의 제1 부피는 제1 액체 배양 배지의 제1 부피의, 세포 (예를 들어, 포유류 세포)를 배제하는 분자량 컷오프를 갖는 멸균 막을 통한 십핑(seeping) 또는 중력 유동에 의해 제거될 수 있다.
제2 액체 배양 배지의 제2 부피는 자동식으로, 예를 들어 관류 펌프에 의해 제1 액체 배양 배지에 첨가될 수 있다.
일부 예에서, 제1 액체 배양 배지의 제1 부피 (예를 들어, 포유류 세포가 실질적으로 존재하지 않는 제1 액체 배양 배지의 제1 부피)의 제거 및 제2 액체 배양 배지의 제2 부피의 제1 액체 배양 배지에의 첨가는 생물반응기에 포유류 세포를 시딩한지 적어도 1시간 이내에 (예를 들어, 2시간 이내에, 3시간 이내에, 4시간 이내에, 5시간 이내에, 6시간 이내에, 7시간 이내에, 8시간 이내에, 9시간 이내에, 10시간 이내에, 12시간 이내에, 14시간 이내에, 16시간 이내에, 18시간 이내에, 24시간 이내에, 36시간 이내에, 48시간 이내에, 72시간 이내에, 96시간 이내에, 또는 96시간 후에) 발생하지 않는다.
유가 배양 생물반응기
본원에 기재된 배양 단계는 유가 배양 생물반응기를 사용하여 수행될 수 있다. 유가 배양 생물반응기에서 세포를 배양하는 것은, 대부분의 배양 기간 동안에, 제2 액체 배양 배지의 제2 부피를 제1 액체 배양 배지에 첨가 (예를 들어, 주기적 또는 연속적 첨가)하는 것을 포함한다. 제2 액체 배양 배지의 첨가는 연속적으로 (예를 들어, 생물반응기 부피 또는 제1 액체 배양 배지 부피의 0.1% 내지 300% (예를 들어, 1% 내지 250%, 1% 내지 100%, 100% 내지 200%, 5% 내지 150%, 10% 내지 50%, 15% 내지 40%, 8% 내지 80%, 및 4% 내지 30%)의 부피를 임의의 주어진 기간 동안에 (예를 들어, 24시간의 기간 동안에, 약 1시간 내지 약 24시간의 점진적 증가 기간 동안에, 또는 24시간 초과의 점진적 증가 기간 동안에) 첨가하는 속도로) 또는 주기적으로 (예를 들어, 3일에 1번, 2일에 1번, 하루에 1번, 하루에 2번, 하루에 3번, 하루에 4번, 또는 하루에 5번), 또는 이들이 임의로 조합되어 수행될 수 있다. 주기적으로 수행되는 경우에, (예를 들어, 약 24시간의 기간 이내에, 약 1시간 내지 약 24시간의 점진적 증가 기간 이내에, 또는 24시간 초과의 점진적 증가 기간 이내에) 첨가되는 부피는 예를 들어, 생물반응기 부피 또는 제1 액체 배양 배지 부피의 0.1% 내지 300% (예를 들어, 1% 내지 200%, 1% 내지 100%, 100% 내지 200%, 5% 내지 150%, 10% 내지 50%, 15% 내지 40%, 8% 내지 80%, 및 4% 내지 30%)일 수 있다. 첨가되는 제2 액체 배양 배지의 제2 부피는 일부 경우에 전체 배양 기간 동안에 또는 일부 배양 기간 동안에 각 24시간의 기간 (또는 별법으로, 약 1시간 내지 약 24시간의 점진적 증가 기간 또는 24시간 초과의 점진적 증가 기간)에 걸쳐서 대략 동일하게 유지될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 제2 액체 배양 배지의 제2 부피가 첨가되는 속도 (부피/단위 시간)는 전체 배양 기간 동안에 또는 일부 배양 기간 동안에 달라질 수 있다. 예를 들어, 첨가되는 제2 액체 배양 배지의 부피는 배양 기간 동안에 각 24시간의 기간 (또는 별법으로, 1시간 내지 약 24시간의 점진적 증가 기간 또는 24시간 초과의 점진적 증가 기간)에 걸쳐서 변화할 수 있다 (예를 들어, 서서히 증가함). 예를 들어, 배양 기간 동안에 각 24시간의 기간 (또는 별법으로, 약 1시간 내지 24시간 초과의 점진적 증가 기간 또는 24시간 초과의 점진적 증가 기간) 이내에 첨가되는 제2 액체 배양 배지의 부피는 배양 기간 동안에 생물반응기 부피 또는 제1 액체 배양 배지 부피의 0.5% 내지 약 20%의 부피에서 생물반응기 부피 또는 제1 액체 배양 배지 부피의 약 25% 내지 약 150%로 증가할 수 있다 (예를 들어, 서서히 또는 시차가 있는 증가를 통해). 제2 액체 배양 배지의 제2 부피가 첨가되는 속도 (부피/단위 시간)는 전체 배양 기간 동안에 또는 일부 배양 기간 동안에 대략 동일할 수 있다.
통상의 기술자라면 제1 액체 배양 배지 및 제2 액체 배양 배지가 동일한 유형의 배지일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 다른 예에서, 제1 액체 배양 배지 및 제2 액체 배양 배지는 상이할 수 있다. 제2 액체 배양 배지의 부피는 자동식으로, 예를 들어 관류 펌프에 의해 제1 액체 배양 배지에 첨가될 수 있다.
일부 예에서, 제1 액체 배양 배지에 제2 액체 배양 배지의 제2 부피를 첨가하는 것은 생물반응기에 포유류 세포를 시딩한지 적어도 1시간 이내에 (예를 들어, 2시간 이내에, 3시간 이내에, 4시간 이내에, 5시간 이내에, 6시간 이내에, 7시간 이내에, 8시간 이내에, 9시간 이내에, 10시간 이내에, 12시간 이내에, 14시간 이내에, 16시간 이내에, 18시간 이내에, 24시간 이내에, 36시간 이내에, 48시간 이내에, 72시간 이내에, 96시간 이내에, 또는 96시간 후에) 발생하지 않는다. 유가 배양 배양물의 세포 배양 배지는 전형적으로 배양 기간이 종료될 때 수거되어 본원에 기재된 임의의 방법에 사용되지만, 유가 배양 배양물의 세포 배양 배지는 또한 배양 기간 동안에 1회 이상의 시점에서 수거되어 본원에 기재된 임의의 방법에 사용될 수 있다.
통상의 기술자라면 임의의 다양한 배양 파라미터 (예를 들어, 용기, 부피, 배양물 부피를 대체하는 속도 또는 빈도, 교반 빈도, 온도, 배지, 및 CO2 농도)가 임의로 조합되어 상기 방법을 수행하는데 사용가능하다는 것을 이해할 것이다. 추가로, 본원에 기재되었거나 관련 기술분야에서 공지된 임의의 포유류 세포가 재조합 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다.
예시적 이점
본원에 기재된 방법은 치료 단백질 약물 물질에 존재하는 재조합 치료 단백질의 부피 생산성에 있어서 실질적인 증가를 초래할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법은 치료 단백질 약물 물질에 존재하는 재조합 치료 단백질의 부피 생산성에 있어서 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 및 10배의 증가를 초래할 수 있다. 재조합 치료 단백질의 생물학적 활성은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 평가될 수 있고, 특이적 재조합 치료 단백질의 활성에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 면역글로불린 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편)인 재조합 치료 단백질의 생물학적 활성은 그의 특이적 에피토프와 결합하는 재조합 치료 항체의 친화도를 측정함으로써 (예를 들어, 바이오코어(Biocore) 또는 경쟁적 효소-결합 면역흡착 분석법을 사용함) 결정될 수 있다. 재조합 치료 단백질은 효소 (예를 들어, 재조합 갈락토시다제, 예를 들어 재조합 알파-갈락토시다제)일 수 있고, 생물학적 활성은 재조합 치료 효소의 활성을 측정함으로써 (예를 들어, 검출가능한 기질의 농도 감소 또는 검출가능한 생성물의 농도 증가를 측정하여 (예를 들어, 분광광도법 또는 발광법을 사용함) 재조합 치료 효소의 촉매반응 속도 상수를 결정함으로써) 결정될 수 있다. 예를 들어, 재조합 치료 갈락토시다제의 생물학적 활성은 글로보트리아실세라미드 (GL-3) 또는 갈라비오실세라미드 수준의 감소, 또는 세라미드 디헥소시드 또는 갈락토스 수준의 증가를 측정함으로써 검출될 수 있다.
본원에 기재된 방법은 재조합 치료 단백질의 회수율 (%) 증가 (예를 들어, 치료 단백질 약물 물질의 액체 배양 배지에 존재하는 재조합 치료 단백질의 수율 (%) 증가)를 초래할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 약 70% 초과, 약 80% 초과, 약 82% 초과, 약 84% 초과, 약 86% 초과, 약 88% 초과, 약 90% 초과, 약 92% 초과, 약 94% 초과, 약 96% 초과, 또는 약 98% 초과의 재조합 치료 단백질 수율 (%)을 초래할 수 있다. 본 발명의 방법은 약 80% 내지 약 90%, 약 82% 내지 약 90%, 약 84% 내지 약 90%, 약 84% 내지 약 88%, 약 84% 내지 약 94%, 약 82% 내지 약 92%, 또는 약 85% 내지 약 95%의 수율 (%)을 초래할 수 있다.
치료 단백질 약물 물질에 존재하는 재조합 치료 단백질의 농도는 약 1.0 mg/mL 초과, 약 1.5 mg/mL 초과, 약 2.0 mg/mL 초과, 약 2.5 mg/mL 초과, 약 3.0 mg/mL 초과, 약 3.5 mg/mL 초과, 약 4.0 mg/mL 초과, 약 4.5 mg/mL 초과, 약 5.0 mg/mL 초과, 약 5.5 mg/mL 초과, 약 6.0 mg/mL 초과, 약 6.5 mg/mL 초과, 약 7.0 mg/mL 초과, 약 7.5 mg/mL 초과, 약 8.0 mg/mL 초과, 약 8.5 mg/mL 초과, 약 9.0 mg/mL 초과, 약 10.0 mg/mL 초과, 약 12.5 mg/mL 초과, 또는 약 15.0 mg/mL 초과일 수 있다.
