TW200918089A - Humanized anti-CD79b antibodies and immunoconjugates and methods of use - Google Patents

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Mark Dennis
Kristi Elkins
Jagath Reddy Junutula
Andrew Polson
Bing Zheng
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200918089 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係針對適用於治療哺乳動物之造血組織腫瘤之物 質組合物及使用彼等物質組合物來治療該造血組織腫瘤之 方法。 相關申請案之交又參考 根據37 CFR §l，53(b)申請之此非臨時申請案主張根據 35 USC §119(e)於2007年7月16曰申請之美國臨時申請案 第60/950,088號的權益，該臨時申請案係以全文引用之方 式併入本文中。 【先前技術】 惡性腫瘤（癌症）係在美國繼心臟病後之第二位主要死亡 原因（Boring等人，a cwe/，43:7 (1993))。癌症 之特徵為源自於正常組織且發生增生形成腫瘤塊之異常或 贅生性細胞的數目之增加、此等贅生性腫瘤細胞對相鄰組 織之侵入及最終經由血液或淋巴系統擴散至區域淋巴結且 經由稱為癌轉移之過程擴散至遠處部位之惡性細胞的產 生。在癌性狀態下，細胞在正常細胞不會生長之條件下發 生増生。癌症自身以各種形式表現，其特徵為不同程度之 侵入性及侵襲性。 涉及在血細胞生成（亦即，一種產生諸如淋巴細胞、白 血球、血小板、紅血球及自然殺手細胞之血液細胞要素的 過程）期間產生之細胞的癌症被稱為造血癌。可見於血液 及淋巴組織中且對於免疫反應至關重要之淋巴細胞被分類 132799.doc 200918089 為兩個主要淋巴細胞類別：B淋巴細胞（B細胞）及T淋巴細 胞（Τ細胞），其分別介導體液及細胞免疫。 Β細胞在骨髓内成熟且離開骨髓，從而於其細胞表面上 表現抗原結合抗體。當初始Β細胞初次遇到抗原（該細胞之 膜結合抗體對其具特異性）時，該細胞開始快速分裂且其 子代分化為記憶Β細胞及稱為”漿細胞"之效應細胞。記憶Β 細胞具有較長壽命且繼續以與原始母細胞相同之特異性表 現膜結合抗體。漿細胞並不產生膜結合抗體，而是產生可 分泌形式之抗體。分泌性抗體為體液免疫之主要效應分 子。 Β細胞相關病症包括（但不限於）惡性淋巴瘤（非霍奇金氏 淋巴瘤（Non-Hodgkin’s Lymphoma)，NHL)、多發性骨髓瘤 (MM)及慢性淋巴細胞性白血病（CLL，B細胞白血病+ B淋巴細胞））。非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)，亦即一組主要由 B淋巴細胞引起之異質性癌症佔所有新確診癌症之大約々％ (Jemal，A.等人，CA_Cancer j CUn，52: 23 47 (2〇〇2))。侵 襲性NHL佔成人NHL之大約3〇_4〇% nl等人，
Hematol. J” 1:53-66 (20G1))且包括彌漫性大B細胞淋巴瘤 (DLBCL)、套細胞淋巴瘤（MCL)、周邊了細胞淋巴瘤及多形 性大細胞淋巴瘤。前線組合化學療法治癒不到一半之侵襲 性祖患者，且大多數患者最終死於其疾病（F—，RJ，
Semin. Oncol，27(增刊 12): 2-8 (2000)) 〇 Τ細胞在為未成熟丁細胞增生及分化提供環境之胸腺内成 熟。在Τ細胞成熟期間’ Τ細胞經受產生Τ細胞受體之基因 132799.doc 200918089 重排及可幫助確定成熟τ細胞之細胞表面表型之陽性與陰 性選擇。成熟Τ細胞之特徵細胞表面標記為CD3:T細胞受 體複合物及辅受體CD4或CD8中之一者。 在曰在發現癌症療法之有效細胞乾的嘗試中，研究人員 已設法鑑別與於一或多種正常非癌細胞上相比於一或多種 特定類型之癌細胞之表面上特異性表現的跨膜或者膜相關 多肽。與於非癌細胞之表面上相比，該等臈相關多肽常常 更大量地表現於癌細胞之表面上。該等腫瘤相關細胞表面 抗原多肽之鑑別已產生特異性靶向癌細胞以經由基於抗體 之療法將其破壞的能力。就此而言，應注意基於抗體之療 法已證明對於治療某些癌症非常有效。舉例而言， HERCEPTIN®及 RITUXAN®(兩者皆來自 Genentech Inc.，
South San Francisco, CaHfornia)為分別已成功地用於治療 乳腺癌及非霍奇金氏淋巴瘤之抗體。更具體而言， HERCEPTIN®為重組DNA源性人類化單株抗體，其選擇性 結合至人類表皮生長因子受體2(HER2)原癌基因之細胞外 域。在25-30%之原發性乳腺癌中觀察到HER2蛋白質過表 現。RITUXAN®為針對存在於正常及惡性B淋巴細胞之表 面上之CD20抗原的遺傳工程化嵌合鼠類/人類單株抗體。 此等抗體皆於CHO細胞中重組產生。 在旨在發現癌症療法之有效細胞靶的其他嘗試中，研究 人員已設法鑑別（1)與由一或多種特定類型之非癌性正常細 胞相比，由一或多種特定類型之癌細胞特異性產生的非膜 相關多肽；（2)由癌細胞以顯著高於_或多種正常非癌細胞 132799.doc 200918089 之表現量產生的容日备. ’或（3)表現明確地僅限於癌性及非癌
i 性狀態下之單-(或極其有限數目之不同)組織類型(例如正 常前列腺及前列腺腫瘤組織)的多肽。該等多肽可保持位 於細胞内或可由癌細胞分泌。此外，豸等多肽可能並非由 癌細胞自身表現，而是由產生及/或分泌對癌細胞具有增 強或促生長效應之多肽之細胞表現。該等分泌性多狀常常 為提供給癌細胞超過正常細胞之生長優勢且包括諸如血管 生成因子、細胞黏附因+、生長因子及其類似物之物質的 蛋白質。將預期鐘別該等非膜相關多月太之拮抗劑可用作治 療該等癌症之有效治療劑。此外，鑑別該等多肽之表現模 式將適用於診斷哺乳動物之特定癌症。 儘管哺乳動物癌症療法已取得上述確定之進步，但極其 需要分別能夠偵測哺乳動物㈣瘤之存在及有效抑制資生 性細胞生長的其他治療劑。因此，本發明之一目的在於鑑 別表現明確地僅限於癌性及非癌性狀態下之單一（或極其 有限數目之不同）組織類型（亦即造血組織）的多肽（亦即細 胞膜相關、分泌性或細胞内多肽），且在於使用彼等多肽 及其編碼核酸來製備適用於哺乳動物之造血癌之治療性治 療及/或偵測的物質組合物。 CD79為由含有 CD79a(Ig<x，mb-Ι)及 CD79b(Igp，B29)之 共仏異質一聚體組成之B細胞受體的信號轉導組分。 CD79a及CD79b各自含有細胞外免疫球蛋白（Ig)域、跨膜域 及細胞内信號轉導域、基於免疫受體酪胺酸之活化基元 (ITAM)域。CD79係於b細胞上及於非霍奇金氏淋巴瘤細胞 132799.doc 200918089 (NHL)中被表現（Cabezudo 等人，^^/^^/^^,84:413-418 (1999); D’Arena等人，乂讲· 乂 64: 275-281 (2000)，Olejniczak 等人，/www/io/ 35: 93-114 (2006))。CD79a及CD79b及slg均為CD79之表面表現所需 (Matsuuchi等人，Cwrr. Opk. /www„0/，13(3): 270-7)。 CD79b於NHL上之平均表面表現類似於於正常b細胞上之 表現，但範圍更大（Matsuuchi等人，Cwrr. Ορίπ. /讀狀〇厂， 13(3): 270-7 (2001))= 假定表現CD79b，則有益於產生CD79b抗原之治療性抗 體’其在投與患者’尤其用於慢性治療時，形成最小抗原 性或無抗原性。本發明滿足此需要及其他需要。本發明提 供可克服當前治療性組合物之侷限性以及提供根據下文詳 細描述將顯而易見之其他優點的抗_CD79b抗體。 在治療癌症中使用抗體-藥物結合物（ADC)(亦即免疫結 合物）局部傳遞細胞毒性劑或細胞抑制劑（亦即用於殺死或 抑制腫瘤細胞之藥物）（Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu 等人（2005)Nature
Biotechnology 23(9):1137-1146: Payne， G. (2003) Cancer Cell 3:207-212 ; Syrigos 及 Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614 ; Niculescu-Duvaz及 Springer (1997) Adv· Drug Del. Rev. 26:151-172 ; US 4975278)允許將藥物 部分粗向傳遞至腫瘤，及於其中細胞内積累，其中全身性 投與此等非結合藥物藥劑可能會導致正常細胞不可接受之 毒性水平以及尋求除去之腫瘤細胞（Baldwin等人 132799.doc 10 200918089 (1986)Lancet 頁數（1986 年 3 月 15 日）:603-05 ; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer
Therapy: A Review,"in Monoclonal Antibodies '84:
Biological And Clinical Applications, A. Pinchera 等人 (編）’第475-506頁）。對改善治療指數（亦即ADC之最大功 效及最小毒性）之努力已集中於對於多株抗體（Rowland等 人（1986)Cancer Immunol· Immunother.，21:183-87)及單株 抗體（mAb)之選擇性以及藥物連接及藥物釋放特性 (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549)。用於抗體藥物結合物中之藥物部分包括細菌蛋白質 毒素，諸如白喉毒素；植物蛋白質毒素，諸如篦麻毒素； 小分子’諸如奥瑞他汀（auristatin)、格爾德黴素 (geldanamycin)(Mandler 等人（2000)J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581 ; Mandler 等人（2000)Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028 ； Mandler 等人 (2002)Bioconjugate Chem. 13:786-791)、美登素類 (maytansinoid)(EP 1391213 ; Liu 等人（1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、卡奇黴素 (calicheamicin)(Lode 等人（1998)Cancer Res. 58:2928; Hinman 等人（1993)Cancer Res. 53:3336-3342)、道諾黴素 (daunomycin)、阿黴素（doxorubicin)、甲胺嗓口令 (methotrexate)及長春地辛（vindesine)(Rowland 等人 (1986) ，見上）。藥物部分可能影響細胞毒性及細胞抑制機 制，包括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制。一 132799.doc 200918089 些細胞毒性藥物在與大抗體或蛋白質受體配位體結合時傾 向於無活性或活性較小。 奥瑞他汀肽、奥瑞他汀E(AE)及單曱基奥瑞他汀 (MMAE)、海兔毒素（dolastatin)之合成類似物（WO 02/088 172)已作為藥物部分與下列各物結合：⑴嵌合單株 抗體cBR96(對癌瘤上之路易斯Y(Lewis Y)具特異性）； (ii)cAClO，其對血液惡性腫瘤上之CD30具特異性 (Klussman 等人（2004)，Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773 ; Doronina等人（2003)Nature Biotechnology 21(7):778-784 ; Francisco 等人（2003)Blood 102(4):1458-1465 ； US 2004/0018194) ; (iii)用於治療CD20表現癌症及免疫病症之 抗-CD20抗體，諸如美羅華（rituxan)(WO 04/032828); (iv) 用於治療結腸直腸癌之抗-EphB2R抗體2H9(Mao等人 (2004)Cancer Research 64(3):781-788) ; (v)E-選擇素抗禮 (Bhaskar 等人（2003)Cancer Res. 63:6387-6394) ; (vi)曲妥 珠單抗（trastuzumab)(HERCEPTIN®，US 2005/0238649); 及（vii)抗-CD30抗體（WO 03/043583)。奥瑞他汀E之變異體 係於US 5767237及US 612443 1中揭示。與單株抗體結合之 單甲基奥瑞他汀E係於2004年3月28曰提出之Senter等人， Proceedings of the American Association for Cancer Research，第45卷，摘要號碼623中揭示。奥瑞他汀類似物 MMAE及MMAF已與各種抗體結合（US 2005/0238649)。 將藥物部分連接（亦即經由共價鍵連接）於抗體之習知方 式一般產生分子之異質混合物，其中該等藥物部分連接於 132799.doc 200918089 該抗體上之若干位點處。舉例而言，細胞毒㈣物通⑽ 由抗體之往往許多離胺酸殘基與抗體結合，從而產生異質 抗體-藥物結合物混合物。視反應條件而定，該異質混合 物通常含有具有〇至約8個或更多個連接藥物部分之抗體之 刀布另外，具有特定整數比率之藥物部分與抗體之結合 物的各亞群為潛在異質混合物，其中藥物部分連接於抗體 上之各位點處。分析及製備方法可能不足以分離及表徵由 結合反應產生之異質混合物中之抗體-藥物結合物物質分 Γ 子。抗體為大、複雜且結構不同之生物分子，常常具有許 多反應性官能基。其與連接子試劑及藥物-連接子中間物 之反應性視諸如pH值、濃度、鹽濃度及共溶劑之因素而 定此外，由於難以控制反應條件及表徵反應物與中間 物，所以多步驟結合方法可能為不可再現的。 半胱胺酸硫醇在中性pH值下具反應性，此不同於經質子 化且在pH 7附近親核性較小之大多數胺。因為游離硫醇 < (RSH，硫氫基）基團具相對反應性，所以具有半胱胺酸殘 基之蛋白質常常以其氧化形式作為二硫鍵連接之募聚物存 在或内部具有橋式二硫基。細胞外蛋白質一般不具有游離 4i^(Garman，1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical
Approach，Academic Press，London，第 55頁）。抗體半胱胺 酸硫醇基團對親電子結合試劑之反應性一般比抗體胺或羥 基基團對親電子結合试劑之反應性大’亦即親核性較大。 已藉由遺傳工程化技術將半胱胺酸殘基引入蛋白質中以形 成與配位體之共價連接或形成新分子内二硫鍵等人 132799.doc -13- 200918089 (1994) J. Biol. Chem. 13:9644-9650; Bernhard 等人（1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132 ; Greenwood 等人（1994) Therapeutic Immunology 1:247-255 ； Tu 等人（1999) proc
Natl. Acad. Sci USA 96:4862-4867 ; Kanno 等人（2000) J. 〇f
Biotechnology, 76:207-214; Chmura等人（2001)Proc·Nat·
Acad. Sci. USA 98(15):8480-8484 ; US 6248564)。然而， 藉由使蛋白質之各種胺基酸殘基突變為半胱胺酸胺基酸進 行的半胱胺酸硫醇基之工程化具有潛在問題，在不成對 ( (游離cys)殘基或相對易受反應或氧化影響之彼等者的情 況下尤然。在蛋白質之濃溶液中，無論在大腸桿菌（E. coli)周質、培養物上清液抑或部分或完全純化蛋白質中， 蛋白質表面上之不成對Cys殘基可配對且發生氧化以形成 分子間二硫鍵，且因此形成蛋白質二聚體或多聚體。二硫 化物二聚體形成使得新Cys對於與藥物、配位體或其他標 記之結合不具反應性。此外，若蛋白質氧化形成新工程化 4 Cys與現有Cys殘基之間的分子内二硫鍵，則兩種Cys硫醇 ^ 基無法用於活性位點參與及相互作用。此外，可藉由三級 結構之錯誤摺疊或失去而使得蛋白質無活性或無特異性 (Zhang 等人（2〇〇2)Anal· Biochem. 311:1-9)。 半胱胺酸工程化抗體已被設計為FAB抗體片段（thi〇Fab) 且表現為全長IgG單株（thioMab)抗體（Junutula，j R•等人 (2〇〇8)J Immunol Methods 332:41-52 ； US 2007/0092940 . 該等文獻之内容以引用的方式併入）。Thi〇Fab& τμ〇μ^ 抗體於新引入之半胱胺酸硫醇處經由連接子與硫醇反應性 132799.doc -14 - 200918089 連接子試劑及藥物連接子試劑結合以製備抗體藥物μ 物（ThioADC)。 、。〇 本文中所引用之所有參考文獻’包括專利申請案及 案均以全文引用的方式併入。 【發明内容】 本發明提供tCD79b抗體或其㈣片段，及其用於治療 造血組織腫瘤之方法。 r 在一態樣中，本發明提供-種抗體，其（較佳特異性地） 結合至上文或下文所述之多肽中之任一者。視情況，該抗 體為皁株抗體、抗體片段（包括Fab、㈣、啊,)2及&片 !)、雙功能抗體、單域抗體、嵌合抗體、人類化抗體、 單鏈抗體錢爭性抑制抗_CD79b多肽抗體與其各別抗原性 抗原決定基之結合之抗體。本發明之抗體可視情況盥生長 抑制劑或細胞毒性劑結合’該生長抑制劑或細胞毒性劑諸 如毒素’包括(例如)奥瑞他汀、美登素類、海兔毒素衍生 物或卡奇黴素、抗生素、放射性同位素、溶核酶或其類似 物。本發明之抗體可視情況於CH0細胞或細菌細胞中產生 且較佳引起其所結合之細胞死亡。出於偵測目#，本發明 之抗體可以可偵测方式標記、連接於固體支撑物或其類似 情況。 在—態樣t，本發明提供一種人類化抗_CD79b抗體，1 中抗體對CD79b之單價'親和力(例如呈Fab片段之抗體對 ⑶79b之親和力）或其二價形式之親和力（例&呈砂片段之 抗體對CD79b之親和力）分別大體上與鼠類抗體（例如呈 132799.doc 200918089 片段或呈IgG片段之鼠類抗體對CD79b之親和力）或嵌合抗 體（例如呈Fab片段或呈IgG片段之嵌合抗體對CD79b之親和 力）之單價親和力或其二價形式之親和力相同，低於或大 於後者，該鼠類抗體或嵌合抗體包含如圖7(SEQ ID NO: 10)及圖8A-B(SEQ ID NO: 14)中所示之輕鏈及重鏈可變域 序列、由該輕鏈及重鏈可變域序列組成或基本上由該輕鏈 及重鏈可變域序列組成。 在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗-CD79b抗體， 其中二價形式之該抗體對CD79b之親和力（例如呈IgG之抗 體對CD79b之親和力）為2·0 nM。 在一態樣中，提供一種結合CD79b之抗體，其中該抗體 包含： (a)至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自由下 列者組成之群的HVR : (i) 包含序列A1-A16之HVR-L1 ，其中A1-A16為 KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO: 59)； (ii) 包含序列B1-B7之HVR-L2，其中B1-B7為 LVSKLDS (SEQ ID NO: 60)； (iii) 包含序列C1-C9之HVR-L3 ，其中C1-C9為 WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 61)； (iv) 包含序列D1-D10之HVR-H1 ，其中D1-D10為 GYTFTSYWMN (SEQ ID NO: 62)； (v) 包含序列E1-E18之HVR-H2，其中E1-E18為 GMIDPSDSETHYNHIFKD (SEQ ID NO: 63);及 132799.doc • 16· 200918089 (vi)包含序列F1-F6之HVR-H3，其中F卜F6為ARNLYL (SEQ ID NO: 64)。 在一態樣中，提供一種結合CD79b之抗體，其中該抗體 包含至少一個變異HVR，其中該變異HVR序列包含對SEQ ID NO: 59、60、61、62、63或64中所示之序列之至少一 個殘基的修飾。 在一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含含有圖13中 所示之 HVR1-HC、HVR2-HC 及 / 或 HVR3-HC 序列（SEQ ID NO: 31-33)之重鏈可變域。 在一態樣中，本發明提供一種抗體’其包含含有圖13中 所示之 HVR1-LC、HVR2-LC 及 / 或 HVR3-LC 序列（SEQ ID NO: 23-25)之輕鏈可變域。 在一態樣中’本發明包括一種抗-CD79b抗體’其包含 SEQ ID NO: 16之重鏈可變域。在另一態樣中，本發明包括 一種抗-CD79b抗體，其包含SEQ ID NO: 12之輕鏈可變域。 在一態樣中，本發明包括一種半胱胺酸工程化抗-CD79b 抗體，其包含一或多個游離半胱胺酸胺基酸及選自SEQ ID NO: 91-122之序列。該半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體可結 合於CD79b多肽。該半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體可藉由 包含由半胱胺酸置換親本抗-CD79b抗體之一或多個胺基酸 殘基之方法來製備。 在一態樣中’本發明包括一種包含一或多個游離半胱胺 酸胺基酸之半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體，其中該半胱胺 酸工程化抗-CD79b抗體結合於CD79b多肽且係藉由包含由 132799.doc •17· 200918089 半胱胺酸置換親本抗-CD79b抗體之一或多個胺基酸殘基之 方法來製備，其中該親本抗體包含至少一個選自下列者之 HVR序列： (a) 包含序列A1-A16之HVR-L1 ，其中A1-A16為 KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO: 59)；
(b) 包含序列 B1-B7 之 HVR-L2，其中 B1-B7 為 LVSKLDS (SEQ ID NO: 60)；
(c) 包含序列 C1-C9 之 HVR-L3，其中C1-C9為 WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 61)或 FQGTHFPFT (SEQ ID NO: 79); (d) 包含序列D1-D10之HVR-H1 ，其中D1-D10為 GYTFTSYWMN (SEQ ID NO: 62)； (e) 包含序列E1-E18之HVR-H2 ，其中E1-E18為 GMIDPSDSETHYNHIFKD(SEQ ID NO: 63);及
(f) 包含序列F卜F6之HVR-H3，其中F1-F6為ARNLYL (SEQ ID NO: 64)。 半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體可為單株抗體、抗體片 段、嵌合抗體、人類化抗體、單鏈抗體或競爭性抑制抗-CD79b多肽抗體與其各另ij抗原性抗原決定基之結合之抗 體。本發明之抗體可視情況與生長抑制劑或細胞毒性劑結 合，該生長抑制劑或細胞毒性劑諸如毒素，包括（例如）奥 瑞他汀或美登素類。本發明之抗體可視情況於CHO細胞或 細菌細胞中產生且較佳抑制其所結合之細胞之生長或增生 或引起其所結合之細胞死亡。出於診斷目的，本發明之抗 體可以可偵測方式標記、連接於固體支撐物或其類似情 132799.doc -18- 200918089 況。 在心、樣中本發明提供製造本發明之抗體之方法。舉 例而5，本發明提供一種製造抗體（如本文所定義， 其包括全長及其片段)之方法，該方法包含使本發明之編 碼該抗體（或其片段）之重組载體表現於合適之宿主細胞中 及回收該抗體。 在〜樣中本發明為一種醫藥調配物，其包含本發明 之抗體或本發明之抗體_藥物結合物及醫藥學上可接受之 C 稀釋劑、載劑或賦形劑。 在L樣中，本發明提供一種製品，其包含—容器；及 含於該容器中之組合物’其中該組合物包含本發明之一或 多種CD79b抗體。 在心樣中，本發明提供一種套組，其包含一第一容 器’其包含含有本發明之一或多種⑶幾抗體之組合物； 及一弟一容器，其包含緩衝劑。 / 在一態樣中，本發明提供本發明之CD79b抗體用於製備 肖以治療性及/或預防性治療疾病(諸如癌症、腫瘤及/或細 胞增生性病症）之藥劑的用途。 在一態樣中，本發明提供本發明之製品用於製備用以治 療性及/或預防性治療疾病（諸如癌症、腫瘤及/或細胞增生 性病症）之藥劑的用途。 在一態樣中，本發明提供本發明之套組用於製備用以治 療性及/或預防性治療疾病（諸如癌症、腫瘤及/或細胞增生 性病症）之藥劑的用途。 132799.doc -19- 200918089 在一態樣中，本發明提供一種抑制表現CD79b之細胞生 長之方法，該方法包含使該細胞與本發明之抗體接觸，藉 此使得該細胞之生長受到抑制。在一實施例中，該抗體與 細胞毒性劑結合。在一實施例中’該抗體與生長抑制劑結 合。 在一態樣中’本發明提供一種治療性地治療具有包含表 現CD79b之細胞之癌性腫瘤的哺乳動物之方法，該方法包 含向該哺乳動物投與治療有效量之本發明之抗體，藉此有 效治療該哺乳動物。在一實施例中，該抗體與細胞毒性劑 結合。在一實施例中，該抗體與生長抑制劑結合。 在一態樣中，本發明提供一種治療或預防與cD79b之表 現增加相關之細胞增生性病症的方法，該方法包含向需要 该治療之個體投與有效量之本發明之抗體，藉此有效治療 或預防該細胞增生性病症。在一實施例中，該增生性病症 為癌症。在一實施例中，該抗體與細胞毒性劑結合。在一 實施例中，該抗體與生長抑制劑結合。 在一態樣中，本發明提供一種抑制細胞生長之方法，其 中該細胞之生長至少部分視(：1)791)之生長增強作用而定’ 該方法包含使該細胞與有效量之本發明之抗體接觸，藉此 抑制該細胞之生長。在—實施例巾，該抗體與細胞毒性劑 結合。在一實施例中，該抗體與生長抑制劑結合。 在虑樣中，本發明提供一種治療性地治療哺乳動物之 腫瘤之方'缶纟中该腫瘤之生長至少部分視CD79b之生長 增強作用而疋，該方法包含使該細胞與有效量之本發明之 132799.doc -20- 200918089 抗體接觸，藉此有效治療該腫瘤。在一實施例中，該抗體 與細胞毒性劑結合。在一實施例中，該抗體與生長抑制劑 結合。 在一態樣中，本發明提供—種治療癌症之方法，其包含 向患者投與包含本文所述之免疫結合物、可接受之稀釋 劑、載劑或賦形劑的醫藥調配物。 在一態樣中，本發明提供一種抑制B細胞增生之方法， 其包含使細胞在容許免疫結合物結合〇〇79]3之條件下暴露 於包含本發明之抗體之免疫結合物。 在一態樣中，本發明提供一種測定懷疑含有cD79b之樣 品中CD79b之存在的方法，該方法包含使該樣品暴露於本 發明之抗體，及測定該抗體與該樣品中之CD79b之結合， 其中該抗體與該樣品中之CD79b之結合指示該樣品中存在 該蛋白質。 在一態樣中，本發明提供一種診斷與表現cD79b之細胞 (諸如B細胞）增加相關之細胞增生性病症的方法，該方法 包含使生物樣品中之測試細胞與上述抗體中之任一者接 觸；藉由偵測該抗體與CD79b之結合來測定結合於該樣品 中之測試細胞的抗體之含量；及比較結合於對照樣品中之 細胞的抗體之含量，其中將所結合之抗體之含量標準化為 測試樣品及對照樣品中表現CD79b之細胞之數目，且其中 與對照樣品相比測試樣品中結合之抗體的含量較高指示與 表現CD79b之細胞相關之細胞增生性病症的存在。 在一態樣中，本發明提供一種偵測血液或血清中之可溶 132799.doc 21 200918089 ! 生CD79b之方法，該方法包含使來自懷疑經歷b細胞增生 !·生病症之哺乳動物之血液或血清的測試樣品與本發明之 抗CD79b抗體接觸且偵測測試樣品中之可溶性cd7外相對 於來自正㊉哺乳動物之血液或血清之對照樣品的增加。 在一態樣中，本發明提供一種使本發明之抗體結合於表 現CD79b之細胞的方法，該方法包含使該細胞與本發明之 抗體接觸。在一實施例中，該抗體與細胞毒性劑結合。在 一實施例中，該抗體與生長抑制劑結合。 Γ 【實施方式】 本發明提供用於鑑別適用於治療哺乳動物之造血組織腫 瘤之組合物的方法、組合物、套組及製品以及使用彼等物 質組合物來治療該造企組織腫瘤之方法。 在本文中提供此等方法、組合物、套組及製品之詳情。 I.通用技術 除非另有指示，否則本發明之實施將利用分子生物學 (包括重組技術）、微生物學、細胞生物學、生物化學及免 i: 疫學之習知技術，其均屬於此項技術之技能範圍内。該等 技術已在諸如以下者之文獻中得到充分闡述："Molecular Cloning: A Laboratory Manual”，第二版（Sambrook等人， 1989) ; "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait 編， 1984) ; "Animal Cell Culture”（R· I. Freshney編，1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.) ； "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel 等人編’ 1987，及週期更新）；"PCR: The Polymerase Chain 132799.doc -22- 200918089
Reaction"，（Mullis等人編，1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988) ； "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas等人，2001)。 Π.定義 出於解釋本說明書之目的，下列定義將適用且無論何時 均為適當的，以單數形式使用之術語亦將包括複數且反之 亦然。在所陳述之任何定義與以引用之方式併入本文中之 任何文獻相抵觸的情況下，應以以下陳述之定義為準。 在本文中"Β細胞表面標記"或”Β細胞表面抗原"為可用能 與之結合之拮抗劑靶向之表現於Β細胞表面上的抗原，該 拮抗劑包括（但不限於）能夠拮抗配位體與天然存在之Β細 胞抗原之結合的Β細胞表面抗原或可溶性形式之Β細胞表 面抗原之抗體。例示性Β細胞表面標記包括CD10、
CD19 、 CD20 、 CD21 、 CD22 、 CD23 、 CD24 、 CD37 、 CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、 CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、 CD83、CDw84、CD85及CD86白血球表面標記（關於描 述，參見 The Leukocyte Antigen Facts Book，第 2版。 1997，編輯：Barclay 等人 Academic Press, Harcourt Brace & Co.，New York)。其他B細胞表面標記包括RP105、 FcRH2、B 細胞 CR2、CCR6、P2X5、HLA-DOB、CXCR5、 FCER2 、BR3 、BAFF 、BLyS 、Btig 、NAG14 、 SLGC16270、FcRHl、IRTA2、ATWD578、FcRH3、 IRTA1、FcRH6、BCMA及239287。與哺乳動物之其他非B 132799.doc -23- 200918089 細胞組織相比’特別受關注之B細胞表面標記優先地表現 於B細胞上且可表現於前㈣細胞及成熟㈣胞兩者上。 承非另有札示，否則如本文所使用，術語係指 來自任何脊椎動物來源之任何天然CD79b，該來源包括哺 乳動物冑如莖長類動物（例如人類、摘狼㈣⑽)）及誓齒 類動物（例如小鼠及大鼠）。人類⑶州在本文中亦稱為 ，，腦6249”（SEQ ID N〇: 2) ^由本文中亦稱為 "DNA225786"之核苷酸序列（卿①n〇: ^編碼。術語
CD79b"涵蓋"全長|’、未加工之⑽外以及由細胞中之加 工產生的任何形式之CD79b。該術語亦涵蓋cD79b之天然 存在之變異體，例如拼接變異體、對偶基因變異體及同功 異型物。本文所述之CD79b多肽可自多種來源分離，諸如 自人類組織類型或另一來源分離，或藉由重組或合成方法 製備。"天然序列CD79b多肽，，包含具有與源自自然界之相 應CD79b多肽相同之胺基酸序列的多肽。該等天然序列 CD79b多肽可自自然界分離或可藉由重組或合成方法產 生。術語’’天然序列CD79b多肽"具體涵蓋特異性cD79b多 肽之天然存在之截短或分泌形式（例如細胞外域序列）、該 多肽之天然存在之變異形式（例如交替拼接形式）及天然存 在之對偶基因變異體。在本發明之某些實施例中’本文所 揭示之天然序列CD79b多肽為包含附圖中所示之全長胺基 酸序列之成熟或全長天然序列多肽。起始及終止密碼子 (若指出）在圖中以粗體顯示且加下劃線。附圖中以"N"表 示之核酸殘基為任何核酸殘基。然而，雖然展示附圖中所 132799.doc -24- 200918089 揭示之CD79b多肽在圖中自本文中指定為胺基酸位置1之 甲硫胺酸殘基開始，但可以想像且有可能的是在圖中位於 胺基酸位置1之上游或下游之其他甲硫胺酸殘基可用作 CD79b多肽之起始胺基酸殘基。 術語"2F2"在本文中用於指鼠類抗-CD79b單株抗體（本文 中亦稱為nmu2F2”或”鼠類2F2”）或嵌合抗體（本文中亦稱為 ”ch2F2”） 。 nmu2F2”或”鼠類2F2”在本文中用於具體指鼠類抗-CD79b f 單株抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO: 10之輕鏈可變域 (圖7)及SEQ ID NO: 14之重鏈可變域（圖8A-B)。mu2F2可 由2006年7月11日以PTA-7712寄存於ATCC之融合瘤產生。 nch2F2”或”嵌合2F2抗體''在本文中用於具體指嵌合抗體 (如先前2006年8月3曰申請之美國申請案第1 1/462,33 6號中 所述），其中該嵌合抗體包含SEQ ID NO: 4之輕鏈（圖4) ’ 其中輕鏈包含SEQ ID NO: 10之可變域（圖7)及人類IgGl之 輕鍵恒定域。嵌_合抗體進一步包含SEQ ID NO: 6之重鍵 ( (圖6)，其中輕鏈包含SEQ ID NO: 14之可變域（圖8A-B)及 人類IgG 1之重鏈恒定域。
"2F2-接枝物”或"2F2接枝’人類化’抗體”或”hu2F2接枝物” 在本文中用於具體指藉由將來自鼠類2F2抗體（mu2F2)之高 變區接枝於具有R71A、N73T及L78A之受體人類一致VL κ I(huKI)及人類亞群III 一致VH(huIII)中所產生的接枝物 (Carter 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992))(參見實例 1A 及圖 7(SEQ ID NO: 11)及 8(SEQ ID 132799.doc -25- 200918089 NO: 15))。 如本文所使用’胺基酸殘基/位置之，，修飾"係指與起始胺 基酸序列相比一級胺基酸序列之變化，其中該變化由涉及 該胺基酸殘基/位置之序列變化引起。舉例而言，典型修 飾包括用另一胺基酸取代該殘基（或於該位置處進行取 代）（例如保守性或非保守性取代）、相鄰於該殘基/位置插 入一或多個（一般少於5或3個）胺基酸及缺失該殘基/位置。 ”胺基酸取代”或其變化形式係指用不同胺基酸殘基置換預 定（起始）胺基酸序列中之現有胺基酸殘基。一般而言且較 佳的是，該修飾導致與包含起始（或"野生型"）胺基酸序列 之多肽相比變異多肽之至少一種物理生化活性的變化。舉 例而言，在抗體之情況下，所改變之物理生化活性可為對 靶分子之結合親和力、結合能力及/或結合效應。 術語"抗體"係在最廣泛意義上加以使用且具體涵蓋（例 如）單一抗-CD79b單株抗體（包括促效劑、拮抗劑、中和抗 體、全長或完整單株抗體）、具有多抗原決定基特異性之 抗-CD79b抗體組合物、多株抗體、多價抗體、由至少兩種 完整抗體形成之多特異性抗體（例如雙特異性抗體，只要 其展現所需生物活性即可）、單鏈抗_CD79b抗體及抗_ CD79b抗體之片段（參見下文）（包括Fab、Fab,、F(ab,)2及π 片段）、nu充體、單域抗體（sdAb)(只要其展現所需生 物或免疫活性即可）。術語，，免疫球蛋白”（Ig)在本文中可與 抗體互換使用。抗討為人類抗體、人類化抗體及/或親 和力成熟抗體。 132799.doc -26- 200918089 術語"抗-CD79b抗體"或"結合於CD79b之抗體》係指能夠 以足夠親和力結合CD79b以便使抗體適用作乾向c〇79b之 診斷劑及/或治療劑的抗體。較佳地，如（例如）藉由放射免 疫檢定（RIA)所量測’抗-CD79b抗體與無關非CD79b蛋白 質之結合程度小於該抗體與CD79b之結合的約1〇%。在某 些實施例中，結合於CD79b之抗體具有$1 μΜ、£100 nM、 $10 ηΜ、SI ηΜ或$0.1 ηΜ之解離常數（Kd)。在某些實施例 中，抗-CD79b抗體結合於CD79b之抗原決定基，其在來自 不同物種之CD79b之間為保守的。 "經分離之抗體''為已自自然環境之組份中鑑別且分離及/ 或回收的抗體。其自然環境之污染物組份為會干擾抗體之 治療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質性或非 蛋白質性溶質。在較佳實施例中，抗體將被純化至如藉 由勞立法（Lowry method)所測定之大於95重量％抗體，且 最佳至大於99重量％ ; (2)至足以藉由使用轉杯式測序儀獲 得N末端或内部胺基酸序列之至少15個殘基的程度；或0) 至藉由SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用庫馬斯藍 (Coomassie blue)或較佳銀染色得知之均質性。經分離之抗 體包括重組細胞内之原位抗體，此係因為抗體之自然環境 中之至少一個組份將不會存在。然而，經分離之抗體通常 將藉由至少一個純化步驟來製備。 基礎4鏈抗體單元為由兩個一致輕（L)鏈及兩個一致重 (H)鏈構成之異質四聚醣蛋白（IgM抗體由5個基礎異質四聚 體單疋以及另一稱為j鏈之多肽組成，且因此含有1〇個抗 132799.doc •27· 200918089 原結合位點，而分泌性IgA抗體可聚合形成包含2_5個基礎 4鏈單元以及J鏈之多價集合體）。在IgG之情況下，4鏈單 元一般為約150,〇〇〇道爾頓。各L鏈係藉由一個共價二硫鍵 連接於Η鏈，而兩個H鏈係藉由一或多個二硫鍵互相連 接，此視Η鏈同型而定。各H及L鏈亦具有規律間隔之鏈内 二硫橋。各Η鏈於Ν末端處具有可變域（Vh)，接著對於α&γ 鏈各為三個恆定域（Ch)且對於μ&ε同型為四個。域。各L 鏈於N末端處具有可變域（Vl)，接著於其其他末端處具有 ( 恆定域（Cl)。VL與Vh對準且CL與重鏈之第一恆定域（Ch1) 對準。咸js特疋胺基酸殘基形成輕鏈與重鏈可變域之間的 界面。vH及vL之配對共同形成單一抗原結合位點。關於抗 體之不同種類之結構及特性’參見例如Basic and c丨inical Immunology ,第 8版，Daniel p 如…，Abba ! 丁爪及
Tristram G. Parslow(編）’ Appleton & Lange，Norwalk，CT， 1994，第71頁及第6章。 , 來自任何脊椎動物物種之L鏈基於其恆定域之胺基酸序 、 列可歸屬於兩種明顯不同之類型（稱為κ及λ)中之一者。視 重鏈之恆足域（CH)之胺基酸序列而定，免疫球蛋白可分為 不同種類或同型。存在五種免疫球蛋白：IgA、igD、 IgE、IgG及IgM，其分別具有稱為α、δ、ε、γ及μ之重鏈。 γ及α類別根據cH序列及功能之相對較小差別而進一步被分 為亞類，例如人類表現下列亞類：IgG1、IgG2、IgG3、
IgG4、IgAl 及 IgA2。 抗體之可變區”或"可變域”係指抗體之重鏈或輕鏈之胺 132799.doc -28- 200918089 土末端域。重鏈之可變域可稱為” VH”。輕鏈之可變域可稱 為” VL’’ 〇 士卜楚 J42 ^ 寺域一般為抗體之最可變之部分且含有抗原結 合位點。 術°吾可變"係指可變域之某些區段的序列在抗體之間廣 ’乏不同的事實。V域介導抗原結合且確定特定抗體對其特 疋抗原之特異性。然而，可變性在可變域之110個胺基酸 跨度上並非均勻分布。事實上，v區由具有15_3〇個胺基酸 之稱為構架區（FR)的相對不變之一段序列組成，該等構架 區被長度各為9-12個胺基酸之稱為”高變區"的具極端可變 I*生之較短區所分隔開。天然重鏈及輕鏈之可變域各自包含 四個主要採用β摺疊構型、藉由三個高變區連接之FR，該 等高變區形成連接β摺疊結構之環，且在一些情況下形成P 指疊結構之部分。各鏈中之高變區藉由FR極接近地固持在 一起’且與來自另一鏈之高變區一起促使抗體之抗原結合 位點形成（參見 Kabat 專人 ’ Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，Public Health Service， National Institutes of Health，Bethesda，MD. (1991))。恆定 域並不直接涉及使抗體與抗原結合，但展現各種效應功 能’諸如使抗體參與抗體依賴性細胞細胞毒性（ADCC)。 元整抗體為包含抗原結合位點以及C l及至少重鏈怪定 域CH1、CH2及CH3之抗體。恆定域可為天然序列恆定域（例 如人類天然序列恆定域）或其胺基酸序列變異體。較佳 地，完整抗體具有一或多種效應功能。 出於本文之目的’"裸抗體”為不與細胞毒性部分或放射 132799.doc -29- 200918089 性標記結合之抗體。 ”抗體片段”包含完整抗體之一部分，較佳為完整抗體之 抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、 F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體（參見美國專利第 5,641，870 號，實例 2 ; Zapata等人 ’ Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]);單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之 多特異性抗體。在一實施例中，抗體片段包含完整抗體之 抗原結合位點且因此保留結合抗原之能力。 Γ 抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個一致抗原結合片段，稱 為"Fab"片段及殘餘"Fc"片段，此為反映容易結晶之能力的 名稱。Fab片段由整個l鏈以及Η鏈之可變區域（VH)及一個 重鏈之第一恆定域（Ch1)組成。每一Fab片段對於抗原結合 為單價的，亦即其具有單一抗原結合位點。抗體之胃蛋白 酶處理產生單一大F(ab，）2片段’其大致對應於具有二價抗 原結合活性之兩個二硫鍵連接之Fab片段且仍能夠使抗原 f 交聯。Fab'片段與Fab片段之不同之處為於Ch1域之羧基末 、端處具有額外少數殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區之 半胱胺酸。Fab’-SH為本文中對於恆定域之半胱胺酸殘基 帶有游離硫醇基之Fab，的名稱。F(ab,)2抗體片段最初係以 彼此之間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab，片段對之形式產生。抗 體片段之其他化學偶合亦為已知。
Fc片段包含由二硫鍵固持在一起之兩個^1鏈之羧基末端 部分。抗體之效應功能係由以區之序列決定，該區亦為由 見於某些細胞類型之F c受體（F c R)識別之部分。 132799.doc -30- 200918089 ” Fv ”為含有完整抗原識別及結合位點之最小抗體片段。 此片段由一個重鏈可變區域與一個輕鏈可變區域緊密、非 共價締合之二聚體組成。在單鏈Fv(scFv)類型中，一個重 鏈可變域及一個輕鏈可變域可藉由撓性肽連接子共價連接 以使得輕鏈及重鏈可以類似於兩鏈Fv類型之"二聚"結構締 合。源自此等兩個域之摺疊的六個高變環（來自Η及L鏈各3 個環）促成胺基酸殘基之抗原結合且賦予抗體抗原結合特 異性。然而’甚至單個可變域（或包含僅三個對抗原具特 異性之CDR的Fv之一半）亦具有識別及結合抗原之能力， 但親和力比整個結合位點低。 ”單鏈Fv"亦被縮寫為”sFv”或"scFv"且為包含連接於單一 多肽鏈中之VH及VL抗體域之抗體片段。較佳地，sFv多肽 另外包含介於vH域與vL域之間的多肽連接子，其使sFv能 夠形成抗原結合之所需結構。關於sFv之综述，參見 Pluckthun, The Pharmacology 〇f Monoclonal Antibodies > 第 113 卷，Rosenburg 及 Moore 編，Springer-Verlag, New York ’ 第 269-315 頁（1994) ; Borrebaeck 1995，見下文。 術語”雙功能抗體"係指具有兩個抗原結合位點之抗體片 段，該等片段包含在同一多肽鏈（VH-VL)中與輕鏈可變域 (VL)連接之重鏈可變域（VH)。小抗體片段係藉由以下程序 製備：在VH域與VL域之間用短連接子（約5-10個殘基）建構 sFv片段（參見前述章節）以使得達成v域之鏈間而非鏈内配 對’從而產生二價片段’亦即具有兩個抗原結合位點之片 段。雙功能抗體可為二價或雙特異性抗體。雙特異性雙功 132799.doc -31 - 200918089 能抗體為兩個”交叉"sFv片段之異質二聚體，其中兩個抗 體之VH域及VL域存在於不同多肽鏈上。雙功能抗體更充分 描述於（例如）EP 404,097、WO 93/11161、Hudson等人， iVa，· MW. 9:129-134(2003)及 Hollinger 等人，
Ad t/M，90:6444-6448(1993)令。三功能抗體及四 功能抗體亦描述於Hudson等人，iVai. jV/ed 9:129-134 (2003)中。 如本文所使用，術語"單株抗體"係指自一群大體上均質 (. 之抗體獲付之抗體，亦即構成該群之個別抗體除可以微量 存在之可能天然產生之突變以外為相同的。單株抗體針對 單一抗原位點具咼度特異性。此外，與包括針對不同決定 子（抗原決定基）之不同抗體之多株抗體製劑不同，每一單 株抗體係針對抗原上之單一決定子。除其特異性外，單株 抗體因其可在不受其他抗體污染之情況下合成而為有利 的。修飾語"單株"不應被理解為需要藉由任何特定方法來 產生抗體。舉例而1：，適用於本發明之單株抗體可藉由最 I 初由K〇hler等人’ Nature，256:495(1975)描述之融合瘤方 法來製備，或可在細菌、真核動物或植物細胞中使用重組 DNA方法製造（參見例如美國專利第4,816,567號卜"單株 抗體”亦可使用（例如）clacks〇n等人，㈣心，352:624_ 628(1991)^Marks^A - J. M〇l. Biol., 222:581-597(1991) 中所述之技術自噬菌體抗體庫分離。 本文中之單株抗體包括”喪合，，抗體，《中重鍵及/或輕鍵 之一部分與源自特定物種或屬於特定抗體種類或亞類之抗 132799.doc -32· 200918089 體的相應序列一致或同源，而該（等）鏈之其餘部分與源自 另一物種或屬於另一抗體種類或亞類之抗體的相應序列一 致或同源；以及該等抗體之片段，只要其展現所需生物活 性即可（參見美國專利第4,816,567號；及Morrison等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA，81:685 1-6855 (1984))。本文 中所關注之嵌合抗體包括”靈長類化”抗體，其包含源自非 人類靈長類動物（例如舊大陸狼（Old World Monkey)、猿 等）之可變域抗原結合序列及人類恆定區序列。 ”人類化”形式之非人類（例如齧齒類）抗體為含有源自非 人類抗體之最小序列之嵌合抗體。一般而言，人類化抗體 為如下人類免疫球蛋白（受體抗體），其中來自受體之高變 區之殘基由具有所需抗體特異性、親和力及能力的來自諸 如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物之非人類物種之高 變區（供體抗體）的殘基置換》在一些情況下，人類免疫球 蛋白之構架區（FR)殘基由相應非人類殘基置換。此外，人 類化抗體可能包含不存在於受體抗體或供體抗體中之殘 基。進行此等修飾以進一步改進抗體效能。一般而言，人 類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之大體上全 ，其中所有或大體上所有高變環對應於非人類免疫球蛋 白之彼等者且所有或大體上所有？11為人類免疫球蛋白序列 之彼等者。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區 (Fc)之至少一部分，通常為人類免疫球蛋白之至少一部 分。欲知詳情，參見jones等人，Nature 321:522_525 (1986) ; Riechmann等人，Nature 332:323 329 (1988广及 132799.doc •33- 200918089
Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。亦參見 下列綜述文章及其中所引用之參考文獻：Vaswani及 Hamilton, Ann. Allergy, Asthma and Immunol., 1:105-115 (1998) , Harris, Biochem. Soc. Transactions, 23:1035-1038 (1995)，Hurle 及 Gross, Cwm (9p. Bz’oiec/z·，5:428-433 (1994)。 nThio”當在本文中用於指抗體時係指半胱胺酸工程化抗 體’而”hu"當在本文中用於指抗體時係指人類化抗體。 "人類抗體"為具有對應於由人類產生且/或使用如本文所 揭示用於製造人類抗體之技術中的任一者製造之抗體之胺 基酸序列的胺基酸序列之抗體。此關於人類抗體之定義明 確地排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。人類抗 體可使用此項技術中已知之各種技術（包括噬菌體呈現庫） 來產生。Hoogenboom 及 Winter，《/· Af〇/.价〇/ , 227:381
(1991)，Marks等人，J. Mo/. 5z.〇/·，222:581 (1991)。Cole 等 A，Monoclona! Antibodies and Cancer Therapy, AUnR L1SS，第 77 頁（1985) ; B〇erner 等人，乂 /， 147(1):86-95(1991)中所述之方法亦可用於製備人類單株抗 體。亦參見 van Dijk 及 van de Winkel， 5: 368-74 (2001)。人類抗體可藉由向已為了 響應於抗原激發產生該等抗體而被改變、但内源性基因座 已不能使用之轉殖基因動物（例如經免疫之轉殖基因小鼠 (xenomice))投與抗原來製備（參見例如關於 XENOM〇USEtm技術之美國專利第6,〇75，181號及第 132799.doc -34- 200918089 6,1 50,584唬）。亦參見例如關於經由人類B細胞融合瘤技術 產生之人類抗體的Li等人，Ρπ心"da汶心厂仍义 103:3557-3562 (2006)。 術語”高變區"、"HVR"或"Hv"當在本文中使用時係指抗 體可變域中在序列上高變且/或形成結構確定之環的區 域° 一般而言’抗體包含六個高變區；三個在VH(Hi、 H2、H3)中’且三個在VL(L1、L2、L3)中。本文中使用且 涵盍許多關於高變區之描繪。Kabat互補判定區（CDR)係基 f 於序列可變性且為最常使用者（Kabat等人，〇/ iWehi 〇/ /mmw«c^〇gzca/ /«加以，，第 5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。f^Chothia係指結構環之位置（Chothi^Lesk，乂 M〇/·价〇/. 196:901-917 (1987))。當使用 Kabat編號規則編 號時，Chothia CDR-H1環之末端在H32與H34之間變化， 此視環之長度而定（此係因為Kabat編號方案將插入置於 H35A及H35B處；若既不存在35A亦不存在；35B，則環末端 I 位於32處；若僅存在35A，則環末端位於33處；若存在 35A與35B兩者’則環末端位於34處）。AbM高變區表示 Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷，且藉由〇xf〇rd Molecular之AbM抗體模型化軟體而加以使用。"接觸”高變 區係基於可得到之複雜晶體結構的分析。來自此等高變區 中之每一者的殘基係在下文中作出註釋。 132799.doc •35· 200918089 環 Kabat AbM Chothia 接觸 L1 L24-L34 L24-L34 L24-L34 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L89-L97 L89-L96 HI H31-H35B H26-H35B H26-H32..34 H30-H35B (Kabat編號） HI H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chcrthia編號） H2 H50-H65 H50-H58 H52-H56 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H95-H102 H93-H101 高變區可包含如下”延伸高變區” ：VL中之24-36或24-34(L1)、46_56 或 50_56(L2)及 89-97(L3)，以及 VH 中之26-35B(H1)、50-65、47-65 或 49-65(H2)及 93-102、94-102 或 95-102(H3)。可變域殘基係根據Kabat等人（見上文）針對此 等定義中之每一者而進行編號。 ”構架”或"FR”殘基為除本文所定義之高變區殘基外之彼 等可變域殘基。 術語"如Kabat中之可變域殘基編號"或"如Kabat中之胺基 酸位置編號"及其變化形式係指Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991) 中用於編製抗體之重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。 使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可能含有對應於可 變域之FR或CDR之縮短或插入可變域之FR或CDR中的較 少或額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變域可包括在H2之殘 基52後插入之單個胺基酸（根據Kabat為殘基52a)及在重鏈 FR殘基82後插入之殘基（例如，根據Kabat為殘基82a、82b 132799.doc -36- 200918089 及82c等）。可藉由在同源區將抗體序列與”標準"Kabat編號 序列比對來確定給定抗體之殘基的Kabat編號。
Kabat編號系統一般係在提及可變域中之殘基（大致為輕 鏈之殘基1-107及重鏈之殘基1-113)時使用（例如，〖讣“等 k，Sequences of Immunological Interest。％ 5版，YuhWc
Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。"EU編號系統"或"EU指數"一般係在提及免疫球 蛋白重鏈恆定區中之殘基時使用（例如，Kabat等人（見上 文）中所報導之EU指數）。"如Kabat中之EU指數”係指人類 IgGl EU抗體之殘基編號。除非本文中另有說明，否則對 抗體之可變域中之殘基編號的提及意謂根據Kabat編號系 統之殘基編號。除非本文中另有說明，否則對抗體之怪定 域中之殘基編號的提及意謂根據EU編號系統之殘基編號 (例如’參見美國臨時申請案第6〇/64〇,323號，關於Ευ編 號之圖）。 "親和力成熟"抗體為如下抗體：在其一或多個HVR中具 有一或多個變化’導致該抗體與不具有彼等變化之親本抗 體相比對抗原之親和力有所改善。較佳之親和力成熟抗體 將對靶抗原具有奈莫耳或甚至皮莫耳親和力。親和力成熟 抗體係藉由此項技術中已知之程序產生D Marks等人之 仏〇/7^/2仙/〇以1〇:779_783(1992)描述藉由VH及VL域改組 引起之親和力成熟。HVR及/或構架殘基之隨機突變誘發 係由下列文獻所描述：Barbas等人，义^， tASd 91:3809-3813 (1994) ; Schier等人，Ge«e 169:147-155 132799.doc ·37· 200918089 (1995)，Yelton等人，乂 /ww⑽σ/. 155:1994-2004 (1995); Jackson 等人，j· 154(7):3310-9 (1995);及
Hawkins等人，乂 Mo/.价〇/· 226:889-896 (1992)。 "阻斷"抗體或"拮抗劑"抗體為抑制或降低所結合之抗原 之生物活性的抗體。較佳阻斷抗體或拮抗劑抗體大體上或 完全抑制抗原之生物活性。 如本文所使用，”促效劑抗體”為模擬所關注多肽之功能 活性中之至少一者的抗體。 "物種依賴性抗體"（例如哺乳動物抗-人類IgE抗體）為對 來自第一哺乳動物物種之抗原之結合親和力比其對來自第 二哺乳動物物種之彼抗原之同系物的結合親和力強之抗 體。通常，物種依賴性抗體”特異性結合"於人類抗原（亦 即’具有不超過約ΙχΗΓ7 Μ、較佳不超過約1χ1〇-8 M且最 佳不超過約1x1 Ο·9 Μ之結合親和力（Kd)值），但對來自第二 非人類哺乳動物物種之該抗原之同系物的結合親和力比其 對人類抗原之結合親和力弱至少約5 〇倍，或至少約5 〇 〇 倍，或至少約1000倍。物種依賴性抗體可為如上文所定義 之各種類型之抗體中的任一者，但較佳為人類化或人類抗 體。 ”結合親和力"一般係指分子（例如抗體）之單一結合位點 與其結合搭配物（例如抗原）之間的非共價相互作用之總和 的強度。如本文所使用，除非另有指示，否則”結合親和 力"係指反映結合對之成員（例如抗體與抗原）之間的丨：j相 互作用之固有結合親和力。分子X對於其搭配物γ之親和 132799.doc -38· 200918089 力般可由解離常數（ICd)表卡。i目4： _ι_ p ,〇 . >s )表 親和力可藉由此項技術中 力r體Γ法量測，包括本文所述之彼等方法。低親和 几邊慢地結合抗原且傾向於容易解離，而高親和 :-般較快地結合抗原且傾向於較久地保持結合。各 種罝測結合親和力之方法在此項技術t係已知的，出於本 ’X月之目的可使用其任一者。特定說明性實施描 述。 或更好田在本文中用於指結合親和力時係指分子與其 結合搭配物之間的更強結合。”或更好”當在本文中使用時 係指以較小U數值表示之更強結合。舉例而言，就對抗原
具有"〇.6 nM或更好”之親和力的抗體而言，該抗體對該抗 原之親和力小於〇·6 nM，亦即〇 59 nM、〇 58 nM、〇 57 nM 等或小於0.6 nM之任何值。 在一實施例中，根據本發明之"Kd”或"Kd值”係藉由用所 關注抗體之Fab形式及其抗原執行的放射性標記抗原結合 檢定（RIA)來量測，如由以下檢定所述：藉由在連續滴定 之非標記抗原存在下使Fab與最小濃度之（1251)標記抗原平 衡’接著用塗有抗-Fab抗體之板捕捉結合抗原，從而量測 Fab對抗原之溶液結合親和力（chen等人，（1999) 乂 Mo/ 价〇/ 293:865-881)。為建立檢定之條件，用50 mM碳酸鈉 (pH 9.6)中之5 pg/ml捕捉抗-Fab抗體（Cappel Labs)塗覆微 量滴定板（Dynex)隔夜，且隨後於室溫（約23°C)下用PBS中 之2%(w/v)牛血清白蛋白阻斷2至5小時。在無吸附劑板 (Nunc #269620)中，將 100 pM或 26 pM [1251]_抗原與連續稀 132799.doc •39- 200918089 釋之所關注Fab混合（例如，與presta等人，（i997) c 心夂57:4593-4599中對抗_VEGF抗體Fab_12之評估一致）。 接著將所關注Fab培養隔冑；然巾，該培養可持續較長時 段（例如65小時）以確保達到平衡。此後，將混合物轉移至 捕捉板上以於室溫下進行培養（例如歷時一個小時卜接著 移除溶液且用PBS中之〇. 1%吐溫_2〇(Tween_2〇)將該板洗務 八次。當板已乾燥時，添加15〇微升/孔之閃爍體 (MicroScint-20 ; Packard)，且將板以 T〇pc〇unt 丫 計數器 f (Packard)計數歷時十分鐘。選擇產生小於或等於最大結合 之20%的各Fab濃度用於競爭性結合檢定。根據另一實施 例，Kd或Kd值係藉由用表面電漿共振檢定 ，於25°C下使 用 BIAc〇reTM-2000 或 BIAc〇reTM_3〇〇〇(BIAe〇re，工如,
Piscataway，NJ)以約1〇反應單位（RU)之固定抗原cm5晶片 來量測。簡έ之’根據供應商之說明，用乙基_^^,_(3_二 甲胺基丙基）-碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC)及，羥基丁二醯亞 胺（NHS)活化羧曱基化葡聚糖生物感應器晶片（CM5， V BIAcore Inc.)。用10 mM乙酸鈉（pH 4.8)將抗原稀釋為5 pg/ml(約0.2 μΜ)，隨後以5微升/分鐘之流動速率注射以獲 得約10反應單位（RU)之偶合蛋白質。在注射抗原後，注射 1 Μ乙醇胺以阻斷未反應之基團。對於動力學量測而言， 於25C下將兩倍連續稀釋之Fab(0.78 ηΜ至500 ηΜ)以約25 μΐ/min之流動速率注入具有〇_〇5%吐溫2〇之PBS(PBST)中。 使用簡單一對一朗谬爾結合模型（Langmuir binding model)(BIAcore評估軟體（BIAcore Evaluation Software)3.2 132799.doc -40- 200918089 版），藉由同時擬合締合及解離感應圖來計算締合速率 (kon)及解離速率（kQff)。平衡解離常數（Kd)係以比率Wk。。 什算。參見（例如）Chen，γ.等人，（1999) j M〇/出〇/ 293:865-881。若藉由上述表面電衆共振檢定得知，。n速率 超過1〇6 Μ·1 S·1 ’則可藉由使用於25°C下量測於PBS(PH 7.2)中之20 nM抗-抗原抗體（Fab形式）之螢光發射強度（激發 -295 nm，發射=340 nm，16 nm帶通）之增減的螢光淬滅技 術在如光譜計所量測之遞增濃度的抗原存在下測定〇n速 ( 率，该光谱计諸如具有經攪拌比色孤之停流配備光譜光度 計（Aviv Instruments)或 80〇〇 系列 SLM_Aminc〇 光譜光度計 (ThermoSpectronic) ° 根據本發明之，’on速率"或”締合之速率"或"締合速率"或 "k:亦可用上述相同之表面電漿共振技術，使用如上文所 述之 BlAcoreTM-2〇〇〇 或 BiAc〇reTM_3〇〇〇(B1Ac〇re, inc ,
Piscataway，NJ)來測定。 如本文所使用，片語"大體上類似”或”大體上相同”表示 、 兩個數值（一般一個與本發明之抗體相關且另一個與參照/ 比較抗體相關）之間的相似性程度足夠高，以使得熟習此 項技術者將認為兩個值之間的差異在由該等值（例如κ d值） 所量度之生物學特徵的範圍内幾乎不具有生物學及/或統 計學顯著性。該兩個值之間的差異作為參照/比較抗體之 值的函數較佳小於約50%，較佳小於約4〇%，較佳小於約 3 〇%，較佳小於約20%，較佳小於約丨〇0/〇。 如本文所使用，片語，，大體上降低"或”大體上不同"表示 132799.doc 200918089 兩個數值（一般一個與本發明之抗體相關且另一個與參照/ 比較抗體相關）之間的差異程度足夠高，以使得熟習此項 技術者將認為兩個值之間的差異在由該等值（例如Kd值， 哈馬反應（HAMA response))所量度之生物學特徵的範圍内 具有統計學顯著性。該兩個值之間的差異作為參照/比較 抗體之值的函數較佳大於約1 〇%，較佳大於約2〇%，較佳 大於約30%，較佳大於約40%，較佳大於約50〇/〇。 "抗原"為抗體可選擇性結合之預定抗原。靶抗原可為多 肽、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原或其他天然存在或 合成之化合物。較佳地，靶抗原為多肽。 出於本文之目的，”受體人類構架"為包含源自人類免疫 球蛋白構架或源自人類一致構架之VL或VH構架之胺基酸 序列的構架。”源自|，人類免疫球蛋白構架或人類一致構架 之受體人類構架可包含其相同胺基酸序列，或可含有預先 存在之胺基酸序列變化。當存在預先存在之胺基酸變化 時，存在較佳不超過5個且較佳4個或4個以下或3個或3個 以下之預先存在的胺基酸變化。當VH中存在預先存在之 胺基酸變化時，較佳為彼等變化僅位於位置則、7阳及 之一者兩者或一者處；例如，彼等位置處之胺基 酸殘基可為71A、73T及/或78A。在—實施例中，VL受體 類構架之序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類一 致構架序列一致。 人類致構架"為表示人類免疫球蛋白VL或vh構架序 列之選擇中最常存在之胺基酸殘基的構架…般而言，、人 132799.doc -42- 200918089 類免疫球蛋白VL或VH序列之選擇係來自可變域序列之亞 群。通常，序列之亞群為根據Kabat等人之亞群。在一實 施例中，對於VL而言，該亞群為根據Kabat等人之亞群κ I。在一實施例中，對於VH而言，該亞群為根據Kabat等人 之亞群III。 ••VH亞群III一致構架"包含自Kabat等人之可變重鏈亞群 III之胺基酸序列獲得的一致序列。在一實施例中，VH亞 群III 一致構架胺基酸序列包含以下序列中之每一者之至少 一部分或全部：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 69)-Hl-WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 70)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 71)-H3-WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 72)。 nVL亞群I一致構架"包含自Kabat等人之可變輕鏈κ亞群I 之胺基酸序列獲得的一致序列。在一實施例中，VL亞群I 一致構架胺基酸序列包含以下序列中之每一者之至少一部 分或全部： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 65)-Ll-WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 66)-L2-GVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 67)-L3-FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 68)。 ”未經修飾之人類構架”為如下人類構架，其具有與受體 人類構架相同之胺基酸序列，例如在該受體人類構架中缺 乏人類至非人類胺基酸取代。 出於本文之目的，"經改變之高變區"為包含一或多個（例 132799.doc -43- 200918089 如1至約1 6個）胺基酸取代之高變區。 出於本文之目的，’’未經修飾之高變區"為如下高變區， 其具有與其所源自之非人類抗體相同之胺基酸序列，亦即 缺乏一或多個胺基酸取代之高變區。 π結合"所關注抗原（例如腫瘤相關性多肽抗原靶）之抗體 為以足夠親和力結合該抗原之抗體，以使得該抗體適用作 乾向表現該抗原之細胞或組織之治療劑，且不與其他蛋白 貝顯著交又反應。在έ亥等實施例中，抗體與”非乾”蛋白質 f 之結合程度將小於抗體與其特定靶蛋白質之結合的約 10%，此如藉由螢光活化細胞分類（FACS)*析或放射免疫 沈澱法（RIA)所測定。關於抗體與靶分子之結合，術語，，特 異性結合”或”特異性地結合於”特定多肽或特定多肽靶上 之抗原決定基或對特定多肽或特定多肽靶上之抗原決定基 ”具特異性”意謂在可量測程度上不同於非特異性相互作用 之結合。特異性結合可（例如）藉由測定與對照分子之結合 相比的分子之結合來量測，該對照分子一般為不具有結合 ( 活性之類似結構之分子。舉例而言，特異性結合可藉由與 類似於靶之對照分子（例如過量非標記靶）競爭來測定。在 此狀況下，若標記靶與探針之結合被過量未標記靶競爭性 地抑制，則表不特異性結合。如本文所使用’術語"特異 性結合’’或”特異性地結合於"特定多肽或特定多肽靶上之 抗原決定基或對特定多肽或特定多肽靶上之抗原決定基 ”具特異性"可（例如）由對該靶具有至少約1〇_4 m、或者至少 約10-5M、或者至少約1〇-6M、或者至少約1〇_7M、或者至 I32799.doc • 44 - 200918089 少約10 8 μ、或者至少約1〇·9 M、或者至少約i〇1〇 μ、或 者至少約ΙΟ.11 Μ、或者至少約1(rl2 Μ或更大2Kd的分子 來展現。在—實施例中，術語,，特異性結合"係指分子結合 於特疋多肽或特定多肽上之抗原決定基但大體上不與任何 其他多肽或多肽抗原決定基結合的結合。 抑制表現CD79b多肽之腫瘤細胞生長"之抗體或"生長抑 制性"抗體為導致對於表現或過表現適當CD79b多肽之癌細 胞的可量测之生長抑制作用的抗體。CD79b多肽可為表現 於癌細胞表面上之跨膜多肽或可為由癌細胞產生且分泌之 多肽。與適當對照組相比，較佳之生長抑制性抗_CD79b抗 體對於表現CD79b之腫瘤細胞的生長抑制率大於2〇%，較 佳約20%至約50%，且甚至更佳大於5〇%(例如約5〇%至約 100%)，該對照組通常為未用測試抗體治療之腫瘤細胞。 在一實施例中，可於在細胞培養物中約〇 J Rg/ml至3〇 pg/ml或約0.5 nM至200 nM之抗體濃度下量測生長抑制， 其中在使腫瘤細胞暴露於抗體後1-1〇天測定該生長抑制。 活體内腫瘤細胞之生長抑制可以多種方式測定，諸如下述 實驗實例章節中所描述。若投與約1微克/公斤體重至約 100毫克/公斤體重之抗-CD79b抗體導致在距離第一次投與 抗體約5天至3個月内（較佳約5天至3 0天内）腫瘤尺寸減小或 腫瘤細胞增生減少，則該抗體具活體内生長抑制性。 π誘發細胞〉周亡”之抗體為如藉由膜聯蛋白V(ann ex in V) 之結合、DNA之斷裂、細胞收縮、内質網之擴張、細胞斷 裂及/或膜囊（稱為細胞凋亡體）之形成所確定誘發漸進式細 132799.doc • 45· 200918089 胞死亡的抗體。該細胞通常為過表現CD79b多肽之細胞。 較佳地’該細胞為腫瘤細胞，例如造血細胞，諸如B細 胞、T細胞、嗜驗性球、嗜伊紅血_球、嗜中性白血球、單 核細胞、血小板或紅血球。各種方法可用於評估與細胞祠 亡相關之細胞事件。舉例而言’鱗脂醢絲胺酸（PS)易位可 藉由膜聯蛋白結合來量測；DNA斷裂可經由DNA條帶 (DNA laddering)來評估；且核/染色質凝集以及dNA斷裂 可藉由亞二倍體細胞之任何增加來評估。較佳地，誘發細 胞凋亡之抗體為在膜聯蛋白結合檢定中導致膜聯蛋白結合 之誘發相對於未經處理之細胞為約2至5 0倍、較佳約5至5 0 倍且最佳約10至50倍的抗體。 "誘發細胞死亡”之抗體為使得活細胞變得不能存活之抗 體。該細胞為表現CD79b多肽且為特異性表現或過表現 CD79b多肽之細胞類型的細胞。該細胞可為特定細胞類型 之癌細胞或正常細胞。CD79b多肽可為表現於癌細胞表面 上之跨膜多肽或可為由癌細胞產生且分泌之多肽。細胞可 為癌細胞，例如B細胞或τ細胞。活體外細胞死亡可在補體 及免疫效應細胞不存在之情況下確定以區別由抗體依賴性 細胞介導細胞毒性（ADCC)或補體依賴性細胞毒性（Cdc)誘 發之細胞死亡。因此，對於細胞死亡之檢定可使用熱滅活 血清（亦即，在補體不存在之情況下）且在免疫效應細胞不 存在之情況下執行。為確定抗體是否能夠誘發細胞死亡， 如藉由攝取峨化丙啶（ΡΙ)、錐蟲藍（參見Moore等人， Cytotechnology 17:1_U (1995))或 7AAD 所評估之膜完整性 132799.doc -46- 200918089 之損失可相對於未經處理之細胞進行評估。較佳之細胞死 亡誘發抗體為在PI攝取檢定中於BT474細胞中誘發pi攝取 之彼等抗體。 抗體"效應功能"係指可歸因於抗體之Fc區（天然序列Fc區 或胺基酸序列變異F c區）之彼等生物活性，且隨抗體同型 而變化。抗體效應功能之實例包括：C1 q結合及補體依賴 性細胞毒性；F c受體結合；抗體依賴性細胞介導細胞毒性 (ADCC);吞噬作用；細胞表面受體（例如B細胞受體）之下 f 調；及B細胞活化。 本文中術語"Fc區”係用於定義免疫球蛋白重鏈之C末端 區域，包括天然序列Fc區及變異Fc區。儘管免疫球蛋白重 鏈之Fc區之邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc區通常係定義 為自位置Cys226處之胺基酸殘基或自Pro230延伸至其羧基 末端。Fc區之C末端離胺酸（根據EU編號系統為殘基447)可 (例如）在產生或純化抗體期間加以移除，或藉由重組工程 化編碼抗體之重鏈之核酸來移除。因此，完整抗體之組合 V 物可包含所有K447殘基被移除之抗體群體、K447殘基未 被移除之抗體群體及具有含有K447殘基之抗體與無K447 殘基之抗體之混合物的抗體群體。 ”功能性Fc區"具有天然序列Fc區之"效應功能"。例示性 "效應功能"包括Clq結合；CDC ; Fc受體結合；ADCC ;吞 喧作用；細胞表面受體（例如B細胞受體；BCR)之下調 等。該等效應功能一般需要Fc區與結合域（例如抗體可變 域）組合且可使用例如本文定義中所揭示之各種檢定來評 132799.doc -47- 200918089 估。 "天然序列Fc區”包含與自然界中所見之Fc區之胺基酸序 列一致的胺基酸序列。天然序列人類F c區包括天然序列人 類IgGl Fc區（非A及A異型）；天然序列人類IgG2 Fc區；天 然序列人類IgG3 Fc區；及天然序列人類igG4 Fc區’以及 其天然存在之變異體。 "變異Fc區"包含由於至少一個胺基酸修飾、較佳一或多 個胺基酸取代而不同於天然序列Fc區之胺基酸序列的胺基 ( 酸序列。較佳地’與天然序列Fc區或親本多肽之Fc區相 比’該變異Fc區在天然序列Fc區中或在親本多肽之Fc區中 具有至少一個胺基酸取代，例如約1個至約丨〇個胺基酸取 代，且較佳約1個至約5個胺基酸取代。本文中之變異Fc區 將較佳與天然序列Fc區及/或與親本多肽之Fc區具有至少 約80%同源性，且最佳與其具有至少約9〇%同源性，更佳 與其具有至少約95%同源性。 ”抗體依賴性細胞介導細胞毒性”或” ADCC，，係指細胞毒 k 性之一種形式，其中結合於存在於某些細胞毒性細胞（例 如’自然殺手（NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞）上的 Fc受體（FcR)上之分泌性ig使此等細胞毒性效應細胞能夠與 帶有抗原之靶細胞特異性結合且隨後用細胞毒素殺死該靶 細胞。抗體”武裝”細胞毒性細胞且為該殺死絕對所需。介 導ADCC之初級細胞，即NK細胞僅表現FcγRΠI，而單核細 胞表現FcyRI ' FqRn及FcyRIII。造血細胞上之FcR表現係 概述於 Ravetch 及 Kinet，Annu. Rev. Immunol. 9:457- 132799.doc •48- 200918089 92(1991)之第464頁之表3中。為評估所關注分子之ADCC 活性’可執行活體外ADCC檢定，諸如美國專利第 5,500,362號或第5,821，337號中所述之檢定。適用於該等檢 疋之效應細胞包括周邊血液單核細胞（pBMC)及自然殺手 (NK)細胞。或者或另外，所關注分子之adcc活性可在活 體内評估’例如在諸如clynes等人，（USA) 95:652_ 656(1 998)中所揭示之動物模型中。
Fc ^:體或nFcR"描述結合於抗體之Fe區之受體。較佳 FcR為天然序列人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG抗體 (γ受體）且包括FcyRI、FcyRII及FcyRIII亞類之受體的 FcR ’包括對偶基因變異體及此等受體之替代性拼接形 式。FcyRII受體包括FcyRIIA(；"活化受體。及FcyRIIB(n抑制 受體"）’其具有主要其細胞質域不同之類似胺基酸序列。 活化受體Fc7RIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺 酸之活化基元（ITAM)。抑制受體FqRIIB在其細胞質域中 含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基元（ITIM)。（參見 Daeron, Annu. Rev. Immunol. 1 5:203-234( 1997)中之综 述，M.)。FcR 係於 Ravetch 及 Kinet，Aunu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991) ; Capel 等人，Immunomethods 4:25-34 (1994) ’ 及 de Haas 等人，J. Lab. Clin. Med. 126:330- 41(1995)中有評述。包括有待以後鑑別之彼等者的其他 FcR為本文中之術語"FcR"所涵蓋。該術語亦包括新生兒受 體FcRn，其引起母IgG轉移至胎兒（Guyer等人，j.
Immunol. 117:587(1976)及 Kim 等人，J. Immunol· 24:249 132799.doc -49- 200918089 (1994)) 〇 可（例如）在表現人類FcRn之轉殖基因小鼠或經轉染人類 細胞株中，或在投與具有變異Fc區之多肽之靈長類動物中 檢定人類FcRn高親和力結合多肽活體内與人類FcRn之結 合及血清半衰期。WO 2000/42072(Presta)描述與FcR之結 合得到改善或減少之抗體變異體。亦參見（例如）81141(18等 人，乂 化〇/· 9(2):6591-6604 (2001)。 人類效應細胞”為表現一或多個FcR且執行效應功能之 白jk球。較佳地，該等細胞至少表現Fc(yRIII且執行ADCC 效應功能。介導ADCC之人類白血球的實例包括周邊血液 單核細胞（PBMC)、自然殺手（NK)細胞、單核細胞、細胞 毒性T細胞及嗜中性白血球；其中PBMC及NK細胞為較 佳。效應細胞可自天然來源分離，例如自血液分離。 π補體依賴性細胞毒性”或”CDCM$指在補體存在下靶細 胞之溶解。典型補體路徑之活化係由補體系統之第一組份 (C 1 q)與（適當亞類之）與同源抗原結合之抗體的結合而引 起。為評估補體活化，可執行CDC檢定，例如Gazzano-Santoro 等人，J. Immunol. Methods 202:163(1996)中所 述。Fc區胺基酸序列發生改變（具有變異Fc區之多肽）且 Clq結合能力得到增強或降低之多肽變異體係（例如）描述 於美國專利第6，194,551 61號及\\^0 1999/51642中。亦參見 例如 Idusogie等人，J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) 〇 術語”包含Fc區之抗體”係指包含Fc區之抗體。Fc區之C 末端離胺酸（根據EU編號系統為殘基447)可（例如）在純化抗 132799.doc -50- 200918089 體期間加以移除，或藉由重組工程化編碼抗體之核酸來移 除。因此，根據本發明之包含具有Fc區之抗體的組合物可 包含具有K447之抗體、所有K447被移除之抗體或具有 K447殘基之抗體與無〖447殘基之抗體之混合物。 CD79b多肽’’細胞外域"或"ECD"係指基本上不含跨膜域 及細胞質域之CD79b多肽之一種形式。通常，CD79b多肽 ECD將具有不到1%之該等跨膜域及/或細胞質域且較佳將 具有不到0.5%之該等域。應瞭解，對於本發明之cD79b多 f 肽鑑別之任何跨臈域係按照此項技術中常被用於鑑別疏水 性域之類型之標準來鑑別。跨膜域之準確邊界可如本文中 最初所鑑別於該域之任一末端處變化（但很可能）最多不超 過約5個胺基酸。因此，視情況，CD79b多肽之細胞外域 可如實例或說明書中所鑑別於跨膜域/細胞外域邊界之任 一側上含有約5個或以下之胺基酸，且本發明涵蓋具有相 關k號肽或無相關信號肽之該等多肽及編碼其之核酸。 赛 本文所揭示之CD79b多肽之”信號肽”的近似位置可展示 I 於本發明之說明書及/或附圖中。然而，應注意，信號肽 之C末端邊界可如本文中最初所鑑別於信號肽〇末端邊界 之任一側上變化（但很可能）最多不超過約5個胺基酸，其中 信號肽之C末端邊界可按照此項技術中常被用於鑑別胺基 酸序列元件之類型之標準來鑑別（例如，Nieisen等人，
Prot· Eng. 1〇:1_6(1997)及_ Heinje等人，Nucl· Acids.