본원에 기재된 방법은 적어도 약 5일, 적어도 약 10일, 적어도 약 15일, 적어도 약 20일, 적어도 약 25일, 적어도 약 30일, 적어도 약 35일, 적어도 약 40일, 적어도 약 45일, 적어도 약 50일, 적어도 약 55일, 적어도 약 60일, 적어도 약 65일, 적어도 약 70일, 적어도 약 75일, 적어도 약 80일, 적어도 약 85일, 적어도 약 90일, 적어도 약 95일, 적어도 약 100일, 적어도 약 110일, 적어도 약 120일, 적어도 약 130일, 적어도 약 140일, 적어도 약 150일, 적어도 약 160일, 적어도 약 170일, 적어도 약 180일, 적어도 약 190일, 적어도 약 200일, 적어도 약 210일, 적어도 약 220일, 적어도 약 230일, 적어도 약 240일, 적어도 약 250일, 적어도 약 260일, 적어도 약 270일, 적어도 약 280일, 적어도 약 290일, 적어도 약 300일, 적어도 약 310일, 적어도 약 320일, 적어도 약 330일, 적어도 약 340일, 적어도 약 350일, 또는 적어도 약 365일의 연속 기간 동안에 약 5 g/일 이상, 약 6 g/일 이상, 약 7 g/일 이상, 약 8 g/일 이상, 약 9 g/일 이상, 약 10 g/일 이상, 약 11 g/일 이상, 약 12 g/일 이상, 약 13 g/일 이상, 약 14 g/일 이상, 약 15 g/일 이상, 약 16 g/일 이상, 약 17 g/일 이상, 약 18 g/일 이상, 약 19 g/일 이상, 약 20 g/일 이상, 약 25 g/일 이상, 약 30 g/일 이상, 약 35 g/일 이상, 또는 약 40 g/일 이상의 치료 단백질 약물 물질 중 재조합 치료 단백질의 순 수율을 초래할 수 있다.
본원에 제공된 방법은 상당히 개선된 비 생산율을 초래할 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질 약물 물질에서 달성되는 비 생산율은 상이한 방법 (예를 들어, 배치 정제 방법 또는 통합되지 않고/거나 연속적이지 않은 방법)을 사용하여 달성되는 비 생산율보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 110배, 120배, 130배, 140배, 150배, 160배, 170배, 180배, 190배, 또는 200배 더 높다. 본 발명의 방법에 의해 달성되는 재조합 단백질 약물 물질의 생산성은 10,000 단위/L (제1 및/또는 제2 액체 배양 배지) 이상, 15,000 단위/L 이상, 약 20,000 단위/L 이상, 약 25,000 단위/L 이상, 약 30,000 단위/L 이상, 약 35,000 단위/L 이상, 또는 약 40,000 단위/L 이상일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 달성되는 재조합 단백질 약물 물질의 생산성은 1 g/L 이상, 1.5 g/L 이상, 2.0 g/L 이상, 2.5 g/L 이상, 3.0 g/L 이상, 4.0 g/L 이상, 4.5 g/L 이상, 또는 5.0 g/L 이상일 수 있다.
본원에 기재된 방법은 또한 액체 배양 배지로부터 치료 약물 물질의 시간-효율적인 제조를 제공한다. 예를 들어, 치료 단백질을 함유하는 유체 (예를 들어, 액체 배양 배지)를 제1 MCCS에 공급하고 치료 단백질 약물 물질 (치료 단백질을 함유함)을 제2 MCCS의 유출구로부터 용리하는 사이의 경과 시간은 예를 들어, 약 4시간 내지 약 48시간 (언급된 한계값 포함), 예를 들어 약 4시간 내지 약 40시간, 약 4시간 내지 약 35시간, 약 4시간 내지 약 30시간, 약 4시간 내지 약 28시간, 약 4시간 내지 약 26시간, 약 4시간 내지 약 24시간, 약 4시간 내지 약 22시간, 약 4시간 내지 약 20시간, 약 4시간 내지 약 18시간, 약 4시간 내지 약 16시간, 약 4시간 내지 약 14시간, 약 4시간 내지 약 12시간, 약 6시간 내지 약 12시간, 약 8시간 내지 약 12시간, 약 6시간 내지 약 20시간, 약 6시간 내지 약 18시간, 약 6시간 내지 약 14시간, 약 8시간 내지 약 16시간, 약 8시간 내지 약 14시간, 약 8시간 내지 약 12시간, 약 10시간 내지 20시간, 약 10시간 내지 18시간, 약 10시간 내지 16시간, 약 10시간 내지 14시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 10시간 내지 약 40시간, 약 10시간 내지 약 35시간, 약 10시간 내지 약 30시간, 약 10시간 내지 약 25시간, 약 15시간 내지 약 40시간, 약 15시간 내지 약 35시간, 약 15시간 내지 약 30시간, 약 20시간 내지 약 40시간, 약 20시간 내지 약 35시간, 또는 약 20시간 내지 약 30시간 (언급된 한계값 포함)이다. 다른 예에서, 치료 단백질을 함유하는 유체 (예를 들어, 액체 배양 배지)를 제1 MCCS에 공급하고 치료 단백질 약물 물질 (치료 단백질을 함유함)을 제2 MCCS의 유출구로부터 용리하는 사이의 경과 시간은 예를 들어, 약 4시간을 초과하며 약 40시간 미만이고 (언급된 한계값 포함), 예를 들어 4시간 초과 내지 약 39시간, 약 38시간, 약 37시간, 약 36시간, 약 35시간, 약 34시간, 약 33시간, 약 32시간, 약 31시간, 약 30시간, 약 29시간, 약 28시간, 약 27시간, 약 26시간, 약 25시간, 약 24시간, 약 23시간, 약 22시간, 약 21시간, 약 20시간, 약 19시간, 약 18시간, 약 17시간, 약 16시간, 약 15시간, 약 14시간, 약 13시간, 약 12시간, 약 11시간, 약 10시간, 약 9시간, 약 8시간, 약 7시간, 약 6시간, 약 5시간, 또는 약 4.5시간 미만 (언급된 한계값 포함)이다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 기재되고, 이 실시예는 청구범위에 기재된 본 발명의 범주를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1. 재조합 치료 단백질의 연속 유동 공정에서의 단일 주기적 향류 크로마토그래피 시스템 ( PCCS ) 의 사용
재조합 치료 단백질의 연속 유동 공정에서 단일 PCCS를 성공적으로 사용하기 위해 필요한 파라미터를 시험하기 위해 일련의 예비 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
세포 배양
12 L의 작업 부피를 갖는 생물반응기 (브로들리-제임스 코포레이션(Broadley-James Corp.), 미국 캘리포니아주 어바인 소재)를 관류 방식으로 폴리에테르술폰 0.2 ㎛ 필터를 갖는 ATF (리파인 테크놀로지즈(Refine Technologies)) 세포 보류 시스템을 이용하여 작동시켰다. 용해 O2 설정값을 유지하기 위해 O2 기체에 대하여 소결 분사기 (20 ㎛)를 사용하였고, pCO2 설정값을 유지하기 위해 N2 기체에 대하여 천공 분사기 (990 ㎛)를 사용하였다. 세포 배양물에서의 세포 밀도를 오프라인(offline) 측정 (Vi-CELL, 베크만 쿨터(Beckman Coulter), 미국 캘리포니아주 브레아 소재)에 의해 또한/또는 온라인(online) 정전용량식 프로브 (푸투라(Futura), 아버 인스트루먼츠(Aber Instruments), 미국 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재)를 통해 모니터링하였다.
생물반응기의 세포 배양 공정 전개는 화학적으로 한정된 배양 배지 및 재조합 치료 항체 또는 재조합 치료 인간 효소를 분비하는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주를 이용하였다. 접종 직후에 생물반응기 배양물에서의 세포 농도는 0.5 x 106개 세포/mL였다. 세포를 50-60 x 106개 세포/mL까지 성장시켰다. 배양물이 상기 세포 밀도에 도달하면, 세포-블리딩(bleeding) 방법을 개시하여 세포 밀도를 정상 상태에서 유지하였다. 세포 배양물의 관류를 접종 후 24시간에, 1 반응기 부피/일로 개시하고, 관류 속도를 배양물에서의 세포 농도에 비례하여 증가시켰다. 0.04-0.05　nL/세포-d의 정상 상태 세포 특이적 관류 속도를 유지하였다. 생물반응기에서 용해 O2를 공기 포화의 30%를 초과하여 유지하였다. 배양 배지의 pH는 탄산나트륨의 첨가를 통해 6.8 내지 6.95에서 유지하였다. 소포제 (폼어웨이(FoamAway), 깁코(GIBCO), 미국 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재)를 액체 배양 배지에 첨가하여 기포 수준을 조절하였다. 생물반응기로부터 수득된 액체 배양 배지를 추가 정화 없이 단일 PCCS로 펌핑하였다.
주기적 향류 ( PCC ) 크로마토그래피 시스템 ( PCCS )
이들 실험에 사용되는 PCCS는 4개의 칼럼까지 전개할 수 있는 맞춤-변형된 AKTA (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 시스템이었다. 시스템은 5개의 UV 모니터 (UV-900), 3개의 펌프 (P-900), 다수의 밸브 (PV-908, SV-903), 1개의 pH 미터 및 1개의 전도도 측정기 (pH/C-900), 및 유니콘-기반 맞춤 소프트웨어 (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)가 설치되었다.
누출 곡선
단일 PCCS를 위한 적절한 칼럼 스위칭 전략을 결정하기 위해 단백질 누출 곡선이 필요하다. 포획 조건하에서의 누출 곡선을 얻기 위해, 정면 로딩 실험을 수행하였다. 동적 결합능 (DBC)을 정화 수거물 및 UV 흡광도 (280 nm)에 의해 측정된 누출 프로파일을 사용하여 체류 시간의 함수로서 평가하였다. DBC의 측정을 위해 재조합 치료 항체 및 재조합 치료 인간 효소 각각에 대하여 6.0 mL 및 1.0 mL의 칼럼 크기를 사용하였다. 로딩 시간이 나머지 칼럼 조작 (세척, 용리, 재생 등)보다 더 연장되도록 보장함과 동시에, 체류 시간이 결합능 요건을 만족시킬 정도로 충분히 연장되도록, 체류 시간을 선택하였다. 그에 따라, 로딩 유량은 재조합 치료 항체에 대해서는 2.5분, 또한 재조합 치료 인간 효소에 대해서는 4.8분의 표적 체류 시간을 달성하도록 조정되었다.
단일 PCCS의 생물반응기와의 통합
PCCS에서, 시스템의 제1 칼럼으로부터의 누출이 시스템의 제2 칼럼에서 포획될 수 있으므로, 칼럼에서의 단백질의 체류 시간 (RT)은 칼럼 크기의 증가 없이 감소할 수 있다. 이러한 특이한 특징은 배양 수거물이 방정식 1에 의해 약술된 바와 같이, 칼럼 부피 (V) 및 RT를 변화시킴으로써 임의의 관류 속도 (D)로 가공될 수 있도록 하는 연속적 공정을 설계하는데 사용되었다.
V = D * RT (1)
재조합 단백질의 연속적 포획을 달성하기 위해, 단일 PCCS가 도 2에 도시된 바와 같이 생물반응기에 직접 연결되었다. 생물반응기/ATF로부터의 수거물은 소용량 서지(surge) 용기로서 작용하는 2 L들이 일회용 백 (하이클론(Hyclone), 미국 유타주 로건 소재)으로 연동 펌프 (마스터플렉스(Masterflex), 콜파머(Cole-Parmer), 미국 일리노이주 버넌 힐스 소재)를 사용하여 펌핑되었다. 생물반응기와 서지 백의 사이에 추가 멸균 격막으로서 0.2 ㎛ 필터 (밀리팩(Millipack) 40, 밀리포어(Millipore), 미국 매사추세츠주 빌레리카 소재)가 추가되었다. 맵셀렉트 슈어 (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 매체 (XK16™), 1.6 cm x 6 cm (지이 헬쓰케어) 칼럼이 재조합 치료 항체 및 재조합 치료 인간 효소를 각각 포획하는데 사용되었다. 각 칼럼의 조작은 평형화, 로딩, 세척, 용리, 및 재생 단계로 이루어졌다. 실험실 규모의 단일 PCCS의 공학은 폐쇄 조작을 허용하지 않으므로, 소듐 아지드가 공정 스트림에 인라인 첨가되었다.