Res· 14:4683-4690 (1986))。此外，亦認識到在一些情況 下，信號序列自分泌性多肽之裂解並非完全均勻，從而產 132799.doc -51 - 200918089 生多於一種分泌物質。本發明涵蓋此等成熟多肽（其中如 本文所鑑別，信號肽在信號肽之c末端邊界之任一侧上最 多不超過約5個胺基酸内發生裂解）及編碼其之聚核苷酸。 nCD79b多肽變異體π意謂如本文所定義與如本文所揭示 之全長天然序列CD79b多肽序列、缺乏如本文所揭示之信 號肽之CD79b多肽序列、具有或無如本文所揭示之信號肽 之CD79b多肽的細胞外域或如本文所揭示之全長CD79b多 肽序列之任何其他片段（諸如由僅為全長CD79b多肽之完整 編碼序列之一部分的核酸編碼之彼等者）具有至少約80%胺 基酸序列一致性的CD79b多肽，較佳為活性CD79b多肽。 該等CD79b多肽變異體包括（例如）於全長天然胺基酸序列 之N或C末端處添加或刪除一或多個胺基酸殘基之CD79b多 肽。通常，CD79b多肽變異體將與如本文所揭示之全長天 然序列CD79b多肽序列、缺乏如本文所揭示之信號肽之 CD79b多肽序列、具有或無如本文所揭示之信號肽之 CD79b多肽的細胞外域或如本文所揭示之全長CD79b多肽 序列的任何其他經具體定義之片段具有至少約80%胺基酸 序列一致性，或者至少約81%、82%、83%、84%、85%、 86% ' 87% > 88% ' 89% ' 90% ' 91% > 92% > 93% ' 94% ' 95%、96°/。、97%、98%或99%胺基酸序列一致性。通常， CD79b變異多肽之長度為至少約10個胺基酸，或者長度為 至少約 20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、 120 、 130 、 140 、 150 、 160 、 170 、 180 、 190 、 200 、 210 、 220 ' 230 ' 240 ' 250 、 260 ' 270 、 280 、 290 、 300 、 310 、 132799.doc •52- 200918089 320 ' 330 、 340 、 350 ' 360 、 370 、 380 、 390 、 400 ' 410 、 420 、 430 、 440 、 450 ' 460 、 470 、 480 、 490 ' 500 、 510 、 520、530、540 ' 550、560、570、580、590、600個胺基 酸’或更長。視情況，CD79b變異多肽將具有與天然 CD79b多肽序列相比不超過一個的保守性胺基酸取代，或 者具有與天然CD79b多肽序列相比不超過2、3、4、5、 6、7、8、9或10個的保守性胺基酸取代。 關於肽或多肽序列（亦即本文中所鑑別之CD79b多肽序 C 列）之"胺基酸序列一致性百分數（％)”係定義為在比對序列 且必要時引入缺口以達成最大序列一致性百分數且不將任 何保守性取代視作序列一致性之一部分後，候選序列中與 特定肽或多肽序列（亦即CD79b多肽序列）中之胺基酸殘基 一致之胺基酸殘基的百分數。出於測定胺基酸序列一致性 百分數之目的’比對可以屬於此項技術技能範圍内之多種 方式達成，例如使用公開可得到之電腦軟體，諸如 BLAST、BLAST-2、ALIGN或 Megalign(DNASTAR)軟體。 I 、 V 為量測比對，熟習此項技術者可確定適當參數，包括在正 進行比較的序列之全長上達成最大比對所需之任何演算 法。然而’出於本文之目的，使用序列比較電腦程式 ALIGN-2產生胺基酸序列一致性0/〇值，其中align_2程式 之7G整原始碼在下文表1中提供。ALIGN_2序列比較電腦 程式係由Genentech，Inc.創造且下文表1中所示之原始碼已 在美國版權局（U.S. Copyright OfficeKWashington D.C.， 20559)與用戶文件一起備案，在美國版權局其以美國版權 132799.doc -53- 200918089 登記號TXU5 10087登記。ALIGN-2程式可公開經由 Genentech，Inc.(South San Francisco，California)得到或可 由下文表1中提供之原始碼編譯。ALIGN-2程式應經編譯 以於UNIX操作系統、較佳數位UNIX V4.0D上使用。所有 序列比較參數係藉由ALIGN-2程式設定且並不變化。 在利用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情況下，如下計 算特定胺基酸序列A與特定胺基酸序列B之胺基酸序列一 致性％(其或者可表述為特定胺基酸序列A與特定胺基酸序 f 列B具有或包含某一胺基酸序列一致性％): 10〇χ(Χ/Υ) 其中X為在A與B之序列比對程式ALIGN-2比對中由該程式 評定為一致匹配之胺基酸殘基的數目，且其中Y為B之胺 基酸殘基的總數。應瞭解，當胺基酸序列A之長度不等於 胺基酸序列B之長度時，A與B之胺基酸序列一致性％不會 等於B與A之胺基酸序列一致性％。 ”CD79b變異聚核苷酸”或"CD79b變異核酸序列"意謂編 f 、 碼如本文所定義之CD79b多肽、較佳為活性CD79b多肽且 與編碼如本文所揭示之全長天然序列CD79b多肽序列、缺 乏如本文所揭示之信號肽之全長天然序列CD79b多肽序 列、具有或無如本文所揭示之信號肽之CD79b多肽的細胞 外域或如本文所揭示之全長CD79b多肽序列之任何其他片 段（諸如由僅為全長CD79b多肽之完整編碼序列之一部分的 核酸編碼之彼等者）的核苷酸酸序列具有至少約80%核酸序 列一致性之核酸分子。通常，CD79b變異聚核苷酸將與編 132799.doc -54- 200918089 碼如本文所揭示之全長天然序列CD79b多肽序列、缺乏如 本文所揭示之信號肽之全長天然序列CD79b多肽序列、具 有或無如本文所揭示之信號序列之CD79b多肽的細胞外域 或如本文所揭示之全長CD79b多肽序列之任何其他片段的 核酸序列具有至少約80%核酸序列一致性，或者至少約 81%、82%、83%、84%、85%、86%、870/〇、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、980/〇或 99%核酸序列一致性。變異體並不包含天然核苷酸序列。 通常，CD79b變異聚核苷酸之長度為至少約5個核苷 酸，或者長度為至少約6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、35 ' 40、45 ' 50、55、60、65、 70、75、80、85、90、95、100、1〇5、110、115、120、 125 、 130 、 135 、 140 、 145 、 150 、 155 、 160 、 165 、 170 、 175 、 180 、 185 ' 190 、 195 、 200 、 210 、 220 、 230 、 240 、 250 、 260 、 270 、 280 、 290 ' 300 ' 310 、 320 、 330 、 340 、 350 、 360 、 370 、 380 、 390 、 400 、 410 、 420 、 430 、 440 、 450 、 460 、 470 、 480 、 490 、 500 、 510 、 520 、 530 、 540 、 550 、 560 、 570 、 580 、 590 、 600 、 610 、 620 、 630 、 640 、 650 、 660 、 670 、 680 、 690 、 700 、 710 、 720 、 730 、 740 ' 750 、 760 、 770 、 780 、 790 、 800 、 810 、 820 、 830 、 840 、 850 、 860 、 870 、 880 、 890 、 900 、 910 、 920 ' 930 、 940 、 950、960、970、980、990或1000個核苷酸，其中就此而 言術語'’約”意謂參考核苷酸序列長度加上或減去彼參考長 132799.doc -55- 200918089 度之10%。 關於本文中所鑑別之編碼CD79b之核酸序列的"核酸序 列一致性百分數（％)"係定義為在比對序列且必要時引入缺 口以達成最大序列一致性百分數後，候選序列中與所關注 之CD79b核酸序列中之核苷酸一致的核苷酸之百分數。出 於測定核酸序列一致性百分數之目的，比對可以屬於此項 技術技月b車ϋ圍内之多種方式達成，例如使用公開可得到之 電腦軟體’諸如BLAST、BLAST-2 、ALIGN或
Megalign(DNASTAR)軟體。然而，出於本文之目的，使用 序列比較電腦程式A LIG N - 2產生核酸序列一致性％值，其 中ALIGN-2程式之完整原始碼在下文表1中提供。aliqn_2 序列比較電腦程式係由Genentech, Inc.創造且下文表ι中所 示之原始碼已在美國版權局（us. c〇pyHght Office)(Washington D.C·，20559)與用戶文件一起備案，在 美國版權局其以美國版權登記號TXU510087登記。 ALIGN-2 程式可公開經由 Genentech，Inc.(South San
Francisco，California)得到或可由下文表上中提供之原始碼 編譯。ALIGN-2程式應經編譯以於UNIX操作系統、較佳 數位UNIX V4.0D上使用。所有序列比較參數係藉由 ALIGN-2程式設定且並不變化。 在利用ALIGN-2進行核酸序列比較之情況下，如下計算 特定核酸序列C與特定核酸序列D之核酸序列一致性％(其 或者可表述為特定核酸序列C與特定核酸序列d具有或包 含某一核酸序列一致性。/〇): 132799.doc -56- 200918089 10〇x(W/Z) 其中W為在c與D之序列比對程式ALIGN-2比對中由該程式 s平定為一致匹配之核苷酸的數目，且其中Z為d之核苷酸 的總數。應瞭解，當核酸序列C之長度不等於核酸序列〇 之長度時，C與D之核酸序列一致性％不會等於d與c之核 酸序列一致性％。除非另外特別規定’否則本文中所使用 之所有核酸序列一致性％值係如剛剛前段中所述使用 ALIGN-2電腦程式獲得。 在其他實施例中，CD79b變異聚核苷酸為編碼CD79b多 肽且較佳在嚴格雜交及洗滌條件下能夠與編碼如本文所揭 不之全長CD79b多肽的核苷酸序列雜交之核酸分子。 CD79b變異多肽可為由CD79b變異聚核苷酸編碼之彼等 者。 術浯’’全長編碼區”在關於編碼CD79b多肽之核酸使用時 系才曰、.扁碼本發明之全長CD79b多肽的核苷酸序列（其在附圖 中常常被展示介於起始密碼子與終止密碼子(包括起始密 碼子與終止密碼子）之間）。術語，，全長編碼
區"在關於ATCC 寄存核酸使用時係指插入寄存於ATCC之載體中之cDna的 CD79b多肽編碼部分（其在附圖中常常被展示介於起始密碼 子與終止密碼子(包括起始密碼子與終止密碼子)之間(起始 密碼子及終止密碼子在圖中為粗體且加下劃線))。 神、i刀離在用於描述本文所揭示之各種CD?讣多肽時意 月已自自然％ ^之組份中別且分離及/或回收的多狀。 其自然環境之污染物組份為通常會干擾多肽之治療用途之 132799.doc -57· 200918089 物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質性或非蛋白質性溶 質。在較佳實施例中，多肽將被純化（1)至足以藉由使用轉 杯式測序儀獲得N末端或内部胺基酸序列之至少15個殘基 的程度；或（2)至藉由SDS_PAGE在非還原或還原條件下使 用庫馬斯藍或較佳銀染色得知之均質性。經分離之多肽包 括重組細胞内之原位多肽，此係因為CD79b多肽自然環境 中之至少一個組份將不會存在。然而，經分離之多肽通常 將藉由至少一個純化步驟來製備。 ί 經分離之"CD79b多肽編碼核酸或其他多肽編碼核酸為 自其通常在多肽編碼核酸之自然來源中所締合的至少一種 污染物核酸分子中鑑別及分離之核酸分子。經分離之多肽 編碼核酸分子在形式或背景方面不同於自然界中所見。因 此’經分離之多肽編碼核酸分子有別於存在於自然細胞中 之特定的多肽編碼核酸分子。然而’經分離之多肽編碼核 酸分子包括包含於通常表現該多肽之細胞中的多肽編碼核 酸分子’其中例如核酸分子位於不同於自然細胞之染色體 V 位置處。 術語”控制序列"係指在特定宿主有機體中表現可操作連 接之編碼序列所必需的DNA序列。適合於原核生物之控制 序列（例如）包括啟動子，視情況包括操縱子序列及核糖體 結合位點。已知真核細胞利用啟動子、多聚腺嘌呤信號及 增強子。 當使核酸與另一核酸序列功能相關時，該核酸被”可操 作地連接”。舉例而言，前序列（presequence)或分泌性前導 132799.doc -58· 200918089 序列之DNA若纟被表現為參與多狀之 被可掘柞从、*分 刀’必的别體蛋白質則 編巧心 多肽之刪，·啟動子或增強子若其影響 錄㈣可操作地連接於該編碼序列，·或核糖 若其經定㈣有助於轉譯則被可操作地連接於 =碼序列。—般而言，”可操作地連接，，意謂所連接之dna =列為鄰接的，且在分泌性前導序列之情況下為鄰接的及 處於閱讀階段。然而，增強子不必為鄰接的。藉由接合於 適宜限制性位點處來實現連接。若該等位點不存在，則根 據t知作法使用合成寡核苷酸接頭或連接子。
雜交反應之”嚴格性，，可容易地由一般熟習此項技術者確 定’且-般為視探針長度、洗膝溫度及鹽濃度而定之經驗 計算。-般而言’為了恰當退火’較長探針需要較高溫 度，而較短探針需要較低溫度。雜交一般視變性DNA在互 補股存在於低於其熔融溫度之環境中時再退火之能力而 定。探針與可雜交序列之間的所要同源性之程度愈高可 使用之相對溫度愈高。因此’由此可見，較高相對溫度將 會傾向於使反應條件更嚴格，而較低溫度較少如此。關於 雜交反應之嚴格性之其他詳情及解釋，參見Ausubel等 人，Current Protocols in Molecular Bi〇1〇gy Wiley Interscience Publishers, (1995) 〇 如本文所定義之”嚴格條件”或"高嚴格性條件"可由下述 方式來確定：（1)利用低離子強度及高溫進行洗滌，例如於 5(TC下，0.015 Μ氣化鈉/0.0015 M檸檬酸鈉/〇1%十二烷基 硫酸鈉’（2)在雜父期間利用變性劑，諸如曱醯胺，例如於 132799.doc •59· 200918089 42°C下，50%(v/v)甲醯胺及0.1%牛血清白蛋白/〇,i〇/0菲科爾 (Ficoll)/0.1%聚乙烯β比洛17定酮/50 mM磷酸納緩衝劑（pH 6·5)及 75 0 mM氣化鈉、75mM擰檬酸鈉；或（3)於42。C下在 使用 50% 甲醯胺、5xSSC(0_75 M NaCl、0.075 Μ檸檬酸 鈉）、50 mM填酸鈉（pH 6.8)、0·1°/。焦磷酸鈉、5xDenhardt 溶液（Denhardt's solution)、經超音波處理之鮭魚精DNA(50 pg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖之溶液中隔夜雜交， 其中於42°C下以〇.2xSSC(氯化鈉/擰檬酸鈉）洗滌10分鐘， 接著為於55°C下由〇·1χ含有EDTA之SSC組成之1〇分鐘高嚴 格性洗滌。 "適度嚴格條件”可如Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press，1989所述來確定，且包括使用嚴格性低於上 述彼等者之洗滌溶液及雜交條件（例如溫度、離子強度及0/〇 SDS)。適度嚴格條件之一實例為於37。〇下在包含20%甲酿 胺、5xSSC(150 mM NaC卜 15 mM檸檬酸三鈉）、50 mM鱗 酸鈉（pH 7.6)、5xDenhardt溶液、i〇〇/0硫酸葡聚糖及2〇 mg/ml變性剪切鮭魚精DNA之溶液中隔夜培養，接著於約 37-50 C下以1 XSSC洗滌過濾器。熟習技術者將認識到如何 按需要調整溫度、離子強度等以適應諸如探針長度及其類 似者之因素。 術語"抗原決定基標記"當在本文中使用時係指包含與 "標記多肽"融合之CD79b多肽或抗_CD79b抗體的嵌合多 肽。該標記多肽具有足夠殘基來提供抗體產生所針對之抗 132799.doc -60- 200918089 原決定基，但又足夠短以至於其不會干擾其所融合之多肤 之活性。標圮多肽較佳亦為相當獨特的以至於抗體大體上 不與其他抗原決定基交又反應。合適之標記多狀一般具有 至少6個胺基酸殘基且通常具有約8個與5〇個之間的胺基酸 殘基數（較佳約10個與20個之間的胺基酸殘基數）。 出於本文之目的，”活性"係指保持天然或天然存在之 CD79b2生物及/或免疫活性的CD79b多肽之形式，其中 ”生物"活性係指由天然或天然存在之cD79b引起之生物學 Γ 功能（抑制或刺激），其不同於誘發產生針對由天然或天然 存在之CD79b所具有之抗原性抗原決定基的抗體之能力， 且免疫，活性係指誘發產生針對由天然或天然存在之 CD79b所具有之抗原性抗原決定基的抗體之能力。 術浯拮抗劑"係在最廣泛意義上加以使用且包括部分或 完全阻斷、抑制或中和天然CD79b多肽之生物活性的任何 分子。以類似方式，術語，，促效劑"係在最廣泛意義上加以 使用且包括模擬天然CD79b多肽之生物活性的任何分子。 a適之促效劑或拮抗劑分子特定地包括促效劑或拮抗劑抗 體或抗體片段、天然。娜多肽之片段或胺基酸序列變異 體肽、反義养核苷酸、小有機分子等。鑑別CD79b多肽 之促效劑或拮抗劑之方法可包含使CD79b多肽與候選促效 刎或七抗劑分子接觸且量測一或多種通常與CD79b多肽相 關之生物活性之可偵測變化。 經純化”意謂分子係以含有該分子之樣品中至少％重量 %或至少98重量％的濃度存在於該樣品中。 132799.doc -61 - 200918089 ”經分離之”核酸分子為自其通常（例如）於其自然環境中 所締合之至少一種其他核酸分子中分離的核酸分子。經分 離之核酸分子進一步包括包含於通常表現該核酸分子之細 胞中的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於 不同於自然染色體位置之染色體位置處。 如本文所使用’術語”載體，，意欲指能夠輸送其所連接之 另一核酸的核酸分子。一種類型之載體為"質體"，其係指 其他DNA區段可連接之環狀雙股DNA環。另一種類型之載 ( ' 體為噬菌體載體。另一種類型之載體為病毒載體，其中其 他DN A區段可連接於病毒基因組中。某些載體能夠在引入 其之宿主細胞中自主複製（例如，具有細菌複製起點之細 菌载體及游離型哺乳動物載體）。其他載體（例如，非游離 型哺乳動物載體）可在引入宿主細胞中後整合至宿主細胞 之基因組中，且藉此與宿主基因組一起複製。此外，某些 載體能夠引導其可操作地連接之基因的表現。該等載體在 ， 本文中稱為”重組表現載體”（或簡稱為，，重組載體"）。一般 I而&，重組dna技術中具有效用之表現載體常常呈質體之 形式。在本說明書中，"質體"及"載體，，可互換使用，此係 因為質體為最常用之載體形式。 如本文中可互換使用之"聚核苷酸"或”核酸，，係指任何長 度之核苦酸之聚合物，且包括丽及RNA。核苦酸可為脫 氧核糖核*酸、核糖核苦酸、經修飾之核*酸或鹼基及/ 或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由 併入聚合物中之任何受質。聚核普酸可包含經修錦之核^ 132799.doc * 62 - 200918089
酸’諸如甲基化核m及其類似物。若存在，則可在聚八 物組裝之前或之後給予對核苦酸結構之修飾。核普酸之^ 列可為繼酸組分所穿插。可在合成後進一步修韩聚核 苦酸，諸如藉由與標記結合來修飾。其他類型之修飾包括 (例如）"帽子％用類似物取代天然存在之核苷酸中之一或 多者；核*酸間修飾，諸如具有不帶電鍵之修飾(例如， 膦酸曱醋、磷酸三醋、磷醯胺酸酿、胺基甲酸醋等）及且 有帶電鍵之修飾（例如，硫代磷酸酷、二硫代磷酸酿等/、' 含有側位部分之修飾（諸如蛋白質，例如核酸酶、毒素、 抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等）、具有嵌人劑之修飾（例 如’ 口丫咬、補骨脂素等）、含有螯合劑之修飾（例如，金 屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等）、含有烷基化劑之修 飾、具有經修飾之鍵的修飾（例如，α_變旋異構核酸等）Y 以及未經修飾形式之聚核苷酸。此外，通常存在於糖中之 羥基之任一者可（例如）經膦酸酯基、磷酸酯基置換經標 準保護基保護，或經活化以製備連接其他核苷酸之其他 鍵’或可與固體或半固體支撐物結合。51及3,末端〇h可經 填酸化或經胺或具有丄至⑼個碳原子之有機封端基團部分 取代。其他羥基亦可衍生為標準保護基。聚核苷酸亦可含 有此項技術中一般已知之類似形式之核糖或脫氧核糖，包 括（例如）2，-〇-甲基-核糖、2，_〇_烯丙基核糖、2，-氟_核糖或 2’-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α變旋異構糖、差向異 構糖（諸如，阿拉伯糖、木糖或來蘇糖）、哌喃醣、呋喃 醣、景天庚酮糖（sedoheptulose)、非環狀類似物及無鹼基 I32799.doc -63 - 200918089 核皆類似物（諸如甲基核糖核苦）。一或多個填酸二酿鍵可 經替代性鍵聯基團置換。此等替代性鍵聯基團包括（但不 限於）磷酸酯經P(〇)S(”硫代酸酯”）、p(s)s(”二硫代酸醋”）、 (0)NR2("醯胺酸酯"）、p(〇)R、P(0)0R·、CO 或 CH2("甲縮 酸"）置換之實施例，其中R或R，各自獨立地為Η或經取代或 未經取代之視情況含有喊（-〇·)鍵的烧基（1 _2〇個C)、芳 基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。並不需要聚核苦酸 中之所有鍵均相同。前面描述適用於本文提及之所有聚核 f 苷酸，包括RNA及DNA。 如本文所使用寡核苷酸"一般係指一般單股、一般為 合成之短聚核苷酸，其長度一般（但未必）小於約2〇〇個核苷 酸。術語"募核苷酸"及"聚核苷酸"並不互相排斥。上文關 於聚核苷酸之描述同樣且完全適用於募核苷酸。 術語”癌症"及”癌性"係指或描述哺乳動物之通常特徵為 不受調節之細胞生長的生理病狀。癌症之實例包括（但不 限於）造血癌或血液相關癌症，諸如淋巴瘤、白血病、骨 I 髓瘤或淋巴惡性腫瘤，以及脾之癌症及淋巴結之癌症，以 及癌瘤、胚細胞瘤及肉瘤。癌症之更特定實例包括B細胞 相關癌症，包括例如高度、中度及低度淋巴瘤（包括B細胞 淋巴瘤’諸如黏膜相關淋巴組織B細胞淋巴瘤及非霍奇金 氏淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、小淋巴細胞 性淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、彌漫性大細胞淋巴瘤、濾泡性 淋巴瘤及霍奇金氏淋巴瘤（H〇dgkin，s iymphoma)& τ細胞淋 巴瘤）及白灰病（包括繼發性白血病、慢性淋巴細胞性白血 132799.doc -64- 200918089 病（CLL)(諸如B細胞白血病（CD5+ B淋巴細胞））、骨髓性白 血病（諸如急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病）、淋巴 細胞性白血病（諸如急性淋巴母細胞性白血病（ALL))及脊 髓發育不良）以及其他血液學癌症及/或B細胞或T細胞相關 癌症。亦包括其他造血細胞之癌症，該等其他造血細胞包 括多形核白血球（諸如嗜鹼性球、嗜伊紅血球、嗜中性白 金球）及單核細胞、樹突狀細胞、血小板、紅血球及自然 殺手細胞。亦包括選自下列疾病之癌性B細胞增生性病 { 症：淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復 發性侵襲性NHL、復發性惰性NHL、難治性NHL、難治性 惰性NHL、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性 淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性 白ir病（ALL)及套細胞淋巴瘤^ B細胞癌症之來源包括如 下：邊緣區B細胞淋巴瘤起源於邊緣區中之記憶b細胞； 濾泡性淋巴瘤及彌漫性大B細胞淋巴瘤起源於生發中心之 亮區中之中心細胞（centrocyte);慢性淋巴細胞性白血病及 I 小淋巴細胞性白血病起源於B1細胞（CD5 + );套細胞淋巴瘤 起源於套區中之初始B細胞；及伯基特氏淋巴瘤起源於生 發中心之暗區中之中心母細胞（centroblast)。包括造血細胞 之組織（在本文中稱為”造血細胞組織”）包括胸腺及骨髓及周 邊淋巴組織，諸如脾、淋巴結、與黏膜相關之淋巴組織， 諸如腸相關淋巴組織、扁桃體、派伊爾斑（Peyer's patch)及 闌尾’及與其他黏膜相關之淋巴組織，例如支氣管襯裏。 該等癌症之其他特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、 132799.doc -65 - 200918089 非小細胞肺癌、肺之腺癌、肺之鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞 癌、胃腸癌、胰腺癌、神經膠質瘤、子宮頸癌、印巢癌、 肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、子 宮内膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、 外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、白血病及其他淋巴組織增生性 病症，以及各種類型之頭頸部癌。 ”B細胞惡性腫瘤”在本文中包括非霍奇金氏淋巴瘤 (NHL)，包括低度/慮泡性NHL、小淋巴細胞性（§l)NHL、 中度/濾泡性NHL、中度彌漫性NHL、高度免疫母細胞性 NHL、高度淋巴母細胞性NHL、高度小無裂細胞NHL、巨 瘤NHL、套細胞淋巴瘤、AIDS相關淋巴瘤及瓦爾登斯特倫 巨球蛋白血症（Waldenstrom's Macroglobulinemia)、非霍奇 金氏淋巴瘤（NHL)、淋巴細胞為主型霍奇金病（lymph〇cyte predominant Hodgkin's diSease，LPHD)、小淋巴細胞性淋 巴瘤（SLL)、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、惰性NHL(包 括復發性惰性NHL及利妥昔單抗（rituximab)難治性惰性 NHL);白血病，包括急性淋巴母細胞性白血病（all)、慢 性淋巴細胞性白血病（CLL)、毛細胞白血病、慢性骨髓母 細胞性白血病；套細胞淋巴瘤；及其他血液學惡性腫瘤。 該等惡性腫瘤可用針對B細胞表面標記（諸如⑶幾)之抗體 來治療。本文中預期藉由投與針對B細胞表面標記（諸如 CD79b)之抗體來治療該等疾病，i包括投與非結合（"裸") 抗體或與如本文所揭示之細胞毒性劑結合之抗體。本文中 亦預期藉由包括本發明之抗_CD79b抗體或抗.⑶爲抗體 132799.doc -66 - 200918089 藥物結合物與同時或連續投與之另一抗體或抗體藥物結合 物、另一細胞毒性劑、放射治療或其他治療之組合的組合 療法來治療該等疾病。在本發明之例示性治療方法中，將 本發明之抗-CD79b抗體與抗_CD2〇抗體、免疫球蛋白或其 CD20結合片段組合同時或依序投與。該抗-(：：1)2〇抗體可為 裸抗體或抗體藥物結合物。在組合療法之一實施例中， 抗-CD79b抗體為本發明之抗體且抗_Cd2〇抗體為 Rituxan®(利妥昔單抗）。 如本文所使用，術語"非霍奇金氏淋巴瘤”或"NHL”係指 淋巴系統之不同於霍奇金氏淋巴瘤之癌症。霍奇金氏淋巴 瘤與非霍奇金氏淋巴瘤之不同之處一般可在於霍奇金氏淋 巴瘤中存在里-斯一氏細胞（Reed-Sternberg cell)，而非霍 奇金氏淋巴瘤中不存在該等細胞。由如本文所使用之該術 語所涵蓋的非霍奇金氏淋巴瘤之實例包括將同樣由熟習此 項技術者（例如腫瘤學家或病理學家）根據此項技術中已知 之分類方案所鑑別的任何非霍奇金氏淋巴瘤，該等分類方 案諸如 Color Atlas of Clinical Hematology(第 3版），A· Victor Hoffbrand及 John E. Pettit(編）（Harcourt Publishers Ltd.，2000)中所述之修訂歐美淋巴瘤（Revjsed European-American Lymphoma，REAL)方案。尤其參見圖 11.57、11.58 及11.59中之列舉。更具體的實例包括（但不限於）復發性或 難治性NHL、前線低度NHL、第Πΐ/ΐν期NHL、化療抗性 NHL、前驅B淋巴母細胞白血病及/或淋巴瘤、小淋巴細胞 性淋巴瘤、B細胞慢性淋巴細胞性白血病及/或前淋巴細胞 132799.doc •67- 200918089 性白血病及/或小淋巴細胞性淋巴瘤、B細胞前淋巴細胞性 淋巴瘤、免疫細胞瘤及/或淋巴漿細胞淋巴瘤、淋巴漿細 胞淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、結外 邊緣區MALT淋巴瘤、結邊緣區淋巴瘤、毛細胞白血病、 漿細胞瘤及/或漿細胞骨髓瘤、低度/濾泡性淋巴瘤、中度/ 濾泡性NHL、套細胞淋巴瘤、濾泡中心淋巴瘤（濾泡性）、 中度彌漫性NHL、彌漫性大B細胞淋巴瘤、侵襲性NHL(包 括侵襲性前線NHL及侵襲性復發性NHL)、自體幹細胞移
植後復發或難治之NHL、原發性縱隔大b細胞淋巴瘤、原 發性渗出性淋巴瘤、高度免疫母細胞性NHL、高度淋巴母 細胞性NHL、高度小無裂細胞NHL、巨瘤NHL、伯基特氏 淋巴瘤、前驅（周邊）大顆粒淋巴細胞性白血病、蕈樣真菌 病及/或賽謝症候群（Sezary syndr〇me)、皮膚（皮膚性）淋巴 瘤多形性大細胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤。 "病症’’為將受益於用本發明之物質/分子或方法治療之任 可病狀此包括杈性及急性病症或疾病，包括使哺乳動物 易於罹患所述病症之彼等病理病狀。本文中所治療之病症 之非限制性實例包括癌性病狀，諸如惡性及良性腫瘤；非 病及淋巴惡性腫瘤；神經元、神經膠質、星形膠質細 胞下丘細及其他腺、巨嗟細胞、上皮細胞、基質及囊胚 、；、症及大症、免疫病症及其他血管生成相關病症。病 2纟包括癌性病狀，諸如B細胞増生性病症及/或B細 瘤，，例如淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（nhl) '侵襲性 復發性侵襲性NHL、復發性惰性NHL、難治性 132799.doc •68· 200918089 NHL、難治性惰性NHL、慢性.淋巴細胞性白血病（μ)、 小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（hcl)、急 性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。 術語"細胞增生性病症"及”增生性病症"係指與某種程度 之異常細胞增生相關之病症。在一實施例中，該細胞增生 性病症為癌症。 如本文所使用，"腫瘤"係指所有贅生性細胞生長及增生 (無論惡性抑或良性）以及所有癌前細胞與組織及癌性細胞 f 與組織。 本文中之"自體免疫疾病"為由個體自身組織或器官產生 及針對個體自身組織或器官之疾病或病症，或其共分離 (C〇-Segregate)或表現症狀或由此產生之病狀。在許多此等 自體免疫及發炎性病症中’可能存在多種臨床及實驗室標 ό己，包括（但不限於）高γ球蛋白血症、高自體抗體含量 '組 織中之抗原抗體複合物沈積、來自皮質類固醇或免疫抑制 劑治療之益處及受感染組織中之淋巴樣細胞聚集體。在不 I 受限於關於Β細胞介導性自體免疫疾病之任一理論的情況 下，咸仏Β細胞經由許多機械途徑展現對人類自體免疫疾 病之病原性影響，該等途徑包括自體抗體產生、免疫複合 物形成、樹突狀及Τ細胞活化、細胞因子合成、直接趨化 因子釋放及提供異位新淋巴生成之病灶。此等途徑之每一 者可不同程度地參與自體免疫疾病之病變。 "自體免疫疾病"可為器官特異性疾病（亦即，免疫反應特 異性地針對器官系統，諸如内分泌系統、造血系統、皮 132799.doc -69- 200918089 膚、心肺系統、胃腸及肝系統、腎系統、甲狀腺、耳朵、 神經肌肉系統、中樞神經系統等）或可影響多個器官系統 之全身性疾病（例如，全身性紅斑狼瘡（sle)、類風濕性關 節火夕肌火等）。較佳之該等疾病包括自體免疫風濕性 病症（諸如，類風濕性關節炎、休格連氏症候群（Sj0gren，s syndrome)、硬皮病、狼瘡（諸如SLE及狼瘡腎炎）、多肌炎/ 皮肌炎冷球蛋白血症、抗麟脂抗體症候群及牛皮癖性關 節炎）、自體免疫胃腸病及肝病（諸如，發炎性腸病（例如， ( 潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病（Crohn's disease))、自體免疫 胃炎及惡性貧血、自體免疫肝炎、原發性膽汁性肝硬化 症、原發性硬化性膽管炎及乳糜填）、血管炎（諸如anca 陰性血官炎及ANCA相關血管炎，包括徹奇_斯全司血管炎 (ChUrg-Strauss vasculitis)、韋格納氏肉牙腫病 gramd〇matosis)及顯微鏡下多血管炎⑽cr〇_pic polyangiitis))、自體免疫神經病症（諸如多發性硬化症、眼 ^ 15車擎肌陣擎症候群、重症肌無力、視神經脊趙炎、帕金森 氏病（ParldnS〇n,S disease)、阿茲海默氏病（Alzheimer，s disease) 及自體免疫多發性神經病）、腎病（諸如絲球體腎炎、古德 帕斯徹氏症候群（Goodpasture，s syndr〇me)及伯格氏師吨 d—)、自體免疫皮膚病(諸如，牛皮癖、風療、蓴麻 療、、尋常天范瘡、大皰性類天范瘡及皮膚性紅斑狼療）、 血液病（諸如，血小板減少性紫癜、栓塞性血小板減少性 紫癒、輸血後紫癜及自體免疫性溶血性貧血）、動脈粥樣 硬化、葡萄膜炎、自體免疫聽力疾病（諸如，内耳病及聽 132799.doc -70- 200918089 力喪失）、貝西氏病（Behcet，s disease)、雷諾氏症候群氓町naud，s syndrome)、盗官移植及自體免疫内分泌病症（諸如，糖尿 病相關自II免疫疾病，諸如胰島素依賴性糖尿病 (IDDM)、艾迪生氏病（Addison，s disease)及自體免疫甲狀 腺病（例如，格雷氏病（Graves, disease)及甲狀腺炎））。更佳 之該等疾病包括（例如）類風濕性關節炎、潰瘍性結腸炎、 ANCA相關血f炎、狼瘡、多發性硬化、休格連氏症候 群、格雷氏病、IDDM、惡性貧血、甲狀腺炎及絲球體腎炎。 如本文所定義，在一些情況下涵蓋彼等上文所列之疾病 之其他自體免疫疾病的特定實例包括（但不限於）關節炎（急 性及k性類風濕性關節炎（包括幼年發病型類風濕性關節 ^及諸如類風濕性滑膜炎之階段）、痛風或痛風性關節 炎、急性免疫性關節炎、慢性發炎性關節炎、退化性關節 X、、Π型膠原蛋白誘導性關節炎、傳染性關節《、萊姆關 節炎（Lyme arthritis)、增生性關節炎、牛皮癬性關節炎、 史提爾氏病（Still’s disease)、脊椎關節炎、骨關節炎、慢 性漸進性關節炎、關節炎畸形、慢性原發性多發性關節 炎、反應性關節炎、絕經期關節[雌激素缺乏關節炎 (estrogen-depletion arthritis)及強直性脊椎炎/類風濕性脊 椎炎）’自體免疫淋巴組織增生性疾病、發炎性過度增生 性皮膚病；牛皮癬，諸如斑塊狀牛皮癬、點狀牛皮癬、膿 皰性牛皮癬及指曱牛皮癬；特異反應，包括異位性疾病， 諸如枯草熱及喬布氏症候群（J〇bls syndrome);皮炎，包括 接觸性皮炎、慢性接觸性皮炎、剝脫性皮炎、過敏性皮 132799.doc 200918089 炎、過敏性接觸性皮炎、蓴麻療、疮療樣皮炎、錢帶狀皮 炎、月曰溢性皮炎、非特異性皮炎、原發性刺激性接觸性皮 炎及異位性皮炎；X性聯高IgM症候群（x_iinked hyper IgM syndrome);過敏性眼内發炎性疾病；蓴麻疹，諸如慢性 過敏性蓴麻疹及慢性特發性蓴麻疹，包括慢性自體免疫性 蓴麻疹；肌炎；多肌炎/皮肌炎；幼年型皮肌炎；中毒性 表皮壞死溶解；硬皮病（包括全身性硬皮病）；硬化症，諸 如全身性硬化症；多發性硬化症（MS)，諸如視神經脊髓炎 型MS(spin〇-〇ptical MS)、原發性進行性MS(ppMS)及復發 緩解型MS(RRMS);進行性全身性硬化症；動脈粥樣硬 化；動脈硬化；播散性硬化症；共濟失調性硬化症；視神 經脊髓炎（NMO);發炎性腸病（IBD)(例如，克羅恩氏病、 自體免疫導性腸胃疾病、腸胃炎症、結腸炎（諸如潰癌 1±結腸久、潰瘍性結腸炎、顯微鏡下結腸炎、膠原性結腸 炎、息肉狀結腸炎、壞死性小腸結腸炎及透壁性結腸炎) 及自體免疫發炎性腸病）；腸炎症；壞疽性膿皮病；結節 性紅斑；原發性硬化性膽管炎；呼吸箸迫症候群，包括成 人或急性呼吸碧迫症候群(ARDS);㈣膜炎；葡萄膜之全 ^或部分的炎症；虹膜炎；脈絡膜炎；自體免疫血液病； 移植物彳;L»宿主疾症..{n I.J. r 、’ s性水腫’諸如遺傳性血管性水 腫；如腦臈炎中之腦神經㈣；姓娠癌療；姓娠性類天癌 療=囊搔癢症；自體免疫印巢早衰；由自體免疫病狀引 犬發I·生耳聾，IgE介導性疾病，諸如過敏症及過敏性 及異位性鼻炎；腦炎，諸如拉斯馬森腦炎（Rasmussen,s 132799.doc -72- 200918089 en:phaht1S)及邊緣葉腦炎及/或腦幹腦炎；葡萄膜炎，諸 “葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽腫性葡萄膜炎、非 肉芽腫性葡萄臈炎、晶狀體過敏性葡萄膜炎、後葡萄膜炎 =體免㈣⑽炎；伴有及不伴有腎病症候群之絲球體 k()諸如忮性或急性絲球體腎炎，諸如原發性 GN、免疫介導性⑽、膜性GN(膜性腎病）、特發性膜性⑽ 或特發性膜性腎病、膜性增生性gn(mpgn)(包括工型及^ 型认快速進行性GN(RPGN);增生腎《：自體免疫多腺性 内分泌衰㉟；龜頭炎’包括漿細胞性侷限性龜頭炎、龜頭 包皮炎；離心性環形紅斑、持久性色素異常性紅斑、多形 性紅斑；S狀肉芽腫；光澤苔癖、硬化萎縮性苔蘚、慢性 單純性苔癖、小棘苔蘚、扁平苔# ;板層狀魚鱗病；表皮 松解性過度角化症、惡變前角化症；壞疽性膿皮病；過敏 性病狀及反應；食物過敏；藥物過敏；昆蟲過敏；罕見過 敏性病症，諸如肥大細胞增多症；過敏反應；濕疹，包括 過敏性或異位性濕疹、皮膚缺乏性濕疹、出汗障礙性濕疹 及水泡性掌摭濕療（vesicular palm〇planUr eczema);哮 喘，諸如支氣管哮喘、支氣管哮喘及自體免疫哮喘；涉及 T細胞浸潤之病狀及慢性發炎性反應；針對外來抗原之免 疫反應’諸如懷孕期間之胎兒Α_β·〇血型；慢性肺部發炎 性疾病；自體免疫心肌炎；白血球黏附缺陷病；狼瘡，包 括狼瘡腎炎、狼瘡性腦炎、小兒狼瘡、非腎狼瘡、腎外狼 瘡 '盤狀狼瘡及盤狀紅斑狼瘡、禿髮性狼瘡、sLE(諸如皮 膚性SLE或亞急性皮膚性SLE)、新生兒狼瘡症候群（nle) 132799.doc -73- 200918089 及播散性紅斑狼瘡，幼年發病型（i型）糖尿病，包括小兒 IDDM，成年發病型糖尿病（II型糖尿病）；自體免疫糖尿 病；特發性尿崩症；糖尿病性視網膜病；糖尿病性腎病； 糖尿病性結腸炎；糖尿病性大動脈病症；與由細胞因子及 T淋巴細胞介導之急性及遲發超敏反應相關之免疫反應； 肺結核；類肉瘤病；肉芽腫病’包括淋巴瘤樣肉芽腫病； 顆粒性球缺乏症；企管炎（包括大血管血管炎，諸如風濕 性多肌痛及巨細胞（高安氏（Takayasu's))動脈炎；中等也管 血管炎’諸如川崎氏病（Kawasaki's disease)及結節性多動 脈炎/結節性動脈周圍炎；免疫性血管炎、CNS血管炎、皮 膚性血官炎、超敏性血管炎、壞死性血管炎（諸如類纖維 蛋白壞死性血管炎及全身性壞死性血管炎）、Anc A陰性血 管炎及ANCA相關血管炎，諸如徹奇-斯全司症候群 (CSS)、韋格納氏肉芽腫病及顯微鏡下多血管炎；顳動脈 炎；再生障礙性貧血；自體免疫再生障礙性貧血；庫姆陽 性貧血（Coombs positive anemia);先天性純紅血球再生障 礙性貧血（Diamond Blackfan anemia);溶血性貧血或免疫 性溶血性貧血，包括自體免疫性溶血性貧血（AIHA);惡性 貧血（pernicious anemia/anemia perniciosa);艾迪生氏病； 純紅血球貧血或發育不全（pRCA);因子νιπ缺乏症；八型 血友病；自體免疫嗜中性球減少症；血球減少症’諸如全 血球減少症、白血球減少症、涉及白血球血球滲出之疾 病；CNS發炎性病症；阿兹海默氏病；帕金森氏病；多器 官損傷症候群，諸如繼發於敗血症之彼等者；外傷或出 132799.doc -74· 200918089 血；抗原抗體複合物介導性疾病；抗腎小球基底膜病·抗 磷月θ抗體症候群；單神經炎（m〇t〇neuritis);過敏性神經 炎，貝西氏病/症候群（Beh9et,s disease/syndr〇me);卡索曼 氏症候群（Castleman’s syndrome);古德帕斯徹氏症候群； 雷諾氏症候群；休格連氏症候群；史蒂芬_瓊森症候群 (Stevens-Johnson syndrome);類天疱瘡或天疱瘡諸如大 皰性類天疱瘡、瘢痕性（黏膜性）類天疱瘡、皮膚類天疱 瘡、尋常天疱瘡、副腫瘤性天疱瘡、落葉狀天疱瘡、天疱 ( 瘡性黏膜性類天疱瘡（pemphigus pemphigoid)及紅斑性天疱瘡；後天性大皰性表皮松解；眼 睛炎症，較佳為過敏性眼睛炎症，諸如過敏性結膜炎；線 性IgA大皰病；自體免疫誘導性結臈炎症；自體免疫性多 内分泌病；萊特爾氏病或症候群（Reiter，s disease syndrome);由自體免疫病狀引起之熱損傷；子癇前期； 免疫複合物病症’諸如免疫複合物性腎炎；抗體介導性腎 炎；神經發炎性病症；多發性神經病；慢性神經病，諸如 ^ 多發性神經病或IgM介導性神經病；血小板減少症（如 由例如心肌梗塞患者逐步顯現），包括栓塞性血小板減少 性紫癜（TTP)、輸血後紫癜（PTP)、肝素誘導性血小板減少 症及自體免疫或免疫介導性血小板減少症，包括（例如）特 發性血小板減少性紫癒（ITP) ’包括慢性或急性ITp ;鞏膜 炎’諸如特發性角膜鞏膜炎；表層鞏瞑炎；睪丸及印巢之 自體免疫疾病，包括自體免疫睪丸炎及卵巢炎；原發性甲 狀腺功能低下，副甲狀腺低能症；自體免疫内分泌疾病， 132799.doc -75- 200918089 包括甲狀腺炎，諸如自體免疫曱狀腺炎、橋本氏病 (Hashimoto’s disease)、慢性曱狀腺炎（橋本氏甲狀腺炎 (Hashimoto's thyroiditis))或亞急性曱狀腺炎；自體免疫甲 狀腺病；特發性曱狀腺功能低下；格雷氏病；格雷氏眼病 (Grave's eye disease)(眼病或甲狀腺相關眼病）；多腺性症 候群，諸如自體免疫多腺性症候群，例如〗型（或多腺性内 分泌病症候群）；副腫瘤症候群，包括神經性副腫瘤症候 群，諸如蘭伯特-伊頓肌無力症候群（Lambert_Eat〇nmyasthenic syndrome)或伊頓-蘭伯特症候群（Eat〇n_Lambert syndr〇me);僵 人症候群（stiff-man/stiff-person syndrome);腦脊髓炎，諸如 過敏性腦脊髓炎及實驗性過敏性腦脊髓炎（EAE);重症肌 無力，諸如胸腺瘤相關重症肌無力；小腦變性；神經性肌 強直，眼陣攣或眼陣攣肌陣攣症候群（〇MS);及感覺神經 病；多灶性運動神經病；席漢氏症候群（Sheehan，s
syndrome);自體免疫肝炎；慢性肝炎；狼瘡樣肝炎；巨 細胞肝炎；慢性活動性肝炎或自體免疫慢性活動性肝炎，· 肺炎，諸如淋巴細胞間質性肺炎（LIp);阻塞性細支氣管炎 (非移植）vs NSIP ;古立安_白瑞症候群（Gui丨iain_Bar^ syndrome);伯格氏病（IgA腎病）；特發性igA腎病；線性 IgA皮膚病’·急性發熱性嗜卞性皮膚，病；角膜下膿皰性皮 膚病；暫時性棘層松解性皮膚病；硬化症，諸如原發性膽 汁性肝硬化症及肺硬變；自體免疫腸病症候群；腹腔疾 病’礼糜4 (麩質腸病）；難治癒性口炎性腹填；特發性月旨 肪寫（idiopathic sprue);冷球蛋白血症，諸如混合型冷球 132799.doc -76· 200918089 蛋白血症；肌肉萎縮性側索硬化（ALS ;盧伽雷氏病（l〇u Gehdg’s disease));冠狀動脈病；自體免疫耳病，諸如自 體免疫内耳病（AIED);自體免疫聽力喪失；多軟骨炎，諸 如難治癒或復發性多軟骨炎；肺泡蛋白質沈積症；角膜 人諸如柯根氏症候群（Cogan's syndrome)/非梅毒性間質 性角膜炎；貝爾氏麻癖（Bell’s palsy);史維特氏病/症候群 (Sweet’s disease/syndrome);自體免疫紅斑痤瘡；帶狀疱 疹相關疼痛；澱粉樣變性病；非癌性淋巴球增多症；原發 | 性淋巴球增多症，包括單株B細胞淋巴球增多症（例如， 性單株γ球蛋白症及意義不明之單株γ球蛋白症，MGus) 7 周邊神經病；副腫瘤症候群；通道病，諸如痛痛症、偏頭 痛、心律不整、肌肉病、耳聾 '失明、週期性麻療及CNS 之通道病；自閉症；發炎性肌病；局灶性或節段性或局灶 性節段性腎小球硬化（FSGS);内分泌性眼病；葡萄膜視網 膜炎；脈絡膜視網膜炎；自體免疫肝病；肌肉纖維疼痛； 多發性内分泌衰竭；施密特氏症候群（Schmidt，s syndrome); I腎上腺炎；胃萎縮；早老性癡呆；脫趙勒病，諸如自體免 疫脫髓鞘病及慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病；德雷斯勒 氏症候群（Dressier，s syndrome);斑禿；普禿；CREST症候 群（舞質沈著症、雷諾氏現象（Raynaudls phen〇men〇n)、食 道功能異常、指端硬化及毛細血管擴張）；男女自體免疫 不孕症，例如歸因於抗精子抗體；混合型結締組織病；卡 格氏病（Chagas，disease);風濕熱；習慣性流產；農民肺； 多形性紅斑；心切開術後症候群；柯興氏症候群 132799.doc •77· 200918089 (CUShing'S Syndr〇me);飼鳥者肺（bird-fancieh lung);過 敏性肉芽腫性脈管炎；良性淋巴細胞性脈管炎；阿爾波特 氏症候群（AlP〇n，s syndn)me);肺泡炎，諸如過敏性肺泡 炎及纖維性肺泡炎；間質性肺病；輸血反應；麻瘋病；瘧 疾；寄生蟲病，諸如利什曼病（leishmaniasis)、錐蟲病、 血吸蟲病、蛔蟲病；麴菌症；薩姆特氏症候群（Sampter,s syndrome);卡普蘭氏症候群（Caplan，s syndr〇me);登革 熱；心内膜炎；心内膜心肌纖維化；彌漫性間質性肺纖維 (化；間質性肺纖維化；纖維性縱隔炎；肺纖維化；特發性 肺纖維化；囊腫狀纖維化；内眼炎；持久性隆起性紅斑； 胎兒紅血球母細胞增多症；嗜伊紅血球筋膜炎；舒曼氏症 候群(Shulman’s syndrome);費爾蒂氏症候群(Felty，s syndr〇me); 絲蟲病；睫狀體炎，諸如慢性睫狀體炎、異時性睫狀體 炎、虹膜睫狀體炎（急性或慢性）或富克氏睫狀體炎（Fuch,s cyclitis);亨-舍二氏紫癜（Hen〇ch_Sch〇nlein purpura);人 類免疫缺陷性病毒（HIV)感染；SCID;後天免疫缺陷症候 ( 群（AIDS)，埃可病毒感染（echovirus infection);敗血症（全身 性發炎性反應症候群（SIRS));内毒素血症；胰腺炎；甲狀 腺中毒症（thyroxicosis);細小病毒感染；風疹病毒感染； 疫苗接種後症候群；先天性風疹感染；埃-巴二氏病毒感 染（Epstein-Barr virus infection);流行性腮腺炎；伊氏症 候群（Evan’s syndrome);自體免疫性腺衰竭；西登哈姆氏 舞蹈病（Sydenham’s chorea);鏈球菌感染後腎炎；血栓閉 塞性脈管炎；曱狀腺毒症；脊髓癆；脈絡膜炎；巨細胞多 132799.doc -78- 200918089 肌痛；慢性超敏性肺炎；結膜炎，諸如春季卡他炎（vernal catarrh)、乾燥性角膜結膜炎及流行性角膜結膜炎；特發 性腎病症候群；微小病變性腎病；良性家族性及缺血再灌 注損傷；移植器官再灌注；視網膜自體免疫性；關節炎 症’支氣管炎；慢性阻塞性氣管疾病/肺病；矽肺病；口 瘡；口瘡性口炎；動脈硬化病（腦血管功能不全），諸如動 脈硬化腦病及動脈硬化視網膜病；不形成精子症；自體免 疫溶血；伯克氏病（Boeck's disease);冷球蛋白金症；杜普 特氏攣縮（Dupuytren's contracture);晶狀體過敏性眼内 k ’過敏性腸炎，麻風結節性紅斑；特發性面神經麻療； 慢性疲勞症候群；風濕性發熱（febris rheumatica);哈麗二 氏病（Hamman-Rich's disease);知覺神經聽力損失；陣發 性血紅素尿；性腺機能減退；侷限性回腸炎；白血球減少 症；傳染性單核白血球增多症；橫貫性脊髓炎；原發性特 發性黏液水腫；腎病；交感性眼炎（ophthalmia symphatica/ sympathetic ophthalmitis);新生兒眼炎；視神經炎；肉芽 腫性睪丸炎；胰腺炎；急性多神經根炎；壞疽性膿皮病； 奎汶氏甲狀腺炎（Quervain's thyreoiditis);後天性脾萎 縮；非惡性胸腺瘤；淋巴樣濾泡性胸腺炎；白斑病；中毒 性休克症候群；食物中毒；涉及T細胞浸潤之病狀；白血 球黏附缺陷病；與由細胞因子及τ淋巴細胞介導之急性及 遲發超敏反應相關之免疫反應；涉及白血球血球渗出之疾 病；多器官損傷症候群；抗原抗體複合物介導性疾病；抗 腎小球基底膜病；自體免疫性多内分泌病；印巢炎；原發 132799.doc -79- 200918089 性黏液水腫；自體免疫萎縮性胃炎；風濕病；混合型結締 組織病，腎病症候群；胰島炎；多内分泌腺衰竭；自體免 疫多腺性症候群，包括I型多腺性症候群；成年發病型特 發性副甲狀腺低能症（AOIH);心肌病，諸如擴張性心肌 病’後天性大皰性表皮松解（eba);血色病；心肌炎；腎 f
病症候群；原發性硬化性膽管炎；化膿性或非化膿性竇 炎；急性或慢性竇炎；篩竇炎、額竇炎、上頜竇炎或蝶竇 ^過敏I"生竇炎，嗜伊紅血球相關病症，諸如嗜伊紅血球 a多肺部次潤性嗜伊紅血球增多、嗜伊紅血球增多_肌 痛症候群、呂弗勒氏症候群（Loffler's syndrome)、慢性嗜 酸性肺炎、熱帶性肺嗜伊紅血球增多、支氣管肺炎性麵菌 ^、麵菌腫或肉芽腫（含有嗜伊紅企球）；過敏症；脊柱關 節病；血清陰性脊柱關節炎；多内分泌腺自體免疫疾病； 硬化(·生膽官炎，鞏膜、夕卜鞏臈、慢性皮膚黏膜念珠菌病； 布魯頓氏症候群（Brut〇nls synd_e);嬰兒暫時性低γ球蛋 白血症，維-奥二氏症候群（Wiskott-Aldrich syndrome);共 濟失凋毛細血官擴張症候群；血管擴張；與膠原病相關之 :體免疫病症’風濕病’諸如慢性關節風濕病；淋巴腺 :’血壓反應減少；血管功能障礙；、组織損傷；心血管局 4缺血’冑覺過敏；腎缺血；大腦局部缺血；及伴有血管 形成之疾-病；過敏性超敏性病症；腎小球腎炎；再灌注損 #缺血)·生再灌注病症；心肌或其他組織之再灌注損傷； 淋巴瘤性氣管支氣管炎；發炎性皮膚病；伴有急性發炎性 成刀之皮膚病，多器官衰竭；大皰病；腎皮質壞死；急性 132799.doc •80· 200918089 化膿性腦膜炎或其他中栖神經系統發炎性病症；眼睛及眼 眶發炎性病症；顆粒球輸注相關症候群；細胞因子誘導性 毋丨生，^作I·生睡病，急性嚴重炎症；慢性難治性炎症；腎 盂炎；動脈内增生；消化性潰瘍；心瓣炎；及子宮内臈異 位。本文中預期藉由投與結合於B細胞表面標記(諸如 CD79b)之抗體來治療該等疾病，且包括投與非結合（"裸") 抗體或與如本文所揭示之細胞毒性劑結合之抗體。本文中 亦預期藉由包括本發明之抗_CD79b抗體或抗-⑽％抗體 Γ t物結合物與同時或連續投與之另一抗體或抗體藥物結合 物、另-細胞毒性劑、放射治療或其他治療之組合的組合 療法來治療該等疾病。 ”治療”或”減輕”係指治療性治療及預防性措施兩者，其 中目的在於預防或減緩（減少）革巴向病理病狀或病症。需要 治療之彼等者包括已患有病症之彼等者以及傾向於患有病 症之彼等者或病症有待預防之彼等者。若在根據本發明之 方法接受治療量之抗_CD79b抗體後，患者顯示可觀察到及/ …戈可量測的下列情況中之一或多者：癌細胞數目減少或癌 細胞不存在；腫瘤尺寸減小；癌細胞浸潤至周邊器官中 (包括癌症擴散至軟組織及骨中）得到抑制（亦即，在$_ 度上得到減緩且較佳為得到阻止）；腫瘤轉移得到抑制（亦 即，在某種程度上得到減緩且較佳為得到阻止）；腫瘤生 長在某種程度上得到抑制；及/或與特定癌症相關之症狀 中之-或多者在某種程度上得到緩解；發病率及死亡率降 低’以及生活品質問題得到改善’則個體或哺乳動物之表 132799.doc -81 - 200918089 現CD79b多肽之癌症得以成功地,,治療，，。就抗4〇7外抗體 可防止現有癌細胞生長及/或殺死現有癌細胞而言，其可 具細胞抑制性及/或細胞毒性。患者亦可感覺到此等徵象 或症狀之減少。 用於評估疾病之成功治療及改善之上述參數可容易地藉 由醫師所熟知之常規程序來量測。對於癌症治療而言，可 例如藉由評估疾病進展時間（ττρ)及/或測定反應率（rr)來 量測功效。癌轉移可藉由分期測試及藉由用於測定向骨之 f 擴散之骨掃描及對鈣含量與其他酶之測試來確定。亦可進 行CT掃描以檢查向區域中之骨盆及淋巴結的擴散。胸部X 射線檢查及藉由已知方法量測肝酶含量被分別用於檢查向 肺及肝之癌轉移。用於監測疾病之其他常規方法包括經直 腸超音波檢查術（TRUS)及經直腸穿刺活檢術（TRNB)。 對於為較為侷限性的癌症之膀胱癌而言，測定疾病進展 之方法包括藉由膀胱鏡檢查進行尿細胞學評估、監測尿液 中血液之存在、藉由音波檢查或靜脈内腎盂照相來目測泌 I 尿道、電腦斷層攝影術（CT)及磁共振成像（MRI)。遠處癌 轉移之存在可藉由腹部之c τ、胸部x射線或骨架之放射性 核種成像來評估。 ”長期”投藥係指與短期模式相反以連續模式投與藥劑， 以便使初始治療效應（活性）維持延長之時間段。”間歇”投 藥為不連續進行但不中斷、而實質上循環進行之治療。 "個體"為脊椎動物。在某些實施例中，該脊椎動物為哺 礼動物。哺乳動物包括（但不限於）農畜（諸如牛）、運動動 132799.doc -82· 200918089 氣及大鼠 物、寵物（諸如猫、狗及馬）、靈長類動物、 在某些實施例中，哺乳動物為人類。 出於治療癌症、減輕癌症之症狀之目的 指歸類為哺乳動物之任何動物，包括人類、导動物”係 以及動物園、運動或玩賞動物，諸如狗、 及農畜， 羊、豬、山羊、兔子等。較佳地，該哺乳動物為人：、綿 與：或多種其他治療劑"組合"投藥包括同時( 及以任何順序連續投藥β ) ί又藥
如本文所使用，··載劑,，包括醫藥學上可接受之栽劑 形劑或穩定劑’其在所用之劑量及濃度下對所 胞或哺乳動物無毒。生理學上可接受之載財^水 值緩衝溶液。生理學上可接受之載劑之實例包括緩衝劑， 诸如麟酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗 壞血酸；低分子量（小於約10個殘基）多肽；蛋自質，諸二 血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如^ 乙烯吡咯啶胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯 胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物， 包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如edta ;糖 醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；鹽形成抗衡離子，諸如 鈉，及/或非離子性界面活性劑，諸如tween⑧、聚乙二 醇（PEG)及 PLURONICS®。 口相或固體支樓物"意謂本發明之抗體可黏附或附著 之非水性基質。本文中所涵蓋之固相之實例包括部分或完 王由玻璃（例如受控微孔玻璃）、多醣（例如瓊脂糖）、聚丙 132799.doc -83- 200918089 稀醯胺、聚苯乙稀、聚乙烯醇及聚石夕氧形成之彼等者。在 某些實施例中’視情況而定’該固相可包含檢定板之孔； 在其他情況下，其為純化管柱（例如親和層析管柱）。此術 語亦包括離散粒子之不連續固相，諸如美國專利第 4,275,149號中所述之彼等者。 ”脂質體，，為由適用於將藥物（諸如CD79b抗體）傳遞至哺 乳動物之各種類型之脂質、鱗脂及/或界面活性劑構成的 小泡。脂質體之組分通常排列成雙層構造，類似於生物膜 Γ 之脂質排列。 小分子或”小’’有機分子在本文中被定義為具有低於約 500道爾頓之分子量。 ”個體（individUaI/subject)，，或"患者"為脊椎動物。在某些 實施例中，該脊椎動物為哺乳動物。哺乳動物包括（但不 限於)農畜(諸如牛)、運動動物、寵物(諸如貓、狗及馬)、靈 長類動物、小鼠及大鼠。在某些實施例中，哺乳動物為人類。 ( 冑語·•醫藥調配物I.係指—種呈可允許活性成份之生物活 i性有效之形式且不含有對將投與調配物之個體具不可接受 之毒性之其他組份的製劑。該調配物可為無菌的。 ”無菌’’調配物為無菌的且不含所有活微生物及其孢子。 本文所揭不之抗體之"有效量”為足以實現具體指定目 的之量。”有效量"可根據指定目的憑經驗及以常規方式來 術語"治療有效量”係指 體或哺乳動物之疾病或病 抗體或其他藥物可有效"治療”個 症之量。在癌症之情況下，治療 132799.doc •84- 200918089 f ί =量之藥物能減少癌細胞之數目；減小腫瘤尺寸；抑制 邊在某種程度上減緩且較佳為阻止）癌細胞浸潤至周 脎二巾’抑制(亦即，在某種程度上減緩且較佳為阻止) 瘤轉移；在某種程度上抑制腫瘤生及/或在某種程 :上減fe與癌症相關之症狀中的一或多個症狀。參見本文 對於"治療’’之定義。就藥物可防止現有癌細胞生長及/或 '死現有癌細胞而言’其可具細胞抑制性及/或細胞毒 f生預防有效量”係指在一定劑量及時間段下可有效達成 所f預防性效果所必需之量。通常但並非必定，因為預防 劑置係在疾病早期階段之前或早期階段時用於個體，所以 預防有效量將小於治療有效量。 抗-CD79b抗體之"生長抑制量"為能夠在活體外或活體内 抑制細胞（尤其腫冑，例如癌細胞）生長之4。出於抑制費 生性細胞生長之目的，抗_CD79b抗體之”生長抑制量”可憑 經驗及以常規方式來確定。 抗-CD79b抗體之”細胞毒性量"為能夠在活體外或活體内 引起細胞（尤其腫瘤，例如癌細胞）破壞之量。出於抑制贅 生性細胞生長之目的，抗_CD79b抗體之”細胞毒性量"可憑 經驗及以常規方式來確定。 表現CD79b之細胞”為於細胞表面上或以分泌形式表現 内源性或經轉染CD79b多肽之細胞。"表現cD79b之癌症” 為包含於細胞表面上存在有CD79b多肽或產生及分泌 CD79b多肽之細胞的癌症。"表現CD79b之癌症，，視情況於 其細胞表面上產生足夠量之CD79b多肽，以使得抗_CD79b 132799.doc -85- 200918089 抗體可與之結合且具有對於該癌症之治療效應。在另一實 施例中，''表現CD79b之癌症”視情況產生及分泌足夠量之 CD79b多肽，以使得抗_CD79b抗體拮抗劑可與之結合且具 有對於該癌症之治療效應。關於後者，該拮抗劑可為能減 少、抑制或防止腫瘤細胞產生及分泌分泌性C D 7 9 b多肽之 反義寡核苷酸。”過表現nCD79b多肽之癌症為與相同組織 類型之非癌性細胞相比於細胞表面上具有顯著較高含量之 CD79b多肽或產生及分泌顯著較高含量之CD79b多肽的癌 f 症。該過表現可由基因擴增或由轉錄或轉譯增加而引起。 CD79b多肽過表現可在偵測或預後檢定中藉由評估存在於 細胞表面上或由細胞分泌之CD 7 9b蛋白質增加之含量來確 定（例如，經由免疫組織化學檢定，使用針對經分離之 CD79b多肽製備之抗-CD79b抗體，其中該多肽可使用重組 DNA技術自編碼CD79b多肽之經分離之核酸製備；FACS分 析等）。或者或另外，吾人可量測細胞中編碼CD79b多肽之 核酸或mRNA之含量，例如經由對應於編碼CD79b之核酸 I 或其補體使用基於核酸之探針進行螢光原位雜交（FISH ; 參見1998年10月公開之W098/45479)、南方墨點法、北方 墨點法或聚合酶鏈反應（PCR)技術，諸如實時定量PCR(RT-PCR)。吾人亦可藉由量測生物流體（諸如血清）中之脫落抗 原來研究CD79b多肽過表現，例如使用基於抗體之檢定（亦 參見例如1990年6月12日頒布之美國專利第4,933,294號； 1991年4月18日公開之W091/05264 ; 1995年3月28日頒布之美 國專利 5,401,638 ;及Sias等人，J· Immunol· Methods 132:73-80 132799.doc -86- 200918089 (199〇))。除了上述檢定，熟練從業者可使用各種活體内檢定。 舉例而言’吾人可使患者體内之細胞暴露於視情況經可偵 測標記（例如放射性同位素）標記之抗體，且可例如藉由針 對放射性進行外部掃描或藉由分析獲自先前暴露於抗體之 患者之活組織檢查來評估抗體與患者體内細胞之結合。 如本文所使用，術語"免疫黏附素"表示組合異源蛋白質 (”黏附素”)之結合特異性與免疫球蛋白怪定域之效應功能的 類抗體分子。在結構上，免疫黏附素包含不同於抗體之抗 ( 原識別及結合位點（亦即，為"異源"）之具有所需結合特異性 的胺基酸序列與免疫球蛋白恆定域序列之融合。免疫黏附 素分子之黏附素部分通常為至少包含受體或配位體之結合 位點的毗連胺基酸序列。免疫黏附素中之免疫球蛋白恆定域 序列可自任何免疫球蛋白獲得，諸如IgG_i、IgG_2、igG_3 或 IgG-4亞型、IgA(包括 IgA-1 及 IgA_2)、IgE、吵或“河。 詞語”標記”在本文中使用時係指直接或間接與抗體結合 以便產生"經標記"抗體之可偵測化合物或組合物。標記本 t 身可為可偵測的（例如放射性同位素標記或螢光標記），或 在酶促標記之情況下可催化可偵測之受質化合物或組合物 之化學變化。 如本文所使用，術語”細胞毒性劑"係指能抑制或阻止細 胞之功能及/或導致細胞破壞之物質。該術語意欲包括放射 性同位素（例如，At211、I131、I125、Y90、Rei86、Rel88、^153、
Bi212、P32及Lu之放射性同位素）；化學治療劑，例如曱胺喋呤 (methotrexate)、阿黴素（adriamicin)、長春花生物驗（vinca 132799.doc -87· 200918089 alkaloid)(長春新驗（vincristine)、長春鹼（vinblastine)、依 託泊^(etoposide))、經道諾紅黴素、美法余（melphalan)、 絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁 酸氮芥（chlorambucil)、柔 紅黴素（daunorubicin)或其他微入劑；酶及其片段’諸如溶 核酶；抗生素；及毒素，諸如細菌、真菌、植物或動物來 源之小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段及/或變異 體；及以下所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。其他細胞毒 性劑描述於下文中。殺腫瘤劑導致腫瘤細胞之破壞。 f "毒素"為能夠對細胞之生長或增生具有有害效應之任何 %、 物質。 "化學治療劑”為不管何種作用機制皆適用於治療癌症之 化學化合物。化學治療劑之種類包括（但不限於）：烷基化 劑、抗代謝物、紡錘體抑制劑、植物鹼、細胞毒性/抗腫 瘤抗生素、拓撲異構酶抑制劑、抗體、光敏劑及激酶抑制 劑。化學治療劑包括用於π靶向療法”及習知化學療法之化 合物。化學治療劑之實例包括：埃羅替尼（erlotinib) I (TARCEVA®，Genentech/OSI Pharm.)、多烯紫杉醇(docetaxel) (TAXOTERE®，Sanofi-Aventis)、5-FU(氟尿嘧啶、5-氟尿 嘴咬，CAS號51-21·8)、吉西他濱（gemcitabine)(GEMZAR®， Lilly)、PD-0325901(CAS 號 391210-10-9，PHzer)、順鉑 (cisplatin)(順-二胺-二氯銘（II)，CAS 號 15663-27-1)、卡舶 (carboplatin)(CAS 號 41575-94-4)、太平洋紫杉醇（paclitaxel) (TAXOL®，Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N J·)、曲妥珠單抗（HERCEPTIN®，Genentech)、替莫。坐胺 132799.doc -88- 200918089 (temozolomide)(4-甲基-5-側氧基-2,3,4,6,8-五氮雜雙環[4.3.0] 壬-2,7,9-三烯-9-甲醯胺，CAS 號 85622-93-1，TEMODAR®， TEMODAL®，Schering Plough)、他莫昔芬（tamoxifen) ((Z)-2-[4-(l，2-二苯基丁 -1-烯基）苯氧基]二曱基-乙胺， NOLVADEX®，ISTUBAL®，VALODEX®)及羥道諾紅黴素 (ADRIAMYCIN®)、Akti-1/2、HPPD及雷帕黴素（rapamycin)。 化學治療劑之更多實例包括：奥賽力始（oxaliplatin) (ELOXATIN®，Sanofi)、硼替佐米（bortezomib) (VELCADE®， Millennium Pharm·)、舒尼替尼（sutent) (SUNITINIB®， SU1 1248 ，Pfizer)、來曲唑（letrozole) (FEMARA®， Novartis)、伊馬替尼曱績酸鹽（imatinib mesylate) (GLEEVEC®， Novartis)、XL-518(Mek抑制劑，Exelixis，WO 2007/044515)、 ARRY-886(Mek 抑制劑，AZD6244，Array BioPharma， Astra Zeneca) 、 SF-1126(PI3K 抑制劑，Semafore
Pharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K抑制劑，Novartis)、XL-147 (PI3K抑制劑，Exelixis)、PTK787/ZK 222584 (Novartis)、 氟維司群（fulvestrant)(FASLODEX®，AstraZeneca)、曱酿 四氫葉酸（leucovorin)(亞葉酸）、雷帕黴素（西羅莫司（sirolimus)， RAPAMUNE®，Wyeth)、拉帕替尼（lapatinib)(TYKERB®， GSK572016，Glaxo Smith Kline)、洛那法尼（lonafarnib) (SARASAR™，SCH 66336，Schering Plough)、索拉非尼 (sorafenib) (NEXAVAR®，BAY43-9006，Bayer Labs)、吉 非替尼（gefitinib) (IRESSA®，AstraZeneca)、伊立替康 (irinotecan) (CAMPTOSAR®，CPT-11，Pfizer)、替吡法尼 132799.doc -89- 200918089 (tipifarnib) (ZARNESTRA™ > Johnson & Johnson) ' ABRAXANE™ (不含克列莫佛（Cremophor))(亦即，太平洋紫杉醇之白蛋 白工程化奈米粒子調配物）(American Pharmaceutical Partners， Schaumberg，II)、範得它尼（vandetanib)(rINN，ZD6474， ZACTIMA®，AstraZeneca)、苯丁酸氮芥、AG1478、AG1571 (SU 5271 ; Sugen)、坦西莫司（temsirolimus) (TORISEL®， Wyeth)、帕佐帕尼（pazopanib) (GlaxoSmithKline)、坎佛酿 胺（canfosfamide) (TELCYTA®，Telik)、塞替派(thiotepa)及環磷 醯胺（cyclosphosphamide) (CYTOXAN®，NEOSAR®);烷基 石黃酸鹽’諸如白消安（busulfan)、英丙舒凡（improsulfan)及旅 泊舒凡（piposulfan);氮丙啶類，諸如苯佐多巴（benz〇dopa)、 卡波醌（carboquone)、米特多巴（meturedopa)及尤利多巴 (uredopa);乙烯亞胺類及曱基三聚氰胺類，包括六甲密胺 (altretamine)、三伸乙基三聚氰胺、三伸乙基磷醯胺、三 伸乙基硫基磷醯胺及三羥曱基三聚氰胺；乙醯精寧 (acetogenin)(尤其布拉他辛（buuataein)及布拉他辛酮 (bullatacinone));喜樹驗（carnpt〇thecin)(包括合成類似物 拓朴替康（topotecan));苔蘚蟲素（bry0Statin);卡利他汀 (callystatin) ; CC-1065(包括其阿多來新（ad〇zelesin)、卡折 來新（carzelesin)及比折來新（bizelesin)合成類似物）；自念 珠藩環肽（cryptophycin)(尤其自念珠藻環肽1及自念珠藻環 肽8);海兔毒素；多卡米辛（duocarmycin)(包括合成類似物 KW-2189 及 CB1-TM1) ’ 艾榴素（eieuther〇bin);水鬼蕉驗 (pancratistatin);沙考的汀（sarc〇dictyin);海綿他汀 132799.doc -90· 200918089 (spongistatin);氮芥類（nitrogen mustards)，諸如苯丁酸氮芥、 奈氮齐（chlornaphazine)、氯碟醯胺、雌莫司汀（estramustine)、 異環碟酿胺（ifosfamide)、氮芬(mechlorethamine)、It芥氧化物 鹽酸鹽、美法命（melphalan)、新氮界（novembichin)、膽甾 醇對苯乙酸氣芬（phenesterine)、潑尼莫司 丁（prednimustine)、 曲洛碟胺（trofosfamide)、尿嘴η定氮芬（uracil mustard);亞 石肖基腺（nitrosurea)，諸如卡莫司汀（carmustine)、氣脲黴素 (chlorozotocin)、福莫司 ί丁（fotemustine)、洛莫司汀（lomustine)、 尼莫司汀（nimustine)及雷莫司汀（ranimnustine);抗生素，諸 如烯二炔(enediyne)抗生素(例如，卡奇黴素(calicheamicin)、卡奇 徽素 γΠ、卡奇徽素 coIl(Angew Chem. Inti. Ed. Engl. (1994) 33:183-186);達内黴素（dynemicin)、達内黴素A;雙膦酸 鹽，諸如氯屈膦酸鹽（clodronate);埃斯培拉黴素（esperamicin); 以及新製癌菌素（neocarzinostatin)發色團及相關色蛋白烯 二炔抗生素發色團）、阿克拉黴素（aclacinomysin)、放線菌 素（actinomycin)、奥斯拉米辛（authramycin)、偶氮絲胺酸 (azaserine)、博萊黴素（bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、 卡拉比辛（carabicin)、洋紅黴素（carminomycin)、嗜癌黴素 (carzinophilin)、色黴素（chromomycinis)、放線菌素 D (dactinomycin)、柔紅黴素、地托比星（detorubicin)、6-重 氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、嗎啉基-羥道諾紅黴素、氱基 嗎啉基-羥道諾紅黴素、2-吡咯啉基-羥道諾紅黴素及脫氧 經道諾紅黴素、表柔比星（epirubicin)、依索比星（esorubicin)、 黃膽素（idarubicin)、麻西羅黴素（marcellomycin)、絲裂黴 132799.doc -91 - 200918089 素（mitomycin)(諸如絲裂黴素C)、黴盼酸（mycophenolic acid)、諾拉黴素（nogalamycin)、橄欖黴素（olivomycin)、培洛 黴素（peplomycin)、泊非黴素（porfiromycin)、嘌呤黴素 (puromycin)、三鐵阿黴素（quelamycin)、羅多比星（rodorubicin)、 鏈黑黴素（streptonigrin)、鏈佐星（streptozocin)、殺結核菌 素(tubercidin)、烏苯美司（ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔 比星（zorubicin);抗代謝物，諸如甲胺'•業β令及5 -氟尿癌唆 (5-FU);葉酸類似物，諸如迪諾特寧（denopterin)、曱胺嗓 吟、蝶羅吟（pteropterin)、三甲曲沙（trimetrexate);嗓吟類 似物，諸如氟達拉濱（fludarabine)、6-疏基嘌吟、嗟咪嗓 口令（thiamiprine)、硫鳥嗓吟（thioguanine);鳴咬類似物，諸 如安西他濱（ancitabine)、阿紮胞努（azacitidine)、6-氮尿 苦、卡莫氟（carmofur)、阿糖胞皆（cytarabine)、雙脫氧尿 苷（dideoxyuridine)、去氧氟尿苷（doxifluridine)、依諾他濱 (enocitabine)、氟尿苷（floxuridine);雄激素，諸如卡普睪 酮（calusterone)、屈他雄酮丙酸醋（dromostanolone propionate)、環 硫雄醇（epitiostanol)、美雄烧（mepitiostane)、睪内 S旨 (testolactone);抗腎上腺類，諸如胺魯米特（aniinoglutethimide)、 米托坦（mitotane)、曲洛司坦（trii〇stane);葉酸補充劑，諸如 夫羅林酸（frolinic acid);醋葡醛内酯（aceglatone);醛磷醯 胺糖苦（aldophosphamide glycoside);胺基乙醯丙酸；恩尿 鳴口定（eniluracil)，安 α丫咬（amsacrine);貝司他布（bestrabucil);比 生群（bisantrene);艾達曲卡（e(jatraxate);得弗伐胺 (defofamine)，秋水仙胺（demec〇icine);地 η丫酿（diaziquone); 132799.doc -92- 200918089 艾弗尼辛（elfornithine);依利醋敍（elliptiniumacetate);埃 坡黴素（epothilone);依託格魯（etoglucid);硝酸鎵；經基 腺；蘑兹多糖（lentinan);羅尼代寧（lonidainine);美登素 類（maytansinoids)，諸如美登素（maytansine)及美登木素 (ansamitocin)；米托胍腙（mitoguazone)；米托蒽酿 (mitoxantrone);莫比旦莫耳(mopidanmol);硝爾靈（nitraerine);喷 司他丁（pentostatin);蛋胺氮芬（phenamet) ; 0比柔比星 (pirarubicin);洛索蒽酿（losoxantrone);足葉草酸（podophyllinic ( acid) ; 2-乙基醯肼；丙卡巴肼（procarbazine) ; PSK®多酷 複合物（JHS Natural Products, Eugene，OR);雷佐生 (razoxane);根瘤菌素（rhizoxin);西佐喝（sizofiran);錯螺胺 (spirogermanium);細交鏈孢菌酮酸（tenuazonic acid);三亞 胺醌（triaziquone) ; 2,2'，2M-三氣三乙胺；單端孢黴烯族毒 素（trichothecene)(尤其 T-2 毒素、韋拉庫林 A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及安奎定（anguidine));烏拉坦 (urethan);長春地辛（vindesine);達卡巴嗪（dacarbazine); 甘露莫司汀（mannomustine);二漠甘露醇（mitobronitol); 二漠衛矛醇（mitolactol) ; 底泊漠院（pipobroman);伽托辛 (gacytosine);阿拉伯糖普（arabinoside)("Ara-C");環鱗酿 胺；塞替派；6-硫鳥嘌呤；锍基嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似 物，諸如順鉑及卡鉑；長春鹼；依託泊苷（VP-1 6);異環 磷酿胺；米托蒽酿；長春新驗；長春瑞賓（vinorelbine) (NAVELBINE®);諾凡特龍(novantrone);替尼泊 ^(teniposide); 依達曲沙（edatrexate);道諸黴素；胺基嗓吟（aminopterin);卡 132799.doc -93- 200918089 培他濱（capecitabine)(XELODA®，Roche);伊班膦酸鹽 (ibandronate) ; CPT-11 ;拓撲異構酶抑制劑 RFS 2000 ;二 氟甲基鳥胺酸（DMFO);類視色素，諸如視黃酸；及上述 任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸及衍生物。 π化學治療劑’'之定義中亦包括：（i)用於調節或抑制激素 對腫瘤之作用的抗激素藥劑，諸如抗雌激素及選擇性雌激 素受體調節劑（SERM)，包括（例如）他莫昔芬（tamoxifen)(包 括NOLVADEX®，檸檬酸他莫昔芬）、雷諾昔酚（raloxifene)、 屈洛昔芬（droloxifene)、4-經基他莫昔芬、曲沃昔芬 (trioxifene)、雷洛昔芬（keoxifene)、LY117018、奥那司酮 (onapristone)及 FARESTON®(擰檬酸托瑞米芬（toremifine citrate)) ; (ii)可抑制酶芳香酶之芳香酶抑制劑，其調節腎 上腺中之雌激素產生，諸如4(5)-咪唑、胺魯米特、MEGASE® (醋酸甲地孕酮（megestrol acetate))、AROMASIN® (依西美坦 (exemestane) ; Pfizer)、弗米斯坦（formestanie)、法屈 〇坐 (fadrozole)、RIVISOR®(伏羅0坐（vorozole))、FEMARA® 、 (來曲》坐（letrozole) ; Novartis)及 ARIMIDEX®(安美達錠 (anastrozole) ; AstraZeneca) ; (iii)抗雄激素，諸如敗他胺 (flutamide)、尼魯米特（nilutamide)、比卡魯胺（bicalutamide)、 亮丙瑞林（leuprolide)及戈舍瑞林（goserelin);以及曲沙他濱 (troxacitabine)(l，3-二氧戊環核苷胞喊咬類似物）；（iv)蛋白 激酶抑制劑，諸如MEK抑制劑（WO 2007/ 044515) ; (v)脂 質激酶抑制劑；（vi)反義募核苷酸，尤其能抑制異常細胞 增生中所涉及之信號轉導途徑中之基因表現的彼等者，例如 132799.doc • 94· 200918089 PKC-α、Raf及H-Ras，諸如奥利默森(〇blimersen) (GENASENSE®， Genta Inc.) ; (vii)核酶，諸如VEGF表現抑制劑（例如 ANGIOZYME®)及HER2表現抑制劑；（Viii)疫苗，諸如基因 治療疫苗，例如ALLOVECTIN®、LEUVECTIN® 及 VAXID® ; PROLEUKIN® rIL-2 ;拓撲異構酶1抑制劑，諸如 LURTOTECAN® ; ABARELIX® rmRH ; (ix)抗血管生成劑， 諸如貝伐單抗（bevacizumab) (AVASTIN®，Genentech);及上 述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸及衍生物。 ”化學治療劑”之定義中亦包括治療性抗體，諸如阿來組 單抗（alemtuzumab)(Campath)、貝伐單抗（AVASTIN®， Genentech);西妥昔單抗（cetuximab)(ERBITUX®，Imclone); 帕尼單抗（panitumumab)(VECTIBIX®，Amgen)、利妥昔單 抗（rituximab)(RITUXAN®，Genentech/ Biogen Idee)、帕 妥珠單抗（pertuzumab) (OMNITARGTM，2C4，Genentech)、 曲妥珠單抗(HERCEPTIN®，Genentech)、托西莫單抗(tositumomab) (Bexxar，Corixia)及抗體藥物結合物吉妥珠單抗奥°坐米星 (gemtuzumab ozogamicin) (MYLOTARG®，Wyeth)。
"生長抑制劑"在本文中使用時係指能在活體外或活體内 抑制細胞、尤其表現CD79b之癌細胞生長的化合物或組合 物。因此，該生長抑制劑可為能顯著降低S期中之表現 CD79b之細胞的百分數之藥劑。生長抑制劑之實例包括能 阻斷細胞週期進程（在除S期以外之階段）之藥劑，諸如誘 導G1停滯及Μ期停滯之藥劑。典型Μ期阻斷劑包括長春鹼 類（長春新鹼及長春鹼）、紫杉烷（taxanes)及拓撲異構酶II 132799.doc -95- 200918089 抑制劑，諸如羥道諾紅黴素、表柔比星、柔紅黴素、依託 泊苷及博萊黴素。能使G1停滯之彼等藥劑亦擴溢為能使8 期停滞，例如DNA烷基化劑，諸如他莫昔芬、潑尼松 (prednisone)、達卡巴嗪（dacarbazine)、氮芥、順鉑、甲胺 喋呤、5-氟尿嘧啶及ara_c。其他資訊可見於The M〇丨丨μ Basis of Cancer，Mendelsohn 及以⑹編，第 ，標題為 "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs”，Murakami等人（WB Saunders:肫㈣叫化 Η%)，尤
其第13頁中。紫杉烧（太平洋紫杉醇及多稀紫杉醇）為皆源 自紫杉樹之抗癌藥。源自歐洲紫杉之多烯紫杉醇 (TAXOTERE® ’ Rh〇ne-P〇ulenc R〇rer)為太平洋紫杉醇(tax〇l⑧，
BriStol-Myers Squibb)之半合成類似物。太平洋紫杉醇及 多烯紫杉醇促進由微管蛋白二聚體組裝微f且藉由防止解 聚合而使微管穩定，此導致細胞之有絲分裂受到抑制。 ”經道諾紅黴素”為蒽環黴素（摘咖yeline)抗生素。經道 諾紅黴素之完整化學名稱為（8S•順km胺基_2,3,6_三 脫氧基-cx-L-來蘇_己〇比嗔糖基）氧基]·7,8,9，ι〇_四氯_6，^_ 三羥基·8·(經基乙醯基）小甲氧基义仏井四苯二酮。， 術語”細胞因子"為由一細胞群體所釋放、作為細胞間介體作 用於另一細胞之蛋白f的通用術語。該等細胞因子之實例為淋 巴因子、早核因子及傳統多肽激素。該等細胞因子中包括生長 =，諸如人财長„、Ν_ψ硫㈣基人财長激素及牛生 甲㈣素^島素；前騰島素；鬆弛 素；前鬆时；醣蛋白激素，諸如㈣泡激素(贿）、促甲狀 132799.doc -96- 200918089 腺激素（TSH)及促黃體素（LH);肝生長因子；纖維母細胞生長 因子；泌乳素，·胎盤生乳素；腫瘤壞死因子_α及腫瘤壞死因子_ β，苗勒抑制物質（muUerian-inhibiting substance);小鼠促性腺 激素相關肽，抑制素；活化素；血管内皮生長因子；整合素； 血小板生成素（TPO);神經生長因子，諸如NGF_p ;血小板生長 因子，轉化生長因子（TGF)，諸如TGF-α及TGF-β ;胰島素樣生 長因子-I及胰島素樣生長因子_Π ;紅血球生成素(Ep〇);骨誘導 因子；干擾素，諸如干擾素-a、干擾素$及干擾素_γ ;群落刺 (激因子（CSF) ’諸如巨嗔細胞_CSF(M_CSF);顆粒球巨嗜細胞_ CSF(GM-CSF) ； ^Hfe^-CSF(G-CSF) ； , ^ IL. 1、比七、IL_2、IL_3、IL_4、IL_5、江_6、il_7、μ、μ、 IL-11、IL-12 ;腫瘤壞死因子，諸如TNF_“tTNF_p ;及其他多 肽因子’包括LIF及kit配位體（KL)。如本文中所使用，術語細 胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養物之蛋白質及天 然序列細胞因子之生物活性等效物。 #語”包裝插頁U於指通常包括在治療產品之商業包 " 裝中之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投藥、 禁忌及/或關於使用該等治療產品之注意事項的資訊。 術語”細胞内代謝物"係指由細胞内對抗體_藥物結合物 (就）之代謝過程或反應產生的化合物。該代謝過程或反 應可為酶促過程，諸如ADC之肽連接子之蛋白水解裂解， 或諸如月宗、醋或醯胺之官能基之水解。細胞内代謝物包括 (但不限於）在進入、擴散、吸收或運輸至細胞中後經受細 胞内裂解之抗體及游離藥物。 ' 132799.doc -97. 200918089 術語”細胞内裂解之"及"細胞内裂解"係指細胞内對抗體-藥 物結合物（ADC)之代謝過程或反應，藉此斷開藥物部分⑼與 抗體（Ab)之間的共價連接（亦即連接子），從而導致在細胞内 使游離藥物自抗體解離。因此，鹰之裂解部分為胞内代謝物。 術語”生物可用性”係指向患者投與之給定量之藥物的全 身可用性（亦即血液/血漿含量）。生物可用性為指示對藥物 自投與劑型達到周身循環之時間（速率）及總量（程度）的量 度之絕對術語。 術語"細胞毒性活性"係指ADC或ADC之細胞内代謝物之 細胞殺死、細胞抑制或生長抑制效應。細胞毒性活性可以 IC5〇值表不，該丨^值為一半細胞存活時每單位體積之濃 度（莫耳濃度或質量）。 如本文所使用，術語"烷基"係指具有一至十二個碳原子 (Ci-C^)之飽和直鏈或支鏈單價烴基，其中該烷基可視情 況獨立地經一或多個下文所述之取代基取代。在另一實施 例中，烷基為一至八個碳原子（Ci_c8)或一至六個碳原子 (CrCJ。燒基之實例包括（但不限於）甲基（Me、_Ch3)、乙 基（Et、-CH2CH3)、1-丙基（n_pr、正丙基、_CH2cH2CH3)、 2-丙基（i-Pr、異丙基、_CH(CH3)2)、卜 丁基（η·Βι1、正丁 基、-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基 _ι_ 丙基（i_Bu、異 丁基、 -CH2CII(CH3)2)、2-丁基（S-Bu、第二丁基、_CH(CH3)CH2CH3)、 2- 甲基-2-丙基（t-Bu、第三丁基、_c(Ch3)3)、卜戊基（正戊 基、-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基（_CH(CH3)CH2CH2CH3)、 3- 戊基（-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基（-C(CH3)2CH2CH3)、 I32799.doc 98« 200918089 3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-曱基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、 2-曱基-1- 丁基（-CH2CH(CH3)CH2CH3) 、 1-己基 (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基（-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、 3- 己基（-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-曱基-2-戊基 (-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-曱基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、 4- 甲基-2-戊基（-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-曱基-3-戊基 (-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-曱基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、 2,3-二甲基-2-丁基（-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁 ί
基（-CH(CH3)C(CH3)3)、1-庚基、1_辛基及其類似基團。 術語"烯基"係指具有至少一個不飽和位點（亦即，碳_碳 sp2雙鍵）且具有兩至八個碳原子（CyC8)之直鏈或支鏈單價 烴基，其中該烯基可視情況獨立地經一或多個本文所述之 取代基取代，且包括具有”順式”及”反式，，取向或者"E"及 πζ"取向之基團。實例包括（但不限於）乙烯基（_CH=CH2)、 烯丙基（-CH2CH=CH2)及其類似基團。 術語”炔基，，係指具有至少一個不飽和位點（亦即，碳-碳 Sp參鍵）且具有兩至八個碳原子（C2_Cs)之直鏈或支鏈單價 烴基’其中該快基可視情況獨立地經—或多個本文所述之 取代基取代。實例包括（但不限於）乙块基（_CSCH)、丙快 基（炔丙基、-CHsCeCH)及其類似基團。 術語'，碳環（carbocycle)'，、”碳環基"、"碟環（carbocyclic 環或具有7至12個碳原子作為雙環之單價㈣族的飽和或 部分不飽和環。具有7至12個原子之雙環碳環可例如排列 132799.doc •99· 200918089 為又％ [4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統，且具有9或ι〇個環 原子之雙環碳環可排列為雙環[5,6]或[6,6]系統，或排列為 諸如雙環[2.2.1]錢、雙環[2 2 2]辛烧及雙環[3 2 2]壬烧 之橋式系統。單環碳環之實例包括（但不限於）環丙基、環 丁基、％戊基、1-環戊_丨_烯基、丨_環戊_2_烯基、丨_環戊_ 3烯基、環己基、^環己-1-稀基、1-環己-2-烯基、1-環 己3_婦基、環己二稀基、環庚基、環辛基、環壬基、環癸 基％十一烷基、環十二烷基及其類似基團。
”芳基"意謂II由自母冑芳族環系統之單一碳原子移除一 個氫原子所產生的具有6_20個碳原子（c^cw之單價芳族 :基。-些芳基在例示性結構中以，，Ar"表示。芳基包括包 含與飽和、部分不飽和環或芳族碳環融合之芳族環的雙環 基團典型芳基包括（但不限於）源自以下者之基團：苯（苯 基經取代之苯、萘、蒽、聯苯、茚基、二氫節基、1,2-一虱萘、1，2,3,4·四氫萘基及其類似基團。芳基視情況獨 立地紐一或多個本文所述之取代基取代。 術語"雜環（heteroeycle)”、”雜環基"及"雜環（heter〇cycHc ring)在本文中可互換使用且係指具有3至π個環原子之飽 f Ρ刀不飽和（亦即’環内具有—或多個雙鍵及/或參鍵） 的碳環基團，其中至少一個環原子為選自氮、^、磷及硫 之雜原子，其餘環原子為C，其中—❹個環原子視情況 獨立地經—❹個下文所述之取代基取代。雜環可為具有 3至7個％成員（2至6個碳原子及個選自N、〇、？及§之雜 原子）之單環或具有7至職環成員（4至9個碳料及⑴個選 I32799.doc -100- 200918089 自N、Ο、P及S之雜原子）之雙環，例如：雙環[4,5]、[5,5]、 [5,6]或[6,6]系統。雜環係描述於以下文獻中：Paquette, Leo A.，Principles of Modern Heterocyclic Chemistry"(W.A. Benjamin，New York, 1968),尤其第1、3、4、6、7及9章；”The
Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs"(John Wiley & Sons, New York, 1950 年至 今），尤其第 13、14、16、19及 28卷；及 J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:55 66。"雜環基"亦包括如下基團，其中雜環基團 與飽和、部分不飽和環或芳族碳環或雜環融合之基團。雜 環之實例包括（但不限於）吡咯啶基、四氫呋喃基、二氮咬 喃基、四氫噻吩基、四氫哌喃基、二氫哌喃基、四氫硫代 哌喃基、哌啶基、嗎啉基、硫代嗎啉基、氧硫雜環己烷 基、哌嗪基、高哌嗪基、吖丁啶基、氧雜環丁烷基、硫雜 環丁烧基、高哌啶基、氧雜環庚烷基、硫雜環庚院基、嚼 氮呼基、二氮呼基、噻氮呼基、2_吡咯啉基、3_吡略琳 基、吲哚啉基、2H-哌喃基、4H_哌喃基、二氧雜環己烧 基、1，3-二氧戊環基、吼唑啉基、二噻烷基、二硫咮基、 一氫哌喃基、二氫噻吩基、二氫呋喃基、吡唑啶基咪唑啶 基、命嗤。定基、3-氮雜雙環[3·ι.0]己基、3_氮雜雙環 [4.1.0]庚基、氮雜雙環[2.2.2]己基、3H-吲哚基、喹嗪基及 N-n比咬基脲。螺部分亦包括在此定義之範疇内。雜環義團 (其中2個環碳原子經侧氧基部分取代）之實例為嘧〆酮 基及1,1 - 一側乳基-硫代嗎琳基。本文中之雜環基團視产、'兄 獨立地經一或多個本文所述之取代基取代。 132799.doc -101 - 200918089 術語"雜芳基”係指5、6或7員環之單價芳基且包括含 有一或多個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子之5-20個原子 的稠環系統(其中至少-者為芳族系統)。雜芳基之實例為 吡啶基（包括例如2_經基，比0定基）“米。坐基、〇米唾井π比咬 基、嘧啶基（包括例如4_羥基嘧啶基）、吡唑基、三唑基、 比秦基 '四唑基、呋喃基、噻吩基、異噁唑基、噻唑基、 °惡°坐基、異°S D坐基、°比°各基、㈣基、異㈣基、十朵 基苯并咪唑基、苯并呋喃基、啐啉基、吲唑基、吲嗪 基、賦嗪基、噠嗪基、三嗓基、異十朵基、嗓咬基、噪吟 基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、噻二唑基、呋吖基、 苯并咳°丫基、苯并喧吩基、苯并嗟嗤基、苯并嗔嗤基、喹 嗤琳基、啥嗔琳基、嗜咬基及吱鳴井吼咬基。雜芳基視情 況獨立地經一或多個本文所述之取代基取代。 雜環或雜芳基可為碳（碳連接）鍵結或氮（氮連接）鍵結於 可能鍵結之處。舉例而言（但不帶限制性），碳鍵結雜環或 雜芳基係鍵結.比咬之位£2、3、4、5或6處，噠唤之位 置3、4、5或6處，嘧啶之位置2、4、5心處，吡嗪之位置 2、3、5或6處，呋喃、四氫呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯 或四氫料之位置2、3、4或5處"惡唾、咪嗤或嘆。坐之位 置2、4或5處，異噁唑、吡唑或異噻唑之位置3、4或5處， 氮丙啶之位置2或3處，吖丁啶之位置2、3或4處，喹啉之 位置2、3、4、5、6、7或8處或異喹啉之位置！、3、4、 5、6、7或 8處。 舉例而言（但不帶限制性），氮鍵結雜環或雜芳基係鍵結 132799.doc -102- 200918089 於氮丙啶、吖丁啶、吡咯、吡咯啶、2-吡咯啉、3-吡洛 啉、咪唑、咪唑啶、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑 啉、2_吡唑啉、3·吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、，嗓琳、 1H-吲喷之位置1處，異吲哚或異吲哚啉之位置2處，嗎啉 之位置4處，及叶嗤或β-β卡琳之位置9處。 "伸烷基"係指具有1-18個碳原子且具有藉由自母體烷烴之同 一碳原子或兩個不同碳原子移除兩個氫原子所產生之兩個 單價基團中心的飽和支鏈或直鏈或環烴基。典型伸烷基包括
(但不限於）：亞甲基（-CHr)、1,2-乙基（-CH2CH2-)、1，3-丙基 (-CH2CH2CH2·)、1，4_T 基(-(：Η2(：Η2(：Η20：Η2·)及其類似基團。 "CVCw伸烷基"為式-(CH2)Mcr之直鏈、飽和烴基。Ci_Ci〇 伸烷基之實例包括亞甲基、伸乙基、伸丙基、伸丁基、伸 戊基、伸己基、伸庚基、伸辛基、伸壬基及伸癸基。 "伸烯基"係指具有2-18個碳原子且具有藉由自母體烯烴 之同一碳原子或兩個不同碳原子移除兩個氫原子所產生之 兩個單價基團中心、的不飽和支鏈或直鏈或環烴基。典型伸 烯基包括（但不限於）：1，2_伸乙基（_ch=ch_)。 ”伸块基”係指具有2_18個碳原子且具有藉由自母體快煙 之同-碳原子或兩個不同碳原子移除兩個氫原子所產生之 兩個單價基團中心的不飽和支鏈或直鏈或環烴基。典型伸 炔基包括（但不限於）：乙快（心c_)、炔丙基（伐㈣）及 4·戊炔基（-CH2CH2CH2CsC-)。
”伸芳基”為具有兩個共價鍵且可呈如下列結構所示之 位'間位或對位構型之芳基： 132799.doc 200918089
其中苯基可未經取代或經至多四個基團取代，該等基團包 括（但不限於）-cvc8烷基、_0_(Ci_c8烷基）、_芳基、 -C(0)R' ' -OC(〇)R' Λ -C(0)0R' . -C(0)NH2 ' -C(0)NHR' > -C(0)N(R')2、-NHC(〇)R|、_S(0)2R’、_s(〇)R，、_〇H、鹵 素、-N3、-NH2、-NH(R’）、_n(R，)2及-CN ;其中 R，各自獨 立地選自H、-CrC8烷基及芳基。
"芳基烷基”係指鍵結於碳原子（通常為末端或sp3碳原子） 之氫原子中之一者經芳基置換之非環狀烷基。典型芳基烷 基包括（但不限於）节基、2_苯基乙_丨_基、2_苯基乙烯 基、萘基甲基、2-萘基乙小基、2_萘基乙烯小基、萘井苄 基、2-奈井苯基乙_丨_基及其類似基團。芳基烷基包含6至 20個碳原子，例如芳基烷基之烷基部分（包括烷基、烯基 或炔基）為1至6個碳原子且芳基部分為5至14個碳原子。 "雜芳基烷基"係指鍵結於碳原子（通常為末端或sp3碳原 子）之氫原子中之一者經雜芳基置換之非環狀烷基。典型 雜芳基烷基包括（但不限於）2_苯并咪唑基甲基、2_呋喃基 乙基及其類似基團。雜芳基烷基包含6至2〇個碳原子，例 如雜芳基炫基之烧基部分（包括烧基、稀基或快基）為… 個碳原子且雜芳基部分為5至14個碳原子及丨至3個選自N、 〇、P及S之雜原子。雜芳基烷基之雜芳基部分可為具有3 至7個環成員（2至6個碳原子）之單環或具有7至1〇個環成員 (4至9個碳原子及！至3個選自N、〇、？及8之雜原子）之雙 132799.doc •104· 200918089 環’例如：雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統。 如本申請案中所使用之術語”前藥”係指本發明之化合物 之前驅體或衍生物形式，其與母體化合物或藥物相比對細 胞之細胞毒性可為較小且能夠被酶促或水解活化或轉化為 更具活性之母體形式。參見（例如）WUman，，，Pr〇drugs in
Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14 ’ 第 375-382 頁，615th Meeting Belfast (1986)及 Stella等
人，"Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery，'1 De/z.ver少，Borchardt 等人，（編）， 第247-267頁，Humana press (i985)。本發明之前藥包括 (但不限於）含有磷酸鹽之前藥、含有硫代磷酸鹽之前藥、 含有硫酸鹽之前藥、含有肽之前藥、經〇_胺基酸修飾之前 藥、糖基化前藥、含有β_内醯胺之前藥、含有視情況經取 代之苯氧基乙醯胺的前藥、含有視情況經取代之苯基乙醯 胺的前藥、5-氟胞嘧啶及其他5_氟尿苷前藥，其可轉化為 更具活性之細胞毒性游離藥物，可衍生成前藥形式以供本 發明使用的細胞毒性藥物之實例包括（但不限於）本發明之 化合物及化學治療劑，諸如上文所述者。 "代謝物”為經由指定化合物或其鹽在身體内代謝所產生 之產物。化合物之代謝物可使用此項技術中已知之常規技 術來鑑別且其活性可使_如本輯述之彼等者之測試來 測定。該等產物可例如由所投與化合物之氧化、還原、水 解、醯胺化、脫醯胺、酯化、脫醋 式產生。因此’本發明包括本發明 、酶促裂解及其類似方 之化合物之代謝物，包 132799.doc •105· 200918089 括藉由包含使本發明之化合物與哺乳動物接觸足以產生代 謝產物之時間段的方法所產生之化合物。 ’’脂質體"為由適用於將藥物傳遞至哺乳動物之各種類型 之脂質、磷脂及/或界面活性劑構成的小泡。脂質體之組 分通常排列成雙層構造，類似於生物膜之脂質排列。 連接子”係指使抗體共價連接於藥物部分之包含共價鍵 或原子鏈之化學部分。在各種實施例中，連接子包括二價 基團，諸如烷二基、芳二基、雜芳二基、諸如 -(CR2)n〇(CR2)n-之部分、烷氧基（例如聚伸乙基氧基、 PEG、聚亞甲基氧基）及烷基胺基（例如聚伸乙基胺基、 amine )之重複單元；以及二元酸酯及醯胺類，包括丁 酉文酉曰丁一 S文醯胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯及己醯胺。 術浯對草性"係指具有對於鏡像搭配物之不重疊性之特性 的分子’而術語，’非對掌性"係指可與鏡像搭配物重疊之分子。 術π立體異構體”係指具有一致化學組成、但原子或基 團之空間排列不同之化合物。
非對映異構體”係指具有兩個或兩個以上對掌性中心且 刀子門互相不為鏡像之立體異構體。非對映異構體具有不 同物理特丨生，例如d彿點、光譜特性及反應性。非對 映異構體之混合物可藉由高解析度分析程序分離，諸如電 泳及層析。 "對映異構體"係指 之兩種立體異構體。 互相為不可重疊之鏡像的一種化合物 本文中所使用 之立體化學定義及慣例一般遵循s· P. 132799.doc 200918089
Yanker 編 ’ McGraw-Hill Dictionary 〇f Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company，New York ;及 Eliel，E. 反 Hen, S.，Stereochemistry of Organic Compounds (1994、 John Wiley & Sons，Inc.，New York。許多有機化合物以光 學活性形式存在，亦即其具有使平面偏振光之平面旋轉之 能力。在描述光學活性化合物時，字首〇及L或及及S用於 表示分子關於其對掌性中心之絕對構型。字首d及1或（+)及 (-)用於表示化合物使平面偏振光旋轉之符號，其中㈠或！ Γ 意謂化合物為左旋的。字首為（+)或d之化合物為右旋的。 對於給定化學結構而言，此等立體異構體除了其互相為鏡 像外為相同的。特定立體異構體亦可稱為對映異構體，且 «亥等異構體之混合物常常被稱為對映異構混合物。對映異 構體之50:50混合物被稱為外消旋混合物或外消旋體，其 可在化學反應或過程中不存在立體選擇性或立體專一性之 情況下出現。術語"外消旋混合物”及"外消旋體"係指兩種 對映異構物質之等莫耳混合物，但其無光學活性。 術語”互變異構體"或”互變異構形式"係指具不同能量之 結構異構體，其可經由低能量障壁互相轉化。舉例而言， 質子互變異構體（亦稱為質子移變互變異構體）包括經由質 子遷移而互相轉化，諸如酮-烯醇及亞胺_烯胺異構化。價 鍵互變異構體包括藉由重組—些成鍵電子而互相轉化。 如本文所使用之片語”醫藥學上可接受之鹽"係指本發明 之化合物的醫藥學上可接受之有機或無機鹽。例示性鹽包 括（但不限於）硫酸鹽、搏檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氣化 132799.doc • 107- 200918089 物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式 磷酸鹽、異菸酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸鹽、 酒石酸鹽、油酸鹽、丹寧酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氮鹽、抗 壞血魷鹽、丁二酸鹽、順丁烯二酸鹽、龍膽酸鹽 (gentisinate)、反丁烯二酸鹽、葡糖酸鹽、葡萄糖醛酸 鹽、葡萄糖二酸鹽、甲酸鹽、苯曱酸鹽、 績酸鹽"甲錢鹽"、乙料酸鹽、苯㈣鹽、對甲苯Z 鹽及雙羥萘酸鹽（亦即Ul_亞甲基雙（2羥基_3_蔡甲酸鹽》 鹽。醫藥學上可接受之鹽可涉及包括諸如乙酸根離子、丁 二酸根離子或其他抗衡離子之另—分子。該抗衡離子可為 使母體化合物上之電荷穩定的任何有機或無機部分。此 外，醫藥學上可接受之鹽可於其結構中具有一個以上帶電 原子。多個帶電原子為醫藥學上可接受之鹽之部分的情況 可具有多個抗衡離子。因此，醫藥學上可接受之鹽可具有 一或多個帶電原子及/或一或多個抗衡離子。 八 若本發明之化合物為鹼，則所需醫藥學上可接受之睡可 藉由此項技術中可利用之任何合適之方法來製備，^用 下列酸處理游離鹼：無機酸，諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、 硝酸、甲烷磺酸、磷酸及其類似酸；或有機酸，二:乙 酸、三氟乙酸、順丁稀二酸、丁二醆、扁桃酸、反丁烯二 酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水楊酸、派喃糖； (Pyran〇SidylaCid)(諸如葡糖搭酸或半乳糖搭酸）、喻酸 (諸如擰檬酸或酒石酸）、胺基酸(諸如天冬胺 S。、芳族酸(諸如苯甲酸或肉桂酸)、磺酸(諸如對甲苯炔 132799.doc -108- 200918089 酸或乙烷磺酸）或其類似酸。 若本發明之化合物為酸，則 藉由任何合適之方法來製 而醫藥學上可接受之鹽可 似物之無機鹼或有機鹼處：鹼土金屬氫氧化物或其類 例包括(伸…、： 酸。合適之鹽之說明性實 例包括（但不限於）源自胺基 氡、後脸 ^ (啫如甘胺酸及精胺酸）、 虱、第一胺、第二胺及第三 * X -fc- 衣私' (诸如0辰0定、嗎及 哌嗪）之有機鹽，及源自鈉、
,Q 3 鉀、鎂、錳、鐵、銅、 鋅、鋁及鐘之無機鹽。 片語"醫藥學上可接受之”并-此& 9不物質或組合物必須與構成 調配物之其他成份及/或所 飞所/〇療之哺乳動物在化學上及/或 毒理學上相容。 ”溶劑合物”係指—或多種溶劑分子與本發明之化合物之 締合物或複合物。形成溶劑合物之溶劑之實例包括(但不 限於）水、異丙醇、乙醇、甲醇、Dm〇、乙酸乙醋、乙酸 及乙醇胺。術語"水合物"係指溶劑分子為水之複合物。 術語”保護基”係指通常用於阻斷或保護特定官能基同時 使化合物上之其他官能基反應之取代基。舉例而言，"胺 基保護基”為連接於胺基之取代基，其阻斷或保護化合物 中之胺基官能基。合適之胺基保護基包括乙醯基、三氟乙 醯基、第二丁氧基羰基（B0C)、苄氧羰基（CBZ)及9穽基甲 氧基羰基（Fmoc)。類似地，|，經基保護基"係指阻斷或保護 羥基官能基之羥基之取代基。合適之保護基包括乙醯基及 矽烷基。羧基保護基”係指阻斷或保護羧基官能基之羧基 132799.doc -109- 200918089 之取代基。常見羧基保護基包括苯基磺醯基乙基、氰基乙 基、2-(三甲基矽烷基）乙基、2_(三甲基矽烷基）乙氧基甲 基、2-(對甲苯磺醯基）乙基、2_(對硝基苯基次磺醯基）乙 基、2-(二苯基膦基）_乙基、硝基乙基及其類似基團。關於 保護基及其用途之概述，參見T. W. Greene，Protective
Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991 。 ”離去基，，係指可經另一官能基取代之官能基。某些離去 Γ:基為此項技術中所熟>，且實例包括（但+限於⑶化物（例 如氯化物、溴化物、碘化物）、甲烷磺醯基（甲磺醯基）、對 甲苯績醯基（甲苯績醯基）、三敦甲基績酿基（三氟甲續酸醋 基）及二氣甲基續酸g旨基。 縮寫 連接子組分： MC = 6-順丁烯二醯亞胺基己醯基
Val-Cit或"vc" =纈胺酸_瓜胺酸（蛋白酶可裂解之連接子中 的例示性二肽） 瓜胺酸=2-胺基-5-脲基戊酸 PAB =對胺基苄氧羰基（”自我犧牲型”連接子組分之實例） Me-Val-Cit=N-甲基-纈胺酸_瓜胺酸（其中連接子肽鍵已 經修飾以防止其被組織蛋白酶B裂解） MC(PEG)6-〇H=順丁烯二醯亞胺基己醯基-聚乙二醇（可 連接於抗體半脱胺酸）。 細胞毒性藥物： 132799.doc •110· 200918089 MMAE=單甲基奥瑞他汀E(MW 718) MMAF=於藥物之C末端處具有苯丙胺酸之奥瑞他汀 E(MMAE)的變異體（MW 731.5) MMAF-DMAEA=具有以醯胺鍵連接至C末端苯丙胺酸之 DMAEA(二曱基胺基乙胺）之MMAF(MW 801.5) MMAF-TEG=具有與苯丙胺酸發生酯化之四乙二醇之MMAF MMAF-NtBu=N-第三丁基，以醯胺形式連接於MMAF之C末端 DM1=N(2’)-脫乙醯基-N(2’)-(3-酼基-1-側氧基丙基）-美登素 DM3=N(2')-脫乙醯基-N2-(4-巯基-1-側氧基戊基）-美登素 DM4=N(2')-脫乙醯基-N2-(4-巯基-4-曱基-1-側氧基戊 基）-美登素 其他縮寫如下：AE為奥瑞他汀E，Boc為TV-(第三丁氧基 叛基），cit為瓜胺酸，dap為多拉脯胺酸（dolaproine)，DCC 為1,3-二環己基碳化二亞胺，DCM為二氯甲烷，DEA為二 乙胺，DEAD為偶氮二曱酸二乙酯，DEPC為氰代磷酸二乙 酯，DIAD為偶氮二甲酸二異丙酯，DIEA為7V,iV-二異丙基 乙胺，dil為多拉異白胺酸（dolaisoleucine)，DMA為二甲基 乙醯胺，DMAP為4-二曱基胺基吡啶，DME為乙二醇二甲 醚（或1，2-二甲氧基乙烷），DMF為7V，7V-二甲基甲醯胺， DMSO為二甲亞石風，doe為多拉非寧（dolaphenine)，dov為 W,iV-二甲基纈胺酸，DTNB為5,5’-二硫基雙（2-硝基苯曱 酸），DTPA為二伸乙基三胺五乙酸，DTT為二硫蘇糖醇， EDCI為1-(3-二曱基胺基丙基）-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽， EEDQ為2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氫喹啉，ES-MS為電 132799.doc -111 - 200918089 喷質譜法，Et0Ac為乙酸乙酯，Fmoc為恳(9_苐基甲氧基羰 基），gly為甘胺酸，HATU為六氟磷酸(9-(7•氮雜苯并三唑·卜 基）W，7V，；v’-四甲基錄，HOBt為1-羥基苯并三唑，HPLC為高 塵液相層析法，ile為異白胺酸，lyS為離胺酸，MecN(cH3CN) 為乙腈，MeOH為曱醇，Mtr為4-曱氧基苄基二苯基甲基（或4· 甲氧基三苯甲基）’ nor為（7χπΗ+)_去甲麻黃鹼，pBS為磷酸 鹽緩衝生理食鹽水（pH 7.4)，PEG為聚乙二醇，凡為苯基， Pnp為對硝基苯基，MC為6_順丁烯二醯亞胺基己醯基，phe 為L-苯丙胺酸，PyBr〇p為六氟磷酸溴參_吡咯啶基鎸，sec 為尺寸排阻層析法’ Su為丁二醯亞胺，TFA為三氟乙酸， TLC為薄層層析法，uv為紫外線，且vai為纈胺酸。 "游離半胱胺酸胺基酸”係指已工程化至親本抗體中、具 有硫醇官能基（-SH)且未以分子内或分子間二硫橋配對之 半胱胺酸胺基酸殘基。 術語"硫醇反應性值"為游離半胱胺酸胺基酸之反應性之 定量表徵。該硫醇反應性值為與硫醇反應性試劑反應之半 胱胺酸工程化抗體中游離半胱胺酸胺基酸之百分比，且被 換算為最大值1。舉例而言，以i 〇〇%產率與硫醇反應性試 劑（諸如生物素-順丁烯二醯亞胺試劑）反應以形成生物素標 記抗體的半胱胺酸工程化抗體上之游離半胱胺酸胺基酸具 有1 · 0之硫醇反應性值。另一被工程化至相同或不同親本 抗體中且以80%產率與硫醇反應性試劑反應之半胱胺酸胺 基酸具有0.8之硫醇反應性值。另一被工程化至相同或不 同親本抗體中且完全不能與硫醇反應性試劑反應之半胱胺 I32799.doc -112· 200918089 酸胺基酸具有ο之硫醇反應性值。特定半胱胺酸之硫醇反 應性值之測定可藉由ELISA檢定、質譜法、液相層析法、 自動放射照相術或其他定量分析測試來進行。 •'親本抗體"為包含一段胺基酸序列且該胺基酸序列中之 一或多個胺基酸殘基由一或多個半胱胺酸殘基置換的抗 體。該親本抗體可包含天然或野生型序列。相對於其他天 然、野生型或經修飾形式之抗體而言，親本抗體可具有預 ί 先存在之胺基酸序列修飾（諸如添加、缺失及/或取代）。親 本抗體可針對所關注之靶抗原， 例如生物學上重要之多 肽。亦涵蓋針對非多肽抗原（諸如 a TTC1 腫瘤相關糖脂抗原；參 見US 5091178)之抗體。 表1
C-C increased from 12 to 15 Z is average of EQ B is average of ND match with stop is _M; stop-slop = 0;) (joker) match = 〇 */ ^define int /* A /♦A*/ /♦BV /* C */ /* D */ /*E*/ /* F*/ /*G·/ /* Η */ /*1*/ /*}*/ /*K*I /*L V /*M*/ /*N */ /*0*/ ΛΡ*/ /*Q*/ /+RV /*S*/ /*T*/ Λ U */ /* V V /* W*/ ΛΧ*/ Λ Y V ΛΖ*/
M -8 /* value of a match with t
stop V _day[26][26]叫 BCDEFGHUKLMNOPQRSTUVWXv { 2, 0,-2, 0, 0,-4, 1,-1,-1, 0,-1,-2,-1, 〇 M, I, 0,-2 1 1 0 0 6 0·} { 0. 3,-4, 3, 2,-5, 0, 1,-2, 0, 0,-3,-2, 2, M,-l, 1 0 0 〇 o'j't'n \3, °^' {-2,-4,15,-5,-5,-4,-3,-3,-2, 0,-5, { 0,3,-5,4, 3,-6, 1, 1,-2, 0, 0,-4,-3, 2, M,-l, 2,-1 〇' 〇 〇' j 7 η j,' { 0,2,-5, 3, 4,-5, 0, 1,-2,0. 0,-3.-2, 1,'m -I 2 -1 〇 〇 Jll' 2)， H,-5,-4,-6,-5, 9,-5.-2, I, 0,-5, 2,0.^t： Μ,-5,-5 ^ ύ {-1,-2,-5,-3,-2,0,-3,-2, 2, 0, 0, 4, 6Γ2 Jm,-2 -I ο,.ζΐ 'ο { 0, 2,-4, 2, 1,-4, 0, 2,-2, 0, 1,-3,-2,2, Μ,-1,1 0 1 0 〇Τά ^1). { 1,-1,-3,-1,-1,-5,-1,0,-2, 0,-1,-3,-2,-1,_Μ, 6, 〇| 0,1, 〇7〇 J| ί〇, 1,-5,2,2,-5,-1.3,-2,0, 1,-2,-U ], Μ, 0, 4, 1 - | Ι| 〇 2 S λ (-2,0,-4,-1,-1,-4,-3,2,-2, 0, 3,3, 0, 〇,；Μ, 〇, , '6' ' °^{5· 3}； { 1. 〇, 0,0,0.-3,1,-Ι.-Ι, 〇, 0,-3,-2, Ι,_Μ, 1,-1, 〇 2'〇)· { 1,0,-2,0, 0,-3, 0,0, 0,-1,-1,0. Μ, 0,-1 7 3 〇 Λ ηΊ1 °)·{0,0,0,0,0,0, 0,0,0, 0,0, 〇, 〇, 〇, μ, 0, 〇, 〇 ά 〇 〇 〇 〇 ή ό « 〇}·{0,-2,-2,-2,-2,-1,-1,2,4, 0,-2,2, 2,-2,_Μ；.ι；.2，2., J 〇' °·.°； °' 0>. {-6,-5,-8,-7,-7, 0,-7,-3,-5, 0,-3,-2,-4,-4, Μ,-6,-5 2-2-5 0-6 17〇λ2'"2^ (ο, ο, 〇, 0,0,0,0,0,0,0,0,0,0, 〇, Μ, ο, 0 0 〇 〇 〇 〇V'n7A〇A0··6}. {-3,-3, 0,-4,-4, 7,-5, 0,-4,-1,-2,-2, Μ；5 -4 ^.3-3 ό 2 ή Α?}) { 〇, 1,5, 2, 3,5, 0, 2,-2, 0, 0,-2,-1, Ι,_Μ, 0, 3, 〇, ό, 6, 0, a'J 0 ϊ °4^ί· 132799.doc -113 - 200918089 表ι(續） /*
V ^include <stdio.h> #include <ctype.h> ^define MAXJMP 16 /* max jumps in a diag */ ^define MAXGAP 24 /* don't continue to penalize gaps larger than this */ ^define JMPS 1024 /* max jmps in an path */ ^define MX 4 /* save if there's at least MX- i bases since last jmp 1 #defme DMAT 3 I* value of matching bases */ #defme DMIS 0 /* penalty for mismatched bases */ ^define DINSO 8 /* penalty for a gap */ Adeline DINS1 1 /* penalty per base */ #deflne PINSO 8 /* penalty for a gap */ ^define PINS1 4 /* penalty per residue */ struct jmp { short n[MAXJMP]; l* size of jmp (neg for dely) */
unsigned short x[MAXJMP]; /* base no. of jmp in seq x */ }; /* limits seq to 2ΛΙ6 -1 */ struct diag {
int score; /* score at last jmp */ long offset; Λ offset of prev block V short ijmp; /* current jmp index */ struct jmp >； jp; /* list of jmps V struct path { int spc; /* number of leading spaces V short n[JMPS];/^ size of jmp (gap) */ int x[JMPS];/* loc of jmp (last elem before gap) */ char *oflIe; /* output file name */ char *namex[2]; /* seq names: getseqs() */ char *prog； /* prog name for err msgs */ char *seqx[2]; /* seqs: getseqs() */ int dmax; /* best diag: nw() */ int dmaxO; /* final diag */ int dna; /* set if dna: main() */ int endgaps; /* set if penalizing end gaps */ int gapx, gapy; I* total gaps in seqs */ int lenO, leal; /* seq lens */ int ngapx, ngapy; I* total size of gaps */ int smax; /* max score: nw() */ int *xbm; /* bitmap for matching */ long offset; /* current offset in jmp file */ struct diag *dx; /* holds diagonals */ struct path PP[2]； /* holds path for seqs */ char char *calloc(), *malloc〇, *index(), *strcpy(); *getseq(), *g_calloc〇;
-114- 132799.doc 200918089 表ι(續） /* Needleman-Wunsch alignment program * * usage: progs filel file2 * where file] and file2 are two dna or two protein sequences. * The sequences can be in upper- or lower-case an may contain ambiguity * Any lines beginning with V, '>* or '<' are ignored * Max file length is 65535 (limited by unsigned short x in the jmp struct)
* A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA * Output is in the file "align.out" * * The program may create a tmp file in /tmp to hold info about traceback. ♦ Original version developed under BSD 4.3 on a vax 8650 */ ^include "nw-h11 ^include "day.h" static _dbval[26] = { 1,14,2,13,0,0,4.11,0,0,12,0,3.15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0,10,0
static _pbval[26j = { 1, 2|(l«CDl-'A,))|(l«(,Nt-,Al))) 4, 8, 16, 32t 64, 128, 256, OxFFFFFFF, 1«10, l«U, 1«12, 1«13, 1«14, 1«15, l«16, 1«】7, K<18, 1«19, 1«20,丨《21，I«22, 1«23,）《24, 1<<25|(]<<(_E，-，A，))|(1<<(，Q，-_A*)) main(ac, av) int char ac; *av[]; main prog = av[0]; if(ac!=3){ fprintf(stdeir,"usage: %s filel file2\n"i prog); fprintf(stderr,"where file! and file2 are two dna or two protein sequences.\nH); fj>rintf(stderr，’’The sequences can be in upper- or lower-case\n"); fprintf^stderr/'Any lines beginning with V or '<' are ignoredVi"); fj)rintf]；stdea,"Output is in the fi!e \"align.out\"\n"); exit(1); } namex[0] = av[l]; namex[l] =5 av[2]; seqx[0] - getseq(namex[0], &len0); seqxjl] = getseq(namex[l], &lenl); xbm = (dna)? .dbval; .pbval;
endgaps - 0; /* 1 to penalize endgaps */ ofile = "align.out"; /* output file */ nw(); /* fill in the matrix, get the possible jmps */ readjmps(); /* get the actual jmps */ print(); /* print stats, alignment */ cleanup(O); /* unlink any tmp files V) -115 - 132799.doc 200918089 表ι(續） /* do the alignment, return best score: main() * dna: values in Fitch and Smith, PNAS, 80, 1382-1386, 1983 * pro: PAM 250 values * When scores are equal, we prefer mismatches to any gap, prefer * a new gap to extending an ongoing gap, and prefer a gap in seqx * to a gap in seq y, */ nw() l char *px, *py; /* seqs and ptrs */ int ♦ndely, *deiy; /* keep track of dely */ int ndelx, delx; /* keep track of delx */ int *tmp; /* for swapping rowO, rowl */ int mis; /* score for each type */ int insO, insl; /* insertion penalties */ register id; /* diagonal index */ register U； /* jmp index */ register *col0, *col1; /* score for curr, last row */ register xx, yy; /* index into seqs */ nw
dx = (struct diag *)g_calloc(,,to get diags", lenO+lenl + 1, sizeof(struct dtag)); ndely = (int *)g_calloc("to get ndely", lenl+!, sizeof(int)); dely = (int *)g_cal!oc("to get dely", lenl + 1, sizeof(int)); colO = (int *)g_calloc("to get col0n, lenl + 1, sizeof(int)); coll =(int *)g_calloc("to get coll", lenl+1, sizeof(int)); ins0 = (dna)?DINS0:PINS0; insl -(dna)?DINSl :PrNSI; smax = -10000; if (endgaps) { for (〇〇!0[0] = dely[0] = -insO, yy = 1; yy <= len 1; yy++)( col0[yy] = dely[yy] = col0[yy-l] - insl; ndelyfyy] = yy; ) col0[0] = 0; /* Waterman Bull Math Biol 84 */ ) e^se for (yy = I; yy <= len I; yy++) dely[yy] = -insO; /* fill in match matrix */ for (px = seqx[0], xx = 1; xx <= lenO; px++, xx++) { /* initialize first entry in col */ if (endgaps) { if(xx~ 1)
col 1 [0] = delx - -(insO+ins I); else coll[0] = delx = col0[0] - insl; ndelx = xx; ) else { collf0]=0; delx = -insO; ndelx - 0; } 132799.doc -116- 200918089 表ι(續） …nw for (py = seqx[l], yy - 1; yy <= lenl; py-Η-, yy++) { mis = col0[yy-t]; if (dna) mis += (xbm[*px-'A']&xbm[*py-,A'])? DMAT : DMIS; else mis += _day[*px-'A'][*py-,A']; /* update penalty for del in x seq; * favor new del over ongong del * ignore MAXGAP if weighting endgaps *i if (endgaps || ndely[yy] < MAXGAP) { if (colOfyy] - insO >= dely[yy]) { dely[yy] = col0[yy] - (insO+insl); ndely[yy] = 1; } else {
dely[yy] -- insl; ndely[yy]++； } } else { if (col0[yy] - (insO+insl) >= de!y[yy]) { dely[yy] = coI0[yy] - (insO+insl); ndely[yy] - 1; } else ndely[yy]++; /* update penalty for del in y seq; * favor new del over ongong del */ if (endgaps || ndelx < MAXGAP) { if (coi 1 [yy-1 ] - insO >= delx) { delx = coll[yy-l] - (insO+insl); ndelx = I； } else { delx -= ins 1; ndelx++; } } else {
if (col 1 [yy-1) - (insO+ins I) >= delx) { delx = coll[yy-l] - (insO+insl); ndelx = 1; } else ndelx-H-; /* pick the maximum score; we're favoring * mis over any del and delx over dely */ nw id ^ \x - yy + lenl - 1, if (mis >= delx && mis >= delyfyy]) coll [yy] = mis; 117- 132799.doc 200918089 表ι(續） else if (delx >= dely[yy]) { coll[yy] = deix; ij =dx[id].ijmp; if (dx[id].jp.n[0] && (!dna || (ndelx >= MAXJMP && xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id],score+DINSO)) { dx[id].ijmp++; if(++ij>= MAXJMP) { writejmps(id); ij = dx[id].ijmp = 0; dx[id].offset - offset; offset += sizeof(struct jmp) + sizeof(offset); } ) dx[id] ,jp.n[ij]" ndelx; dx[id].jp.x[ij] = xx； dx[id].score = delx; } else { coll[yy] - dely[yy]; ij = dx[id].ijmp;
if (dx[id].jp.n【0] && (!dna || (ndelylyy] >= MAXJMP && xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id].score+DINSO)) { dx[idj.ijmp++; ιΓ(++υ>= MAX JMP) { writejmps(id); ij = dx[id].ijmp = 0; dx[id].ofFset = offset; offset += sizeof(struct jmp) + sizeofi(offset); } } dx[id].jp.n[ij] = -ndely[yy]; dx[id].jp.x[ij] xx; dxfidj.score = dely[yy]; } if (xx = lenO && yy < len 1) {
I* last col V if (endgaps) coll[yy] -= ins0+insl*(lcnl-yy); if (col l [yy] > smax) { smax = col![yy]; dmax - id; } if (endgaps &,& xx < lenO) coll[yy-l] -= insO+insl*(lenO-xx); if(co!1[yy-l]>smax){ smax = coll [yy-1]; dmax = id; tmp = colO; colO = col 1; col 1 = tmp; (void) frec((char *)coll); 118- (void) free((char *)ndelv)； (void) frec((char *)dely); (void) frce((char ♦)〇〇!0); 132799.doc 200918089 表ι(續）
/· * * print() — only routine visible outside this module * * static: * getmat() - trace back best path, count matches: print() * pr_align() -- print alignment of described in array p[]: print() * dumpblock() -- dump a block of lines with numbers, stars: pr_align() * nums() - put out a number line: dumpblock() * putline() - put out a line (name, [num], seq, fnum]): dumpblock〇 * stars() - -put a line of stars: dumpblock() * stripname() - strip any path and prefix from a seqname */ ^include "nw.h" ^define SPC 3 ^define P LINE 256 ^define P_SPC 3 extern _day[26}[26]; int olen; FILE *fx; print() { int lx, ly, flrstgap, lastgap; /* overlap */ if ((fx = fopen(ofi)e, 'V')) =-= 0) { ^>rintf(stderr,"%s: can't write %s\n", prog, ofile); cleanup ⑴； ) fprintfl[ix, "<first sequence; %s (length - %d)\n", namex[0], lenO); fpnntfiffx, "<second sequence: %s (length = %d)\n", namex[l], lenl); olen = 60; lx ~ lenO; ly = len I; firstgap = lastgap = 0; if (dmax < lcnl - 1) { /* leading gap in x */ pp[0].spc = firstgap = len I - dmax -1; ly -= pp[0].spc; } else if (dmax > lenl -1) { /* leading gap in y */ pp[I].spc = firstgap = dmax - (len I - I); !x -= pp[1].spc; ) if (dmaxO < lenO - l) { /* trailing gap in x */ lastgap = lenO - dmaxO -1; lx -- lastgap; } else if (dmaxO > lenO -1) { /* trailing gap in y */ lastgap = dmaxO - (lenO -1); ly -= lastgap; } getmat(lx, ly, firstgap, lastgap); pr—align〇; ) /* maximum output line */ /* space between name or num and seq */ /♦ set output line length */ /* output file */ print 132799.doc -119- 200918089 表ι(續）
/* * trace back the best path, count matches
V static getmat(lx, ly, fustgap, lastgap) int lx, ly; int firstgap, lastgap;{ /* "core”（minus endgaps) */ /* leading trailing overlap */ getmat int char double register register char /* get total matches, score */ iO = il =siz0 = sizl =0; pO = seqx[0] + pp[I].spc; pi -seqx[l] + pp[0].spc; nO = pp[l].spc+ Ϊ; nl -pp[0].spc+ 1; nm, iO, il, sizO, sizl; outx[32]; pet; nO, n l;*P〇, *pi; nm = 0; while (*p0&& *pl ){ if(sizO){ p!-f+ nl++ sizO- else if (sizl) { p0++; nO-H-; sizl-; } else { if(xbm[*pO-,A']&xbm[*pl-'A,]) nm++; if (n0++ ~ pp[0],x[i0]) sizO - pp[0].n[i0++]; if (nl++ = pp[]].x[il]) sizl = pp[l].n[il++]; p0++; pl++; /* pci homology:
* if penalizing endgaps, base is the shorter seq * else, knock off overhangs and take shorter core if (endgaps) lx = (lenO < len 1)? lenO : !en 1; else lx = (lx < ly)? ix : iy; pct= IOO,*(double)nm/(double)lx; fprintf(fx, Λη'1); fprintf(fx, "<%d match%s in an overlap of %d: %.2f percent similarity\nM, nm, (nm -= 1)? "": "es", lx, pet); 120- 132799.doc 200918089 表ι(續）
fprintf(fxs "<gaps in first sequence: %d", gapx); if (gapx) { (void) sprintii[outx," (%d %s%s)", ngapx, (dna)? "base'^'Yesidue", (ngapx = 1)? "":Ms"); fprintf(fx,"%s", outx); fprintf^fx,", gaps in second sequence: %d", gapy); if (gapy) { (void) sprintf(outx," (%d %s%s)", ngapy, (dna)? "base":"residue", (ngapy == 1)? fprintfifx,"%s", outx); ) if (dna) fprintf(fx, "\n<score: %d (match = %d, mismatch = %d, gap penalty = %d + %d per base)\nH, smax, DMAT, DMIS, DINSO, DINSI); else iprinti^ix, "\n<score: %ύ (DayhoffPAM 250 matrix, gap penalty = %d + %d per residue)^", smax.PrNSO, PINS1); if (endgaps) fprintf(fx, "<endgaps penalized, left endgap: %d %s%s, right endgap: %d %s%s\n", firstgap, (dna)? ”base": "residue", (firstgap = 1)? ”” ： ”s”， Iastgap, (dna)? "base": "residue", (lastgap — 1)? "": "s"); else fprintf(fx, *'<endgaps not penalized\n"); ...getmat static nm; /* matches in core - for checking */ static Imax; /* lengths of stripped file names */ static ij[2]； /* jmp index for a path */ static nc[2]; /* number at start of current line */ static ni[2]； /* current elem number - for gapping */ static siz[2]; static char *ps[2]; /* ptr to current element */ static char *P〇[2]； /* ptr to next output char slot */ static char out[2][P LINE]; /* output line */ static char starfP UNE]； /* set by stars() */
/* * print alignment of described in struct path pp[) */ static pr—a!ign〇 ί int nn; /* char count */ int more; register i; for (i = 0, Imax = 0; i < 2; i++) { nn - stripname(namex[i]); if (nn > Imax) lmax = nn; nc[i】 =1; ni[i] = l； siz[i]-ij[i]==0; ps[i] = seqx[i]； po[i] = out[i]; } pr_align 132799.doc -121 - 200918089 表ι(續）
for (nn = nm = 0, more = 1; more;) { for (i = more = 0; i < 2; i-H-) { /* * do we have more of this sequence? */ if〇*ps[i]) continue; more-H·; if (pp[i].spc) { /* leading space */ *P〇[i】W_; pp[i).spc-;} else if (sizji]) { /* in a gap */ *po[i]++二，Λ siz[i]--;} else ( /* we're putting a seq element ♦/ *po[i] = *ps[i); if (islower(*ps[i])) *ps[i] = toupper(*ps[i]); P〇[i]++； ps[i]++; /* * are we at next gap for this seq? */ if(ni[i]^ppti].x[ij[i]]) { /* * we need to merge all gaps * at this location */ Siz[i] = pp[i]n[ij[i]-H-]; while (ni[i] == pp[i].x[ij[i]]> siz[i] += pp[i].n[ij[i]++];} ni[i]++; ,pr_align if (-H-nn — olen || !more && nn) { dumpblockO; for (i = 0; i < 2; i++) po[i】 = o_; nn = 0;
/* * dump a block of lines, including numbers, stars: pr_align() */ 一 static dumpblock()( register i; for(i = 0;i<2;i++) *po[i]- = *\0'; dumpblock 132799.doc 122- 200918089 表1 (續） •••dumpblock (void) putciV, fx); for(i = 0; i <2; i++)( if (*out[i] && (*out[" != 1 _ || *(po[i]) != )> { if(i — 0) nums(i); if (i == 0 && *out[l]) stars(); putline(i); if (ί = 〇 && *〇ut[l]) fprintf)[fx, star); if(i = 1) nums(i); } } } /♦ * put out a number line: dumpblock() */ static
nums(ix)i num$ int ix； /* index in out[] holding seq line */ char nline[P_LINE]; register i,j; register char *pn, *px, *py; for (pn = n]ine，i = 0; i < lmax+P_SPC; i++，pn十+) *pn = "; for (i - nc[ix], py = out[ix); *py; py++, pn-H·) { if(*py=-M|| *py *pn = 1
else { if(i%10 = 0||(i — 1 && nc[ix] != 1)) { j = (i < 0)? -i: i; for (px = pn;j;j/= 10, px-) *ρχ = '}%\0 + ^\ if(i<0) *px=*；) else *pn = "； i++；}} *pn - '\0'; nc[ix] = i; for (pn = nline; *pn; pn+十） (void) putc(*pn, fx); (void) putc(、n·, fx); /·
* put out a line (name, fnum], seq, [num]): dumpblock() V static putline(ix) int ix; putline -123 - 132799.doc 200918089 表ι(續） int ί; register char *px: for (px - namcx[ix], i = 0; *px && *px !-px++, i-H-) (void) putc(*px, ix); for (; i < lmax+P_SPC; i++) (void) putc('fx); /* these count from 1; * ni[] is current eiemeni (from 1) * nc[] is number at start of current line */ for (px = 〇ut[ix]; *px; px十+) (void) putc(*px&0x7F, ix); (void) putcC\n', fx); ...putline
/* * put a line of stars (seqs always in out[0], out[l]): dumpblock() ♦/ static stars(){ int i; register char *p0, *pl, cx, *px; if (! *out[0] || (*out[0] ='' && *(po[0]) ='') || ! *out[ I ] || (+out[ !]=-"&& *(po[ I ]) == *')) return; px = star; for (i = lmax+Ρ—SPC; i; i--) *pX-H- = 1 for (pO = out[0], p 1 = 〇ut[ I ]; *p0 && *p 1; pO-Η-, p 1 ++) { if (isalpha(*p〇) && isalpha(#pI)) { if (xbm【*pO-，A，]&xbm[*pl-_A_]) { cx = nm++;) else if (!dna && _day[*pO-'A'][*p 1-Ά'] > 0) cx = ’__; else cx =} else cx = *px+十=cx;) *px++ = ^n'; *px =’\0’； stars 132799.doc -124- 200918089 表ι(續） /* * strip path or prefix from pn, return len: pr_align() */ static stripname stripname(pn) char *pn; /* file name (may be path) */ { register char *px, *py; py^o； for (px - pn; *px; px++) if(*px = r) py = px+ I; if (py) (void) strcpy(pn, py); return(str!en(pn)); ( 132799.doc -125- 200918089 表ι(續） /* * cleanup() - cleanup any tmp file * getseq() - read in seq, set dna, ien, maxlen * g_calloc() - calloc() with error checkin * readjmps〇 - get the good jmps, from tmp file if necessary * writejmps〇 - write a filled array of jmps to a tmp file: nw() */ ^include "nw.h" ^include <sys/file.h> char *jname - 7tmp/homgXXXXXX"; /* tmp file for jmps */ FILE *ij; int cleanup(); /* cleanup tmp file */ long lseek(); /* * remove any tmp file if we blow */ cleanup(i) cleanup
if(fj) (void) unlink(jname); exit(i);} /* * read, return ptr to seq, set dna, len, maxlen * skip lines starting with or * seq in upper or lower case V char *
getseq(file, len) char *file; int *len;{ char register char int FILE /* file name */ /* seq len */ getseq
line[1024], *pseq; *px, *py; natgc, tlen; *Φ； if ((fp = fopen(ftle,"r")) == 0) { fprinti(stderr,"%s: can't read %s\n", prog, file); exit ⑴；} tlen = natgc = 0; while (fgets(line, 1024, fp)) { if (*line = || *line = '<f || *line ='>') continue; for (px = line; *px !- V; px++) if (isupper(*px) |j islower(*px)) tlen++; if ((pseq - malloc((unsignedXt!en+6))) — 0) { fprintfistderr/^/os: malloc〇 failed to get %d bytes for %s\n", prog, t!en+6, file); exit ⑴；} pseq[0] = pseq[l] = pseq[2] = pseq[3] = '\0'; 132799.doc -126- 200918089 表ι(續） ...getseq py = pseq + 4; *ien = tlen; rewind(fp); while (fgetsfline, 1024, fp)) { if (*Iine ==|| *line = '<' |) *Iine ='>') continue; for (px = line； *px != '\n'; px++) { if (isupper(*p\)) *py++ = *ρχ; else if (islower(*px)) *py++ = toupper(*px); if (index(,,ATGCb",*(py-1))) natgc++;
♦py-H· = *\〇'； *py =，\〇T; (void) fclose(fp); dna = natgc > (tlen/3); return(pseq+4); Ϊ char ♦ g_calloc(msg, nx, sz) char *msg; /* program, calling routine */ int nx, sz; /* number and size of elemems */i char *px, *caHoc(); if ((px = calloc((unsigncd)nx, (unsigned)sz)) = 0) { if(*msg) { fprintfistderT, "%s: g_calloc〇 failed %s (n=%d, sz=%d)\n", prog, msg, nx, sz); exit ⑴； " g_ca!loc return(px);
/* * get final jmps from dx[] or tmp file, set ρρΠ^ reset dmax: main() */ readjmps(){ int fd = -1; int siz, i0, il； register i, j, xx; (void) fclose(Q); if ((fd = open(jname, 0_RDONLY, 0)) < 0) { fprintfistderr, ''%s: can't open()%s\nH, prog, jname); cleanup(l); Ϊ) for (i = iO = i I = 0, dmaxO = dmax, xx = JenO;; i++) { while (1){ for (j = dx[dmax].ijmp; j >=0 && dx[dmax].jp.x[)} >= xx; j-) readjmps 132799.doc -127- 200918089 表ι(續） if 〇 < 0 && dx[dmax].offset && 〇) { (void) lseck(fd, dx[dmax].offset, 0); (void) read(fd, (char *)&dx[dmax].jp, sizeofistruct jmp)); (void) read(fd, (char *)&dx(dmax).offset, 5izeof(dx(dmax].offse〇); dx[dmax].ijmp = MAXJMP-1; } else break; } if(i>-JMPS){ fprintfistderr, "%s: too many gaps in alignmentVn", prog); cleanup(l);} if(j>=〇){ siz - dx[dmax].jp.n[j]； xx = dx[dmax].jp.x[j]; dmax += siz; if(siz<0) { /* gap in second seq */ pp[l].nlU) = -siz; xx +== siz; /* id = xx - yy + len 1 - 1 */ pp[l].x[ill =xx - dmax + len 1 - 1; ...readjmps
gapy++; ngapy -= siz; /* ignore MAXGAP when doing endgaps */ siz = (-siz < MAXGAP || endgaps)? -siz : MAXGAP; il++; else if (siz > 0) { /* gap in first seq */ pp[0].n[i0] - siz; pp[0].x[i0] - xx; gapx++; ngapx +- siz; /♦ ignore MAXGAP when doing endgaps */ siz = (siz < MAXGAP || endgaps)? si2 : MAXGAP; i0++; else break;
/* reverse the order of jmps */ for 〇 - 0, i〇-; j < i〇-) { i= PP[〇] nL)3； PP[〇].n[j] - pp[〇].n[i0]; pp[0] n[i0] - i; i = pp[0] x[j]； PP[〇].xD] s PP[〇].x[iQ3； PP[〇]-x[i〇] = i； Ϊ for (j =0, il-s j< Π； j++, Π-) { i = pp[l].n[j]； pp[i].n[j] *= pp[IJ.n[i1]; pp[I].n[il] = i;ί = ρρΙΠ-χϋϊ； ρρΙΠχϋΐe ρρΙΠ-χΙΠ]; ρρ[ΐ]·χ[»Π s»;} if(fd>= 0) (void) close(fd); (void) unlink(jname);0 = 〇; offset = 0; 132799.doc -128- 200918089 表ι(續） * write a filled jmp struct offset of the prev one (if any): nw() */ writejmps(ix) writejmps int ix; { char *mktemp(); ίί(!〇)[ if (mktemp(jname) < 0) { fprintf^stclcrr, "%s: can't mktemp() %s\n", progjname); cieanup(l); } if ((〇 = fopen(jname, "w")) ™ 0) { fprintf(stdcn·, "%s: can't write %s\n", prog, jname); exit(l); } ) (void) fwrite((char *)&dx[ix].jp, sizeof(structjmp), I, fj); (void) fwrite((char *)&dx[ixj.offset, sizeof(dx[ix].offset), I, ^); } III.本發明之組合物及方法 本發明提供抗-CD79b抗體或其功能片段，及其用於治療 造血組織腫瘤之方法。 在一態樣中，本發明提供一種抗體，其（較佳特異性地） 結合至上文或下文所述之多肽中之任一者。視情況，該抗 體為單株抗體、抗體片段（包括Fab、Fab’、F(abi)2及Fv片 段）、雙功能抗體、單域抗體、嵌合抗體、人類化抗體、 單鏈抗體或競爭性抑制抗-CD79b多肽抗體與其各別抗原性 抗原決定基之結合之抗體。本發明之抗體可視情況與生長 抑制劑或細胞毒性劑結合，該生長抑制劑或細胞毒性劑諸 如毒素，包括（例如）奥瑞他汀、美登素類、海兔毒素衍生 物或卡奇黴素、抗生素、放射性同位素、溶核酶或其類似 物。本發明之抗體可視情況於CH0細胞或細菌細胞中產生 且較佳引起其所結合之細胞死亡。出於偵測目的，本發明 之抗體可以可偵測方式標記、連接於固體支撐物或其類似 •129· 132799.doc 200918089 情況。 在-態樣中’本發明提供一種人類化抗_CD79b抗體，I 中該抗體對CD79b之單價親和力（例如呈Fab片段之抗體對 CD79b之親和力）大體上與鼠類抗體（例如呈㈣片段之鼠類 抗體對CD79b之，親和力）或嵌合抗體（例士口呈μ片段之嵌合 抗體對CD79b之親和力）之單價親和力相同，該鼠類抗體或 欲合抗體包含如圖7(SEq ID N〇: 1〇)及圖8ab(seq山 NO:丨4)巾所示之輕鏈及重鏈可變域序列、由該輕鍵及重 鏈可變域序列組成或基本上由該輕鏈及重鏈可變域序列組 成0 在另匕、樣中，本發明提供一種人類化抗_CD79b抗體， 其中《亥抗體對CD79b之單價親和力(例如呈㈣片段之抗體 子 之親和力）比鼠類抗體（例如呈Fab片段之鼠類抗體 對79b之親和力；)或甘欠合抗體（例士口呈㈣片段之嵌合抗體 對CD79b之親和力）之單價鞀 }平價規和力低，例如低至少1、2或3 倍，該鼠類抗體或嵌合抗體包含如圖7(_ ι〇 Ν〇: 1〇)及 圖 8A-B(SEQ ID NO. 14、士 ^ _ • )中所示之輕鏈及重鏈可變域序 列、由該輕鍵及重赫可 ^•域序列組成或基本上由該輕鏈及 重鏈可變域序列組成。 在另-態樣中，本發明提供一種人類化抗·_抗體， 其中該抗體對CD79b之單價親和力(例如呈㈣片段之抗體 對C 79b之親和力）比氣類抗體⑼如呈^片段之鼠類抗體 ^ 之親和力)或嵌合抗體(例如呈Fab片段之嵌合抗體 對C’之親和力）之單價親和力大，例如大至少卜2或3 132799.doc • 130 - 200918089 倍’該鼠類抗體或嵌合抗體包含如圖7(8£(^ ID NO: 10)及 圖8A-B(SEQ ID NO: 14)中所示之輕鏈及重鏈可變域序 列、由該輕鏈及重鏈可變域序列組成或基本上由該輕鏈及 重鏈可變域序列組成。 在一悲樣中，本發明提供一種人類化抗_CD79b抗體，其 中二價形式之該抗體對CD79b之親和力（例如呈IgG片段之 抗體對CD79b之親和力）大體上與二價形式之鼠類抗體（例 如呈igG片段之鼠類抗體aCD79b之親和力）或嵌合抗體（例 如呈IgG片之嵌合抗體對cd79b之親和力）之親和力相 同，該鼠類抗體或嵌合抗體包含如圖7(SEQ ID N〇: 1〇)及 圖8A-B(SEQ ID NO: 14)中所示之輕鏈及重鏈可變域序 列、由該輕鏈及重鏈可變域序列組成或基本上由該輕鏈及 重鏈可變域序列組成。 在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗_CD79b抗體， 其中二價形式之該抗體對CD79b之親和力（例如呈IgG片段 之抗體對CD79b之親和力）比二價形式之鼠類抗體（例如呈 IgG片段之鼠類抗體對CD79b之親和力）或嵌合抗體（例如呈 Fab片段之嵌合抗體對CD79bi親和力）之親和力低，例如 低至少1、2或3倍，該鼠類抗體或嵌合抗體包含如圖7(seq ID NO: 10)及圖8A-B(SEQ ID NO: 14)中所示之輕鏈及重鏈 可變域序列、由該輕鏈及重鏈可變域序列組成或基本上由 該輕鏈及重鏈可變域序列組成。 在另一態樣中’本發明提供一種人類化抗_CD79b抗體， 其中二價形式之該抗體對CD79b之親和力（例如呈Ig(}片段 132799.doc .丨 31 . 200918089 之抗體對CD79b之親和力）比二價形式之鼠類抗體（例如呈 IgG片段之鼠類抗體對CD79b之親和力）或嵌合抗體（例如 Fab片段之嵌合抗體對CD79b之親和力）之親和力大，例如 大至少1、2或3倍，該鼠類抗體或嵌合抗體包含如圖7(SEQ ID NO: 10)及圖8A-B(SEQ ID NO: 14)中所示之輕鏈及重鏈 可變域序列、由該輕鏈及重鏈可變域序列組成或基本上由 該輕鏈及重鏈可變域序列組成。 在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗-CD79b抗體， (其中二價形式之該抗體對CD79b之親和力（例如呈IgG之抗 體對CD79b之親和力）為2.0 nM。在另一態樣中，本發明提 供一種人類化抗-CD79b抗體，其中二價形式之該抗體對 CD79b之親和力（例如呈IgG之抗體對CD79b之親和性）為2.0 nM+/-0.5 〇 在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗-CD79b抗體， 其中二價形式之該抗體對CD79b之親和力（例如呈IgG之抗 體對CD79b之親和力）為1 nM或更好。在另一態樣中，本 I 發明提供一種人類化抗-CD79b抗體，其中二價形式之該抗 體對CD79b之親和力（例如呈IgG之抗體對CD79b之親和力） 為1.5 nM或更好。在另一態樣中，本發明提供一種人類化 抗-CD79b抗體，其中二價形式之該抗體對CD79b之親和力 (例如呈IgG之抗體對CD79b之親和力）為2 nM或更好。在另 一態樣中，本發明提供一種人類化抗-CD79b抗體，其中二 價形式之該抗體對CD79b之親和力（例如呈IgG之抗體對 CD79b之親和力）為2.5 nM或更好。在另一態樣中，本發明 132799.doc -132- 200918089 提供一種人類化抗-CD79b抗體，其中二價形式之該抗體對 CD79b之親和力（例如呈IgG之抗體對CD79b之親和力）為3 nM或更好。在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗-CD79b抗體，其中二價形式之該抗體對CD79b之親和力（例 如呈IgG之抗體對CD79b之親和力）介於1 nM與3 nM之間。 在另一態樣中，本發明提供一種人類化抗-CD79b抗體，其 中二價形式之該抗體對CD79b之親和力（例如呈IgG之抗體 對CD79b之親和力）介於1.5 nM與2.5 nM之間。在另一態樣 ( 中，本發明提供一種人類化抗-CD79b抗體，其中二價形式 之該抗體對CD79b之親和力（例如呈IgG之抗體對CD79b之 親和力）介於1.75 nM與2.25 nM之間。 在一態樣中，鼠類抗體對CD79b之單價親和力大體上與 包含 SEQ ID NO: 10(圖 7)及 SEQ ID NO: 14(圖 8A-B)之可變 域序列之Fab片段的結合親和力相同。在另一態樣中，鼠 類抗體對CD79b之單價親和力大體上與包含由2006年7月 11曰以PTA-7712寄存於ATCC之融合瘤產生之抗體的可變 / 、 域序列之Fab片段或包含來自由2006年7月11日以PTA-7712 寄存於ATCC之融合瘤產生之抗體的可變域之嵌合抗體之 結合親和力相同。 如此項技術中所認可，配位體與其受體之結合親和力可 使用多種檢定中之任一者來測定，且以多種數值來表示。 相應地，在一實施例中，結合親和力係以Kd值表示且反映 固有結合親和力（例如，親和力效應減至最小）。一般且較 佳地，無論在無細胞抑或細胞相關之背景中，結合親和力 132799.doc -133 - 200918089 皆係在活體外量測。如本文中更詳細描述，結合親和力之 倍數差異可以人類化抗體（例如呈Fab形式）之單價結八 力值與參考/對照抗體（例如呈Fab形式）(例如具有供體高變 區序列之鼠類抗體）之單價結合親和力值之比率來量化， 其中該等結合親和力值係於類似檢定條件下測定。因此， 在一實施例中，結合親和力之倍數差異係以呈Fab形式之 人類化抗體與該參考/對照Fab抗體之Kd值之比率來求出。 舉例而言，在一實施例中，若本發明之抗體（A)具有比參 ( 考抗體（M)之親和力”低3倍，，之親和力，則若AiKd值為 3x，則Μ之Kd值將為ix，且八之1^與1<4之1^(1之比率將為 3:1。相反，在一實施例中，若本發明之抗體（c)具有比參 考抗體（R)之親和力"大3倍"之親和力，則若C之Kd值為 lx ’則R之Kd值將為3x，且C之Kd與R之Kd之比率將為 1:3。此項技術中已知之許多檢定中之任一者（包括本文所 述之彼等者）可用於獲得結合親和力量測，包括例如 Biacore、放射免疫檢定（rIA)及elISA。 / I 在一態樣中，提供一種結合CD79b之抗體，其中該抗體 包含： (a)至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自由下 列者組成之群的HVR : ⑴包含序列A1-A16之HVR-L1 ，其中A1-A16為 KSSQSLLDSDGKTYLN(SEQ ID NO: 59)； (ii)包含序列B1-B7之HVR-L2，其中B1-B7為 LVSKLDS(SEQ ID NO: 60)； 132799.doc -134- 200918089 (iii) 包含序列C1-C9之HVR-L3 ，其中C1-C9為 WQGTHFPYT(SEQ ID NO: 61)； (iv) 包含序列D1-D10之HVR-H1，其中D1-D10為 GYTFTSYWMN(SEQ ID NO: 62)； (v) 包含序列E1-E18之HVR-H2，其中E1-E18為 GMIDPSDSETHYNHIFKD(SEQ ID NO: 63)及 (vi) 包含序列F1-F6之HVR-H3 ，其中F1-F6為 ARNLYL(SEQ ID NO: 64)。 在一實施例中，本發明之抗體之HVR-L1包含SEQ ID NO: 59之序列。在一實施例中，本發明之抗體之HVR-L2 包含SEQ ID NO: 60之序列。在一實施例中，本發明之抗 體之HVR-L3包含SEQ ID NO: 61之序列。在一實施例中， 本發明之抗體之HVR-H1包含SEQ ID NO: 62之序列。在一 實施例中，本發明之抗體之HVR-H2包含SEQ ID NO: 63之 序列。在一實施例中，本發明之抗體之HVR-H3包含SEQ ID NO: 64之序列。在一實施例中，包含此等序列（呈如本 文所述之組合形式）之本發明之抗體為人類化或人類抗 體。 在一態樣中，提供一種結合CD79b之抗體，其中該抗體 包含： (a)至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自由下 列者組成之群的HVR : ⑴包含序列A1-A16之HVR-L1 ，其中A1-A16為 KSSQSLLDSDGKTYLN(SEQ ID NO: 59)； 132799.doc -135- 200918089 (ii)包含序列B1-B7之HVR-L2 ，其中B1-B7為 LVSKLDS(SEQ ID NO: 60)； (iii) 包含序列C1-C9之HVR-L3 ，其中C1-C9為 WQGTHFPYT(SEQ ID NO: 61)； (iv) 包含序列D1-D10之HVR-H1，其中D1-D10為 GYTFTSYWMN(SEQ ID NO: 62)； (v) 包含序列E1-E18之HVR-H2，其中E1-E18為 GMIDPSDSETHYNHIFKD(SEQ ID NO: 63)及
(vi)包含序列F1-F6之HVR-H3 ，其中F1-F6為 ARNLYL(SEQ ID NO: 64);及 (b)至少一個變異HVR，其中該變異HVR序列包含對SEQ ID N〇：59、60、61、62、63或64中所示之序列之至少一 個殘基的修飾。在一實施例中，本發明之抗體之HVR-L1 包含SEQ ID NO: 59之序列。在一實施例中，本發明之抗 體之HVR-L2包含SEQ ID NO: 60之序列。在一實施例中， 本發明之抗體之HVR-L3包含SEQ ID NO: 61之序列。在一 實施例中，本發明之抗體之HVR-H1包含SEQ ID NO: 62之 序列。在一實施例中，本發明之抗體之HVR-H2包含SEQ ID NO: 63之序列。在一實施例中，本發明之抗體之HVR-H3包含SEQ ID NO: 64之序列。在一實施例中，包含此等 序列（呈如本文所述之組合形式）之本發明之抗體為人類化 或人類抗體。 在一態樣中，本發明提供一種包含一個、兩個、三個、 四個、五個或六個HVR之抗體，其中HVR各自包含選自由 132799.doc -136- 200918089 SEQ ID NO: 59、60、61、62、63及 64組成之群的序列、 由該序列組成或基本上由該序列組成，且其中SEQ ID NO: 59對應於 HVR-L1，SEQ ID NO: 60對應於 HVR-L2，SEQ ID NO: 61 對應於HVR-L3，SEQ ID NO: 62對應於11¥11-H1，SEQ ID NO: 63 對應於 HVR-H2，且 SEQ ID NO: 64對 應於HVR-H3。在一實施例中，本發明之抗體包含11¥11-Ll、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2 及 HVR-H3， 其中各自依序包含SEQ ID NO: 59、60、61、62、63及 64 ° 本發明之抗體中之變異HVR可具有對HVR内之一或多個 殘基之修飾。在一實施例中，HVR-L3變異體包含以下位 置處之1-2(1或2)個取代：C1(F)及C8(F)。每一位置後之括 號中之字母指示例示性取代（亦即，置換）胺基酸；如將為 熟習此項技術者所明瞭，其他胺基酸在本文所述之情況下 作為取代胺基酸的適合性通常可使用此項技術中已知及/ 或本文所述之技術來評估。在一實施例中，變異HVR-L3 中之C1為F。在一實施例中，變異HVR-L3中之C8為F。在 一實施例中，本發明之抗體包含其中C1為F且C8為F之變 異 HVR-L3。 在一實施例中，本發明之抗體包含其中C1為F之變異 HVR-L3。在一實施例中，本發明之抗體包含其中08為卩之 變異HVR-L3。在一些實施例中，該變異HVR-L3抗體進一 步包含 HVR-L1、HVR-L2、HVR-H1、HVR-H2 及 HVR-H3，其中各自依序包含SEQ ID NO: 59、60、62、63及64 132799.doc -137- 200918089 中所示之序列。在一些實施例中，此等抗體進一步包含人 類亞群III重鏈構架一致序列。在此等抗體之一實施例中， 該構架一致序列包含位置71、73及/或78處之取代。在此 等抗體之一些實施例中，位置71為A，73為丁且/或78為 A。在此等抗體之一實施例中，此等抗體進一步包含人類 κΐ輕鏈構架一致序列。 在態樣中，本發明提供一種包含圖9(SEQ ID NO: 18) 中所示之HVR序列的抗體。
用於宿主個體之治療劑較佳在該個體體内幾乎不引起針 對該藥劑之免疫原性反應。在—實施例中，本發明提供此 類藥劑。舉例而言，在一實施例中，本發明提供一種在宿 主個體體内以與包含SEQ ID N〇: 1〇及14之序列之抗體相 比大體上降低的水平引起及/或預期引起人類抗.小鼠抗體 反應（HAMA)之人類化抗體。在另—實例中，本發明提供 -種能引起且/或預期能_小人類抗_小氣抗體反應 (HAMA)或*弓丨起人類抗_小鼠抗體反應（Μ·)之人類化 抗體。在一實例中，本發明夕^2丨& > + 个赞之抗體引起臨床上可接受之水 平或低於臨床上可接受之水平的抗_小鼠抗體反應。 本發明之人類化抗體可於其重鍵及7或輕鍵可變域中包 含一或多個人類及/或人類—致非高變區（例如構架）序列。 ~ 或多個其他修飾存在於該等人類及/ 或人類-致非高變區序列中。在一實施例+，本發明之抗 體之重鏈可變域包含人類一致構架 為亞群III 一致構架序列。 八 施例中 在實施例中，本發明之抗體包 132799.doc •138· 200918089 含於至少一個胺基酸位置處經修飾之變異亞群m 一致構架 序列。舉例而言，在一實施例中，變異亞群m一致構架序 列可包含位置71、73及/或78之一或多者處之取代。在一 實施例中，該取代為呈任何組合形式之R71A、]^73丁及/或 L78A。 如此項技術中所知，且如下文中更詳細描述，界定抗體 之高變區之胺基酸位置/邊界可視此項技術中已知（如下文 所述）之情況及各種定義而變化。可變域内之一些位置可 (% 視作混雜高變位置，此係因為根據一組標準可認為此等位 置在高變區内，而根據一組不同標準可認為其在高變區 外。此等位置中之一或多者亦可見於延伸高變區中（如下 文進一步定義）。本發明提供包含此等混雜高變位置處之 修飾之抗體。在一實施例中，此等高變位置包括重鏈可變 域中之一或多個位置26-30、33-35B、47-49、57-65、93、 94及101-102。在一實施例中，此等混雜高變位置包括輕 鏈可變域中之位置24-29、3 5-3 6、46-49、56及97中之—出 」 多者。在一實施例中，本發明之抗體包含於一或多個混雜 高變位置處經修飾之人類變異人類亞群一致構架序列。 在一態樣中’本發明之抗體包含含有於位置26_3〇、 35、48-49、58、60-63、93及101中之一或多者處經修錦之 變異人類亞群III 一致構架序列的重鏈可變域。 在一態樣中’本發明之抗體包含含有於位置24、27_ 29、56及97中之一或多者處經修飾之變異人類κ亞群I —致 構架序列的輕鏈可變域。 132799.doc -139· 200918089 在一態樣中，本發明之抗體包含含有於位置26_3〇、33_ 35、48-49、58、60-63、93及 101 中之1、2、3、4、5、6、 7 8 9、10、11、12、13、14、15、16 個或全部位置處 經修飾之變異人類亞群m一致構架序列的重鏈可變域。在 本發明之一些實施例中，本發明之抗體包含於位置71、乃 及/或78處經修飾之變異亞群ΙΠ重鏈構架一致序列。在— 實施例中’該取代為R71A、Ν73Τ及/或L78A。 在一態樣中，本發明之抗體包含含有於位置24、U (29、56及97中之1、2、3、4、5個或全部位置處經修飾之 變異人類κ亞群I 一致構架序列的輕鏈可變域。 本發明之抗體可包含任何合適之人類或人類一致輕鏈構 架序列，其限制條件為抗體展現所需生物學特性（例如所 需結合親和力）。在一實施例中，本發明之抗體包含人類κ 輕鏈之構架序列之至少一部分（或全部）。在一實施例中， 本發明之抗體包含人類κ亞群；[構架一致序列之至少—部八 (或全部）。 (... 在一態樣中，本發明之抗體包含含有SEQ IDN〇: %圖乃 及/或13(圖8A-B)中所示之構架序列之重鏈及/或輕鏈可變 域。 在一態樣中，本發明之抗體為與細胞毒性劑結合之人類 化抗-CD79b抗體。在一態樣中，該與細胞毒性劑結合之人 類化抗-CD79b抗體抑制異種移植物中之腫瘤進展。 在一態樣中，人類化抗體與嵌合抗體皆為單價抗體。在 一實施例中，人類化與嵌合抗體皆包含連接於以區之單一 132799.doc •140· 200918089
Fab區。在一實施例中，參考嵌合抗體包含連接於人類Fc 區之圖 7(SEQ ID NO: 10)及圖 8A-B(SEQ ID NO: 14)中所示 之可變域序列。在一實施例中，該人類Fc區為IgG(例如 IgGl、2、3 或 4)之 Fc區。 在一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含含有圖13中 所示之 HVR1-HC、HVR2-HC 及 / 或 HVR3-HC 序列（SEQ ID NO: 31-33)之重鏈可變域。在一實施例中，該可變域包含 圖 13 中所示之FRJ-HC、FR2-HC、FR3-HC及/或 FR4-HC序 ( 列（SEQ ID NO: 27-30)。在一實施例中，該抗體包含圖13 中所示之CH1及/或Fc序列（SEQ ID NO: 34-35)。在一實施 例中，本發明之抗體包含含有HVR1-HC、HVR2-HC及/或 HVR3-HC序列（圖 13，SEQ ID NO: 3 1-33)及 FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC及 /或 FR4-HC序列（圖 13，SEQ ID NO: 27-30) 之重鏈可變域。在一實施例中，本發明之抗體包含含有 HVR1-HC、HVR2-HC及 / 或 HVR3-HC序列（圖 13 ’ SEQ ID NO: 31-33)及圖13中所示之CH1及/或Fc序列（SEQ ID NO: 34-35)之重鏈可變域。在一實施例中，本發明之抗體包含 含有 HVR1-HC、HVR2-HC及 /或 HVR3-HC序列（圖 13，SEQ ID NO: 31-33)及 FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC及 /或 FR4-HC 序列（圖 13，SEQ ID NO: 27-3 0)及 CH1 及/或 Fc(圖 13，SEQ ID NO: 34-35)之重鏈可變域。 在一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含含有圖1 3中 所示之 HVR1-LC、HVR2-LC 及 / 或 HVR3-LC 序列（SEQ ID NO: 23-25)之輕鏈可變域。在一實施例中，該可變域包含 132799.doc -141 - 200918089 圖 13 中所示之 FRl-LC、FR2-LC、FR3-LC及 / 或 FR4-LC序 列（SEQ ID NO: 19-22)。在一實施例中，該抗體包含圖13 中所示之CL1序列（SEQ ID NO: 26)。在一實施例中，本發 明之抗體包含含有圖13中所示之HVR1-LC、HVR2-LC及/ 或 HVR3-LC序列（SEQ ID NO: 23-25)及 FRl-LC、FR2-LC、 FR3-LC及 / 或 FR4-LC 序列（SEQ ID NO: 19-22)之輕鏈可變 域。在一實施例中，本發明之抗體包含含有圖13中所示之 HVR1-LC、HVR2-LC及/或 HVR3-LC序列（SEQ ID NO:23-f 25)及CL1序列（SEQ ID NO: 26)之輕鏈可變域。在一實施 例中，本發明之抗體包含含有圖13中所示之HVR1-LC、 HVR2-LC及 / 或 HVR3-LC序列（SEQ ID NO: 23-26)&FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC及 /或 FR4-LC(SEQ ID NO: 19-22)及 圖13中所示之CL1序列（SEQ ID NO: 26)之輕鏈可變域。 在一態樣中，本發明之抗體包括半胱胺酸工程化抗體， 其中親本抗體之一或多個胺基酸如W02006/034488、US 2007/0092940(以全文引用的方式併入本文中）中所揭示經 ί 游離半胱胺酸胺基酸置換。任何形式之抗-CD79b抗體可如 此經工程化，亦即突變。舉例而言，親本Fab抗體片段可 經工程化以形成半胱胺酸工程化Fab，本文中稱為 "ThioFab"。類似地，親本單株抗體可經工程化以形成 "ThioMab”。應注意，單一位點突變在ThioFab中產生單一 工程化半胱胺酸殘基，而由於IgG抗體之二聚性質，單一 位點突變在ThioMab中產生兩個工程化半胱胺酸殘基。本 發明之半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體包括單株抗體、人類 132799.doc •142- 200918089 化或嵌合單株抗體及抗體之抗原結合片段、融合多肽及優 先結合細胞相關CD79b多肽之類似物。或者，半胱胺酸工 紅化抗體可包含於抗體或Fab中之本文所揭示之位置處包 含半胱胺酸的抗體，此由抗體之序列設計及/或選擇產 生但不—定改變親本抗體，諸如藉由噬菌體呈現抗體設 计及選擇或經由輕鏈及/或重鏈構架序列及恆定區之重新 設計來達成。半胱胺酸工程化抗體包含一或多個具有在 0.6至1.0、〇.7至1〇或〇8至1〇之範圍内之硫醇反應性值的 游離半脱胺酸胺基酸。游離半胱胺酸胺基酸為已工程化至 親本抗體中且不為二硫橋之部分的半胱胺酸殘基。半胱胺 酸工程化抗體適用於經由例如順丁烯二醯亞胺或_乙醯基 使細胞毒性及/或成像化合物連接於工程化半胱胺酸之位 點處。Cys殘基之硫醇官能基對順丁烯二醯亞胺基團之親 核反應性與蛋白質中之任何其他胺基酸官能基（諸如離胺 酸殘基之胺基或N末端胺基）相比高約1〇〇〇倍。碘乙醯基及 順丁稀二酿亞胺試劑中之硫醇特異性官能基可與胺基反 應’但需要較高pH值（>9.〇)及較長反應時間（Garman，1997,
Non-Radioactive Labelling： A Practical Approach, Academic Press, London) ° 在一態樣中’本發明之半胱胺酸工程化抗_CD79b抗體包 含於下列位置之任一者處之工程化半脱胺酸，其中輕鏈中 之位置係根據Kabat等人來編號（參見Kabat等人（1991) Sequences of Proteins of Immun〇i〇gical interest，第 5版
Public Health Service, National Institutes of Health, 132799.doc -143- 200918089
Bethesda，MD)且重鏈（包括Fc區）中之位置係根據EU編號來 編號（參見Kabat等人（1991)，見上），其中圖17A及18A中藉 由加下劃線描繪之輕鏈恆定區開始於位置1 〇9(Kabat編號） 且圖1 7B及1 8B中藉由加下劃線描繪之重鏈恆定區開始於 位置118(EU編號）。該位置亦可以其在圖17-18中所示之全 長輕鏈或重鏈之胺基酸的依序編號中之位置來提及。根據 本發明之一實施例，抗-CD79b抗體包含於LC-V205C處之 工程化半胱胺酸（在圖1 8A中，Kabat編號：Val 205 ;依序 ( 編號2 10，於彼位置處工程化為Cys)。在圖18A中，輕鏈中 之工程化半胱胺酸係以粗體、雙下劃線文字顯示《根據一 實施例，抗-CD79b抗體包含於HC-A118C處之工程化半胱 胺酸（在圖17B中，EU編號：Ala 118 ; Kabat編號114 ;依 序編號11 8，於彼位置處工程化為Cys)。在圖1 7B中，重鏈 中之工程化半胱胺酸係以粗體、雙下劃線文字顯示。根據 一實施例，抗-CD79b抗體包含於Fc-S400C處之工程化半胱 胺酸（在圖17-18B中，EU編號：Ser 400 ; Kabat編號396 ; I 依序編號400，於彼位置處工程化為Cys)。在其他實施例 中，重鏈（包括Fc區）之工程化半胱胺酸位於下列位置之任 一者處（根據Kabat編號，括號中為EU編號）：5、23、84、 112、114(EU編號為 118)、116(EU編號為 120)、278(EU編 號為282)、371(EU編號為375)或396(EU編號為400)。因 此，本發明之親本人類化抗-CD79b抗體之此等位置處的胺 基酸之變化為：V5C、A23C、A84C、S112C、A114C(EU 編號為 A118C)、T116C(EU編號為 T120C)、V278C(EU 編號 132799.doc -144- 200918089 為 V282C)、S371C(EU編號為 S375C)或 S396C(EU編號為 S400C)。因此，本發明之親本嵌合抗-CD79b抗體之此 等位置處的胺基酸之變化為：Q5C、K23C、S84C、 S112C、A114C(EU 編號為 A118C)、T116C(EU 編號為 T120C)、V278C(EU編號為 V282C)、S371C(EU編號為 S3 75C)或S3 96C(EU編號為S400C)。在其他實施例中， 輕鏈之工程化半胱胺酸位於下列位置之任一者處（根據 Kabat編號）：15、110、114、121、127、168、205。 因此，本發明之親本人類化抗-CD79b抗體之此等位置 處的胺基酸之變化為：V15C、V110C、S114C、 S121C、S127C、S168C或V205C。因此，本發明之親本 嵌合抗-CD79b抗體之此等位置處的胺基酸之變化為： I15C、V110C、S114C、S121C、S127C、S168C 或 V205C 。 在一態樣中，本發明包括一種包含一或多個游離半胱胺 酸胺基酸之半胱胺酸工程化抗_CD79b抗體，其中該半胱胺 酸工程化抗-CD79b抗體結合於CD79b多肽且係藉由包含由 半胱胺酸置換親本抗-CD79b抗體之一或多個胺基酸殘基之 方法來製備’其中該親本抗體包含至少一個選自下列者之 HVR序列： Ο)包含序列A1-A16之HVR-L1 ，其中A1-A16為 KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO: 59)； (b)包含序列 B1-B7 之 HVR-L2，其中 B1-B7 為 LVSKLDS (SEQ ID NO： 60)； 132799.doc -145- 200918089
(C)包含序列 C1-C9之 HVR-L3，其中C1-C9 為 WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 61)或 FQGTHFPFT (SEQ ID NO: 79); (d) 包含序列D1-D10之HVR-H1 ，其中D1-D10為 GYTFTSYWMN (SEQ ID NO: 62)； (e) 包含序列E1-E18之HVR-H2 ，其中EhE18為 GMIDPSDSETHYNHIFKD (SEQ ID NO: 63);及
(f) 包含序列 F1-F6 之 HVR-H3，其中 F1-F6 為 ARNLYL (SEQ ID NO: 64)。 在某一態樣中，本發明係關於一種半胱胺酸工程化抗· CD79b抗體，其包含與具有如本文所揭示之全長胺基酸序 列之半胱胺酸工程化抗體或缺乏如本文所揭示之信號肽之 半胱胺酸工程化抗體胺基酸序列具有至少約80%胺基酸序 列一致性或者至少約81%、82%、83%、84%、85°/〇 ' 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性的 胺基酸序列。 在又一態樣中，本發明係關於一種經分離之半胱胺酸工 程化抗-CD79b抗體，其包含由與編碼下列各者之DNA分子 之補體雜交的核苷酸序列編碼之胺基酸序列：（a)具有如本 文所揭示之全長胺基酸序列之半胱胺酸工程化抗體；（b)缺 乏如本文所揭示之信號肽之半胱胺酸工程化抗體胺基酸序 列；（c)具有或無如本文所揭示之信號肽的跨膜半胱胺酸工 程化抗體蛋白質之胞外域；（d)由本文所揭示之核酸序列之 任一者編碼的胺基酸序列；或Ο)如本文所揭示之全長半胱 132799.doc -146· 200918089 胺酸工程化抗體胺基酸序列之任何其他經具體定義的片 段。 在一特定態樣中，本發明提供一種無N末端信號序列及/ 或無起始曱硫胺酸且由可編碼如所描述之此類胺基酸序列 之核苷酸序列編碼的經分離之半胱胺酸工程化抗_CD79b抗 體。本文中亦描述製造該抗體之方法，其中彼等方法包含 在適合於表現半胱胺酸工程化抗體之條件下培養包含含有 適當編碼核酸分子之載體之宿主細胞及自細胞培養物回收 半胱胺酸工程化抗體。 本發明之另一態樣提供一種經分離之半胱胺酸工程化 抗-CD79b抗體’其缺失跨膜域或跨膜域失活。本文中亦描 述製造該抗體之方法’其中彼等方法包含在適合於表現半 胱胺酸工程化抗體之條件下培養包含含有適當編碼核酸分 子之載體之宿主細胞及自細胞培養物回收半胱胺酸工程化 抗體。 在其他態樣中，本發明提供經分離之抗_CD79b嵌合半胱 胺酸工程化抗體，其包含與異源（非CD79b)多肽融合之本 文中所述之半胱胺酸工程化抗體的任—者。該等嵌合分子 之實例包含與異源多肽（諸如免疫球蛋白之抗原決定基標 記序列或Fc區）融合的本文中所述之半胱胺酸工程化抗體 的任一者。 半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體可為單株抗體、抗體片 段、嵌合抗體、人類化抗體、單鏈抗體或競爭性抑制抗_ CD79b多肽抗體與其各另抗原性抗原決定基之結合之抗 132799.doc -147- 200918089 體。本發明之抗體可視情況與生長抑制劑或細胞毒性劑結 合，該生長抑制劑或細胞毒性劑諸如毒素，包括（例如）奥 瑞他汀、美登素類、海兔毒素衍生物或卡奇黴素、抗生 素、放射性同位素、溶核酶或其類似物。本發明之抗體可 視情況於CHO細胞或細菌細胞中產生且較佳抑制其所結合 之細胞之生長或增生或引起其所結合之細胞死亡。出於診 斷目的’本發明之抗體可以可偵測方式標記、連接於固體 支撐物或其類似情況。 在本發明之其他態樣中，本發明提供包含編碼本文中所 述之抗-CD79b抗體及抗-CD79b半胱胺酸工程化抗體中之 任一者的DNA之載體。亦提供包含任何此類載體之宿主細 胞。舉例而言，宿主細胞可為Ch〇細胞、大腸桿菌（E. coli)細胞或酵母細胞。進一步提供一種製造本文中所述之 多肽中之任一者的方法且該方法包含在適合於表現所需多 肽之條件下培養宿主細胞及自細胞培養物回收所需多肽。 半胱胺酸工程化抗體可適用於治療癌症且包括對細胞表 面及跨膜受體及腫瘤相關抗原（TAA)具特異性之抗體。該 等抗體可以裸抗體（未與藥物或標記部分結合）或以抗體-藥 物結合物（ADC)形式使用。本發明之半胱胺酸工程化抗體 可位點特異性地及有效地與硫醇反應性試劑偶合。該硫醇 反應性試劑可為多官能連接子試劑、捕捉標記試劑、勞光 團試劑或藥物-連接子中間物。半胱胺酸工程化抗體可用 可偵測標記來標記’固定於固相支撐物上及/或與藥物部 71 ' ° &石;|1·醇反應性可經推廣適用於任何抗體，其中由反 132799.doc -148- 200918089 應性半胱胺酸胺基酸取代胺基酸可在輕鏈中於選自下列胺 基酸範圍之範圍内產生：1^10丄20、1^105丄115、1^109-L119 、 L116-L126 、 L122-L132 、 L163-L173 、 L200-L210 ; 及在重鏈中於選自下列胺基酸範圍之範圍内產生：^-H10、H18-H28、H79-H89、H107-H117、H109-H119、 H111-H121 ;及在 Fc 區中於選自 H270-H280、H3 66-H376、 H3 91-401之範圍内產生，其中胺基酸位置之編號開始於 Kabat 編號糸統之位置 l(Kabat 等人（1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD)且之 後如W02006034488 ; US 2007/0092940中所揭示依序繼 續。硫醇反應性亦可經推廣適用於抗體之某些域，諸如輕 鏈恆定域（CL)及重鏈恆定域CHI、CH2及CH3。導致0.6及 更高之硫醇反應性值之半胱胺酸置換可分別在下列完整抗 體之重鏈恆定域α、δ、ε、γ及μ中產生：IgA、IgD、igE、 IgG及 IgM，包括 IgG亞類：igGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgA及IgA2。該等抗體及其用途係於w〇2〇〇6/〇34488、US 2007/0092940 中揭示。 本發明之半胱胺酸工程化抗體較佳保留其野生型親本抗 體對應物之抗原結合能力。因此，半胱胺酸工程化抗體能 夠（較佳特異性地）結合於抗原。該等抗原包括（例如）腫瘤 相關抗原（TAA)、乡田胞表面受㈣白及其他細胞表面分 子、跨膜蛋白、信號轉導蛋白、細胞存活調節因子、細胞 增生調節因子、與組織發育或分化相關（例如，已知或懷 132799.doc •149· 200918089 疑功能上有促進作用）之分子、淋巴因子、細胞因子、涉 及細胞週期調節之分子、涉及血管發生之分子及與血管生 成相關（例如，已知或懷疑功能上有促進作用）之分子。腫 瘤相關抗原可為鎮群分化因子（亦即⑶蛋白包括（但不限 於）CD79b)。本發明之半胱胺酸工程化抗-⑶携抗體保留 其親本抗-CD79b抗體對應物之抗原結合能力。因此，本發 明之半胱胺酸工程化抗_CD79b抗體能夠（較佳特異性地）結 合至包括人類抗_CD79b同功異型物β及/或α之cD79b抗 原，包括當該等抗原表現於包括（但不限於）B細胞之細胞 表面上時。 在一態樣中’本發明之抗體可與任何標記部分結合，該 標圮部分可經由反應性部分、活化部分或反應性半胱胺酸 硫醇基共價連接於抗體（Singh等人（2002)Anal. Biochem. 304:147-15 ; Harlow E.及 Lane, D. (1999) Using
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ； Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification，第 2版 CRC Press，Boca Raton, FL)。所連接之標記可用於：（i)提 供可偵測信號；（ii)與第二標記相互作用以改良由第一或 第二標記提供之可檢測信號，例如產生FRET(螢光共振能 量轉移）；（iii)使與抗原或配位體之相互作用穩定或增加與 抗原或配位體之結合親和力；（iv)藉由電荷、疏水性、形 狀或其他物理參數影響遷移率，例如電泳遷移率或細胞滲 透率；或（v)提供捕捉部分，以調節配位體親和力、抗體/ 132799.doc -150- 200918089 抗原結合或離子錯合。 經標記之半胱胺酸工程化抗體可適用於診斷檢定，例如 偵測所關注抗原於特定細胞、組織或血清中之表現。對於 診斷應用而言，該抗體通常將用可偵測部分標記。可利用 眾多標記，其一般可分為下列類別： 放射性同位素（放射性核種），諸如有3H、"C、14C、 18F、32P、35s、64Cu、68Ga、86γ、99Tc、nlIn、123I、 124I、125I、、i33Xe、177Lu、2"心或 213Bi。放射性同位 素標記之抗體適用於受體靶向成像實驗。抗體可使用 Current Protocols in Immunology，第 1及 2卷，Coligen等人 編 ’ Wiley-Interscience，New York, NY，Pubs.(1991)中所述 之技術用可結合、螯合或者錯合放射性同位素金屬之配位 體試劑標記，其中該試劑可與抗體之工程化半胱胺酸硫醇 反應。可錯合金屬離子之螯合配位體包括DOTA、DOTP、 D0TMA、DTPA及 TETA(Macrocyclics，Dallas, TX)。放身子 性核種可經由與本發明之抗體-藥物結合物錯合來靶向（Wu 等人（2005)Nature Biotechnology 23(9):1137-1146) 0 諸如DOTA-順丁烯二醯亞胺（4-順丁烯二醯亞胺基丁醯胺 基节基-DOTA)之連接子試劑可按照Axworthy等人 (2000)Proc. Natl· Acad. Sci. USA 97(4):1802-1807之程序藉 由胺基苄基-DOTA與經氣甲酸異丙酯（Aldrich)活化之4_順 丁烯二醯亞胺基丁酸（Fluka)反應來製備=DOTA-順丁烯二 醯亞胺試劑與半胱胺酸工程化抗體之游離半胱胺酸胺基酸 反應且於抗體上提供金屬錯合配位體（Lewis等人 132799.doc -151 - 200918089 (998)Bi〇c〇nj. Chem. 9:72-86)= ^ DOTA-NHS( 1,4,7,1 〇- 四乳雜環十u，4,7，10_四乙酸單⑽經基丁二酿亞胺 酯))之螯合連接子標記試劑為市售的(Macrocyclics，Dallas， TX) H生核種標記抗冑進行受體輕向成像可藉由债 测及量化腫瘤組織中抗體之進行性積累*提供路徑活化之 標諸（Albert 等人（1998)Bi〇〇rg.㈣以⑽ Leu 8:12〇7_ 1210)。結合之放射金屬可在溶酶體降解後保留在細胞 内。 ( 適用作成像實驗之抗體標記之金屬-螯合物錯合物揭示 於以下專利文獻中：US 5342606 ; US 5428155 ; US 5316757 ； US 5480990 ； US 5462725 ； US 5428139 ； US 5385893 ； US 5739294 ； US 5750660 ； US 5834456 ；
Hnatowieh 等人（1983)J. Immunol. Methods 65:147-157 ; Meares 等人（1984) Anal. Biochem. 142:68-78; Mirzadeh 等 人（1990)Bioconjugate Chem. 1:59-65 ; Meares 等人（1990) J. Cancerl990, Suppl. 10:21-26 ； Izard 等人（1992) (
Bioconjugate Chem. 3:346-350 ; Nikula 等人（1995)>^(；1· Med. Biol· 22:387-90 ; Camera等人（1993) Nucl. Med. Biol. 20:955-62 ； Kukisf A(1998) J. Nucl. Med. 39:2105-2110 ； Verel 等人（2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670 ; Camera等人 (1994) J. Nucl. Med. 21:640-646 ; Ruegg等人（1990) Cancer Res. 50:4221-4226 ; Verel 等人（2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670 ; Lee 等人（2001) Cancer Res. 61:4474-4482 ; Mitchell 等人（2003) J. Nucl. Med. 44:1105-1112 ; 132799.doc -152- 200918089
Kobayashi 等人（1999) Bioconjugate Chem. 10:103-111 ; Miederer等人（2004) J. Nucl. Med. 45:129-137 ; DeNardo等 人（1998) Clinical Cancer Research 4:2483-90 ; Blend等人 (2003) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 1 8:355-363 ; Nikula 等人（1999) J. Nucl, Med. 40:166-76 ; Kobayashi 等人（1998) J· Nucl. Med. 39:829-36 ； Mardirossian等人（1993) Nucl. Med. Biol. 20:65-74 ; Roselli 等人（1999) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14:209-20 ° 螢光標記，諸如有稀土螯合物（銪螯合物）；螢光素類 型’包括FITC、5-羧基螢光素、6-羧基螢光素；若丹明 (rhodamine)類型，包括TAMRA ; 丹醯；麗絲胺 (Lissamine);花青；藻紅蛋白；得克薩斯紅（Texas Red); 及其類似物。該等螢光標記可使用例如Current Protocols in Immunology(見上文）中所揭示之技術與抗體結合。螢光 染料及螢光標記試劑包括可賭自Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR)及 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford，IL)之彼等者。 各種酶-受質標記係可利用的或已有揭示（US 4275149)。 酶一般催化產色受質之化學變化，此可使用各種技術量 測。舉例而言，酶可催化受質之變色，此可用分光光度計 量測。或者，酶可改變受質之螢光或化學發光。量化螢光 變化之技術已在上文描述《化學發光受質藉由化學反應而 變成電子激發態且因而能發射可被量測到（例如使用化學 132799.doc -153- 200918089 光度计）或向螢光欠體提供能量之光。酶促標記之實例包 括螢光素酶(例如’螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶；us 4737456)、螢光素、2,3_二氫酞嗪二酮、蘋果酸脫氫酶、 尿素酶、過氧化酶（諸如辣根過氧化酶（HRp))、鹼性磷酸 酶（AP)、β-半孔糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、醣氧化酶 (例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖_6_磷酸脫 氫酶）、雜環氧化酶（諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶）、乳過氧 化物酶、微過氧化物酶及其類似酶。使酶與抗體結合之技 術係描述於〇’SulHvan等人（1981) "Meth〇ds f的心
Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", in Methods in Enzym. (J. Langone 及 H. Van Vunakis編），Academic Press, New York，73:147· 166 中。 酶-受質組合之實例包括（例如）： ⑴辣根過氧化酶（HRP)與作為受質之過氧化氫酶，其中 該過氧化氫酶氧化染料前驅體（例如，鄰苯二胺（〇pD)或 ^。'^。’-四曱基聯苯胺鹽酸鹽^^^)); (⑴鹼性磷酸酶（AP)與作為產色受質之對硝基苯基磷酸 鹽；及 (m)p-D-半乳糖苷酶（p_D_Gal)與產色受質（例如，對硝基 本基-β-D-半乳糖苷酶）或螢光受質心甲基傘形半乳 糖苷酶。 許多其他酶-受質組合可為熟習此項技術者所利用。關 於綜合評述，參見US 4275149及US 43 18980。 132799.doc •154- 200918089 標S己可間接與胺基酸側鍵、活化胺基酸側鏈、半胱胺酸 工程化抗體及其類似物結合。舉例而言，抗體可與生物素 結合且上文所提及之三大類標記中之任一者可與抗生物素 蛋白或抗生蛋白鏈菌素結合，或反之亦然。生物素選擇性 地結合於抗生蛋白鏈菌素且因此標記可以此間接方式與抗 體結合。或者’為達成標記與多肽變異體之間接結合，使 多肽變異體與小半抗原（例如地高辛（digoxin))結合且使上 文所提及之不同類標記中之一者與抗-半抗原多肽變異體 (例如抗-地尚辛抗體）結合。因此，可達成標記與多肽變異 體之間接結合（Hermanson，G. (1996) in Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego) ° 本發明之抗體可用於任何已知檢定方法，諸如ELISA、 競爭性結合檢定、直接及間接夾層檢定及免疫沈澱檢定 (Zola， (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of
Techniques ’ 第 147-158 頁，CRC Press, Inc.)。 偵測標記可適用於定位、觀察及定量結合或識別事件。 本發明之經標記之抗體可偵測細胞表面受體。可偵測標記 之抗體之另一用途為基於珠粒之免疫捕捉之方法，其包含 使珠粒與螢光標記之抗體結合且在結合配位體後偵測螢光 信號。類似結合偵測方法利用表面電漿共振（SPR)效應來 量測及偵測抗體-抗原相互作用。 諸如螢光染料及化學發光染料之偵測標記（Briggs等人 (1997) "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., 132799.doc -155- 200918089