분석 방법
재조합 치료 항체
자체(in-house) 분석법이 숙주 세포 단백질 (HCP), 응집, 잔류 단백질 A, 및 재조합 항체의 효능에 대한 역가의 정량화를 위해 사용되었다. 역가는 단백질 A 칼럼 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)을 사용하여 측정하였다. 잔류 단백질 A 및 HCP는 자체 생산된 항원 및 항체를 사용하여 ELISA에 의해 정량화하였다. 응집은 TSK-GEL, G3000SWXL, 7.8 mM X 30 cm, 5 ㎛ 칼럼 (토소 하스(TOSO HAAS), 미국 펜실베니아주 킹오브프러시아 소재)을 사용하여 HPLC-SEC에 의해 측정하였다. 재조합 치료 항체 효능은 시험관내 세포-기반 분석법에 의해 측정하였다.
재조합 치료 인간 효소 활성 분석법
p-니트로페놀 (pNP) (시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 미국 미주리주 세인트루이스 소재)에 결합된 합성 기질의 가수분해 속도를 측정함으로써 칼럼 로딩액 및 용리액 중 재조합 치료 인간 효소의 역가를 결정하였다. 샘플 (25 μL)을 40 μM 기질 225 μL와 함께 15분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 반응을 pH 10.5의 0.3 M 글리신 250 μL로 켄칭하고, 흡광도를 400 nm를 측정하였다. 1 단위의 활성은 한정된 분석 조건하에서 분 당 pNP에 결합된 기질 1 마이크로몰을 가수분해하는데 필요한 재조합 치료 효소의 양으로서 정의되었다. 단백질 농도를 POROS R2/H 2.1 X 30 mM 칼럼 (어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)을 사용하여 RP-HPLC에 의해 측정하였다. 비활성도은 pNP (단위)/단백질 (mg)로서 표시되었다.
자체 분석법이 HCP, 응집, 및 순도의 정량화를 위해 사용되었다. HCP는 특허 시약을 사용하여 ELISA에 의해 분석하였다. 응집 (SEC-HPLC) 분석법은 TSK-GEL, G3000SWXL, 7.8 mM X 30 cm, 5 ㎛ 칼럼 (토소 하스, 미국 펜실베니아주 킹오브프러시아 소재)을 사용하였고, RP-HPLC 순도 분석법은 YMC 옥틸 2 mm X 100 mM, 5 ㎛ 칼럼 (워터스(Waters), 미국 매사추세츠주 밀포드 소재)을 사용하였다.
단일 PCCS의 기본 개념
칼럼 조작은 일반적으로 로딩, 세척, 용리, 및 재생 단계로 이루어진다. 단일 PCCS에서, 다수의 칼럼이 동일한 단계를 순환하는 방식으로 별도로 연속적으로 실행하는데 사용된다. 칼럼이 직렬로 조작되므로, 하나의 칼럼으로부터의 통과액 및 세척액은 제2 칼럼에 의해 포획된다. PCC 시스템의 이러한 특이한 특징은 배치식 크로마토그래피 동안에 전형적인 동적 결합능 대신에, 정적 결합능에 근접한 수지의 로딩을 허용한다. 단지 예시의 용이함을 위해, PCCS 작동의 이러한 원리를 설명하기 위해 3-칼럼 시스템이 사용된다 (도 3). 사이클은 3개의 별개의 용리 풀을 초래하는 3개의 완료된 칼럼 조작으로서 정의된다. 사이클에서 모든 단계가 완료되었을 때, 사이클은 재시작된다. 그 결과, PCC 시스템의 작동에서 공급물 스트림이 연속적으로 가공되고, 각 칼럼으로부터의 재조합 치료 단백질 용리는 독립적이며 주기적이다.
칼럼 스위칭 전략
PCCS 사이클 (도 3) 내에서 하나의 단계로부터 또 다른 단계로 진행하기 위해서, 칼럼-스위칭 전략이 이용된다. PCCS에서 칼럼 당 2개의 자동식 스위칭 작동이 필요하고, 그 중 첫번째 것은 초기 재조합 치료 단백질 누출과 관련이 있고, 반면에 두번째 것은 칼럼 포화와 일치한다. 이 실시예에서 설명된 단일 PCCS는 동적 UV 모니터링을 이용하는 조절 전략을 사용하여 작동되었다. 일반적으로, 칼럼 스위칭은 피드백 조절과 함께 재조합 치료 단백질 농도를 인라인 측정할 수 있는 임의의 공정 분석 기술 (Process Analytical Technology; PAT) 기구에 의해 결정될 수 있다. 그러나, 실시간으로 작동되는 PAT 기구, 예컨대 UV는 칼럼 스위칭을 위한 촉발 신호를 제공하는데 있어서 이상적이다.
도 4는 공급물 유입구와 칼럼 유출구 사이의 UV 흡광도 차이 (ΔUV)에 기초한 칼럼 스위칭의 원리를 도시한다. 칼럼 로딩 (단계 1; 도 3) 동안에, PCC 조절 시스템은 흡광도가 안정화되었을 때 불순물 기준선을 결정한다. 재조합 치료 단백질이 누출될 때 (단계 2; 도 3), 유출구 UV 신호가 불순물 기준선보다 증가한다. ΔUV가 미리 결정된 역치 (예컨대, 재조합 치료 단백질의 3% 누출)에 도달하면, 칼럼 1로부터의 통과액이 폐기물 대신에 칼럼 2로 향한다 (t1; 도 4). 칼럼 1이 재조합 치료 단백질로 거의 포화되고 ΔUV가 미리 결정된 값에 도달하면 (t2; 도 4), 공급물은 칼럼 2로 스위칭된다. 이러한 ΔUV-기반 칼럼 스위칭 전략의 중요한 이점은 이것이 공급물 재조합 치료 생성물 농도 및 칼럼 용량과 상관없이 칼럼의 균일한 로딩을 허용한다는 것이다. 적정한 범위 내에서, 전략은 수거물 역가 변동성에 있어서 적절하고, 그에 의해 시스템의 강건성을 향상시킨다.
공급물과 칼럼 유출구 사이의 UV 흡광도 차이에 기초한, 칼럼-스위칭 시간의 정확한 결정은 단일 PCCS 실시간 조절 전략의 중요한 요소 중 하나이다. 이를 위해 5개의 UV 검출기 (1개의 공급물 검출기 및 4개의 칼럼 유출구 검출기)를 모두 좁은 범위 내에서 동기화할 필요가 있다. UV 검출기는 3% 아세톤 용액을 사용하여 보정되었다. 검출기 경로 길이는 5개의 흡광도 값이 모두 서로에 대하여 0.5% 이내에 있도록 수동으로 조정되었다. 경로 길이 조정은 ≤ 10%였다.
재조합 항체를 사용하는 개념의 증거
세포 배양
본 연구를 위한 모델 재조합 치료 항체를 12 L들이 관류 생물반응기에서 재료 및 방법에 기재된 조건하에 70일의 기간 동안에 연속적으로 생산하였다 (도 5). 부피 생산율은 30일과 40일 사이에 1　g/L-d에 도달하였고, 그 후에 아직 판명되지 않은 이유로 서서히 감소하였다. 피크 부피 생산율은 동일한 세포주를 사용하는 유가 배양 공정보다 > 5배 더 높았고, 연속적 공정에 있어서 상당한 상향의 가능성을 나타낸다. 본 연구의 목적이 통합된 연속적 시스템의 기능성을 입증하는 것임을 주목해야 한다. 사실, 부피 생산율 변화는 단일 PCCS의 강건성, 및 특히 수거물 역가의 변동성을 처리하는 능력의 시험을 가능하게 한다.
하류
배치 크로마토그래피에서, 최대 DBC는 체류 시간 (RT)을 증가시키고, 후속적으로 칼럼을 과대화함으로써 달성된다. PCCS에서는, 제1 칼럼으로부터의 누출이 제2 칼럼에서 포획될 수 있으므로, RT가 칼럼 크기의 증가 없이 감소할 수 있다. PCCS의 이러한 이점은 보다 작은 칼럼 크기 및 보다 단축된 RT를 허용한다. 단일 PCCS 공정이 연속적이기 위해서는, RT가 나머지 공정 (평형화, 세척, 용리, 재생 등)이 차지하는 시간을 합친 것보다 연장되어야 한다. 따라서, 주어진 공정에 대하여 PCCS와 함께 사용되는 칼럼의 크기 및 개수는, 로딩 단계의 길이를 좌우하는 수지 결합능에 따라 달라진다. 재조합 항체 공정 (50 g/L)에서 맵셀렉트 슈어™ 수지의 고결합능은 나머지 칼럼 단계를 합친 것보다 연장된 로딩 단계를 유도하고, 이는 3개의 칼럼을 함유하는 PCCS를 사용하는 연속적인 재조합 치료 단백질 포획을 가능하게 한다. 재조합 항체에 대하여 상이한 체류 시간에서 누출 곡선을 결정하기 위해 정면 로딩 실험을 이용하였고 (데이터 도시되지 않음), 2.5분의 체류 시간이 최적인 것으로 밝혀졌다.
단일 PCCS의 장기 성능을 시험하기 위해, 생물반응기 수거물이 시간-기반 성능 저하의 징후 없이, 38회의 PCC 사이클 및 110회의 칼럼 조작에 상응하는 30일 동안 연속적으로 포획되었다. 연구 기간 동안에 연속적 포획의 일관성을 다수의 성능 지표, 예컨대 크로마토그래피 프로파일, 회수율, 및 재조합 항체 중요 품질 특성 (CQA)에 기초하여 평가하였다. 공급물 스트림의 UV 프로파일은 전개 기간 동안에 거의 일정하였고, 3개의 칼럼 UV 유출구는 다수의 사이클에 걸쳐서 재현가능하였다. 포획 용리액에 대하여 분석된 회수율 및 5개의 CQA는 3개의 칼럼 사이에, 또한 연속적인 수거물 포획의 전체 기간 동안에 유사하였다 (도 6). 이러한 결과는 장기간 동안 일관된 공정 성능 지표 및 CQA를 제공하는, 관류 생물반응기로부터의 직접적 연속적 재조합 항체 포획의 실행가능성을 입증하였다.
단일 PCCS 공정을 추정 크로마토그래피 칼럼 발자국 및 원료 소비와 관련하여 기존의 단일 칼럼 배치 크로마토그래피 시스템과 비교하였다. 구체적으로, 배치식 정제와 비교하여 단일 PCCS에서, 크로마토그래피 매체 용량 이용율은 20% 증가하였고, 완충액 사용량은 25% 감소하였으며, 개별 칼럼 크기는 75배 감소하였다.