Perkin-Trans. 1:1051_1058)提供可悄測信號且一般適用於 標記抗體，其較佳具有以下特性：⑴經標記之抗體應在低 本底情況下產生極尚信號以便可在無細胞及基於細胞之檢 疋中靈敏地偵測到少量抗體；及（丨丨）經標記之抗體應為不 感光的以便可觀察、監測及記錄螢光信號但無顯著光致漂 白。對於涉及經標記之抗體與膜或細胞表面（尤其活細胞） 之細胞表面結合的應用而言，標記較佳（iH)具有良好水溶 性以達成有效結合濃度及偵測敏感性且〇ν)對活細胞無毒 以免破壞細胞之正常代謝過程或引起早熟細胞死亡。 細胞螢光強度之直接量化及螢光標記事件（例如肽-染料 結合物之細胞表面結合）之列舉可用使使用活細胞或珠粒 之k合及δ買取、非放射性檢定（Miraglia，"Homogeneous cell- and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) J· of Biomolecular Screening 4:193-204)自動化之系統 (FMAT® 8100 HTS System，Applied Biosystems，Foster City, Calif.)進行。經標記之抗體之用途亦包括細胞表面受 體結合檢定、免疫捕捉檢定、螢光連接免疫吸附檢定 (FLISA)、卡斯蛋白酶（caspase)裂解（Zheng，”Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:618-23; US 6372907)、細胞凋亡 (Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early 132799.doc -156- 200918089 apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V" (1995) J. Immunol. Methods 184:39-51)及細胞毒性檢定。 螢光微量檢定技術可用於藉由靶向細胞表面之分子來鑑別 上調或下調（Swartzman，"A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) Anal. Biochem. 271:143-51)。 本發明之經標記之抗體適用作諸如以下之各種生
及刀子成像方法及技術的成像生物標記及探針：⑴ MRI(磁共振成像）；（ii) Micr〇CT(電腦斷層攝影術”（山） SPECT(單光子放射電腦斷層攝影術）；（iy) ρΕτ(正電子放 射斷層攝影術）（Chen等人’（2〇〇4)則〇__咖 1⑽-49);(v)生物發光；㈤m(vii)超音波。免疫 閃爍攝影術係-種成像程序’其中向動物或人類患者投斑 用放射性物質標記之抗體且對㈣内抗體^位之部位拍照 。24) &像生物標記可客觀地加以量測且作為正 :物I過程、觸㈣㈣對治療介人之藥料反應之指 ==與生物?記可具有若干類型型為疾病之 節炎之讲膜"已知^床指標縱向㈣，例如類風濕性關 入之效ΓΓ 評估；1型標記根據作錢制捕捉介 纪起替代/使該機制可能與臨床結果無關亦然；型俨 二：代性終點之作用，其中生物標記之變 :：
號預示使•向反應生效之臨床益處，_二 里測之類風濕性關節 &為如藉由CT 月钕蝕。因此，成像生物標記可 132799.doc -157. 200918089 提供關於以下内容之藥效學（PD)治療資訊：（i)乾蛋白質之 表現；（ii)治療劑與靶蛋白質之結合，亦即選擇性；及（Hi) 清除率及半衰期藥物動力學資料。活體内成像生物標記相 對於基於實驗室之生物標記之優點包括：非侵入性治療、 可疋置之全身評估、反覆給藥及評估（亦即多時間點）及自 臨床前（小動物）至臨床（人類）結果之潛在可轉移之效應。 對於一些應用而言’生物成像替代或減少臨床前研究中動 物實驗之數目。 肽標記方法係眾所周知的。參見Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc. ； Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2 ； Garman, (1997) Non-
Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2 ； Glazer 等人（1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co·，New York ; Lundblad, R. L.及 Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification，第 I及 II 卷，CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in
Protein Chemistry，H. Tschesche 編，Walter DeGryter， Berlin 及 New York;及 Wong (1991) Chemistry of Protein
Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, 132799.doc -158- 200918089
Fla. ; De Le〇n-R〇drigUez 等人（2〇〇4) Chem Eur 厂 10:1149-1155 ; Lewis 等人（2001) Bi_jugate a· 12:320-324； Li # Λ (2002) Bioconjugate Chem. 13:110- 115，Mier 等人（2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237。 用足夠接近之兩個部分（亦即螢光報導體及抑止劑）標記 之肽及蛋白質經歷螢光共振能量轉移（FRET)。報導體基團 通常為可由某一波長之光激發且以適於以最大亮度發射之 斯托克斯位移（Stokes shift)將能量轉移至受體或抑止劑、 f 基團之螢光染料。螢光染料包括具有擴大之芳香性之分 子，諸如螢光素及若丹明，及其衍生物。螢光報導體可由 完整肽中之抑止劑部分部分或顯著抑止。由肽酶或蛋白酶 裂解肽後，可量測螢光之可偵測增加（Knight，c (1995) "Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes", Methods in
Enzymology，Academic Press, 248:18-34)。 本發明之經標記之抗體亦可用作親和力純化藥劑。在此 方法中，使用此項技術中熟知之方法將經標記之抗體固定 " 於諸如葡聚糖凝膠樹脂或遽紙之固相上。使經固定之抗體 與含有待純化之抗原之樣品接觸，且之後用合適之溶劑洗 務支撑物，此將移除樣品中除待純化之抗原外的大體上所 有物質，該抗原結合於經固定之多肽變異體。最後，用諸 如甘胺酸緩衝劑（pH 5.0)之另一合適溶劑洗滌支撐物，此 將自多肽變異體釋放抗原。 標記試劑通常帶有反應性官能基，其可⑴直接與半胱胺 酸工程化抗體之半胱胺酸硫醇反應以形成經標記之抗體； 132799.doc -159· 200918089 (Π)與連接子試劑反應以形成連接子-標記中間物；或（iii) 與連接子抗體反應以形成經標記之抗體。標記試劑之反應 性官能基包括：順丁烯二醯亞胺、齒乙醯基、碘乙醯胺丁 二醯亞胺基酯（例如NHS、N-羥基丁二醯亞胺）、異硫氰酸 S旨、續醯氣、2,6-二氯三嗪基、五氟苯基酯及亞磷醯胺， 不過亦可使用其他官能基。 例示性反應性官能基為可偵測標記（例如生物素或螢光 染料）之羧基取代基之>}_羥基丁二醯亞胺基酯（NHS)。標記 之NHS酯可預先形成，加以分離，純化及/或表徵，或其可 原位形成且與抗體之親核基團反應。通常，標記之羧基形 式係藉由與碳化二亞胺試劑（例如二環己基碳化二亞胺、 二異丙基幾化二亞胺）或脲鑌試劑（TSTU(四氟硼酸〇_(Ν_τ 二酿亞胺基）-Ν，Ν，Ν'，Ν'-四曱基錁）、HBTU(六氟磷酸Ο-苯 并二嗤-1-基）-N，N，N’，N，-四甲基錁）或HATU(六氟磷酸0-(7-氮雜苯并三唑-1_基）_N，N，N，，N，_四曱基錁））、活化劑（諸如 1-經基苯并三嗤（110出））及N_羥基丁二醯亞胺之一些組合 反應以產生標記之NHS酯來活化。在一些情況下，標記及 抗體可藉由以單步驟原位活化標記及與抗體反應以形成標 δ己-抗體結合物而偶合。其他活化劑及偶合劑包括τβτυ(六 苯并三唑-1-基）-1，1，3,3-四甲基錁）、TFFH(2-氟-六氟磷酸N，N，，N，，，N’，，-四甲基錁）、PyB0P(六氟磷酸苯 并一唑基-氧基-參-吡咯啶基-鱗）、EEDQ(2-乙氧基-1-乙 氧&基-1,2-二氯-喹啉）、Dcc(二環己基碳化二亞胺）、 DIPCDI( 一異丙基羰化二亞胺）、MSNT(l-(均三甲苯-2-磺 132799.doc 200918089 醯基）_3_硝基，2,4_三。坐）及芳基續醢基齒化物⑼如三 異丙基苯績醯氣）。 本發明之白蛋白結合肽_Fab化合物： 在一態樣中，本發明之抗體與白蛋白結合蛋白融合。血 漿-蛋白質結合可為改善短命分子之藥物動力學特性之有 效方式。白蛋白為企漿中最豐富之蛋白質。血清白蛋白結 合肽（ABP)可改變融合之活性域蛋白質之藥效學性質，^ 括改變組織吸收、滲透及擴散。此等藥效學參數可藉由特 定選擇適當企清白蛋白結合肽序列來調節（M 20040001827)。一系列白蛋白結合肽係藉由噬菌體呈現篩 選來鑑別（Dennis 等人（2002) ”Aibumin Binding As a
General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins” J Biol Chem· 277:35〇35_35〇43 ; w〇 〇i/45746)。 本發明之化合物包括由以下文獻教示之abp序列：⑴
Dennis 等人（2002) J Biol Chem· 277:35035-35043 之表 III 及 IV，第 35038 頁；（ii) US 20040001827 之[0076] SEQ ID NOS: 9-22 ;及（出）W0 01/45746之第1213頁，所有該等 文獻均以引用的方式併入本文中。白蛋白結合（ABp)_Fab 係藉由以1:1化學計量比（1 ABP/1 Fab)使白蛋白結合肽與 Fab重鏈之C末端融合來工程化。已顯示在兔子及小鼠中此 等ABP-Fab與白蛋白之締合使抗體半衰期增加超過乃倍。 因此’上述反應性Cys殘基可引入此等ABp_Fab中且用於 與細胞毒性藥物位點特異性結合，接著進行活體内動物研 究。 132799.doc -161 - 200918089 例示性白蛋白結合肽序列包括（但不限於）SEQ ID NO: 80-84中所列之胺基酸序列。 SEQIDNO: 80 SEQ ID NO: 81 SEQ ID NO: 82 SEQ ID NO: 83 SEQ ID NO: 84
CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDF
QRLMEDICLPRWGCLWEDDF
QRLIEDICLPRWGCLWEDDF
RLIEDICLPRWGCLWEDD
DICLPRWGCLW 抗體-藥物結合物
在另一態樣中，本發明提供免疫結合物或抗體-藥物結 合物（ADC)，其包含與諸如化學治療劑、藥物、生長抑制 劑、毒素（例如，細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活 性毒素，或其片段）或放射性同位素（亦即’放射性結合物） 之細胞毒性劑結合之抗體。在另一態樣中’本發明進一步 提供使用該等免疫結合物之方法。在一態樣中’免疫結合 物包含共價連接於細胞毒性劑或可偵測藥劑之上述抗-CD79b抗體中之任一者。 在一態樣中’本發明之CD79b抗體結合於由另一 CD79b 抗體所結合之CD79b上之同一抗原決定基。在另一實施例 中，本發明之CD79b抗體結合於由自2006年7月11曰以 PTA-7712寄存於ATCC之融合瘤產生之單株抗體、包含 SEQIDNO: 10(圖 7)及 SEQIDNO: 14(圖 8A-B)之可變域之 單株抗體或包含自2006年7月11日以PTA-7712寄存於ATCC 之融合瘤產生之抗體的可變域及來自IgG 1之恆定域或包含 SEQ ID NO: 10(圖 7)及 SEQ ID NO: 14(圖 8A-B)之序列之單 132799.doc -162- 200918089 株抗體的可變域之嵌合抗體之Fab片段所結合的CD79b上 之同一抗原決定基。在另一實施例中，本發明之CD79b抗 體結合於由另一 CD79b抗體（亦即，CB3_1(BD Biosciences 目錄號 555678 ; San Jose，CA)、AT105-l(AbD Serotec 目錄 號 MCA2208 ; Raleigh, NC)、AT107-2(AbD Serotec目錄號 MCA2209)、抗-人類 CD79b 抗體（BD Biosciences 目錄號 5 57592 ; San Jose，CA)))所結合之CD79b上之同一抗原決 定基。 在另一態樣中，本發明之CD79b抗體結合於CD79b上不 同於由另一 CD79b抗體結合之抗原決定基的抗原決定基。 在另一實施例中，本發明之CD79b抗體結合於CD79b上不 同於由自2006年7月11日以PTA-7712寄存於ATCC之融合瘤 產生之單株抗體、包含SEQ ID NO: 1〇(圖7)及SEQ ID NO: 14(圖8 A-B)之可變域之單株抗體或包含自2006年7月11曰 以PTA-7712寄存於ATCC之融合瘤產生之抗體的可變域及 來自IgGl之恆定域或包含SEQ ID NO: 10(圖7)及SEQ ID NO: 14(圖8A-B)之序列之單株抗體的可變域之嵌合抗體之 Fab片段所結合的抗原決定基之抗原決定基。在另_實施 例中，本發明之CD79b抗體結合於CD79b上不同於由另一 CD79b 抗體（亦即，CB3_1(BD Biosciences 目錄號 555678 ; San Jose, CA) ' AT105-l(AbD Serotec 目錄號MCA2208 ; Raleigh, NC)、AT107-2(AbD Serotec 目錄號MCA2209)、 抗-人類 CD79b抗體（BD Biosciences 目錄號 557592 ; San Jose，CA))結合之抗原決定基的抗原決定基。 132799.doc -163· 200918089 在另一態樣中，本發明之CD79b抗體不同於（亦即’其不 為）自2006年7月11曰以PTA-7712寄存於ATCC之融合瘤產 生之單株抗體、包含SEQ ID NO: 10(圖7)及SEQ ID NO: 14(圖8A-B)之可變域之單株抗體或包含自2006年7月11日 以PTA-7712寄存於ATCC之融合瘤產生之抗體的可變域及 來自IgGl之恆定域或包含SEQ ID NO: 10(圖7)及SEQ ID NO: 14(圖8 A-B)之序列之單株抗體的可變域之嵌合抗體之
Fab片段。在另一實施例中，本發明之cD79b抗體不同於
(亦即，其不為）另一 CD79b抗體（亦即，CB3.1(BD
Biosciences 目錄號 555678 ; San Jose，CA)、AT105-l(AbD
Serotec 目錄號 MCA2208 ; Raleigh, NC)、AT107-2(AbD
Serotec 目錄號 MCA2209)、抗-人類 cD79b 抗體（BD
Biosciences 目錄號 557592 ; San J〇se，CA))之Fab片段。 在一態樣中，本發明之抗體特異性結合於第一動物物種 之CD79b且並不特異性結合於第二動物物種之CD79b。 在一實施例中，該第一動物物種為人類及/或靈長類（例 如，獼猴），且該第二動物物種為鼠類（例如，小鼠或 犬類。在-實施例甲，第一動物物種為人類。在一實施例 中，第-動物物種為靈長類’例如獼猴。在一實施例中， 第二動物物種為鼠類，例如小鼠。在-實施例中，第二動 物物種為犬類= 之一或多種抗體及 為醫藥學上可接受 在一態樣中，本發明提供包含本發明 载劑之組合物。在一實施例中，該載劑 的。 132799.doc -164 - 200918089 在一態樣中，本發明提供編碼本發明之CD79b抗體之核 酸。 在一態樣中，本發明提供包含本發明之核酸之載體。 在一態樣中，本發明提供包含本發明之核酸或载體之宿 主細胞。載體可為任何類型，例如重組載體，諸如表現載 體。可使用多種宿主細胞中之任一者。在一實施例中，宿 主細胞為原核細胞，例如大腸桿菌。在一實施例中，宿主 細胞為真核細胞，例如哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢 (CHO)細胞。 在一態樣中，本發明提供製造本發明之抗體之方法。舉 例而言，本發明提供一種製造〇〇791)抗體（如本文所定義， 其包括全長及其片段）之方法，該方法包含使本發明之編 碼該抗體（或其片段）之重組载體表現於合適之宿主細胞中 及回收該抗體。 在-態樣中，本發明提供—種製品，其包含—容器；及 含於該容器中之組合物’其中該組合物包含本發明之一或 多種CD79b抗體。在—實施例中，該組合物包含本發明之 核酸。在-實施例中，包含抗體之組合物進一步包含載 劑，在-些實施例中其為醫藥學上可接受的。在一實施例 中本考X明之製σα進一步包含關於向個體投與組合物（例 如抗體）之說明書。 /一態樣中，本發明提供-種套組，其包含一第一容 益’其包含含有本發明> _ A, J* .. 或夕種CD79b抗體之組合物； 及一第二容器，其包含綞 沒衝劑。在一實施例中，該緩衝劑 132799,doc -165 - 200918089 為醫藥學上可接受的。在一眘始 貫施例中，包含拮抗劑抗體之 組合物進一步包含載香I，尤_ α β 戰別在一些實施例中其為醫藥學上可 接受的。在一實施例中，套紐隹.^ ^ Ba 貧、，且進一步包含關於向個體投與 組合物（例如抗體）之說明書。 r \ i 在態樣中，本發明提供本發明之CD79b抗體用於製備 用乂 /口療）·生及/或預防性治療疾病（諸如癌症、腫瘤及/或細 胞增生性病症）之藥劑的用㉟。在—實施例中，癌症、腫 瘤及/或細胞增生性病症係選自淋巴瘤、#霍奇金氏淋巴 瘤（NHL)、^:襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性 NHL、難治性輒、難治性惰性職、慢性淋巴細胞性白 血病(CLL)、+淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血 病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。 在一態樣中，本發明提供本發明之核酸用於製備用以治 療I·生及/或預防性治療疾病（諸如癌症、腫瘤及/或細胞增生 性病症)之藥劑的用途。在一實施例巾，癌症、腫瘤及/或 細胞增生性病症係選自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤 (NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性ΝΗ[、復發性惰性 NHL、難治性NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白 血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血 病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。 在一態樣中，本發明提供本發明之表現载體用於製備用 以/CT療性及/或預防性治療疾病（諸如癌症、腫瘤及/或細胞 增生性病症）之藥劑的用途。在一實施例中，癌症、腫瘤 及/或細胞增生性病症係選自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤 132799.doc -166- 200918089 (NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性職、復發性惰性 祖、難A性祖、mif性NHL、慢性淋⑽胞性白 血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血 病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。 在一態樣中，本發明提供本發明之宿主細胞用於製備用 以治療性及/或預防性治療疾病（諸如癌纟、腫瘤及/或細胞 增生性病症）之藥劑的用途。在一實施例中，癌症、腫瘤 及/或細胞增生性病症係選自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤 (NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHl、復發性惰性 NHL、難治性NHL、難治性惰性NHl、慢性淋巴細胞性白 血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血 病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。 在一態樣中，本發明提供本發明之製品用於製備用以治 療性及/或預防性治療疾病（諸如癌症、腫瘤及/或細胞增生 1"生病症）之藥劑的用途。在一實施例中，癌症、腫瘤及/或 細胞增生性病症係選自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤 (NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性 NHL '難治性NHL、難治性惰性nhl、慢性淋巴細胞性白 血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血 病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。 在一‘癌樣中’本發明提供本發明之套組用於製備用以治 療性及/或預防性治療疾病（諸如癌症、腫瘤及/或細胞增生 性病症）之藥劑的用途。在一實施例中，癌症、腫瘤及/或 、細胞增生性病症係選自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤 132799.doc •167· 200918089 (NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性ΝΗί、復發性惰性 NHL、難治性NHL、難治性惰性^^^^、慢性淋巴細胞性白 血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血 病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。 在一態樣中，本發明提供一種抑制表現cD79bi細胞生 長之方法，該方法包含使該細胞與本發明之抗體接觸，藉 此使得該細胞之生長受到抑制。在一實施例中，該抗體與 細胞毒性劑結合。在一實施例中，該抗體與生長抑制劑結 合。 在一 樣中，本發明提供一種治療性治療具有包含表現 CD79b之細胞之癌性腫瘤的哺乳動物之方法，該方法包含 向該哺乳動物投與治療有效量之本發明之抗體，藉此有效 治療該哺乳動物。在一實施例中，該抗體與細胞毒性劑結 合。在一實施例中，該抗體與生長抑制劑結合。 在一態樣中’本發明提供一種治療或預防與CD79b之表 現增加相關之細胞增生性病症的方法，該方法包含向需要 該治療之個體投與有效量之本發明之抗體，藉此有效治療 或預防該細胞增生性病症。在一實施例中，該增生性病症 為癌症。在一實施例中，該抗體與細胞毒性劑結合。在一 實施例中’該抗體與生長抑制劑結合。 在一態樣中，本發明提供一種抑制細胞生長之方法，其 中該細胞之生長至少部分視CD79b之生長增強作用而定， 該方法包含使該細胞與有效量之本發明之抗體接觸，藉此 抑制該細胞之生長。在一實施例中，該抗體與細胞毒性劑 132799.doc • 168 - 200918089 結合。在一實施例中，該抗體與生長抑制劑結合。 在一態樣中，本發明提供一種治療性治療哺乳動物之腫 瘤之方法，其中該腫瘤之生長至少部分視CD79b之生長增 強作用而疋，該方法包含使該細胞與有效量之本發明之抗 體接觸’藉此有效治療該腫瘤。在一實施例中，該抗體與 細胞毒性劑結合。在一實施例中’該抗體與生長抑制劑結 合。 在一態樣中，本發明提供一種治療癌症之方法，其包含 向患者Ί又與包含本文所述之免疫結合物、可接受之稀釋 劑、載劑或賦形劑之醫藥調配物。在一實施例中，該癌症 係選自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、 復發性侵襲性NHL、復發性惰性NHL、難治性NHL、難治 性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞 性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞 性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。在一實施例中，投與患 者細胞毒性劑與抗體-藥物結合物化合物之組合。 在一態樣中，本發明提供一種抑制B細胞增生之方法， 其包含使細胞在容許免疫結合物與c D 7 9 b結合之條件下暴 露於包含本發明之抗體之免疫結合物。在一實施例中，該 B細胞增生係選自淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵 襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性NHL、難治性 NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白血病（cll)、 小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急 I·生淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。在一實施例 132799.doc -169· 200918089 中’ B細胞為異種移植物。在一實施例中，該暴露在活體 外進行。在-實施例中，該暴露在活體内進行。
在L樣中，本發明提供一種測定懷疑含有携之樣 品中CD79b之存在的方法’該方法包含使該樣品暴露於本 發明之抗體’及敎該抗體與該樣品中之⑽心之結合， 其中該抗體與該樣品t之CD79b之結合指示該樣品中存在 該蛋白質。在一實施例中，該樣品為生物樣品。在另一實 施例中，該生物樣品包含B細胞。在一實施例中生物樣 品係來自經歷或懷疑經歷B細胞病症及細胞增生性病 症之哺乳動物，該病症包括（但不限於）淋巴瘤、非霍奇金 氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性Nhl、復發性侵襲性NHL、復發 性惰性NHL、難治性NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴細 胞性白jk病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細 胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋 巴瘤。 在_態樣中’本發明提供一種診斷與表現CD79b之細胞 (諸如B細胞）增加相關之細胞增生性病症的方法，該方法 包含使生物樣品中之測試細胞與上述抗體中之任一者接 觸；藉由偵測該抗體與CD79b之結合來測定結合於該樣品 中之測試細胞的抗體之含量；及比較結合於對照樣品中之 細胞的抗體之含量，其中將所結合之抗體之含量標準化為 測試樣品及對照樣品中表現CD79b之細胞之數目，且其中 與對照樣品相比測試樣品中結合之抗體的含量較高指示與 表現CD79b之細胞相關之細胞增生性病症的存在。 132799.doc -170- 200918089 在一態樣中，本發明提供一種偵測血液或血清中之可溶 性CD79b之方法，該方法包含使來自懷疑經歷B細胞增生 性病症之哺乳動物之血液或血清的測試樣品與本發明之 抗-CD79b抗體接觸且偵測測試樣品中之可溶性79b相對 於來自正常哺乳動物之血液或血清之對照樣品的增加。在 一實施例中，該偵測方法適用作診斷與哺乳動物之血液或 血清中之可溶性CD79b增加相關的b細胞增生性病症之方 法。 在一怨樣中，本發明提供一種使本發明之抗體結合於表 現CD79b之細胞的方法’該方法包含使該細胞與本發明之 抗體接觸。在一實施例中，該抗體與細胞毒性劑結合。在 一實施例中，該抗體與生長抑制劑結合。 本發明之方法可用於影響任何合適之病理狀態，例如與 CD79b表現相關之細胞及/或組織。在一實施例中，本發明 之方法中所革巴向之細胞為造血細胞。舉例而言，造血細胞 可為選自由淋巴細胞、白血球、血小板、紅金球及自然殺 手細胞組成之群之一者。在一實施例中，本發明之方法中 所靶向之細胞為B細胞或T細胞。在一實施例中，本發明之 方法中所靶向之細胞為癌細胞。舉例而言，癌細胞可為選 自由淋巴瘤細胞、白血病細胞或骨骑瘤細胞組成之群之一 者。 本發明之方法可進一步包含其他治療步驟。舉例而言， 在一實施例中，方法進一步包含使靶細胞及/或組織（例如 癌細胞）暴露於放射治療或化學治療劑之步驟。 132799.doc -171 - 200918089 如本文所述，CD79b為B細胞受體之信號轉導組分。因 此，在本發明之方法之一實施財，戶斤乾向之細胞（例如 癌細胞）為與不表現CD79b之細胞相比較表現之細 胞。在另一實施例中，靶向之細胞為與相同組織類型之正 常非癌細胞相比CD79b表現增強之癌細胞。在一實施例 中’本發明之方法引起乾向之細胞死亡。 在本發明之其他態樣中，本發明提供包含編碼本文中所 述之抗體中之任一者的舰之載體。亦提供包含任何此類 ( 載體之宿主細胞。舉例而·^，該宿主細胞可為ch〇細胞、 大腸桿菌細胞或酵母細胞。進一步提供一種製造本文中所 述之抗體中之任-者的方法且該方法包含在適合於表現所 需抗體之條件下培養宿主細胞及自細胞培養物回收所需抗 體。 在又一態樣中，本發明係關於一種包含如本文所述之 抗CD79b抗體與載劑之組合的物質組合物。視情況，該載 # 劑為醫藥學上可接受之载劑。 ' 本發明之另一態樣係針對如本文所述之抗-CD79b多肽抗 體用於製備適用於治療對該抗.⑶携多肽抗體起反應之病 狀之藥劑的用途。 本發明之另一 ％、樣為一種包含式〗之抗體_藥物化合物之 混合物的組合物’其中平均每抗體藥物負荷為約2至約5, 或約3至約4。 本心明之另一癌樣為—種醫藥組合物，丨包括式T adc 化口物、式I ADC化合物之混合物或其醫藥學上可接受之 132799.doc •172- 200918089 〜川合物’及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形 劑。 九’土樣提供一種醫藥組合，其包含式I ADC化合物及 〃有抗癌特性或其他治療效應之第二化合物。 、另—態樣為一種殺死腫瘤細胞或癌細胞或抑制腫瘤細胞 或癌、、田胞增生之方法’纟包含用適量可有效殺死該等腫瘤 胞或癌細胞或抑制該等腫瘤細胞或癌細胞增生的式I之 抗體-藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物處 理該等細胞。 另一態樣為一種治療癌症之方法，其包含向患者投與治 療有效量之包括式IADC之醫藥組合物。 另一態樣包括製品，亦即套組，其包含抗體_藥物結合 物、容器及指示治療之包裝插頁或標籤。 本發明之一態樣為一種製造式〗抗體藥物結合物化合物 之方法，其包含下列步驟：使半胱胺酸工程化抗體之工 程化半胱胺酸基團與連接子試劑反應以形成抗體_連接子 中間物Ab_L;及（b)使Ab-L與活化藥物部分D反應；藉此形 成該抗體-藥物結合物；或包含下列步驟：（c)使藥物部分 之親核性基團與連接子試劑反應以形成藥物-連接子中間 物D-L ;及（d)使D-L與半胱胺酸工程化抗體之工程化半胱 胺酸基團反應；藉此形成該抗體-藥物結合物。 本發明之一悲樣為一種彳貞測癌細胞之檢定，其包含：（a) 使細胞暴露於半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體-藥物結合 物；及（b)測定該半胱胺酸工程化抗_CD79b抗體-藥物結合 132799.doc -173· 200918089 物化合物與該等細胞之結合程度。 A.抗-CD79b抗體 在一實施例中，本發明提供可在本文中用作治療劑之 抗-CD79b抗體。例示性抗體包括多株抗體、單株抗體、人 類化抗體、雙特異性抗體及異質結合物抗體。 1.多株抗體 多株抗體較佳係藉由多次皮下（sc)或腹膜内（ip)注射相關 抗原及佐劑而在動物體内產生。其可適用於使相關抗原 (尤其當使用合成肽時）與在待免疫之物種體内具免疫原性 之蛋白質結合。舉例而言，可使用雙官能試劑或衍生試劑 使抗原與匙孔螺血藍蛋白（KLH)、血清白蛋白、牛甲狀腺 球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑結合，該等試劑例如為順丁 稀二醯亞胺节醯基續基丁二酿亞胺酯（經由半胱胺酸殘基 結合）、N-羥基丁二醯亞胺（經由離胺酸殘基）、戊二醛、丁 二酸酐、S0C12或R^NsC^NR，其中R及R1為不同烷基。 藉由組合例如100 或5 pg蛋白質或結合物（分別針對兔 子或小鼠）與3體積之弗氏不完全佐劑（Freund,s c〇mplete adjuvant)且於多個部位經皮注射溶液使動物對抗原、免疫 原性結合物或衍生物免疫。一個月後，藉由於多個部位皮 下注射以1/5至1/1〇初始量之於弗氏不完全佐劑中之肽或結 合物使動物加強免疫。7至14天後，給動物放血且檢定血 清之抗體效價。使動物加強免疫直至效價平台期。結合物 亦可在重組細胞培養物中以蛋白質融合物形式產生。又， 適當地使用諸如明礬之聚集劑來增強免疫反應。 132799.doc • 174- 200918089 2.單株抗艘 單株抗體可使用最初由Kohler等人，Nature，256:495 (1975)描述之融合瘤方法來製造，或可藉由重組dNA方法 來製造（美國專利第4,816,567號）。 在融合瘤方法中，如上文所述使小鼠或其他適當宿主動 物（堵如倉鼠）免疫以激發產生或能夠產生將特異性結合於 用於免疫之蛋白質之抗體的淋巴細胞。或者，可在活體外 使淋巴細胞免疫。免疫後，將淋巴細胞分離且接著使用合 適之融合劑（諸如聚乙二醇）與骨髓瘤細胞株融合以形成融 合瘤細胞（Goding，Monoclona丨 Antibodies: Principles and Practice ’ 第 59-103 頁（Academic Press, 1986))。 將由此製備之融合瘤細胞接種且使之生長於合適之培養 基中’該培養基較佳含有一或多種可抑制未融合之親本骨 髓瘤細胞（亦稱為融合搭配物）之生長或存活的物質。舉例 而言，若親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖 基轉移酶（HGPRT或HPRT) ’則融合瘤之選擇性培養基通常 將包括次黃嘌啉、胺基喋呤及胸苷（HAT介質），該等物質 防止缺乏HGPRT之細胞生長。 較佳融合搭配物骨髓瘤細胞為有效融合、支持所選的產 生抗體之細胞穩定高量產生抗體且對針對未融合之親本細 胞所選擇之選擇性培養基敏感的彼等者。較佳骨越瘤細胞 株為鼠類骨髓瘤細胞株’諸如源自可得自沙克研究所細胞 分配中心（Salk Institute Cell Distribution CenterXSan Diego, California USA)之 MOPC-21 及 MPC-11 小鼠腫瘤以及 132799.doc -175- 200918089 可得自美國菌種保藏中心（Manassas，Virginia，USA)之SP-2 及衍生物（例如X63-Ag8-653細胞）的彼等者。亦已關於產 生人類單株抗體描述了人類骨髓瘤及小鼠-人類雜骨髓瘤 細胞株（Kozbor，J. Immunol·，133:3001 (1984);及 Brodeur 等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and
Applications，第 51-63 頁（Marcel Dekker，Inc_，New York， 1987))。 檢定内部生長融合瘤細胞之培養基的針對抗原之單株抗 體的產生。較佳地，藉由免疫沈澱或藉由諸如放射免疫檢 定（RIA)或酶聯免疫吸附檢定（ELISA)之活體外結合檢定來 測定由融合瘤細胞產生之單株抗體之結合特異性。 單株抗體之結合親和力可例如藉由Munson等人，Anal. Biochem·，107:220 (1980)中所述之史卡查分析（Scatchard analysis)來測定。 鑑別出產生具所需特異性、親和力及/或活性之抗體之 融合瘤細胞後，可藉由限制稀釋程序對純系進行次選殖且 藉由標準方法使其生長（Goding，M〇n〇cl〇na丨Antib〇dies:
Principles and Practice ^ f 59-1 〇3 I (Academic Press, 1986))。出於此目的，合適之培養基包括（例如）d_me_ RPMM640培養基。另外，融合瘤細胞可料腹水腫瘤生 長於動物活體内，例如藉由將細胞腹膜内注射至小鼠體内 來達成。 藉由諸如親和層析（例如佶茂_ 如便用蛋白質A或蛋白質G_瓊脂 糖）或離子交換層析、經碰； 在嶙厌石層析、凝膠電泳、透析等 132799.doc -176- 200918089 之習知抗體純化程序，將由次⑽分泌之單株抗體適當地 自培養基、腹水流體或血清分離。 使用習知程序（例如’藉由使用能夠特異性結合於編碼 鼠類抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針）來容易地 將編碼單株抗體之DNA分離及定序。融合瘤細胞用作該 DNA之較佳來源。在分離後，可將DNA置於表現載體中， 接著將其轉染至諸如大腸桿菌細胞、猿c〇s細胞、中國倉 鼠卵巢（CHO)細胞或骨髓瘤細胞之不以其他方式產生抗體 蛋白之宿主細胞中’以獲得單株抗體在重組宿主細胞中之 〇成。關於編碼抗體之DNA在細菌中之重組表現的評述文 章包括 Skerra等人 ’ Curr. Opinion in Immunol.，5:256-262 (1993)及 Pliickthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)。 在另一實施例中，單株抗體或抗體片段可自使用
McCafferty等人，Nature，348:552-554(1990)中所述之技術 產生之抗體盤菌體庫分離。Clackson等人，Nature, 352:624-628 (1991)及 Marks 等人，J. Mol. Biol.，222:581- 597 (1991)分別描述使用噬菌體庫分離鼠類及人類抗體。 後續公開案描述藉由鏈改組（Marks等人，Bio/Techno丨ogy， 10:779-783 (1992))以及組合感染及活體内再組合作為建構 極大0丞菌體庫之策略（Waterhouse等人，Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993))來產生高親和力（nM範圍）人類抗體。 因此’此等技術為用於分離單株抗體之傳統單株抗體融合 瘤技術之可行替代者。 132799.doc •177- 200918089 可修飾編碼抗體之DNA以產生嵌合或融合抗體多肽，例 如藉由用人類重鏈及輕鏈恆定域（CH及CL)取代同源鼠類序 】（美國專利第4,816,567號；及Morrison，等人，Proc. Natl
Sei· USA，81:6851 (1984))，或藉由使免疫球蛋白編 媽序列與非免疫球蛋白多肽（異源多肽）之編碼序列之全部 或部分融合來達成。非免疫球蛋白多肽序列可取代抗體之 怪疋域’或用其取代抗體之一個抗原結合位點之可變域以 开> 成包含一個對一抗原具有特異性之抗原結合位點及另一 個對不同抗原具有特異性之抗原結合位點的嵌合二價抗 體。 3.人類抗體及人類化抗體 本發明之抗-CD79b抗體可進一步包含人類化抗體或人類 抗體。非人類（例如鼠類）抗體之人類化形式為含有源自非 人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、其免疫球 蛋白鏈或片段（諸如FV、Fab、F(ab，）2或抗體之其他抗原結 合子序列）。人類化抗體包括人類免疫球蛋白（受體抗體）， 其中來自受體之互補判定區（CDR)之殘基由來自諸如小 鼠、大鼠或兔子之非人類物種（供體抗體）之Cdr且具有所 需特異性、親和力及能力的殘基置換。在一些情況下，人 類免疫球蛋白之Fv構架殘基由相應非人類殘基置換。人類 化抗體亦可包含既不見於受體抗體中亦不見於所輸入cdr 或構架序列中之殘基。一般而言，人類化抗體將包含至少 一個且通常兩個可變域之大體上全部，其中所有或大體上 所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白之彼等者且所有或大 132799.doc •178- 200918089 體上所有FR區為人類免疫球蛋白一致序列之彼等者。人類 化抗體最佳亦將包含免疫球蛋白恆定區（Fc)之至少—部 分’通常為人類免疫球蛋白之至少一部分[jones等人，
Nature, 321:522-525 (1986) ; Riechmann 等人，Nature 332:323-329 (1988);及 Presta, Curr. Op. Struct. 2:593-596 (1992)] ° 人類化非人類抗體之方法在此項技術中係熟知的。—般 而言，人類化抗體具有一或多個自非人類來源引入其中之 胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基常常被稱為”輸入，，殘 基’其通常取自"輸入”可變域。人類化可基本上按照
Winter 及同事之方法[jones 等人，Nature, 321:522-525 (1986) ; Riechmann等人，Nature，332:323-327 (1988); Verhoeyen等人，Science, 239:1534-1536 (1988)]，藉由用 齧齒類CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列來執行。 因此，該等"人類化"抗體為嵌合抗體（美國專利第 4,816,5 67號）’其中大體上不及完整人類可變域已由來自 非人類物種之相應序列取代。實際上，人類化抗體通常為 一些CDR殘基及可能一些FR殘基由來自齧齒類抗體中之類 似位點之殘基取代的人類抗體。 當抗體意欲用於人類治療用途時，對欲用於製備人類化 抗體之人類可變域（輕鏈及重鏈）之選擇對於降低抗原性及 哈馬反應（人類抗·小鼠抗體）極為重要。降低或消除哈馬反 應為合適之治療劑之臨床發展的重要態樣。參見（例 如）Khaxzaeli等人，j. Natl. Cancer Inst. (1988)，80:937 ; 132799.doc -179- 200918089
Jaffers等人，Transplantation (1986)，41:572 ; Shawler等 人，J_ Immunol. (1985)，135:1530; Sears等人，J. Biol. Response Mod. (1984)，3:138 ; Miller等人，Blood (1983)， 62:988 ; Hakimi 等人，J. Immunol· (1991), 147:1352 ; Reichmann等人 ’ Nature (1988)，332:323 ; Junghans等人， Cancer Res. (1990)，50:1495。如本文所述，本發明提供經 人類化以便降低或消除哈馬反應之抗體。使用此項技術中 已知之常規方法可進一步獲得此等抗體之變異體，其中一 些在下文作進一步描述。根據所謂"最合適"方法，針對整 個已知人類可變域序列庫篩選齧齒類抗體之可變域之序 列。鑑別出最接近齧齒類之人類V域序列且接受其中之人 類構架區（FR)用於人類化抗體（Sims等人，j. Immun〇I. 151:2296 (1993) ; Chothia等人，J· Mol. Bi〇1·，i96:9〇1 (1987))。另一方法使用源自輕鏈或重鏈之特定亞群之所有 人類抗體的一致序列之特定構架區。對於若干不同人類化 抗體可使用相同構架（Carter等人，Proc. Nat丨.Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992) ; Presta等人 ’ j. Immun〇1· 151:2623 (1993)) 〇 舉例而言，來自如本文所述之抗體之胺基酸序列可用作 使構架及/或高變序列多樣化之起始（親本）序列。起始高變 序列所連接之所選構架序列在本文中被稱為受體人類構 架。雖然受體人類構架可來自或源自人類免疫球蛋白（其 VL及/或VH區域），但較佳地為受體人類構架來自或源自 人類-致構架序列，此係因為已顯示該等構架在人類患者 132799.doc -180· 200918089 體内具有最小免疫原性或無免疫原性。 在受體源自人類免疫球蛋白時，吾人可視情況選擇基於 與供體構架序列之同源性藉由比對供體構架序列與人類構 架序列集合中之各種人類構架序列來選擇的人類構架序 列，且選擇與受體最同源之構架序列。 在一實施例中，本文中之人類一致構架來自或源自VH 亞群III及/或VLk亞群I 一致構架序列。 因此，VH受體人類構架可包含下列構架序列中之一 個、兩個、三個或全部： 包含 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 之 FR1(SEQ ID NO: 69)； 包含 WVRQAPGKGLEWV之 FR2(SEQ ID NO: 70); 包含 RFTISXfXzSKNTXJLQMNSLRAEDTAVYYC 之 FR3 (SEQ ID NO: 73)，其中X丨為A或R，X2為T或N，且X3為A 或L ; 包含 WGQGTLVTVSS之 FR4(SEQ ID NO: 72)。 VH—致構架之實例包括： 缺失Kabat CDR之人類VH亞群I一致構架（SEQ ID NO: 36)； 缺失延伸高變區之人類VH亞群I一致構架（SEQ ID NO: 37- 39) ； 缺失Kabat CDR之人類VH亞群II一致構架（SEQ ID NO: 40) ； 缺失延伸高變區之人類VH亞群II 一致構架（SEQ ID NO: 132799.doc -181 - 200918089 41-43)； 缺失Kabat CDR之人類VH亞群III一致構架（SEQ ID NO: 44); 缺失延伸高變區之人類VH亞群III一致構架（SEQ ID NO: 45-47)； 缺失Kabat CDR之人類VH受體構架（SEQ ID NO: 48); 缺失延伸高變區之人類VH受體構架（SEQ ID NO: 49-50); 缺失Kabat CDR之人類VH受體2構架（SEQ ID NO: 51);或 缺失延伸高變區之人類VH受體2構架（SEQ ID NO: 52-54)。 在一實施例中，VH受體人類構架包含下列構架序列中 之一個、兩個、三個或全部：
包含 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 之 FR1(SEQ ID NO: 69)； 包含 WVRQAPGKGLEWV之 FR2(SEQ ID NO: 70); 包含 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO: 71)； RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO: 74)； RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAYYYCAR (SEQ ID NO: 75) ' RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCS (SEQ IDNO: 76)或 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR (SEQ ID NO: 77)之 FR3 ; 包含 WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 72)之 FR4。 VL受體人類構架可包含下列構架序列中之一個、兩 個、三個或全部： 132799.doc -182- 200918089 包含 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 之 FR1(SEQ ID NO: 65)； 包含 WYQQKPGKAPKLLIY之 FR2(SEQ ID NO: 66); 包含 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 之 FR3 (SEQ ID NO: 67)； 包含 FGQGTKVEIKR之 FR4(SEQ ID NO: 68)。 VL—致構架之實例包括： 人類VLk亞群I一致構架（SEQ ID NO: 55); 人類VL κ亞群II一致構架（SEQ ID NO: 56); 人類VLk亞群III 一致構架（SEQ ID NO: 57);或 人類VL κ亞群IV—致構架（SEQ ID NO: 5 8)。 雖然受體之序列可與無論來自人類免疫球蛋白抑或人類 一致構架之所選人類構架序列一致，但本發明涵蓋受體序 列可包含相對於人類免疫球蛋白序列或人類一致構架序列 預先存在之胺基酸取代。此等預先存在之取代較佳為極 少；相對於人類免疫球蛋白序列或一致構架序列通常僅四 個、三個、兩個或一個胺基酸差別。 將非人類抗體之高變區殘基併入VL及/或VH受體人類構 架中。舉例而言，吾人可併入對應於Kabat CDR殘基、 Chothia高變環殘基、Abm殘基及/或接觸殘基之殘基。視 情況，併有如下延伸高變區殘基：24-34(Ll)、50-56(L2) 及 89-97(L3)、26-35Β(Η1)、50-65、47-65 或 49-65(H2)及 93-102 、 94-102或95-102(H3)。 雖然本文中論述高變區殘基之”合併”，但應瞭解此可以 132799.doc -183 - 200918089 多種方式達成，例如編碼所需胺基酸序列之核酸可藉由使 編碼小鼠可變域序列之核酸突變以便使其構架殘基變為受 體人類構架殘基，或藉由使編碼人類可變域序列之核酸突 變以便使高變域殘基變為非人類殘基，或藉由合成編碼所 需序列之核酸等而產生。 在本文實例中，對各高變區使用獨立寡核苷酸藉由編碼 人類受體序列之核酸之Kunkel突變誘發來產生高變區接枝 變異體。Kunkel 等人，MdWi /, 154:367_382 (1987)。可使用常規技術將適當變化引入構架及/或高變區 中以修正及重建適當高變區-抗原相互作用。 噬菌體（噬粒）呈現（在一些情況下本文中亦稱為噬菌體呈 現）可用作用於產生由序列隨機化產生之庫中之許多不同 潛在變異抗體及對該等不同潛在變異抗體進行篩選的便利 及快速之方法。然而，製造及篩選經改變之抗體之其他方 法可為熟習此項技術者所利用。 噬菌體（噬粒）呈現技術提供一種用於產生結合於配位體 (諸如抗原）之新穎蛋白質及對該等蛋白質進行選擇的有效 工具。以菌體（噬粒）呈現技術之使用允許產生大蛋白質變 異體庫，可快速針對以高親和力結合於靶分子之彼等序列 對該等庫進行分選。編碼變異多肽之核酸一般與編碼病毒 外殼蛋白（諸如基因ΠΙ蛋白或基因vm蛋白）之核酸序列融 α已開發出其中編碼蛋白質或多肽之核酸序列與編碼基 因III蛋白之一部分之核酸序列融合的單價噬粒呈現系統。 (Bass，S·，ρ她―，8:3〇9 (199〇); L〇wman 及 132799.doc -184^ 200918089
Methods: A Companion to Methods in Enzymology，3:205 (1991))。在單價噬粒呈現系統中，以低量表現基因融合且 亦表現野生型基因III蛋白以便保留顆粒之感染性。產生肽 庫及篩選彼等庫之方法已在許多專利（例如美國專利第 5,723,286號、美國專利第5,432,018號、美國專利第 5,580,717號、美國專利第5,427,9〇8號及美國專利第 5,498,530號）中有揭示。 已以許多方式製備抗體或抗原結合多肽之庫，包括藉由 經由插入隨機DNA序列改變單一基因或藉由選殖相關基因 家族來進行。使用噬菌體（噬粒）呈現來呈現抗體或抗原結 合片段之方法已於美國專利第5,75〇,3 73號、第5,733,743 號、第 5,837,242號、第 5,969，108號、第 6，172，197號、第 5,580,717號及第5,658,727號中描述。隨後針對具有所需特 徵之抗體或抗原結合蛋白之表現來對庫進行篩選。 將所選之胺基酸取代至模板核酸中之方法在此項技術中 為充分確立的，其中一些在本文中有描述。舉例而言，高 變區殘基可使用Kunkel方法取代。參見（例如）Kunkel等 人 ’ Mei/zo心五《叮所0/· 154:367-382 (1987)。 寡核苷酸之序列包括為待改變之高變區殘基所設計之密 碼子、’且中的一或多者。密碼子組為一組用於編碼所需變異 胺基酸之不同核苷酸三聯體序列。密碼子組可使用表示特 定核苷酸或核苷酸之等莫耳混合物之符號來表示，如下文 根據IUB代碼所示。 IUB代碼 132799.doc -185- 200918089 G鳥嘌呤 A腺嘌呤 T胸腺嘧啶 C胞嘧啶 R(A 或 G) Y(C 或 T) Μ(Α 或 C) K(G 或 Τ) S(C 或 G) W(A 或 Τ) Η(Α或C或Τ) B(C或G或Τ) V(A或C或G) D(A或 G或 T)H N(A或C或G或Τ) 舉例而言，在密碼子組DVK中，D可為核苷酸八或〇或 丁； V可為A或G或C ;且K可為G或T。此密碼子組可提供18 種不同密碼子且可編碼胺基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thj>、
Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly及 Cys。 募核苷酸或引子組可使用標準方法合成。—〜 殂养核苷酸 可例如藉由固相合成來合成’其含有表示由密碼子組提供 之核苷酸三聯體之所有可能組合及將編碼所 1 π需胺基酸組的 序列。於某些位置處具有所選核苷酸”簡併,， 叮 < 养核苷酸的 口成在此項技術中係熟知的。該等具有某此 一贲碼子組之核 132799.doc -186- 200918089 苷酸組可使用商業核酸合成器（例如可得自Appiied Biosystems，Foster City，CA)來合成，或可自商業來源獲得 (例如得自 Life Technologies，Rockville，MD)。因此，所人 成的具有特定密碼子組之一組寡核苷酸通常將包括複數個 具有不同序列之寡核苷酸，該等差異由整個序列内之密碼 子組產生。如根據本發明所使用之寡核苷酸具有允許與可 變域核酸模板雜交且亦可包括用於選殖目的之限制性酶位 點的序列。 在一種方法中，編碼變異胺基酸之核酸序列可藉由寡核 苷酸介導之突變誘發來形成^此技術在此項技術中係熟知 的，如Zoller 等人勤c/ez.c； Jc 油 10:6487-6504 (1987) 所述。簡言之，編碼變異胺基酸之核酸序列係藉由使編碼 所需密碼子組之募核苷酸組與DNA模板雜交來形成，其中 該模板為含有可變區核酸模板序列之單股形式之質體。雜 交後，使用DNA聚合酶合成模板之整個第二互補股，此將 由此合併寡核苷酸引子，且將含有如由寡核苷酸組所提供 之密碼子組。 一般而言，使用長度為至少25個核苷酸之寡核苷酸。最 佳养核苷酸將具有12至1 5個與模板在編碼突變之核苷酸之 任一側完全互補的核苷酸。此確保募核苷酸將適當地與單 股DNA模板分子雜交。募核苷酸容易使用此項技術中已知 之技術合成，諸如Crea等人，以〇£； #如7 75:5765(1978)所述之技術。 DNA模板係由源自噬菌體M13載體（市售M13mpl8& 132799.doc •187- 200918089 M13mp19載體為合適的）之彼等載體或含有單股噬菌體複 製起點之彼等載體（如Viera等人，Me故五153:3 (1987)所述）產生。因此，可將待突變之dna插入此等載體 之一者中以產生單股模板。單股模板之產生在“111匕〇吐等 人（上文）之4.21-4.41章節中有描述。 為改變天然DNA序列，在合適之雜交條件下使寡核苷酸 與單股模板雜交。接著添加通常為T7 DNA聚合酶2Dna 聚合酶或DNA聚合酶i之Klenow片段以使用募核苷酸作為 合成引子來合成模板之互補股。由此形成異源雙鏈體分子 以便使DNA之一股編碼基@1之突變形式，且另一股（原始 模板）編碼基因1之天然、未改變序列。接著將此異源雙鏈 體分子轉型至合適之宿主細胞中，通常為原核生物，諸如 大腸桿菌JM101。使細胞生長後，將其塗於瓊脂糖板上且 使用經32-磷酸鹽放射性標記之寡核苷酸引子進行筛選以 鑑別含有突變DNA之細菌群落。 上文剛剛所述之方法可加以修改以便形成如下同源雙鏈 體分子’其中兩股質體皆含有突變。修改如下：使單股寡 核苷酸與如上文所述之單股模板一起退火。將三種脫氧核 糖核苷酸（亦即脫氧核糖腺苷（dATp)、脫氧核糖鳥苷 (dGTP)及脫氧核糖胸苷（dTT))之混合物與稱為dCTp (aS)之 經修飾之硫代脫氧核糖胞嘧啶（其可自Amersham獲得）組 合。將此混合物添加至模板_寡核苷酸複合物中。將dna 聚合酶添加至此混合物中後，產生除突變鹼基外與模板一 致之一股DNA。另外，此新股DNA將含有dCTP-(aS)而非 132799.doc •188· 200918089 dCTP，ItdCTIMaS)用來保護DNA免於限制性核酸内切酶 消化。用適當限制酶對雙股異源雙鏈體之模板股切割後， 可用ExGin核酸m適當核_，越過含有待誘發突 變之，點之區域消化該模板股。接著停止反應以留下僅部 分為早股之分子。接著在所有四種脫氧核糖核㈣三碟酸 鹽、ATP及DNA連接酶存在τ使用職聚合酶形成完整雙 股DNA同源雙鏈體。接著可將此同源雙鏈體分子轉型至合 適之宿主細胞中。 f
^先前所指示，寡核㈣組之序列具有^以與模板核酸
:交之長度且亦可(但並非必定)含有限制性位點。DNA 模板可由源自4菌體Ml3載體或含有單股嗟菌體複製起點 之載體（如Viera等人，細, 153:3 (1987)所述） 的彼等載體產生。因此，必須將待突變之DNA插人此等載 體之一者中以產生單股模板。單股模板之產生在Sambrook 專人（見上）之4.21-4.41章節中有描述。 根據另-方法，抗原結合可在抗體人類化期間經由選擇 L復阿變區來恢復（參見2〇〇5年2月18日申請之申請案第 U/〇61，841號）。該方法包括將非人類高變區併於受體構架 上且進-步將-或多個胺基酸取代引入一或多個高變區中、 Μ修飾受體構架㈣4者’―或多個胺基酸取代之引 入可伴有受體構架序列之修飾。 :據另-方法，可藉由提供上游及下游寡核苦酸組來產 各組具有複數個具有不同序列之寡㈣酸，該等不 序列由寡核《序列内提供之密碼子組所建立。上游及 132799.doc •189· 200918089 下游寡核普酸組以及可變域模板核酸序歹可用⑨聚合酶鍵 反應中以產生PCR產物之"庫"PCRi物可稱為”核酸盒，，， 此係因為可使帛已確立之分子生物學技#將其與其他相關 或無關核酸序列（例如病毒外殼蛋白及二聚化結構域）融 合0 PCR引子之序列包括為高變區中溶劑可接近且高度不同 之位置所設計之密碼子組中之—或多纟。如上文所述，密 (
碼子組為一組用於編碼所需變異胺基酸之不同核苷酸三聯 體序列。 可使用標準重組技術將如經由$當篩選/選擇步驟所選 之符合所需標準之抗體選擇物分離及選殖。 更為重要的是將抗體人類化但保留對抗原之高結合親和 力及其他㈣生物學特性。為達成此目標，根據較佳方 法，藉由使用親本及人類化序列之三維模型分析親本序列 及各種概念性人類化產物之方法來製備人類化抗體。三維 免疫球蛋白模型通常為可利用的且為熟習此項技術者所熟 悉。可利用電腦程式，其例示且展現所選候選免疫球蛋白 序列之可能三維構形結構。對此等展現之檢查允許分析殘 基在候選免疫球蛋白序列被你田口兔 斤夕】起作用時之可能作用，亦即分析 影響候選免疫球蛋白妹人並户店 ，_ ^ 、，° σ其抗原之能力之殘基。以此方 式，0Γ自受體及輸入序列選遥只及成话 πk擇FR殘基且加以組合以便獲得 所需·ί几體特徵（諸如對知P4 * 几原之親和力增加）。一般而言， 高變區殘基直接且大多數 夕数大體上涉及影響抗原結合。 本發明涵蓋各種形式之 飞之人類化抗-CD79b抗體。舉例而 132799.doc -190· 200918089 言，人類化抗體可為抗體片段，諸如Fab，其視情況與一 或多種細胞毒性劑結合以產生免疫結合物。或者，人類化 抗體可為完整抗體，諸如完整IgGl抗體。 作為人類化之替代’可產生人類抗體。舉例而言，現在 有可能產生轉殖基因動物（例如小鼠），其在免疫後能夠在 不產生内源性免疫球蛋白之情況下產生人類抗體之完整譜 系。舉例而言’已描述喪合及生殖系突變小鼠體内之抗體 重鏈連接區域（JH)基因之純合性缺失導致内源性抗體產生 受到完全抑制。人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至該 等生殖系突變小鼠中將導致在抗原激發後產生人類抗體。 參見例如，Jakobovits等人 ’ Proc· Natl. Acad. Sci. USA， 90:2551 (1993) ; Jakobovits 等人，Nature，362:255-258 (1993) ; Bruggemann 等人，Year in Immuno. 7:33 (1993);美國專利第5,545,8〇6號、第5,569,825號、第 5,591，669 號（均為 GenPharm的）；第 5,545,807 號；及 WO 97/17852 。 或者’可使用噬菌體呈現技術（McCafferty等人，Nature 348:552-553 [1990])在活體外自未經免疫之供體之免疫球 蛋白可變（V)域基因譜系產生人類抗體及抗體片段。根據 此技術’將抗體V域基因同框選殖至絲狀嗟菌體（諸如Μ1 3 或fd)之主要或次要外殼蛋白基因中，且作為功能性抗體片 段呈現於嗤菌體顆粒之表面上。因為絲狀顆粒含有嗟菌體 基因組之單股DNA複本，所以基於抗體之功能特性之選擇 亦導致選擇編碼展現彼等特性之抗體之基因。因此，噬菌 132799.doc -191 - 200918089 體模擬B細胞之一些特性。噬菌體呈現可以多種形式執 行’此於（例如）J〇hnson，Kevin S·及Chiswell，David J.， Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993) 中有综述。V基因區段之若干來源可用於噬菌體呈現。
Clackson等人，Nature，352:624-628 (1991)自源自經免疫 之小鼠之脾的V基因之小隨機組合庫分離不同抗-噁唑_抗 體陣列。可建構未經免疫之人類供體之V基因的譜系且不 同抗原（包括自體抗原）陣列之抗體可基本上按照Marks等 人 ’ J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)或 Griffith 等人， EMBO J· 12:725-734 (1993)所述之技術來分離。亦參見美 國專利第5,565,332號及第5,573,905號。 如上文所討論’人類抗體亦可由活體外活化B細胞產生 (參見美國專利5,567,610及5,229,275)。 4.抗體片段 在某些情況下’使用抗體片段而非完整抗體有益處。較 小尺寸之片段允許快速清除，且可導致對實體腫瘤之接近 付到改善。 已開發各種技術用於製造抗體片段。傳統上，此等片段 係經由完整抗體之蛋白水解消化而得到（參見（例 如）Morimoto 等人，journai 〇f Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992);及 Brennan 等 人，Science，229:81 (1985))。然而，此等片段現在可直接 由重組宿主細胞產生。Fab、Fv及ScFv抗體片段均可在大 腸桿菌中表現且自其分泌，因此允許容易地製造大量此等 132799.doc -192· 200918089 片段。可將抗體片段自上文所論述之抗體噬菌體庫分離。 或者’可直接自大腸桿菌回收Fab'-SH片段且使其化學偶 合以形成F(ab，）2 片段（Carter等人，Bi〇/Techn〇l〇gy 1〇:163_ 167 (1992))。根據另一方法，可直接自重組宿主細胞培養 物分離F(ab')2片段。包含補救受體結合抗原決定基殘基且 活體内半衰期增加之Fab及F(ab')2片段係描述於美國專利 第5,869,046號中。用於製造抗體片段之其他技術對於熟練 從業者將顯而易見。在其他實施例中，所選抗體為單鏈Fv 片段（scFv)。參見WO 93/16185 ;美國專利第5,571 894 號；及美國專利第5,587,458號。Fv及sFv為具有完整結合 位點但無恆定區之僅有物質；因此，其適合於在活體内使 用期間降低之非特異性結合。可建構sFv融合蛋白以獲得 效應蛋白於sFv之胺基或羧基末端處之融合。參見 Antibody Engineering，Borrebaeck編，見上。抗體片段亦 可為"線性抗體·•，例如美國專利5，641，870中所述。該等線 性抗體片段可為單特異性或雙特異性抗體。 5.雙特異性抗體 雙特異性抗體為對至少兩個不同抗原決定基具有結合特 異性之抗體。例示性雙特異性抗體可結合於如本文所述之 CD79b蛋白質之兩個不同抗原決定基。其他該等抗體可組 合CD79b結合位點與另一蛋白質之結合位點。或者，抗_ CD79b臂可與結合於白血球上諸如τ細胞受體分子（例如 CD3)之誘發分子或諸如 FcyRI(CD64)、Fc^RII(CD32)及 FcyRIII(CD16)之IgG之Fc受體（FcyR)的臂組合，以便針對 132799.doc -193- 200918089 表現CD79b之細胞集中及定位細胞防禦機制。雙特異性抗 體亦可用於針對表現CD79b之細胞定位細胞毒性劑。此等 抗體具有CD79b結合臂及結合細胞毒性劑（例如沙泊寧 (saporin)、抗-干擾素-α、長春花生物驗、篦麻毒素a鏈、 甲胺喋呤或放射性同位素半抗原）之臂◎雙特異性抗體可 以全長抗體或抗體片段形式製備（例如F(ab')2雙特異性抗 體）。 \^〇 96/16673描述一種雙特異性抗_£此82/抗彳0丫11111抗 體且美國專利第5,837,234號揭示一種雙特異性抗_ErbB2/ 抗-FcyRI抗體。雙特異性抗_ErbB2/Fca抗體係展示於 WO98/02463中。美國專利第5,821，337號教示一種雙特異 性抗-ErbB2/抗-CD3抗體。 用於製造雙特異性抗體之方法在此項技術中係已知的。 全長雙特異性抗體之傳統製造係基於兩個免疫球蛋白重 鏈-輕鏈對之共表現，其中該兩個鏈具有不同特異性 (Millstein等人，Nature 305:537-539 (1983))。由於免疫球 蛋白重鍵及輕鍵隨機分配，因此此等融合瘤（四源雜交瘤） 產生10種不同抗體分子之潛在混合物，其中僅一種具有正 確雙特異性結構。通常藉由親和層析步驟進行之正確分子 之純化相當繁瑣，且產物產率較低。類似程序係揭示於 WO 93/08829及 Traunecker 等人，EMBO J. 10:3655-3659 (1991)中。 根據不同方法，使具有所需結合特異性之抗體可變域 (抗體·抗原結合位點）與免疫球蛋白恆定域序列融合。較佳 132799.doc -194- 200918089 也”包3鉸鏈、CH2及CH3區域之$小 ^ B, . ± H匕埤之至少一部分的Ig重鏈恆 疋域融合。較佳使含有輕鏈 ，5 ^ _ 口 ％必需之位點的第一重鏈 恆疋區（CH1)存在於融合物之至 者中。將編碼免疫球 蛋白重鏈融合物及（需要時）务，芦 ^ . 免度球蛋白輕鏈之DNA插入獨 立表現載體中，且共韓毕5人，奋 办 、轉木至合適之宿主細胞中。當不等比 率之用於建構之三個多肽鏈提 7系雙特異性抗體之最佳 產率時’此提供調節實施例中 ^ T —個多肽片段之相互比例的 較向靈活性。然而，當等比率
一 寻匕丰之至）兩個多肽鏈的表現導 致向產率時或當比率對所需 Τ所私鍵組合之產率無顯著影響時， 有可能將兩個或所有r他I容# ^ 凡吓,一個夕肽鏈之編碼序列插入單一 載體中。 在此方法之-較佳實施例中，雙特異性抗體係由在一個 臂中具有第—結合特異性之雜合免疫球蛋白重鏈及在另一 臂中之雜合免疫球蛋白重鍵·輕鍵對（提供第二結合特異性） 構成。發現此残稱結構有助於所需雙特異性化合物與不 需要之免疫球蛋白鏈組合分離，因為免疫球蛋白輕鍵存在 於僅-半雙特異性分子中提供容易分離之方式。此方法係 揭不於W〇 94/G469G中。關於產生雙特異性抗體之其他詳 細情形，參見例如Suresh等人，Meth〇ds & Enzym〇丨〇gy 121:210 (1986)。 根據美國專利第5,731，168號中所述之另一方法，抗體分 子對之間的卩面可經工程化則吏自重組細㈣養物回收之 異質二聚體的百分比最大化。較佳界面包含CH3域之至少 一部分。在此方法中，來自第一抗體分子之界面的一或多 132799.doc -195- 200918089 個小胺基酸側鏈經較大側鏈（例如，酪胺酸或色胺酸）置 換。藉由用較小胺基酸側鍵（例如，丙胺酸或蘇胺酸）置換 較大胺基酸側鏈而於第二抗體分子之界面上產生與大側鏈 相同或類似之尺寸的補償性"空穴"。此提供一種使異質二 聚體之產率增加超過其他不需要之終產物（諸如同質二聚 體）的機制。 雙特異性抗體包括交聯或"異質結合物"抗體。舉例而 言’異質結合物中抗體中之一者可與抗生物素蛋白偶合， 另一者可與生物素偶合。舉例而言，已提出該等抗體使免 疫系統細胞靶向不需要之細胞（美國專利第4,676,98〇號），
且用於治療 HIV 感染（WO 91/00360、WO 92/200373 及 EP 03089) ^異質結合物抗體可使用任何便利交聯方法來製 造。合適之交聯劑在此項技術中係熟知的，且與許多交聯 技術一起揭示於美國專利第4,676,98〇號中。 用於自抗體片段產生雙特異性抗體之技術亦已描述於文 獻中。舉例而言，雙特異性抗體可使用化學鍵聯來製備。 Brennan等人，Science 229:81 (1985)描述一種將完整抗體 蛋白分解裂解以產生F(abi)2片段之程序。在二硫醇錯合劑 亞砷酸鈉存在下將此等片段還原以使鄰近二硫醇穩定且阻 止形成分子間二硫鍵。接著將所產生之Fab，片段轉化為硫 代硝基苯甲酸酯（TNB)衍生物。接著藉由用毓基乙胺還原 將Fab’-TNB衍生物之一者再轉化為Fab，_硫醇且將其與等莫 耳量之另一 Fab,-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所 產生之雙特異性抗體可用作選擇性固定酶之藥劑。 132799.doc •196· 200918089 最新發展有助於自大腸桿菌直接回收Fab,_SH片段，可 以化學方法使該等片段偶合以形成雙特異性抗體。 Shalaby等人，J. Exp. Med. 175: 217_225 (1992)描述完全 人類化雙特異性抗體F(ab，）2分子之製造。每一Fab，片段自 大腸桿菌獨立分泌且使其經受活體外定向化學偶合以形成 雙特異性抗體。由此形成之雙特異性抗體能夠與過表現 ErbB2文體之細胞及正常人類τ細胞結合，且誘發人類細胞 毋性淋巴細胞針對人類乳腺腫瘤乾之溶解活性。 亦已描述用於直接自重組細胞培養物製造及分離雙特異 性抗體片段之各種技術。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈製 造雙特異性抗體。Kostelny等人，j. lmmunol> 148(5):1547-15 53 (1992)。藉由基因融合將來自Fos及jun 蛋白之白胺酸拉鏈肽連接於兩個不同抗體之Fab，部分。於 鉸鏈區還原抗體同質二聚體以形成單體且接著再氧化以形 成抗體異質二聚體。此方法亦可用於製造抗體同質二聚
體。由 Hollinger 等人 ’ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)所述之n雙功能抗體"技術已提供一種 用於製造雙特異性抗體片段之替代性機制。該等片段包含 藉由過短而使得同一鏈上之兩個域間無法配對的連接子連 接於VL之VH。因此，迫使一個片段之\^及乂1域與另一片 丰又之互補V l及V η域配對，由此形成兩個抗原結合位點。亦 已報導另一種藉由使用單鏈Fv(sFv)二聚體製造雙特異性抗 體片#又之朿略。參見Gruber等人’ J. Immunol” 152:5368 (1994)。 132799.doc -197- 200918089 本發明涵蓋具有2以上之價數之抗體。舉例而言，可製 備二特異性抗體。Tutt 等人 ’ J. Immunol. 147.60 (1991) 6. 異質結合物抗體 異質結合物抗體亦在本發明之範疇内。異質結合物抗體 係由兩個共價連接之抗體構成。舉例而言，已提出該等抗 體使免疫系統細胞靶向不需要之細胞[美國專利第 4,676,980號]，且用於治療HIV 感染[w〇 91/〇〇36〇 ; 92/200373 ;及EP 03089]。預期可使用合成蛋白質化學中 之已知方法（包括涉及交聯劑之彼等者）在活體外製備抗 體。舉例而言，免疫毒素可使用二硫鍵交換反應或藉由形 成硫醚鍵來建構。出於此目的，合適之試劑之實例包括亞 胺基硫醇鹽及甲基-4-巯基丁醯亞胺及例如美國專利第 4,676,980號中所揭示之彼等者。 7. 多價抗體 多價抗體可藉由表現抗體所結合之抗原的細胞快於二價 抗體内在化（及/或異化本發明之抗體可為具有三個或三 個以上抗原結合位點之多價抗體（例如，四價抗體）（其不同 於I g Μ類）’其可谷易地藉由編碼抗體之多肤鍵之核酸的重 組表現來產生。多價抗體可包含二聚化結構域及三個或三 個以上抗原結合位點。較佳二聚化結構域包含Fc區或鉸鏈 區（或由其組成）。在此情況下，抗體將包含Fc區及位於該 Fc區之胺基末端的三個或三個以上抗原結合位點。本文中 之較佳多價抗體包含三個至約八個（但較佳四個）抗原結合 位點（或由其組成）。多價抗體包含至少一個多肽鏈（且較佳 132799.doc -198· 200918089 兩個多肽鏈）’其中該（等）多肽鏈包含兩個或兩個以上可變 域。舉例而言，多肽鏈可包含VD1_(xl)n_VD2_(X2)n_Fe， 其中VD1為第一可變域，VD2為第二可變域，卜為卜區之 一個多肽鏈，XI及X2表示胺基酸或多肽，且n為。舉 例而言，多肽鏈可包含：VH-CH1-可撓性連接子_VH_CH1_ Fc區鏈’或VH-CH1-VH-CH1 -Fc區鏈。本文中之多價抗體 較佳進一步包含至少兩個（且較佳四個）輕鏈可變域多肽。 本文中之多價抗體可（例如）包含約兩個至約八個輕鍵可變 域多肽。本文中所涵蓋之輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域 且視情況進一步包含CL域。 8.效應功能工程化 可希望就效應功能而言修飾本發明之抗體，例如以便增 強抗體之抗原依賴性細胞介導細胞毒性（ADCC)及/或補體 依賴性細胞毒性（CDC)。此可藉由將一或多個胺基酸取代 引入抗體之Fc區中來達成。或者或另外，可將半胱胺酸殘 基引入Fc區中’藉此允許此區内形成鏈間二硫鍵。由此產 生之同質二聚抗體可具有改善之内在化能力及/或增加之 補體介導細胞殺死及抗體依賴性細胞細胞毒性（ADCC)。 參見 Caron 等人，J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)及 Shopes，B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)。抗腫瘤活 性增強之同質二聚抗體亦可使用如Wolff等人，Cancer Research 53:2560-2565 (1993)中所述之異型雙官能交聯劑 來製備。或者，抗體可經工程化具有雙Fc區且進而可具有 增強之補體溶解及ADCC能力。參見Stevenson等人，Anti- 132799.doc -199- 200918089
Cancer Dag Design 3:2〗9_23〇 (〗989)。為增加抗體之血 /月半衰期，吾人可將補救受體結合抗原決定基併入抗體 (尤其抗體片段）中’例如美國專利5,739,277中所述。如本 文所使用，術語"補救受體結合抗原決定基"係指負責增加 IgG分子之活體内血清半衰期的IgQ分子（例如、 IgG2、IgG3或IgG4)之Fc區之抗原決定基。 9.免疫結合物 本發明亦係關於免疫結合物（可互換地稱為"抗體_藥物結 合物”或"ADC”）’其包含與諸如化學治療劑、生長抑制 劑、毋素（例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性 t素，或其片段）或放射性同位素（亦即，放射性結合物）之 細胞毒性劑結合之抗體。 在某些實施例中，免疫結合物包含抗體及化學治療劑或 他毒素。適用於產生該等免疫結合物之化學治療劑已在 上文描述。可使用之酶促活性毒素及其片段包括白喉A 鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素（ex〇t〇xin)A鏈 (來自綠膿桿菌（八⑽似、篦麻毒素A 鏈、相思豆毒素（abrin)A鏈、莫迪素（m〇deecin)A鏈、心帚 麴菌素（sarcin)、油桐如/0成〇蛋白、康乃馨蛋 白、洋商陸⑽⑺·蛋白（ρΑρι、ρΑρι工及 pap-s)、苦瓜…山·仏以謝⑷抑制劑、麻楓樹蛋白 (⑽_ 、巴豆毒素（cr〇tin)、肥皂草（sap_aria officinalis)抑制劑、天堂果蛋白（gei〇nin)、有絲分裂素、 侷限麴®素卜如士⑽⑷、酚黴素（phen〇myein)、伊諾黴素 132799.doc -200- 200918089 (enomycin)及黴菌毒素（tricothecene)。各種放射性核種可 用於製造放射性結合抗體。實例包括212Bi、131I、i3]In、 90Y及186Re。使用各種雙官能蛋白質偶合劑來製造抗體與 細胞毒性劑之結合物’該等蛋白質偶合劑諸如：N- 丁二釀 亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇）丙酸酯（SPDP)、亞胺基硫雜環 戊烷（IT)、亞胺基酯之雙官能衍生物（諸如己二亞胺二甲能 鹽酸鹽（dimethyl adipimidate HCL))、活性酯（諸如辛二酸 二丁二醯亞胺酯）、醛（諸如戊二醛）、雙疊氮基化合物（諸 ( 如雙（對疊氮基苄醯基）己二胺）、雙重氮鏽衍生物（諸如雙· (對重氮鏽苄醯基）-乙二胺）、二異氰酸酯（諸如曱苯2,6_二 異氰酸酯）及雙活性氟化合物（諸如1，5-二氟-2,4-二硝基 苯）。舉例而言，篦麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人， Science，238: 1098 (1987)中所述來製備。經碳14標記之s 異硫氰酸根苄基-3 -曱基二伸乙三胺五乙酸（MX-DTPA)為用 於使放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參見w〇 94/11026。 抗體與一或多個小分子毒素及此等毒素之具有毒素活性 之衍生物的結合物亦涵蓋於本文中’該等毒素諸如卡奇黴 素、奥瑞他汀肽（諸如單甲基奥瑞他汀（MMAE)(海兔毒素 之合成類似物））、美登素類（諸如DM1)、曲可辛 (trichothene)及 CC1065。 例示性免疫結合物-抗體-藥物結合物 本發明之免疫結合物（或”抗體-藥物結合物”（"ADC"))可 為以下式I，其中抗體經由可選連接子與一或多個藥物 132799.doc -201 - 200918089 共價連接）。ADC可包括thioMAb藥物
Ab-(L-D)p 1
"亥抗體可直接或經由連接子與藥物結合。在式I 中’P為每抗體藥物部分之平均數，其範圍可例如為每抗 體約1個至約20個藥物邱公， 、物口p刀且在某些實施例中範圍為每 抗體1個至約8個藥物部分。本發明包括-種包含式!之抗
體藥物化σ物之混合物的組合物，其中每抗體平均藥物 負荷為約2至約5，或約3至約4。 a.例示性連接子
部分（D)結合（亦即 結合物（”TDCn)。 連接子可包含—或多個連接子組分。例示性連接子組分 包括6-順丁烯二醯亞胺基己醯基、順丁烯二醯亞胺 基丙醯基（"MP")、纈胺酸_瓜胺酸（，，val_citl，或ί、丙胺 酸-苯丙胺酸（"ala-phe”）、對胺基节氧羰基（"pAB")及由與 下列連接子試劑結合所產生之彼等者：4_(2_吡啶基硫基） 戊酸N·丁二醯亞胺酯（"spp")、4·(Ν_順丁烯二醯亞胺基甲 基）環己烷-1曱酸Ν-丁二醯亞胺酯（”SMCC”，本文中亦稱為 ” MCC")及（4-碘-乙醯基）胺基苯甲酸N_ 丁二醯亞胺酯 ("SIAB”）。各種連接子組分在此項技術中係已知的，其中 一些描述在下文中描述。 連接子可為"可裂解連接子"，其有助於藥物在細胞中釋 放。舉例而言’可使用酸不穩定性連接子（例如，腙）、蛋 白酶敏感性（例如’肽酶敏感性）連接子、光不穩定性連接 132799.doc •202- 200918089 子、二甲基連接子或含有二硫鍵之連接子（Chari等人，
Cancer Research 52:127-131 (1992);美國專利第5,2〇8,020 號）。 在某些實施例中，連接子係以以下式II所示： —Aa—WW—Yy- 其中A為延展基（stretcher)單元，且a為0至1之整數；w為 胺基酸單元，且W為〇至12之整數，γ為間隔基單元，且y 為0、1或2 ;且Ab、D及p係如上文對於式丨所定義。該等連 接子之例示性實施例係描述於US 2005-0238649 A1中，該 案明確地以引用的方式併入本文中。 位點）。 在一些實施例中’連接子組分可包含使抗體連接於另— 連接子組分或藥物部分之"延展基單元"。例示性延展基單 及*展不於下文中（其中波形線指示連接至抗體之共價連接
132799.doc 200918089
ο 在一些實施例中，連接子組分可包含胺基酸單元。在一 此類實施例中，胺基酸單元允許連接子由蛋白酶所裂解， 藉此有助於在暴露於細胞内蛋白酶（諸如溶酶體酶）後自免 疫結合物釋放藥物。參見例如D〇r〇nina等人（2003) 21:778-784。例示性胺基酸單元包括（但不限 於）二肽、三肽、四肽及五肽。例示性二肽包括：纈胺酸_ 瓜胺酸（vC或Val-Cit)、丙胺酸-苯丙胺酸（af或ala_phe)、苯 丙胺酸-離胺酸（fk或phe-lys)或N-甲基-纈胺酸_瓜胺酸（Me_ val-cit)。例示性三肽包括：甘胺酸-纈胺酸_瓜胺酸（giy_ val-cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸（gly_gly_gly)。胺基酸單 元可包含天然存在之胺基酸殘基，以及次要胺基酸及非天 然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。可對胺基酸單元進 行设s十且最優化其選擇性以便由特定酶（例如腫瘤相關蛋 白酶、組織蛋白酶B、C及D或纖溶酶蛋白酶;)酶促裂解。 在一些實施例中，連接子組分可包含使抗體直接或經由 延展基單元及/或胺基酸單元連接於藥物部分之"間隔基"單 元間隔基單元可為''自我犧牲型（self-immolative)”或，，非 自我犧牲型”。"非自我犧牲型"間隔基單元為在ADC之酶 132799.doc -204- 200918089 =:蛋白水解)裂解後間隔基單元之部分或全部保持結 :系物部分之間隔基單元。非自我犧牲型間隔基單元之 實'包括(但不限於)甘胺酸間隔基單元及甘胺酸-甘胺酸間 隔基早疋。亦涵蓋對序列特異性酶促裂解敏感之肽間隔基 之其他組合。舉例而言，腫瘤細胞相關蛋白酶對含有甘胺 酸-甘胺酸間隔基單元之ADC的酶促裂解將導致自綱之 剩餘部=釋放甘胺酸甘胺酸-藥物部分。在-此類實施例 r 中接著甘胺酸-甘胺酸·藥物部分在腫瘤細胞中經受獨立 水解步驟，由此自藥物部分裂解甘胺酸_甘胺酸間隔基單 元0 自我犧牲型間隔基單元允許在無獨立水解步驟之情況 下釋放藥物部分。在某些實施例中，連接子之間隔基單元 包含對胺基$基單元。在-此類實施例中，對胺基节醇經 由醯胺鍵連接於胺基酸單元，且在料與細胞毒性劑之間 形成胺基甲酸酯、甲基胺基甲酸酯或碳酸酯。參見（例 如）Hamann等人（2005)仏户州办化以以户价价（2〇〇5) 15:1087-1 1G3。在-實施例中，$隔基單元為對胺基节氧 羰基（PAB)。在某些實施例中，對胺基苄基單元之伸苯基 部分經Qm取代，其中烷基、_〇_(Ci_C8烷基）、 -鹵素、·硝基或-氰基；且111為範圍為〇_4之整數。自我犧牲 型間隔基單元之實例進一步包括（但不限於）在電子學上類 似於對胺基苄醇之芳族化合物（參見例如us 2〇〇5/〇256〇3〇 A1)，諸如2-胺基咪唑_5_甲醇衍生物（Hay等人（1999) 扪⑽W C/zem· Im· 9:2237)及鄰胺基苄基縮醛或對胺 132799.doc - 205 - 200918089 基苄基縮醛。可使用在醯胺鍵水解後經歷環化之間隔基， 諸如經取代及未經取代之4-胺基丁酸醯胺（Rodrigues等 人，C/zembiry价〇/〇尽少，1995，2, 223);適當地經取代之雙 環[2.2.1]及雙環[2.2.2]環系統（81;〇1'111等人，>/.^477^广.0/26»7. •Soc.，1972，94，5815);及 2-胺基苯基丙酸醯胺（Amsberry 等 人，丄Org. C/zem·，1990，55，5867)。於甘胺酸之α位置處 經取代之含胺藥物的消除（Kingsbury等人，Mec/. C/zem., 1984，27，1447)亦為適用於ADC之自我犧牲型間隔基之實 (例。 在一實施例中’間隔基單元為如下文所述之支鏈雙（經 甲基）苯乙烯（BHMS)單元，其可用於合併及釋放多個藥 物。
酶促裂解 其中 基； 2個藥物Q為-Ci-Cg烧基、-〇_cc r1 h 甘、 上 * (1-CS烧基）、-鹵素、-硝基或-氰 m為範圍為0-4之整數 20 〇 n為0或1 ;且p範圍為1至約 在另一實施例中，連接早τ 、 关于L可為用於經由分枝、多官能 連接子部分使一個以上藥物 樂物。卩分共價連接於抗體之樹枝型 132799.doc -206 - 200918089 連接子（Sun 等人（2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215 ; Sun 等人（2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768)。樹枝狀連接子可增加 藥物與抗體之莫耳比率，亦即負荷，其與ADC之效能有 關。因此，當半胱胺酸工程化抗體僅帶有一個反應性半胱 胺酸硫醇基時，許多藥物部分可經由樹枝狀連接子連接。 在式Π之ADC之情況下，例示性連接子組分及其組合展 不於下文中：
MC-val-cit 〇 >^D P HN- o^nh2
Val-Cit 或VC
MC-val-cit-PAB 132799.doc -207- 200918089 包括延展基、間隔基及胺基酸單元之連接子組分可藉由 此項技術中已知之方法來合成，諸如仍2嶋_〇238649 中所述之彼等者。 b·例示性藥物部分 登資及4登痹 在二實施例中，免疫結合物包含與一或多個美登素類 分子結合之抗體。美登素類為有絲分裂抑制劑，其藉由抑 制微管蛋白聚合而起作用。美登素最初係自東非灌木齒葉 ί 美登木（Mayknus serrata)中分離得之（美國專利第3896lu 號）。隨後，發現某些微生物亦產生美登素類，諸如美登 醇（maytansinol)及c_3美登醇酯（美國專利第4，i5i，〇42號）。 合成美登醇及其衍生物與類似物（例如）揭示於美國專利第 4，137,230 號；第 4,248,870 號；第 4,256,740 號；第 4,260,608 號；第 4,265,814 號；第 4,294,757 號；第 4,307,016 號；第 4,308,268 號；第 4,308,269 號；第 4,309,428 號；第 4,313,946 號；第 4,315,929 號；第 p I 4,317,821 號；第 4,322,348 號；第 4,331，598 號；第 4,361，650 號；第 4,364,866 號；第 4,424,219 號；第 4,450,254號；第 4,362,663號；及第 4,371，533號中。 美登素類藥物部分為抗體-藥物結合物中有吸引力之藥 物部分’此係因為其：（i)可相對容易地藉由醱酵或醱酵產 物之化學修飾或衍生來製備；（ii)易被衍生化而具有適合 於經由二硫鍵及非二硫鍵連接子與抗體結合之官能基； (iii)在血漿中穩定；且（iv)有效抵抗各種腫瘤細胞株。 132799.doc -208- 200918089 適合用作美登素類樂物部分之美登素化合物在此項技術 中係熟知的且可根據已知方法自天然來源分離或使用遺傳 工程化及醱酵技術產生（US 6790952 ; US 2005/0170475 ; Yu等人（2002) PNAS 99:7968-7973)。美登醇及美登醇類似 物亦可根據已知方法合成製備。 例示性美登素類藥物部分包括具有經修飾之芳族環之彼 等者’諸如：C-19-脫氯（美國專利第4256746號）（藉由美登 木素（ansamytocin)P2之氫化鋁鋰還原來製備）；c_2〇_羥基 (或(：-20-脫曱基）+/-(：-19-脫氯（美國專利第43 61650號及第 43 07016號）（藉由使用鏈黴菌⑼叫仏⑽㈣）或放線菌 〇4如《⑽脫甲基或使用LAH脫氯來製備）；及c_2〇_脫 甲氧基、C-20-醯氧基（-〇c〇R)、+/_脫氣（美國專利第 4,294,75 7號）（藉由使用醯基氯醯化來製備），以及於其他位 置處具有修飾之彼等者。 例示性美登素類藥物部分亦包括具有諸如以下之修飾的 彼等者：C-9-SH(美國專利第4424219號）（藉由使美登醇與 Ηβ或Pd5反應來製備）；C-14-貌氧基甲基（脫甲氧基/ CH2OR)(US 4331598) ; C-14-羥甲基或醯氧基甲基（CH2〇h 或CH2〇Ac)(美國專利第4450254號）（自奴卡菌（N〇cardia)製 備），C-15-羥基/醯氧基（US 4364866)(藉由以鏈黴菌使美登 醇轉化來製備），C-15 -曱氧基（美國專利第43 13 94 6號及第 43 15929 號）（自滑桃樹（Trewia nudlflora)分離）；C-18-N-脫 甲基（美國專利第4362663號及第4322348號）(藉由以鏈黴菌 使美登醇脫甲基來製備）；及4,5-脫氧基（US 4371533 )(藉由 132799.doc -209- 200918089 美登醇之三氣化鈦/LAH還原反應來製備）。 已知美登素化合物上之許多位置適用作鍵聯位置，此視 連接類型而I舉例而言，對於形成自旨鍵而言，具有經基 之C-3位置、經經甲基修飾之c_14位置、經經基修飾之c_ μ位置及具有經基之C_2G位置均為合適的（us 52_〇;
Us 7368565 ； US US RE39151 ； US 6913748 2006/0167245 ; US 2007/0037972)。 美登素類藥物部分包括具有以下結構之彼等者：
其中波形線指示美登素類藥物部分之硫原子至ADC之連接 子的共價連接。R可獨立地為H4Ci_C0烷基。使醯胺基團 連接於硫原子之伸烷基鏈可為亞甲基、伸乙基或伸丙基， 亦即 m為 1、2 或 3(US 633410 ; US 5208020 ; US 7276497 ; Chari 等人（1992) 心义 52:127-131 ; Liu 等人（1996) dcac/· «SW 93:8618-8623)。 本發明之化合物涵蓋美登素類藥物部分之所有立體異構 體，亦即D之對掌性碳處之及與$構型的任何組合。在一實 施例中，美登素類藥物部分將具有下列立體化學結構： 132799.doc -210- 200918089 ch3o
DM1 DM3及 美登素類藥物部分之例示性實施例包括 DM4，其具有以下結構：
132799.doc 211 - 200918089
ChU
其中波形線指示藥物之硫原子至抗體-藥物結合物之連接 子（L)的共價連接。2005/037992 ; US 2005/0276812 A1)。 其他例不性美登素類抗體-藥物結合物具有以下結構及 縮寫（其中Ab為抗體且1)為丨至約8): 132799.doc
ch30、/
Ab -SPP-DM1 •212- 200918089
Ab-SPDB-DM4 c
NIH
b A
Ab-SMCC-DMl 例示性抗體-藥物結合物（其中DM1經由BMPEO連接子連 接於抗體之硫醇基）具有以下結構及縮寫： 132799.doc 213- 200918089
其中Ab為抗體；η為〇、1或2;且p為1、2、3或4。 含有美登素類之免疫結合物、製造其之方法及其治療用 f 、 V 途係（例如）揭示於Erickson等人（2006)Cancer Res. 66(8):4426-4433 ;美國專利第 5,2〇8,〇20號、第 5,416,064 號、US 2005/0276812 A1及歐洲專利EP 0 425 235 B1 中， 该等文獻之揭示内容明確地以引用的方式併入本文中。 抗體-美登素類結合物係藉由以化學方法使抗體連接於 美登素類分子但不顯著減小抗體或美登素類分子之生物活 性來製備。參見（例如）美國專利第5,2〇8,〇2〇號（其揭示内容 (曰月確地以引用的方式併入本文中）。美登素類可藉由已知 技術合成或自天然來源分離。合適之美登素類係（例如）揭 讀美國專利第5,208，()2()號以及上文所提及之其他專利及 非專利公開案中，諸如美登醇及於芳族環中或於美登醇分 ^ ”他位置處經修飾之美登醇類似物，諸如各種美登醇 此項技術中已知存在有件絲 ^ ^ 于牡有許夕鍵聯基團用於製造抗） 五素類結合物，句社“ .lJ〇 ,〇 (门如）美國專利第5208020號或歐 利 〇 425 235 B1 ;〜巧 寻人 Cancer Researcfj 52.Λ2' 132799.doc -214- 200918089
(1992);及 US 2005/016993 A1 中所姐 _ ^ A 中所揭不之彼等者，該等文 獻之揭示内容明確地以引用的方式併入本文中。包含連接 子組，SMCC之抗體-美登素類結合物可如us 2〇〇5助68 i 2
Al ’ Antibody-drug conjugates and Methods” 巾所揭示來 裝備。該等連接子包含二硫基、硫醚基團、酸不穩定性基 團、光不穩定性基團、肽酶不穩定性基團或酉旨酶不穩定性 基團，如上文確定之專利中所揭示。本文中描述及例示其 他連接子。 可使用各種雙官能蛋白質偶合劑來製造抗體與美登素類 之結合物，該等蛋白質偶合劑諸如冰丁二醯亞胺基·3_(2_ 吡啶基二硫基）丙酸酯（SPDp)、丁二醯亞胺基_4·(ν_順丁烯 二醯亞胺基曱基）環己烷甲酸酯（SMCC)、亞胺基硫雜環 戊烷（IT)、亞胺基酯之雙官能衍生物（諸如己二亞胺二曱酯 鹽酸鹽）、活性酯（諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯）、醛（諸如 戊二醛）、雙疊氮基化合物（諸如雙（對疊氮基苄醯基）己二 胺）、雙重氮鏽衍生物（諸如雙_(對重氮鏽苄醯基）_乙二 胺）、二異氰酸酯（諸如甲苯2,6-二異氰酸酯）及雙活性氟化 合物（諸如1,5 -一敗-2，4-二琐基苯）。在某些實施例中，偶 合劑為N- 丁二醯亞胺基_3_(2_吡啶基二硫基）丙酸酯 (SPDP)(Carlsson等人，隱《/. 173:723-737 (1978))或 N- 丁二醯亞胺基-4-(2-吡啶基硫基）戊酸酯（SPP)以提供二硫 鍵。 連接子可於各種位置處連接於美登素類分子，此視連接 類型而疋。舉例而言，|旨鍵可藉由使用習知偶合技術與經 132799.doc •215- 200918089 基反應來形成。該反應可於具有經基之C-3位置、經經甲 基修飾之C-14位置、經羥基修飾之C-15位置及具有羥基之 C-20位置處發生。在一實施例中，於美登醇或美登醇類似 物之C-3位置處形成鍵聯。 (2)奥瑞他汀及海兔毒素 在一些實施例中’免疫結合物包含與海兔毒素或海兔毒 素肽類似物或衍生物（例如’奥瑞他汀（美國專利第5635483 號；第5780588號））結合之抗體。已顯示海兔毒素及奥瑞他 汀干擾微管動力學特性、GTP水解以及核及細胞分裂 (Woyke 等人（2〇〇l)J/7".mz.cr0Z). anof C/jewoi/zer. 45 (12).3580-3584)且具有抗癌活性（美國專利第5663149號）及 抗真菌活性（Pettit等人（1998)如如z.cro^ Agents CTzemoAer. 42:2961-2965)。海兔毒素或奥瑞他汀藥物部分 可經由肽藥物部分之N(胺基）末端或C(缓基）末端連接於抗 體（WO 02/088172)。 例示性奥瑞他汀實施例包括N末端連接之單曱基奥瑞他 汀藥物部分DE及DF(US 2005/0238649，揭示於2〇〇4年3月 28 曰提出之 Senter 等人 ’ Proceedings 〇f the American Association for Cancer Research，第 45卷，摘要編號623 中，該文獻之揭示内容明確地以全文引用的方式併入本文 中）u 肽藥物部分可選自以下式DE及式DF之部分·· 132799.doc -216- 200918089 人
Ν— R
3 R
R1 9 R— Ν de
Ν— R
ο ΗΝ
ο
R——N
R11 \ z ο οR1 df 其中DE及DF之波形線指示連接至抗體或抗體-連接子組分 之共價連接位點，且在各位置處以下情況為獨立的。 R2係選自11及<^-(：8烷基； R3係選自Η、CVC成基、C3_Cs碳環、芳基、LG院基_ 芳基、Cl-c8烧基-(c3-c8碳環）、C”C8雜環及c (c3-c8雜環）； R4係選自H、Cl-C8燒基、μ碳環、芳基、 芳基、c丨-c8炫基-((Vc8碳環） ^ 1 8’元土 (c3-c8雜環C3%雜環及Cl-C8院基- R5係選自Η及甲基； 或R4與R5共同形成碳環且具有 心蜀立地選自H、Cl^基及 U·，其㈣及 4、5及6 ; 8久娘且11係選自2、3、 R6係選自Η及C〗-C8烷基； R7係選自 H、Cl-c^;、C3_C8雙環一 芳基、C〗-C8烧基-(C3-c8碳環）、c '基、CrC8院基_ 3~c*雜環及Cl-C8烷基- I32799.doc ·217· 200918089 (c3-c8雜環）； C3_C8碳環及〇_ R8各自獨立地選自Η、OH、Ci_c8烷基 (Ci-Cs烧基）； R9係選自Η&(ν(：8烷基； R10係選自芳基或c3-c8雜環； Z為0、S、NH或NR'其中r、Ci_C8烧基； R11係選自H、Cl-c2。烧基、芳基、C3_C· R14或-(R丨30)m_CH(R]5)2; 1 〇)m
m為範圍為ι_ι000之整數； Rl3為C2-C8烷基； R14為Η或Cl-C8烷基； R15在 N(R,6)2、 R16在 COOH ； 每次出現時獨立地為Η、c〇〇H、 -(CH2)n-S03H 或-(CH2)n_s〇3_Ci_C8烧基； ~(CH2)n- 每次出現時獨立地為Η
Ci_C8 烷基或-(CH2)n- ( R 係選自-c(r8)2-C(R8)2_芳基、c(r8)2-C(r8)2_⑷3_c8雜 環）及-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳環）；且 η為範圍為0至6之整數。 在厂實施例中，R3、RW獨立地為異丙基或第二丁基 且R5為-H或曱基。在—例示性實施例中，尺3及尺4各自為異 丙基，R5為-H，且R7為第二丁基。 、 在又-實施例中，R\r6各自為甲基且r、_h。 在又一實施例中，R8在每次出現時為_〇CH3。 在—例^性實施例中’ R3及以自為異丙基，以作 132799.doc -218- 200918089 自為曱基，R5為-H，R7為第二丁基，R8在每次出現時為 -OCH3，且 R9為-H。 在一實施例中，。 在一實施例中’ R10為芳基。 在一例示性實施例中，R10為-苯基。 在一例示性實施例中，當Z為-〇_時，、曱基或 第三丁基。 在一實施例中’當Z為-NH時，R11為-CH(R15)2，其中R15 為-(CH2)n-N(R16)2，且尺“為^心烷基或 _(CH2)n_c〇〇H。 在另一實施例中，當Z為-NH時，R"為-CH(R15)2，其中 R15為-(CH2)n-S03H。 式de之一例示性奥瑞他汀實施例為MMAE，其中波形線 指示連接至抗體-藥物結合物之連接子（L)的共價連接：
MMAE 式DF之一例示性奥瑞他汀實施例為MMAF ’其中波形線 指示連接至抗體·藥物結合物之連接子（L)的共價連接（參見 US 2005/0238649 及 Doronina 等人（2006) A’ocoWwgaie Chem. 17:114-124)： 132799.doc -219- 200918089
MMAF 其他例示性實施例包括於五肽奥瑞他汀藥物部分之C末 端處具有苯丙胺酸羧基修飾的單甲基纈胺酸化合物（WO 2007/008848)及於五肽奥瑞他汀藥物部分之C末端處具有 苯丙胺酸側鏈修飾的單曱基纈胺酸化合物（WO 2007/008603) ° 其他藥物部分包括下列MMAF衍生物，其中波形線指示 連接至抗體-藥物結合物之連接子（L)的共價連接：
132799.doc -220- 200918089 1 ο Ο
132799.doc -221 - 200918089
在一態樣中，如上所示，包括（但不限於）三乙二醇酯 (TEG)之親水性基團可連接於藥物部分之R"處。在不受任 何特定理論約束之情況下，親水性基團有助於藥物部分之 内在化及不聚結。 包含奥瑞他汀/海兔毒素或其衍生物之式I之ADC的例示 性實施例係描述於US 2005-0238649及Doronina等人 (2006)价〇<:〇?7_/叹〇^(：/^所.17:114-124中，該等文獻明確地 以引用的方式併入本文中。包含MMAE或MMAF及各種連 接子組分之式I之ADC的例示性實施例具有下列結構及縮 寫（其中"Ab"為抗體；p為1至約8，" vai_cit"或’’ve"為绳胺 酸-瓜胺酸一肽，且"S"為硫原子）。應注意，在本文中硫連 接之ADC之某些結構描述中，抗體僅以”Ab_s"表示以指示 硫連接特徵而不指示特定硫原子帶有多個連接子_藥物部 分。下列結構之左括號亦可置於硫原子之左側，介於八1)與 s之間，此將為本文通篇所述之本發明之ADC的等同描 述0
Ab-MC-vc-PAB-MMAF 132799.doc -222- 200918089
Ab-MC-MMAF 包含MMAF及各種連接子組分之式I之ADC的例示性實施 例進一步包括 Ab-MC-PAB-MMAF及 Ab-PAB-MMAF。有趣 地是，已顯示包含藉由不可蛋白水解裂解之連接子連接於 抗體之MMAF的免疫結合物具有與包含藉由可蛋白水解裂 解之連接子連接於抗體之MMAF的免疫結合物相當之活 性。參見 Doronina 等人（2006) A’occmj’Mg'aie C/?ew. 17:114-1 24。在該等情況下，咸信，藉由抗體在細胞中降解來實 現藥物釋放。同前。 通常，基於肽之藥物部分可藉由在兩個或兩個以上胺基 酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備。該等肽鍵可例如根 據肽化學領域中眾所周知之液相合成方法（參見E. Schr6der 132799.doc -223 - 200918089 及 K. Liibke，"The Peptides"，第 1卷，第 76-136 頁，1965, Academic Press)來製備。奥瑞他汀/海兔毒素藥物部分可根 據下列文獻之方法來製備：US 2005-0238649 A1 ;美國專 利第5635483號；美國專利第5780588號；Pettit等人（1989) «/. dm. C/zew. iSoc. 1 11:5463-5465 ; Pettit等人（1998)4«"-Cawcer . Design 13:243-277 ; Pettit, G.R·，等人
Synthesis, 1 996，719-725 ; Pettit 等人（1 996)乂 C/zem. Perkin Trans. 1 5:859-863 ；及 Doronina (2003) Nat.
Biotechnol. 2\(jy.TT名-Ί名A ° 詳言之，式DF之奥瑞他汀/海兔毒素藥物部分（諸如 MMAF 及其衍生物）可使用 US 2005-0238649 A1 及 Doronina 等人（2006) C/zem. 17:114-124 中所述之方法 來製備。式DE之奥瑞他汀/海兔毒素藥物部分（諸如MMAE 及其衍生物）可使用Doronina等人（2003) TVai. 21:778-784中所述之方法來製備。藥物-連接子部分]^0 MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF 及 MC-vc-PAB， ΜΜΑΕ可方便地藉由常規方法合成，例如Doronina等人 (2003) iVai.价oiec/z. 21:778-784及專利申請公開案第US 2005/0238649 A1號中所述，且接著與所關注之抗體結 合0 (3)卡奇擻素 在其他實施例中，免疫結合物包含與一或多個卡奇黴素 分子結合之抗體。卡奇黴素抗生素家族能夠於亞皮莫耳濃 度下產生雙股DNA斷裂。關於卡奇黴素家族之結合物之製 132799.doc •224- 200918089 備，參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第 5,739，116 號、第 5,767,285 號、第 5,770,701 號、第 5,770,710 號、第 5,773,001 號、第 5,877,296 號（均來自 American Cyanamid Company)。可使用之卡奇黴素之結構 類似物包括（但不限於）γ/、（X21、a/、N-乙醯基-γ/、PSAG 及 Θ jHinman 等人，Career iJesearc/z 53:3336-3342 (1993) ; Lode 等人，Cwcer 及以〜厂以 58:2925-2928 (1998);及American Cyanamid之上述美國專利）。抗體可 與之結合之另一抗腫瘤藥物為qFA，其為抗葉酸物。卡奇 黴素與QFA兩者皆具有細胞内作用位點且不容易穿越質 膜。因此’此等藥劑經由抗體介導性内在化之細胞吸收大 大增強其細胞毒性效應。 c.其他細胞毒性劑 可與抗體結合之其他抗腫瘤劑包括BCNU、鏈佐星、長 春新驗及5-敦尿嘧啶、統稱為LL_E33288複合物之藥劑家 族（美國專利第5，G53,394號、第5,770,710號中所述）以及埃 斯培拉黴素（美國專利第5,877,296號）^ 可使用之酶促活性毒素及其片段包括白喉Λ鏈、白喉毒 2之非結合活性片段、外毒素Α鍵（來自綠腹桿菌）、說麻 毋素鏈相心豆毒素A鏈、莫迪素a鏈、α_帚麴菌素、油 桐蛋白、康乃馨蛋白、洋商陸蛋白（ΡΑΡΙ、ΡΑΡΙΙ及ΡΑΡ-^古瓜抑制劑、麻楓樹蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制 劑天至果蛋白、有絲分裂素、侷限麴菌素、酚黴素、伊 諾黴素及黴菌毒音。來
母畜參見例如1993年1 〇月28日公開之WO 132799.doc -225- 200918089 93/21232 。 本發明進—步涵蓋在抗體與具有溶核活性之化合物（例 如核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，諸如脫氧核糖核酸酶； DNase)之間形成的免疫結合物。 在某些實施例中’免疫結合物可包含高放射性原子。各 種放射性同位素可用於製造放射性結合抗體。實例包括 At21】、ΐΠ1、1125、Y9。、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、 Pb212及Lu之放射性同位素。當免疫結合物用於偵測時，其 可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如tc"m或 12 3 1 ’或用於核磁共振（NMR)成像（亦稱為磁共振成像， mri)之自紅標記，諸如埃_i23、埃-13 1、銦-1 Π、氟_丨9、 碳-1 3、氮-1 5、氧-1 7、釓、錳或鐵。 放射性標記或其他標記可以已知方式併入免疫結合物 中。舉例而言，肽可用生物學方法合成或可藉由化學胺基 酸合成使用包含（例如）氟_19以替代氫之合適胺基酸前驅體 來合成。諸如tc99%iUm、Rem、Rem及Inm之標記可經 由肽中之半胱胺酸殘基連接。釔_9〇可經由離胺酸殘基連 接。IODOGEN 方法（Fraker 等人（1978) 心父C㈣所⑽· 80: 49-57)可用於合併碘]23。”M〇n〇cl〇nal
Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1 9 8 9 )詳細描述其他方法。 在某些實施例中’免疫結合物可包含與可使前藥（例如 肽基化學治療劑’參見WO 81/01145)轉化為活性藥物（諸 如抗癌藥物）之前藥活化酶結合之抗體。該等免疫結合物 132799.doc -226· 200918089 適用於抗體依賴性酶介導前藥療法（"ADEPT")。可與抗體 結合之酶包括（但不限於）驗性碟酸酶，其適用於使含有填 酸醋之前藥轉化為游離藥物；芳基硫酸酯酶，其適用於使 含有硫酸酯之前藥轉化為游離藥物；胞射脫胺酶，其適 用於使無毒5_氟胞㈣轉化為抗癌藥物5•氣尿μ ;蛋白 酶’諸如沙雷氏菌（Serratia)蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草 桿菌蛋白酶、羧基肽酶及組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B及 L)，其適用於使含有肽之前藥轉化為游離藥物；仏丙胺酿 基羧基肽酶，其適用於轉化含有〇_胺基酸取代基之前藥； 碳水化合物裂解酶，諸如β_半乳糖苦酶及神經胺酸酶，其 適用於使糖基化前藥轉化為游離藥物；卜内醯胺酶，其適 用於使以β-内醯胺衍生化之藥物轉化為游離藥物；及青黴 素酿胺酶’諸如青徽素V醯胺酶及青彳數素G醯胺酶，其分 別適用於使於胺氮處以苯氧基乙醯基或苯乙醯基衍生化之 藥物轉化為游離藥物。酶可藉由此項技術中熟知之重組 DNA技術與抗體共價結合。參見例如等人， iVaiwre 312:604-608 (1984)。 d.藥物負荷 藥物負荷係以式I分子中之p(亦即每抗體藥物部分之平 均數）表不。藥物負荷可在每抗體i至2〇個藥物部分之 圍内變化。式！之ADC包括與範圍為i至2〇個之藥物部分 結合之抗體的集合。來自結合反應之ADC製劑中每抗體藥 物部分之平均數可藉由習知方式表徵，諸如質譜法、 ELISA檢疋及HPLC。亦可測定以p計之ADC之數量分布。 I32799.doc •227· 200918089 ^些情況下’均f ADC(其中p為某一值）自具有其他藥物 念订之ADC的分離、純化及表徵可藉由諸如逆相 電泳之方式來违Λ、 ^ 運成。因此，式I抗體-藥物結合物之醫藥 配物可為該等結合物與連接於1、2、3、4或更多個藥物部 v 刀之抗體之異質混合物。
子於些抗體藥物結合物而言，P可能受抗體上之連接 ’之數目限制。舉例而言’當如上文例示性實施例中， 連接為半胱胺酸硫醇時，抗體可具有僅-個或若干個半胱 胺醇基’或可具有僅一個或若干個具足夠反應性且連 可連接之硫醇基。在某些實施例中，較高藥物負荷 (例如㈣可引起某些抗體-藥物結合物之聚集、不溶性、 毒^或細胞渗透率損失。在某些實施例中，本發明之ADC 藥物負荷的範圍為!至約8 ;約2至約6 ;或約3至約5。實 八 < 已顯不對於某些ADC而言，每抗體藥物部分之最佳 率可〗、於8，且可為約2至約5。參見us 2〇〇5_〇23%的 A1 〇 在某些實施例中’在結合反應期間比理論最大值少之藥 :π分與抗體結合。如下文所述，抗體可含有(例如)不與 萬物連接子中間物或連接子試劑反應之離胺酸殘基。一 般’抗體不含有許多可連接於藥物部分之游離及反應性半 脱胺酸㈣基；實際上，抗體巾之大多數半胱胺酸硫醇殘 ，以二硫橋鍵形式存在。在某些實施例中，可用諸如二硫 蘇糖醇（DTT)或三艘基乙基膦（TCEp)之還原劑在部分或完 全還原條件下還原抗體以產生反應性半胱胺酸硫醇基。在 132799.doc •228- 200918089 某些實施例中，使抗體 半脱胺酸之反應性親核性基=條件以露出諸如離胺酸或 由抗體比率)可以不同方式控制，例如藉 式來達成：⑴限㈣物·連接子Μ物或連接子 =相對於抗體之莫耳過量；⑼限制結合反應時間或溫 度’及㈣+胱胺酸硫醇㈣之部分或限㈣原條件。
應瞭解w個以上親核性基團與藥物-連接子中間物 或連接子試劑、接㈣㈣分試駭料，㈣得產物為 具有-或多個連接於抗體之藥物部分之分布的adc化合物 之混合物。每&體藥物之平均&可藉由對抗體具特異性且 對藥物具特異性之雙重ELISA抗體檢定自混合物計算。個 別ADC分子可藉由質譜法在混合物中鑑別出且藉由例如疏 水性相互作用層析之HPLC分離（參見例如，McD〇nagh等人 (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307 ； Hamblett 等人（2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070 ；
Hamblett, K.J.，等人"Effect of drug loading 〇n the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti- CD30 antibody-drug conjugate，"摘要編號 624，American
Association for Cancer Research, 2004年 3 月 27-31 曰之 2004 年年會，Proceedings of the AACR，第 45 卷，2004年 3 月； Alley, S.C.，等人"Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates,"摘要編號 627, American Association for Cancer Research, 2004年 3 月 27， 31 曰之 2004 年年會，Proceedings of the AACR ’ 第 45 卷， 132799.doc -229- 200918089 具有單一負荷值之均質 2004年3月）。在某些實施例中 ADC可藉由電泳或層析自結合混合物分離。 e•製備免疫結合物之某些方法 式I之ADC可藉由若干途徑利用熟習此項技術者已知之 有機化學反應、條件及試劑來製備，包括：⑴使抗體之親 核性基團與二價連接子試劑反應以形成經由共價鍵連接之 Ab_L，接著與藥物部分D反應；及（2)使藥物部分之親核性 基團與二價連接子試劑反應以形成經由共價鍵連接之D_ L，接著與抗體之親核性基團反應。經由後一途徑製備式工 之ADC之例不性方法係描述於us 2〇〇5 〇238649 Ai中，該 文獻明確地以引用的方式併入本文中。
抗體上之親核性基團包括（但不限於）：（i)N末端胺基； (ii)側鏈胺基，例如離胺酸；（iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺 酸；及（IV)糖羥基或胺基，其中抗體經糖基化。胺、硫醇 及羥基具親核性且能夠與連接子部分及連接子試劑上之親 電子基團反應形成共價鍵，該等連接子部分及連接子試劑 包括：（i)活性酯，諸*NHS酯、H0Bt酯、鹵甲酸酯及醯 基鹵；（U)院基及苄基鹵化物’諸如鹵乙醯胺；（iH)醛、 酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基團。某些抗體具有可還原性 鏈間二硫鍵，亦即半胱胺酸橋。可使抗體具有反應性以便 藉由用諸如DTT(二硫蘇糖醇）或三羰基乙基膦（TCEP)之還 原劑處理以至於使抗體完全或部分還原而與連接子試劑結 合。理論上，每一半胱胺酸橋將由此形成兩個反應性硫醇 親核體。其他親核性基團可經由修飾離胺酸殘基而引入抗 132799.doc -230- 200918089 體中，例如藉由使離胺酸殘基與2_亞胺基硫雜環戊烷（特勞 特氏試劑（TraUt，S reagent))反應，從而導致胺轉化為硫 醇。反應性硫醇基可藉由引入一個、兩個、三個、四個： 更多半胱胺酸殘基而引入抗體中（例如藉由製備包含一或 多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之變異抗體）。
本發明之抗體-藥物結合物亦可藉由抗體上之親電子其 團（諸如醛或酮羰基）與連接子試劑或藥物上之親核性基團 之間的反應來產生。連接子試劑上之適用親核性基團包括 (但不限於）醯肼、两、胺基、肼、硫代半卡巴腙 (thi〇Semicarbaz〇ne)、羧酸肼及芳基醯肼。在一實施例 中，修倚抗豸以引入能夠與連接子試劑或藥物上之親核性 取代基反應之親電子部分。在另—實施例中，糖基化抗體 之糖可例如用尚碘酸鹽氧化劑氧化，以形成可與連接子試 劑或藥物部分之胺基反應的醛或酮基團。所得亞胺席夫鹼 (Schiff base)基團可形成穩定鍵，或可例如藉由蝴氫化物 試劑還原以形成穩定胺鍵。在—實施例中，糖基化抗體之 碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏高碘酸鈉之反應可在 抗體中產生可與藥物上之適當基團反應的羰基（醛及酮）基 團（Hermanson，Bioconjugate Techniques)。在另一實施例 中，含有N末端絲胺酸或蘇胺酸殘基之抗體可與偏高碘酸 鈉反應，導致產生醛而非第一胺基酸& 5以以， (1992) •零化 陳 3:138·146 ;⑽ 5362852)。該醛 可與藥物部分或連接子親核體反應。 藥物。卩分上之親核性基團包括（但不限於）·胺、硫醇、 132799.doc -231 - 200918089 羥基、醯肼、肟、肼、硫代半卡巴腙、羧酸肼及芳基醯肼 基團’其能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電子基團 反應形成共價鍵’該等連接子部分及連接子試劑包括：⑴ 活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸酯及醯基鹵；（Π) 烷基及苄基鹵化物’諸如鹵乙醯胺；（iii)醛、酮、羧基及 順丁烯二醯亞胺基團。 本發明之化合物明確地涵蓋（但不限於）用下列交聯劑製 備之 ADC : BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、 MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、 SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、 磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB以及SVSB(丁二醯亞胺基-(4-乙烯基砜）苯甲酸酯）， 其均為市售的（例如來自Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL.，U.S.A ;參見2003-2004年應用手冊及目錄， 第 467-498頁）。 亦可使用各種雙官能蛋白質偶合劑來製造包含抗體及細 胞毒性劑之免疫結合物’該等蛋白質偶合劑諸如N- 丁二醯 亞胺基-3-(2-^ σ定基二硫基）丙酸醋（spdp)、丁二醯亞胺基_ 4-(Ν-順丁烯二醯亞胺基甲基）環己烷甲酸酯（SmcC)、亞 胺基硫雜環戊烧（IT)、亞胺基酯之雙官能衍生物（諸如己二 亞胺二甲酯鹽酸鹽）、活性酯（諸如辛二酸二丁二醯亞胺 酯）、醛（諸如戊二醛）、雙疊氮基化合物（諸如雙（對疊氮基 苄醯基）己二胺）、雙重氮鏽衍生物（諸如雙_(對重氮鏽苄醯 基）-乙二胺）、二異氰酸酯（諸如曱苯2,6-二異氰酸酯）及雙 132799.doc •232 - 200918089 一氣-2，4 -—硝基本）。舉例而言，
活性氟化合物（諸如 篦麻毒素免疫毒素 (1987)中所述來製備 甲基一伸乙三脸7· 實施例中，抗體可與”受體”（諸如抗生蛋白鏈菌 素）結合以用於腫瘤預靶向’其中向患者投與抗體受體結 合物，接著使用清除劑自循環移除未結合之結合物且接著 投與與細胞毒性劑（例如放射性核苷酸）結合之"配位體八例 如抗生物素蛋白）。 例示性免疫結合物—Thio-抗體藥物結合物 a·半胱胺酸工程化抗_CD79b抗體之製備 編碼本發明之半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體及親本抗_ CD79b抗體之胺基酸序列變異體的dNA係藉由各種方法製 備’該等方法包括（但不限於）自天然來源（在天然存在之胺 基酸序列變異體之情況下）分離；藉由早先製備之編碼多 肽之DNA的定點（或募核苦酸介導）突變誘發（carter (1985) 等人Nucleic Acids Res· 13:4431-4443 ; Ho 等人（1989) Gene (Amst.) 77:51-59 ; Kunkel 等人（1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 ; Liu 等人（1998) J. Biol. Chem. 273:20252- 132799.doc -233 - 200918089 20260)、PCR突變誘發（Higuchi, (1990) in PCR Protocols， 第 177-183 頁，Academic Press; Ito 等人（1991) Gene 102:67-70; Bernhard等人（1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132 ;及 Vallette 等人（1989) Nuc. Acids Res. 17:723-733)及 盒突變誘發（Wells等人（1985) Gene 34:3 15-323)製備。突變 誘發方案、套組及試劑為市售的，例如QuikChange®多定 點突變誘發套組（Stratagene，La Jolla, CA)。單一突變亦藉 由寡核苷酸定向突變誘發使用雙股質體DNA作為模板，藉 由基於PCR之突變誘發來產生（Sambrook及Russel，（2001)
Molecular Cloning: A Laboratory Manua卜第 3版；Zoller等 人（1983) Methods Enzymol. 100:468-500 ; Zoller，M.J.及 Smith，M. (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487-6500)。重組抗 體之變異體可亦藉由限制性片段操作或藉由用合成募核苷 酸之重疊延伸PCR來建構。誘變引子編碼半胱胺酸密碼子 置換。標準突變誘發技術可用於產生編碼該等突變半胱胺 酸工程化抗體之 DNA(Sambrook 等人 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor，N.Y·，1989 ;及 Ausubel 等人 Current
Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, N.Y., 1993) 〇 可使用噬菌體呈現技術（McCafferty等人（1990) Nature 348:552-553)在活體外自未經免疫之供體之免疫球蛋白可 變（V)域基因譜系產生抗-CD79b人類抗體及抗體片段。根 據此技術，將抗體V域基因同框選殖至絲狀噬菌體（諸如 132799.doc -234- 200918089 Μ1 3或fd)之主要或次要外殼蛋白基因中，且作為功能性抗 體片段呈現於噬菌體顆粒之表面上。因為絲狀顆粒含有喧 菌體基因組之單股DNA複本，所以基於抗體之功能特性之 選擇亦導致選擇編碼展現彼等特性之抗體之基因。因此， 噬菌體模擬B細胞之一些特性（j〇hnson等人（1993) Current
Opinion in Structural Biology 3:564-571 ; Clackson 等人 (1991) Nature，352:624-628 ; Marks 等人（1991) J. Mol. Biol. 222:581-597 ; Griffith #A(1993)EMBOJ.12:725- 734 ； US 5565332 ； US 5573905 ； US 5567610 ； US 5229275) 〇 抗-CD79b抗體可使用已知寡肽合成方法以化學方法合成 或可使用重組技術製備及純化。適當胺基酸序列或其部分 可藉由直接狀合成使用固相技術來產生（Stewart等人， Solid-Phase Peptide Synthesis, (1969) W.H. Freeman Co., San Francisco, CA; Merrifield, (1963) J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154)。活體外蛋白質合成可使用手動技術或藉由 自動裝置來執行。自動固相合成可例如利用t_B〇C或Fmoc 保護之胺基酸及使用應用生物系統肽合成器（Foster City， CA)使用製造商之說明書來實現。抗_CD79b抗體或CD79b 多肽之各種部分可以化學方法分別合成且使用化學或酶促 方法組合以產生所需抗_CD79b抗體或CD79b多肽。 已開發各種技術用於製造抗體片段==傳統上，此等片段 係經由完整抗體之蛋白水解消化而得到（Morimoto等人 (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 132799.doc -235 - 200918089 24:107-1 17 ;及 Brennan 等人（1985) Science，229:81)，或直 接藉由重組宿主細胞產生。Fab、Fv及ScFv抗-CD79b抗體 片段均可在大腸桿菌中表現且自其分泌，因此允許容易地 製造大量此等片段。可將抗體片段自本文所論述之抗體噬 菌體庫分離。或者，Fab'-SH片段可直接自大腸桿菌回收 且使其化學偶合以形成F(ab')2片段（Carter等人（1992) Bio/Technology 10:163-167)，或直接自重組宿主細胞培養 物分離。抗-CD79b抗體可為（scFv)單鏈Fv片段（WO 93/16185 ; US 5571894 ; US. 5587458)。抗-CD79b抗體片 段亦可為”線性抗體"（US 5641870)。該等線性抗體片段可 為單特異性或雙特異性抗體。 以下描述主要係關於藉由培養經含有編碼抗-CD79b抗體 之核酸之載體轉型或轉染的細胞產生抗-CD79b抗體。編碼 抗-CD79b抗體之DNA可自由咸信具有抗-CD79b抗體mRNA 且以可偵測量表現該mRNA之組織製備的cDNA庫獲得。因 此，人類抗-CD79b抗體或CD79b多肽DNA可方便地自由人 類組織製備之cDNA庫獲得。編碼抗-CD79b抗體之基因亦 可自染色體組庫獲得或藉由已知合成程序（例如自動核酸 合成）獲得。 本發明之設計、選擇及製備方法使半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體能夠與親電子官能基反應。此等方法進一步使 諸如抗體-藥物結合物（ADC)化合物之抗體結合物化合物能 夠於指定、設計、選擇位點處具有藥物分子。抗體表面上 之反應性半胱胺酸殘基允許經由諸如順丁烯二醯亞胺或鹵 132799.doc - 236- 200918089 乙醯基之硫醇反應性基團而特異性結合藥物部分。Cys殘 基之硫醇官能基對順丁烯二醯亞胺基團之親核反應性與蛋 白質中之任何其他胺基酸官能基（諸如，離胺酸殘基之胺 基或N末端胺基）相比高約1 000倍。雖然碘乙醯基及順丁烯 二醯亞胺試劑中之硫醇特異性官能基可與胺基反應，但需 要較高pH值（>9.0)及較長反應時間（Garman，1997，Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London)。蛋白質中游離硫醇之量可藉由標準愛耳門 { 氏檢定（Ellman's assay)來估計。免疫球蛋白Μ為二硫鍵連 接五聚體之一實例，而免疫球蛋白G為具有將亞單元結合 在一起之内部二硫橋之蛋白質的一實例。在諸如此類之蛋 白質中，需要用諸如二硫蘇糖醇（DTT)或石西醇之試劑還原 二硫鍵（Singh 等人（2002) Anal. Biochem. 304:147-156)以產 生反應性游離硫醇。此方法可能導致抗體三級結構及抗原 結合特異性受損。 PHESELECTOR(用於選擇反應性硫醇之噬菌體ELISA)檢 、 定允許偵測呈ELISA噬菌體形式之抗體中之反應性半胱胺 酸基團，藉此有助於設計半胱胺酸工程化抗體（Junutula， J.R.等人（2008) J Immunol Methods 332:41-52 ； WO 2006/034488 ; US 2007/0092940)。將半胱胺酸工程化抗體 塗覆於孔表面上，接著與噬菌體顆粒一起培養，添加HRP 標記之第二抗體，且偵測吸光度。呈現於噬菌體上之突變 蛋白質可以快速、穩固且高產量方式篩選。可產生半胱胺 酸工程化抗體之庫且使其經受使用相同方法之結合選擇以 132799.doc - 237- 200918089 自抗體或其他蛋白質之隨機蛋白質-噬菌體庫中鑑別游離 Cys併入之適當反應性位點。此技術包括使呈現於嗟菌體 上之半胱胺酸突變蛋白質與亦具硫醇反應性之親和力試劑 或報導基團反應。 PHESELECTOR檢定允許篩選抗體中之反應性硫醇基。 藉由此方法鑑別A121C變異體為例示性的。可有效研究整 個Fab分子以鑑別更多具有反應性硫醇基之ThioFab變異 體。使用參數（亦即表面可及性分數）來鑑別及定量溶劑對 多肽中之胺基酸殘基之可及性。表面可及性可以能夠由溶 劑分子（例如水）接觸之表面面積（A2)表示。水之佔據空間 近似為1.4A半徑球體。軟體為可免費獲得的或可獲許可的 (Secretary to CCP4, Daresbury Laboratory, Warrington, WA4 4AD，United Kingdom，傳真：（+44) 1925 603825， 或藉由網際網路：www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html)， 如結晶學程式之CCP4 Suite，其利用算法以已知的X-射線 結晶術得到之座標計算蛋白質之各胺基酸之表面可及性 ("The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography" (1994) Acta. Cryst. D50:760-763)。兩個執行表面可及性計 算之例示性軟體模組為"AREAIMOL"及"SURFACE"，其基 於 B. Lee及 F.M. Richards (1971) J. Mol. Biol. 55:379-400之 算法。AREAIMOL將蛋白質之溶劑可及表面定義為探針球 (表示溶劑分子）當其在蛋白質之凡得瓦爾（Van der Waal s) 表面上滾動時之中心軌跡。AREAIMOL藉由在各原子周圍 (距離原子中心等於原子及探針半徑之總和之距離處）之延 132799.doc •238- 200918089
伸球體上產生表面& α Λ L 球體内之彼與相鄰原子相關之等效 A D #㈣可及表面面積° AREAIMOL在 PDB座標文件中溫$丨店 ^ 之溶劑可及面積，且總結殘基、 鏈及整個分子之可；, #慕、叮宜 面積。個別原子之可及面積（或面積 差異）可寫人請_文件IAREAI隱假設各元素 之皁一半徑，且僅識別有限數目之不同元素。
areAImol及SURFACE報導絕料及性，亦即埃（入）平 方數。參考多肽⑽基酸㈣之標準狀態來計算表面可及 性分數。參考狀態為三肽⑴y_x_Gly，其中x為所關注之胺 基酸且參考狀態應為，延伸，構形，亦即類似陳中之彼等 者。延伸構形使X之可及性達到最大。將計算出之可及面 積除以Gly〇C_Gly三肽參考狀態之可及面積且記錄商，其 為可及性分數ϋ性百分數為可及性分數乘以ι〇〇。另 -用於計算表面可及性之例示性算法係基於程式“Μ之 SOLV 模組（Broger，c,，F Hoffman_LaR〇che，Basel)，其基
於多肽之X射線座標計算胺基酸殘基與水球體之可及性分 數。抗體中每個胺基酸之表面可及性分數可使用可得到之 晶體結構資訊來計算（Eigenbrot等人（1993) J M01 Biol 229:969-995)。 使用習知程序（例如，藉由使用能夠特異性結合於編碼 鼠類抗體之重鏈及輕鏈之基因的募核苷酸探針）來容易地 將編碼半胱胺酸工程化抗體之DNA分離及定序。融合瘤細 胞用作該DNA之來源《在分離後，可將DNA置於表現载體 中，接著將其轉染至不以其他方式產生抗體蛋白之宿主細 132799.doc -239· 200918089 胞中，該等宿主細胞諸如大腸桿菌細胞、猿c〇s細胞、中 國倉鼠卵巢（CHO)細胞或其他哺乳動物宿主細胞，諸如骨 髓瘤細胞（US 5807715 ; US 2005/0048572 ; us 2004/ 0229310)，以獲得單株抗體在重組宿主細胞中之合成。 在設計及選擇後，具有經工程化、高反應性之未配對 Cys殘基（亦即”游離半胱胺酸胺基酸"）之半胱胺酸工程化抗 體（例如ThioFab)可藉由以不步驟產生：⑴在細菌（例如大 腸桿菌）系統（Skerra等人（1993) Curr. Opinion in Immun〇1. 5:256-262 , Pluckthun (1992) Immunol. Revs. 130:151-188) 或哺乳動物細胞培養系統（WO 01/00245)(例如中國倉鼠印 巢（CHO)細胞）中表現；及（ii)使用常見蛋白質純化技術純 化（Lowman 等人（1991) J. Biol. Chem 266(17):1〇982_ 10988)。 工程化Cys硫醇基與親電子連接子試劑及藥物_連接子中 間物反應以形成半胱胺酸工程化抗體藥物結合物及其他經 標圯之半胱胺酸工程化抗體。半胱胺酸工程化抗體以及存 在於親本抗體中之經配對且形成鏈間及鏈内二硫鍵的Cys 殘基並不具有任何反應性硫醇基（除非用還原劑處理）且並 不與親電子連接子試劑或藥物-連接子中間物反應。新工 紅化Cys殘基可保持未配對，且能夠與親電子連接子試劑 或藥物-連接子中間物（諸如藥物-順丁烯二醯亞胺）反應（亦 即與之結合）。例示性藥物-連接子中間物包括：mc- mmae 、 MC_MMAF 、 Mc魯PAB_MMAE 及 MCvepAB_ MMAF。重鏈及輕鏈之卫程化Cys殘基之結構位置係根據 132799.doc -240- 200918089 依序編號系統進行編號。此依序編號系統與Kabat編號系 統（Kabat 等人，（1991) Sequences of Proteins 〇f Immunological Interest，第 5 版 Public Health Service，
National Institutes of Health，Bethesda，MD)有關，起始於 N末端’與Kabat編號方案（底列）不同之處在於以a、b、c表 示插入。使用Kabat編號系統，實際線性胺基酸序列可能 含有對應於可變域之FR或CDR之縮短或插入的較少或額外 胺基酸。半胱胺酸工程化重鏈變異位點係藉由依序編號及 ( Kabat編號方案鑑別。 在一實施例中，半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體係藉由包 含下列步驟之方法來製備： (a) 由半胱胺酸置換親本抗-CD79b抗體之一或多個胺基 酸殘基；及 (b) 藉由使半胱胺酸工程化抗體與硫醇反應性試劑反應 來測定半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體之硫醇反應性。 半胱胺酸工程化抗體與硫醇反應性試劑之反應性可比親 ( 本抗體與硫醇反應性試劑之反應性大。 游離半胱胺酸胺基酸殘基可位於重鏈或輕鏈中，或位於 怪定域或可變域中。例如F ab之抗體片段亦可以一或多個 半胱胺酸胺基酸置換抗體片段之胺基酸來工程化，以形成 半胱胺酸工程化抗體片段。 本發明之另一實施例提供一種製備（製造）半胱胺酸工程 化抗-CD79b抗體之方法，其包含： (a)將一或多個半胱胺酸胺基酸引入親本抗-CD79b抗體 132799.doc -241 - 200918089 中以產生半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體；及 (b)測定半胱胺酸工程化抗體與硫醇反應性試劑之硫醇 反應性； 其中半胱胺酸工程化抗體與硫醇反應性試劑之反應性比 親本抗體與硫醇反應性試劑之反應性大。 該製備半胱胺酸工程化抗體之方法之步驟（a)可包含： (i) 誘發編碼半胱胺酸工程化抗體之核酸序列突變； (ii) 表現半胱胺酸工程化抗體；及 (iii) 分離且純化半胱胺酸工程化抗體。 該製備半胱胺酸工程化抗體之方法之步驟（b)可包含於 選自嗟菌體或噬粒顆粒之病毒顆粒上表現半胱胺酸工程化 抗體。 該製備半胱胺酸工程化抗體之方法之步驟（b)亦可包 含： (i)使半胱胺酸工程化抗體與硫醇反應性親和力試劑反應 以產生親和力標記之半胱胺酸工程化抗體；及 (H)量測親和力標記之半胱胺酸工程化抗體與捕捉培養 基之結合。 本發明之另一實施例為一種針對硫醇反應性篩選具有高 反應性、未配對之半胱胺酸胺基酸之半胱胺酸工程化抗體 的方法，其包含·· Ο)將一或多個半胱胺酸胺基酸引入親本抗體中以產生半 胱胺酸工程化抗體； (b)使半胱胺酸工程化抗體與硫醇反應性親和力試劑反 132799.doc •242· 200918089 應以產生親和力標記之半胱胺酸工程化抗體；及 (C)量測親和力標記之半胱胺酸工程化抗體與捕捉培養基 之結合；及 (d)測定半胱胺酸工程化抗體與硫醇反應性試劑之硫醇 反應性。 該篩選半胱胺酸工程化抗體之方法之步驟（a)可包含： (1)誘發編碼半胱胺酸工程化抗體之核酸序列突變； (ii) 表現半胱胺酸工程化抗體；及 (iii) 分離且純化半胱胺酸工程化抗體。 該篩選半胱胺酸工程化抗體之方法之步驟（b)可包含於 選自嗤菌體或噬粒顆粒之病毒顆粒上表現半胱胺酸工程化 抗體。 該篩選半胱胺酸工程化抗體之方法之步驟（b)亦可包 含： ⑴使半胱胺酸工程化抗體與硫醇反應性親和力試劑反應 以產生親和力標記之半胱胺酸工程化抗體；及 (Π)量測親和力標記之半胱胺酸工程化抗體與捕捉培養 基之結合。 b.抗-CD79b IgG變異體之半胱胺酸工程化 藉由本文所述之半胱胺酸工程化方法將半胱胺酸於重鏈 11 8(EU編號）（相當於重鏈位置11 8 全長、嵌合親本單株抗-CD79b抗體中或於輕 編號）（相當於輕鏈位置209，依序編號）位點處 嵌合親本單株抗_CD79b抗體中。 依序編號）位點處引入 鍵 205(Kabat 引入全長、 132799.doc •243- 200918089 所產生之於重鏈118(EU編號）處具有半胱胺酸之半胱胺 酸工程化抗體為：（a)具有重鏈序列（SEQ ID NO: 85)及輕 鏈序列（SEQ ID NO: 86)之 thio-hu2F2.D7-HC(A118C)，圖 \Ί。 所產生之於輕鏈205(Kabat編號）處具有半胱胺酸之半胱 胺酸工程化抗體為：（a)具有重鏈序列（SEQ ID NO: 87)及 輕鏈序列（SEQ ID NO: 88)之 thio-hu2F2.D7-LC(V205C)， 圖1 8。 f 此等半胱胺酸工程化單株抗體係藉由在含有1 mM半胱 胺酸之培養基中短暫醱酵而表現於CHO(中國倉鼠卵巢）細 胞中。 根據一實施例，人類化2F2半胱胺酸工程化抗_CD79b抗 體包含下列具有游離半胱胺酸胺基酸之重鏈序列（SEQ ID NO: 91-99，表2)中之一或多者。 表2 :人類化2F2半胱胺酸工程化抗_CD79b抗體變異艎 之重鏈依序編號、Kabat編號及EU編號之比較 序列 依序編號 KABAT編號 EU編號 SE〇 ID NO: EVQLCESGGG V5C V5C 91 LRLSCCASGYT A23C A23C 92 MNSLRCEDTAV A88C A84C 93 TLVTVCSASTK S112C S112C 94 VTVSSCSTKGP A114C A114C A118C 95 VSSASCKGPSV T116C T116C T120C 96 WYVDGCEVHNA V278C V278C V282C 97 KGFYPCDIAVE S371C S371C S375C 98 PPVLDCDGSFF S396C S396C S400C 99 根據一實施例，嵌合2F2半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體 132799.doc 244- 200918089 包含下列具有游離半胱胺酸胺基酸之重鏈序列（SEQ ID NO: 100-108，表3)中之一或多者。 表3 : ch2F2半胱胺酸工程化抗_CD79b抗體變異體之重鏈 依序編號、Kabat編號及EU編號之比較： 序列 依序編號 KABAT編號 EU編號 SEQ ID NO: 0V0LC0PGAE Q5C 05C 100 VKISCCASGYT K23C K23C 101 LSSLTCEDSAV S88C S84C 102 TSVTVCLASTK S112C S112C 103 VTVSSCSTKGP A114C A114C A118C 104 VSSASCKGPSV T116C T116C T120C 105 WYVDGCEVHNA V278C V278C V282C 106 KGFYPCDIAVE S371C S371C S375C 107 PPVLDCDGSFF S396C S396C S400C 108 根據一實施例，人類化2F2半胱胺酸工程化抗-CD79b抗 體包含下列具有游離半胱胺酸胺基酸之輕鏈序列（SEQ ID NO: 109-115，表4)中之一或多者。 表4 :人類化2F2半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體變異體 之輕鏈依序編號及Kabat編號之比較 序列 依序編號 KABAT編號 SEQ ID NO: SLSASCGDRVT V15C V15C 109 EIKRTCAAPSV V115C V110C 110 TVAAPCVFIFP S119C S114C 111 FIFPPCDEQLK S126C S121C 112 DEQLKCGTASV S132C S127C 113 VTEQDCKDSTY S173C S168C 114 GLSSPCTKSFN V210C V205C 115 根據一實施例，嵌合2F2半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體 132799.doc -245- 200918089 包含下列具有游離半胱胺酸胺基酸之輕鏈序列（SEQ ID NO: 116-122，表5)中之一或多者。 表5 :嵌合2F2半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體變異體之 輕鍵依序編號及Kabat編號之比較 序列 依序編號 KABAT編號 SEQ ID NO: TLSVTCGQPAS I15C I15C 116 ELKRTCAAPSY Y115C V110C 117 TVAAPCVFIFP S119C S114C 118 FIFPPCDEQLK S126C S121C 119 DEQLKCGTASV S132C S127C 120 VTEQDCKDSTY S173C S168C 121 GLSSPCTKSFN V210C V205C 122 c.經標記之半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體 半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體可位點特異性地及有效地 與硫醇反應性試劑偶合。硫醇反應性試劑可為多官能連接 子試劑、捕捉（亦即親和力）標記試劑（例如，生物素·連接 子試劑）、偵測標記（例如螢光團試劑）、固相固定試劑（例 如SEPHAROSE™、聚苯乙烯或玻璃）或藥物-連接子中間 物。硫醇反應性試劑之一實例為N-乙基順丁烯二醯亞胺 (NEM)。在一例示性實施例中，ThioFab與生物素-連接子 試劑之反應提供生物素標記之ThioFab，可藉由該生物素 標記之ThioFab偵測及量測工程化半胱胺酸殘基之存在及 反應性。ThioFab與多官能連接子試劑之反應提供具有官 能化連接子之ThioFab，其可進一步與藥物部分試劑或其 他標記反應。ThioFab與藥物-連接子中間物之反應提供 ThioFab藥物結合物。 132799.doc -246- 200918089 此處所述之例示性方法一般可應用於抗體之鑑別及製 造，且更一般地，經由應用本文所述之設計及篩選步驟而 應用於其他蛋白質。 此類方法可應用於其他硫醇反應性試劑之結合，其中反 應性基團為（例如）順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺、吡啶基二 硫化物或其他硫醇反應性結合搭配物（Haugland，2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc. ； Brinkley, 1992，Bioconjugate Chem. 3:2 ; Garman，1997，Non-
Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London ； Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2 i
Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press，San Diego，第 40-55頁，第 643-671 頁）。硫醇反應性 試劑可為藥物部分、螢光團（諸如螢光染料，如螢光素或 备丹明）、成像或放射性治療金屬之螯合劑、肽基或非肽 基“ s己或谓測標籤或清除調節劑（諸如，聚乙二醇之各種 異構體、結合於第三組分之肽或另一碳水化合物或親脂性 藥劑）。 d.半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體之用途 半胱胺酸工程化抗_ C D 7 9 b抗體及其結合物可用作治療及/ 或診斷藥劑。本發明進一步提供預防、控制、治療或改善 或夕個與B細胞相關病症相關之症狀之方法。詳古之， 本發明提供預防、控制、治療或改善一或多個與細胞增生 性病症相關之症狀之方法，該細胞增生性病症諸如癌症， 132799.doc •247· 200918089 例如淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復 發性侵襲性NHL、復發性惰性NHL、難治性NHL、難治性 惰性NHL、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性 淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性 白血·病（ALL)及套細胞淋巴瘤。本發明更進一步提供診斷 CD79b相關病症或患上此類病症之傾向之方法，以及鐘別 優先結合B細胞相關CD79b多肽之抗體及抗體之抗原結合 片段的方法。 本發明之另一實施例係針對半胱胺酸工程化抗_CD79b抗 體用於製備適用於治療對B細胞相關病症有反應之病狀之 藥劑的用途。 e.半胱胺酸工程化抗體藥物結合物（Thio-抗體藥物 結合物（TDC)) 本發明之另一態樣為一種抗體-藥物結合物化合物，其 包含半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體（Ab)及奥瑞他汀藥物部 分（D)，其中該半胱胺酸工程化抗體係藉由連接子部分（L) 經由一或多個游離半胱胺酸胺基酸連接於D;該化合物具 有式I :
Ab-(L-D)p I 其中P為1、2、3或4;且其中半胱胺酸工程化抗體係藉由 包含由一或多個游離半胱胺酸胺基酸置換親本抗_CD79b抗 體之—或多個胺基酸殘基之方法來製備。 本發明之另一態樣為一種包含式I之抗體-藥物化合物之 扣合物的組合物’其中每抗體平均藥物負荷為約2至約5， 132799.doc 200918089 或約3至約4。 圖17-1 8展示半胱胺酸工程化抗_CD79b抗體藥物結合物 (ADC)之實施例，其中奧瑞他汀藥物部分連接於輕鏈（lc_ ADC)或重鏈（HC-ADC)中之工程化半胱胺酸基團。 半胱妝酸工程化抗_CD79b抗體藥物結合物之潛在優點包 括安全性得到改善（較大治療指數）；PK參數得到改善；可 使結合物穩定且保留活性結合構形之抗體鏈間二硫鍵得到 保留；藥物結合位點得到確定；及由半胱胺酸工程化抗體 與藥物-連接子試劑之結合製備半胱胺酸工程化抗體藥物 結合物產生較為均質之產物。 連接子 連接子”、”連接單元”或"連接"意謂使抗體共價連接於 藥物。卩刀之包含共價鍵或原子鏈之化學部分。在各種實施 例中，連接子係以L表示。"連接子、L)為可用於連接一或 夕個藥物。卩分（D)及抗體單元（Ab)以形成式丨之抗體_藥物結 a物（ADC)之雙官能或多官能部分。抗體·藥物結合物 ()了方便地使用具有結合於藥物及抗體之反應性官能 基之連接子來製備。半胱胺酸工程化抗體（Ab)之半胱胺酸 1醇可與連接子试劑、藥物部分或藥物-連接子中間物之 親電子官能基形成鍵。 在悲樣中，連接子具有反應性位點，該位點具有對存 在於抗體上之親核性半胱胺酸具反應性之親電子基團。抗 體之半胱胺酸硫醇可與連接子上之親電子基團反應且形成 連接於連接子之共價鍵。適用親電子基團包括（但不限於） 132799.doc -249- 200918089 順丁烯二醯亞胺及齒乙醢胺基團。 連接子包括二價基團，諸如烷二基、伸芳基、雜伸芳 基、諸如-(CR2)nO(CR2)n-之部分、烧氧基（例如聚伸乙基氧 基、PEG、聚亞曱基氧基）及烷基胺基（例如聚伸乙基胺 基、Jeffamine™)之重複單元；以及二元酸酯及醯胺類，包 括丁二酸酯、丁二酸醯胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯及己醯 胺。 根據 Klussman 等人（2004)，Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773之第766頁之結合方法及根據實例6之方案， 半胱胺酸工程化抗體與連接子試劑或藥物_連接子中間物 反應，與諸如順丁烯二醢亞胺或α_ _基羰基之親電子官能 基反應。 連接子可由一或多個連接子組分構成。例示性連接子組 分包括6-順丁烯二醯亞胺基己醯基（，，MC")、順丁烯二醯亞 胺基丙醯基（"MP")、纈胺酸-瓜胺酸（”vai_eit"或"vc")、丙
胺酸.苯丙胺酸（"ala_phe"或"af”）、對胺基苄氧羰基 ("PAB”）、4_(2_吡啶基硫基）戊酸N_丁二醯亞胺酯（nspp”）、 4供順丁缔二醯亞胺基甲基）環己院]甲酸n_ 丁二酿亞胺 醋（"sMCC")、（4鲁乙酿基）胺基苯甲酸n_ 丁二醯亞胺醋 =AB”）、作為一或多個重複單元之伸乙基氧基_ ^办⑽”或”曆，）。其他連接子組分在此項技術中 你巳知的且一些在本文中有描述。 在一實施例中，ADC之連接子L具有下式 132799.doc 200918089 —Aa—Ww—Yy- 其中： A-為共價連接於抗體（Ab)之半胱胺酸硫醇之延展基單 元； a為0或1 ; -W-各自獨立地為胺基酸單元； w獨立地為範圍為〇至12之整數； 為共價連接於藥物部分之間隔基單元；且 y為ο、1或2。 延展基單元
押延展基單元（.A-)在存在時能夠使抗體單元連接於胺基酸 單元（-w_)。就此而言，抗體（Ab)具有可與延展基之官能基 形成鍵之官能基。可天然地或經由化學操作存在於抗體上 之適用官能基包括（但不限於）硫氫基（_SH)、胺基、經基、 羧基、碳水化合物之變旋異構性羥基及羧基。在一態樣 中，抗體官能基為硫氫基或胺基。硫氫基可藉由還原抗體 之分子内二硫鍵而產生。或者，硫氫基可藉由使用2-亞胺 基硫雜環戊炫（特勞特氏試劑）或另—硫氫基生成劑使抗體 之離胺酸部分之胺基反應來產生。在一實施例中，抗體 (Ab)具有可與延展基單元之親電子官能基形成鍵之游離半 胱胺酸硫醇基。式！結合物中之例示性延展基單元係以別 及m所示’其中抓、，一、_〇、心係如上文所定 義’且R17為選自下列各者之二價基團··（cH2)r、碳 環基、CKCHA、伸芳基、（CH2)r_伸芳基、-伸芳基- 132799.doc •251 - 200918089 (CH2)r-、（CH2)r-(C3-CW 環基）、（C3_c8碳環基 HCH2)r、 C3-C8雜環基、（CH2)r-(C3-C8雜環基）、_(C3_C8雜環基 HCH2)r_ 、-(CH2)rC(0)NRb(CH2)r- 、-(CH2CH20)r-、_(CH2CH20)r-CH2- -(CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)r- > -(CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)r-CH2--(CH2CH20)rC(〇)NRb(CH2CH2〇)r- χ -(CH2CH20)rC(〇)NRb(CH2CH20)r-
基、苯基或苄基；且r獨立地為範圍為卜⑺之整數。 伸芳基包括藉由自芳族環系統移除兩個氫原子所得到之 Γ 6·20個碳原子之二價芳族烴基。典型伸芳基包括（但不限 於）源自苯、經取代之笨、萘、蒽、聯苯及其類似基團之 雜％基包括其中一或多個環原子為例如氮、氧及硫之雜 原子之環系統。雜環基團包含1至20個碳原子及1至3個選 自N、0、P及S之雜原子》雜環可為具有3至7個環成員（2 至6個碳原子及1至3個選自N、〇、？及s之雜原子）之單環 或具有7至10個環成員（4至9個碳原子及1至3個選自N、〇、 ?及S之雜原子）之雙環，例如：雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或 [6,6]系統。雜環係描述於以下文獻中：paqueUe，a.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A.
Benjamin，New York，1968)，尤其第 1、3、4、0、7及 9 早，The Chemistry 〇f Heterocyclic Compounds，A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present)，尤其第 π、i4、μ、19及 28卷；及 J. Am. Chem.
Soc· (1960) 82:5566。 132799.doc •252 - 200918089 雜環之實例包括（舉例而言，但不限於）吡啶基、二氫吡 啶基、四氫°比啶基（哌啶基）、噻唑基、四氫噻吩基、硫氧 化四氫°塞吩基、嘴咬基、咬喃基、嗟吩基、°比洛基、》比唑 基、咪唾基、四峻基、苯并咬味基、嗟萘基 (thianaphthalenyl)、吲哚基、吲哚婦基（indolenyl)、喹琳 基、異喧琳基、苯并U米峻基、α底σ定基、4 -派α定酮基、°比略 0定基、2 - °比11各咬_基、吼洛琳基、四氫咬喃基、雙-四氫吱 σ南基、四氫旅喃基、雙-四氫β底喃基、四氫啥琳基、四氫 異喹琳基、十氫喹啉基、八氫異喹琳基、吖辛因基、三嗓 基、6Η-1，2,5-嗟二唤基、2Η，6Η-1，5,2-二嗔嗅基、嚷吩 基、噻嗯基、哌喃基、異苯并呋喃基、吮烯基、咄基、啡 °惡嗟基、2Η-吼洛基、異嗟嗤基、異。惡。坐基、π比唤基、噠 嗓基、吲噃基、異吲哚基、3Η-吲哚基、1Η-,唑基、嗓吟 基、4Η-喹嗪基、酞嗪基、喑啶基、喹喏啉基、喹唑琳 基、峰嚇基、噪咬基、4 Ah-叶·β坐基、叶唾基、β — g^琳基、 啡啶基、吖咬基、嘧啶基、啡啉基、啡嗪基、啡噻嗪基、 呋吖基、啡噁嗪基、異咣基、咣基、咪唑啶基、咪唑啉 基、吼唑啶基、吼唑啉基、哌嗪基、吲哚啉基、異吲哚啉 基、喵啶基、嗎啉基、噁唑啶基、苯并三 咬基、經基…、苯并……紅开酿： (isatinoyl)。 碳環基包括具有3至7個碳原子作為單環或具有7至⑵固 碳原子作為雙環之飽和或不飽和環。單環碳環具有⑻個 環原子’更通常為5或6個環原子。雙環碳環具有7至12個 132799.doc •253, 200918089 或具有如排列為雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統， 單"S 1〇個環原子，其排列為雙環[5,6]或[6,6]系統。 2碳環之實例包括環丙基、環丁基、環戍基、i-環戊 、土 1-%戍-2_烯基、N環戊-3-稀基、環己基、1-環己_ 烯基、1·環己-2-稀基、卜環己小稀基、環庚基及 基。 自式I ADC之所有例示性實施例（諸如⑴州應瞭解，即 使未明確表示，亦將!至4個藥物部分連接於抗體(ρ=")， 此視工程化半胱胺酸殘基之數目而定。
2〜CONH-R17-C(0)〜Ww、y 〜D
P in
例示性式II延展基單元係源自順丁烯二醯亞胺基_己醯基 (MC)，其中 R17為 _(CH2)5_ :
MC 例示性式II延展基單元係源自順丁烯二醯亞胺基_丙醯基 (MP)，其中 R17為-(CH2)2-: 132799.doc -254- 200918089
另一例示性式II延展基單元，其中R17為-(CH2CH20)r-CH2-且 r 為 2 ·
另一例示性式II延展基單元，其中R17為 -(CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)r-CH2-，其中 Rb 為 Η 且 r 各自為 2 ：
M,
MPEG
C 例示性式III延展基，其中R17為-(CH2)5-:
I Η 在另一實施例中，延展基單元經由抗體之工程化半胱胺 酸硫原子與延展基單元之硫原子之間的二硫鍵連接於半胱 胺酸工程化抗-CD79b抗體。此實施例之代表性延展基單元 係以式IV所示，其中R17、Ab-、-W-、-Y-、-D、w及y如上 文所定義。 132799.doc • 255 -
IV 200918089
Ab—S
S-R17—C(O)—Ww—Yy一D
在又一實施例中，延展基之反應性基團含有可與抗體之 游離半胱胺酸硫醇形成鍵之硫醇反應性官能基。硫醇反應 官能基之實例包括（但不限於）順丁烯二醯亞胺、（X-鹵乙醯 基、活化酯（諸如丁二醯亞胺酯、4-硝基苯酯、五氟苯酯、 四氟苯酯）、酸酐、酸氯化物、磺醯氯、異氰酸酯及異硫 氰酸酯。此實施例之代表性延展基單元係以式Va及Vb所 示，其中-R17-、Ab-、-W-、-Y-、-D、w及y如上文所定 義；
Ab—S4-C(0)NH—R17-C(0)—Ww~Yy— D ) \ / P Va
Ab—S-f-C(S)NH—R17-C(0)—Ww—Yy— D J 、 / P Vb 在另一實施例中’連接子可為用於經由分枝、多官能連 接子部分使一個以上藥物部分共價連接於抗體之樹枝型連 接子（Sun 等人（2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215 ; Sun 等人（2003) Bioorganic &
Medicinal Chemistry 11:1761-1768 ； King (2002)
Tetfahedwn Letters 43:1987-1990)。樹枝狀連接子可增加 藥物與抗體之莫耳比率，亦即負荷，其與ADC之效能有 關。因此，當半胱胺酸工程化抗體僅帶有一個反應性半胱 胺酸硫醇基時，許多藥物部分可經由樹枝狀連接子連接。 132799.doc •256· 200918089 胺基酸單元 連接子可包含胺基酸殘基。胺基酸單元（_ww_)在存在時 使抗體（Ab)連接於本發明之半胱胺酸工程化抗體-藥物結 合物（ADC)之藥物部分（D)。 -Ww-為二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、 九肽、十肽、十一肽或十二肽單元。構成胺基酸單元之胺 基酸殘基可包含天然存在之彼等者，以及次要胺基酸及非 天然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。-W-單元各自獨 立地具有下文以方括號表示之式，且w為範圍為0至12之整 數：
其中R19為氫、曱基、異丙基、異丁基、第二丁基、苄 基、對羥基苄基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、 -CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、 -(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、 -(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(=NH)NH2 ' -(CH2)4NH2、 -(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、 -(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-口比咬基甲 基-、3 -0比σ定基甲基-、4 -0比17定基甲基-、苯基、環己基、 132799.doc -257- 200918089
當f不為敦時，R、連接之碳原子為對掌㈣。r19所 連接之各碳原子獨立地呈⑻或⑻構型，或外消旋混合 物。因此，胺基酸單it可為對映異構性純的、外消旋的或 非對映異構的。 例示性-Ww•胺基酸單元包括：肽、三肽、四肽或五狀。 例不性二肽包括：纈胺酸_瓜胺酸（vc4val_cit)、丙胺酸-苯 丙胺酸（af或ala-phep例示性三肽包括：甘胺酸_纈胺酸_
瓜胺酸（gly-val-cit)及甘胺酸.甘胺酸-甘胺酸（gly_gi厂 giy)。構成胺基酸連接子組分之胺基酸殘基可包含天然存 在之彼等者，以及次要胺基酸及非天然存在之胺基酸類似 物’諸如瓜胺酸。 胺基酸單元可藉由一或多種酶（包括腫瘤相關蛋白酶）酶 促裂解，以釋出藥物部分（_D)，在一實施例中其在釋放後 經活體内質子化而提供藥物（D)。可對胺基酸連接子組分 進行設計且最優化其選擇性以便由特定酶(例如腫瘤相關 132799.doc •258- 200918089 ^白轉、組織蛋白酶B、C及D或纖溶酶蛋白酶）酶促裂 間隔基單元 當胺基酸單元存在(w=1_12)時’間隔基單元 在(y=i或2)時使胺基酸單元(_Ww_)連接於藥物部分⑼ 者，當胺基酸單元不存在時，間隔基單元使延展基單元連 接於樂物部分。當胺基酸單元與延展基單元皆不存在卜 y-〇)時’間隔基單元亦使藥物部分連接於抗體單元。間隔 基單元具有兩種一般類型：自我犧牲型及非自我犧牲型。 非自我犧牲型間隔基為在自抗體-藥物結合物或藥物部分_ 連接子裂解（尤其酶促裂解）胺基酸單元後間隔基單元之部 分或全部保持結合於藥物部分之間隔基單元。當含有甘胺 酸-甘胺酸間隔基單元或甘胺酸間隔基單元之鞭經歷經 由腫瘤細胞相關蛋白酶、癌症細胞相關蛋白酶或淋巴細胞 相關蛋白酶酶促裂解日夺，甘胺酸_甘胺酸_藥物部分或甘胺 酸-藥物部分自Ab-Aa_Ww.裂解。在—實施例中，獨立水解 反應在靶細胞内進行，從而使甘胺酸_藥物部分鍵裂解且 釋出藥物。 在另-實施例中，-Yy_為伸苯基部分經^取代之對胺基 节基胺曱醯基（PAB)單元，其中卩為丨广^烷基、 烷基）、-鹵素、-硝基或-氰基；且111為範圍為〇_4之整數。 非自我犧牲型間隔基單元（_Y_)之例示性實施例為·· -Gly-Gly- ; -Gly- ; -Ala-Phe- ; -Val-Cit-。 在一實施例中，提供間隔基單元不存在（y=〇)之藥物部 132799.doc -259- 200918089 刀-連接子或ADC，或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合 物。 或者’含有自我犧牲型間隔基單元之AdC可釋放_D。在 一實施例中，-Y-為經由PAB基團之胺基氮原子連接於_ww_ 且絰由衩酸酯、胺基甲酸酯或醚基直接連接於之基 團’其中ADC具有例示性結構： / \
Ab 十 Aa，w-] \ °iy 其中Q為-CVQ院基、_0_(Cl_C8烧基）、_鹵素、_硝基或_ 氰基；m為範圍為〇·4之整數；且p範圍為1至4。 自我犧牲型間隔基之其他實例包括（但不限於）在電子學 上類似於ΡΑΒ基團之芳族化合物，諸如2_胺基η米唾_5_甲醇 衍生物（Hay 等人（1 999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237)、 雜環PAB類似物（US 2005/0256030)、β-葡萄糖苷酸（w〇 2007/011968)及鄰胺基苄基縮醛或對胺基苄基縮醛，可使 用在醯胺鍵水解後經歷環化之間隔基，諸如經取代及未經 取代之4-胺基丁酸酿胺（R〇dri gues等人（1995) Chemistry Biology 2:223)、適當經取代之雙環[2.2.1]及雙環[2.2.2]環 系統（Storm 等人（1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815)及 2-胺 基苯基丙酸醯胺（Amsberry等人（1990) J. Org. Chem. 55:5867)。於甘胺酸處經取代之含胺藥物的消除 (Kingsbury 等人（1984) J. Med. Chem. 27:1447)亦為適用於 132799.doc -260- 200918089 ADC之自我犧牲型間隔基之實例。 例不性間隔基單元（_Yy_)係以式χ_χπ表示：
X XI )—ΗΝ—CH2一CO—| NHCH2C(0)-NHCH2C(0)-
XII
樹枝狀連接子 在另一實施例中’連接子L可為用於經由分枝、多官能 連接子部分使一個以上藥物部分共價連接於抗體之樹枝型 連接子（Sun 等人（2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215 ; Sun 等人（2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 1 1:1761-1768)。樹枝狀連接子可增加 藥物與抗體之莫耳比率，亦即負荷，其與ADC之效能有 關。因此’當半胱胺酸工程化抗體僅帶有一個反應性半胱 胺酸硫醇基時，許多藥物部分可經由樹枝狀連接子連接。 分枝、樹枝狀連接子之例示性實施例包括2,6-雙（羥曱基）-對甲酚及2,4,6_參（羥曱基）_酚樹枝狀聚合物單元（w〇 2004/01993，Szalai 等人（2003) J. Amer. Chem. Soc. 125:15688-15689; Shamis 等人（2004) J.Amer.Chem.Soc. 126:1726-1731 ; Amir 等人（2003) Angew, Chem. Int. Ed. 42:4494-4499) 〇 在一實施例中’間隔基單元為支鏈雙（羥甲基）苯乙烯 132799.doc •261 - 200918089 (BHMS)，其可用於合併及釋放多個藥物且具有以下結 構： 〇
其包含2-(4-胺基亞苄基）丙-1,3-二醇樹枝狀聚合物單元 (WO 2004/043493 ; de Groot 等人（2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4490-4494)，其中 Q 為-C丨-C8 烷基、-O-CCVCs 烷 基）、-鹵素、-硝基或-氰基；m為範圍為0-4之整數；n為0 或1 ;且ρ範圍為1至4。 式I抗體-藥物結合物化合物之例示性實施例包括Xllla (MC)、Xlllb (val-cit)、XIIIc (MC-val-cit)及 Xllld (MC-val-cit-PAB)：
HN 。丄 nh2 XHIb 132799.doc -262- 200918089
p
式la抗體-藥物結合物化合物之其他例示性實施例包括 XIVa-e ：
XlVa
/ Ο Ο 1 II II Ab——S-V-CH2C—Y—C——D
XlVb
XIVc
XlVd 132799.doc - 263 - 200918089
XlVe
其中X為： —CH2H^ — —(CH2)n~ —(CH2CH20)n — Ο c—N—(CH2)n— R
/=V^CH2)n- Y為： o —(CH2)n~C—N—(CH2)n- R 或 且R獨立地為H或C〗-C6烷基；且n為1至12。 在另一實施例中，連接子具有反應性官能基，該官能基 具有對存在於抗體上之親電子基團具反應性之親核性基 團。抗體上之適用親電子基團包括（但不限於）醛及酮羰 基。連接子之親核性基團之雜原子可與抗體上之親電子基 團反應且形成連接至抗體單元之共價鍵。連接子上之適用 親核性基團包括(但不限於)醯肼、#、胺基、_、硫代半 卡巴月不Μ酸肼及芳基酿肼。抗體上之親電子基團提供適 於連接於連接子之適宜位點。 、吊肽型連接子可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/ 132799.doc -264· 200918089 或肽片段之f切成肽鍵㈣備。該等肽鍵刊如根據肽化 學領域中眾所周知之液相合成方法（E Seh咖er及k. Ltibke (1965) "The Peptides1' ^ 76-136 1 ^ Academic
Press)來製備。連接子中間物可以包括間隔基、延展基及 胺基酸單元之任何反應組合或反應順序組裝。間隔基、延 展基及胺基酸單元可利用性f上為親電子、親核性或自由 基之反應性官能基。反應性官能基包括（但不限於）羧基、 羥基、對硝基苯基碳酸酯、異硫氰酸酯及離去基，諸如〇_ 甲石黃酿基、0-甲苯續醯基、_a、_Br、七或順丁稀二醯 亞胺。 舉例而。，諸如崎酸根（_S〇3_)或録之帶電取代基可增加 。式浏之水/合性且有助於連接子試劑與抗體或藥物部分之偶 合反應，或有助於Ab-L(抗體_連接子中間物）與1)或〇_1^(藥 物連接子中間物）與Ab之偶合反應，此視用於製備ADC之 合成途徑而定。 連接子試劑 可使用各種雙官能連接子試劑來製造抗體與奧瑞他汀之 結合物，該等連接子試劑諸如N_ 丁二醯亞胺基_3_(2_吡啶 基二硫基）丙酸S旨（SPDP)、丁二醯亞胺基_4_(N_順丁烯二醯 亞胺基曱基）環己烧·1,曱酸s旨（SMCC)、亞胺基硫雜環戍燒 (IT)、亞胺基酯之雙官能衍生物（諸如己二亞胺二甲酯鹽酸 鹽）、活性酿（諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯）、醛（諸如戊二 醛）、雙疊氮基化合物（諸如雙（對疊氮基苄醯基）己二胺）、 雙重氮鏽衍生物（諸如雙_(對重氮鏽苄醯基）_乙二胺）、二異 132799.doc •265 - 200918089 氰酸酯（諸如曱苯2,6-二異氰酸酯）及雙活性氟化合物（諸如 1,5-二氟-2,4-二硝基苯）。 抗體藥物結合物亦可用下列連接子試劑製備： BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、 MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMPB、SMPH、磺酸 基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB以及 SVSB(丁二醯亞胺基-(4-乙烯基颯）苯曱酸酯），且包括雙-順丁烯二醯亞胺試劑：DTME、BMB、BMDB、BMH、 BMOE、1，8-雙-順丁烯二醯亞胺基二乙二醇（BM(PEO)2)及 ι，ιι-雙-順丁烯二醯亞胺基三乙二醇（bm(peo)3)，其可購 自 Pierce Biotechnology, Inc.、ThermoScientific (Rockford, IL)及其他試劑供應商。雙-順丁烯二醯亞胺試劑允許半胱 胺酸工程化抗體之硫醇基以依序或同時方式連接於含有硫 醇之藥物部分、標記或連接子中間物。除順丁烯二醯亞胺 外之可與半胱胺酸工程化抗體、藥物部分、標記或連接子 中間物之硫醇基反應的其他官能基包括碘乙醯胺、溴乙醯 胺 '乙烯基吡啶、二硫化物 '吡啶基二硫化物、異氰酸酯 及異硫氰酸酯。
βμ(ρεο)2 0 Ο
Ό ΒΜ(ΡΕ0)3 適用連接子試劑亦可經由其他商業來源獲得，諸如 132799.doc •266- 200918089
Molecular Biosciences Inc.(Boulder, CO)，或根據下列文獻 中所述之程序來合成：Toki等人（2002) J. Org. Chem.