재조합 인간 효소를 이용하는 개념의 증거
세포 배양
본 연구에서의 재조합 치료 인간 효소를 12 L들이 생물반응기에서 재료 및 방법에 기재된 조건하에 70일의 연속적 배양 동안에 생산하였다 (도 7). 부피 생산율은 25일쯤에 0.4 g/L-d에 도달하였고, 그 후에도 분석 변동성과 크게 관련있는 16%의 CV로 정상 상태를 유지하였다. 동일한 분자를 제조하는 레거시(legacy) 공정과 비교하여, 상기 부피 생산성은 약 40배 더 높고, 이는 높은 세포 밀도 및 상당히 개선된 세포 비 생산율의 상승작용성 영향의 결과이다.
하류
본 연구의 목적은 장기간 동안에 칼럼 및 사이클마다 포획 칼럼 성능 지표, 포획 용리액 CQA의 일관성, 및 단일 PCCS 하드웨어 및 조절 전략의 강건성을 결정하는 것이다. HIC 포획 칼럼의 결합능이 낮은 것을 고려하면 (1 g/수지 (L)), 칼럼을 로딩하는데 필요한 시간이 나머지 공정 단계 (세척, 용리, 재생 등)를 합친 것보다 단축되었다. 이는 수거물이 연속적으로 가공되기 위해 3개의 칼럼 대신에, 4개의 칼럼이 필요한 단일 PCCS를 초래하였다. 그에 따라, 단일 4-칼럼 PCCS가 개발되었고 재조합 인간 효소를 연속적으로 포획하는데 사용되었다.
연구를 2상으로 나누었다. 제1 상은 방법 개발로 이루어졌고, 여기서 사전에 수집된 수거물이 멸균 일회용 백으로부터 단일 PCCS에 공급되었다. 제2 상 동안에, 단일 PCCS는 도 2에 약술된 바와 같이, 연속적 공정을 위해 생물반응기와 직접적으로 통합되었다. 본 연구의 제1 상에서, 단일 PCCS를 9일 및 41회의 단일 PCCS 사이클 또는 164회의 칼럼 조작 동안에 연속적으로 작동시켰다. 공급물의 UV 프로파일은 전체 전개 동안에 일정하였고, 4개의 칼럼 유출구 UV 신호는 4개의 칼럼 사이에 다수의 사이클에 걸쳐서 적절하게 일관적이었다. 전체 전개 동안에 단일 PCCS 작동의 일관성은 추가 칼럼 성능 지표 및 포획된 재조합 치료 단백질의 CQA 분석에 의해 입증되었다 (도 8). 분석된 회수율 및 5개의 CQA는 9일의 연속적 수거물 포획 기간 동안에 4개의 칼럼 사이에 유사하였다.
본 연구의 제2 상에서, 단일 PCCS를 도 2에 도시된 바와 같이 생물반응기와 통합함으로써 재조합 치료 단백질은 관류 생물반응기로부터 직접적으로 포획되었다. 주요 목적은 장기간 동안 고도로 복잡한, 비-항체 단백질을 이용하여 연속적 생물공정 플랫폼의 성능을 입증하는 것이다. 생물반응기 수거물의 연속적 포획을 달성하기 위해, 칼럼 크기 및 RT를 방정식 1에 따라 변경하였다. 통합 단일 PCCS를 시간-기반 성능 저하의 징후 없이, 31일 및 640회의 독립적 칼럼 조작에 상응하는 160회의 단일 PCCS 사이클 동안에 연속적으로 작동시켰다. 공급물 UV 프로파일, 4개의 칼럼 유출구 UV 프로파일 및 CQA는 전체 PCCS 작동 기간 동안에 일관적이었다. 데이터가 본 연구의 제1 상에서 얻은 데이터와 실질적으로 등가이므로, 시간 프로파일은 도시되지 않았다.
요약하면, 이러한 데이터는 단일 PCCS가 포유류 세포 배양물에 의해 생산된 재조합 치료 단백질 (재조합 치료 항체와 재조합 치료 인간 효소 둘 모두)의 가공에 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 2. 재조합 단백질의 연속 유동 공정에서의 2개의 주기적 향류 크로마토그래피 시스템 ( PCCS ) 의 사용
생물반응기의 세포 배양 배지로부터 재조합 치료 항체의 연속적 생물공정을 가능하게 하는, 2개의 상이한 PCCS를 사용하는 시스템을 제작하였다. 재조합 치료 항체를 함유하는 시스템의 용리액은 제형화되지 않은 치료 단백질 약물 물질로서, 실질적으로 제약 조성물로서 제형화될 준비가 되었다.
재료 및 방법
세포 배양
10 L의 작업 부피를 갖는 생물반응기 (브로들리-제임스 코포레이션, 미국 캘리포니아주 어바인 소재)를 관류 방식으로 폴리에테르술폰 0.2 ㎛ 필터를 갖는 ATF (리파인 테크놀로지즈) 세포 보류 시스템을 이용하여 작동시켰다. 배양 배지에서 용해 O2 설정값을 유지하기 위해 O2 기체에 대하여 소결 분사기 (20 ㎛)를 사용하였고, pCO2 설정값을 유지하기 위해 N2 기체에 대하여 천공 분사기 (990 ㎛)를 사용하였다. 생물반응기에서의 세포 밀도를 오프라인 측정 (Vi-CELL, 베크만 쿨터, 미국 캘리포니아주 브레아 소재)에 의해 또한/또는 온라인 정전용량식 프로브 (푸투라, 아버 인스트루먼츠, 미국 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재)를 통해 모니터링하였다.
생물반응기의 세포 배양 공정 전개는 화학적으로 한정된 액체 배양 배지 및 재조합 치료 단일클론 항체를 생산하는 CHO 세포주를 이용하였다. 접종 후에, 생물반응기는 액체 배양 배지에서 0.5 x 106개 세포/mL의 생존 세포 농도를 함유하였다. 세포를 30-40 x 106개 세포/mL의 세포 밀도까지 성장시켰다. 세포가 상기 밀도에 도달하면, 세포-블리딩 방법을 개시하여 세포 밀도를 정상 상태에서 유지하였다. 관류를 접종 후 24시간에 개시하고, 생물반응기에서 제거되고 대체되는 액체 배양 배지의 부피는 세포 농도에 비례하여 증가하였다. 0.04-0.05　nL/세포-d의 정상 상태 세포 특이적 관류 속도를 유지하였다. 액체 배양 배지에서 용해 O2를 공기 포화의 30%를 초과하여 유지하였다. 액체 배양 배지의 pH는 탄산나트륨의 첨가를 통해 6.8 내지 6.95에서 유지하였다. 소포제 (폼어웨이, 깁코, 미국 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재)를 사용하여 생물반응기에서 기포 수준을 조절하였다. 생물반응기로부터 수거된 액체 배양 배지를 추가 정화 없이 2개의 PCC 시스템으로 펌핑하였다.
하류
재조합 단백질 약물 물질 (DS)의 통합되고 완전히 연속적인 제조 방법을 개발하기 위해 2개의 PCCS (PCCS1 및 PCCS2)가 사용되었다 (도 9). 각각의 PCCS는 연속적인 칼럼 조작을 위해 주기적 향류 크로마토그래피의 사용을 허용하는 것 이외에도, 다수의 조작을 수행하였다. 실험실 규모의 PCCS의 공학이 폐쇄 조작을 허용하지 않으므로, 소듐 아지드가 공정 스트림에 인라인 첨가되었다. 소규모 시스템의 이러한 한계는 대규모 PCCS 하드웨어의 적절한 설계에 의해 성공적으로 해결될 수 있다.
2개의 주기적 향류 ( PCC ) 크로마토그래피 시스템
본 연구에서 사용되는 2개의 PCCS는 4개의 칼럼까지 전개할 수 있는 맞춤 변형된 AKTA (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)였다. 각각의 시스템은 5개의 UV 모니터 (UV-900), 3개의 펌프 (P-900), 다수의 밸브 (PV-908, SV-903), 1개의 pH 미터 및 1개의 전도도 측정기 (pH/C-900), 및 유니콘-기반 맞춤 소프트웨어 (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)가 설치되었다.
생물반응기의 PCCS1 및 PCCS2와의 통합
생물반응기/ATF로부터의 수거물은 소용량 서지 용기로서 작용하는 2 L들이 일회용 백 (하이클론, 미국 유타주 로건 소재)으로 연동 펌프 (마스터플렉스, 콜파머, 미국 일리노이주 버넌 힐스 소재)를 사용하여 펌핑되었다. 생물반응기와 서지 백의 사이에 추가 멸균 격막으로서 0.2 ㎛ 필터 (밀리팩 40, 밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌레리카 소재)가 추가되었다. 맵셀렉트 슈어 (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 크로마토그래피 매체 (XK16™), 1.6 cm x 6 cm 칼럼이 재조합 치료 단일클론 항체를 포획하는데 사용되었다. 각 단백질 A 칼럼 (pH 3.75)으로부터의 용리액이 바이러스 불활성화 (VI) 조작을 수행하기 위해 1시간의 체류 시간을 갖는, 250 mL들이 유리 교반 저장소로 펌핑되었다. 0.2 ㎛ 필터 (밀리팩 100, 밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌레리카 소재)가 PCCS1과 PCCS2의 사이에 추가되어, 혼합 장치 및 하류 칼럼을 위한 미립자 격막으로서 작용하였다.
PCCS1로부터의 조정된 로딩 물질은 PCCS2에서, 결합 및 용리 방식으로 3개의 XK16TM, 1.1 cm x 7 cm (지이 헬쓰케어) 캅토 S (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 추가로 정제되었다. 최종적으로, 캅토 S 용리액을 캅토-S 칼럼 유출구에 직접적으로 연결된 7 mL 사토바인드 Q-막 (사토리우스 XX)을 사용하여 폴리싱하여, 재조합 단백질 약물 물질을 제공하였다. 추가적으로, 캅토-S 및 사토바인드 Q-막에서의 두 로딩 전에 필요한 인라인 희석이, 각각 PCCS1 및 PCCS2 펌프를 사용하여 수행되었다 (도 9). 각각의 칼럼 조작은 평형화, 로딩, 세척, 용리, 및 재생 단계로 이루어졌다. 사토바인드 Q-막은 평형화, 로딩, 세척, 및 재생 단계로 이루어졌다. 표 1 및 2는 각각 PCCS1 및 PCCS2를 사용하여 수행되는 모든 단위 조작의 공정 파라미터를 나타낸다. 도 9는 또한 두 PCCS를 통해 펌핑되는 액체의 유량을 도시한다.
<표 1>
제1 PCCS (PCCS1)의 작동 파라미터
Figure pct00001
Figure pct00002
<표 2>
제2 PCCS (PCCS2)의 작동 파라미터
Figure pct00003
Figure pct00004
분석 방법
자체 분석법이 숙주 세포 단백질 (HCP), 응집, 잔류 단백질 A, 및 재조합 단일클론 항체의 효능에 대한 역가의 정량화를 위해 사용되었다. 역가는 단백질 A 칼럼 (어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)을 사용하여 측정하였다. 잔류 단백질 A 및 HCP는 자체 생산된 항원 및 항체를 사용하여 ELISA에 의해 정량화하였다. 응집은 TSK-GEL, G3000SWXL, 7.8 mM X 30 cm, 5 ㎛ 칼럼 (토소 하스, 미국 펜실베니아주 킹오브프러시아 소재)을 사용하여 HPLC-SEC에 의해 측정하였다. 재조합 치료 단일클론 항체 효능은 시험관내 세포-기반 분석법에 의해 측정하였다.
칼럼 스위칭 전략
PCCS 사이클 (도 3) 내에서 하나의 단계로부터 또 다른 단계로 진행하기 위해서, 칼럼-스위칭 전략이 이용된다. 각각의 PCC에서 칼럼 당 2개의 자동식 스위칭 작동이 필요하고, 그 중 첫번째 것은 초기 재조합 치료 단백질 누출과 관련이 있고, 반면에 두번째 것은 칼럼 포화와 일치한다. 이 작업에서 기재된 PCC 시스템은 동적 UV 모니터링 및 시간 기반 스위칭을 이용하는 신규한 조절 전략을 사용하여 작동되었다. 일반적으로, 칼럼 스위칭은 피드백 조절과 함께 재조합 치료 단백질 농도를 인라인 측정할 수 있는 임의의 PAT 기구에 의해 결정될 수 있다.
도 4는 공급물 유입구와 칼럼 유출구 사이의 UV 흡광도 차이 (ΔUV)에 기초한 칼럼 스위칭의 원리를 도시한다. 칼럼 로딩 (단계 1; 도 3) 동안에, PCC 조절 시스템은 흡광도가 안정화되었을 때 불순물 기준선을 결정한다. 재조합 치료 단백질이 누출될 때 (단계 2; 도 3), 유출구 UV 신호가 불순물 기준선보다 증가한다. ΔUV가 미리 결정된 역치 (예컨대, 재조합 치료 단백질의 3% 누출)에 도달하면, 칼럼 1로부터의 통과액이 폐기물 대신에 칼럼 2로 향한다 (t1; 도 4). 칼럼 1이 재조합 치료 단백질로 거의 포화되고 ΔUV가 미리 결정된 값에 도달하면 (t2; 도 4), 공급물은 칼럼 2로 스위칭된다. 이러한 ΔUV-기반 칼럼 스위칭 전략의 중요한 이점은 이것이 공급물 재조합 치료 단백질 농도 및 칼럼 용량과 상관없이 칼럼의 균일한 로딩을 허용한다는 것이다. 적정한 범위 내에서, 전략은 수거물 역가 변동성에 있어서 적절하고, 그에 의해 시스템의 강건성을 향상시킨다.
상기에 논의된 바와 같이, 공급물과 칼럼 유출구 사이의 UV 흡광도 차이에 기초한, 칼럼-스위칭 시간의 정확한 결정은 PCC 실시간 조절 전략의 중요한 요소 중 하나이다. 이를 위해 5개의 UV 검출기 (1개의 공급물 검출기 및 4개의 칼럼 유출구 검출기)를 모두 좁은 범위 내에서 동기화할 필요가 있다. UV 검출기는 3% 아세톤 용액을 사용하여 보정되었다. 검출기 경로 길이는 5개의 흡광도 값이 모두 서로에 대하여 0.5% 이내에 있도록 수동으로 조정되었다. 경로 길이 조정은 ≤ 10%였다.
칼럼 스위칭을 위해 사용되는 제2 전략은 시간과 관련있다. 31일의 생산 동안에 재조합 치료 단백질 역가가 준-정상 상태이므로, 칼럼 스위칭은 미리 결정된 역치 및 포화를 위해 걸리는 시간에 기초하여 계산될 수 있다.
결과 및 고찰
2-PCC 시스템의 장기 성능을 시험하기 위해, 생물반응기로부터 수거된 액체 배양 배지가 시간-기반 성능 저하의 징후 없이, 372회의 정제 사이클 또는 25개의 2-PCC 시스템 배치 생산에 상응하는 31일 동안 연속적으로 정제되었다. 연구 기간 동안에 연속적 포획의 일관성을 다수의 성능 지표, 예컨대 크로마토그래피 프로파일, 회수율, 및 재조합 치료 단일클론 항체 중요 품질 특성 (CQA)에 기초하여 평가하였다. 공급물 스트림의 UV 프로파일은 전개 기간 동안에 거의 일정하였고, 3개의 칼럼 UV 유출구는 다수의 사이클에 걸쳐서 재현가능하였다. 이러한 상세한 내용 및 사이클-대-사이클 재현가능성은 도 12-14에 도시된 전개 크로마토그램 스냅샷에서 입증되었다. 포획 용리액에 대하여 분석된 회수율 및 5개의 CQA는 3개의 칼럼 사이에, 또한 연속적인 수거물 포획의 전체 기간 동안에 유사하였다 (도 16). 이러한 결과는 장기간 동안에 일관된 공정 성능 지표 및 CQA를 제공하는, 2-PCC 시스템을 사용하는 관류 생물반응기로부터의 직접적 연속적 재조합 치료 단일클론 항체 포획의 실행가능성을 입증하였다. 모델 재조합 치료 단일클론 항체가 통합된 2-PCC 시스템을 사용하는 완전히 연속적인 생물공정 플랫폼의 실행가능성 연구에 사용되었다.
MAb를 사용하는 개념의 증거
세포 배양
본 연구를 위한 모델 재조합 치료 단일클론 항체를 12 L들이 관류 생물반응기에서 재료 및 방법에 기재된 조건하에 59일의 기간 동안에 연속적으로 생산하였다. 부피 생산성은 10일째부터 59일째까지 1.0 내지 1.6 g/L에서 유지되었다. 피크 부피 생산성은 동일한 세포주를 사용하는 유가 배양 공정보다 약 8배 더 높았고, 관류 속도의 최적화 및/또는 정상 상태 세포 밀도의 증가에 의해 연속적 공정에 있어서 상당한 상향의 가능성을 나타낸다 (도 11 및 12).　 본 연구의 목적이 통합된 연속적 시스템의 기능성을 입증하는 것임을 주목해야 한다.　 사실, 부피 생산율 변화는 PCC 시스템의 강건성, 및 특히 수거물 역가의 변동성을 처리하는 능력의 시험을 가능하게 한다.
하류
주요 목적은 장기간 동안에 통합된 2-PCC 시스템을 사용하는 재조합 치료 단일클론 항체의 연속적 생물공정 플랫폼 성능을 입증하는 것이다. 단백질 A 및 양이온 교환 칼럼 둘 모두를 위한 칼럼/막 크기 및 체류 시간을 변경하여 생물반응기 수거물의 제형화되지 않은 약물 물질 (DS)로의 연속적 공정을 달성하였다. 통합 시스템은 시간-기반 성능 저하의 징후 없이, 15개의 독립적인 제형화되지 않은 DS 배치에 상응하는 31일 동안에 연속적으로 작동되었다 (배치는 15 Q-막 여과물의 1.25일 가공, 또는 0.8 g의 DS로서 정의됨). 단백질 A 포획 및 캅토-S 뿐만 아니라, 사토바인드 Q 막 여과물에 대한 공급물 UV 프로파일, 3-칼럼 유출구 UV 프로파일은 통합된 생물반응기-PCC1-PCC2의 전체 작동 기간 동안에 일정하였다 (도 12-14). 추가로, 제형화되지 않은 DS의 모든 CQA는 PCC의 전체 작동 기간 동안에 일관적이었다 (도 15 및 16). 기존의 배치 정제 방법과 비교하여, 재조합 치료 단일클론 항체를 생산하기 위해 통합된 연속적 2-PCC 시스템을 사용하는 것의 이점은 부피 생산성의 증가, 크로마토그래피 매체 용량 이용율의 증가, 완충액 사용 부피의 감소, 및 개별 칼럼 크기의 부피 감소를 포함한다.
완전히 연속적인 생물제조 플랫폼의 실행
현재, 생물약제 제조를 위한 2가지의 지배적인 플랫폼이 존재한다: 안정한 단백질의 생산을 위한 (1) 관류 생물반응기, 및 (2) 유가 배양 생물반응기. 두 경우 모두에서, 본원에 기재된 비제한적 예시적 시스템은 생물반응기의 작동 후에, 정화, 포획, 폴리싱 크로마토그래피, 및 보유 단계를 포함하는 다수의 배치 단위 조작을 제공한다. 이 실시예에 기재된 완전히 연속적인 생산 기술의 예는 능률화된 재조합 치료 단백질의 생산을 가능하게 한다. 이 실시예에서 입증되는 바와 같이, 고능력 클론 및 화학적으로 한정된 배지와 조합된 이러한 예시적 시스템은 정상 상태에서의 작동과 함께, 매우 높은 세포 밀도 및 부피 생산성을 달성할 수 있다. 그 결과, 반응기 규모가 10,000 L를 초과하는 전통적인 방법과 비교하여, 보다 소용량의 생물반응기 (< 500 L)로 충분한 생산 능력이 달성될 수 있다. ATF 세포 분리 장치의 사용은 정화 단위 조작을 제거한다. 가장 중요한 점은, 완전히 연속적인 생산의 직접적 통합이 수거물 보유 탱크를 쓸모 없는 것으로 만들고, 또한 대용량 배치 포획 칼럼을 연속적 시스템에 사용되는 2 자릿수 이하로 더 작은 칼럼으로 대체한다는 것이다. 추가로, 수거된 액체 배양 배지의 연속적 가공은 재조합 치료 단백질의 품질과 관련하여 상당한 이점을 제공한다. 구체적으로, 수거 및 다른 보유 단계의 제거는 표적 재조합 치료 단백질의 효소적, 화학적, 및 물리적 분해에의 노출을 감소시킴으로써, 재조합 치료 단백질의 안정성 위험을 완화시킨다. 요약하면, 재조합 단일클론 항체를 제조하기 위한 소규모의 완전히 연속적인 생물공정 플랫폼의 성공적인 개발은 그의 대규모 산업적 실행에 대한 가능성을 열었다. 이러한 데이터는 예시적인 통합된, 완전히 연속적인 생물공정 시스템이 재조합 치료 단백질의 제조를 위한 전통적인 접근법에 비해 특이한 이점을 제공한다는 것을 보여준다. 예를 들어, 하기 표 3 및 4는 이 실시예에 기재된 예시적 방법 및 시스템에 의해 제공된 일부 이점을 나열한다.
실시예 3. 500 L들이 생물반응기를 포함하는 예시적 2- PCC 시스템
500 L들이 생물반응기 배양물로부터 수거된 재조합 치료 단백질의 연속적 생물공정을 수행하기 위해 하기에 기재된 방법 및 시스템이 사용될 수 있다.
재료 및 방법
세포 배양
500 L의 작업 부피를 갖는 생물반응기를 관류 방식으로 폴리에테르술폰 0.2 ㎛ 필터를 갖는 ATF (리파인 테크놀로지즈) 세포 보류 시스템을 이용하여 작동시켰다. 용해 O2 설정값을 유지하기 위해 O2 기체에 대하여 소결 분사기 (20 ㎛)를 사용하였고, pCO2 설정값을 유지하기 위해 N2 기체에 대하여 천공 분사기 (990 ㎛)를 사용하였다. 세포 배양물에서의 세포 밀도를 오프라인 측정 (Vi-CELL, 베크만 쿨터, 미국 캘리포니아주 브레아 소재)에 의해 또한/또는 온라인 정전용량식 프로브 (푸투라, 아버 인스트루먼츠, 미국 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재)를 통해 모니터링하였다.