67:1866-1872 ;Walker, Μ, ,Α· (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355 ；Frisch 等 人 (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186 ； US 6214345 WO 02/088172 ；US 2003130189 ； US 2003096743 ；WO 03/026577 ；WO 03/043583 ；及 WO 04/032828 ° 可藉由使下列連接子試劑與胺基酸單元之N末端反應來 將式（Ilia)之延展基引入連接子中：
其中η為範圍為1-10之整數且T為-H或-S03Na ;
132799.doc -267- 200918089
可藉由使下列雙官能試劑與胺基酸單元之N末端反應來 將延展基單元引入連接子中：
亦可藉由使下列雙官能試劑與胺基酸單元之N末端反應 來將式之延展基早元引入連接子中：
132799.doc •268- 200918089
Ο B〇c~NH'NH2--^~~y^ 具有順丁稀二酿亞胺延展基及對胺基节基胺甲醯基 (PAB)自我犧牲型間隔基之例示性纈胺酸_瓜胺酸（val_eit4 vc)二肽連接子試劑具有以下結構：
具有順丁烯二酿亞胺延展基單元及pAB自我犧牲型間隔 基單元之例示性phe-lys (Mtr，單-4-甲氧基三苯甲基）二肽 連接子試劑可根據Dubowchik等人（1997) Tetrahedron Letters，38:5257-60來製備，且具有以下結構：
半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體_藥物結合物之製備 式I之ADC可藉由若干途徑利用熟習此項技術者已知之 有機化學反應、條件及試劑來製備，包括：（1)使半胱胺酸 工程化抗體之半胱胺酸基團與連接子試劑反應，以形成經 132799.doc -269- 200918089 由共價鍵連接之抗體_連接子中間物Ab_L，接著與活化藥 物部分D反應；及（2)使藥物部分之親核性基團與連接子試 劑反應，以形成經由共價鍵連接之藥物-連接子中間物D_ L，接著與半胱胺酸工程化抗體之半胱胺酸基團反應。結 合方法（1)及（2)可利用各種半胱胺酸工程化抗體、藥物部 分及連接子用於製備式丨之抗體-藥物結合物。 抗體半胱胺酸硫醇基具親核性且能夠與連接子試劑及藥 物-連接子中間物上之親電子基團反應形成共價鍵，該等 連接子試劑及藥物-連接子中間物包括：（i)活性酯，諸如 NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸酯及醯基鹵；⑴）烷基及苄基鹵 化物，諸如_乙醯胺；（iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醢亞 胺基團；及（iv)二硫化物，包括吡啶基二硫化物，經由硫 化物交換。藥物部分上之親核性基團包括（但不限於）： 胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、硫代半卡巴腙、羧酸肼 及芳基醯肼基團，其能夠與連接子部分及連接子試劑上之 親電子基團反應形成共價鍵。 可使半胱胺酸工程化抗體具有反應性以便藉由用諸如 DTT(克萊蘭氏試劑（Cieiand’s reagent)，二硫蘇糖醇）或 TCEP(鹽酸參（2_叛基乙基）膦；Getz等人（1999) Anal. Biochem·第 273卷：73-80 ; Soltec Ventures，Beverly，MA)之 還原劑處理，接著再氧化以重新形成鏈間及鏈内二硫鍵 (實例5)而與連接子試劑結合。舉例而言，於37。〇下用約5〇 倍莫耳過1之TCEP還原表現於CHO細胞中之全長半胱胺 酸工程化單株抗體（ThioMab)歷時3小時以還原半胱胺酸加 132799.doc •270 · 200918089 合物中之二硫鍵，其可在新引入之半胱胺酸殘基與存在於 培養基中之半胱胺酸之間形成。將經還原之Thi〇Mab稀釋 且以1 0 mM乙酸鈉（pH Tm P )裝載於HlTrap S管柱上，且用含 有0.3 Μ氯化鈉之PBS溶離。於室溫下利用稀（福)硫酸 銅（cuS〇4)水溶液（隔夜），在存在於親本祕中之半耽胺酸 殘基之間重新形成二硫鍵。或者，脫氫抗壞血酸（DHAA) 為可在半胱胺酸加合物之還原裂解後有效用於重新形成半 f 胱胺酸工程化抗體之鏈内二硫基的氧化劑。可使用此項技 術中所已知之其他氧化劑及氧化條件。周圍空氣氧化亦為 有效的。此溫和部分再氧化步驟以高保真度有效形成鏈内 二硫鍵且保留新引入之半胱胺酸殘基之硫醇基。添加約10 倍過量之藥物連接子中間物（例如MW··， 加以混合，且於室溫下雜 下靜置約1小時以實現結合且形成抗_ 。職抗體-藥物結合物。將結合混合物凝膠過遽且經由 阶叫8管柱裝載並溶離以移除過量藥物-連接子中間物及 其他雜質。 、—展丁裝備由細胞培養物表現之半胱胺酸工程化抗體 以進订結合的通用方法。當細胞培養基含有半胱胺酸時， :硫化物加合物可在新引入之半胱胺酸胺基酸與來自培養 二之半胱胺酸之間形成。必須使圖“之例示性 生左）中以圓所示的此等半耽胺酸加合物還原以產 之還應性之半胱胺酸工程化抗體。用諸如職^ 片性裂解…肤胺酸加合物大概與各種鍵間二硫鍵一起還 原丨生裂解以Υ寻到 于]抗體之還原形式。在部分氧化條件下利用 132799.doc -271 - 200918089 硫酸銅、DHA A或暴露於周图翁& & 黍路於周圍虱而重新形成介於配對半胱 胺酸殘基之間的鏈間二硫鍵。新引 ^ 新与丨入、經工程化及未配對 之半耽胺酸殘基仍可用於盘植垃工 用％興遲接子試劑或藥物-連接子中 間物反應以形成本發明之抗體纟士入私 人十如乃 < 机體結合物。表現於哺乳動物細 胞株中之Thi—b產生經由·s_s.鍵形成與工程化Cys外部
結合之Cys加合物。因此’用如實例5中所述之還原及再氧 化程序處理經純化之ThioMab以產生反應性ThioMal^此 等ThioMab用於與含有順丁烯二醯亞胺之細胞#性藥物、 螢光團及其他標記結合。 10.免疫脂質體 本文所揭示之抗-CD79b抗體亦可被調配為免疫脂質 體。π脂質體’’為由適用於將藥物傳遞至哺乳動物之各種類 型之脂質、磷脂及/或界面活性劑構成的小泡。脂質體 之組分通常排列成雙層構造，類似於生物臈之脂質排列。 含有抗體之脂質體係藉由此項技術中已知之方法來製備， 諸如 Epstein 等人，Proc· Natl· Acad. Sci. USA 82:3688
(1985) ; Hwang 等人 ’ Proc· Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980);美國專利第 4,485,045 號及第 4,544,545 號；及1997年10月23日公開之W097/38731中所述之方 法。循環時間提尚之脂質體係揭示於美國專利第5, 〇 1 3 5 5 6 號中。 尤其適用之脂質體可藉由用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及 PEG衍生之磷脂醯乙醇胺（PEG_PE)之脂質組合物的逆相蒸 發法來產生。經由限定孔徑之過濾器擠出脂質體以得到具 I32799.doc -272- 200918089 有所需直徑之脂質體。本發明之抗體之Fab’片段可經由二 硫鍵互換反應而與脂質體結合（如Martin等人，J. Biol, them· 257:286-288 (1982)中所述）。脂質體内視情況含有 化子冶療劑。參見 Gabizon等人，J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989)。 B.某些製造抗體之方法 1.篩選具有所需特性之抗_CD79b抗體 用於產生結合於CD79b多肽之抗體之技術已在上文描 述°吾人可進一步按需要選擇具有某些生物學特性之抗 體。 本發明之抗-CD79b抗體之生長抑制效應可藉由此項技術 中已知之方法來評估，例如使用内源性表現或在用CD79b 基因轉染後表現CD79b多肽之細胞。舉例而言，可用各種 濃度之本發明之抗_CD79b單株抗體將適當腫瘤細胞株及 CD79b轉染之細胞處理幾天（例如2_7天）且用結晶紫或mtt 染色或藉由一些其他比色檢定分析。另一量測增生之方法 將藉由比較在本發明之抗_ c D 7 9 b抗體存在或不存在的情況 下處理之細胞的3H-胸苷吸收來進行。在處理後，採集細 胞且以閃爍計數器量化併入DNA中之放射性量。適當陽性 對照包括用已知抑制所選細胞株生長之生長抑制性抗體處 理彼細胞株。腫瘤細胞之活體内生長抑制可以此項技術中 已知之各種方式來測定。腫瘤細胞可為過表現cD79b多肽 之、、田胞。與未經處理之腫瘤細胞相比，抗—CD?%抗體可將 表現CD79b之腫瘤細胞活體外或活體内之細胞增生抑制約 132799.doc -273 · 200918089 25-100°/。’更佳抑制約3〇_1〇〇%，且在一實施例中，在約 〇·5 pg/ml至30 pg/ml之抗體濃度下甚至更佳抑制約5〇_ 100°/。或70-100%。生長抑制可於在細胞培養物中約〇 5 pg/ml至30 pg/ml或約0.5 nM至200 nM之抗體濃度下量測， 其中在使腫瘤細胞暴露於抗體後1_1〇天測定生長抑制。若 投與約1微克/公斤體重至約100毫克/公斤體重之抗_CD79b 抗體導致在距離第一次投與抗體約5天至3個月内（較佳約5 天至3 0天内）腫瘤尺寸減小或腫瘤細胞增生減少，則抗體 具活體内生長抑制性。 為選擇誘發細胞死亡之抗_CD79b抗體，可相對於對照組 評估如由例如碘化丙啶（PI)、錐蟲藍或7AAD攝取所指示的 膜完整性之損失。PI攝取檢定可在補體及免疫效應細胞不 存在之情況下執行。將表現CD79b多肽之腫瘤細胞與單獨 培養基或含有適當抗_CD79b抗體（例如約10 pg/mi)之培養 基一起培養。將細胞培養3天之時段。繼各處理後，將細 胞洗條且等分至蓋有35 mm過遽器之12x75管中（每管1 ml ’每治療組3管）以移除細胞凝塊❶接著管接受ρι(1〇 pg/ml)。可使用FACSCAN®流式細胞儀及FACSCONVERT® CellQuest軟體（Becton Dickinson)分析樣品。可選擇如藉由 PI攝取所測定之彼等誘導統計學上顯著的細胞死亡量之 抗-CD79b抗體作為誘發細胞死亡之抗_CE>79b抗體。 為篩選結合於由所關注之抗體結合之CD79b多肽上的抗 原決定基之抗體，可執行常規交又阻斷檢定，諸如 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 132799.doc -274- 200918089
Laboratory，Harlow及 David Lane 編輯，（1988)中所述之彼 檢定。此檢定可用於測定是否測試抗體結合與已知抗_ CD79b抗體相同之位點或抗原決定基。或者或另外，可藉 由此項技術中已知之方法執行抗原決定基定位。舉例而 言，可諸如藉由丙胺酸掃描誘發抗體序列突變以鑑別接觸 殘基。最初測試突變抗體與多株抗體之結合以確保正確摺 豐。在不同方法中，對應於CD79b多肽之不同區域之肽可 與測試抗體或與測試抗體及具有經表徵或已知抗原決定基 之抗體一起用於競爭檢定中。 2.某些庫篩選方法 本發明之抗-CD79b抗體可藉由使用組合庫篩選具有所需 活性之抗體來製備。舉例而言，此項技術中已知各種用於 產生嗟菌體呈現庫及針對具有所需結合特徵之抗體筛選該 等庫的方法。該等方法—般描述於HGQgenb_等人（謂^ in Methods in Molecular Bi〇1〇gy 178:1 37 (〇,Β_ 等人 編，Press，T〇t〇wa，NJ)中，且在某些實施例中描述 於 Lee 等人（2004) j. Μ〇ι 出〇1 34〇 ι〇73ι〇93 中。 原則上藉由篩選含有呈現與噬菌體外殼蛋白融合之抗 體可變區㈣之各種片段的嗟菌體之嗤菌體庫來選擇合成 抗體純系。藉由針對戶斤堂P @ + 斤需抗原之親和層析淘選該等噬菌體 庫。使表現能夠結合於所需抗原之Fv片段之純系吸附於抗 二f因此與庫中之非結合純系分離。接著將結合純系自 抗原ί谷離出來，且可逸一牛益山仏 V藉由抗原吸附/溶離之額外循 展 本發明之抗_CD79b抗體中之任-者可藉由設計 132799.doc -275- 200918089 合適之抗原篩選程序以選擇所關注之噬菌體純系，接著使 用來自所關注之噬菌體純系之Fv序列及合適恆定區（FC)序 列來建構全長抗-CD79b抗體純系（Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD (1991)，第 1-3卷中所 述）而獲得。 在某些實施例中，抗體之抗原結合域係由兩個約1 10個 胺基酸之可變（V)區形成，各來自輕鏈（VL)及重鏈（VH)， 兩者皆存在有三個高變環（HVR)或互補判定區（CDR)。如 Winter 等人 ’ Ann. Rev. Immunol·，12: 433-455 (1994)中戶斤 述，可變域可就功能而言以下列形式呈現於噬菌體上：單 鏈Fv(scFv)片段’其中VH及VL經由短撓性肽共價連接； Fab片段，其中其各自與恆定域融合且非共價地相互作 用。如本文所使用，編碼scFv之噬菌體純系及編碼Fab之 嗟菌體純系被統稱為"Fv嗟菌體純系"或"Fv純系"。 VH及VL基因之譜系可獨立地藉由聚合酶鍵反應（pcr)選 殖且隨機再組合於噬菌體庫中，接著可查找抗原結合純 系’此如 Winter等人 ’ Ann. Rev. Immunol” 12: 433-455 (1994)中所述。來自經免疫來源之庫向免疫原提供高親和 力抗體而無需建構融合瘤。或者，可選殖初始譜系以向各 種非自體抗原以及自體抗原提供人類抗體之單一來源而無 需任何免疫處理（如Griffiths等人，EMBO J，12: (1993)所述）。最後，亦可藉由選殖來自幹細胞之未重排之 V基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引子來編碼高可 132799.doc -276· 200918089 變CDR3區及實現活體外重排（如Hoogenboom及Winter，J. M〇1· Bio1·，227: 381-388 (1992)所述），從而以合成方式製 備初始庫。 在某些實施例中，使用絲狀噬菌體來藉由與次要外殼蛋 白pin融合而呈現抗體片段。抗體片段可以下列形式呈 現：單鏈Fv片段’其中VH及VL域藉由撓性多肽間隔基連 接於同一多肽鏈上’例如Marks等人’ j· M〇i. Bi〇l.，222: 581-597 (1991)所述；或Fab片段，其中一條鏈與ρΙΠ融合 且另一條分泌至細菌宿主細胞周質中，在該周質中藉由置 換一些野生型外殼蛋白來組裝呈現於噬菌體表面上之F a b _ 外设蛋白結構，例如Hoogenboom等人，Nucl. Acids Res.， 19: 4133-4137 (1991)中所述。 一般而言，編碼抗體基因片段之核酸係自採集自人類或 動物之免疫細胞獲得。若需要偏向有利於抗_CD79b純系之 庫，則用CD79b使個體免疫以產生抗體反應，且回收脾細 胞及/或循環B細胞或其他周邊血淋巴細胞（pBL)以用於建 構庫。在一較佳實施例中，偏向有利於抗_CD79b純系之人 類抗體基因片段庫係藉由在帶有功能性人類免疫球蛋白基 因陣列（且缺乏功能性内源性抗體產生系統）之轉殖基因小 鼠體内產生抗-CD79b抗體反應以至於CD79b免疫導致形成 產生針對CD79b之人類抗體之b細胞而獲得。產生人類抗 體之轉殖基因小鼠之產生描述如下。 抗-CD79b反應性細胞群體之另外富集可藉由使用合適之 篩選程序來分離表現CD79b特異性膜結合抗體之B細胞（例 132799.doc -277- 200918089 如藉由使用CD79b親和層析分離細胞或使細胞吸附於榮光 染料s己之CD79b接著進行流式活化細胞分選（facs)來達 成）而獲得。 或者’使用來自未經免疫之供體之脾細胞及/或B細胞或 其他PBL挺供可此抗體譜糸之較好圖示，且亦允許使用 CD79b不具抗原性之任何動物（人類或非人類）物種建構抗 體庫。對於合併活體外抗體基因構建之庫而言，自個體採 集幹細胞以提供編碼未重排之抗體基因區段之核酸。所關 注之免疫細胞可自各種動物物種獲得，諸如人類、小鼠、 大鼠、兔類、狼類、犬類、貓類、豬類、牛類、馬類及鳥 類物種等。 自所關注之細胞回收編碼抗體可變基因區段（包括VH及 VL區段）之核酸且進行擴增。在重排vh及VL基因庫之情 況下，所需DNA可藉由自淋巴細胞分離染色體組dna或 mRNA，接著用匹配重排VH及VL基因之5’及3'末端的引子 進行聚合酶鏈反應（PCR)(如Orlandi等人，Proc. Natl.Acad. Sci_ (USA), 86: 3833-3837 (1989)中所述），藉此為表現製 得不同V基因譜系而獲得。v基因可用編碼成熟v域之外顯 子之5’末端處的反向引子及立基於j區段内之前向引子（如
Orlandi 等人（1989)及 Ward 等人，Nature, 341: 544-546 (1989)中所述;)自cDNa及染色體組dmA擴增。然而，對於 自cDNA擴增而言，反向引子亦可立基於前導外顯子中（如
Jones等人，Bi〇techn〇l·，9: 88-89 (1991)中所述），且前向 引子立基於恆定區内（如Sastry等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 132799.doc • 278 · 200918089 (USA)，86: 5728-5732 (1989)中所述）。為使互補性達到最 大，可如Orlandi等人（1989)或Sastry等人（1989)中所述將簡 併併入引子中。在某些實施例中，為了擴增存在於免疫細 胞核酸樣品中之所有可用VH及VL排列，藉由使用把向各 V基因家族之PCR引子使庫多樣性最大化，例如Marks等 人，J. Mol. Biol·，222: 581-597 (1991)之方法中所述或
Orum等人，Nucleic Acids Res·，21: 4491-4498 (1993)之方 法中所述。為了將擴增之DNA選殖至表現載體中，可如 Orlandi等人（1989)中所述將稀有限制性位點作為一端處之 標籤引入PCR引子内，或如Clackson等人，Nature, 352. 624-628 (1991)中所述進一步用標籤引子進行PCR擴增。 合成重排V基因之譜系可自V基因區段活體外產生。已 對大多數人類VH基因區段進行選殖及定序（TomHns〇n等 人，J. Mol. Biol·，227: 776-798(1992)中所報導），並加以 定位（Matsuda等人，Nature Genet.，3: 88-94 (1993)中所耜_ 導）；此等經選殖之區段（包括HI及H2環之所有主要構形） 可用於以編碼不同序列及長度之H3環之PCR引子產生不同 VH基因譜系（如 Hoogenboom&Winter，J.Mol.Biol.，227· 381-388 (1992)中所述）。亦可如 Barbas 等人，proc, Natl. Acad. Sci. USA，89: 445 7-4461 (1992)中所述製備所有序列 多樣性集中於單一長度之長H3環中之VH譜系。已對人類 Vk及νλ區段進行選殖及定序（Williams及Winter，Eur. J. Immunol，，23: 1456-1461 (1993)中所報導）且可用於製備合 成輕鏈譜系。基於一系列VH與VL摺疊及L3與H3長度之合 132799.doc -279- 200918089 成v基因譜系將編碼具有可觀結構多樣性之抗體。繼編碼 V基因之DNA的擴增後，可根】
Mol· B1〇l.，227: 381-388 (1992)之方法使生殖系乂基因區段 於活體外重排。 抗體片段之譜系可藉由以若干方式將VH及乂1基因譜系 組合在一起而建構。各譜系可在不同載體中形成，且將該 等載體在活體外再組合，例如H〇grefe等人，Gene, 128: 119 126 (1993)中所述，或藉由組合感染在活體内再組 合，例如 Waterhouse等人，Nucl. Acids Res，21: 2265_ 2266 (1993)中所述之l〇xP系統。活體内再組合方法利用
Fab片段之兩鏈性質來克服由大腸桿菌轉型效率對庫尺寸 所施加之限制。分別對初始¥11及VL譜系進行選殖，一個 選殖至噬粒中且另一個選殖至噬菌體載體中。接著藉由含 有噬粒之細菌之噬菌體感染將兩個庫組合以至於各細胞含 有不同組合且庫尺寸僅受限於所存在之細胞之數目（約i〇u 個純系）。兩載體含有活體内再組合信號以至於將VH及VL· 基因再組合於單一複製子上且共包裝於噬菌體病毒粒子 中。此等巨大庫提供大量具有良好親和力之不同抗體（Kj 為約 1(Γ8 Μ)。 或者’可將該等譜系依序選殖至同_載體中，例如
Barbas等人，pr〇c Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)中所述，或藉由pCR組裝在一起且接著選殖，例如
Clackson專人，Nature, 352: 624-628 (1991)中所述。PCR 組裝亦可用於連接VH及VL· DNA與編碼撓性肽間隔基之 132799.doc 200918089 DNA以形成單鏈Fv(scFv)譜系。在另一技術中，使用"細胞 内PCR組裝"藉由PCR將vh及VL基因組合於淋巴細胞内且 接著選殖連鎖基因之譜系（如Embleton等人，Nucl. Acids
Res.，20: 383 1-3837 (1992)中戶斤述）。 由初始庫（天然或合成）所產生之抗體可具有中等親和力 (Kd為約1 〇6至1 〇7 M·1)，但亦可藉由自次級庫建構及再選 擇來活體外模擬親和力成熟（如Winter等人（1 994)(見上）中 所述）。舉例而言’可藉由在Hawkins等人，j. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)之方法或 Gram等人，Proc. Natl. Acad.
Sci USA’ 89: 3576-3580 (1992)之方法中使用易錯聚合酶 (Leung荨人 ’ Technique，1: 11-15 (1989)中所報導）而於活 體外隨機地引入突變。另外，可藉由隨機地使所選個別Fv 純系中之一或多個CDR突變（例如使用PCR，用帶有跨越所 關注之CDR之隨機序列的引子），且篩選較高親和力純系 來執行親和力成熟。WO 9607754( 1996年3月14日公開）描 述一種誘發免疫球蛋白輕鏈之互補判定區突變以形成輕鏈 基因庫之方法。另一有效方法係如Marks等人， Biotechnol.，10: 779-783 (1992)中所述將藉由噬菌體呈現 所遥之VH或VL域與自未經免疫供體獲得的天然存在之v 域變異體之譜系再組合且以若干輪鏈改組篩選較高親和 力。此技術允許產生具有約1〇·9 Μ或更小之親和力之抗體 及抗體片段。 庫之篩選可藉由此項技術中已知之各種技術來完成。舉 例而言，CD79b可被用於塗覆吸附板之孔，被表現在附著 132799.doc -281 · 200918089 於吸附板之宿主細胞上或被用於細胞分選，或與生物素結 合以用塗有抗生蛋白鏈菌素之珠粒進行捕捉，或被用於任 何其他用於淘選噬菌體呈現庫之方法中。 使嗔菌體庫樣品與固定CD79b在適合於使噬菌體顆粒之 至少一部分與吸附劑結合的條件下接觸。通常，選擇包括 pH值、離子強度、溫度及其類似條件之條件來模擬生理條 件。將結合於固相之噬菌體洗滌且接著以酸溶離，例如
Barbas專人，Proc. Natl. Acad. Sci USA，88: 7978-7982 k (1991)中所述’或以鹼溶離，例如Marks等人，J. Mol.
Biol·，222: 581-597 (1991)中所述，或藉由cD79b抗原競爭 溶離’例如類似於Clackson等人，Nature, 352: 624-628 (1991)之抗原競爭方法之程序。在單輪選擇中可使喔菌體 富集20-1，〇〇〇倍。此外，可使富集之噬菌體生長於細菌培 養物中且經受其他輪之選擇。 選擇效率視許多因素而定，包括洗滌期間之解離動力學 , 性質，及是否單一噬菌體上之多個抗體片段可同時與抗原 V - 嗜合。具有快速解離動力學性質（及弱結合親和力）之抗體 可通過利用短時間洗滌、多價噬菌體呈現及於固相中之高 抗原塗覆密度來保留。高密度不僅經由多價相互作用使嗤 菌體穩定’且亦有利於已解離之噬菌體重新結合。具有緩 慢解離動力學性質（及良好結合親和力）之抗體的選擇可通 過利用長時間洗滌及單價噬菌體呈現（如Bass等人，
Proteins，8: 309-314 (1990)及 WO 92/09690 中所述）及低抗 原塗覆密度（如 Marks 等人，Biotechnol·, 10: 779-783 132799.doc -282- 200918089 (1992)中所述）來促進β 有可能在不同親和力之噬菌體抗體之間選擇，即使對於 CD79b之親和力略微不同亦然。然而，所選抗體之隨機 突變（例如在一些親和力成熟技術中所執行）彳艮可能導致 許多突變、大多數與抗原結合且少許具有較高親和力。 在限制CD79b之情況下’稀有高親和力嗤菌體可被競爭 出局。為保留所有較高親和力突變體，可將喧菌體與過 量生物素標記之CD79b —起培養，但生物素標記之 CD79b的莫耳濃度比對於CD79b之靶莫耳親和力常數 低。接著可藉由塗有抗生蛋白鏈菌素之順磁性珠粒捕捉 南親和力結合嗟菌體。該"平衡捕捉”允許根據結合親和力 選擇抗體，其靈敏度允許具有僅僅高兩倍之親和力之突變 純系與大大過量之具有較低親和力之噬菌體分離。亦可控 制用於洗滌結合於固相之噬菌體之條件以基於解離動力學 進行區分。 可基於活性選擇抗-CD79b純系。在某些實施例中， 本發明提供結合於天然表現CD79b之活細胞之抗-CD79b 抗體。在一實施例中，本發明提供阻斷C D 7 9 b配位體與 CD79b之間的結合、但不阻斷CD79b配位體與第二蛋白 質之間的結合之抗-CD79b抗體。對應於該等抗- CD79b 抗體之Fv純系可藉由下列步驟進行選擇··（ 1)自如上文 所述之噬菌體庫分離抗-CD79b純系，且視情況藉由使 所分離之噬菌體純系群體在合適之細菌宿主中成長來擴 增該群體；（2)選擇分別需要阻斷及非阻斷活性所針對之 132799.doc - 283 - 200918089 CD79b及第二蛋白質. ，（）使抗-CD79b噬菌體純系吸附 於固定CD79b ; (4)使用過量 置第一蛋白質來;谷離識別與第 二蛋白質之結合決定子番蟲斗、 且或與别述者共有之CD79b結 合決定子的任何不希望古^ . 有之純系；及（5)溶離在步驟（4) 之後仍吸附之純系。視楂π π # 巩匱况，可進一步藉由將本文所述之 選擇程序重複一或多次爽舍隹曰士 人采田集具有所需阻斷/非阻斷特性 之純系。 容易使用習知程序（例如驻a f \ U』如藉由使用經設計用以自融合瘤 或唾菌體DNA模板特異性擴增所關注之重鏈及輕鏈編碼區 域之寡核普酉夂引子）將編碼本發明之融合瘤源性單株抗體 或噬菌體呈現Fv純系之DNA分離及定序。分離後，可將 驅置於表現載體巾，㈣將其轉染至諸如大腸桿菌細 胞、猿cos細胞、中國倉鼠印巢（CH〇)細胞或骨髓瘤細胞 之不以其他方式產生免疫球蛋白蛋白質之宿主細胞中以 獲得所需單株抗體在重組宿主細胞中之合成。關於編碼抗 體之DNA在細菌中之重組表現的評述文章包括认⑽等 人，Cun·· 〇pinion in Immun〇1，5: 256
Immunol· Revs，130: 151 (1992)。 可將編碼本發明之Fv純系之DNA與編碼重鏈及/或輕鏈 恆疋區之已知DNA序列組合（例如可自Kabat等人（見上）獲 得適當DNA序列）以形成編碼全長或部分長度之重鏈及“戈 輕鏈之純系。應瞭解任何同型之恆定區可用於此目的，包 括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恆定區，且該等恆定區可自 任何人類或動物物種獲得。源自一種動物（諸如人類）物種 132799.doc -284- 200918089 之可變域DNA且接著與另一動物物種之恆定區〇ΝΑ融合以 形成"雜合”全長重鏈及/或輕鏈之編碼序列的Fv純系係包括 在如本文所使用之”嵌合，•及，，雜合"抗體之定義中。在某些 實施例中，將源自人類可變DNA之Fv純系與人類恆定區 DNA融合以形成全長或部分長度之人類重鏈及/或輕鏈之 編碼序列。 編碼源自融合瘤之抗-CD79b抗體之DNA亦可例如藉由用 人類重鏈及輕鏈恆定域之編碼序列取代以替代源自融合瘤 純系之同源鼠類序列來進行修飾（例如Morrison等人，
Proc. Natl. Acad. Sci. USA，81: 685 1-6855 (1984)之方 法）。編碼融合瘤或Fv純系源性抗體或片段之DNa可進一 步藉由使非免疫球蛋白多肽之編碼序列之全部或部分共價 連接於免疫球蛋白編碼序列來進行修飾。以此方式，製備 具有本發明之F v純系或融合瘤純系源性抗體之結合特異性 的”嵌合”或”雜合”抗體。 C，抗體依賴性酶介導前藥療法（adept) 本發明之抗體亦可藉由使抗體與能使前藥（例如肽基化 學治療劑，參見WO 81 /〇 1145)轉化為活性抗癌藥物之前藥 活化酶結合而用於ADEPT中。參見例如w〇 88/07378及美 國專利第4,975,278號。 適用於ADEPT之免疫結合物之酶組分包括能夠以一定方 式作用於前藥以便使前藥轉化為其更具活性之細胞毒性形 式的任何酶。 適用於本發明之方法之酶包括（但不限於）鹼性磷酸酶， 132799.doc -285- 200918089 其適用於將含有碌酸醋之前藥轉化為游離藥物；芳基硫酸 酉曰酶，其適用於將含有硫酸醋之前藥轉化為游離藥物；胞 哺咬脫胺酶’其適用於將無毒5_1胞㈣轉化為抗癌藥 物’ 5-氟尿。密咬；蛋白酶’諸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱 菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧基肽酶及組織蛋白酶 (諸如組織蛋白酶BU)，其適用^將含有肽之前藥轉化 為游離藥物；D·丙胺醯錢基肽酶，其適用於轉化含有 D-胺基酸取代基之前藥；碳水化合物裂解酶，諸如卜半 乳糖普酶及神經胺糖酸普酶，其適用於將糖基化前藥轉 化為㈣藥物；β_内醯胺酶，其適用於將用卜内醯胺衍 生之藥物轉化為游離藥物；及青黴素醯胺酶，諸如青黴 素V醯胺酶及青黴素G醯胺酶，其分別適用於將於其胺 氮處用苯氧基乙醯基或苯乙基衍生之藥物轉化為游離藥 物。或者，具有酶促活性之抗體（此項技術中亦稱為，，抗 體酶”)可用於將本發明之前藥轉化為游離活性藥物(參 見例如 Massey，Nature 328:457_458 (1987))。為將抗體酶 傳遞至腫瘤細胞群體可如本文所述製備抗體_抗體酶結合 物。 本發明之酶可藉由此項技術中熟知之技術（諸如使用上 述所論述之異型雙官能交聯劑）來共價結合於抗_cD79b抗 體。或者，至少包含至少連接於本發明之酶之功能活性部 刀的本發明之抗體之抗原結合區的融合蛋白可使用此項技 術中熟知之重組DNA技術來建構（參見例如Neuberger等 人 ’ Nature 312:604-608 (1984))。 132799.doc -286· 200918089 D.抗-CD79b抗體 除了本文所述之抗-CD79b抗體，預期可製備抗_CD79b 抗體變異體。抗_CD79b抗體變異體可藉由將適當核苷酸變 化引入編碼DNA中，及/或藉由合成所需抗體或多肽來製 備。熟習此項技術者應瞭解，胺基酸變化可能改變抗_ CD79b抗體之轉譯後過程，諸如改變糖基化位點之數目或 位置或改變膜錨定特徵。 本文所述之抗-CD79b抗體之變化可例如使用（例如）美 國專利第5,364,934號中所述用於保守性及非保守性突變 之技術及準則中的任一者來產生。變化可為一或多個編碼 抗體或多肽之密碼子之取代、缺失或插入’此導致胺基酸 序列與天然序列抗體或多肽相比有變化。視情況，該變化 為用抗-CD79b抗體之一或多個域中之任何其他胺基酸 取代至少一個胺基酸。對於確定可插入、取代或缺失哪個 胺基酸殘基而不會不利地影響所需活性之指導可藉由比較 抗-CD79b抗體之序列與同源已知蛋白質分子之序列且 將高同源性區域中所產生之胺基酸序列變化之數目減至最 少而得到。胺基酸取代可為用另一個具有類似結構及/或 化學特性之胺基酸置換一個胺基酸之結果，諸如用絲胺酸 置換白胺酸，亦即保守性胺基酸置換。插入或缺失可視情 況在約1個至5個胺基酸之範圍内。所允許之變化可藉由 系統地在序列中進行胺基酸之插入、缺失或取代且針對由 全長或成熟天然序列所展現之活性測試所得變異體而判 定。 132799.doc •287- 200918089 本文提供抗-CD79b抗體片段。該等片段可於N末端或c 末端處截短，或可缺乏内部殘基，例如當與全長天然抗體 或蛋白質相比時。某些片段缺乏對於抗_CD79b抗體之所需 生物活性並非必需之胺基酸殘基。 抗-CD79b抗體片段可藉由許多習知技術中之任一者來製 備。所需肽片段可以化學方法合成。—種替代性方法包含 藉由酶促消化產生抗體或多肽片段，例如藉由用已知於由 特定胺基酸殘基界定之位點處使蛋白質裂解之酶處理蛋白 質，或藉由用合適之限制酶消化DNA且分離所需片段。另 一合適之技術包含分離編碼所需抗體或多肽片段之d n A片 段及藉由聚合酶鏈反應（pCR)擴增。在pcR中於5，及引子 處利用界定DNA片段之所需末端之寡核苷酸。較佳地， 抗-CD79b抗體片段與本文所揭示之天然抗_CD79b抗體共 有至少一種生物及/或免疫活性。 在特定實施例中，所關注之保守性取代係如表6中較佳 取代之標題下所示。若該等取代導致生物活性變化，則引 入表6中稱為例示性取代或如下文進一步關於胺基酸種類 所述之更多實質變化且篩選產物。 132799.doc 288- 200918089 表6 原始殘基 例示性取代 較佳取代 Ala(A) val ; leu ; ile val Arg(R) lys ; gin ; asn lys Asn(N) gin ; his ; lys ; arg gin Asp(D) glu glu Cys(C) ser ser Gln(Q) asn asn Glu(E) asp asp Gly(G) pro ； ala ala His(H) asn ; gin ; lys ; arg arg He(I) leu ； val ； met ； ala ； phe ； 正白胺酸 leu Leu(L) 正白胺酸；ile ; val ; met ; ala ; phe ile Lys(K) arg ； gin ； asn arg Met(M) leu ； phe ； ile leu Phe(F) leu ; val ; ile ; ala ; tyr leu Pro(P) ala ala Ser(S) thr thr Thr(T) ser ser Trp(W) tyr ; phe tyr Tyr(Y) trp ; phe ; thr ; ser phe Val(V) ile ； leu ； met ； phe ； ala ;正白胺酸 leu 抗-CD79b抗體之功能或免疫學一致性之實質修飾係藉由 132799.doc •289· 200918089 ^擇取代來達成’該等取代在其對保持以下特徵之效應方 面顯著不同：⑷在取代區域中之多肽主鏈之結構，例如呈 摺疊或螺旋構形；(b)靶位點處之分子之電荷或疏水性；或 (C)側鏈之堆積推度。天然存在之殘基基於常見側鏈特性被 分為下列各組： (1) 疏水性··正白胺酸、met、ala、val、leu、Ue; (2) 中性親水性：CyS、ser、; (3) 酸性：aSp、giu ; (4) 鹼性：asn、gln、Ms、lys、arg ; (5) 影響鏈取向之殘基：giy、pr〇 ;及 (6) 方族.trp、tyr、phe。 非保守性取代將需要將此等種類中之一者的成員交換為 另一種類。該等經取代之殘基亦可引入保守性取代位點或 更佳地引入剩餘（非保守性）位點。 可使用此項技術中已知之方法來作出變化，諸如寡核苷 酸介導（定點）突變誘發、丙胺酸掃描及PCR突變誘發。可 對所選殖之DNA執行定點突變誘發[Carter等人，Nucl.
Acids Res.，13:4331 (1986) ; Zoller 等人，Nticl. Acids
Res·，10:6487 (1987)]、盒突變誘發[WeUs等人，Gene， 34:315 (1985)]、限制選擇突變誘發[wells等人，Phi〖〇s. Trans· R· Soc_ London SerA，317:415 (1986)]或其他已知 技術以產生抗-CD79b抗體變異體DNA。 掃描胺基酸分析亦可用於沿連續序列鑑別一或多個胺基 酸。在較佳掃描胺基酸中有相對小的中性胺基酸。該等胺 132799.doc -290- 200918089 基酸包括丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸及半胱胺酸。丙胺酸通 常為此組中之較佳掃描胺基酸，此係因為其消除了 β碳之 上的側鏈且不大可能改變變異體之主鏈構形[Cunningham 及 Wells，Science, 244:1081-1085 (1989)]。丙胺酸亦通常 為較佳的’此係因為其為最常見之胺基酸。此外，其常常 見於内埋與暴露位置處[Creighton, The Proteins，（W.H.
Freeman & Co.，ν·Υ·) ; Chothia，J. Mol. Bi〇l.，150:1 (1976)]。若丙胺酸取代不產生足夠量之變異體，則可使用 電子等排胺基酸。 不涉及維持抗_CD79b抗體之恰當構形之任何半胱胺酸殘 基亦可一般經絲胺酸取代，以改善分子之氧化穩定性且防 止異常交聯。相反’可將半胱胺酸鍵添加至抗-CD79b抗體 中以改善其穩定性（尤其當抗體為抗體片段時，諸如Fv片 段）。 尤其較佳之取代性變異體類型包含取代親本抗體（例如
人類化或人類抗體）之一或多個高變區殘基。一般，為進 一步發展而選擇之所得變異體將具有相對於產生其之親本 抗體改善之生物學特性。用於產生該等取代性變異體之習 知方式包含使用噬菌體呈現進行之親和力成熟。簡言之， 使若干高變區位點（例如，6_7個位點）突變以於各位點處產 生所有可能的胺基取代。由此產生之抗體變異體係以單價 方式自絲㈣㈣顆粒作為與包裝在各顆㈣之之基 因ηι產物的融合物呈現。接著㈣如本文中所揭示之生物 活性(例如結合親和力）筛選噬菌體呈現之變異體。為鑑別 132799.doc -291 . 200918089 修飾之候選高變區位點，可執行丙胺酸掃描突變誘發以鑑 別顯著有助於抗原結合之高變區殘基。或者或另外，其可 有益於分析抗原_抗體複合物之晶體結構以鑑別抗體與 CD79b多肽之間的接觸點。該等接觸殘基及相鄰殘基為根 據本文中詳述之技術進行取代之候選者。一旦產生該等變 異體後，使變異體組經受如本文所述之薛選且可為進一步 發展而選擇在一或多個相關檢定中具有優良特性之抗體。 編碼抗-CD79b抗體之胺基酸序列變異體之核酸分子係藉 由此項技術中已知之多種方法來製備。此等方法包括（但 不限於）自天然來源（在天然存在之胺基酸序列變異體之情 況下）分離或藉由早先製備之變異體或非變異體形式之抗_ CD79b抗體的寡核普酸介導（或定點）突變誘發、pcR突變 誘發及盒突變誘發來製備。 E.抗-CD79b抗體之修飾 抗-CD79b抗體之共價修飾包括在本發明之範_内。共價 修飾之一種類型包括使抗_CD79b抗體之靶向胺基酸殘基與 能夠與抗-CD79b抗體之所選側鏈或Ν* c末端殘基反應的 有機衍生劑反應。用雙官能試劑衍生化（例如）適用於使抗_ CD79b抗體與不溶於水之支撐物基質或表面交聯以供用於 純化抗-CD79b抗體之方法使用，且反之亦然。常用交聯劑 包括（例如）1，1-雙（重氮乙醯基）·2_苯乙烷、戊二醛、氺羥 基丁二酿亞胺酯（例如與4-疊氮基水揚酸形成之酯）、同型 雙官能醯亞胺酯（包括二丁二醯亞胺酯，諸如3,3，_二硫基 雙（丁二醯亞胺基丙酸酯））、雙官能順丁烯二醯亞胺（諸如 132799.doc •292- 200918089 雙-N-順丁烯二醯亞胺基_丨，8·辛烷）及諸如甲基_3_[(對疊氮 基苯基）二硫基]丙醯亞胺酯之藥劑。 其他修飾包括使麵酿胺醯基及天冬酿胺醯基殘基分別脫 醯胺形成相應麩胺醯基及天冬胺醯基殘基；脯胺酸及離胺 酸之羥基化；絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基之碟酸化； 離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α_胺基之曱基化[T E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co.，San Francisco，第 79-86頁（1983)]; N末端胺之乙醯化；及任何c末端叛基之酿胺化。 包括在本發明之範疇内的對抗_CD79b抗體之共價修飾的 另一種類型包含改變抗體或多肽之天然糖基化模式。出於 本文之目的，"改變天然糖基化模式”意欲意謂刪去一或多 個存在於天然序列抗-CD79b抗體中之碳水化合物部分（藉 由移除基礎糖基化位點或藉由以化學及/或酶促方式删去 糖基化而達成），及/或添加一或多個不存在於天然序列抗_ CD79b抗體中之糖基化位點。另外，該片語包括天然蛋白 質之糖基化之質變，包含各種所存在之碳水化合物部分之 性質及比例的變化。 抗體及其他多肽之糖基化通常為N_連接或〇_連接。N-連 接係指碳水化合物部分連接於天冬醯胺殘基之側鏈。三狀 序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺_χ_蘇胺酸（其中χ為除 脯胺酸外之任何胺基酸）為碳水化合物部分酶促連接於天 冬醯胺側鏈之識別序列。因此，多肽中此等三肽序列中之 任一者之存在形成潛在糖基化位點。連接糖基化係指糖 132799.doc 293 - 200918089 者連接於經基胺基 酸’但亦可使用5_ N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一者 酸，該經基胺基酸最常為絲胺冑或蘇胺酸 羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。 點添加至
言）。抗-CD79b抗體 便利地藉由改變胺基酸序列來達成將糖基化位 抗體中以便使其含有上述三肽序列中之一或多_ 胺基酸序列可視情況經由DNA水平之變化，尤其藉由使編 碼抗-CD79b抗體之DNA於預選驗基處突變以便產生將轉譯 為所需胺基酸之密碼子來改變。 另一增加抗-CD79b抗體上之碳水化合物部分之數目的方 式為糖苷與多肽之化學或酶促偶合。該等方法在此項技術 中已有描述’例如1987年9月11日公開之WO 87/05330，及
Aplin 與 Wriston，CRC Crit. Rev. Biochem.，第 259-306 頁，（1981)。 存在於抗-CD79b抗體上之碳水化合物部分的移除可以化 學方法或以酶促方法或藉由編碼用作糖基化靶之胺基酸殘 基之密碼子的突變取代來實現。化學脫糖基化技術在此項 技術中係已知的且例如由Hakimuddin等人，Arch. Biochem. Biophys.，259:52 (1987)及 Edge 等人，Anal. Biochem.，118:131 (1981)所描述。多肽上之碳水化合物部 分之酶促裂解可如Thotakura等人，Meth. Enzymol.， 138:3 50 (1987)所述藉由使用各種内切醣苷酶及外切醣苷 132799.doc -294- 200918089 酶來達成。 對抗-CD79b抗體之共價修飾之另_類型包含以美國專利
第 4,640,835 號、第 4,496,689 號、第 4,301，144 號、第 4,670,417號、第4,791，192號或第4，179,337號中所述之方 式使抗體連接於各種非蛋白質性聚合物（例如聚乙二醇 (PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯）中之一者。抗體亦可包埋於 例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備之微膠囊（分別 例如為羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚·（曱基丙稀酸甲 酿）微膠囊）中；包埋於膠態藥物傳遞系統（例如，脂質體、 白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊）中；或包 埋於巨乳液中。該等技術係揭示於Remjngt〇n，S
Pharmaceutical Sciences，第 16版，〇sl〇, A.，Ed.，（1980) 中。 本發明之抗-CD79b抗體亦可以形成嵌合分子之方式進行 修飾，該等分子包含與另一異源多肽或胺基酸序列融合之 抗-CD79b抗體。 在一實施例中’此類嵌合分子包含抗-CD79b抗體與提供 抗-標籤抗體可選擇性結合於之抗原決定基之標籤多肽的 融合物。抗原決定基標籤一般被置於抗_CD79b抗體之胺基 或羧基末端處。抗_CD79b抗體之該等抗原決定基標籤形式 之存在可使用針對標籤多肽之抗體來偵測。又，抗原決定 基標籤之提供使抗_CD79b抗體能夠容易地藉由親和力純化 使用抗-標籤抗體或結合於抗原決定基標籤之另一類型之 親和力基質來純化。各種標籤多肽及其各自抗體在此項技 132799.doc -295 - 200918089 術中係熟知的。實例包括聚-組胺酸（P〇ly-his)或聚-組胺酸-甘胺酸（poly-his-gly)標籤；flu HA標籤多肽及其抗體 12CA5[Field等人，Mol· Cell· Biol” [:2159-2165 (1988)]; c-myc 標籤及其 8F9、3C7、6E10、G4、B7 及 9E10 抗體 [Evan等人，Molecular and Cellular Biology, 1:3610-3616 (1985)];及單純疮療病毒（Herpes Simplex virus)醣蛋白 D(gD)標籤及其抗體[Paborsky等人，Protein Engineering, i(6):547-553 (1990)]。其他標籤多肽包括Fiag_肽[Hopp等 人，BioTechnology，6:1204-1210 (1988)] ; KT3抗原決定 基肽[Martin等人 ’ Science，255:192-194 (1992)] ; α-微管 蛋白抗原決疋基狀[Skinner等人，J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)];及 T7基因 1〇蛋白肽標籤[Lutz-Freyermuth等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87:6393- 6397 (1990)]。 在一替代性實施例中，嵌合分子可包含抗_CD79b抗體與 免疫球蛋白或免疫球蛋白之特定區域之融合物。對於嵌合 分子之二價形式（亦稱為"免疫黏附素"）而言，此類融合可 為與IgG分子之Fc區之融合。ig融合物較佳包括可溶性（跨 膜域缺失或失活）形式之抗_CD79b抗體之取代以替代Ig分 子内之至少一個可變區。在一尤其較佳的實施例中，免疫 球蛋白融合物包括IgG1分子之鉸鏈、〇112及CH3，或鉸 鏈、CH,、CH2及CH3區。關於免疫球蛋白融合物之產生， 亦參見1995年6月27日頒布之美國專利第5,428，13〇號。 F·抗-CD79b抗體之製備 132799.doc •296· 200918089 以下描述主要係關於藉由培養經含有編碼抗_CD79b抗體 之核酸之載體轉型或轉染的細胞產生抗_CD79b抗體。當 然’預期可使用此項技術中所熟知之替代性方法來製備 抗-CD79b抗體。舉例而言，適當胺基酸序列或其部分可藉 由直接肽合成使用固相技術來產生[參見例如Stewan等 人，Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co.,
San Francisco, CA (1969) ； Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85_2 149-2 1 54 (1 963)]。活體外蛋白質合成可使用手動技術 或藉由自動裝置來執行。自動合成可例如使用應用生物系 統肽合成器（Foster City, CA)使用製造商之說明書來實 現。抗-CD79b抗體之各種部分可以化學方法分別合成且使 用化學或酶促方法組合以產生所需抗_CD79b抗體。 1.編碼抗-CD79b抗體之DNA之分離 編碼抗-CD79b抗體之DNA可自由咸信具有抗_CD79b抗 體mRNA且以可偵測量表現該mRNA之組織製備的cdNA庫 獲得。因此’人類抗_CD79b抗體DNA可方便地自由人類組 織製備之cDNA庫獲得。編碼抗_CD79b抗體之基因亦可自 染色體組庫獲得或藉由已知合成程序（例如自動核酸合成） 獲得。
可用經設計用以鑑別所關注之基因或由該基因編碼之蛋 白貝的探針（諸如至少約20-80個驗基之寡核苷酸）篩選庫。 用所選探針篩選cDNA或染色體組庫可使用標準程序進 行’諸如 Sambrook 等人，Molecular Cloning: A
Laboratory Manua 丨（New York: Cold Spring Harbor 132799.doc -297- 200918089
Laboratory Press，1989)中所述。分離編碼抗_CD79b抗體之 基因之替代性方式為使用PCR方法[Sambrook等人，見 上；Dieffenbach 等人，PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]。 用於篩選cDNA庫之技術在此項技術中係熟知的。經選 擇作為探針之募核苷酸序列應具有足夠長度且足夠明顯以 將假陽性減至最少。募核苷酸較佳經標記以便使其可在與 所篩選之庫中之DNA雜交後被偵測到。標記方法在此項技 術中係熟知的’且包括使用如32P標記之ATP之放射性標 s己、生物素標記或酶標記。包括中等嚴格性及高嚴格性之 雜交條件係於Sambrook等人（見上）中提供。 可將δ亥專庫篩選方法中所鑑別之序列與寄存於公開資料 庫（諸如GenBank)或其他私用序列資料庫中及可在該等資 料庫中得到之其他已知序列比較及比對。分子之指定區域 内或整個全長序列之序列一致性（在胺基酸水平或核苷酸 水平下）可使用此項技術中已知及如本文所述之方法來測 定。 具有蛋白質編碼序列之核酸可藉由使用本文首次所揭示 之推斷胺基酸序列且必要時使用習知引子^伸程序（如
Sambrook等人（見上）中所述）來筛選所選或染色體組 庫’偵測月i驅體並加工可能未反轉錄成cDNA之⑺㈣八之中 間物而獲得。 2·宿主細胞之選擇及轉型 用本文所述用於抗_CD79b抗體產生之表現或選殖載體將 132799.doc 200918089 宿主細胞轉染或轉型且培養於酌情改良之習知營養培養基 中以誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼所需序列之基 因。諸如培養基、溫度、pH值及其類似條件之培養條件可 由熟習技術者在無需不當實驗之情況下加以選擇。一般而 言，使細胞培養物之生產力達到最大之原理、方案及實用 技術可見於Mammalian Cell Biotechnology: a Praetieal Approach，M. Butler編（IRL Press，1991)及 Sambrook等人 (見上）中。 旨在將DNA引入宿主中以便使DNA可以染色體外形式或 以染色體整合子形式複製的真核細胞轉染及原核細胞轉型 之方法為一般熟習技術者所知，例如CaCh、CaP04、脂質 體”導、t乙一醇/DMSO及電穿孔。視所用之宿主細胞而 定，使用適合於該等細胞之標準技術執行轉型。如 Sambrook等人（見上）中所述利用氯化鈣之鈣處理或電穿孔 一般被用於原核生物。用根癌土壤桿菌 感染被用於某些植物細胞之轉型，如^以界等
人，Gene, 23:315 (1983)及 1989年 ό 月 29 日公開之 WO 89/05859所述。對於無該等細胞壁之哺乳動物細胞而言， 可利用 Graham 及 van der Eb, Virology, 52:456-457(1978)之 磷酸鈣沈澱方法。哺乳動物細胞宿主系統轉染之一般態樣 已描述於美國專利第4,399,216號中。轉型至酵母中通常係 根據 Van Solingen等人，J. Bact.，130:946 (1977)及 Hsiao 等 人，Proc. Natl. Acad· Sci· (USA)，76:3829 (1979)之方法 進行。然而’亦可使用諸如藉由核顯微注射、電穿孔、與 132799.doc -299- 200918089 完整細胞之細菌原生質體融合或聚陽離子（例如聚凝胺、 聚鳥胺酸）將DNA引入細胞中之其他方法。關於使哺乳動 物細胞轉型之各種技術，參見Keown等人，Methods in EnZymology，185:527_537(199〇mMans〇ur等人，驗㈣， 336:348-352 (1988)。 本文中適合用於選殖或表現載體中《DNA的宿主細胞包 括原核生物、酵母或高等真核生物細胞。 a.原核宿主細胞 合適之原核生物包括（但不限於）古細菌及真細菌，諸如 革蘭氏陰性（Gram-negative)或革蘭氏陽性（Gram_p〇sitive) 有機體，例如腸内菌科（Enter〇bacteriaceae)，諸如大腸桿 菌。各種大腸桿菌菌株為可公開獲得的，諸如大腸桿菌 K12 菌株 MM294(ATCC 31，446);大勝桿 iX1776(ATCC 31，537)，大腸桿菌菌株 W311〇(ATCC 27,325)及 K5 772 (ATCC 53,635)。其他合適之原核宿主細胞包括腸内菌 科，諸如埃希氏菌屬，例如大腸桿菌；腸桿 菌屬（心;伊文氏桿菌屬（五〜⑻·…；克雷伯氏菌 {Klebsiella)；變形桿菌屬（/V价似）；沙門氏菌屬 (5W則加//α)，例如鼠傷寒沙門氏菌咖/w〇加//α AVp/niwWw/w);沙雷氏菌屬，例如黏質沙雷氏菌 似）；及志賀桿菌屬（jS7^e//a);以及芽 孢桿菌屬（5acz7/〇，諸如枯草桿菌（凡⑽化仏）及地衣芽抱 桿菌（5. (例如1989年4月12曰公開之dd 266,710中所揭示之地衣芽孢桿菌41p);假單胞菌屬 132799.doc 300· 200918089 (PMWi/omona·?) ’諸如綠膿桿菌（P. ⑽_sa);根瘤菌屬 (Rhizobia).，透明顫菌屬（乃_的〇如7/幻；副球菌屬 (•ΡίϊΓίϊCOC(?)，及鍵薇[菌屬（iSVrej!?ίοwjy)。此等實例為 明性的而非限制性的。菌株W3 110為一種尤其較佳的宿主 或親本伯主’此係因為其為用於重組DN A產物醱酵之常見 宿主菌株。較佳地，宿主細胞分泌最少量之蛋白水解酶。 舉例而言，菌株W3110(Bachmann, Cellular and Moleculat* Biology，第 2卷（Washington, D.C.: American Society for
Microbiology，1987)，第 1190-1219 頁；ATCC寄存編號 27,325)可經修飾以實現編碼對於宿主為内源性之蛋白質之 基因的基因突變’該等宿主之實例包括大腸桿菌W3 11 〇菌 株1A2，其具有完整基因型;大腸桿菌W3u〇菌株 9E4，其具有完整基因型;大腸桿菌W3丨丨〇菌株 27C7(ATCC 55,244) ’其具有完整基因型£0以 Ε15 AgP owpr ；大腸桿菌 W3110 菌 株3 7〇6’其具有完整基因型/<9”3^^3尸/704五7 5 (argF-lac)169 degP ompT 7 z7vG Ara〆；大腸桿菌 W3 11 0 鹵株40B4 ’其為具有非卡那黴素（kanamycin)抗性c/叹尸缺 失突變之菌株37D6;大腸桿菌W3110菌株33D3，其具有基 浪 XfhuA (AtonA) ptr 3 lac Iq lacL8 AompT匕（nmpc- /ep幻degPW （美國專利第5,639,635號）；及具有1990 年8月7曰頒布之美國專利第4,946,7 83號中所揭示之突變周 質蛋白酶的大腸桿菌菌株。其他菌株及其衍生物亦為合適 的，諸如大腸桿菌294(ATCC 31,446)、大腸桿菌B、大腸 132799.doc -301 . 200918089
6\ATCC 3 1 537)及大腸桿菌 RV3〇8(ATCC 3 1,608)。此等實例為說明性 月性的而非限制性的。用於建構具 有以基因型之上述細菌中之任一者的衍生物之方法在此 項技術中係已知的且例如描述於^等人，―， 8·309 314 (1990)中。—般有必要考慮細菌細胞中之複製子 之複製性來選擇適當細菌。舉例而言，當使用諸如 PBR322、pBR325、pACYC17^pK編之熟知質體供應 複製子時，大腸桿g、沙雷氏g屬或沙門氏菌屬物種可適 當地用作宿主。通常，宿主細胞應分泌最少量之蛋白水解 酶’且可希望將其他蛋白酶抑制劑併入細胞培養物中。或 者’活體外選殖方法為合適的，例如pcR或其他核酸聚合 酶反應。 全長抗體、抗體片段及抗體融合蛋白可在細菌中產生， 尤其當不需要糖基化及Fc效應功能時，諸如當治療性抗體 與細胞毒性劑（例如毒素）結合且免疫結合物獨立顯示對於 腫瘤細胞破壞之有效性時。全長抗體在循環中具有較長半 衰期。大腸桿菌中之產生更快且更有成本效率。關於抗體 片段及多肽在細菌中之表現，參見例如u s 5,648,237 (Carter 等人）、U.S. 5,789，199(J〇ly 等人）及 u.s· 5 84〇 523 (Simmons等人）’其描述用於最優化表現及分泌之轉譯起 始區（TIR)及信號序列’此等專利以引用的方式併入本文 中。在表現後，將抗體自大腸桿菌細胞糊狀物分離於可溶 性部分中且可視同型而定經由例如蛋白質A或G管柱純 化。最終純化可類似於用於純化例如表現於CHO細胞中之 132799.doc 002- 200918089 抗體的方法而進行。 b ·真核宿主細胞 除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適 合用於編碼抗-CD79b抗體之載體的選殖或表現宿主。釀酒 酵母（以cereWhae)為常用低等真核宿主微生 物 其他者包括粟酒裂瘦酵母（iSc/n.zosacc/zaromyce·? /?ow6e)(Beach及 Nurse，Nature, 290: 140 [ 198 1 ] ; 1985 年 5 月2日么開之EP 139,383)，刻魯維拉菌屬（尺/WyVeroWij；ceiy) 宿主（美國專利第4,943,529號；Fleer等人，Bio/ Technology，9:968-975 (1991))，諸如乳酸刻魯維拉菌（尺. /acibXMWPS-SC、CBS683、CBS4574 ; Louvencourt 等 人，J. Bacteriol·，154(2):737-742 [1983])、脆壁刻魯維拉 菌（尺./ragz7z’j)(ATCC 12,424)、保加利亞刻魯維拉菌（[. bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克刻魯維拉菌（尺· wi’cAreramz’/)(ATCC 24,178)、華特刻魯維拉菌（尺· waltii)(ATCC 56,500) > 果繩刻魯維拉菌（尺. drosophilarum)(ATCC 36,906 ; Van den Berg 等人， Bio/Technology，8:135 (1990))、对熱刻魯維拉菌（尺. i/zerwoio/eraws)及馬克斯刻魯維拉菌（尺.warxz’awws);耶氏 酵母屬（_yarrowζ·α)(ΕΡ 402,226);曱醇酵母（Pic/π’α pastoris)(EP 1 83,070 ; Sreekrishna 等人，J. Basic
Microbiol·，28:265-278 [1988]);念珠菌屬（C⑽山·而）；里 氏木徽（IWc/zot/ermfl ree>s/i3)(EP 244,234);粗厚神經胞子菌 crawaXCase 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 132799.doc -303 - 200918089 USA, 76:5259-5263 [1979])； 許旺 酵母屬 (Schwanniomyces)，諸如西方許旺酵母 σί^·<^«ίβ/ί·5)(1990年 10月 3 1 日公開之EP 394,538);及絲狀 真菌，諸如紅黴屬、青黴菌屬、 彎頸黴菌屬（7b/_ypoc/fl山'wm)(1991年1月10曰公開之WO 91/0〇357)及麴菌屬宿主，諸如構巢麴菌（儿 nidu Ians) (Ball since 等人，Bioehem. Biophys. Res. Commun·， 112:284-289 [1983] ; Tilburn 等人，Gene， 26:205-221 [1983] ; Yelton等人，Proc. Natl. Acad· Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984])及黑麴菌（儿 m'ger)(Kelly 及 Hynes，EMBO J.，4:475-479 [1985])。曱醇酵母在本文中 為合適的且包括（但不限於）能夠藉助於曱醇生長之酵母， 其選自由漢森酵母屬、念珠菌屬、克勒克酵母 屬（JC!oeckera)、 畢赤酵母屬（Pichia)、 酵母屬 (•Sacc/zarowyces)、球擬酵母屬（Tbrw/opib)及紅酵母屬 組成之屬。為此類酵母之實例的特定種類列 表可見於C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs， 269 (1982)中。 適合用於表現糖基化抗-CD79b抗體之宿主細胞係源自多 細胞有機體。無脊椎動物細胞之實例包括昆蟲細胞，諸如 果繩（Drosophila)S2及夜蛾（SpodopUra)Sf9 ;以及植物細 胞’諸如棉花、玉米、馬鈐薯、大豆、矮牽牛、番茄及煙 草之細胞培養物。已鑑別出眾多桿狀病毒菌株及變異體以 及來自諸如草地黏蟲/rwg/peMa)(毛蟲）、埃及 132799.doc - 304- 200918089 伊蚊（dei/以 (蚊子）、白紋伊蚊（Jeda a/6o/7z’ciw·?)(蚊子）、黑腹果繩（·〇"〇·ϊ〇/?/π·/β me/⑽ogasier)(果 蠅）及家蠶（万worz·)之宿主的相應受納昆蟲宿主細 胞。用於轉染之各種病毒株可公開獲得，例如，苜蓿丫紋 夜蛾（Jwiogr叩/m cah/or«/ca)NPV之L-1變異體及家蠶NPV 之Bm-5菌株，且該等病毒可根據本發明用作本文中之病 毒，尤其用於轉染草地黏蟲細胞。 然而，最關注於脊椎動物細胞，且脊椎動物細胞在培養 物（組織培養物）中之繁殖已變成常規程序。適用哺乳動物 宿主細胞株之實例為由SV40轉型之猴腎CV1株（COS-7， ATCC CRL 1651);人類胚腎株（經次選殖生長於懸浮培養 物中之 293 或 293 細胞，Graham等人，J. Gen Virol. 36:59 (1977));幼小倉鼠腎細胞（ΒΗΚ，ATCC CCL 10);中國倉 鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980));小鼠塞特利氏細胞（sertoli cell)(TM4，Mather，Biol. Reprod. 23:243-251 (1980));猴 腎細胞（CV1 ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細胞（VERO-76， ATCC CRL-1 587)；人類宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2);犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34);布法羅大鼠 (buffalo rat)肝細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442);人類肺細 胞（W138，ATCC CCL 75);人類肝細胞（Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL51) ; TRI 細胞（Mather 等人，Annals N.Y. Acad· Sci. 383:44-68 (1982)) ; MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝腫瘤細胞株 132799.doc - 305 - 200918089 (Hep G2)。 用上迷用於抗_CD79b抗體 生之表現或選殖載體將宿主 =轉型且培養於㈣改良之習知營養培養基中以誘導啟 動子、選擇轉化子㈣增編碼所f序狀基因。 3.可複製載體之選擇及使用 f 般為哺乳動物）來源 ^於本發明之抗體之重組產生而t，將編碼其之核酸 =侧A或染色體組DNA)分離且插人可複製載體中以 進—步選殖（祕擴增）或以供表現。使用習知程序（例 2，藉^使用能夠特異性結合於編碼抗體之重鏈及輕鍵之 :因的募核苦酸探針）來容易地將編碼抗體之〇να分離及 疋序。可利用許多載體。載體之選擇在某種程度上視所用 之宿主細胞而$。一般，較佳宿主細胞為原核或真核(一 體可（例如）呈質體、黏粒（e_id)、㈤毒顆粒或喔菌 一之形式。可藉由各種程序將適當核酸序列插入載體中。 般而5，使用此項技術中已知之技術將dna插入適當限 制性核酸内切酶位財。載體組件—般包括（但不限於）信 旒序列、複製起點、一或多個標記基因 '增強子元件、啟 動了及轉錄終止序列中之-或多纟。含有此等組件中之- 或夕者之合適載體的建構利用熟習技術者已知之標準連接 枝術。 、 9b不僅可直接重組產生，而且可以與可為信號序列 之異源多肽或於成熟蛋白質或多肽之N末端處具有特異性 裂解位點之其他多肽的融合多肽形式產生。-般而言，信 132799.doc -306- 200918089
號序列可為載體之組件，或其可為插入載體中之編碼疒 CD79b抗體之DNA的一部分。信號序列可為例如選自鹼性 磷酸酶、青黴素酶、Ipp或熱穩定性腸毒素n前導序列之群 之原核信號序列。對於酵母分泌而言，信號序列可例如為 酵母轉化酶前導序列、α因子前導序列（包括酵母及刻魯維 拉菌心因子前導序列，後者描述於美國專利第5’〇1〇,182號 中）或酸性磷酸酶前導序列、白色念珠菌（c 葡糖U 澱粉酶前導序列（199〇年4月4日公開之£]?362，179)或^卯年 11月15日公開之W0 9〇/13646中所述之信號序列。在哺乳 動物細胞表現中’哺乳動物信號序列可用於指導蛋白質之 分泌，諸如來自相同或相關物種之分泌性多肽之信號序 列，以及病毒分泌性前導序列。 a·原核宿主細胞 編碼本發明之抗體之多肽組分的聚核苷酸序列可使用標 準重組技術來獲得。所需聚核苷酸序列可自諸如融合瘤細 胞之抗體產生細胞分離及定序。或者，聚核苷酸可使用核 苷fee σ成器或pCR技術來合成。一旦獲得後，將編碼多肽 之序列插入能夠在原核宿主中複製及表現異源聚核苷酸之 重、’且載體中。可利用且此項技術中已知之許多載體可用於 本發月之目的。適當載體之選擇將主要視待插人載體中之 核I之尺寸及待以載體轉型之特定宿主細胞而定。各載體 3有各種組分，此視其功能（擴增或表現異源聚核苷酸， 或兩者）及其與其所位於之特定宿主細胞之相容性而定。 而° ’關於此等宿主使用含有源自與宿主細胞相容 132799.doc •307- 200918089 之物種之複製子及控制序列的質體載體。表現及選殖載體 皆含有使載體能夠在一或多種所選宿主細胞中複製之核酸 序列，以及能夠在轉型細胞中提供表型選擇之標記序列。 對於各種細菌、酵母及病毒而言，該等序列係熟知的。來 自含有編碼胺苄青黴素（ampUiUin，Amp)及四環素 (tetracycline，Tet)抗性之基因且因此提供鑑別轉型細胞之 容易方式的質體PBR322之複製起點適合於大多數革蘭氏 陰性細菌，2 μ質體起點適合於酵母，且各種病毒起點 (SV40、多形瘤、腺病毒、彻或Βρν)適用於在哺乳動物 細胞中選殖載體。PBR322、其衍生物或其他微生物質體 或噬菌體亦可含經修飾而含有彳纟微生物有機體用於 表現内源性蛋白質之啟動子。用於表現特定抗體之 PBR322衍生物之實例係詳述於Carter等人之美國專利第 5,648,237號中。 另外，關於此等宿主可使用含有與宿主微生物相容之複 製子及控制序列㈣菌體载體作為轉型載體。舉例而言， 諸如λΟΕΜ.ΤΜ.-ΙΙ之噬菌體可用於製備能夠用於使諸如大 腸桿菌LE392之易感性宿主細胞轉型之重組載體。 本發明之表現載體可包含兩個或兩個以上啟動子_順反 子對，其編碼多肽組分之每一者。啟動子為位於順反子上 游（5’）之未轉譯的調節序列’其巾該順反子調節該序列之 表現。原核啟動子通常分成兩種類型，亦即可誘導型及組 成型。可誘導型啟動子為響應於培養條件之變化（例如營 養物之存在與否或溫度變化）在其控制之下引起順反子2 132799.doc 200918089 轉錄水平增加的啟動子。 為各種潛在宿主細胞所識別之大量啟動子係眾所周知 的。可藉由經由限制酶消化自來源DNA移除啟動子且將經 分離之啟動子序列插入本發明之載體中而將所選啟動子可 操作地連接於編碼輕鏈或重鏈之順反子Dna。天然啟動子 序列及許多異源啟動子皆可用於指導靶基因之擴增及/或 表現。在一些實施例中，利用異源啟動子，此係因為其一
般允§午所表現之靶基因與天然靶多肽啟動子相比有更多的 轉錄及更高的產率。 為各種潛在宿主細胞所識別之啟動子係眾所周知的。適 合用於原核宿主之啟動子包括PhoA啟動子、卜半乳聚糖酶 及乳糖啟動子系統[Chang等人，Nature, 275:615 C1978);
Goeddel等人，Nature，281:544 (1979)]、鹼性磷酸酶、色 胺酸（trp)啟動子系統[Goeddel，Nueleic Acids Res.，8:4〇57 (1980) ; EP 36,776]及雜合啟動子，諸如iac[deB〇er等人， (1983)]或ac啟動
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 子。用於細菌系統之啟動子亦將含有可操作地連接於編碼 抗-CD79b抗體之DNA的夏因_達爾瓦諾（ShineDaig_， S，D·)序列。然而’在細菌中起作用之其他啟動子（諸如其 他已知細菌或㈣體啟動子）亦為合適的。已公開其” 酸序列’藉此使技工能夠使用連接子或接頭可操作地料 連接於編碼乾輕鏈及重鏈之順反子（SMemh等人 (1980)Cell 20: 269)以供應任何所需的限制性位點。 在本發明之一態樣中 重組載體内之各順反子包含分泌 132799.doc -309- 200918089
信號序列組件’其指導所表現之多肽移位穿過膜。一般而 言，信號序列可為載體之組件，或其可為插入載體中之乾 多肽_之-部分。出於本發明之目的，所選之信號序列 應為由宿主細胞所識別及加工（亦即由信號肽酶所裂解）之 序列。對於並不識別及加工對於異源多肽為天然之^號序 列之原核宿主細胞而言，信號序列經例如選自由鹼性磷酸 酶、青黴素酶、Ipp或熱穩定性腸毒素II(STn)前導序列、 LamB、Ph〇E、PelB、0mpA及MBP組成之群之原核信㈣ 列取代。在本發明之-實施例中，用於表現系統之兩種順 反子之信號序列為STII信號序列或其變異體。 在另一態樣中，根據本發明之免疫球蛋白之產生可在宿 主細胞之細胞質中發生，且因此並不需要每一順反子内存 在分泌信號序列。就此而言，使免疫球蛋白輕鏈及重鏈表 現，加以摺疊及組裝以在細胞質内形成功能性免疫球蛋 白。某些宿主菌株（例如，大腸桿菌菌株）提供有利於 二硫鍵形成之細胞質條件，藉此允許所表現之蛋白質亞單 兀之正確摺疊及組裝。Proba&Pluckthun (1995) 〇 本發明提供一種表現系統，其中所表現之多肽組分之定 量比率可加以調節以便使所分泌及正確組裝之本發明抗體 的產率達到最大。該調節至少部分藉由同時調節多肽組分 之轉譯強度來實現。 一種用於調節轉譯強度之技術係揭示於Simm〇ns等人之 美國專利第5,84G，523號巾。其制順反子内之轉譯起始區 132799.doc -310· 200918089 (TiR)之變異體。對於給定TIR而言，可在一定轉譯強度範 圍内形成一系列胺基酸或核酸序列變異體，藉此提供用於 針對特定鏈之所需表現水平調整此因素的習知方式。TIR 變異體可藉由習知突變誘發技術產生，該等技術導致可改 r
L 變胺基酸序列之密碼子變化，不過核苷酸序列之沉默變化 為較佳。TIR之變化可包括（例如）夏因-達爾瓦諾序列之數 目或間距之變化，以及信號序列之變化。一種用於產生突 變信號序列之方法為在不改變信號序列之胺基酸序列（亦 即’變化為沉默的）之編碼序列開始時產生"密碼子庫π。此 "Τ藉由改變母一岔碼子之第三核苷酸位置來實現；另外， 諸如白胺酸、絲胺酸及精胺酸之一些胺基酸具有可能會増 加庫製備之複雜性的多個第—及第二位置。此突變誘發^ ^itL^Yansuraf A(1992) METHODS: A Companion t〇 /«五4:151158 中。 1廿w久丁<一疋HR強度簕 圍内產生。此有限組提供各 物之彦車/夂括 〃鍵之表現水平以及所需抗體產 產，在各種瓜強度組合下之比較，度可如
Slmm°nS#人之美國專利第5機⑵號中所詳述藉由量化 1'導體基因之表現水平測定。基於轉譯強度比較，選擇 需個別™以組合於本發明之表現载體建構體中。、擇所 b-真核宿主細胞 戟瓶組1千 版a括（但不限於）下列各者 “虎序列、複製起點、一或多個標 ’ 啟動子及轉錄終止序列。 U 、強子70件、 132799.doc -311 · 200918089 (Ό信號序列組件 用於真核宿主細胞之載體亦可含有於所關注之成熟蛋白 質或多狀之Ν末端處具有特異性裂解位點的信號序列或其 他夕肽。所選之異源信號序列較佳為由宿主細胞所識別及 加工（亦即由信號肽酶所裂解）之序列。在哺乳動物細胞表 現中，可使用哺乳動物信號序列以及病毒分泌性前導序列 (例如單純疱疹gD信號）。 將》亥則驅體區域之DNA在閱讀框架中連接於編碼抗體之 DNA。 (2)複製起點 叙而e，哺乳動物表現載體無需複製起點組件。舉例 而言’通常可使用SV40起點，原因僅在於其含有早期啟動 子0
，，w 姐 7T 表現及選殖載體通當蔣冬古，駿 、㊉將3有選擇基因，亦稱為可選擇標 記。典型選擇基因編碼且有 。/、爷卜列作用之蛋白質：（a)賦予對 抗生素或其他卷去< t素（例如，胺节青黴素、新黴素 (neomycin)、甲胺喋呤 p ^ ^ 飞四環素）之抗性；（b)補充營養缺 例如：：或⑷供應不可得自複合培養基之關鍵營養物， 、’碼牙孢桿菌之D-丙胺酸消旋酶之基因。 選擇方案之一實例利用藥物 笪#丄， +丨且滯佰主細胞之生長。彼 寺成功地經異源基因轉〗 質且1之，、、田胞產生賦予藥物抗性之蛋白 質且因此經受得住該選擇 物新㈣w 擇方案。该顯性選擇之實例使用藥 新黴素、锨酚酸及濕黴素。 132799.doc -312- 200918089 適合於哺乳動物細胞之可選擇標記之一實例為可實現鑑 別能夠接納編碼抗_CD79b抗體之核酸之細胞的彼等標記， 諸如DHFR或胸苷激酶、金屬硫蛋白及金屬硫蛋白_π(較 佳為靈長類金屬硫蛋白基因）、腺苷脫胺酶、鳥胺酸脫羧 酶等。當利用野生型DHFR時’適當宿主細胞為缺乏DHFR 活性之CHO細胞株（例如，ATcc CRL-9096)，其如Urlaub 等人 ’ Proc· Natl. Acad. Sci. USA，77:4216 (1980)所述來 製備及繁殖。舉例而言，經DHFR選擇基因轉型之細胞最 初係藉由將所有轉化子培養於含有甲胺喋呤（Mtx)(亦即 DHFR之一種競爭性拮抗劑）之培養基中來鑑別。或者，可 藉由於含有選擇劑之培養基中的細胞生長針對諸如胺基糖 苷抗生素（例如卡那黴素、新黴素或G 4 1 8)之可選擇標記來 選擇用編碼抗體、野生型DHFR蛋白質及另一可選擇標記 (諸如胺基糖苷3’-磷酸轉移酶（ΑΡΗ))之DNA序列轉型或共 轉型的宿主細胞（尤其含有内源性DHFR之野生型宿主）。 參見美國專利第4,965，199號。 適合用於酵母之選擇基因為存在於酵母質體YRp7中之 基因[Stinchcomb 等人，Nature，282:39 (1979);
KmgSman等人，Gene，7:141 (1979) ; 等人，
Gene，10:157 (1980)]。卜pl基因為缺乏生長於色胺酸中之 能力的酵母突變株（例如，ATCC^44〇76號或pEp4_〇提供 選擇標記[Jones, Genetics，85:12 。 (4)啟動子組件 表現及選殖載體通常含有可操作地連接於編碼抗_cD79b 132799.doc -313- 200918089 抗體之核酸序列以指導„111>1八合成之啟動子。為各種潛在 宿主細胞所識別之啟動子係眾所周知的。 實際上，所有真核基因具有位於轉錄起始位點上游約25 至3 0個鹼基處之AT富集區。在許多基因轉錄起始處上游7〇 至80個驗基處發現的另一序列為CNCAAT區，其中N可為 任何核苷酸。在大多數真核基因之3,末端處為aataaa序 列’其可為用於將p〇ly A尾添加至編碼序列之3，末端的信 號。將所有此等序列適當地插入真核表現載體中。 適合用於酵母宿主之啟動序列之實例包括3 _磷酸甘油酸 激酶[Hitzeman等人，J. Biol. Chem.，255:2073 (1980)]或 其他糖解轉[Hess 專人，J. Adv. Enzyme Reg·, 7:149 (1968)，Holland，Biochemistry，17:4900 (1978)](諸如烯醇 化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、 磷酸果糖激酶、葡糖-6-磷酸異構酶、3_磷酸甘油酸變位 酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡糖異構酶及葡 萄糖激酶）之啟動子。 其他酵母啟動子（其為具有受生長條件控制之轉錄的其 他優勢之可誘導型啟動子）為醇脫氫酶2、異細胞色素 (is〇Cyt〇Chr〇me)C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關之降解 酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3 -磷酸脫氫酶及負責麥芽糖及半 乳糖利用之酶的啟動子區。適合用於酵母表現之載體及啟 動子進一步描述於EP 73,657中。 抗-CD79b抗體自哺乳動物宿主細胞中載體之轉錄（例如） 受自病毒（諸如多形瘤病毒、雞痘病毒（1989年7月5曰公 132799.doc •314· 200918089 開之UK： 2,211,504)、腺病毒（諸如腺 病毒、禽肉瘤病毒、細胞巨大病毒腺病反II、/主乳頭狀瘤 炎病基；土 — i 欠轉錄病毒、B型肝 扃毒及&病毒40(SV4〇))之基因组獲得 物啟動子（例如，㈣蛋白啟動 、源寿摘 n- n a μ y, ^ 飞兒疫球蛋白啟動子）獲 侍及自熱休克啟動子獲得之啟 此等啟動子與宿主細胞系統相容。斤控制’其限制條件為 =:毒之早期及晚期啟動子係作為亦含有 =起點之SV條制性片段而方便地獲得。人類細胞巨大 病母之即刻早期啟動子係作_indIIIE限制性片段而方便 :獲得二種使用牛乳頭狀瘤病毒作為載體使驗表現於 礼動物宿主中之系統揭示於美國專利第4,川糾號中。 此系統之修改描述於美國專㈣4风978號中。關於人類 β-干擾素CDNA在小鼠細胞中在來自單純范療病毒之胸苦 ㈣啟動子控制下之表現’亦參見Reyes等人，細㈣ 297:598-6(>1 (1982)。或者，勞斯肉瘤病毒（R_ sarcoma vlrus)長末端重複序列可用作啟動子。 (5)增強子元件組件 间等真核生物對編碼抗/!^^抗體之DNA之轉錄可藉由 將增強子序列插人載體巾來增加。增強子為驗之順^作 用兀件，通常約10至300 bp，其作用於啟動子以增加其轉 錄。現已知許多增強子序列來自哺乳動物基因（血球蛋 白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及姨島素）。然而， 通常將使用來自真核細胞病毒之增強子。實例包括在複製 起點之晚期側的SV40增強子（bp 100-270)、細胞巨大病毒 132799.doc •315- 200918089 早期啟動子增強子、在複製昶 起點之晚期側的多形瘤增強子 及腺病毋增強子。關於用於活 具核啟動子之增強元件， maniv，^一 297:17_18 (198小雖然可將增強子於 編碼抗-CD·抗體之序列之位置5,或3,處拼接至載體中， 但較佳位於啟動子之位點5,處。 (6)轉錄終止組件 f. c. 用於真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、 人類或來自其他多細胞生物之有核細胞)之表現載體亦將 含有終止轉錄及使mRNA穩定所必需之序列。該等序列通 吊'可得自真核或病毒01^八或cDNA之5,(且偶爾為3，）未轉譯 區域。此等區域含有在編碼抗_CD79b抗體之mRNA之未轉 譯部分中轉錄為多聚腺嘌呤化片段的核苷酸區段。一種適 用之轉錄終止組件為牛生長激素多聚腺嘌呤化區域。參見 WO94/11026及其中所揭示之表現載體。 適合於適應抗-CD79b抗體在重組脊椎動物細胞培養物中 之合成的其他方法、載體及宿主細胞描述於Gething等 人 ’ Nature，293:620-625 (1981) ; Mantei等人，Nature, 281:40-46 (1979) ; EP 117,060 ;及 EP 1 1 7,058 中。 4.培養宿主細胞 可將用於產生本發明之抗-CD79b抗體之宿主細胞培養於 各種培養基中。 a ·原核彳g主細胞 使用於產生本發明之多肽之原核細胞生長於此項技術中 已知且適用於培養所選宿主細胞之培養基中。合適之培養 132799.doc -316- 200918089 基之實例包括魯利亞肉湯（luria br〇th，LB)加上必需營養 補充剤。在一些實施例中，培養基亦含有基於表現載體之 建構所選之選擇劑以選擇性允許含有表現載體之原核細胞 生長。舉例而言，為使表現胺苄青黴素抗性基因之細胞生 長將胺苄青黴素添加至培養基中。 亦可以適當濃度包括除碳、氮及無機磷酸鹽來源外之任 何必需補充劑，其單獨引入或作為與另一補充劑或培養基 之此合物（諸如複合氮源）引入。視情況，培養基可含有一 或多種選自由麵胱甘肽、半胱胺酸、胱胺、硫代乙醇酸 鹽、二硫赤藻糖醇及二硫蘇糖醇組成之群的還原劑。 於合適之溫度下培養原核宿主細胞。對於大腸桿菌生長 而言，例如，較佳溫度範圍為約20t:至約39t：，更佳為約 C至約37C，甚至更佳為約3〇。〇。培養基之pH值可為範 圍為約5至約9之任何pH值，其主要視宿主有機體而定。對 於大腸桿菌而言，pH值較佳為約6·8至約74，且更佳為約 7.0。 ' 若本發明之表現載體中使用可誘導型啟動子，則在適合 於活化啟動子之條件下誘導蛋白質表現。在本發明之一 ^ 樣中，將Pho Α啟動子用於控制多肽之轉錄。因此，為了誘 導將經轉型之宿主細胞培養於磷酸鹽限制培養基中。較佳 地，磷酸鹽限制培養基為C.R.A.P培養基（參見例如
Simmons等人，/所则⑽/她，（2〇〇2)，2幻⑴ 147)。如此項技術中所知，根據所使用之载體建構體，可 使用各種其他誘導物。 132799.doc •317· 200918089 在-實施例中，所表現之本發明多肽被分泌至宿主細胞 之周質中且自該周質回收。蛋白質回收通常涉及一般藉由 諸如渗透休克、音波處理或溶胞之方式來破壞微生物。一 旦細胞被破壞後，細胞碎片或完整細胞可藉由離心或過滤 移除。可例如藉由親和樹脂層析將蛋白質進一步純化。或 者，可將蛋白質輸送至培養基中且在其中進行分離。可自 培養物移除細胞且為進—步純化所產生之蛋白質將培養物 上清液過遽並濃縮。可進一步使用諸如聚丙稀酿胺凝膠電 泳（PAGE)及西方墨點法檢定之通常已知之方法來將所表現 之多肽分離及鑑別。 在本發明之—態樣中，藉由醱酵過程大批量進行抗體產 生。各種大規模分批進料輯程序可用於製造重組蛋白 質。大規模醱酵具有至少1000公升之容量，較佳約1，〇〇〇 至100，_公升之容量。此等輯器使㈣拌器葉輪來分 配氧及營養物’尤其葡萄糖（較佳之碳源/能源）。小規模醱 酵-般係指在不超過約100公升容量且容量範圍可為則公 升至約100公升之醱酵器中進行的醱酵。 在醋酵過程中，蛋白質表現之誘導通常係在細胞於合適 條件下生長至所需密度（例如約i8G_22G之OD55。)（在該階段 細胞處於穩定期初期）後開始。如此項技術中所知且如上 文所述，根據所使用之載體建構體，可使用各種誘導物。 可在誘導之前使細胞生長較料間。通常將細胞誘導約 12 5 0 j 過亦可使用更長或更短之誘導時間。 為改善本發明之多肽之產率及品f，可改良各種礙酵條 132799.doc -318- 200918089 件。舉例而言，為改善所分泌之抗體多肽之正確組裝及摺 疊’可使用過表現諸如Dsb蛋白（DsbA、DsbB、DsbC、 DsbD及/或DsbG)或FkpA(—種具有伴隨蛋白活性之肽基脯 胺酿基順，反-異構酶）之伴隨蛋白的其他载體來使宿主原核 細胞共轉型。已證明伴隨蛋白有助於細菌宿主細胞中所產 生之異源蛋白質之正確摺疊及溶解性。Chen等人（1999) / C/zem 274:19601-19605 ; Georgiou等人，美國專利第 6’〇83,715 號；Georgiou 等人，美國專利第 6,〇27,888 號；
Bothmarm 及 Pluckthim (2000) J.价0/. c/zem. 275:17100-17105 ， Ramm 及 Pluckthun (2000) 乂 Biol. Chem. 275:17106-17113 ; Arie等人（2001) Mo/· Μ/⑽Ho/· 39:199-210 〇 為將所表現之異源蛋白質（尤其具蛋白水解敏感性之彼 等者）之蛋白水解減至最少，缺乏蛋白水解酶之某些宿主 菌株可用於本發明。舉例而言，宿主細胞菌株可經修飾以 實現編碼諸如蛋白酶ΙΠ、〇mpT、Degp、丁邛、蛋白酶工、 蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合之已知細菌蛋白 酶之基因的基因突變。一些大腸桿菌蛋白酶缺乏菌株係可 用的且（例如）描述於以下文獻中：J〇ly等人（1998)，見上 文；Georgiou等人，美國專利第5,264,365號；⑹㈤叫等 人，美國專利第5,508，192號；Hara等人，妨 及2:63-72 (1996) _。 在實施例中，使用缺乏蛋白水解酶且用過表現一或多 種伴隨蛋白之質體轉型之大腸桿菌菌株作為本發明之表現 132799.doc -319- 200918089 系統中之宿主細胞。 b.真核宿主細胞 諸如漢姆氏F10(Ham’s F10)(Sigma)、最低必需培養基 (MEM ’ Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及杜氏改良伊格爾培 養基（Dulbecco’s Modified Eagle's Medium，DMEM，
Sigma)之市售培養基適合於培養宿主細胞。另外，11&„1等 人 ’ Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes 等人，Anal.