<표 3>
2-PCC 시스템의 예시적 이점
Figure pct00005
<표 4>
2-PCC 시스템의 예시적 이점
Figure pct00006
생물반응기의 세포 배양 공정 전개는 화학적으로 한정된 배양 배지 및 재조합 항체 또는 재조합 인간 효소를 분비하는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주를 이용하였다. 접종 직후에 생물반응기 배양물에서의 세포 농도는 0.5 x 106개 세포/mL였다. 세포를 50-60 x 106개 세포/mL까지 성장시켰다. 배양물이 상기 세포 밀도에 도달하면, 세포-블리딩 방법을 개시하여 세포 밀도를 정상 상태에서 유지하였다. 세포 배양물의 관류를 접종 후 24시간에, 1 반응기 부피/일로 개시하고, 관류 속도를 배양물에서의 세포 농도에 비례하여 증가시켰다. 0.04-0.05　nL/세포-d의 정상 상태 세포 특이적 관류 속도를 유지하였다. 생물반응기에서 용해 O2를 공기 포화의 30%를 초과하여 유지하였다. 배양 배지의 pH는 탄산나트륨의 첨가를 통해 6.8 내지 6.95에서 유지하였다. 소포제 (폼어웨이, 깁코, 미국 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재)를 액체 배양 배지에 첨가하여 기포 수준을 조절하였다. 생물반응기로부터 수득된 액체 배양 배지를 추가 정화 없이 단일 PCC 시스템으로 펌핑하였다.
주기적 향류 ( PCC ) 크로마토그래피 시스템
이들 실험에 사용되는 PCC 시스템은 4개의 칼럼까지 전개할 수 있는 맞춤-변형된 AKTA (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 시스템이었다. 시스템은 5개의 UV 모니터 (UV-900), 3개의 펌프 (P-900), 다수의 밸브 (PV-908, SV-903), 1개의 pH 미터 및 1개의 전도도 측정기 (pH/C-900), 및 유니콘-기반 맞춤 소프트웨어 (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)가 설치되었다. 제1 PCCS는 4-칼럼 PCCS이고, 여기서 처음 3개의 칼럼은 단백질 A 결합 수지를 함유하며 유체로부터 재조합 치료 단백질을 포획하는 단위 조작을 수행하고, 제4 칼럼은 유체에 존재하는 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행한다 (예를 들어, 유체를 3.75의 pH에서 약 1시간 동안 보유할 수 있음). 제2 PCCS는 재조합 치료 단백질을 정제하는 단위 조작을 수행하는 총 3개의 크로마토그래피 칼럼 (양이온 교환 수지를 함유함) 및 폴리싱 단위 조작을 수행하는 1개의 크로마토그래피 막 (양이온 교환 수지를 함유함)을 함유한다. 재조합 단백질 약물 물질을 연속적으로 생산하는데 사용되는 제1 및 제2 PCC 시스템의 비 유량 및 다른 특성이 각각 표 5 및 6에 나타나 있다.
<표 5>
제1 PCCS의 작동 파라미터
Figure pct00007
Figure pct00008
<표 6>
제2 PCCS의 작동 파라미터
Figure pct00009
Figure pct00010
누출 곡선
각각의 PCC 시스템을 위한 적절한 칼럼 스위칭 전략을 결정하기 위해 단백질 누출 곡선이 필요하다. 포획 조건하에서의 누출 곡선을 얻기 위해, 정면 로딩 실험을 수행하였다. 동적 결합능 (DBC)을 정화 수거물 및 UV 흡광도 (280 nm)에 의해 측정된 누출 프로파일을 사용하여 체류 시간의 함수로서 평가하였다. DBC의 측정을 위해 재조합 치료 항체 및 재조합 치료 인간 효소 각각에 대하여 6.0 mL 및 1.0 mL의 칼럼 크기를 사용하였다. 로딩 시간이 나머지 칼럼 조작 (세척, 용리, 재생 등)보다 더 연장되도록 보장함과 동시에, 체류 시간이 결합능 요건을 만족시킬 정도로 충분히 연장되도록, 체류 시간을 선택하였다.
단일 PCC 시스템의 생물반응기와의 통합
PCC 시스템에서, 시스템의 제1 칼럼으로부터의 누출이 시스템의 제2 칼럼에서 포획될 수 있으므로, 칼럼에서의 단백질의 체류 시간 (RT)은 칼럼 크기의 증가 없이 감소할 수 있다. 이러한 특이한 특징은 배양 수거물이 방정식 1에 의해 약술된 바와 같이, 칼럼 부피 (V) 및 RT를 변화시킴으로써 임의의 관류 속도 (D)로 가공될 수 있도록 하는 연속적 공정을 설계하는데 사용되었다.
V = D * RT (1)
재조합 단백질의 연속적 포획을 달성하기 위해, 제1 단일 PCCS가 도 2에 도시된 바와 같이 생물반응기와 직접 연결되었다. 생물반응기/ATF로부터의 수거물은 소용량 서지 용기로서 작용하는 2 L들이 일회용 백 (하이클론, 미국 유타주 로건 소재)으로 연동 펌프 (마스터플렉스, 콜파머, 미국 일리노이주 버넌 힐스 소재)를 사용하여 펌핑되었다. 생물반응기와 서지 백의 사이에 추가 멸균 격막으로서 0.2 ㎛ 필터 (밀리팩 40, 밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌레리카 소재)가 추가되었다. 맵셀렉트 슈어 (지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 칼럼이 재조합 치료 항체 및 재조합 치료 인간 효소를 각각 포획하는데 사용되었다. 각 칼럼의 조작은 평형화, 로딩, 세척, 용리, 및 재생 단계로 이루어졌다. 실험실 규모의 단일 PCC 시스템의 공학은 폐쇄 조작을 허용하지 않으므로, 소듐 아지드가 공정 스트림에 인라인 첨가되었다.
분석 방법
재조합 항체
자체 분석법이 숙주 세포 단백질 (HCP), 응집, 잔류 단백질 A, 및 재조합 항체의 효능에 대한 역가의 정량화를 위해 사용되었다. 역가는 단백질 A 칼럼 (어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)을 사용하여 측정하였다. 잔류 단백질 A 및 HCP는 자체 생산된 항원 및 항체를 사용하여 ELISA에 의해 정량화하였다. 응집은 TSK-GEL, G3000SWXL, 7.8 mM X 30 cm, 5 ㎛ 칼럼 (토소 하스, 미국 펜실베니아주 킹오브프러시아 소재)을 사용하여 HPLC-SEC에 의해 측정하였다. 재조합 항체 효능은 시험관내 세포-기반 분석법에 의해 측정하였다.
단일 PCC 시스템의 기본 개념
칼럼 조작은 일반적으로 로딩, 세척, 용리, 및 재생 단계로 이루어진다. 각각의 PCC 시스템에서, 다수의 칼럼이 동일한 단계를 순환하는 방식으로 별도로 연속적으로 실행하는데 사용될 것이다. 칼럼이 직렬로 조작되므로, 하나의 칼럼으로부터의 통과액 및 세척액은 제2 칼럼에 의해 포획된다. PCC 시스템의 이러한 특이한 특징은 배치식 크로마토그래피 동안에 전형적인 동적 결합능 대신에, 정적 결합능에 근접한 수지의 로딩을 허용한다. 예시의 용이함을 위해, PCC 시스템 작동의 이러한 원리를 설명하기 위해 3-칼럼 시스템이 사용된다 (도 3). 사이클은 3개의 별개의 용리 풀을 초래하는 3개의 완료된 칼럼 조작으로서 정의된다. 사이클에서 모든 단계가 완료되었을 때, 사이클은 재시작된다. 그 결과, PCC 시스템의 작동에서 공급물 스트림이 연속적으로 가공되고, 각 칼럼으로부터의 재조합 치료 단백질 용리는 독립적이며 주기적이다.
칼럼 스위칭 전략
PCC 시스템 사이클 (도 3) 내에서 하나의 단계로부터 또 다른 단계로 진행하기 위해서, 칼럼-스위칭 전략이 이용된다. PCC 시스템에서 칼럼 당 2개의 자동식 스위칭 작동이 필요하고, 그 중 첫번째 것은 초기 재조합 치료 단백질 누출과 관련이 있고, 반면에 두번째 것은 칼럼 포화와 일치한다. 이 실시예에서 설명된 단일 PCC 시스템은 각각 동적 UV 모니터링을 이용하는 조절 전략을 사용하여 작동되었다. 일반적으로, 칼럼 스위칭은 피드백 조절과 함께 재조합 치료 단백질 농도를 인라인 측정할 수 있는 임의의 공정 분석 기술 (PAT) 기구에 의해 결정될 수 있다. 그러나, 실시간으로 작동되는 PAT 기구, 예컨대 UV는 칼럼 스위칭을 위한 촉발 신호를 제공하는데 있어서 이상적이다.
도 4는 공급물 유입구와 칼럼 유출구 사이의 UV 흡광도 차이 (ΔUV)에 기초한 칼럼 스위칭의 원리를 도시한다. 칼럼 로딩 (단계 1; 도 3) 동안에, PCC 조절 시스템은 흡광도가 안정화되었을 때 불순물 기준선을 결정한다. 재조합 치료 단백질이 누출될 때 (단계 2; 도 3), 유출구 UV 신호가 불순물 기준선보다 증가한다. ΔUV가 미리 결정된 역치 (예컨대, 재조합 치료 단백질의 3% 누출)에 도달하면, 칼럼 1로부터의 통과액이 폐기물 대신에 칼럼 2로 향한다 (t1; 도 4). 칼럼 1이 재조합 치료 단백질로 거의 포화되고 ΔUV가 미리 결정된 값에 도달하면 (t2; 도 4), 공급물은 칼럼 2로 스위칭된다. 이러한 ΔUV-기반 칼럼 스위칭 전략의 중요한 이점은 이것이 공급물 재조합 치료 단백질 농도 및 칼럼 용량과 상관없이 칼럼의 균일한 로딩을 허용한다는 것이다. 적정한 범위 내에서, 전략은 수거물 역가 변동성에 있어서 적절하고, 그에 의해 시스템의 강건성을 향상시킨다.
공급물과 칼럼 유출구 사이의 UV 흡광도 차이에 기초한, 칼럼-스위칭 시간의 정확한 결정은 각각의 단일 PCC 시스템 실시간 조절 전략의 중요한 요소 중 하나이다. 이를 위해 5개의 UV 검출기 (1개의 공급물 검출기 및 4개의 칼럼 유출구 검출기)를 모두 좁은 범위 내에서 동기화할 필요가 있다. UV 검출기는 3% 아세톤 용액을 사용하여 보정되었다. 검출기 경로 길이는 5개의 흡광도 값이 모두 서로에 대하여 0.5% 이내에 있도록 수동으로 조정되었다. 경로 길이 조정은 ≤ 10%였다.
다른 실시양태
본 발명이 그의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 상기 기재내용은 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의되는 그의 범주를 제한하려는 것이 아님을 이해하여야 한다. 다른 측면, 이점 및 수정도 하기 청구범위의 범주 내에 포함된다.

Claims (111)

  1. (i) 세포가 실질적으로 존재하지 않는 재조합 치료 단백질을 포함하는 액체 배양 배지를 제공하는데, 여기서 액체 배양 배지는 제1 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS1)으로 공급되고;
    (ii) MCCS1을 사용하여 액체 배양 배지 중의 상기 재조합 치료 단백질을 포획하며, 여기서 재조합 치료 단백질을 함유하는 MCCS1의 용리액은 제2 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS2)으로 연속적으로 공급되고;
    (iii) MCCS2를 사용하여 재조합 치료 단백질을 정제하고 폴리싱(polishing)하는데, 여기서 MCCS2의 용리액이 치료 단백질 약물 물질인 것
    을 포함하고, 상기 액체 배양 배지부터 치료 단백질 약물 물질인 MCCS2의 용리액까지 통합되고 연속적으로 전개되는, 치료 단백질 약물 물질의 통합된 연속적 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 액체 배양 배지가 재조합 치료 단백질을 분비하는 포유류 세포의 배양물을 함유하는 관류 생물반응기로부터 제거된 액체 배양 배지, 재조합 치료 단백질을 분비하는 포유류 세포의 배양물을 함유하는 유가 배양 생물반응기로부터 제거된 액체 배양 배지, 및 재조합 치료 단백질을 분비하는 박테리아 또는 효모 세포의 배양물로부터의 정화된 액체 배양 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, MCCS1 및/또는 MCCS2가 2개 이상의 상이한 단위 조작을 수행하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, MCCS1 또는 MCCS2, 또는 이들 둘 모두의 사용이 칼럼 스위칭을 포함하는 것인 방법.
  5. 제3항에 있어서, MCCS1이 재조합 치료 단백질을 포획하고 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행하는 것인 방법.
  6. 제3항에 있어서, MCCS2가 재조합 치료 단백질을 정제하고 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, MCCS1 및/또는 MCCS2가 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼을 이용하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, MCCS1 및/또는 MCCS2가 2개 이상의 크로마토그래피 막을 이용하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, MCCS1 및/또는 MCCS2가 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 및 1개 이상의 크로마토그래피 막을 이용하는 것인 방법.
  10. 제2항에 있어서, 액체 배양 배지가 재조합 치료 단백질을 분비하는 포유류 세포의 배양물을 함유하는 관류 생물반응기로부터 제거된 액체 배양 배지인 방법.
  11. 제1항에 있어서, MCCS1이 제1 주기적 향류 크로마토그래피 시스템 (PCCS1)인 방법.
  12. 제11항에 있어서, PCCS1이 4-칼럼 PCCS를 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 4-칼럼 PCCS에서 4개의 칼럼 중 3개가 액체 배양 배지로부터 재조합 치료 단백질을 포획하는 단위 조작을 수행하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 포획이 친화 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 또는 분자체 크로마토그래피를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 친화 크로마토그래피가 단백질 A-결합 포획 메카니즘, 기질-결합 포획 메카니즘, 항체- 또는 항체 단편-결합 포획 메카니즘, 앱타머(aptamer)-결합 포획 메카니즘, 및 보조인자-결합 포획 메카니즘으로 이루어진 군으로부터 선택된 포획 메카니즘으로 수행되는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 친화 크로마토그래피가 단백질 A-결합 포획 메카니즘으로 수행되고, 재조합 치료 단백질이 항체 또는 항체 단편인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 4-칼럼 PCCS의 4개의 칼럼 중 3개로부터의 재조합 치료 단백질을 함유하는 용리액이 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼으로 공급되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼이 바이러스 불활성화를 위해 재조합 치료 단백질을 함유하는 용리액을 낮은 pH에서 유지함으로써 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼이 바이러스 불활성화를 위해 재조합 치료 단백질을 함유하는 용리액을 약 10분 내지 약 1.5시간의 기간 동안 낮은 pH에서 유지하는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, MCCS2가 제2 주기적 향류 (PCCS2) 크로마토그래피 시스템인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼으로부터의 용리액이 PCCS2에 공급되기 전에 인라인(in-line) 완충액 조정 저장소를 사용하여 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼으로부터의 용리액의 pH를 조정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, PCCS2 크로마토그래피 시스템이 3개의 크로마토그래피 칼럼 및 크로마토그래피 막을 포함하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, PCCS2의 3개의 크로마토그래피 칼럼이 PCCS1의 용리액으로부터의 재조합 치료 단백질을 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제하는 단위 조작을 수행하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, PCCS2의 3개의 크로마토그래피 칼럼으로부터의 용리액이 PCCS2의 크로마토그래피 막으로 공급되는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, PCCS2의 크로마토그래피 막이 PCCS2의 3개의 크로마토그래피 칼럼으로부터의 용리액에 존재하는 재조합 치료 단백질을 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 폴리싱하는 단위 기능을 수행하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, PCCS2의 크로마토그래피 막이 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 폴리싱하는 단위 기능을 수행하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 크로마토그래피 막의 통과액 및 세척액이 치료 단백질 약물 물질인 방법.
  28. 제1항에 있어서, 치료 단백질 약물 물질을 제약 조성물로 제형화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  29. 제1항에 있어서, 재조합 치료 단백질이 항체 또는 항체 단편, 효소, 가공 단백질, 또는 면역원성 단백질 또는 단백질 단편인 방법.
  30. 제23항에 있어서, PCCS2의 3개의 칼럼으로부터의 용리액이 PCCS2의 크로마토그래피 막에 공급되기 전에 인라인 완충액 조정을 사용하여 PCCS2의 3개의 칼럼으로부터의 용리액의 이온 농도를 조정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  31. 제20항에 있어서, PCCS1과 PCCS2의 사이에 브레이크 탱크(break tank)를 사용하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  32. 제20항에 있어서, PCCS1로부터의 용리액이 PCCS2에 공급되기 전에 이 용리액을 여과하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  33. 제1항에 있어서, 액체 배양 배지가 MCCS1에 공급되기 전에 이 액체 배양 배지를 여과하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  34. (i) 재조합 치료 단백질을 분비하는 포유류 세포를 액체 배양 배지를 함유하는 관류 생물반응기에서 배양하는데, 여기서 세포가 실질적으로 존재하지 않는 액체 배양 배지의 일정 부피는 관류 생물반응기로부터 연속적으로 또는 주기적으로 제거되어 제1 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS1)으로 공급되고;
    (ii) 제거된 액체 배양 배지 중의 상기 재조합 치료 단백질을 MCCS1을 사용하여 포획하며, 여기서 재조합 치료 단백질을 함유하는 MCCS1의 용리액은 제2 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS2)으로 연속적으로 공급되고;
    (iii) MCCS1의 용리액 중의 치료 재조합 단백질을 MCCS2를 사용하여 정제하고 폴리싱하는데, 여기서 MCCS2의 용리액이 치료 단백질 약물 물질인 것
    을 포함하고, 상기 제거된 액체 배양 배지부터 치료 단백질 약물 물질인 MCCS2의 용리액까지 통합되고 연속적으로 전개되는, 치료 단백질 약물 물질의 통합된 연속적 제조 방법.
  35. 제34항에 있어서, MCCS1 및/또는 MCCS2가 2개 이상의 상이한 단위 조작을 수행하는 것인 방법.
  36. 제34항에 있어서, MCCS1 또는 MCCS2, 또는 이들 둘 모두의 사용이 칼럼 스위칭을 포함하는 것인 방법.
  37. 제35항에 있어서, MCCS1이 재조합 치료 단백질을 포획하고 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행하는 것인 방법.
  38. 제35항에 있어서, MCCS2가 재조합 치료 단백질을 정제하고 폴리싱하는 단위 조작을 수행하는 것인 방법.
  39. 제34항에 있어서, MCCS1 및/또는 MCCS2가 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼을 이용하는 것인 방법.
  40. 제34항에 있어서, MCCS1 및/또는 MCCS2가 2개 이상의 크로마토그래피 막을 이용하는 것인 방법.
  41. 제34항에 있어서, MCCS1 및/또는 MCCS2가 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 및 1개 이상의 크로마토그래피 막을 이용하는 것인 방법.
  42. 제34항에 있어서, MCCS1이 제1 주기적 향류 크로마토그래피 시스템 (PCCS1)인 방법.
  43. 제42항에 있어서, PCCS1이 4-칼럼 PCCS를 포함하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 4-칼럼 PCCS에서 4개의 칼럼 중 3개가 액체 배양 배지로부터 재조합 치료 단백질을 포획하는 단위 조작을 수행하는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 포획이 친화 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 또는 분자체 크로마토그래피를 사용하여 수행되는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 친화 크로마토그래피가 단백질 A-결합 포획 메카니즘, 기질-결합 포획 메카니즘, 항체- 또는 항체 단편-결합 포획 메카니즘, 앱타머-결합 포획 메카니즘, 및 보조인자-결합 포획 메카니즘으로 이루어진 군으로부터 선택된 포획 메카니즘으로 수행되는 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 친화 크로마토그래피가 단백질 A-결합 포획 메카니즘으로 수행되고, 재조합 치료 단백질이 항체 또는 항체 단편인 방법.
  48. 제44항에 있어서, 4-칼럼 PCCS의 4개의 칼럼 중 3개로부터의 재조합 치료 단백질을 함유하는 용리액이 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼으로 공급되는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼이 바이러스 불활성화를 위해 재조합 치료 단백질을 함유하는 용리액을 낮은 pH에서 유지함으로써 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행하는 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼이 바이러스 불활성화를 위해 재조합 치료 단백질을 함유하는 용리액을 약 10분 내지 약 1.5시간의 기간 동안 낮은 pH에서 유지하는 것인 방법.
  51. 제49항에 있어서, MCCS2가 제2 주기적 향류 (PCCS2) 크로마토그래피 시스템인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼으로부터의 용리액이 PCCS2로 공급되기 전에 인라인 완충액 조정 저장소를 사용하여 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼으로부터의 용리액의 pH를 조정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, PCCS2 크로마토그래피 시스템이 3개의 크로마토그래피 칼럼 및 크로마토그래피 막을 포함하는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, PCCS2의 3개의 크로마토그래피 칼럼이 PCCS1의 용리액으로부터의 재조합 치료 단백질을 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제하는 단위 조작을 수행하는 것인 방법.
  55. 제54항에 있어서, PCCS2의 3개의 크로마토그래피 칼럼으로부터의 용리액이 PCCS2의 크로마토그래피 막으로 공급되는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, PCCS2의 크로마토그래피 막이 PCCS2의 3개의 크로마토그래피 칼럼으로부터의 용리액에 존재하는 재조합 치료 단백질을 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 폴리싱하는 단위 기능을 수행하는 것인 방법.
  57. 제56항에 있어서, PCCS2의 크로마토그래피 막이 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 폴리싱하는 단위 기능을 수행하는 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 크로마토그래피 막의 통과액 및 세척액이 치료 단백질 약물 물질인 방법.