Biochem. 102:255 (1980)、美國專利第 4,767,7〇4號、第 4,657,866 號、第 4,927,762 號、第 4,560,655 號或第 5，122,469號、WO 90/03 43 0、WO 87/00195 或美國專利 Re. 30,985中所述之培養基中之任一者可用作宿主細胞之培養 基。此等培養基中之任一者可按需要用以下各物補充：激 素及/或其他生長因子（諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長 因子）、鹽（諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽）、緩衝液（諸如 HEPES)、核苷酸（諸如腺苷及胸苷）、抗生素（諸如 GENTAMYCINtm藥物）、痕量元素（經定義為通常以微莫耳 範圍内之最終濃度存在的無機化合物）及葡萄糖或等效能 源。任何其他必要補充亦可以將為熟習此項技術者所知之 適當濃度包括在内。諸如溫度、pH值及其類似條件之培養 條件為先前用於經選擇以供表現之宿主細胞的彼等條件， 且對於一般熟習技術者將顯而易見。 5.偵測基因擴增/表現 基因擴増及/或表現可直接在樣品中量測，例如藉由習 知南方墨點法、旨在定量mRNA轉錄之北方墨點法 132799.doc -320· 200918089 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)]、點潰法（dot blotting)(DNA分析）或原位雜交（使用 適當經標記之探針，基於本文提供之序列）。或者，可利 用能識別包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體及DNA-RNA雜合 雙鏈體或DNA -蛋白質雙鏈體之特定雙鏈體的抗體。又可 對抗體進行標記且可在雙鏈體結合於表面時進行檢定，以 便在表面上形成雙鏈體後，能偵測到結合於雙鏈體之抗體 之存在。 或者，基因表現可藉由諸如細胞或組織切片之免疫組織 化學染色及對於細胞培養物或體液之檢定的免疫學方法來 量測，以直接定量基因產物之表現。適用於免疫組織化學 染色及/或樣品流體之檢定的抗體可為單株或多株抗體， 且可在任何哺乳動物體内製備。方便地，可製備針對天然 序列CD79b多肽或針對基於本文所提供之DNA序列之合成 肽或針對與CD79b DNA融合且編碼特定抗體抗原決定基之 外源性序列的抗體。 6.抗-CD79b抗體之純化 各形式之抗-CD79b抗體可自培養基或自宿主細胞溶胞物 回收。若為膜結合的，則其可使用合適之清潔劑溶液（例 如Triton-X 100)或藉由酶促裂解自膜釋放。用於表現抗· CD79b抗體之細胞可藉由各種物理或化學方法來破壞’諸 如凍融循環、音波處理、機械破壞或細胞溶解劑。 可能希望自重組細胞蛋白質或多肽純化抗-CD79b抗體。 下列程序例示合適之純化程序：用離子交換管柱分級分 132799.doc 321 200918089 離’乙醇沈殿；逆相HPLC ;二氧化矽層析或陽離子交換 樹脂（諸如DEAE)層析；層析聚焦；SDS_PAGE ;硫酸銨沈 殿；使用例如Sephadex G-75之凝膠過濾；蛋白質A瓊脂糖 凝膠管柱用以移除諸如IgG之污染物；及金屬螯合管柱用 以結合抗原決定基標籤形式之抗_CD79b抗體。可利用各種 蛋白質純化方法且該等方法在此項技術中係已知的並（例 如）描述於 Deutscher，Methods in Enzymology, 182 (1990) , Scopes, Protein Purification: Principles and
Practice, Springer-Verlag，New York (1982)中。所選之純 化步驟將（例如）視所用之製備方法及所製備之特定抗_ CD79b抗體的性質而定。 當使用重組技術時，抗體可在細胞内於周質間隙中產 生，或直接分泌至培養基中。若抗體在細胞内產生，則作 為第一步驟，例如藉由離心或超濾來移除宿主細胞或溶胞 片段之微粒碎片。Carter等人，Bio/Technology l〇:i63]67 (1992)描述一種用於分離被分泌至大腸桿菌之周質間隙中 之抗體的程序。簡言之，在乙酸鈉（pH 3 5)、edta及苯甲 基磺醯氟（PMSF)之存在下經約3〇 min將細胞糊狀物解凍。 可藉由離心移除細胞碎片。在抗體被分泌至培養基中之情 況下，一般首先使用市售蛋白質濃縮過濾器（例如， Amicon或MUiipore以丨丨沁时超濾單元）來濃縮來自該等表現 系統之上清液。在上述步驟中之任一者中可包括諸如 ，之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解，且可包括抗生素 以防止外來污染物之生長。 132799.doc -322* 200918089 由細胞製備之抗體組合物可.使用（例如）羥磷灰石層析 法、凝膠電泳法、透析及親和性層析法來純化，其中親和 性層析法為較佳純化技術。蛋白質A作為親和配位體之適 宜性係視存在於抗體中之任何免疫球蛋白F c域的種類及同 型而定。蛋白質八可用於純化基於人類γ1、丫2或丫4重鏈之 抗體（Lindmark 等人，J, Immun〇l. Meth. 62:113 (1983))。對所有小鼠同型及人類γ3推薦蛋白質G(Guss等 人’ EMBO J. 5:15671575 〇986))。雖然親和配位體所連 接之基質最常見為瓊脂糖，但可使用其他基質。與用瓊脂 糖可達成之流速及加工時間相比，機械穩定性基質（諸 如，受控微孔玻璃或聚（苯乙烯二乙烯基）苯）允許更快之流 速及更短之加工時間。在抗體包含Ch3域之情況下’
Bakerbond ABX™樹脂（j. T. Baker，Phillipsburg，NJ)可用於 純化。視待回收之抗體而定，亦可利用其他蛋白質純化技 術，諸如用離子交換管柱分級分離、乙醇沈澱、逆相 HPLC、二氧化矽層析、肝素SEPHAR〇SETM層析、陰離子 或陽離子交換樹脂（諸如聚天冬胺酸管柱）層析、層析聚 焦' SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。 在任何初步純化步驟後，可使包含所關注之抗體及污染 物之混合物經受使用pH值介於約2.5_4.5之間的溶離緩衝液 較佳在較低鹽農度（例如，約〇- 〇. 2 5 Μ鹽）下進行之低值 疏水性相互作用層析法。 G·醫藥調配物 本發明之抗體-藥物結合物（ADC)可藉由適合於待治療病 132799.doc -323 · 200918089 狀之任何途徑來投與。ADC通常將以非經腸方式投與，亦 即輸注、皮下、肌肉内、靜脈内、皮内、鞘内及硬膜外投 與。 為了治療此等癌症，在一實施例中’經由靜脈内輸注投 與抗體-藥物結合物。經由輸注投與之劑量在每劑約1 pg/m2至約10,000 pg/m2之範圍内，一般為每週一劑’總共 為一劑、兩劑、三劑或四劑。或者，劑量範圍為約1 pg/m2 至約 1000 Mg/m2、約 1 至約 8〇〇 ^/m2、約 i f Mg/m2 至約 600 Pg/m2、約 1 pg/m2 至約 400 pg/m2、約 10
Mg/m2 至約 500 pg/m2、約 1〇 叫/^ 至約 3〇〇 pg/m2、約 1〇 pg/m至約200 pg/m2及約1 yg/m2至約2〇〇 yg/m2。劑量可每 天投與一次’每週投與一次’每週投與多次但少於每天一 次’每月投與多次但少於每天一次，每月投與多次但少於 每週一次’每月投與一次或間歇性投與，以減輕或緩和疾 病症狀。可以所揭示之時間間隔中之任一者持續投藥，直 / 至所治療之淋巴瘤、白血病之腫瘤或症狀得到緩解。可在 達成症狀緩解或減輕後繼續投藥，其中藉由該繼續投藥延 長該緩解或減輕。 本發明亦提供一種減緩自體免疫疾病之方法，其包含向 罹患該自體免疫疾病之患者投與治療有效量之前述實施例 中之任者的人類化2F2抗體-藥物結合物。在較佳實施例 中’經靜脈内或經皮下投與該抗體。以在每劑約1 pg/m2 至約100 mg/m2之範圍内的劑量經靜脈内投與該抗體·藥物 σ 〇物且在—特定實施例中該劑量為1 gg/rn2至約5〇〇 132799.doc -324- 200918089
Mg/m。齊可每天投與一：欠，每週投與—次，每週投與 多次但少於每天-次，每月投與多次但少於每天—次，每 月投與多次但少於每週—次，每月投與—次或間歇性投 與以減輪或緩和疾病症狀。可以所揭示之時間間隔中之 任者持續技藥，直至所治療之自體免疫疾病之症狀得到 減I或減緩。可在達成症狀之減輕或減緩後繼續投藥，其 中藉由該繼續投藥延長該減缓或減輕。 本發明亦提供一種治療B細胞病症之方法，其包含向罹 患諸如B細胞增生性病症（包括（但不限於）淋巴瘤及白血病） 之B細胞病症或自體免疫疾病之患者投與治療有效量之前 述實施例中之任一者的人類化2F2抗體，該抗體未與細胞 毒性分子或可偵測分子結合。抗體通常將以約1 pg/m2至 約1000 mg/m2之劑量範圍投與。 在一態樣中，本發明進一步提供醫藥調配物，其包含至 少一種本發明之抗-CD79b抗體及/或至少一種其免疫結合 物及/或至少一種本發明之抗_CD79b抗體-藥物結合物。在 一些實施例中’醫藥調配物包含本發明之抗體及/或其 免疫結合物；及（2)醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例 中’醫藥調配物包含（1)本發明之抗體及/或其免疫結合 物；及（視情況）(2)至少一種其他治療劑。其他治療劑包括 (但不限於）下文所述之彼等者。ADC通常將以非經腸方式 投與’亦即輸注、皮下、肌肉内、靜脈内、皮内、鞘内及 硬膜外投與。 根據本發明所使用之包含抗-CD79b抗體或CD79b免疫結 132799.doc -325 - 200918089 口物之化療/·生調配物係藉由以;東乾調配物或水溶液之形式
將八有所需純度之抗體或免疫結合物與可選醫藥學上可接 受之載劑、賦形劑或穩定劑（Remington，s PharmaceuticaI f
Science5^16版’ OS〇i，A.編（198〇))混合來製備以供儲存。 可接党之載劑、賦形劑或穩定劑在所用之劑量及濃度下對 接受者係無毒的，且包括緩衝劑，諸如乙酸鹽、加、麟 酸鹽、擦檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸 及甲硫胺I·防腐劑(諸如氣化十八烷基二甲基节基銨； 氯化六烴季銨；氯节烷銨、节索氯銨；苯酚、丁醇或节 醇；對羥基苯甲酸烷基酿，諸如對羥基苯甲酸甲醋或對經 基笨甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3_戊醇；及 間甲酚）；低分子量（少於約10個殘基）多肽；蛋白質，諸如 血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚 乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯 胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水 化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如 EDTA ;張力劑，諸如海藻糖及氯化鈉；糖，諸如蔗糖、 甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；界面活性劑，諸如聚山梨 醇酯；鹽形成抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物（例如，Zn_ 蛋白質錯合物）；及/或非離子界面活性劑，諸如 TWEEN®、PLURONICS®或聚乙二醇（PEG)。待用於活體 内投藥之醫藥調配物一般無菌。此易於藉由經由無菌過渡 膜過濾來實現。 本文中之調配物亦可含有一種以上為所治療之特定適應 132799.doc -326- 200918089 症所必需之活性化合物，較佳為彼此無不利影響之具有互 補活性之彼等者。舉例而言，除了抗_CD79b抗體以外，可 希望一種調配物中包括另一種抗體，例如結合CD79b多肽 上之不同抗原決定基之第二抗_CD79b抗體，或諸如影響特 定癌瘤生長之生長因子之一些其他靶的抗體。或者或另 外，該組合物可進一步包含化學治療劑、細胞毒性劑、細 胞因子、生長抑制劑、抗激素藥劑及，或心臟保護劑。該 等分子適當地係以對於所欲目的有效之量組合存在。 活性成份亦可包埋於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合 所製備之微膠囊（分別例如為羥甲基纖維素或明膠_微膠囊 及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中；包埋於膠態藥物傳遞 系統（例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子 及奈米膝囊）中；《包埋於巨乳液中。該等技術係揭示於 Remington’s Pharmaceutical 第“版 〇s〇i a 編（1980)中。 可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之合適實例包括含 有抗體之固體疏性聚合物的半透性基質，該等基質呈成 形物品之形式’例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質之實例 包括聚醋、水凝膠(例如，聚(2_經乙基_甲基丙稀酸醋)或 I (乙稀^醇））、聚丙；m 円父s曰（美國專利第3,773,919號）、L-麩胺 酸與γ乙基心麩胺酸鹽之共聚物、不可降解之己稀-乙酸乙
烯^可降解之乳酸'•乙醇酸共聚物（諸如LUPRON ΟΤ®(由礼酸-乙醇酸共聚物及醋酸亮丙瑞林（1〇事〇恤 _她）組成之可注射微球體）)及聚心(-)_3_經基了酸。雖 132799.doc •327· 200918089 f
然諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物使八子匕 夠釋放歷時超過100天’但某些水凝膠釋玫蛋白質歷時^ 短時間。當囊封之免疫球蛋白在身體内保持报長時間時I 其可能由於暴露於3rc下之水分而變性或聚集從而導致 生物活性之損失及免疫原性可能之變化。視所涉及之機制 而定，可設計合理策略以求穩定。舉例而言，若發現聚集 機制為經由硫基-二硫鍵互換形成分子間s_s鍵，則可藉= 修飾硫氫基殘基、自酸性溶液凍乾、控制水分含量、使用 適當添加劑且研製特定聚合物基質組合物來達成穩定化。 可以任何適合於傳遞至靶細胞/組織之形式調配抗體。 舉例而言，可將抗體調配為免疫脂質體。"脂質體”為由適 用於將藥物傳遞至哺乳動物之各種類型之脂質、磷脂及/ 或界面活性劑構成的小泡。脂質體之組分通常排列成雙層 構造，類似於生物膜之脂質排列。含有抗體之脂質體^藉 由此項技術中已知之方法來製備，諸如Epstein等人， 户附·胸/.心从〜·㈣82:3688 (1985) ; Η”％等人，
Pr〇C，Natl 々Μ把⑽77:4030 (1980);美國專利第 4,485’〇45號及第4,544,545號；及胸年1〇月23日公開之 WO 97/3 873 1中所述之方法。循環時間提高之脂質體係揭 示於美國專利第5,〇13,556號中。 尤其適用之脂質體可藉由用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及 咖衍生之磷脂醯乙醇胺(pEG，之脂質組合物的逆相蒸 發法來產生。經由限定孔徑之過濾器擠出脂質體以得到具 有所而直徑之脂質體。本發明之抗體之Fab，片段可經由二 132799.doc -328- 200918089 硫鍵互換反應而與脂質體結合（如Martin等人，J. 5ζ·ο/. C/iew. 25 7:286-288 (1982)中所述）。化學治療劑視情況包 含於脂質體内。參見Gabizon等人，《/· iVai/o⑽/ Ca«cer /«•si. 81(19):1484 (1989) » 待用於活體内投藥之調配物必須為無菌的。此易於藉由 經由無菌過濾膜過濾來實現。 H.用抗-CD79b抗體治療 為測定癌症中之CD79b表現，可利用各種偵測檢定。在 一實施例中，CD79b多肽過表現可藉由免疫組織化學法 (IHC)來分析。可使來自腫瘤活組織檢查之石蟻包埋組織 切片經受IHC檢定且符合如下CD79b蛋白質染色強度標 準： 刀數0 -未觀察到染色或在不到1 〇 %之腫瘤細胞中觀察到 膜染色。 分數1 +-在超過1 0°/〇之腫瘤細胞中偵測到微弱/勉強可看 得出之膜染色。該等細胞僅在其膜之部分中被染色。 分數2+ -在超過1 〇〇/〇之腫瘤細胞中觀察到弱至中等的全 膜染色。 分數3+ -在超過1〇〇/0之腫瘤細胞中觀察到中等至強的全 膜染色。 對於CD79b多肽表現具有〇或1 +分數之彼等腫瘤可經表 徵為不過度表現CD79b，而具有2+或3 +分數之彼等腫瘤可 經表徵為過度表現CD79b。. 或者或另外，可對福爾馬林（f〇rmalin)固定、石蠟包埋 132799.doc •329· 200918089 之腫瘤組織進行諸如INFORM®(由Ventana，Arizona出售） 或PATHVISION®(Vysis，Illinois)之 FISH檢定以測定腫瘤中 CD79b過表現之程度（若存在）。 CD79b過表現或擴增可使用活體内偵測檢定來評估，例 如藉由投與結合待偵測之分子且用可偵測標記（例如，放 射性同位素或螢光標記）標記之分子（諸如抗體）且外部地掃 描患者來定位該標記而進行。 如上文所述，本發明之抗-CD79b抗體具有各種非治療性 應用。本發明之抗-CD79b抗體可適用於表現CD79b多肽之 癌症之分級（例如在放射成像中）。該等抗體亦適用於 CD79b多肽自細胞之純化或免疫沈澱，適用於CD79b多肽 之活體外偵測及量化（例如ELIS A或西方墨點法中），可作 為其他細胞純化之步驟用於自混合細胞群體中殺死表現 CD79b之細胞及自該群體消除表現CD79b之細胞。 目前，視癌症之階段而定，癌症治療包含下列療法中之 一者或組合：手術移除癌組織、放射療法及化學療法。 抗-CD79b抗體療法可尤其為不能良好地耐受化學療法之毒 性與副作用之老年患者及放射療法具有有限有用性之轉移 性疾病所需的。靶向腫瘤之本發明之抗-CD79b抗體適用於 在最初診斷疾病後或在復發期間減緩表現CD79b之癌症。 對於治療性應用而言，抗-CD79b抗體可單獨使用，或以與 (例如）激素、抗血管生成藥或放射性標記化合物或與手 術、冷凍療法及/或放射療法之組合療法使用。抗-CD79b 抗體治療可結合其他形式之習知療法，與習知療法一起連 132799.doc - 330- 200918089 續投與、在習知療法之前或在習知療法之後投與。諸如 TAXOTERE®(多稀紫杉醇）、TAXOL®(太平洋紫杉醇 (palictaxel))、雌莫司汀及米托蒽醌之化學治療藥物用於治 療癌症’尤其低危（good risk)患者之癌症。在本發明用於 治療或減緩癌症之本發明方法中’可結合用前述化學治療 劑中之一或多者治療來投與癌症患者抗_CD79b抗體。尤 其，涵蓋與太平洋紫杉醇及經改質之衍生物之組合療法 (參見例如EP0600517)。抗-CD79b抗體將與治療有效劑量 之化學治療劑一起投與《在另一實施例中，結合化學療法 投與抗-CD79b抗體以增強化學治療劑（例如，太平洋紫杉 醇）之活性及功效。醫師桌上參考手冊（physicians, Reference，PDR)揭示已用於治療各種癌症之此等藥劑之 劑量。治療上有效之此等上述化學治療藥物之給藥方案及 劑量將視所治療之特定癌症、疾病程度及熟習此項技術之 醫師所熟悉之其他因素而定且可由醫師確定。 在一特定實施例中，向患者投與包含與細胞毒性劑結合 之抗-CD79b抗體之結合物。較佳地，結合於CD79b蛋白質 之免疫結合物被細胞内在化，從而導致免疫結合物殺死其 所結合之癌細胞之治療性功效得到增強。在—較佳實施例 中，細胞毒性⑽向或干擾癌細胞中之核酸。該等細胞毒 性劑之實例在上文已有描述且包括美登素類、卡奇徽素、 核糖核酸酶及DNA核酸内切酶。 根據已知方法’諸如靜脈内投藥(例如以大丸劑形式或 藉由經—段時間連續輸注）、⑽肉内、腹臈内、腦脊髓 132799.doc 331 · 200918089 内、皮下、關節内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途 徑，向人類患者投與抗-CD79b抗體或其毒素結合物。靜派 内或皮下投與抗體為較佳。 —其他治療性方案可與抗_CD79b抗體之投與組合。組合投 藥包括使用獨立調配物或單一醫藥調配物共投藥及以任一 项序連續投藥，其中較佳存在兩種（或所有）活性劑同時發 揮其生物活性之時段。較佳地，該組合療法產生協同治療 效應。 f 亦可希望將抗-CD79b抗體之投與與針對另—與特定癌症
相關之腫瘤抗原之抗體的投與相組合Q 在另一實施例中，本發明之治療性治療方法包含抗_ CD79b抗體與一或多種化學治療劑或生長抑制劑之組合投 與，包括不同化學治療劑或亦抑制腫瘤生長之其他細胞毒 性劑或其他治療劑之混合物的共投與。化學治療劑包括雌 莫司汀磷酸鹽、潑尼莫司汀、順鉑、5_氟尿嘧啶、美法 〆 侖、環磷醯胺、羥基脲及羥基脲紫杉烷類 、 （hydroxyureataxanes)(諸如太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇、及, 或蒽環黴素抗生素。該等化學治療劑之製劑及給藥進度可 根據製造商之說明或如由熟練從業者憑經驗所判定來使 用。該等化學療法之製劑及給藥進度亦描述於 Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore，MD(1992)中。可將抗體與如下抗_激素化合物 組合；例如’抗-雌激素化合物，諸如他莫昔芬；抗-孕 酮，諸如奥那司酮（參見EP 616 812);或抗_雄激素，諸如 132799.doc -332- 200918089 氟他胺β亥等分子之劑量為已知的。在待治療之癌症為雄 激素非依賴性癌症的情況下，患者可能先前6經受抗_雄 激素療法且在癌症變成雄激素非依賴性後可向患者投與 抗-CD79b抗體（及（視情況）如本文所述之其他藥劑）。、 有時，亦可能有益的&向患者共投與心臟保言蔓劑（以預 防或減少與療法相關之心肌功能不幻或—或多種細胞因 子。除了上述治療性方案以外，患者可在抗體療法之前、 同時或之後經受癌細胞之手術移除及/或放射療法（例如外 射束照射或用諸如抗體之放射性標記藥劑之療法）。適用 ，上述共投與之藥劑中之任__者的劑量為目前所使用之彼 等劑量且可能由於藥劑與抗-CD79b抗體之組合作用（協同 作用）而降低。 本發明之&餘合物將以肖良好醫學實踐一致之方式來 調配、給藥及投與。就此而f ’考慮因素包括所治療之特 定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床情況、 病症病因、藥劑傳遞部位、投藥方法、投藥進度安排及開 業醫師已知之其他因素。抗體無需與一或多種目前用於預 防或治療所述病症之藥劑一起調配，但視情況可與後者_ 起調配。該等其他_之有效量係視存在於調配物中之本 發明抗體的ϊ、病症或治療之類型及上述其他因素而定。 此等者一般係以與上文所用相同之劑量及投藥途徑來使用 或以約為迄今所用之劑量之1%至99%的劑量來使用。 對於預防或治療疾病而言，投藥之劑量及模式將由醫師 根據已知標準來選擇。抗體之適當劑量將視如上文所定義 132799.doc - 333 - 200918089 之待治療之疾病類型、疾病之嚴重性及病因、抗體係出於 預防性目的抑或治療性目的而投與、先前療法、 於 比 百之臨 ;史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。 向患者-次性地或經一系列治療投與抗體。較佳地，藉由 靜脈内輸注或藉由皮下注射投與抗體。視疾病之類型及嚴 重性而定，無論（例如）藉由一或多次獨立投藥抑或藉由連 續輸注，、約1微克/公斤體重至約50毫克/公斤體重（例如， 約0.1-15毫克/公斤/劑量）之抗體可為向患者投與之初始候 選劑量。給藥方案可包含投與約4 mg/kg之初始負荷劑 =，接著投肖約2 mg/kg之抗-cdm抗體之每週維持劑 ΐ。然而，可使用其他給藥方案。典型曰劑量可在約1 至100 mg/kg或更高劑量之範圍内變化，此視上文所 j及之因素而定。對於經數天或更長時間之重複投藥而 言’視病狀而定，持續治療直至對疾病症狀之所需抑制出 現為止。此療法之進程可容易地藉由習知方法及檢定且基 於醫師或其他熟習此項技術者已知之標準來監測。 :了向患者投與抗體蛋白以外’本發明之;請案涵蓋藉 由基因療法投與抗體。編碼抗體之核酸之所述投與係 述”投與治療有效量之抗體"所涵蓋。參見例如州年 14曰公開之職/〇7321’_於使用基因療法來產生 細胞内抗體。 存在兩種使核酸(視情況含於載體中)進入患者細胞内之 =途徑：活體内及離體。對於活體内傳遞而言，將核酸 接主入患者體内，通常注射在需要抗體之部位處。對於 132799.doc -334. 200918089 離體治療而言’移除患者之細胞，將核酸引人此等經分離 之細胞内且直接或例如囊封於植入患者體内之多孔膜中向 患者投與經改變之細胞（參見例如美目料j第4,892,538號 及第5,283，1 87號）。存在各種可用於將核酸引入活細胞内 之技術。該等技術視是否將核酸活體外轉移至培養細胞中 或活體内轉移至所欲宿主之細胞中而變化。適合於將核酸 活體外轉移至哺乳動物細胞中之技術包括使用脂質體、電 穿孔、顯微注射、細胞融合、DEAE_葡聚糖、磷酸鈣沈澱 方法等。一種常用於離體傳遞基因之載體為反轉錄病毒載 體。 ， 目前較佳之活體内核酸轉移技術包括用病毒載體（諸如 腺病毒、單純疱疹I病毒或腺相關病毒）及基於脂質之系統 (適用於脂質介導之基因轉移之脂質例如為DOTMA、 DOPE及DC-Choi)轉染。關於目前已知之基因標記及基因 >口療方案之細述’參見Anderson等人，Science 256:808· 813 (1992)。亦參見WO 93/256了3及其中所引用之參考文 獻。 本發明之抗-CD79b抗體可呈由本文中"抗體"之定義所涵 蓋之不同形式。因此，該等抗體包括全長或完整抗體、抗 體片段、天然序列抗體或胺基酸變異體、人類化、嵌合或 融合抗體、免疫結合物及其功能片段。在融合抗體中，抗 體序列與異源多肽序列融合。該等抗體可在Fc區中被修飾 以提供所需效應功能。如本文中關於適當Fc區之章節中更 詳細地論述，結合於細胞表面上之裸抗體可（例如）經由抗 132799.doc -335- 200918089 體依賴性細胞細胞毒性（ADCC)或藉由以補體依賴性細胞 毒性募集補體或一些其他機制誘導細胞毒性。或者，當希 望消除或降低效應功能以便將副作用或治療併發症減至最 少時，可使用某些其他Fc區。 在一實施例中’抗體競爭結合於或大體上結合於與本發 明之抗體相同的抗原決定基。亦涵蓋具有本發明之抗_ CD79b抗體之生物學特徵的抗體’該等生物學特徵特別包 括活體内腫瘤乾向及任何細胞增生抑制或細胞毒性特徵。 本文中詳細描述製造上述抗體之方法。 本發明之抗-CD79b抗體適用於治療哺乳動物之表現 C D 7 9 b之癌症或減緩該癌症之一或多種症狀。此類癌症包 括（但不限於）造血癌或血液相關癌症，諸如淋巴瘤、白血 病、骨髓瘤或淋巴惡性腫瘤，以及脾之癌症及淋巴結之癌 症。該等B細胞相關癌症之更特定實例包括例如高度、中 度及低度淋巴瘤（包括B細胞淋巴瘤，諸如黏膜相關淋巴組 織B細胞淋巴瘤及非霍奇金氏淋巴瘤、套細胞淋巴瘤 '伯 基特氏淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、彌 漫性大細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤及霍奇金氏淋巴瘤及τ 細胞淋巴瘤）及白血病（包括繼發性白血病、慢性淋巴細胞 性白血病（諸如B細胞白血病（CD5+ b淋巴細胞））、骨髓性 白血病（諸如急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病）、淋 巴細胞性白血病（諸如急性淋巴母細胞性白血病）及脊髓發 育不良）以及其他血液學癌症及/或B細胞或τ細胞相關癌 症。該等癌症涵蓋前述任一者之轉移性癌症。抗體能夠結 132799.doc •336· 200918089 合於哺乳動物體内表現CD79b多肽之癌細胞之至少一部 分。在一較佳實施例中，抗體可在結合於細胞上之CD79b 多肽後在活體外或活體内有效地破壞或殺死表現CD79b之 腫瘤細胞或抑制該等腫瘤細胞之生長。此類抗體包括裸 抗-CD79b抗體（未與任何藥劑結合）。具有細胞毒性或細胞 生長抑制特性之裸抗體可進一步用細胞毒性劑裝備以使其 在腫瘤細胞破壞方面甚至更有效。可藉由（例如）使抗體與 細胞f性劑結合以形成如本文所述之免疫結合物來賦予 抗-CD79b抗體細胞毒性特性。該細胞毒性劑或生長抑制劑 較佳為小分子。諸如卡奇黴素或美登素類及其類似物或衍 生物之毒素為較佳。 本發明提供一種包含本發明之抗_CD79b抗體及載劑之組 合物。出於治療癌症之目的，可向需要該治療之患者投與 組合物，其中該組合物可包含一或多種以免疫結合物形式 或以裸抗體形式存在之抗_CD79b抗體。在另一實施例中， β亥等組合物可包含此等抗體與諸如細胞毒性劑或生長抑制 劑（包括化學治療劑）之其他治療劑的組合。本發明亦提供 包含本發明之抗_CD79b抗體及載劑之調配物。在一實施例 中，該調配物為包含醫藥學上可接受之載劑的治療性調配 物0 本發明之另一態樣為經分離之編碼抗_CD79b抗體之核 酸。其涵蓋編碼Η與L鏈及尤其高變區殘基之核酸、編碼 天然序列抗體以及抗體之變異體、修飾及人類化形式之 鍵〇 132799.doc -337- 200918089 本發明亦提供適用於治療哺乳動物之表現CD79b多肽之 癌症或減緩該癌症之一或多種症狀的方法，其包含向該哺 乳動物投與治療有效量之抗_CD79b抗體。該抗體治療性組 δ物可短期或長期進行投與’或如醫師所指示間歇投與。 亦提供抑制表現CD79b多肽之細胞之生長及殺死表現 CD79b多肽之細胞的方法。 本發明亦提供包含至少一種抗_CD79b抗體之套組及製 0口 S有抗_CD79b抗體之套組可（例如）用於CD79b細胞殺 死檢疋，用於CD79b多肽自細胞之純化或免疫沈澱。舉例 而言，對於CD79b之分離及純化而言，套組可含有與珠粒 (例如瓊脂糖凝膠珠粒）偶合之抗_CD79b抗體。可提供含有 用於活體外偵測及量化CD79b(例如ELISA或西方墨點法 中）之抗體之套組。該適用於偵測之抗體可具備諸如螢光 或放射性標記之標記。 I·抗體-藥物結合物治療 預期本發明之抗體-藥物結合物（ADC)可用於治療各種疾 病或病症，舉例而言，該等疾病或病症之特徵為過度表現 腫瘤抗原。例示性病狀或過度增生性病症包括良性或惡性 腫瘤，白血病及淋巴惡性腫瘤。其他疾病包括神經元病 症、神經膠質病症、星形膠質細胞病症、下丘腦病症、腺 體病症、巨噬細胞病症、上皮病症、基質病症、囊胚腔病 症、發炎性病症、血管生成病症及免疫病症（包括自體免 疫病症）。 在動物模型及基於細胞之檢定中鑑別之ADC化合物可進 132799.doc - 338 - 200918089 一步在帶有腫瘤之高等靈長類及人類臨床試驗中進行測 試。人類臨床試驗可經設計用以測試本發明之抗_CD79b單 株抗體或免疫結合物在經歷B細胞增生性病症之患者體内 的功效，該病症包括（但不限於）淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴 瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性 NHL、難治性NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白 血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血 病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。 臨床試驗可經設計用以評估ADC與諸如放射療法及/或化 子療法（涉及已知化學治療劑及/或細胞毒性劑）之已知治療 性方案之組合的功效。 一般而言，待治療之疾病或病症為過度增生性疾病，諸 如B細胞增生性病症及/或b細胞癌症。本文中待治療之癌 症之實例包括（但不限於）B細胞增生性病症，其係選自淋 巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發性侵 襲性NHL、復發性惰性nhL、難治性NHL、難治性惰性 NHL、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴 瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血 病（ALL)及套細胞淋巴瘤。 該癌症可包含表現CD79b之細胞，以便使本發明之ADC 能夠結合於癌細胞。為測定癌症中之CD79b表現，可使用 各種診斷/預後檢定。在一實施例中，可藉由IHc分析 CD79b過表現。可使來自腫瘤活組織檢查之石蠟包埋組織 切片經受IHC檢定且就染色程度及所檢驗腫瘤細胞之比例 132799.doc -339- 200918089 而言符合CD79b蛋白質染色強度標準。 ’ ADC之適當劑量將視如上文 、疾病之嚴重性及病因、分子 對於預防或治療疾病而言 所定義之待治療之疾病類型
係出於預防性目的抑或治療性目的而投與、先前療法、患 者之臨床錢及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。 適田地向患者-次性地或經一系列治療投與分子。視疾病 之類型及嚴重性而$，無論(例如)藉由-或多次獨立投藥 抑或藉由連續輪注，約1盹/4至丨5 mg/kg(例如（M_20 mg/kg)之分子為向患者投與之初始候選劑量。典型日劑量 可在約1 pg/kg至100 mg/kg4更高劑量之範圍内變化’此 視上文所提及之因素而定。向患者投與之adc之例示性劑 量在約0.1 mg/kg患者體重至約1Q ^&患者體重之範圍 内。 對於經數天或更長時間之重複投藥而言，視病狀而定， 持續冶療直至對疾病症狀之所需抑制出現為止。例示性給 樂方案包含投與約4 mg/kg之初始負荷劑量，接著投與約2 mg/kg之抗_ErbB2抗體之每週維持劑量。可使用其他給藥 方案。此療法之進程易於藉由習知技術及檢定來監測。 】·組合療法 本發明之抗體·藥物結合物（ADC)可與具有抗癌特性之第 二化合物一起組合於醫藥組合調配物中，或以組合療法形 式、、且口於給藥方案中。醫藥組合調配物或給藥方案之第二 化合物對組合中之ADC較佳具有互補活性，以使 ： 不利影響。 … 132799.doc -340- 200918089 &物可為化學治療劑、細胞毒性劑、細胞因 子生長抑制劑、抗激素藥劑及/或心臟保m該等分 子適當地係以對於所欲目的有效之量組合存在。含有本發 明之ADC之醫藥組合物亦可具有治療有效量之化學治療 劑諸如微官蛋白形成抑制劑、拓撲異構酶抑制劑或DNA 結合劑。 在心樣中’第一化合物為本發明之抗_cD79b ADC且 第一化s物為抗—CD20抗體（其為裸抗體或ADC)。在一實 她例中第—化合物為抗-CD20抗體利妥昔單抗 (Rituxan®)^2H7(Genentech, Inc., South San Francisco, CA)。另一種適用於與本發明之抗_CD79b adc組合之免疫 療法的抗體包括（但不限於）抗_VEGF(例如’ Avastin⑧）。 其他治療性方案可與根據本發明所鑑別之抗癌劑之投與 組合，泫等方案包括（但不限於）放射療法及/或骨髓及周邊 血液移植，及/或細胞毒性劑、化學治療劑或生長抑制 劑。在該等實施例之-者巾，化學治㈣為諸如環填酿 胺、羥基柔紅黴素、阿黴素、多柔比星（d〇x〇rubincin)、長 春新鹼（Oncovin™)、潑尼龍、CH〇P、CVP或c〇P之藥劑 或藥劑之組合，或諸如抗_CD2〇(例如Rhuxan⑧）或抗_ VEGF(例如Avastin®)之免疫治療劑。 組合療法可以同時或依序方案投與。當依序投與時，該 組合可以兩次或兩次以上投藥來投與。組合投藥包括使用 獨立調配物或單一醫藥調配物共投藥及以任一順序連續投 藥，其中較佳存在兩種（或所有）活性劑同時發揮其生物活 132799.doc -341 · 200918089 性之時段。 在、實知例巾，用ADC治,療涉及本文中所鑑別之抗癌劑 與-或多種化學治療劑或生長抑制劑之組合投與，包括不 同化學治療劑之混合物之共投與。化學治療劑包括紫杉烧 (諸如太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇）及/或蒽環黴素抗生素。 s等化予/α療劑之製劑及給藥進度可根據製造商之說明或 如由熟練從業者憑經驗所判定來使用。該等化學療法之製 劑及給藥進度亦描述於"chemotherapy Service"，（1992) Ed.，M.C. perry，Williams & Wil]dns，以出贿e，刚甲。 適用於上述共投與之藥劑中之任—者的劑量為目前所使 用之彼等劑量且可能由於新鑑別之藥劑及其他化學治療劑 或治療之組合作用（協同作用）而降低。 組合療法可提供”協同作用”且證明為”協同的”，亦即活 性成份一起使用時所達成之效應大於由單獨使用該等化合 物所引起之效應的總和。協同效應可在活性成份為下列情 況時獲得：（1)將其共調配且同時以組合之單位劑量調配物 投與或傳遞；（2)將其以獨立調配物交替或並行傳遞；或 (3)利用一些其他方案。當以交替療法傳遞時，協同效應可 在（例如）藉由以獨立注射器進行不同注射來依序投與或傳 遞化合物時獲得。一般而言，在交替療法期間，依序（亦 即連續）投與有效劑量之各活性成份，而在組合療法中， 同時投與有效劑量之兩種或兩種以上活性成份。 K.製品及套組 本發明之另一實施例為一種含有適用於治療、預防及/ 132799.doc .342- 200918089
或診斷表現CD79b之癌症之物質的製品。該製品包含一一 器及-在該容器上或與該容器相聯之標籤或包裝插頁二 適之容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器等。該等容琴； 由諸如玻璃或塑料之各種材料形成。容器容納可有效治 療、預防及/或診斷癌症病狀之組合物且可具有一無菌= 入孔（例如，容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的 靜脈輸液袋或小瓶）。組合物中之至少—種活性劑為本發 明之抗-CD79b抗體。標籤或包裝插頁指示組合物用於治療 癌症。標籤或包裝插頁將進—步包含關於向癌症患者投與 抗體組合物之說明書。另外，該製品可進一步包含一第_ 容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝劑，諸如抑菌性注射 用水（BWFI)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液 (Ringer’s solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業 及使用者立％需要之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋 劑、過濾器、針及注射器。 亦提供適用於各種目的之套組’例如適用於表現CD79b 之細胞殺死檢定，適用於CD79b多肽自細胞之純化或免疫 沈澱。對於CD79b多肽之分離及純化而言，套組可含有與 珠粒（例如瓊脂糖凝膠珠粒）偶合之抗-CD79b抗體。可提供 含有用於活體外偵測及量化CD79b多肽（例如ELISA或西方 墨點法中）之抗體之套組。如同製品一樣，套組包含一容 器及一在該容器上或與該容器相聯之標籤或包裝插頁。該 容器容納包含至少一種本發明之抗-CD79b抗體之組合物。 可包括含有（例如）稀釋劑及缓衝劑、對照抗體之其他容 132799.doc -343 - 200918089 器。標籤或包裝插頁可提供關於組合物之描述以及關於所 欲活體外或偵測用途之說明。 L. CD79b多肽之用途 本發明涵蓋篩選化合物以鑑別模擬cD79b多肽（促效劑） 或阻止CD79b多肽之效應（拮抗劑）之彼等者的方法。設計 用於拮抗劑藥物候選者之筛選檢定以㈣結合由本文中所 鑑別之基因編碼之CD79b多肽或與該多肽複合或者干擾所 編碼之多肽與其他細胞蛋白質之相互作用(包括例如抑制 CD79b多肽自細胞之表現）的化合物。該等筛選檢定將包括 能執行化學庫之高產量筛選之檢定，從而使其尤其適合於 鑑別小分子藥物候選者。 該等檢定可以各種形式執行，包括蛋白f 蛋白質結合 檢定、生物化學轉檢定、免疫較及基於細胞之檢定， 此在此項技術中已有充分描繪。 關於.口 .几劑之所有檢定的共同之處在於其需要使藥物候 選者與由本文中所鑑別之核酸編碼之CD79b多肽在足以可 使此等兩種組份相互作用之條件及時間下接觸。 °檢疋中，相互作用為結合且所形成之複合物可得 j刀離或在反應混合物中得則貞測。在—特定實施例中， 藉由"價或非共價連接使由本文中所鑑別之基因編碼之 多肽或藥物候選者固定於固相上，例如微量滴定板 上非共價連接一般係藉由用⑽外多肽之溶液塗覆固體 表面且進仃乾燥來實現。或者，對待固定之CD79b多肽具 '之、’’二固疋的抗體（例如單株抗體）可用於使其錨定於 132799.doc .344· 200918089 固體表面上。蕤由 错由將可用可偵 組份添加至銥㈤〜 、*彳7^c作標記之未經固定之 表面）中來執 有！錯定組份之經塗覆 未反應之組份，s #、， 戍夺，例如藉由洗滌移除 初未經固定之έ份帶 上之複合物。當最 ^己之㈣广 標記時，對固定於表面上之 ^己之動]彳旨轉在複合㈣。 未帶有標記時 / ^未經固定之組份並 例精由使用特異性結合經固定之複合 物的經裇記之抗體來偵測複合作用。 化口物與由本文中所鑑別之基因編碼之特定 CD79b多肽相互作用，但並不結合於該特定c猶多肽， 則其與彼多肽之相互作用可藉由熟知用於谓測蛋白質-蛋 白質相互作用之方法來檢定。該等檢定包括傳統方法，諸 如交聯、共免疫沈澱及經由梯度或層析管柱之共純化。另 外，蛋白質-蛋白質相互作用可藉由使用由^^如及同事所 述之基於酵母之遺傳系統來監測（Fields及s〇ng，Nature
(London)，340:245-246 (1989) ; Chien等人，Proc· Natl. Acad· Sci· USA，88:9578-9582 (1991))，如由 Chevray及 Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991) 所揭示。諸如酵母GAL4之許多轉錄活化因子由兩個物理 離散模組化域組成，一個充當DNA結合域，另一個充當轉 錄活化域。上述公開案中所述之酵母表現系統（一般稱為，’ 雙雜合系統”）利用此特性，且利用兩種雜合蛋白質，其中 一者中靶蛋白與GAL4之DNA結合域融合，且其中另一者 中候選活化蛋白與活化域融合。GALl-/acZ報導體基因在 132799.doc -345 - 200918089 gaL4活化啟動子控制下之表現視經由蛋白質-蛋白質相互 作用所達成之GAL4活性的重建而定。用β-半乳糖普酶之 產色文質偵測含有相互作用之多狀之群落。一種使用雙雜 合技術鑑別兩種特異性蛋白質之間的蛋白質-蛋白質相互 作用之完整套組（matchmakerTM)可麟自ci〇ntech。此系 統亦可經擴展以定位特異性蛋白質相互作用中所涉及之蛋 白質域以及精確定位對於此等相互作用至關重要之 殘基。 干擾編碼本文中所鑑別之CD79_狀之基因與其他細胞 内或細胞外組份的相互作用之化合物可如下進行測試：通 常在允許兩種產物相互作用及結合之條件及時間下製備含 有基因與細胞内或細胞外組份之產物的反應混合物。為測 試候選化合物抑制結合之能力’在測試化合物不存在及在 存在之情況下進行反應。另外，可將安慰劑添加至第三反 應混合物中，以作為陽性對照組。如上文所述監測存在於 混合物中之測試化合物與細胞内或細胞外組份之間的結合 (複合物形成）。對照組反應中而非含有測試化合物之^ 混合物中複合物之形成指示測試化合物干擾測試化合物與 其反應搭配物之相互作用。 為檢定拮抗劑，可將CD79b多肽連同有待針對特定活性 加以篩選之化合物添加至細胞中且在CD79b多肽存在下化 合物抑制所關注之活性的能力指示化合物為CD79b多肽之 拮抗劑。或者，可藉由在對於競爭性抑制檢定適當之條件 下將CD79b多肽及潛在拮抗劑與結合膜之CD79b多肽受體 132799.doc -346- 200918089 或重組文體組合來偵測拮抗劑。可諸如利用放射性對 CD79b多肽作標記，以便可使用結合於受體之cD79b多肽 刀子之數目來測疋潛在括抗劑之有效性。編碼受體之基因 可藉由熟習此項技術者已知之許多方法加以鑑別，例如配 位體淘選及 FACS 分選。Coligan 等人，Current pr〇t〇c〇ls .mmun’’ W2). ChaPter 5 (1991)。較佳地，利用表現選 殖其中自對CD79b多肽有反應之細胞製備多聚腺嘌呤化 RNA且將由此RNA建立之cDNA庫分為多個池並用於轉染 (0〇8細胞或對CD79b多肽無反應之其他細胞。使生長於玻 璃載片上之經轉染之細胞暴露於經標記之CD79b多肽。 CD79b多肽可藉由各種方式加標記’包括碘化作用或包含 位點特異性蛋白激酶之識別位點。繼固定及培養後，使载 片經文自動射線照相分析。鑑別陽性池且製備亞池並使用 互相作用之亞彙集及再篩選過程進行再轉染，最終產生編 碼假定受體之單一純系。 作為受體鑑別之替代性方法，可將經標記iCD79b多肽 與細胞膜或表現受體分子之提取製劑光親和連接。藉由 PAGE解析交聯物質且使其暴露於χ射線膠片。可將含有受 體之經標記之複合物切開，分解成肽片段，且使之經受蛋 白質微量定序。自微量定序獲得之胺基酸序列將用於設計 一組簡併寡核苷酸探針以篩選cDNA庫，從而鑑別編碼假 定受體之基因。 在關於拮抗劑之另一檢定t，將表現受體之哺乳動物細 胞或膜製劑與經標記之CD79b多肽在候選化合物存在下一 132799.doc -347- 200918089 起培養。接著可量測化合物增強或阻斷此相互作用之能 力。 潛在拮抗劑之更具體的實例包括結合於免疫球蛋白與 CD79b多肽之融合物之寡核苷酸，且尤其為包括㈠旦不限 於）下列各物之抗體：多株及單株抗體及抗體片段、單鏈 抗體、抗-獨特型抗體及該等抗體或片段之嵌合或人類化 形式，以及人類抗體及抗體片段。或者，潛在拮抗劑可為
V 密切相關之蛋白質，例如突變形式之CD79b多肽，其識別 受體，但不賦予效應，藉此競爭性抑制CD79b多肽之作 用。 可以醫藥，組合物之形式投與特異性結合本文中所鑑別之 CD79b多肽之抗體以及藉由上文所揭示之篩選檢定所鑑別 的其他分子以用於治療包括癌症之各種病症。 若CD79b多肽處於細胞内且全部抗體用作抑制劑，則内 在化抗體為較佳1而，脂質體轉染或脂質體亦可用於將 抗體或抗體片段傳遞至細胞中。當使用抗體片段時，特異 性結合於靶蛋白之結合域之最小抑制性片段為較佳。舉例 而言，基於抗體之可變區序列，可設計保留結#蛋白序 列之能力的肽分子。該等肽可以化學方法合成及/或藉由 重組DNA技術產生。參見例如黯咖〇等人十此細I.
Acad. Sci. USA，90: 7889-7893 (1993)。 本文中之調配物亦可含有—種以上為所治療之特定適應 症所必需之活性化合物，較佳為彼此無不利影響之且有互 補活性之彼等者。或者或另外，組合物可包含增強其功能 132799.doc -348- 200918089 之藥劑’諸如細胞毒性劑、細胞因子、化學治療劑或生長 抑制劑。該等分子適當地係以對於所欲目的有效之量組合 存在。 M·抗體衍生物 本發明之抗體可進一步經修飾以含有此項技術中已知且 容易得到之其他非蛋白質性部分。較佳地’該等適用於抗 體衍生化之部分為水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制 性實例包括（但不限於）聚乙二醇（PEG)、乙二醇/丙二醇 f . 吁 \ I 共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯 啶酮、聚-1，3-二氧雜環戊烷、聚-1，3,6-三噁烷、乙烯/順丁 烯二酸酐共聚物、聚胺基酸（均聚物或無規共聚物）及葡聚 糖或聚（N-乙烯吡咯啶酮）聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧 化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇（例如丙三 醇）、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中 之穩定性而可具有製造優點。該聚合物可具有任何分子 (1，且可為支鏈或非支鏈聚合物。連接於抗體之聚合物之 數目可變化，且若連接一個以上聚合物，則其可為相同或 不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物之數目及/或 類型可基於包括(但不限於)下列各者之考慮因素來確定： 待改良之抗體之特定特性或功能、抗體衍生物是否將在限 定條件下用於治療等。 N.筛選方法 本發明《另—實施例係針對一種測定懷疑含有c議多 狀之樣品中CD79b多肽之存在的方法，其中該方法包含使 132799.doc -349· 200918089 該樣品暴露於其可結合於CD79b多肽之抗體藥物結合物及 測疋其抗體藥物結合物與樣品中之CD79b多肽之結合，其 中該結合之存在指示樣品中存在CD79b多肽。視情況，樣 扣可含有懷疑表現CD79b多肽之細胞（其可為癌細胞）。用 於忒方法之其抗體藥物結合物可視情況以可偵測方式標 記、連接於固體支撐物或其類似情況。 本發明之另一實施例係針對一種診斷哺乳動物體内腫瘤 之存在的方法，其中該方法包含（a)使包含自該哺乳動物獲 得之組織細胞之測試樣品與其可結合於CDMb多肽之抗體 藥物結合物接觸及（b)偵測其抗體藥物結合物與該測試樣品 中之CD79b多肽之間的複合物之形成，其中複合物之形成 指示哺乳動物體内存在腫瘤。視情況，其抗體藥物結合物 係以可偵測方式標記、連接於固體支撐物或其類似情況， 且/或組織細胞之測試樣品係自懷疑具有癌性腫瘤之個體 獲得。 IV.使用抗-CD79b抗體及免疫結合物之其他方法 A.診斷方法及偵測方法 在一態樣中，本發明之抗-CD79b抗體及免疫結合物適用 於4貞測生物樣品中CD79b之存在。如本文所使用之術語"伯 測”涵蓋定量或定性偵測。在某些實施例中，生物樣品包 含細胞或組織。在某些實施例中，該等組織包括正常組織 及/或以相對於其他組織較高之水平表現CD79b之癌性組 織，例如B細胞及/或B細胞相關組織。 在一態樣中，本發明提供一種偵測生物樣品中CD79b之 132799.doc -350- 200918089 存在之方法。在某些實施例中，該方法包含使該生物樣品 與抗-CD79b抗體在容許該抗-CD79b抗體結合於CD79b之條 件下接觸，及偵測是否在抗-CD79b抗體與CD79b之間形成 複合物。 在一態樣中，本發明提供一種診斷與CD79b表現增加相 關之病症的方法。在某些實施例中，該方法包含使測試細 胞與抗-CD79b抗體接觸；藉由偵測該抗-CD79b抗體與 CD79b之結合來測定該測試細胞對CD79b之表現量（定量地 或定性地）；及比較測試細胞對CD79b之表現量與對照細胞 (例如，與測試細胞相同之組織來源之正常細胞或以與此 類正常細胞相當之量表現CD79b之細胞）對CD79b之表現 量，其中與對照細胞相比測試細胞對CD79b之表現量較高 指示存在與CD79b表現增加相關之病症。在某些實施例 中，測試細胞係自懷疑患有與CD79b表現增加相關之病症 之個體獲得。在某些實施例中，該病症為細胞增生性病 症，諸如癌症或腫瘤。 可使用本發明之抗體診斷之例示性細胞增生性病症包括 B細胞病症及/或B細胞增生性病症，包括（但不限於）淋巴 瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲 性NHL、復發性惰性NHL、難治性NHL、難治性惰性 NHL、慢性淋巴細胞性白jk病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴 瘤、白血病、毛細胞白jk病（HCL)、急性淋巴細胞性白血 病（ALL)及套細胞淋巴瘤。 在某些實施例中，諸如上述彼等者之診斷或偵測方法包 132799.doc -351 - 200918089 含偵測抗-CD79b抗體與表現於細胞表面上或獲自表面上表 現CD79b之細胞之膜製劑中的CD79b之結合。在某些實施 例中’該方法包含使細胞與抗-CD79b抗體在容許該抗- CD79b抗體結合於CD79b之條件下接觸，及偵測是否在抗- CD79b抗體與細胞表面上之cD79b之間形成複合物。一種 用於偵測抗-CD79b抗體與表現於細胞表面上之CD79b之結 合的例示性檢定為"FACS"檢定。 某些其他方法可用於偵測抗_CD79b抗體與CD79b之結
合。該等方法包括（但不限於）此項技術中熟知之抗原結合 檢定，諸如西方墨點法、放射免疫檢定、ELISA(酶聯免疫 吸附檢定）、”夾心”免疫檢定、免疫沈澱檢定、螢光免疫檢 疋、蛋白質A免疫檢定及免疫組織化學（jhc)。 在某些實施例中，對抗-CD79b抗體加標記。標記包括 (但不限於）可直接偵測之標記或部分（諸如螢光標記、發色 標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記），以 =可（例如）經由酶促反應或分子間相互作用間接偵測之部 分，諸如酶或配位體。例示性標記包括（但不限於）放射性 同位素、、WH及⑴1;榮光團，諸如稀土養合 物或發光素及其衍生物4丹明及其m物；丹酿；伞形 酮，螢光素酶，例如螢火电g 土 U划耸人蟲螢先素酶及細菌螢光素酶（美 國專利第4 737 456號）；螢光幸 )京尤常，2,3-二氫酞嗪二酮；辣 過氧化酶（HRP);鹼性磷酸酶； 、— P千礼糖苷酶，葡糖澱粉 崎，洛菌酶；醣氧化酶，例如_ 蜍《贫 酌萄糖氧化酶、半乳糖氧化 酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；雜環急 裒乳化S#，諸如尿酸酶及黃 132799.doc -352· 200918089 嘌呤氧化酶；與利用過氧化氫氧化染料前驅體之酶偶合 者，諸如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化物酶；生物素/抗 生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基；及其 類似物。 在某些實施例中，將抗-CD79b抗體固定於不溶性基質 上。固定需要使抗-CD79b抗體自溶液中保持游離之任何 CD79b分離。此習知係藉由在檢定程序前使抗-CD79b抗體 不溶（如藉由吸附於水不溶性基質或表面上（Bennich等人’ U.S. 3,720,760)或藉由共價偶合（例如使用戊二醛交聯））或 藉由在抗-CD79b抗體與CD79b之間形成複合物後使抗-CD79b抗體不溶（例如藉由免疫沈澱）來實現。 關於診斷或偵測之上述實施例中之任一者可使用本發明 之免疫結合物代替抗-CD79b抗體或除抗-CD79b抗體外還 使用本發明之免疫結合物來進行。 B.治療方法 本發明之抗體或免疫結合物可（例如）用於活體外、離體 及活體内治療方法中。在一態樣中，本發明提供活體内或 活體外抑制細胞生長或增生之方法，該方法包含在容許免 疫結合物結合於CD79b之條件下使細胞暴露於抗-CD79b抗 體或其免疫結合物。”抑制細胞生長或增生"意謂使細胞生 長或增生減少至少 10%、20%、30%、40%、50。/。、60%、 70%、80%、90%、95%或100%，且包括誘導細胞死亡。 在某些實施例中，該細胞為腫瘤細胞。在某些實施例中， 該細胞為B細胞。在某些實施例中，該細胞為異種移植 132799.doc -353 - 200918089 物，例如本文中所例示。 在一態樣中’使用本發明之抗體或免疫結合物來治療或 預防B細胞增生性病症。在某些實施例中’細胞增生性病 症與CD79b之表現及/或活性增加相關。舉例而言，在某些 實施例中’ B細胞增生性病症與b細胞表面上CD79b之表現 增加相關。在某些實施例中’ B細胞增生性病症為腫瘤或 癌症。待用本發明之抗體或免疫結合物治療之B細胞增生 性病症的實例包括（但不限於）淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤 (NHL·)、侵襲性ΝΗ[、復發性侵襲性NHl、復發性惰性 NHL、難治性NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴細胞性白 金病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血 病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（All)及套細胞淋巴瘤。 在一態樣中’本發明提供治療B細胞增生性病症之方 法’其包含向個體投與有效量之抗_CD79b抗體或其免疫結 合物。在某些實施例中’一種治療B細胞增生性病症之方 法包含向個體投與有效量之醫藥調配物，該醫藥調配物包 含抗-CD79b抗體或抗-CD79b免疫結合物及（視情況）至少一 種其他治療劑，諸如下文所提供之彼等者。在某些實施例 中’一種治療細胞增生性病症之方法包含向個體投與有效 量之醫藥調配物’該醫藥調配物包含1)包含抗_CD79b抗體 及細胞毒性劑之免疫結合物；及（視情況）2)至少一種其他 治療劑’諸如下文所提供之彼等者。 在一態樣中，本發明之抗體或免疫結合物中之至少一些 可結合來自除人類外之物種之CD79b。因此，本發明之抗 132799.doc •354- 200918089 體或免疫結合物可用於結合（例如）含有CD79b之細胞培養 物、人類或具有與本發明之抗體或免疫結合物交叉反應之 CD79b之其他哺乳動物（例如黑猩猩、狒狒、狨猴、獼猴及 恆河猴、豬或小鼠）中的CD79b。在一實施例中，抗-CD79b抗體或免疫結合物可用於藉由使抗體或免疫結合物 與CD79b接觸以形成抗體或免疫結合物-抗原複合物以便使 免疫結合物之結合細胞毒素達到細胞内部而乾向B細胞上 之CD79b。在一實施例中，該CD79b為人類CD79b。 在一實施例中，抗-CD79b抗體或免疫結合物可用於用以 結合罹患與CD79b表現及/或活性增加相關之病症之個體的 CD79b之方法中，該方法包含向該個體投與抗體或免疫結 合物以便使個體之CD79b被結合。在一實施例中，使結合 之抗體或免疫結合物内在化至表現CD79b之B細胞中。在 一實施例中，該CD79b為人類CD79b，且該個體為人類個 體。或者，個體可為表現抗-CD79b抗體所結合之CD79b之 哺乳動物。此外，個體可為已引入CD79b(例如藉由CD79b 之投與或藉由編碼CD79b之轉殖基因之表現來達成）之哺乳 動物。 可向人類投與抗-CD79b抗體或免疫結合物以用於治療目 的。此外，可向表現與抗體交叉反應之CD79b之非人類哺 乳動物（例如，靈長類、豬、大鼠或小鼠）投與抗-CD79b抗 體或免疫結合物以用於獸醫目的或作為人類疾病之動物模 型。關於後者，該等動物模型可適用於評估本發明之抗體 或免疫結合物之治療功效（例如，測試投藥劑量及投藥時 132799.doc - 355 - 200918089 程）。 本發明之抗體或免疫結合物可單獨地加以使用或與療法 中之其他組合物組合使用。舉例而言，本發明之抗體或免 疫結合物可與至少一種其他治療劑及/或佐劑共投與。在 某些實施例中，另一治療劑為細胞毒性劑、化學治療劑或 生長抑制劑。在該等實施例之一者中，化學治療劑為諸如 環磷醯胺、羥基柔紅黴素、阿黴素、多柔比星、長春新鹼 (Oncovin™)、潑尼龍、CH〇p、cvp或c〇P之藥劑或藥劑 之組合，或諸如抗-CD20(例如Rituxan(g))或抗_VEGF(例如 Avastm®)之免疫治療劑，其中組合療法適用於治療癌症及 /或B細胞病症，諸如B細胞增生性病症，包括淋巴瘤、非 雈奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性 NHL、復發性惰性NHL、難治性^^^、難治性惰性nhl、 慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白 血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（all) 及套細胞淋巴瘤。 上文所述之該等組合療法涵蓋組合投藥（其中兩種或兩 種以上療劑包括於同一或獨立調配物中）；及獨立投 藥在°亥凊况下，本發明之抗體或免疫結合物之投與可在 另一治療劑及/或佐劑之投與之前、同時及/或之後進行。 本發明之抗體或免疫結合物亦可與放射療法組合使用。 本發明之抗體或免疫結合物（及任何其他治療劑或佐劑） 可藉由任何合適之方式投與，包括非經腸、皮下、腹膜 内、肺内及鼻内方式，且若局部治療需要時包括病灶内投 132799.doc •356· 200918089 樂。非經腸輸注包括肌肉内、靜脈内、動脈内、腹膜内或 投藥。另外，適當地藉由脈衝輸注投與抗體或免疫結 “勿，尤其遞減抗體或免疫結合物之劑量。可藉由任何人 適之途徑進行給藥，例如以注射方式，諸如靜脈内或皮; 注射，此部分視投藥是否為短暫投藥抑或長期投藥而定。 本發明之抗體或免疫結合物將以與良好醫學實踐一致之 方式來編己、給藥及投與。就此而言，考慮因素包括所治 療之特疋病症、所治療之转定u者$丨紅
， 特疋#礼動物、個別患者之臨床 情況、病症病因、藥劑傳遞部位、投藥方法、投藥進 排及開業醫師已知之其他因素。抗體或免疫結合物無^與 -或多種目前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配， 但視情況可與後者一起調配。該等其他藥劑之有效量係視 存在於調配物中之抗體或免疫結合物的量、病症或治療之 類型及上述其他因素而定。此等者一般係以與本文所述相 同之劑量及投藥途徑來使用或以約為本文所述之劑量之 1%至99%的劑量來使用，或以根據經驗/臨床確定為適當 之任何劑量及任何途徑來使用。 對於疾病之預防或治療而言，本發明之抗體或免疫結合 物之適當劑量(當單獨使用或與諸如化學治療劑之-或I 種其他額外治療劑組合使用時)將視待治療之疾病之類 型、抗體或免疫結合物之類型、疾病之嚴重性及病因、抗 體或免疫結合物係出於預防性目的抑或治療性目的而投 與、先前療法、患者之臨床病史及對抗體或免疫結合物之 反應以及主治醫師之判斷而定。適當地向患者一次性地或 132799.doc -357- 200918089 經一系列治療投與抗體或免疫結合物。 似说疾病之類型及嚴 重性而定，無論（例如）藉由一式炙 )猎由或夕次獨立投藥抑或藉由連 續輸注’約1 Mg/kg至100 mg/k (例 S 趴灼如0」mg/kg-20 mg/kg) 之抗體或免疫結合物可為向患者投與之初始候選劑量。一 個典型日劑量可在約1
Mg/kg至1〇〇 mg/kyt更高劑量之範 圍内變化’此視上文所提及之因素而定。對於經數天或更 長時間之重複投藥而言，視病狀而定，一般將持續治療直 至對疾病症狀之所需抑制出現為止。抗體或免疫結合物之 一個例示性劑量將在約〇.〇5 mg/kg至約1〇叫心之範圍 内。因此，可向患者投與約G5叫心、2() mg/kg、4〇 mg/kg或10 mg/kg(或其任何組合）中之一或多個劑量的抗體 或免疫結合物。該等劑量可間歇地投與例如每週或每三 週（例如以便使患者接受約兩個至約二十個或例如約六個 劑量之抗體或免疫結合物)。可投與初始較高負荷劑量， κ. 接著-或多個較低劑量。例示性給藥方案包含投與約4 mg/kg之初始負荷劑量，接著投與約2 之抗體之每週 維持劑量。然而’可使用其他給藥方案。此療法之進程易 於藉由習知技術及檢定來監測。 C.活性檢定 可藉由此項技術中已知之各種檢定針對物理/化學特性 及/或生物活十生來表徵本發明之抗〇7外抗體及免疫結合 物0 1.活性檢定 在態樣中，提供用以鑑別具有生物活性之抗_CD79b抗 132799.doc - 358 - 200918089 體或其免疫結合物的檢定。生物活性可包括（例如）抑制細 胞生長或增生之能力（例如細胞殺死”活性）；或誘導細 胞死亡之能力’包括漸進式細胞死亡（細胞凋亡）。亦提供 活體内及/或活體外具有該等生物活性之抗體或免疫結合 物。 在某些實知例中，對抗-CD79b抗體或其免疫結合物測試 其活體外抑制細胞生長或增生之能力。關於抑制細胞生長 或增生之檢定在此項技術中係熟知的。由本文所述之，，細 胞殺死"檢定所例示的關於細胞增生之某些檢定量測細胞 存活力。該種檢定為CellTiter-Gl〇TM發光細胞存活力檢 定，其可購自Promega (Madison，WI)。彼檢定基於所存在 之ATP之量化來測定培養物中活細胞之數目，Ατρ為代謝 活性細胞之指示。參見Crouch等人（1993) j Immun〇i Meth. 160:81-88，美國專利第66〇2677號。該檢定可以％ 孔或384孔形式進行，使其能執行自動高產量篩選（hts)。 參見 Cree 等人（1995) AntiCancer Drugs 6:398-404。該檢定 程序涉及將單一試劑（CellTiter_Gl〇®試劑）直接添加至培養 細胞中。此導致細胞溶解且產生由螢光素酶反應產生之發 光信號。該發光信號與所存在之Ατρ之量成比例，Ατρ之 量與存在於培養物中之活細胞之數目成正比。可藉由光度 計或CCD攝影成像裝置記錄f料。發光輸出係以相對光單 位（RLU)表示。 關於細胞增生之另一檢定為"MTT”檢定，亦即藉由線粒 體還原酶置測溴化3-(4,5-二曱基噻唑_2_基）-2,5-二苯基四 132799.doc -359· 200918089 唑鏽鹽至甲臢之氧化的比色檢定。類似檢 定，此檢定指不存在於細胞培養物中之代謝活性細胞之數 目。參見（例如）M〇smann (1983) J. Immun〇1 Meth 65:55_ 63及 Zhang 等人（2005) Cancer Res. 65:3877-3882。 在一態樣十，對抗-CD79b抗體測試其活體外誘導細胞死 亡之能力。關於誘導細胞死亡之檢定在此項技術中係熟知 的。在一些實施例中，該等檢定量測（例如）如藉由碘化丙 啶（pi)、錐蟲藍（參見厘00代等人，（1995) Cyt〇techn〇i〇gy， 17:1-11)或7AAD之攝取所指示的膜完整性之損失。在一例 示性PI攝取檢定中，將細胞培養於補充有1〇%熱滅活 FBS(Hycl〇ne)及2 mM L-麩胺醯胺之杜氏改良伊格爾培養 基（D-MEM):漢姆氏F-12(50:50)中。因此，在補體及免疫 效應細胞不存在之情況下執行檢定。將細胞以每盤3χ1〇6 個之密度接種於100x20 mm盤中且使其黏附隔夜^移除培 養基且用單獨新鮮培養基或含有各種濃度之抗體或免疫結 合物之培養基置換。將細胞培養3天之時段。繼治療後， 用PBS洗蘇單層且藉由騰蛋白酶消化分離。接著於4。^下將 細胞以1200 rpm離心5分鐘’將離心塊再懸浮於3 m^Ca2+ 結合緩衝液（10 mM Hepes(pH 7_4)、140 mM NaC 卜 2.5 mM CaCl2)中且等分至蓋有35爪爪過濾器之12χ75 mm管中 (每管1 ml，每治療組3管）以移除細胞凝塊。接著管接受 PI(10 Mg/ml)。使用FACSCANTM流式細胞儀及 FACSCONVERT™ CellQuest軟體（Becton Dickinson)分析樣 品。由此鑑別如藉由PI攝取所測定之誘導統計學上顯著的 132799.doc •360- 200918089 細胞死亡量之抗體或免疫結合物。 在一態樣中，對抗-CD79b抗體或免疫結合物測試其活體 外誘導細胞凋亡（漸進式細胞死亡）之能力。關於誘導細胞 凋亡之抗體或免疫結合物之一種例示性檢定為膜聯蛋白結 合檢定。在一例不性臈聯蛋白結合檢定中，將細胞培養且 接種於如前段中所論述之盤中。移除培養基且用單獨新鮮 培養基或含有0.001叫/如至10 μ§/Γη1之抗體或免疫結合物 之培養基置換。繼三天培養時段後，用PBS洗滌單層且藉 由胰蛋白酶消化分離。接著將細胞離心，再懸浮於。2+結 合緩衝劑中，且等分至如前段中所論述之管中。接著管接 受經標記之膜聯蛋白（例如膜聯蛋白。使 用FACSCANTN^式細胞儀及FACSC〇NVERTTM㈤旧口…軟 體（BD Biosciences)分析樣品。由此鑑別相對於對照組誘 導統計學上顯著的膜聯蛋白結合量之抗體或免疫結合物。 關於誘導細胞阔亡之抗體或免疫結合物之另一例示性檢定 為用於偵測染色體組DNA之核小體間降解之組蛋白DNA ELIS A比色檢定。此類檢定可使用（例如）細胞死亡偵測 ELISA套組（Roche，Palo Alto, CA)來執行。 用於上述活體外檢定中之任一者的細胞包括天然表現 CD79b或經工程化而表現CD79b之細胞或細胞株。該等細 胞包括相對於相同組織來源之正常細胞過表現CD79b之腫 瘤細胞。該等細胞亦包括表現CD79b之細胞株（包括腫瘤細 胞株）及通常並不表現CD79b但已經編碼CD79b之核酸轉染 之細胞株。 132799.doc •361 · 200918089 在一態樣中，對抗_CD79b抗體或其免疫結合物測試其活 體内抑制細胞生長或增生之能力。在某些實施例中，對 抗-CD79b抗體或其免疫結合物測試其活體内抑制腫瘤生長 之能力。諸如異種移植模型之活體内模型系統可用於該測 試。在一例示性異種移植系統中，將人類腫瘤細胞引入適 當之免疫受損非人類動物（例如SCID小鼠）中。向該動物投 與本發明之抗體或免疫結合物。量測抗體或免疫結合物抑 制或降低腫瘤生長之能力。在上述異種移植系統之某些實 施例中’人類腫瘤細胞為來自人類患者之腫瘤細胞。該等 適用於製備異種移植模型之細胞包括人類白血病及淋巴瘤 細胞株’其包括（但不限於）BJAB_luc細胞（經螢光素酶報導 體基因轉染之EB V陰性伯基特氏淋巴瘤細胞株）、Rarnos細 胞（ATCC，Manassas，VA，CRL-1923)、SuDHL-4 細胞 (DSMZ, Braunschweig，Germany，AAC 495)、DoHH2細胞 (參見 Kluin-Neilemans，H.C.等人，Leukemia 5:221-224 (1991)及 Kluin-Neilemans，H.C.等人，Leukemia 8:1385-1391 (1994))、Granta-519 細胞（參見 Jadayel，D.M_ 等人，
Leukemia 11⑴:64_72 (1997))。在某些實施例中，藉由皮 下注射或藉由移植至合適部位（乳腺脂肪墊）中將人類腫瘤 細胞引入適當之免疫受損非人類動物中。 2.結合檢定及其他檢定 在一態樣中，對抗-CD79b抗體測試其抗原結合活性。舉 例而言，在某些實施例中，對抗_CE>79b抗體測試其結合於 表現於細胞表面上之CD79b之能力。FACS檢定可用於該測 132799.doc - 362- 200918089 試。 在一態樣中，競爭性檢定可用於鑑別與鼠類2F2抗體及/ 或人類化2F2.D7抗體競爭結合於CD79b之單株抗體。在某 些實施例中，此類競爭性抗體結合於由鼠類2F2抗體及/或 人類化2F2.D7抗體所結合之同一抗原決定基（例如線性或 構形抗原決定基）。例示性競爭性檢定包括（但不限於）常規 檢定，諸如 Harlow 及 Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor，NY)中所提供之彼等者。關於定位抗體所結合之抗 原決定基的詳細例示性方法係於Morris (1 996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology 第 66 卷（Humana Press, To to wa, NJ)中提供。若各自將另一者之 結合阻斷50%或以上，則認為兩個抗體結合於同一抗原決 定基。 在一例示性競爭性檢定中，將經固定之CD79b培養於包 含可結合於CD79b之第一經標記之抗體（例如，鼠類2F2抗 體及/或人類化2F2.D7抗體）及第二未經標記之抗體（測試其 與第一抗體競爭結合於CD79b之能力）的溶液中。第二抗體 可存在於融合瘤上清液中。作為對照組，將經固定之 CD79b培養於包含第一經標記之抗體但不包含第二未經標 記之抗體的溶液中。在容許第一抗體結合於CD79b之條件 下培養後，移除過量未結合之抗體，且量測與經固定之 CD79b相聯之標記的量。若測試樣品中與經固定之CD79b 相聯之標記的量相對於對照樣品大體上降低，則此指示第 132799.doc - 363 - 200918089 二抗體與第一抗體競爭結合於CD79b。在某些實施例中， 經固定之CD79b存在於細胞表面上或存在於獲自表面上表 現CD79b之細胞之膜製劑中。 在一態樣中，經純化之抗-CD79b抗體可進一步藉由一系 列檢定來表徵，該等檢定包括（但不限於）N末端定序、胺 基酸分析、非變性尺寸排除高壓液相層析（HPLC)、質譜 法、離子交換層析及木瓜蛋白酶消化。 在一實施例中，本發明涵蓋一種經改變之具有一些但非 所有效應功能的抗體，該等功能使其成為抗體之活體内半 衰期較重要但某些效應功能（諸如補體及ADCC)並非必需 或為有害之許多應用的理想候選者。在某些實施例中，量 測抗體之Fc活性以確保僅維持所需特性。可進行活體外及/ 或活體内細胞毒性檢定以確定CDC及/或ADCC活性之降低/ 減少。舉例而言，可執行Fc受體（FcR)結合檢定以確保抗 體缺乏FcYR結合（因此可能缺乏ADCC活性），但保留FcRn 結合能力。介導ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcyRIII， 而單核細胞表現FcyRI、FcyRII及FcyRIII。造血細胞上之 FcR表現係總結於 Ravetch及 Kinet，Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)之第464頁之表3中。旨在評估所關注之分 子之ADCC活性的活體外檢定之一實例係描述於美國專利 第5,500,362號或第5,821，337號中。適用於該等檢定之效應 細胞包括周邊血液單核細胞（PBMC)及自然殺手（NK)細 胞。或者或另外，所關注之分子之ADCC活性可在活體内 評估，例如在諸如 Clynes 1A，PNAS (USA) 95:652- 132799.doc -364- 200918089 656(1998)中所揭示之動物模型中。亦可進行Clq結合檢定 以確定抗體不能結合C 1 q且因此缺乏CDC活性。為評估補 體活化，可執行CDC檢定，例如Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202:163 (1996)中所述。亦可使用此項 技術中已知之方法執行FcRn結合及活體内清除率/半衰期 測定。 僅出於說明性目的提供下列實例，而非意欲以任何方式 限制本發明之範疇。 本說明書中所引用之所有專利及參考文獻係以全文引用 的方式併入本文中。 實例 除非另有指示，否則根據製造商之說明書使用實例中所 提及之市售試劑。實例中所用之抗體包括市售抗體。下列 實例中及通篇說明書中以ATCC寄存編號標識之彼等細胞 之來源為美國菌種保藏中心，Manassas，VA。 實例1 :人類化抗-CD79b抗體之產生 殘基編號係根據Kabat(Kabat等人，Segwences 〇/ proteins of immunological interest，第 5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。使用單字母胺基酸縮寫。DNA簡併係使用IUB代 碼表示（N=A/C/G/T、D=A/G/T、V=A/C/G、B=C/G/T、 H=A/C/T、K=G/T、M=A/C、R=A/G、S = G/C、W=A/T、 Y=C/T)。 嵌合2F2抗體（本文中稱為”ch2F2”）係如先前2006年8月3 132799.doc - 365 - 200918089 曰申請之美國申請案第11/462,3 36號中所述來產生。 A,人類化抗-CD79b抗體接枝物 產生人類化抗-CD79b抗體。將來自鼠類2F2抗體 (mu2F2)之VL及VH域與人類一致VL κ I(huKI)及人類亞群 III 一致VH(huIII)域比對。為製造HVR接枝物，使用於如 下3個位置處不同於人類亞群III 一致VH域之受體VH構 架：R71A、N73T及 L78A(Carter 等人，Proc. iVa".