  59. 제34항에 있어서, 치료 단백질 약물 물질을 제약 조성물로 제형화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  60. 제34항에 있어서, 재조합 치료 단백질이 항체 또는 항체 단편, 효소, 가공 단백질, 또는 면역원성 단백질 또는 단백질 단편인 방법.
  61. 제54항에 있어서, PCCS2의 3개의 칼럼으로부터의 용리액이 PCCS2의 크로마토그래피 막으로 공급되기 전에 인라인 완충액 조정을 사용하여 PCCS2의 3개의 칼럼으로부터의 용리액의 이온 농도를 조정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  62. 제51항에 있어서, PCCS1과 PCCS2의 사이에 브레이크 탱크를 사용하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  63. 제51항에 있어서, PCCS1로부터의 용리액이 PCCS2에 공급되기 전에 이 용리액을 여과하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  64. 제34항에 있어서, 액체 배양 배지가 MCCS1에 공급되기 전에 이 액체 배양 배지를 여과하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  65. 유입구를 포함하는 제1 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS); 및
    유출구를 포함하는 제2 MCCS
    를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 MCCS는 서로 유체 연통되는 것인, 유체가 유입구로 들어가서, 제1 및 제2 MCCS를 거쳐, 유출구를 통해 제조 시스템에서 나오도록 구성된 생물학적 제조 시스템.
  66. 제65항에 있어서, 생물반응기를 추가로 포함하고, 여기서 생물반응기 및 유입구는 서로 유체 연통되는 것인, 생물반응기에 존재하는 유체가 유입구로 들어갈 수 있도록 구성된 제조 시스템.
  67. 제65항에 있어서, 제1 MCCS 또는 제2 MCCS, 또는 이들 둘 모두가 2개 이상의 별개의 단위 조작을 수행하도록 구성된 것인 시스템.
  68. 제65항에 있어서, MCCS1 또는 MCCS2, 또는 이들 둘 모두의 사용이 칼럼 스위칭을 포함하는 것인 시스템.
  69. 제67항에 있어서, 제1 MCCS가 재조합 치료 단백질을 포획하고 바이러스를 불활성화하는 단위 조작을 수행하도록 구성된 것인 시스템.
  70. 제67항에 있어서, 제2 MCCS가 재조합 치료 단백질을 정제하고 폴리싱하는 단위 조작을 수행하도록 구성된 것인 시스템.
  71. 제65항에 있어서, 제1 MCCS 또는 제2 MCCS, 또는 이들 둘 모두가 2개 이상의 크로마토그래피 칼럼을 함유하는 것인 시스템.
  72. 제65항에 있어서, 제1 MCCS 또는 제2 MCCS, 또는 이들 둘 모두가 2개 이상의 크로마토그래피 막을 함유하는 것인 시스템.
  73. 제65항에 있어서, 제1 MCCS 또는 제2 MCCS, 또는 이들 둘 모두가 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼 및 1개 이상의 크로마토그래피 막을 함유하는 것인 시스템.
  74. 제65항에 있어서, 제1 MCCS가 제1 주기적 향류 크로마토그래피 시스템 (PCCS1)인 시스템.
  75. 제74항에 있어서, PCCS1이 4-칼럼 PCCS를 포함하는 것인 시스템.
  76. 제75항에 있어서, 4-칼럼 PCCS에서 4개의 칼럼 중 3개가 액체 배양 배지로부터 재조합 치료 단백질을 포획할 수 있는 것인 시스템.
  77. 제76항에 있어서, 4-칼럼 PCCS에서 4개의 칼럼 중 3개가 친화 크로마토그래피 칼럼, 양이온 크로마토그래피 칼럼, 음이온 크로마토그래피 칼럼, 및 분자체 크로마토그래피 칼럼 중 1개 이상을 포함하는 것인 시스템.
  78. 제77항에 있어서, 4-칼럼 PCCS에서 4개의 칼럼 중 3개가 단백질 A-결합 포획 메카니즘, 기질-결합 포획 메카니즘, 항체- 또는 항체 단편-결합 포획 메카니즘, 앱타머-결합 포획 메카니즘, 및 보조인자-결합 포획 메카니즘으로 이루어진 군으로부터 선택된 포획 메카니즘을 이용하는 친화 크로마토그래피 칼럼 중 1개 이상을 포함하는 것인 시스템.
  79. 제76항에 있어서, 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼이 바이러스 불활성화를 위해 재조합 치료 단백질을 함유하는 4-칼럼 PCCS의 4개의 칼럼 중 3개로부터의 용리액을 낮은 pH에서 유지할 수 있는 저장소 또는 칼럼인 시스템.
  80. 제79항에 있어서, 4-칼럼 PCCS의 제4 칼럼이 바이러스 불활성화를 위해 4-칼럼 PCCS의 4개의 칼럼 중 3개로부터의 재조합 치료 단백질을 함유하는 용리액을 약 10분 내지 약 1.5시간의 기간 동안 낮은 pH에서 유지할 수 있는 것인 시스템.
  81. 제79항에 있어서, 제2 MCCS가 제2 주기적 향류 크로마토그래피 시스템 (PCCS2)인 시스템.
  82. 제65항에 있어서, 제1 MCCS와 제2 MCCS 사이에 배치된 유체 도관을 추가로 포함하는 시스템.
  83. 제82항에 있어서, 제1 MCCS와 제2 MCCS 사이에 배치된 유체 도관과 유체 연통되고, 인라인 완충액 조정 저장소 내에 함유된 완충액이 제1 MCCS와 제2 MCCS 사이에 배치된 유체 도관에 존재하는 유체로 도입되도록 구성된 인라인 완충액 조정 저장소를 추가로 포함하는 시스템.
  84. 제82항에 있어서, 제1 MCCS와 제2 MCCS 사이의 유체 도관에 배치되고, 제1 MCCS와 제2 MCCS 사이의 유체 도관에 존재하는 유체로부터 미립자 물질을 제거할 수 있도록 구성된 필터를 추가로 포함하는 시스템.
  85. 제81항에 있어서, PCCS2가 3개의 크로마토그래피 칼럼 및 크로마토그래피 막을 포함하는 것인 시스템.
  86. 제85항에 있어서, PCCS2의 3개의 크로마토그래피 칼럼과 PCCS2의 크로마토그래피 막 사이에 배치된 유체 도관을 추가로 포함하는 시스템.
  87. 제86항에 있어서, PCCS2의 3개의 크로마토그래피 칼럼과 PCCS2의 크로마토그래피 막 사이에 배치된 유체 도관과 유체 연통되고, 인라인 완충액 조정 저장소 내에 함유된 완충액이 PCCS2의 3개의 크로마토그래피 칼럼과 PCCS2의 크로마토그래피 막 사이에 배치된 유체 도관에 존재하는 유체에 도입되도록 구성된 인라인 완충액 조정 저장소를 추가로 포함하는 시스템.
  88. 제85항에 있어서, PCCS2의 3개의 크로마토그래피 칼럼이 재조합 치료 단백질을 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제할 수 있는 것인 시스템.
  89. 제85항에 있어서, PCCS2의 크로마토그래피 막이 양이온 교환 크로마토그래피 막인 시스템.
  90. 제85항에 있어서, PCCS2의 크로마토그래피 막과 유출구 사이에 유체 도관을 추가로 포함하는 시스템.
  91. 제90항에 있어서, PCCS2의 크로마토그래피 막과 유출구 사이의 유체 도관에 배치되고, PCCS2의 크로마토그래피 막과 유출구 사이의 유체 도관에 존재하는 유체로부터 미립자 물질을 제거할 수 있도록 구성된 필터를 추가로 포함하는 시스템.
  92. 제65항에 있어서, 유입구와 유체 연통되는 펌프 시스템을 추가로 포함하는 시스템.
  93. 제92항에 있어서, 펌프 시스템이 유체를 유입구로 밀어낼 수 있는 펌프를 포함하는 것인 시스템.
  94. 제92항에 있어서, 펌프와 유입구 사이에 배치된 유체 도관을 추가로 포함하는 시스템.
  95. 제94항에 있어서, 펌프와 유입구 사이의 유체 도관에 배치되고, 펌프와 유입구 사이의 유체 도관에 존재하는 유체로부터 미립자 물질을 제거할 수 있도록 구성된 필터를 추가로 포함하는 시스템.
  96. 제94항에 있어서, 펌프와 유입구 사이의 유체 도관에 배치되고, 펌프와 유입구 사이의 유체 도관과 유체 연통되며, 유입구에 들어갈 수 없는 유체 도관에 존재하는 임의의 유체를 저장할 수 있도록 구성된 브레이크 탱크를 추가로 포함하는 시스템.
  97. 제65항에 있어서, 제1 MCCS 및 제2 MCCS가 스키드(skid) 상에 배치된 것인 시스템.
  98. 제97항에 있어서, 스키드가 이동을 가능하게 하는 1개 이상의 구조를 포함하는 것인 시스템.
  99. 제65항에 있어서, 제1 MCCS가 제1 스키드 상에 배치된 것인 시스템.
  100. 제99항에 있어서, 제2 MCCS가 제2 스키드 상에 배치된 것인 시스템.
  101. 제100항에 있어서, 제1 및 제2 스키드가 각각 이동을 가능하게 하는 1개 이상의 구조를 포함하는 것인 시스템.
  102. 제65항에 있어서, 전체 시스템이 스키드 상에 배치된 시스템.
  103. 제102항에 있어서, 스키드가 이동을 가능하게 하는 1개 이상의 구조를 포함하는 것인 시스템.
  104. 제66항에 있어서, 전체 시스템이 스키드 상에 배치된 시스템.
  105. 제104항에 있어서, 스키드가 이동을 가능하게 하는 1개 이상의 구조를 포함하는 것인 시스템.
  106. 제65항에 있어서, 브레이크 탱크를 포함하지 않는 시스템.
  107. 2개 이상의 서브시스템을 포함하고, 여기서 2개 이상의 서브시스템은 각각:
    (i) 유입구를 포함하는 제1 다중 칼럼 크로마토그래피 시스템 (MCCS); 및
    (ii) 유출구를 포함하는 제2 MCCS
    를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 MCCS는 서로 유체 연통되는 것이며, 2개 이상의 서브시스템은 이들이 각각 유체를 함유하는 단일 저장소와 유체 연통되고, 단일 저장소로부터의 유체가 2개 이상의 서브시스템의 유입구로 들어가도록 구성된 것인, 유체가 유입구로 들어가서, 제1 및 제2 MCCS를 거쳐, 유출구를 통해 제조 시스템에서 나올 수 있도록 구성된 생물학적 제조 시스템.
  108. 제107항에 있어서, 2개 이상의 서브시스템이 각각 그 자체를 위한 스키드 상에 배치된 것인 시스템.
  109. 제108항에 있어서, 스키드가 이동을 가능하게 하는 1개 이상의 구조를 포함하는 것인 시스템.
  110. 제107항에 있어서, 전체 시스템이 스키드 상에 배치된 시스템.
  111. 제110항에 있어서, 스키드가 이동을 가능하게 하는 1개 이상의 구조를 포함하는 것인 시스템.
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