Scz·· t/M 89:4285 (1992))。將來自鼠類2F2(mu2F2)抗體之 高變區工程化至受體人類一致構架中以產生2F2之直接 HVR接枝物（本文中稱為"2F2接枝物”或"2F2接枝‘人類 化’抗體"或”hu2F2-接枝物”）。在VL域中，將下列區域接 枝於人類一致受體：位置24-34(Ll)、50-56(L2)及89-97 (L3)(圖 7)。在 VH域中，接枝位置 26-35(Η1)、49-65(H2)及 93-102(H3)(圖 8A 及 8B)。MacCallum 等人（MacCallum 等 人，乂 Mo/.价〇厂，262: 732-745 (1996))分析抗體及抗原複 合物晶體結構且發現，重鏈之位置49、93及94為接觸區之 部分且因此當人類化抗體時，其包括在HVR-H2及HVR-H3 之定義中。 藉由Kunkel突變誘發，對於各高變區使用獨立募核苷 酸，以呈現於噬菌體上之Fab形式及以IgG形式產生直接-接枝物變異體（2F2-接枝物）。藉由DNA定序來評估正確純 系。 人類化抗-CD79b抗體接枝物變異艘 使用噬菌體庫產生在2F2接枝"人類化”抗體之高變區中 I32799.doc -366- 200918089 包括突變多樣性之抗-CD79b抗體接枝物變異體。抗-CD79b抗體接枝物變異體包括HVR中之多個位置變化（圖 9) 〇 C. 噬菌體選擇 對於噬菌體選擇而言，於4°C下將huCD79becd(2 pg/ml)固 定於Max iS orp微量滴定板（Nunc)上之PBS中隔夜。使用酷 蛋白阻斷劑（Pierce)使板阻斷至少1 h。自培養物上清液收 穫噬菌體並將其懸浮於含有0.5% BSA及0.05% Tween 20(PBSBT)之PBS中。繼添加噬菌體庫及噬菌體選擇歷時2 h後，用含有0·05% Tween 20(PBST)之PBS廣泛地洗滌微量 滴定孔以移除未結合之噬菌體，且藉由將該等孔與100 mM HC1—起培養30 min來溶離結合之噬菌體。可在連續 輪選擇期間，藉由在溶離之前增加用PBST洗滌之次數或 藉由與可溶性huCD79beed —起培養歷時增加之時段來增加 選擇嚴格性。 用1 M Tris(pH 8)中和溶離之噬菌體且使用XLl-Blue細 胞及M13/K07輔助噬菌體擴增，並於37°C下於2YT、50 pg/ml羧节西林（carbenacillin)中生長隔夜。將溶離自含有 靶之孔之噬菌體的效價與回收自不含有靶之孔之噬菌體的 效價比較，以評估富集。 D. Fab產生及IgG產生 為表現Fab蛋白質以供親和力量測，將終止密碼子引入 噬菌體呈現載體中之重鏈與g3之間。將純系轉型至大腸桿 菌34B8細胞中且於30°C下生長於完全C.R.A.P.培養基中 132799.doc - 367- 200918089 (Presta等人.CMcer 57: 4593-4599 (1997))。藉由離心 收穫細胞，將其懸浮於PBS、100 μΜ PMSF、100 μΜ苄 脒、2.4 mM EDTA中且使用微流體化儀使其破碎。用蛋白 質G親和層析純化Fab。 出於篩選目的，最初在293細胞中產生IgG變異體。使用 FuGene系統將編碼VL及VH之載體（25 pg)轉染至293細胞 中。將 500 μlFuGene與4.5ml不含有FBS之DMEM培養基 混合且於室溫下培養5 min。將每一鏈（25 pg)添加至此混 合物中且於室溫下培養20 min並接著轉移至燒瓶中以於 3 7°C、5% C02下轉染隔夜。第二天，移除含有轉染混合物 之培養基且用23 ml具有0.1 ml/L痕量元素及10 mg/L胰島 素之PS04培養基置換。將細胞再培養5天，之後以1000 rpm收穫培養基歷時5 min，且使用0.22 μιη低蛋白質結合 過濾器進行無菌過濾。可在對每125 ml培養基添加2.5 ml 0.1% PMSF後將樣品儲存於4°C下。 E.親和力測定（Biacore分析) 對於2F2接枝”人類化”抗體變異體之親和力測定而言， 使人類CD79b之細胞外域（huCD79beed)單獨地或以Fc融合 物（huCD79becd-Fc)形式表現於CHO細胞中，且藉由習知方 式加以純化。另外，藉由習知方式合成含有2F2之抗原決 定基之16個胺基酸的肽（ARSEDRYRNPKGSACK)(SEQ ID NO: 78)。 2F2抗體（在圖14中標為”測試肽”）之抗原決定基之表徵先 前揭示於2006年8月3日申請之美國申請案第11/462,336號 132799.doc - 368 - 200918089 中。2F2抗體之抗原決定基位於跨膜域遠端之細胞外肽區 域中且存在於全長及截短形式之人類CD79b中（Cragg， 100(9): 3068-76 (2002))，該等形式已被描述見於正 常及惡性 Β 細胞中（Hashimoto，S.等人，Mo/· 32(9): 65 1-9 (1995) ; Alfarano等人’別⑽4 93(7): 2327-35 (1999))。截短形式之CD79b缺乏整個細胞外Ig樣域（在圖14 中將不存在於拼接截短形式之CD79b中之細胞外Ig樣域加 框）。 藉由表面電漿共振量測ch2F2之Fab及IgG變異體、2F2接 枝”人類化”抗體（hu2F2接枝物）或2F2接枝π人類化”抗體變 異體7(hu2F2.D7)與經固定之huCD79becd或CD79b-Fc或含 有2F2之抗原決定基之16個胺基酸的肽之結合。使用 BIAcoreTM-2000藉由表面電漿共振來執行親和力測定。將 抗原 huCD79becd4huCD79b-Fc 固定（約 50-200 RU)於 CM5感 應器晶片上之10 mM乙酸鈉（pH 4.8)中。在量測與含有2F2 之抗原決定基（SEQ ID NO: 78之胺基酸1-11)之16個胺基酸 的肽（ARSEDRYRNPKGSACK)(SEQ ID NO: 78)之結合之實 驗中，用塗有抗生蛋白鍵菌素之感應器晶片捕捉生物素標 記肽（約20 RU)。以3 0 pL/min之流動速率注射經純化之2F2 接枝”人類化"抗體變異體（呈Fab或IgG形式）（於PBST中之 0.5 nM至1000 nM之2倍連續稀釋液）。對每一樣品以4分鐘 締合及10分鐘解離分析。在每次注射後，使用1 〇 mM甘胺 酸（pH 1.7)使該晶片再生。 藉由自2F2接枝”人類化”抗體變異體（呈Fab或IgG形式）流 132799.doc -369- 200918089 動細胞減去對照流動細胞來校正結合反應。使用kQn及koff 之同時擬合之1:1朗缪爾模型（Languir model)進行動力學分 析。 F·結合分析（FACS分析) 為進一步測定由SR庫產生之2F2接枝”人類化”抗體變異 體7(hu2F2.D7)與BJAB細胞之結合，使用FACS分析來分析 經標記之hu2F2.D7(IgG變異體）抗體與BJAB細胞之結合。 對於FACS分析而言，根據製造商之說明，用Zenon® Alexa Fluor® 488 人類 IgG標記套組（Invitrogen，Carlsbad， California)標記單株抗體ch2F2及2F2.D7。對BJAB細胞 (100 μΐ體積中為1χ1〇6個）進行染色，其中經標記之抗體 hlgGl 同型、ch2F2 或 2F2.D7 各為 1 pg。 G.親和力測定（Scatchard分析) 為進一步測定於HVR-L3中具有變化之2F2接枝"人類化" 抗體變異體7(hu2F2.D7)之IgG變異體的結合，利用與未標 記之ch2F2競爭來分析經碘化之抗-CD79b(具有與ch2F2相 同之抗原決定基）與表現人類CD79b及獼猴CD79b之BJAB 細胞的結合且執行Scatchard分析。 對於Scatchard分析而言，在穩定表現獼猴CD79b及内源 性人類CD79b之經轉染之BJAB株存在下，0·5 nM具有與 ch2F2相同之抗原決定基之I125標記的抗-人類CD79b或0.5 nM I125標記之2F2接枝”人類化"抗體變異體7(hu2F2.D7)分 別與範圍為50 nM至0.02 nM(12步1:2連續稀釋）之未標記之 ch2F2或hu2F2.D7競爭。於4°C下四小時培養後，洗滌細胞 132799.doc -370· 200918089 且藉由γ計數器（1470 WIZARD自動γ計數器；Perkin Elmer, Walthem，ΜΑ)讀取細胞小球計數。所有點均重複進行三次 且計數歷時1 0分鐘。使用新配位體（Genentech，South San Francisco, CA)程式將平均CPM用於Kd計算。 結果與討論 A.人類化抗-CD79b抗體之產生之結果 用於產生人類化抗-CD79b之人類受體構架包含一致人類 κ I VL域及人類亞群III 一致VH域之變異體。變異VH域具 有來自人類一致：R71A、N73T及L78A之3個變化。將鼠 類2F2(mu2F)之VL及VH域與人類κ I及亞群III域比對；鑑 別每一 HVR且接著將其接枝於人類受體構架中以產生可以 Fab形式呈現於噬菌體上之HVR接枝物（圖7及8)。 以Fab形式呈現2F2-接枝物之噬菌體並不結合於經固定 之huCD79beed(資料未顯示）。另外，Fab形式之2F2-接枝物 並不結合huCD79beed且Fab或Ig形式之2F2-接枝物並不結合 huCD79beccj-Fc(圖10，NB =不結合），如藉由Biacore分析戶斤 測定。 1. CDR修復 鑑別能夠結合於具有下列序列變化之經固定之 11110〇7913£：£：£1的2F2接枝”人類化"抗體變異體。 在含有多個位置變化之庫中僅觀察到靶向L3中之HVR的 序列變化且將之展示於圖9中（對於L3突變：W89F及Y96F (2F2.D7 突變））（SEQ ID NO: 18)。 將所選純系重組為Fab以藉由FACS分析且重組為IgG以 132799.doc -371 - 200918089 進一步藉由Biacore及Scatchard分析。 a. 親和力測定（Biacore分析） 如展示Biacore分析結果之圖10中所示，此CDR修復途徑 鑑別恢復2F2接枝”人類化'’抗體之親和力的HVR-L3(hu2F2.D7)中之序列變化。表面電漿共振檢定顯示當結 合於經固定之huCD79beed或含有2F2之抗原決定基（SEQ ID NO: 78之胺基酸1-11)之16個胺基酸的肽時，L3(hu2F2.D7) 中之變化具有類似於ch2F2之親和力（圖10)(如藉由Biacore 分析所測定）。 b. 親和力測定（Scatchard分析） 如藉由Scatchard分析所評估，此CDR修復途徑鑑別改善 2F2接枝”人類化"抗體之親和力的序列變化。具體而言， 細胞結合檢定顯示ch2F2及2F2接枝”人類化"抗體變異體 7(hu2F2.D7)(重組為IgG)對於結合穩定表現獼猴CD79b及 内源性人類CD79b之BJAB細胞的親和力如藉由Scatchard分 析所測定分別為 1 nM(ch2F2 ; Kd=0.99 ± 〇·23 nM)及 2 nM(hu2F2.D7 ; Kd=2.0 ± 0.53 nM)之Kd值（資料未顯示）。 c. 結合測定（FACS測定） 如藉由FACS分析所評估，此CDR修復途徑鑑別改善2F2 接枝"人類化''抗體（hu2F2接枝物）與B JAB細胞之結合（資料 未顯示）的序列變化。具體而言，對自噬菌體庫鑑別之單 株hu2F2.D7(IgG變異體）與BJAB細胞之FACS分析顯示 hu2F2.D7變異體與BJAB細胞之結合（資料未顯示）。 B. 2F2抗體之人類化之討論 132799.doc • 372· 200918089 自 6個鼠類2F2 HVR(定義為位置 24-34(Ll)、50-56(L2)、 89-97(L3)、26-35(Η1)、49-65(H2)及 93-102(H3))接枝於人 類一致κ I VL及亞群III VH(含有A71、T73及A78)中開始， 使用CDR修復來鑑別改善結合親和力之HVR 1-6中之變 化。圖10中所鑑別之HVR序列變化產生具有類似於ch2F2 之親和力的2F2之人類化變異體。 實例2 :抗-CD79b抗體藥物結合物（ADC)之產生 為測試2F2接枝”人類化”抗體變異體之IgG變異體之功 效，使2F2接枝"人類化”抗體變異體與諸如DM1之藥物結 合。與DM1結合之變異體包括於HVR-L3中具有變化之變 異體。 用於產生抗-CD79b抗體之抗體藥物結合物（ADC)之藥物 包括美登素類DM1且可包括海兔毒素10衍生物單甲基奥瑞 他汀E(MMAE)及單甲基奥瑞他汀F(MMAF)。（參見US 2005/0276812 ； US 2005/0238649 ； Doronina 等人， C/zem., 17:114-123 (2006))，DM1、MMAE 及 MMAF為細胞毒性比用於化療性治療NHL之長春花生物鹼 有絲分裂抑制劑大至少1〇〇倍的有絲分裂抑制劑（Doronina 等尺，Bioconjug. Chem., 1 7:1 14-123 (2006) ; Doronina等 A > Nat. Biotechnol., 21: 778-784 (2003) ； Erickson^· A » 66: 4426-443 3 (2006)，所有該等文獻均以全 文引用的方式併入本文中）。適用於產生ADC之連接子對 於DM1為BMPEO、SPP或SMCC(本文中亦稱為"MCC")且對 於MMAE及MMAF為MC或MC-vc-PAB。對於DM1而言，使 132799.doc -373 · 200918089 用連接子試劑SMCC使抗體經由離胺酸之ε-胺基連接於 DM1之硫基。或者，對於DM1而言，可使用SPP連接子使 抗體經由離胺酸之ε-胺基連接於DM1。SPP(4-(2’-吡啶基硫 基）戊酸N-丁二醯亞胺酯）與離胺酸之ε胺基反應以於蛋白質 上留下反應性2-吡啶基二硫化物連接子。在SPP連接子情 況下，在與游離硫氫基（例如DM1)反應後，吡啶基被置 換，從而留下經由還原性二硫鍵連接之DM1。在還原條件 下釋放經由SPP連接子連接之DM 1 (亦即，例如在細胞 内），而在還原條件下經由SMCC連接子連接之DM1對裂解 具抗性。此外，若使ADC内在化且靶向溶酶體，從而引起 離胺酸-NS-DM1(其為細胞内之有效抗有絲分裂劑）之釋 放，則SMCC-DM1 ADC誘導細胞毒性，且當自細胞釋放 時，離胺酸-NS-DM1為無毒的（Erickson等人，沢以.， 66: 4426-4433 (2006))。對於 MMAE 及MMAF而言，抗體係 藉由順丁烯二醯亞胺基己醯基-纈胺酸-瓜胺酸（vc)-對胺基 苄氧羰基（MC-vc-PAB)經由半胱胺酸連接於MMAE或 MMAF。對於MMAF而言，或者，抗體可藉由順丁烯二醯 亞胺基己醯基（MC)連接子經由半胱胺酸連接於MMAF。 MC-vc-PAB連接子可由諸如組織蛋白酶B之細胞間蛋白酶 所裂解且當裂解時釋放游離藥物（Doronina等人，iVai. 別orec/mo/·，21: 778-784 (2003))，而MC連接子對細胞内蛋 白酶裂解具有抗性。 類似於US 2005/0276812中所述之程序產生使用SMCC-DM1之抗-CD79b之抗體藥物結合物（ADC)。將抗-CD79b純 132799.doc -374- 200918089 化之抗體缓衝劑交換至含有50 mM磷酸鉀及2 mM EDTA(pH 7.0)之溶液中。將SMCC(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)溶解於二甲基乙醯胺（DMA)中且添加至抗體 溶液中以構成10:1之最終SMCC/Ab莫耳比率。於室溫下使 該反應在混合下進行三個小時。隨後將經SMCC修飾之抗 體用以35 mM擰檬酸鈉及150 mM NaCl與2 mM EDTA(pH 6.0)平衡之GE Healthcare HiTrap脫鹽管柱（G-25)純化。將 溶解於DMA中之DM1添加至SMCC抗體製劑中以得到10:1 之DM1與抗體之莫耳比率。於室溫下使該反應在混合下進 行4-20小時。用20體積之PBS透濾經DM1修飾之抗體溶液 以移除未反應之DM1，進行無菌過濾，且儲存於4°C下。 通常，經由此過程獲得40-60%產率之抗體。如藉由凝膠過 濾及雷射光散射所評估，製劑通常>95%為單體。因為 DM1於252 nm下具有吸收最大值，所以可藉由於252及280 nm下之差異吸收量測來測定結合於抗體之藥物之量。通 常，藥物與抗體之比率為3比4。
類似於US 2005/0276812中所述之程序產生使用SPP-DM1連接子之本文所述之抗-CD79b抗體的抗體藥物結合物 (ADC)。將抗-CD79b純化之抗體緩衝劑交換至含有50 mM 磷酸鉀及2 mM EDTA(pH 7.0)之溶液中。將SPP (Immunogen)溶解於DMA中且添加至抗體溶液中以構成約 10:1之最終SPP/Ab莫耳比率，精確比率視抗體之所需藥物 負荷而定。1 0:1比率通常將導致約3-4之藥物與抗體之比 率。於室溫下使SPP在混合下反應3-4小時。隨後將經SPP 132799.doc -375· 200918089 修飾之抗體用以35 mM檸檬酸鈉及15〇 mM ^^^與2 mM EDTA(pH 6.0)或磷酸鹽緩衝生理食鹽水（pH 74)平衡之GE Healthcare HiTrap脫鹽管柱（G_25)純化。將DM1溶解於 DMA中且添加至SPP抗體製劑中以得到1〇:1iDM1與抗體 之莫耳比率，此導致超過抗體上之可用spp連接子3_4倍莫 耳過量。於室溫下使與DM!之反應在混合下進行4_2〇小 時。用20體積之PBS透濾經DM1修飾之抗體溶液以移除未 反應之DM 1，進行無菌過濾，且儲存於4。〇下。通常，以 此過程獲得40-60%或更大之抗體產率。如藉由凝膠過濾及 雷射光散射所评估，抗體-藥物結合物通常>95%為單體。 如對於製備SMCC-DMi結合物（上文所述）所述，藉由於252 及280 nm下之差異吸收量測來測定結合藥物之量。 亦可類似於US 2005/0238649中所述之程序產生使用]^(：- MMAF、MC-MMAE、MC-Val_cit(vc)_pAB_MMAE 或 MC_ Val-cit(Vc)-PAB-MMAF藥物連接子之本文所述之抗_CD79b 抗體的抗體藥物結合物（ADC)。將經純化之抗_ci)79b抗體 溶解於500 mM蝴酸納及500 mM氣化鈉（pH 8·0)中且進一步 用過量100 ΜΜ二硫蘇糖醇（DTT)處理。於37。〇下培養約3〇 分鐘後，藉由經由葡聚糖凝膠G25樹脂溶離來交換緩衝劑 且用具有1 mM DTPA之PBS進行溶離。藉由根據溶液於 280 nm下之吸光度來測定還原抗體濃度且藉由與 DTNB(Aldrich，Milwaukee, WI)反應並測定於412 nm下之 吸光度來測定硫醇濃度，從而檢驗硫醇/Ab值。將還原、之_ 抗體溶解於用冰冷卻之PBS中。將於DMSO中之例如MC- 132799.doc -376· 200918089 val-cit(vc)-PAB-MMAE之藥物連接子溶解於乙腈及水中， 且添加至於PBS中之經冷卻、經還原的抗體中。在一小時 培養後，添加過量順丁烯二醯亞胺以中止反應且將任何未 反應之抗體硫醇基封端。藉由離心超濾濃縮反應混合物且 將抗體藥物結合物純化並藉由以PBS經由G25樹脂溶離來 脫鹽，在無菌條件下經由0.2 μιη過濾器過濾，並冷凍儲 存。 將抗體藥物結合物（使用本文所述之抗-CD79b抗體）以2χ 10 pg/ml稀釋於檢定培養基中。用交聯劑SMCC連接結合 物（替代性二硫化物連接子SPP可用於美登素類DM1毒 素）（參見 US 2005/0276812及 US 2005/0238649)。此外’可 用MC-纈胺酸-瓜胺酸（vc)-PAB或MC使結合物連接於海兔 毒素10衍生物單甲基奥瑞他汀E(MMAE)毒素或單曱基奥瑞 他汀F(MMAF)毒素（參見2005年5月31曰申請之美國申請案 第11/141,344號及2004年11月5日申請之美國申請案第 10/983,340號）。陰性對照組包括基於HERCEPTIN®(曲妥 珠單抗）（抗-HER2)之結合物（SMCC-DM1或SPP-DM1或MC-vc-MMAE或MC-vc-MMAF)。陽性對照組可包括等同於結 合物負荷劑量之游離L-DM1。使樣品渦旋以確保在稀釋之 前混合物均勻。 適合於藥物結合之抗-CD79b抗體包括2F2嵌合抗體（實例 1A中所述）及本文另外描述之抗體（參見實例1 )，包括 hu2F2.D7 ° 實例3:活體内腫瘤細胞殺死檢定 132799.doc • 377· 200918089 異種移植物 為測試於HVR-L3中具有變化之2F2接枝”人類化"抗體變 異體的IgG變異體（hu2F2.D7)之功效，使hu2F2.D7變異體 與DM1結合且分析結合變異體對小鼠腫瘤之效應。 具體而言，可檢驗抗體使多種異種移植模型中之腫瘤消 退之能力，該等模型包括RAMOS細胞、BJAB細胞（含有 t(2;8)(pll2;q24) (IGK-MYC)易位、突變p53基因且為埃-巴 二氏病毒（EBV)陰性之伯基特氏淋巴瘤細胞株）(Drexler， H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001)、Granta 519細胞（含有導致 過度表現細胞週期素〇1(8(^1)之砍11;14)〇13 432)(80^1-IGH)易位、含有P16INK4B及P16INK4A缺失且為EBV陽性 之套細胞淋巴瘤細胞株）（DrexIer, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic
Press, 2001)、U698M細胞（淋巴母細胞性淋巴肉瘤B細胞 株 ' OTQxki:，H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Fach San Diego: Academic Press, 2001)及 DoHH2細 胞（含有導致過度表現由Ig重鏈驅動之Bcl-2之表示濾泡性 淋巴瘤特徵的易位t(14;18)(q32;q21)、含有P16INK4A缺 失、含有t(8;14)(q24;q32) (IGH-MYC)易位且為EBV陰性之 濾泡性淋巴瘤細胞株）（〇^\161>，1^.0.，77^/^«^所/(3-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press，200 1)。 為了分析2F2接枝"人類化"抗體變異體之功效，對雌性 132799.doc -378 - 200918089 CB17 ICR SCID 小鼠（6_8 週齡，來自 Charles Rivers
Laboratories ; Hollister，CA)經由注入CB17 ICR SCID小鼠 之側腹經皮下接種2x 107個BJAB-螢光素酶細胞或Granta_ 5 19細胞且使異種移植腫瘤生長至平均200 mm2。除非下文 具體指示，否則第0天係指腫瘤平均為200 mm2且當投與第 一/或唯一治療劑量時之日期。根據式：V=〇 5axb2(其中a 及b分別為腫瘤之長直徑及短直徑），基於使用測徑規量測 之兩個尺寸計算腫瘤體積，且以mm3表示。自每一實驗組 收集之資料係以平均值土 SE表示。以介於5〇微克與21〇微 克抗體連接藥物/平方公尺小鼠（相當於約1_4毫克/公斤小 鼠）之間的單一靜脈注射（i.v.)劑量，用2F2接枝，，人類化”抗 體後:異體或對照抗體-藥物結合物治療1 〇隻小鼠之組。在 整個實驗中母週一次或兩次量測腫瘤《在整個實驗中每週 一次或兩次量測小鼠之體重。在腫瘤體積達到3〇〇〇 mm3之 前或當腫瘤顯示近迫性潰瘍之徵象時對小鼠施以安樂死。 所有動物方案均經機構動物照顧與使用委員會 (Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批 准。 對於DM1而言’抗體與毒素之間所使用的連接子為硫醚 交聯劑SMCC。其他連接子可包括二硫化物連接子spp或 硫醚交聯劑SMCC(對於DM1而言）或MC或MC-纈胺酸-瓜胺 酸（vc)-PAB或具有順丁烯二醯亞胺組分及對胺基苄基胺甲 醯基（PAB)自我犧牲型組分之（纈胺酸-瓜胺酸（vc))二肽連 接子試劑（對於單甲基奥瑞他汀E(MMAE)或單甲基奥瑞他 132799.doc •379- 200918089 汀F(MMAF)而言）。所用之毒素為DM1。其他毒素可包括 MMAE 或 MMAF。 用於此實驗之CD79b抗體包括如2006年8月3日申請之美 國申請案第1 1/462,336號中所述之嵌合2F2(ch2F2)抗體（參 見實例1A)以及本文所述之2F2接枝"人類化"抗體變異體 (參見實例1)。其他抗體可包括由2006年7月11日以PTA-7712寄存於ATCC之融合瘤產生的2F2抗體。 陰性對照組包括基於HERCEPTIN® (曲妥珠單抗）（抗-HER2)之結合物（SMCC-DM1)。 B·結果 1. BJAB-螢光素酶異種移植物 在36天時程中，與DM1結合之2F2接枝"人類化"抗體變 異體7(hu2F2.D7變異體）（重組為IgG)及嵌合抗-CD79b抗體 (ch2F2)(分別為 hu2F2.D7-SMCC-DMl 及 ch2F2-SMCC-DMl) 顯示與陰性對照組HERCEPTIN®(曲妥珠單抗）-SMCC-DM1(抗-HER2-SMCC-DM1)相比具有BJAB-螢光素酶腫瘤 之SCID小鼠之腫瘤生長得到抑制。對於所有ADC及對照組 在第0天以單劑量投與ADC(如表7中所指示）。具體而言， hu2F2.D7-SMCC-DMl 抗體（重組為 IgG)及 ch2F2-SMCC-DM1顯著抑制腫瘤生長（圖19)。此外，在表7中，指示所測 試之總數中顯示PR=部分消退（其中投藥後任何時候之腫瘤 體積下降至低於第0天時量測之腫瘤體積之50%)或CR=完 全好轉（其中投藥後任何時候之腫瘤體積下降至〇 mm3)的 小鼠數目。 132799.doc • 380 - 200918089 表7 : SCID小鼠之B JAB-螢光素酶異種移植物（2千萬個細 胞/隻小鼠） 所投與之抗體(治療） PR CR Ab劑量 (mg/kg) 藥物-DM1 劑量 (Hg/m2) 藥物比率 (藥物/Ab) 對照組抗-HER2-SMCC-DM1 0/10 0/10 2 100 3.3 ch2F2-SMCC-DMl 0/10 1/10 2.3 100 3 ch2F2-SMCC-DMl 0/10 0/10 1.2 50 3 hu2F2.D7-SMCC-DMl 1/10 1/10 2.9 100 2.3 hu2F2.D7-SMCC-DMl 1/10 0/10 1.5 50 2.3 2. Granta-519(人類套細胞淋巴瘤）異種移植物 在14天時程中，2F2接枝"人類化”抗體變異體 7(hu2F2.D7 變異體）（重組為 IgG)(hu2F2.D7-SMCC-DMl)顯 示與陰性對照組HERCEPTIN⑨（曲妥珠單抗）-SMCC-DM1(抗-HER2-SMCC-DM1)相比具有 Granta-519 腫瘤之 SCID小鼠之腫瘤生長得到抑制。對於所有ADC及對照組在 第0天以單劑量投與ADC(如表8中所指示）。具體而言， hu2F2.D7-SMCC-DMl抗體（重組為IgG)顯著抑制腫瘤生長 (圖 20A)。 此外，用 hu2F2.D7-SMCC-DMl 及對照組 HERCEPTIN® (曲妥珠單抗）-SMCC-DMl (抗-HER2-SMCC-DM1)治療並未 導致小鼠體重百分比降低（圖20B)。更進一步地，在表8 中，指示所測試之10隻小鼠總數中顯示PR=部分消退（其中 投藥後任何時候之腫瘤體積下降至低於第〇天時量測之腫 瘤體積之50%)或CR=完全好轉（其中投藥後任何時候之腫 瘤體積下降至0 mm3)的小鼠數目。 132799.doc -381 - 200918089 表8 : SCID小鼠之Granta-519異種移植物（2千萬個細胞/隻 小鼠） 所投與之抗體(治療） PR CR Ab劑量 (mg/kg) 藥物-DM1 劑量 (μδ/ιη2) 藥％比率 (藥物/Ab) 對照組抗-HER2-SMCC-DM1 0/10 0/10 4 206 ~X4 ~ hu2F2.D7-SMCC-DMl 0/10 0/10 4 166 ~Z8 ~~~ 根據2F2接枝"人類化”抗體ADC顯著抑制異種移植物之 腫瘤進展之能力，CD79b分子可為治療哺乳動物腫瘤之優 良輕，該等腫瘤包括B細胞相關癌症，諸如淋巴瘤（亦即非 霍奇金氏淋巴瘤）、白血病（亦即慢性淋巴細胞性白血病）及 其他造血細胞之癌症。此外，2F2接枝"人類化"ADC適用 於降低腫瘤之活體内腫瘤生長，該等腫瘤包括B細胞相關 癌症，諸如淋巴瘤（亦即非霍奇金氏淋巴瘤）、白血病（亦即 慢性淋巴細胞性白血病）及其他造血細胞之癌症。 實例4 : CD79b抗體共定位 為確定2F2接枝”人類化”抗體及抗體變異體在内在化至 細胞中後傳遞之部位’可在Ramos細胞株中評估内在化至 B細胞株中之抗-CD79b抗體之共定位研究。LAMP-1為晚 期内體及溶酶體（包括MHC II型隔室（MIIC)，其為晚期内 體/溶酶體樣隔室）之標誌（Kleijmeer等人’《/owrwa/ 〇/ Ce// Biology, 139(3): 639-649 (1997) ; Hunziker 等人，
Bioessays, 18:379-389 (1996) ； Mellman^ Λ. * Annu. Rev. Z^v.价o/ogy, 12:575-625 (1996))。HLA-DM為 MIIC之標誌。 於37°C下將Ramos細胞與1 pg/ml 2F2接枝”人類化”抗體 及抗體變異體、FcR嵌段（Miltenyi)及25 pg/ml Alexa647-轉 132799.doc -382- 200918089 鐵蛋白（Molecular Probes) —起於完全無碳酸鹽培養基 (Gibco)中在1〇 pg/mi亮抑蛋白酶肽（R0Che)及5 μΜ抑胃肽 (Roche)存在下培養3小時以抑制溶酶體降解。接著將細胞 洗滌兩次，於室溫下用3%三聚曱醛（Electron Microscopy Sciences)固定 20 分鐘，用 50 mM NH4Cl(Sigma)中止，用 0.4%皂苷/2% FBS/1% BSA滲透處理20分鐘且接著與1 pg/ml Cy3 抗-小鼠（Jackson Immunoresearch)—起培養 20 分 鐘。接著用小鼠IgG(Molecular Probes)將反應阻斷20分 在里’接者與Image-iT FX信號增強子（Molecular Probes) — 起培養30分鐘。最後將細胞與Zenon Alexa488標記之小鼠 抗-LAMP 1 (BE) Pharmingen)(亦即一種溶酶體與MIIC(亦即 為MHC II型路徑之部分的溶酶體樣隔室）之標誌）一起培養 20分鐘，且用3¾ PFA進行後固定。將細胞再懸浮於20 μΐ 皂苷緩衝劑中且使其黏附於塗有聚-離胺酸（sigma)之載 片 ’ I5通後以含有DAPI 之 VectaShield(Vector Laboratories)安 上蓋片。對於MIIC或溶酶體之免疫螢光而言，將細胞如上 固定、滲透處理及增強’接著按照製造商之說明書 (Molecular Probes)在過量小鼠IgG存在下與zenon標記之 Alexa555-HLA-DM(BD Pharmingen)及 Alexa488-Lampl 共 染色。 因此’如藉由免疫螢光所評估’ 2F2接枝”人類化，，抗體 或抗體變異體與B細胞株之Mnc或溶酶體之共定位可指示 分子作為治療哺乳動物腫瘤之優良藥劑，該等腫瘤包括B 細胞相關癌症，諸如淋巴瘤（亦即非霍奇金氏淋巴瘤）、白 132799.doc • 383 · 200918089 血病（亦即慢性淋巴細胞性白血病）及其他造血細胞之癌 症。 實例5:半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體之製備 如本文所揭示執行半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體之製 備。 可藉由本文所揭示之方法誘發編碼ch2F2抗體（輕鏈， SEQ ID NO: 4，圖 4 ;及重鏈，SEQ ID NO: 5，圖 5)之 DNA突變以修飾輕鏈及重鏈。 藉由本文所揭示之方法誘發編碼hu2F2.D7抗體（重鏈 (SEQ ID NO: 90)及輕鏈（SEQ ID NO: 89)，圖 13)之 DNA 突 變以修飾重鏈。亦可藉由本文所揭示之方法誘發編碼 hu2F2.D7抗體（重鏈（SEQ ID NO: 90)圖13)之DNA突變以修 飾重鍵之Fc區。 在半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體之製備中，誘發編碼輕 鏈之DNA突變以如圖18(hu2F2.D7 thioMAb之輕鏈SEQ ID NO: 8 8)中所示用半胱胺酸取代輕鏈中Kabat位置205(依序 位置2 1 0)之纈胺酸。誘發編碼重鏈之DNA突變以如圖 17(hu2F2.D7 thioMAb^ t ^SEQ ID NO: 8 5) t ^ ^ ^ 胺酸取代重鏈中EU位置118(依序位置118 ; Kabat編號114) 處之丙胺酸。可誘發抗-CD79b抗體之Fc區突變以如表2-3 中所示用半胱胺酸取代重鏈Fc區中EU位置400(依序位置 400 ; Kabat編號396)處之絲胺酸。 A.藉由還原及再氧化來製備用於結合之半胱胺酸工程化 抗-CD79b抗艘 132799.doc -384- 200918089 使全長、半胱胺酸工程化抗-CD79b單株抗體（ThioMab) 表現於CHO細胞中且以蛋白質A親和層析接著尺寸排阻層 析進行純化。將經純化之抗體於500 mM硼酸鈉及500 mM 氣化鈉（約pH 8.0)中複配且於37°C下用約50-100倍莫耳過 量之1 mM TCEP(鹽酸參（2-羧基乙基）膦；Getz等人 (1999)Anal. Biochem.第 273 卷：73-80 ; Soltec Ventures， Beverly, ΜA)還原歷時約1-2小時。將經還原之ThioMab稀 釋且以10 mM乙酸鈉（pH 5)裝載於HiTrap S管柱上，且用 含有0.3 Μ氣化鈉之PBS溶離。於室溫下用2 mM脫氫抗壞 血酸（dhAA)(pH 7)或2 mM硫酸銅（CuS04)水溶液將經溶離 還原之ThioMab處理3小時隔夜。周圍空氣氧化亦可為有效 的。藉由經由葡聚糖凝膠G25樹脂溶離來交換緩衝劑且用 具有1 mM DTPA之PBS進行溶離。藉由根據溶液於280 nm 下之吸光度來測定還原抗體濃度且藉由與DTNB(Aldrich, Milwaukee, WI)反應並測定於412 nm下之吸光度來測定硫 醇濃度，從而估算硫醇/Ab值。 實例6 :藉由半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體與藥物-連接子 中間物之結合來製備半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體藥物 結合物 在實例5之還原及再氧化程序後，將半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體於PBS(磷酸鹽緩衝生理食鹽水）緩衝液中複配 且於冰上冷卻。將相對於每抗體之工程化半胱胺酸約1.5 莫耳當量之具有硫醇反應性官能基（諸如順丁烯二醯亞胺 基）的奥瑞他汀藥物連接子中間物（諸如MC-MMAE(順丁烯 132799.doc -385- 200918089 二醯亞胺基己醯基··單曱基奥瑞他汀E)、MC-MMAF、MC-val-cit-PAB-MMAE 或 MC-val-cit-PAB-MMAF)溶解於 DMSO 中，稀釋於乙腈及水中，且添加至於PBS中之經冷卻還 原、再氧化之抗體中。在約一小時後，添加過量順丁烯二 醯亞胺以中止反應且將任何未反應之抗體硫醇基封端。藉 由離心超濾濃縮反應混合物且將半胱胺酸工程化抗-CD79b 抗體藥物結合物純化並藉由以PBS經由G25樹脂溶離來脫 鹽，在無菌條件下經由0.2 μπι過濾器過濾，並冷凍儲存。 可如下執行hu2F2.D7-HC(A118C)thioMAb-BMPEO-DMl 之製備。藉由雙-順丁烯二醯亞胺基試劑BM(PEO)3 (Pierce Chemical)修飾 hu2F2.D7-HC(A 11 8C) thioMAb上之游離半 胱胺酸，從而於抗體表面上留下未反應之順丁烯二醯亞胺 基。此係藉由將BM(PEO)3溶解於50°/。乙醇/水混合物中至 1 0 mM之濃度且將十倍莫耳過量之BM(PEO)3添加至含有 hu2F2.D7-HC(A118C) thioMAb於磷酸鹽緩衝生理食鹽水中 之溶液（濃度為約1·6 mg/ml(10微莫耳））中且使其反應1小時 來實現。藉由凝膠過遽（HiTrap管柱，Pharmacia)以30 mM 檸檬酸鹽（pH 6)及150 mM NaCl緩衝劑移除過量 BM(PEO)3。將溶解於二曱基乙醯胺（DMA)中之約10倍莫 耳過量 DM1 添加至 hu2F2.D7-HC(A118C) thioMAb-BMPEO 中間物中。亦可利用二甲基甲醯胺（DMF)溶解藥物部分試 劑。使反應混合物反應隔夜，隨後凝膠過濾或透析至PB S 中以移除未反應之藥物。使用以PBS於S200管柱上之凝膠 過濾來移除高分子量聚集體且提供經純化之hu2F2.D7- 132799.doc -386· 200918089 HC(A118C) thioMAb-BMPEO-DMl。 藉由相同方案，可產生thio對照組hu-抗-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1、thio 對照組 hu-抗-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF、thio 對照組 hu-抗-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-1^厘八£及让1〇對照組抗-€022-11(：(八118(：)-厘(：-^4]^八尸。 藉由上述程序，可製備及測試例如（但不限於）下列各者 之半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體藥物結合物（TDC): 1. 藉由 A118C thio hu2F2.D7-HC(A118C)與 MC-MMAF 之 結合得到之 thio hu2F2.D7-HC(A118C)-MC-MMAF ; 2. 藉由 A118C thio hu2F2.D7-HC(A118C)與 BMPEO-DM1 之結合得到之thio hu2F2.D7-HC(A118C)-BMPEO-DMl ; 3. 藉由 A118C thio hu2F2.D7-HC(A118C)與 MC-val-cit-PAB-MMAE 之結合得到之 thio hu2F2.D7-HC(A 11 8C)-MCvcPAB-MMAE ； 4. 藉由 thio ch2F2-HC(A118C)與 MC-MMAF 之結合得到之 thio ch2F2-HC(A118C)-MC-MMAF ;及 5. 藉由 thio ch2F2-LC(V205C)與 MC-MMAF 之結合得到之 thio ch2F2-LC(V205C)-MC-MMAF。 實例7:半胱胺酸工程化ThioMAb藥物結合物與細胞表面 抗原之結合親和力的表徵 藉由FACS分析測定thio hu2F2.D7藥物結合物及thio ch2F2藥物結合物與表現於BJAB-螢光素酶細胞上之CD79b 的結合親和力。 簡言之，使100 μΐ之約1X106個細胞與不同量（每百萬細 132799.doc -387- 200918089 胞之BJAB-螢光素酶細胞為1.0 pg、0.1 pg或0.01 pg之Ab) 的（但不限於）下列抗-CD79b thioMAb藥物結合物或裸物質 (未結合之Ab作為對照組）中之一者接觸：（l)thio ch2F2-LC(V205C)-MC-MMAF 或（2)thio ch2F2-HC(Al 18C)-MC-MMAF ； (3)thio hu2F2.D7-HC(A 11 8C)-MCvcPAB-MMAE ； (4)thio hu2F2.D7-HC(A118C)-BMPEO-DMl 或（5)thio hu2F2.D7-HC(A118C)-MC-MMAF。使用 PE 結合之小鼠抗-人類Ig作為第二偵測抗體（BD目錄號555787)。 使用PE結合之小鼠抗人類Ig偵測結合於細胞表面之抗-CD79b抗體。 實例8:關於藉由抗-CD79b ThioMab藥物結合物活體外降 低細胞增生之檢定 藉由細胞增生檢定（例如在BJAB-螢光素酶、Granta-519、WSU-DLCL2細胞中）量測抗-CD79b ThioMAb-藥物結 合物（包括（但不限於）thio hu2F2.D7-HC(A118C)-MCMMAF、 thio hu2F2.D7-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE 及 thio hu2F2.D7-HC(A118C)-BMPEO-DMl)之活體外效能。 CellTiter-Glo®發光細胞存活力檢定為基於鞘翅目 (Co/eopiera)螢光素酶之重組表現之市售（Promega Corp.， Madison, WI)均質檢定方法（US 5583024; US 5674713; US 5700670)。此細胞增生檢定基於所存在之ATP之量化來 測定培養物中活細胞之數目，ATP為代謝活性細胞之指示 物（Crouch等人，J. 如/· Mei/zo·, 160: 81-88 (1993); US 6602677)。以96孔形式進行CellTiter-Glo®，使其能執 132799.doc -388· 200918089 行自動南產篁師選（HTS)(Cree等人，/^"以， 6:398-404 (1995))。均質檢定程序涉及直接將單一試劑 (CellTiter-Glo®試劑）添加至培養於補給血清之培養基中之 細胞中。 均質"添加-混合-量測"形式導致細胞溶解且產生與所存 在之ATP之量成比例的發光信號。藉由重組螢火蟲螢光素 酶使受質曱蟲螢光素氧化脫羧基，同時伴隨ATP轉化為 AMP且產生光子。以相對發光單位（RLU)反映活細胞。可 藉由光度計或CCD攝影成像裝置記錄資料。將發光輸出表 示為RLU，其係隨時間測得。將％RLU標準化為與"非藥 物-結合物"對照組相比之RLU百分比。或者，可用閃爍計 數器在閃爍體存在下對來自發光之光子計數。接著可以 CPS(每秒計數）表示光單位。 藉由細胞增生檢定’利用以下自CellTiter Glo發光細胞 存活力檢定（Promega Corp. Technical bulletin TB288 ; Mendoza等人，62: 5485-5488 (2002))修改之 方案來量測thioMAb-藥物結合物之功效： 1. 使40 μΐ於培養基中含有約3000個BJAB、Granta-519或 WSU-DLCL2細胞之細胞培養物的等分試樣沈積於384孔、 不透明壁板之各孔中。 2. 將TDC(ThioMab藥物結合物）（10 μι)添加至（一式四份） 實驗孔中至 10000 ng/mL、3333 ng/mL、1111 ng/mL、370 ng/mL、123 ng/mL、41 ng/mL、13.7 ng/mL、4.6 ng/mL或 1.5 ng/mL之最終濃度，其中”非藥物結合物"對照孔僅接受 132799.doc - 389- 200918089 培養基’且加以培養3天。 3.將該等板平衡至室溫歷時約30分鐘。 4·添加 CellTiter-Glo試劑（50 μΐ)。 5 ·將内含物用軌道震盪器混合2分鐘以誘導細胞溶胞。 6. 將板於室溫下培養1〇分鐘以使發光信號穩定。 7. 記錄發光且以％RLU(相對發光單位）報導於圖中。於 0.51 ng/mL下將來自用無藥物-結合物培養基培養之細胞之 資料繪圖。 培養基：BJAB、Granta-519及WSU-DLCL2細胞生長於 RPMI1640/1 0%FBS/2mM麩醯胺酸中。 實例9:關於抗-CD79b ThioMab藥物結合物活體内抑制腫 瘤生長之檢定 在類似研究中’使用與實例3中所揭示相同之異種移植 研究方案（參見上文），改變所投與之藥物結合物及劑量， 研究thioMAb藥物結合物對於減小異種移植模型中之b細 胞腫瘤體積之功效’該等異種移植模型例如Granta_5 19異 種移植物（人類套細胞淋巴瘤）、DOHH2(濾泡性淋巴瘤）異 種移植物、WSU-DLCL2(彌漫性大細胞淋巴瘤）異種移植物 或BJAB(伯基特氏淋巴瘤）異種移植物。 應認為，上文所寫之說明書足以使熟習此項技術者能夠 實施本發明。本發明在範疇上不限於寄存構建物，此係因 為寄存實施例意欲作為本發明之某些態樣之單一說明且功 能等效之任何構建物均屬於本發明之範疇内。本文中物質 之寄存並未構成對本文中含有之所寫描述不足以使本發明 I32799.doc •390- 200918089 之任何態樣（包括其最佳方式）之實施成為可能的承認，亦 不視為使申請專利範圍之範嘴受限於其所體現之特定示 例。實際上’除本文所述及所示之彼等者外的本發明之多 種修改根據上文描述對於熟習此項技術者將變得顯而易見 且屬於附申請專利範圍之範疇内。 【圖式簡單說明】 圖1展示PR036249 cDNA之核苷酸序列（seq m N〇: 1)其中SEQ ID NO: 1為本文中指定為”DNA225786,，之純 系（本文中亦稱為”CD79b”）。該核苷酸序列編碼CD79b，其 中起始及終止密碼子以粗體顯示且加下劃線。 圖2展示源自圖所示之SEQ ID N〇:五之編碼序列的胺 基酸序列（SEQ ID NO: 2)。 圖3顯示嵌合2F2(ch2F2)IgG1(2F2為鼠類單株抗_cD79b 抗體）之輕鏈之核皆酸序列（SEQ ID N〇: 3)。該核苷酸序列 編碼圖4中所示之祕2之輕鏈，其中第-密碼子（編碼SEQ ID NO: 4之第一胺基酸）以粗體顯示且加下劃線。 圖4展示㈣圖3中所示之SEQ ID N〇: 3之編碼序列的胺 基酸序列(SEQ ID NO: 4)。可變區為未加下劃線之區域。 >圖5顯示嵌合2F2(ch2F2)IgG1(2F2為鼠類單株抗<〇7讣 抗體）之重鏈之核#酸序列（SEQ ID N〇: 5)。該核皆酸序列 編碼圖6中所示之_2之重鏈，其密碼子（編碼SEQ ID NO: 6之第—胺基醆）以粗體顯示且加下劃線。 圖6展示源自圖5中所示之SEQ m N〇: 5之編碼序列的胺 基酸序列（SEQ ID Ν0: 6)。可變區為未加下劃線之區域。 132799.doc •391 . 200918089 圖7展示下列者之可變輕鏈之序列的比對：具有VL-FRl 、 VL-FR2 、 VL-FR3 、 VL-FR4(分別為 SEQ ID NO: 65-68)之輕鏈人類κ I一致序歹ij (標為"huKI” ； SEQ ID NO: 9)、 鼠類2F2抗-CD79b抗體（標為”mu2F2”且本文中亦稱為 "2F2" ； SEQ ID NO: 10)、2F2接枝”人類化"抗體（標為 "hu2F2接枝物”；SEQ ID NO: 11)及2F2接枝”人類化"抗體 變異體7(標為"hu2F2.D7" ; SEQ ID NO: 12)(含有 71A、73T 及78A)。根據Kabat對位置進行編號且將自鼠類2F2接枝於 可變輕鏈κ I 一致構架之高變區（HVR)加框。 圖8A-B展示下列者之可變重鏈之序列的比對：具有VH-pRl 、 VH-FR2 、 VH-FR3及 VH-FR4(分別為 SEQ ID NO: 69-72)之重鏈人類亞群III 一致序列（標為"humlll” ； SEQ ID NO: 13)、鼠類2F2抗-CD79b抗體（標為Mmu2F2”且本文中亦 稱為"2F2" ; SEQ ID NO: 14)、2F2接枝”人類化”抗體（標為 ”hu2F2 接枝物"；SEQ ID NO: 15)(含有 71A、73T 及 78A)及 2F2接枝”人類化"抗體變異體7(標為” hu2F2.D17" ; SEQ ID NO: 16)(含有71A、73T及78A)。根據Kabat對位置進行編 號且將自mu2F2接枝於可變重鏈亞群III 一致構架之高變區 (HVR)加框。 圖9展示所選2F2接枝"人類化"抗體變異體之HVR序列 (SEQ ID NO: 18)，其中該變異體於2F2接枝n人類化"抗體 之單一 HVR區中具有多個胺基酸變化（HVR-L3(SEQ ID NO: 61)之部分在圖9中以SEQ ID NO: 17展示）。所示胺基 酸變化外之可變輕鏈及可變重鏈之序列與2F2接枝物一致 132799.doc -392- 200918089 且未圖示。未觀察到2F2接枝"人類化"抗體之HVR-L1(SEQ ID NO: 59) ' HVR-L2(SEQ ID NO: 60) ' HVR-H1(SEQ ID NO: 62)、HVR-H2(SEQ ID NO: 63)或 HVR-H3(SEQ ID NO: 64)之變化。 圖10展示對包括ch2F2抗體（標為”ch2F2")、2F2接枝"人 類化”抗體（標為”hu2F2接枝物"且本文中亦稱為"2F2接枝物··） 及2F2接枝”人類化”抗體變異體7(hu2F2.D7)(89F、96F ; SEQ ID NO: 18)之所選抗-CD79b抗體與包括人類CD79b之 ( 細胞外域（huCD79beed)、與Fc融合之人類CD79b之細胞外 域（huCD79beed-Fc)及含有2F2之抗原決定基的16個胺基酸 之肽（16mer 肽；SEQ ID NO: 78 ; SEQ ID NO: 78 之胺基酸 1 -11處之抗原決定基）的指定抗原之Biacore分析結果。未 偵測到之結合在圖中以"NB"表示。 圖11A-B(可變重鏈（VH)—致構架）及圖12(可變輕鍵（VL) 一致構架）展示具有如下序列識別符之用於實施本發明之
例示性受體人類一致構架序列：（圖11A-B)缺失Kabat CDR f
之人類VH亞群I一致構架（SEQ ID NO: 3 6)、缺失延伸高變 區之人類VH亞群I 一致構架（SEQ ID NO: 37-39)、缺失 Kabat CDR之人類VH亞群II一致構架（SEQ Π) NO: 40)、缺 失延伸高變區之人類VH亞群II 一致構架（SEQ ID NO: 41-43)、缺失Kabat CDR之人類VH亞群III —致構架（seq id NO: 44)、缺失延伸高變區之人類VH亞群in—致構架（SEq ID NO: 45-47)、缺失Kabat CDR之人類VH受體構架（SEQ ID NO: 48)、缺失延伸高變區之人類VH受體構架（SEQ ID 132799.doc - 393 - 200918089 NO: 49-5 0)、缺失Kabat CDR之人類VH受體2構架（SEQ ID NO: 51)及缺失延伸高變區之人類VH受體2構架（SEQ ID NO: 52-54)以及（圖12)人類VL κ亞群I 一致構架（SEQ ID NO: 55)、人類 VL κ 亞群 II 一致構架（SEQ ID NO: 56)、人 類κ亞群III 一致構架（SEQ ID NO: 57)及人類κ亞群IV—致 構架（SEQ ID NO: 58)。 圖13A(輕鏈）及13B(重鏈）展示本發明之抗體（2F2.D7)之 胺基酸序列。圖13A(輕鏈）及13B(重鏈）展示本發明之抗體 (hu2F2.D7)之一實施例的構架（FR)、高變區（HVR)、第一 恆定域（CL或CH1)及Fc區（Fc)之胺基酸序列（SEQ ID NO: 19-26(圖 13A)及 SEQ ID NO: 27-3 5(圖 13B))。分別展示 2F2.D7之輕鏈及重鏈之全長胺基酸序列（可變區及恆定 區）（SEQ ID NO: 89(圖13A)及90(圖13B))，其中將恆定域 加下劃線。展示可變域之胺基酸序列（SEQ ID NO: 12(圖 13A為輕鏈）及SEQIDNO:16(圖13B為重鏈））。 圖14展示來自人類（SEQ ID NO: 2)、獼猴（cyno)(SEQ ID NO: 7)及小鼠（SEQ ID NO: 8)之CD79b之胺基酸序列的比 對。人類及cyno-CD79b具有85%胺基酸一致性。圖中指出 信號序列、測試肽（實例1中所述之2F2抗體的11個胺基酸 之抗原決定基；SEQ ID NO: 78之胺基酸1-11 (ARSEDRYRNPK))、跨膜（TM)域及基於免疫受體酪胺酸 之活化基元（ITAM)域。加框之區域為CD79b之拼接變異體 中不存在的CD79b之區域（實例1中所述）。 圖15展示半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體藥物結合物 132799.doc - 394 - 200918089 (ADC)之圖示，其中藥物部分連接於輕鏈（LC-ADC)、重鏈 (HC-ADC)及Fc區（Fc-ADC)中之工程化半胱胺酸基團。 圖16展示下列步驟：（i)用還原劑TCEP(鹽酸參（2-羧基乙 基）膦）還原半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體（ThioMab)中之 半胱胺酸二硫化物加合物及鏈間與鏈内二硫鍵；（丨丨）用 dhAA(脫氫抗壞血酸）部分氧化，亦即再氧化以重新形成鏈 間與鏈内二硫鍵；及（⑴）使再氧化抗體與藥物_連接子中間 物結合以形成半胱胺酸抗-CD79b藥物結合物（ADC)。 圖17展示人類化半胱胺酸工程化抗-CD79b抗體（thio-hu2F2.D7-HC-A118C)之（A)輕鏈序列（SEQ ID NO: 86)及（B) 重鏈序列（SEQ ID NO: 85)，其中重鏈之EU位置118處之丙 胺酸（依序位置丙胺酸118 ; Kabat位置114)變為半胱胺酸。 藥物部分可連接於重鏈中之工程化半胱胺酸基團。在各圖 中’改變之胺基酸以粗體文字、加雙下劃線顯示。加單下 劃線指示恆定區。可變區為未加下劃線之區域。Fc區係以 斜體標識。”Thio"係指半胱胺酸工程化抗體，而"hu"係指 人類化抗體。 圖18展示半胱胺酸工程化抗—⑶？％抗體（Thio-hu2F2.D7-LC-V205C)之（A)輕鏈序列（SEq m N〇: 88)及⑻重鏈序列 (SEQ ID NO: 87)，其中輕鏈之Kabat位置205處之纈胺酸 (依序位置纈胺酸210)變為半胱胺酸。重鏈之EU位置6處之 胺基酸D(圖中為陰影）可或者為e。藥物部分可連接於重鏈 中之工程化半胱胺酸基團。在各圖中，改變之胺基酸以粗 體文子、加雙下劃線顯示。加單下劃線指示丨互定區。可變 132799.doc - 395 - 200918089 區為未加下劃線之區域。Fc區係以斜體標識。"Thio"係指 半胱胺酸工程化抗體。 圖19為關於BJAB-螢光素酶異種移植模型中活體内腫瘤 生長之抑制之圖，該圖顯示向具有人類B細胞腫瘤之SCID 小鼠投與抗-CD79b抗體（(a)ch2F2-SMCC_DMl，藥物負荷 為約3(表7);及（b)hu2F2.D7-SMCC-DMl，藥物負荷為約 2.3(表7))顯著抑制腫瘤生長。對照組包括HERCEPTIN® (曲妥珠單抗）-SMCC-DMl(抗-HER2-SMCC-DM1)。"hu"係 指人類化抗體且”ch”係指嵌合抗體。 圖20A為關於Granta-519(人類套細胞淋巴瘤）異種移植模 型中活體内腫瘤生長之抑制之圖，該圖顯示向具有人類B 細胞腫瘤之SCID小鼠投與抗-CD79b抗體（hu2F2.D7-SMCC-DM1，藥物負荷為約2.8(表8))顯著抑制腫瘤生長。對照組 包括 HERCEPTIN®(曲妥珠單抗）-SMCC-DMl(抗-HER2-SMCC-DM1)。圖20B為關於來自Granta-519異種移植研究 (圖20A及表8)之小鼠之重量變化百分比的圖，其顯示在研 究之頭7天期間重量無顯著變化。”hu”係指人類化抗體。 132799.doc 396- 200918089 序列表 <110>美商建南德克公司 <120>人類化之抗-CD79B抗體及免疫結合物及使用方法 <130> P5112R1 <140> 097126862 <141> 2008-07^15 <150> US 60/950,088 <151> 2007-07-16 <160> 122 <210〉 1 <211> 1270 <212> DNA <213>智人 <400> 1 caggggacag gctgcagccg gtgcagttac acgttttcct ccaaggagcc 50 tcggacgttg tcacgggttt ggggtcgggg acagagcagt gaccatggcc 100 aggctggcgt tgtctcctgt gcccagccac tggatggtgg cgttgctgct 150 gctgctctca gctgagccag taccagcagc cagatcggag gaccggtacc 200 ggaatcccaa aggtagtgct tgttcgcgga tctggcagag cccacgtttc 250 atagccagga aacggggctt cacggtgaaa atgcactgct acatgaacag 300 cgcctccggc aatgtgagct ggctctggaa gcaggagatg gacgagaatc 350 cccagcagct gaagctggaa aagggccgca tggaagagtc ccagaacgaa 400 tctctcgcca ccctcaccat ccaaggcatc cggtttgagg acaatggcat 450 ctacttctgt cagcagaagt gcaacaacac ctcggaggtc taccagggct 500 gcggcacaga gctgcgagtc atgggattca gcaccttggc acagctgaag 550 cagaggaaca cgctgaagga tggtatcatc atgatccaga cgctgctgat 600 catcctcttc atcatcgtgc ctatcttcct gctgctggac aaggatgaca 650 gcaaggctgg catggaggaa gatcacacct acgagggcct ggacattgac 700 cagacagcca cctatgagga catagtgacg ctgcggacag gggaagtgaa 750 gtggtctgta ggtgagcacc caggccagga gtgagagcca ggtcgcccca 800 tgacctgggt gcaggctccc tggcctcagt gactgcttcg gagctgcctg 850 gctcatggcc caaccccttt cctggacccc ccagctggcc tctgaagctg 900 gcccaccaga gctgccattt gtctccagcc cctggtcccc agctcttgcc 950 132799-序列表.doc 200918089 aaagggcctg gagtagaagg acaacagggc agcaacttgg agggagttct 1000 ctggggatgg acgggaccca gccttctggg ggtgctatga ggtgatccgt 1050 ccccacacat gggatggggg aggcagagac tggtccagag cccgcaaatg 1100 gactcggagc cgagggcctc ccagcagagc ttgggaaggg ccatggaccc 1150 aactgggccc cagaagagcc acaggaacat cattcctctc ccgcaaccac 1200 tcccacccca gggaggccct ggcctccagt gccttccccc gtggaataaa 1250 cggtgtgtcc tgagaaacca 1270 <210> 2 <211> 229 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 2
Met Ala Arg Leu Ala Leu Ser Pro Val Pro Ser His Trp Met Val 15 10 15
Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ala Glu Pro Val Pro Ala Ala Arg 20 25 30
Ser Glu Asp Arg Tyr Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser Arg 35 40 45 lie Trp Gin Ser Pro Arg Phe lie Ala Arg Lys Arg Gly Phe Thr 50 55 60
Val Lys Met His Cys Tyr Met Asn Ser Ala Ser Gly Asn Val Ser 05 70 75
Trp Leu Trp Lys Gin Glu Met Asp Glu Asn Pro Gin Gin Leu Lys 80 85 90
Leu Glu Lys Gly Arg Met Glu Glu Ser Gin Asn Glu Ser Leu Ala 95 100 105
Thr Leu Thr lie Gin Gly lie Arg Phe Glu Asp Asn Gly lie Tyr 110 115 120
Phe Cys Gin Gin Lys Cys Asn Asn Thr Ser Glu Val Tyr Gin Gly 125 130 135
Cys Gly Thr Glu Leu Arg Val Met Gly Phe Ser Thr Leu Ala Gin 140 145 150
Leu Lys Gin Arg Asn Thr Leu Lys Asp Gly lie lie Met lie Gin 155 160 165
Thr Leu Leu lie lie Leu Phe lie lie Val Pro lie Phe Leu Leu 170 175 180
Leu Asp Lys Asp Asp Ser Lys Ala Gly Met Glu Glu Asp His Thr 185 190 195
Tyr Glu Gly Leu Asp lie Asp Gin Thr Ala Thr Tyr Glu Asp lie -2- 132799-序列表.doc 200918089 200 205 210
Val Thr Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu His 215 220 225
Pro Gly Gin Glu <210> 3 <211> 657 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>嵌合2F2抗體-輕鏈 <400> 3 ccattggaca 50 gatagtgatg 100 gtctccagag 150 ctgacaggtt 200 agcagagtgg 250 acattttccg 300 ctgtggctgc 350 aaatctggaa 400 agaggccaaa 450 cccaggagag 500 agcagcaccc 550 cgcctgcgaa 600 tcaacagggg 650
Ser Val Thr lie 15 Gin Ser Leu Leu 30 gatatcgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta accagcctcc atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gaaagacata tttgaattgg ttattacaga ggccaggcca cgcctaattt atctggtgtc taaactggat tctggagtcc cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc aggctgagga tttgggagtt tattgttgct ggcaaggtac tacacgttcg gagggggtac caaggtggag atcaaacgaa accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg ctgcttctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta \— gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct agagtgt 657 <210> 4 <211> 219 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>嵌合2F2抗體-輕鏈 <400> 4
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu 1 5 10
Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser 20 25 132799-序列表.doc 200918089
Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro 35 40 45
Gly Gin Ser Pro Glu Arg Leu lie Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp 50 55 60
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75
Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val 80 85 90
Tyr Cys Cys Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 95 100 105
Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val 110 115 120
Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala 125 130 135 f Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys ’140 145 150
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 155 160 165
Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 170 175 180
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 185 190 195
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val 200 205 210
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215 <210> 5 , <211> 1329
C <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>嵌合2F2抗體-重鏈 <400> 5 caggttcaac tccagcaacc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc 50 agtgaagctg tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga 100 tgaactgggt gaagcagagg cctggacaag gccttgaatg gattggtatg 150 attgatcctt cagacagtga aactcactac aatcatatct tcaaggacaa 200 ggccactttg actgtagaca aatcctccag cacagcctac ttgcagctca 250 gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaaatctc 300 tacttgtggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctccttag cctccaccaa 350 -4- 132799·序列表.doc 200918089 gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 400 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 450 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc 500 ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgactg 550 tgccctctag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 600 aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga 650 caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 700 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 750 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc 800 tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca 850 agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc 900 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg 950 caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 1000 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1050 cgggaagaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg 1100 ct tctatccc agcgacatcg ccgiggagtg ggagagcaat gggcagccgg 1150 agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctcct tc 1200 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa 1250 cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 1300 agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa 1329 ^ <210> 6 <211〉 442 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> Chimeric 2F2 Antibody - Heavy Chain <400〉 6
Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 15 10 15 A]a Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser G】y 丁yr 丁hr Phe Thr 20 25 30
Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45
Glu Trp lie Gly Met lie Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr 50 55 60 132799-序列表.doc 200918089
Asn His lie Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser 65 70 75
Ser Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp 80 85 90
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Tyr Leu Trp Gly Gin 95 100 105
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Leu Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 110 115 120
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 125 130 135
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 140 145 150
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 155 160 165
Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 170 175 180
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie 185 190 195
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 200 205 210
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 215 220 225
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys 320 325 330
Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 335 340 345
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser 350 355 360 132799-序列表.doc 200918089
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val 365 370 375
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 380 385 390
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 395 400 405
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 410 415 420
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 425 430 435
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 440
<210> 7 <211> 231 <212> PRT f <213>智人 \ <400> 7
Met A!s A.rg Leu A.ls Leu Scr Pro Vsl Ser Scr His Trp Lsu Vsl 1 5 10 15
Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala Glu Pro Val Pro Ala Ala 20 25 30
Lys Ser Glu Asp Leu Tyr Pro Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser 35 40 45
Arg lie Trp Gin Ser Pro Arg Phe lie Ala Arg Lys Arg Gly Phe 50 55 60
Thr Val Lys Met His Cys Tyr Val Thr Asn Ser Thr Phe Ser lie 65 70 75
Val Ser Trp Leu Arg Lys Arg Glu Thr Asp Lys Glu Pro Gin Gin 80 85 90
Val Asn Leu Glu Gin Gly His Met His Gin Thr Gin Asn Ser Ser 95 100 105
Val Thr Thr Leu lie lie Gin Asp lie Arg Phe Glu Asp Asn Gly 110 115 120 lie Tyr Phe Cys Gin Gin Glu Cys Ser Lys Thr Ser Glu Val Tyr 125 130 135
Arg Gly Cys Gly Thr Glu Leu Arg Val Met Gly Phe Ser Thr Leu 140 145 150
Ala Gin Leu Lys Gin Arg Asn Thr Leu Lys Asp Gly lie lie Met 155 160 165 lie Gin Thr Leu Leu lie lie Leu Phe lie lie Val Pro lie Phe 170 175 180
Leu Leu Leu Asp Lys Asp Asp Ser Lys Ala Gly Met Glu Ala Asp 132799-序列表.doc 200918089 185 190 195
His Thr Tyr Glu Gly Leu Asp lie Asp Gin Thr Ala Thr Tyr Glu 200 205 210
Asp lie Val Thr Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly 215 220 225
Glu His Pro Gly Gin Glu 230 <210> 8 <211> 228 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 8
Met Ala Thr Leu Val Leu Ser Ser Met Pro Cys His Trp Leu Leu 15 10 15
Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ser Gly Glu Pro Val Pro Ala Met Thr 20 25 30
Ser Ser Asp Leu Pro Leu Asn Phe Gin Gly Ser Pro Cys Ser Gin 35 40 45 lie Trp Gin His Pro Arg Phe Ala Ala Lys Lys Arg Ser Ser Met 50 55 60
Val Lys Phe His Cys Tyr Thr Asn His Ser Gly Ala Leu Thr Trp 65 70 75
Phe Arg Lys Arg Gly Ser Gin Gin Pro Gin Glu Leu Val Ser Glu 80 85 90
Glu Gly Arg lie Val Gin Thr Gin Asn Gly Ser Val Tyr Thr Leu 95 100 105
Thr He Gin Asn lie Gin Tyr Glu Asp Asn Gly lie Tyr Phe Cys 110 115 120 g '
Lys Gin Lys Cys Asp Ser Ala Asn His Asn Val Thr Asp Ser Cys 125 130 135
Gly Thr Glu Leu Leu Val Leu Gly Phe Ser Thr Leu Asp Gin Leu 140 145 150
Lys Arg Arg Asn Thr Leu Lys Asp Gly lie lie Leu He Gin Thr 155 160 165
Leu Leu lie lie Leu Phe lie lie Val Pro lie Phe Leu Leu Leu 170 175 180
Asp Lys Asp Asp Gly Lys Ala Gly Met Glu Glu Asp His Thr Tyr 185 190 195
Glu Gly Leu Asn lie Asp Gin Thr Ala Thr Tyr Glu Asp lie Val 200 205 210
Thr Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu His Pro 215 220 225 132799-序列表.doc 200918089
Gly Gin Glu <210> 9 <211> 108 <212> PRT <213>智人 <400> 9
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser 20 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45
Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75
Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90
Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 lie Lys Arg <210> 10 <211> 113 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>嵌合hu2F2之輕鏈之可變域 <400> 10
Asp He Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr lie 15 10 15
Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu 20 25 30
Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro 35 40 45
Gly Gin Ser Pro Glu Arg Leu lie Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp 50 55 60
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75
Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val 80 85 90 132799-序列表.doc 200918089
Tyr Tyr Cys Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 95 100 105
Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 110 <210> 11 <211〉 113 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類化抗體接枝物（hu2F2接枝物）之輕鏈之可變域 <400> 11
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu 20 25 30 f Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 40 45
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp 50 55 60
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75
Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr 80 85 90
Tyr Tyr Cys Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gin 95 100 105
Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 110 <210> 12 4 <211> 113
I <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類化抗體（hu2F2.D7)之輕鏈之可變域 <400> 12
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu 20 25 30
Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 40 45
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp 50 55 60
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp -10- 132799-序列表.doc 200918089 65 70 75
Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr 80 85 90
Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gin 95 100 105
Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 110 <210〉 13 <211> 113 <212> PRT <213>智人 <400> 13
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser f ' 20 25 30 \
Ser 丁yr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Val Ser Val lie Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr 50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser 65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 95 100 105
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 、<210〉 14 <211> 113 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>嵌合2F2之重鏈之可變域 <400> 14
Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30
Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45
Glu Trp lie Gly Met lie Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr 50 55 60 -11 - 132799·序列表.doc 200918089
Asn His lie Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser 65 70 75
Ser Ser Thr Ala Tyr Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp 80 85 90
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Tyr Leu Trp Gly Gin 95 100 105
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Leu 110 <210> 15 <211> 113 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類化抗體接枝物（hu2F2接枝物）之重鏈之可變域 f <400> 15 Ί. ' Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30
Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Val Gly Met lie Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr 50 55 60
Asn His lie Phe Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Tyr Leu Trp Gly Gin v 95 100 105
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 <210> 16 <211> 113 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類化抗體（hu2F2.D7)之重鏈之可變域 <400> 16
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 -12- 132799-序列表.doc 200918089
Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Val Gly Met lie Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr 50 55 60
Asn His lie Phe Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75
Lys Asn Thr Ala 丁yr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Tyr Leu Trp Gly Gin 95 100 105
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110
<210> Π <211> 8 <212> PRT f <213>人工序列 % <220> <223〉人類化抗體變異體(hu2F2接枝物）之HVR_L3(部分） <400> 17
Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Tyr 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類化抗體變異體(HVR-L3突變） <400〉 18
Phe Gin Gly Thr His Phe Pro Phe 5 <210> 19 <211> 23 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>人類化抗體變異體（hu2F2.D7)之FR1-LC <400> 19
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 20 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 -13 - 132799-序列表.doc 200918089 <220> <223>人類化抗體變異體（hu2F2.D7)之FR2-LC <400> 20
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr 15 10 15 <210> 21 <211> 32 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人類化抗體變異體（hu2F2.D7)之FR3-LC <400> 21
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 15 10 15
Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 20 25 30
Tyr Cys
<210〉 22 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類化抗體變異體(hu2F2.D7)之FR4-LC <400> 22
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 5 10 1 <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>人類化抗體變異體(hu2F2. D7)之HVR1-LC <400> 23
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu 15 10 15
Asn <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>人類化抗體變異體（hu2F2,D7)之HVR2-LC -14- 132799-序列表.doc 200918089 <400> 24
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類化抗體變異體（hu2F2.D7)之HVR3-LC <400> 25
Phe Gin Gly Thr His Phe Pro Phe Thr 5 <210> 26 <211> 106 <212> PRT <213>人工序列 (<220>
' <223>人類化抗體變異體（hu2F2,D7)之CL1-LC <400> 26
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 20 25 30
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala 35 40 45
Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser 50 55 60
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 65 70 75 蠢 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His I / 80 85 90
Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 95 100 105
Cys <210> 27 <211> 25 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類化抗體變異體（hu2F2.D7)之FR卜HC <400> 27
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 -15 - 132799-序列表.doc 200918089
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210〉 28 <211> 13 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類化抗體變異體（hu2F2,D7)之叩2-HC <400> 28
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu GIu Trp Val 5 10 <210> 29 <211> 30 <212> PRT <213>人工序列 <220> f <223>人類化抗體變異體(hu2F2.D7)之FR3-HC <400〉 29
Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 15 10 15
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30
<210> 30 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類化抗體變異體(hu2F2,D7)之FR4-HC <400> 30 $
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉人類化抗體變異體（hu2F2.D7)之HVR1-HC <400〉 3]
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn 5 10 <210> 32 <211〉 18 <212〉 PRT <213>人工序列 <220>
<223>人類化抗體變異韹（hu2F2. D7)之HVR2-HC -16- 132799-序列表.doc 200918089 <400> 32
Gly Met lie Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn His lie 15 10 15
Phe Lys Asp <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類化抗體變異體（hu2F2.D7)之HVR3-HC <400> 33
Ala Arg Asn Leu Tyr Leu 5 <210> 34 f <211> 108
! <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類化抗體變異體（hu2F2.D7)之HC的CHI <400> 34
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 15 10 15
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 20 25 30
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 35 40 45
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser 50 55 60 I? . \ Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser ' 65 70 75
Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 80 85 90
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 95 100 105
Thr His Thr <210> 35 <211> 221 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人類化抗體變異體（hu2F2.D7)之HC的Fc -17- 132799-序列表.doc 200918089 <400> 35
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 15 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg 20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 35 40 45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 50 55 60
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 80 85 90
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 95 100 105 f. ' Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 110 115 120
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 125 130 135
Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 140 145 150
Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn 155 160 165
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 170 175 180
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 185 190 195
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His I 200 205 210
Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 215 220 <210> 36 <211> 87 <212> PRT <213>智人 <400> 36
Gin Val ϋΐη Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg 35 40 45 -18 - 132799-序列表.doc 200918089
Val Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 50 55 60
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 65 70 75
Arg Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80 85 <210> 37 <211> 81 <212> PRT <213>智人 <400> 37
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30 f Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr lie Thr Ala Asp X 35 40 45
Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gin Gly Thr 65 70 75
Leu Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 38 <211> 80 <212> PRT <213>智人 <400〉 38
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 15 10 15 i'.
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30
Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr He Thr Ala Asp 35 40 45
Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gin Gly Thr I.eu 65 70 75
Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 39 <211> 79 <212> PRT <213>智人 -19- 132799-序列表.doc 200918089 <400> 39
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30
Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Arg Val Thr lie Thr Ala Asp 35 40 45
Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 65 70 75
Thr Val Ser Ser <210> 40 ί <211> 87
I <212> PRT <213>智人 <400> 40
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15
Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser 20 25 30
Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly Arg 35 40 45
Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys 50 55 60
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 65 70 75 ( Arg Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser ^ 80 85 <210> 41 <211> 81 <212> PRT <213>智人 <400> 41
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 15 10 15
Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp lie Arg Gin Pro 20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Arg Val Thr lie Ser Val Asp 35 40 45
Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala 50 55 60 -20- 132799-序列表.doc 200918089
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gin Gly Thr 65 70 75
Leu Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 42 <211> 80 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 42
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 15 10 15
Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp lie Arg Gin Pro 20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Arg Val Thr lie Ser Val Asp 35 40 45
Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala 50 55 60
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gin Gly Thr Leu 65 70 75
Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 43 <211> 79 <212> PRT <213>智人 <400> 43
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 15 10 15
Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp lie Arg Gin Pro 20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Arg Val Thr lie Ser Val Asp 35 40 45
Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala 50 55 60
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 65 70 75
Thr Val Ser Ser <210> 44 <211> 87 <212> PRT <213〉智人 <400> 44 -21 - 132799·序列表.doc 200918089
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Scr Cys Ala Ala Scr Gly rhe Thr Phe Ser 20 25 30
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg 35 40 45
Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 50 55 60
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 65 70 75
Arg Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80 85 <210> 45 <211> 81 <212> PRT f <213>智人 <400〉 45
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp 35 40 45
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gin Gly Thr 65 70 75
Leu Val Thr Val Ser Ser , 80 <210> 46 <211> 80 <212> PRT <213〉智人 <400> 46
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala ,Ser Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp 35 40 45
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gin Gly Thr Leu •22- 132799-序列表.doc 200918089 65 70 75
Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 47 <211> 79 <212> PRT <213>智人 <400> 47
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp 35 40 45
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 65 70 75
Thr Val Ser Ser <210> 48 <211> 87 <212> PRT <213〉智人 <40ϋ> 48
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys 20 25 30
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg 35 40 45
Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin 50 55 60
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser 65 70 75
Arg Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80 85 <210> 49 <211> 81 <212〉 PRT <213>智人 <400> 49
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 -23- 132799-序列表.doc 200918089
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp 35 40 45
Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gin Gly Thr 65 70 75
Leu Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 50 <211> 80 <212> PRT <213>智人 f <400> 50 气Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp 35 40 45
Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60
Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ser Trp Gly Gin Gly Thr Leu 65 70 75
Val Thr Val Ser Ser 80 , <210> 51 1 <211> 87 <212> PRT <213>智人 <400> 51
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys 20 25 30
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg 35 40 45
Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin 50 55 60
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 65 70 75 -24- 132799-序列表.doc 200918089
Arg Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80 85 <210> 52 <211> 81 <212> PRT <213〉智人 <400> 52
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp 35 40 45
Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gin Gly Thr 65 70 75
Leu Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 53 <211> 80 <212> PRT <213>智人 <400> 53
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp 35 40 45
Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gin Gly Thr Leu 65 70 75
Val Thr Val Ser Ser BO <210〉 54 <211> 79 <212> PRT <213>智人 <400> 54
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala -25· 132799-序列表.doc 200918089 20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp 35 40 45
Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 65 70 75
Thr Val Ser Ser <210> 55 <211> 80 <212> PRT <213>智人 <400> 55
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val /15 10 15 '1
Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 20 25 30
Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu 50 55 60
Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gly Gin Gly Thr 65 70 75
Lys Val Glu lie Lys 80
<210> 56 <211> 80 <212> PRT I <213>智人 <400> 56
Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 15 10 15
Gly Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly 20 25 30
Gin Ser Pro Gin Leu Leu lie Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val 50 55 60
Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gin Gly Thr 65 70 75
Lys Val Glu lie Lys 80 -26- 132799-序列表.doc 200918089 <210> 57 <211> 80 <212> PRT <213>智人 <400> 57
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro 15 10 15
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 20 25 30
Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie Tyr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu 50 55 60
Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gin Gly Thr 65 70 75
Lys Val Glu lie Lys 80 <210> 58 <211> 80 <212> PRT <213>智人 <400> 58
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu 15 10 15
Uly Glu Arg Ala Thr Jle Asn Cys Trp Tyr Gin Uln Lys Pro Gly 20 25 30
Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu 50 55 60
Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gin Gly Thr 65 70 75
Lys Val Glu lie Lys 80 <210〉 59 <211> 16 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> hu2F2接枝物之HVR卜LC <400〉 59
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu 15 10 15 -27- 132799-序列表.doc 200918089
Asn <210> 60 <211〉 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> hu2F2 接枝物之 HVR2-LC <400〉 60
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 5 <210〉 61 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> f <223> hu2F2 接枝物之 HVR3-LC <400〉 61
Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr 5 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> hu2F2 接枝物之 HVR1-HC <400> 62
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn 5 10 <210〉 63 ξ <211> 18 1 · <212> PRT ^ <213>人工序列 <220> <223> hu2F2 接枝物之 HVR2-HC <400> 63
Gly Met lie Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn His lie 15 10 15
Phe Lys Asp <210> 64 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223> hu2F2 接枝物之 HVR3-HC 28- 132799-序列表.doc 200918089 <400> 64
Ala Arg Asn Leu Tyr Leu 5 <210> 65 <211> 23 <212> PRT <213〉智人 <400> 65
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 20 <210> 66 <211> 15 <212〉 PRT <213〉智人 r <400> 66
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr 15 10 15 <210> 67 <211> 32 <212> PRT <213〉智人 <400> 67
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 15 10 15
Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 20 25 30
Tyr Cys i <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213>智人 <400> 68
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 5 10 <210> 69 <211> 25 <212> PRT <213>智人 <400> 69
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 -29- 132799·序列表.doc 200918089 <210> 70 <211> 13 <212> PRT <213〉智人 <400> 70
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10 <210> 71 <211> 30 <212> PRT <213〉智人 <400> 71
Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 15 10 15 r
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213>智人 <400> 72
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 73 <211> 30 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉人類化抗體變異體之FR3-HC複合物 <220> ^ <221> Misc-feature ^ ； <222> 6 <223〉Xaa=A 或 R <220> <221> Misc-feature <222〉 8 <223> Xaa=T 或 N <220> <221〉 Misc-feature <222> 13 <223〉 Xaa=A 或 L <400> 73
Arg Phe Thr lie Ser Xaa Asp Xaa Ser Lys Asn Thr Xaa Tyr Leu 15 10 15
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 -30- 132799-序列表.doc 200918089 <210> 74 <211> 31 <212〉 PRT <213>智人 <400〉 74
Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 15 10 15
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30
Ala <210> 75 <211> 32 <212> PRT <213>智人 <400> 75 f Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 1 5 10 15
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30
Ala Arg <210> 76 <211> 31 <212> PRT <213>智人 <400> 76
Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ser <210> 77 <211> 32 <212> PRT <213>智人 <400> 77
Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 15 10 15
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30
Ser Arg <210> 78 -31 - 132799-序列表.doc 200918089 <211> 16 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>含有抗原決定基之肽 <400〉 78
Ala Arg Ser Glu Asp Arg Tyr Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys 15 10 15
Lys
<210> 79 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉人類化抗體變異體（hu2F2,D7)之HVR-L3 <400> 79
Phe Gin Gly Thr His Phe Pro Phe Thr 5
<210> 80 <211> 30 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉白蛋白結合肽 <4ϋϋ> 8ϋ
Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Ser Gin Arg Leu Met Glu 15 10 15
Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp Phe 20 25 30 <210> 81 <211> 20 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>白蛋白結合肽 <400> 81
Gin Arg Leu Met Glu Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu 15 10 15
Trp Glu Asp Asp Phe 20 <210> 82 <211> 20 <212> PRT <213>人工序列 -32- 132799-序列表.doc 200918089 <220> <223〉白蛋白結合肽 <400> 82
Gin Arg Leu lie Glu Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu 15 10 15 丁rp Glu Asp Asp Phe 20 <210〉 83 <211> 18 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223>白蛋白結合肽 <400> 83
Arg Leu lie Glu Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 15 10 15
Glu Asp Asp <210> 84 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>白蛋白結合肽 <400> 84
Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 5 10 <210> 85 <211> 442 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223> Thio 抗-CD79b (hu2F2.D7)-HC(A118C)變異體-HC <400> 85
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30
Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Val Gly Met lie Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr 50 55 60
Asn His lie Phe Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 -33- 132799-序列表.doc 200918089
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Tyr Leu Trp Gly Gin 95 100 105
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Cys Ser Thr Lys Gly Pro Ser 110 115 120
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 125 130 135
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 140 145 150
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 155 160 165
Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 170 175 180 f Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie % 185 190 195
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 200 205 210
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 215 220 225
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270
Phe Asn Trp 丁yr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 〆 275 280 285
I
Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys 320 325 330
Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 335 340 345
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser 350 355 360
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val 365 370 375
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr -34- 132799·序列表.doc 200918089 380 385 390
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 395 400 405
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 410 415 420
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 425 430 435
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 440 <210> 86 <211> 219 <212> PR丁 <213>人工序列 <220〉
<223〉Thio抗-CD79b (hu2F2,D7)-HC(A118C)變異體-LC f <400> 86
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu 20 25 30
Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 40 45
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp 50 55 60
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75
Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr 80 85 90
Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gin 95 100 105
Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val 110 115 120
Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala 125 130 135
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 140 145 150
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 155 160 165
Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 170 175 180
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 185 190 195 -35 - 132*799-序列表.doc 200918089
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val 200 205 210
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215 <210> 87 <211> 442 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223> Thio 抗-CD79b (hu2F2.D7)-HC(V205C)變異體-HC <400> 87
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30
Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu 丁rp Val Gly Met lie Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr 50 55 60
Asn His lie Phe Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Tyr Leu Trp Gly Gin 95 100 105
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 110 115 120
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 125 130 135
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 140 145 150
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 155 160 165
Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 170 175 180
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie 185 190 195
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 200 205 210
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 215 220 225 -36- 132799-序列表.doc 200918089
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys 320 325 330 f Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 1 335 340 345
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser 350 355 360
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val 365 370 375
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 380 385 390
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 395 400 405
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 410 415 420
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 425 430 435
C
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 440 <210> 88 <211> 219 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> Thio 抗-CD79b (hu2F2,D7)-HC(V205C)變異體-LC <400> 88
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu 20 25 30
Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro -37· 132799-序列表.doc 200918089 35 40 45
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp 50 55 60
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75
Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr 80 85 90
Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gin 95 100 105
Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val 110 115 120
Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala 125 130 135
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys f 140 145 150 \
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 155 160 165
Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 170 175 180
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 185 190 195
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Cys 200 205 210
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215
<210> 89 <211> 219 , <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> hu2F2.D7抗體之輕鏈 <400> 89
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu 20 25 30
Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 40 45
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp 50 55 60
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75 -38- 132799-序列表.doc 200918089
Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr 80 85 90
Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gin 95 100 105
Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val 110 115 120
Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala 125 130 135
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 140 145 150
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 155 160 165
Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 170 175 180
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 185 190 195
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val 200 205 210
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215 <210> 90 <211> 442 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223> hu2F2.D7抗體之重鏈 <400> 90
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30
Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp Val Gly Met lie Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr 50 55 60
Asn His lie Phe Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Tyr Leu Trp Gly Gin 95 100 105 -39- 132799·序列表.doc 200918089
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 110 115 120
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 125 130 135
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 140 145 150
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 155 160 165
Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 170 175 180
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie 185 190 195
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 200 205 210 f Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys " 215 220 225
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr , 305 310 315 $ \
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys 320 325 330
Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 335 340 345
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser 350 355 360
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val 365 370 375
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 380 385 390
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 395 400 405
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser -40- 132799-序列表.doc 200918089 410 415 420
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 425 430 435
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 440 <210> 91 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉Thio_hu2F2-HC-變異體 <400> 91
Glu Val Gin Leu Cys Glu Ser Gly Gly Gly 5 10 <210> 92 /" <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉Thio-hu2F2-HC-變異體 <400〉 92
Leu Arg Leu Ser Cys Cys Ala Ser Gly Tyr Thr 5 10 <210> 93 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> Thio抗-CD79b (ch2F2)-HC-變異體 <400> 93 \ Met Asn Ser Leu Arg Cys Glu Asp Thr Ala Val 5 10 <210> 94 <211> 11 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223> Thio-hu2F2-LC-變異體 <400> 94
Thr Leu Val Thr Val Cys Ser Ala Ser Thr Lys 5 10 <210> 95 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 -41 - 132799·序列表.doc 200918089 <220> <223> Thio-hu2F2-HC-變異體 <400> 95
Val Thr Val Ser Ser Cys Ser Thr Lys Gly Pro 5 10 <210> 96 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223> Thio 抗-hu2F2-HC·變異體 <400> 96
Val Ser Ser Ala Ser Cys Lys Gly Pro Ser Val 5 10 <210> 97 <211> 11 f <212> PRT 1 <213>人工序列 <220〉 <223> Thio-hu2F2-HC-變異趙 <400> 97
Lys Phe Asn Trp Tyr Cys Asp Gly Val Glu Val 5 10 <210> 98 <211> 11 <212> PRT <2i3>人工序列 <220> <223> Thio-hu2F2-HC-變異體 <400> 98
Lys Gly Phe Tyr Pro Cys Asp lie Ala Val Glu 5 10 <210> 99 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> Thio-hu2F2-HC-變異體 <400> 99
Pro Pro Val Leu Asp Cys Asp Gly Ser Phe Phe 5 10 <210> 100 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 •42 132799-序列表.doc 200918089 <223>Thio-抗-CD79b (ch2F2)-HC-變異體 <400> 100
Gin Val Gin Leu Cys Gin Pro Gly Ala Glu 5 10 <210> 101 <211> 11 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223> Thio-抗-CD79b (ch2F2)-HC-變異體 <400> 101
Val Lys Leu Ser Cys Cys Ala Ser Gly Tyr Thr 5 10
<210〉 102 <211〉 11 <212> PRT / <213>人工序列 \ <220> <223〉Thio·抗-CD79b (ch2F2)-HC-變異體 <400> 102
Leu Ser Ser Leu Thr Cys Glu Asp Ser Ala Val 5 10 <210> 103 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> Thio-抗-CD79b (ch2F2)-HC-變異體 <400> 103
Thr Ser Val Thr Val Cys Leu Ala Ser Thr Lys 5 10 <210> 104 <211> 11 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223> Thio-抗-CD79b (ch2F2)-HC-變異體 <400> 104
Val Thr Val Ser Ser Cys Ser Thr Lys Gly Pro 5 10 <210> 105 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>Thio-抗-CD79b (ch2F2)-HC-變異體 •43 · 132799-序列表.doc 200918089 <400〉 105
Val Ser Ser Ala Ser Cys Lys Gly Pro Ser Val 5 10 <210> 106 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> Thio-抗-CD79b (ch2F2)-HC-變異體 <400> 106
Lys Phe Asn Trp Tyr Cys Asp Gly Val Glu Val 5 10 <210> 107 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉Thio-抗-CD79b (ch2F2)-HC-變異體 <400> 107
Lys Gly Phe Tyr Pro Cys Asp lie Ala Val Glu 5 10 <210> 108 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> Thio-抗-CD79b (ch2F2)-HC-變異體 <400〉 108
Pro Pro Val Leu Asp Cys Asp Gly Ser Phe Phe 5 10 f ： <210> 109 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> Thio-hu2F2-LC-變異體 <400> 109
Ser Leu Ser Ala Ser Cys Gly Asp Arg Val Thr 5 10 <2io> no <211〉 11 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223> Thio-hu2F2-LC-變異體 -44 132799-序列表.doc 200918089 <400> 110
Glu lie Lys Arg Thr Cys Ala Ala Pro Ser Val 5 10 <210> 111 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> Thio-hu2F2-LC-變異體 <400> 111
Thr Val Ala Ala Pro Cys Val Phe lie Phe Pro 5 10 <210> 112 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 f <220> A <223> Thio-hu2F2-LC-變異體 <400> 112
Phe lie Phe Pro Pro Cys Asp Glu Gin Leu Lys 5 10 <210> 113 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> Thio-hu2F2-LC-變異體 <400> 113
Asp Glu Gin Leu Lys Cys Gly Thr Ala Ser Val 5 10 <210> 114 { <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> Thio-hu2F2-LC·變異體 <400> 114
Val Thr Glu Gin Asp Cys Lys Asp Ser Thr Tyr 5 10 <210> 115 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> Thio-hu2F2-LC-變異體 <400> 115 -45 132799-序列表.doc 200918089 Gly Leu Ser Ser Pro Cys Thr Lys Ser Phe Asn 5 10 <210> 116 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>Thio-抗-CD79b (ch2F2)-LC-變異體 <400> 116 Thr Leu Ser Val Thr Cys Gly Gin Pro Ala Ser 5 10 <210> 117 <211> 11 <212> PRT <213〉人工序列 f \ <220> <223> Thio-抗-CD79b (ch2F2)-LC-變異體 <400> 117 Glu lie Lys Arg Thr Cys Ala Ala Pro Ser Val 5 10 <210> 118 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>Thio-抗-CD79b (ch2F2)-LC·變異體 <400> 118 Thr Val Ala Ala Pro Cys Val Phe lie Phe Pro 5 10 <210> 119 <211> 11 t <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉Thio-抗-CD79b (ch2F2)-LC·變異體 <400> 119 Phe He Phe Pro Pro Cys Asp Glu Gin Leu Lys 5 10 <210> 120 <211> 11 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>Thio-抗-CD79b (ch2F2)-LC-變異體 <400> 120 Asp Glu Gin Leu Lys Cys Gly Thr Ala Ser Val 132799-序列表.doc -46- 10 200918089 <210〉 121 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223> Thio-抗-CD79b (ch2F2)-LC-變異體 <400> 121
Val Thr Glu Gin Asp Cys Lys Asp Ser Thr Tyr 5 10 <210> 122 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> Thio-抗-CD79b (2chF2hLC·變異體 <400> 122
Gly Leu Ser Ser Pro Cys Thr Lys Ser Phe Asn 5 10 -47 132799-序列表.doc

Claims (1)

  1. 200918089 十、申請專利範圍： 1. 一種抗-CD79b抗體，其包含： (a) 至少一個選自由下列者組成之群的HVR序列： ⑴包含序列A1-A16之HVR-L1 ，其中A1-A16為 KSSQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO: 59)； (ii) 包含序列B1-B7之HVR-L2 ，其中B1-B7為 LVSKLDS(SEQ ID NO: 60)； (iii) 包含序列C1-C9之HVR-L3 ，其中C1-C9為 (' WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 61)； (iv) 包含序列m-D10之HVR-H1 ，其中D1-D10為 GYTFTSYWMN (SEQ ID NO: 62)； (v) 包含序列E1-E18之HVR-H2，其中E1-E18為 GMIDPSDSETHYNHIFKD (SEQ ID NO: 63)； (vi) 包含序列 F1-F6 之 HVR-H3，其中 F1-F6 為 ARNLYL (SEQ ID NO: 64);及 (b) 至少一個變異HVR，其中該變異HVR包含對SEQ ID 、 :NO: 59、60、61、62、63或64中所示之序列之至少一個 殘基的修飾。 2. 如請求項1之抗體，其中變異HVR-L3中之C1為F。 3. 如請求項1之抗體，其中變異HVR-L3中之C8為F。 4. 如請求項1之抗體，其中該抗體為人類化抗體。 5. 如請求項1之抗體，其中構架序列之至少一部分為人類 一致構架序歹丨】（consensus framework sequence)。 6. 如請求項1之抗體，其中該修飾為取代、插入或缺失。 132799.doc 200918089 7. 如請求項1之抗體，其中HVR-L3變異體包含以下位置之 任一者處的1個取代：C1(F)及C8(F)。 8. 如請求項1之抗體，其包含具有SEQ ID NO: 59之序列的 HVR-L1。 9. 如請求項1之抗體，其包含具有SEQ ID NO: 60之序列的 HVR-L2。 10. 如請求項1之抗體，其包含具有SEQ ID NO: 62之序列的 HVR-H1。 ( 11.如請求項1之抗體，其包含具有SEQ ID NO: 63之序列的 HVR-H2。 12. 如請求項1之抗體，其包含具有SEQ ID NO: 64之序列的 HVR-H3。 13. 如請求項1之抗體，其中變異HVR-L3中之C1為F。 14. 如請求項1之抗體，其中變異HVR-L3中之C8為F。 15. —種人類化抗-CD79b抗體，其中該抗體對人類CD79b之 單價親和力大體上與鼠類抗體之單價親和力相同，該鼠 I 類抗體包含如圖7(SEQ ID NO: 10)及圖8A-B(SEQ ID NO: 14)中所示之輕鏈及重鏈可變序列。 16. —種人類化抗-CD79b抗體，其中該抗體對人類CD79b之 單價親和力比鼠類抗體或嵌合抗體之單價親和力大至少 1、2或3倍，該鼠類抗體或嵌合抗體包含如圖7(SEQ ID NO: 10)及圖8A-B(SEQ ID NO: 14)中所示之輕鏈及重鏈 可變序列。 17. —種人類化抗-CD79b抗體，其中該抗體對人類CD79b之 132799.doc 200918089 單價親和力比鼠類或嵌合抗體之單價親和力低至少丨、2 或3倍，該鼠類或嵌合抗體包含如圖7(seqidn〇: 1〇)及 圖8A-B(SEQ ID NO: 14)中所示之輕鏈及重鏈可變序列。 如明求項13、14或15之人類化抗體，其中該鼠類抗體係 由2006年7月11日以PTA_7712寄存於ATCC之融合瘤細胞 株產生。 19. 一種人類化抗_CD79b抗體’其中二價形式之該抗體對人 類CD79b之親和力大體上與呈二價形式且包含如圖 7(SEQ ID NO: 10)及圖 8A-B(SEQ ID N〇: 14)中所示之輕 鏈及重鏈可變序列之鼠類抗體的親和力相同。 20. —種人類化抗_CD79b抗體，其中二價形式之該抗體對人 類CD79b之親和力比呈二價形式且包含如圖7(SEQ m NO: 10)及圖8A_B(SEQ ID NO: 14)中所示之輕鏈及重鏈 可變序列之鼠類或嵌合抗體的親和力大至少丨、2或3 倍。 21，一種人類化抗-CD79b抗體，其中二價形式之該抗體對人 類CD79b之親和力比呈二價形式且包含如圖7(SEQ m NO: 10)及圖8A-B(SEQ ID NO: 14)中所示之輕鏈及重鏈 可變序列之鼠類或嵌合抗體的親和力低至少丨、2或3 倍。 22. —種人類化抗-CD79b抗體，其中二價形式之該抗體對人 類CD79b之親和力為2.0 nM。 23. 如請求項22之人類化抗-CD79抗體，其中二價形式之該 抗體對人類CD79b之親和力為2.0 nM +/- 〇.53。 132799.doc 200918089 24·如請求項！ 5_23中任一項之抗體，其中該結合親和力係以 Kd值表示。 ' 25. 如請求項13_23中任一項之抗體’其中該結合親和力係藉 由Biacore或放射免疫檢定來量測。 26. 如請求項丨_3中任一項之抗體，其包含人類κ亞群1 一致構 架序列（human κ subgroup 1 consensus framework sequence) ° 27. 如請求項i _3中任一項之抗體，其包含重鏈人類亞群出 一致構架序列（heavy chain human subgroup III consensus framework sequence) ° 28·如請求項27之抗體’其中該構架序列包含位置7丨、73及/ 或7 8處之取代。 29. 如請求項28之抗體，其中該取代為R71A、N73T及/或 L78A。 30. —種人類化抗_CD79b 2F2抗體，其中該人類化抗體在與 細胞毒性劑結合時抑制腫瘤細胞生長。 3 1.如前述請求項之抗體，其中該人類化抗體與嵌合抗體兩 者皆為單價或二價抗體。 32. 如前述請求項之抗體’其中該人類化抗體與嵌合抗體兩 者皆包含連接於Fc區域之單一 Fab區域。 33. —種抗體，其包含含有圖13中所示之hvRI-HC、HVR2-HC及/或HVR3-HC序列（SEQ ID NO: 31-33)之重鍵可變 域。 34. 如請求項33之抗體，其中該可變域包含圖13中所示之 132799.doc 200918089 FRl-HC、FR2-HC、FR3-HC 及 / 或 FR4_hC：序列（SEQ ID NO: 27-30) 〇 35. 如請求項33或34之抗體’其中該抗體包含（SEq id NO: 34及/或35)中所示之(^⑴及/或卜序列。 36. —種抗體’其包含含有圖13中所示之HVR1-LC、HVR2-LC及/或HVR3-LC序列（SEQ ID NO: 23-25)之輕鏈可變 域0 3 7.如請求項36之抗體，其中該可變域包含圖13中所示之 FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC 及/4fR4_lc 序列（SEQ ID NO: 19-22)。 38.如請求項36或37之抗體，其中該抗體包含圖13中所示之 CL1 序列（SEQ ID NO: 26)。 39· —種多肽’其包含圖13中所示之序列（SEq m N〇: 12)。 4〇· 一種多肽’其包含圖13中所示之序列（SEQ ID NO: 16)。 41. 一種抗體’其係藉由以下方法製得： (a) 培養表現包含如請求項33-35中任一項之抗體之重鏈 可變域及如請求項36-38中任一項之抗體之輕鏈可變域的 抗體之細胞；及 (b) 將該抗體自該培養細胞分離。 42. —種抗體，其包含如請求項33_35中任一項之抗體之重鏈 可變域及如請求項3 6-3 8中任一項之抗體之輕鏈可變域。 43. 如睛求項42之抗體，其中該抗體為單價抗體且包含以區 域。 ID NO: 44. 如請求項！之抗體，其中該抗體包含與選自seq 132799.doc 200918089 12之胺基酸序列具有至少90%胺基酸序列一致性的輕鏈 可變域。 45. 如凊求項1之抗體，其中該抗體包含與選自SEQ ID NO: 16之胺基酸序列具有至少90%胺基酸序列—致性的重鏈 可變域。 46. 如清求項1之抗體，其中該抗體包含含有選自SEQ ID NO: 69、70、71及72之一個、兩個、三個或四個構架胺 基酸序列之重鏈可變域。 ' 47·如請求項1之抗體’其中該抗體包含含有選自SEQ ID NO: 65、66、67及68之一個、兩個、三個或四個構架胺 基酸序列之輕鏈可變域。 48. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含含有一個、兩個、 三個或四個與選自SEQ ID NO: 69、70、71及72之胺基酸 具有至少90%胺基酸序列一致性之構架胺基酸序列的重 鏈可變域。 49. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含含有一個、兩個、 S I 三個或四個與選自SEQ ID NO: 65、66、67及68之胺基酸 具有至少90°/。胺基酸序列一致性之構架胺基酸序列的輕 鏈可變域。 50. 如請求項44之抗體，其中該抗體包含與選自SEQ ID NO: 16之胺基酸序列具有至少90%胺基酸序列一致性之重鏈 可變域。 51_如請求項45之抗體，其中該抗體包含與選自SEQ ID NO: 12之胺基酸序列具有至少90%胺基酸序列一致性之輕鏈 132799.doc 200918089 可變域。 52. —種結合於CD79b之抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列具有至少90°/。序列一致性之重鏈可 變域。 53. —種結合於CD79b之抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 12之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之輕鏈可 變域。 54· —種結合於CD79b之抗體’其中該抗體包含與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列具有至少90°/。序列一致性之重鏈可 變域及與SEQ ID NO: 12之胺基酸序列具有至少90%序列 一致性之輕鏈可變域。 55. —種聚核苷酸，其編碼如請求項1、7、42、54或177之 抗體。 56. —種載體，其包含如請求項55之聚核苷酸。 5 7. —種宿主細胞，其包含如請求項56之載體。 5 8. —種製造抗-CD79b抗體之方法’其中該方法包含（a)在適 合於表現編碼該抗體之聚核苷酸的條件下培養選自包含 真核細胞及CHO細胞之群之宿主細胞，及分離該抗 體。 5·9.如請求項1、7、42、54或177之抗體，其中該抗體結合 於來自SEQ ID NO: 2之胺基酸29-39或SEQ ID NO: 78之 胺基酸1-11之CD79b區域内的抗原決定基。 60.如請求項1、7、42、54或177之抗體，其中該CD79b係表 現於細胞之表面上。 I32799.doc 200918089 61. 如請求項6〇之抗體，其中該細胞為b細胞。 62. 如請求項6〇之抗體，其中該b細胞與b細胞增生性病症相 關。 63·如請求項62之抗體，其中該B細胞增生性病症為癌症。 64. 如請求項63之抗體，其中該b細胞增生性病症係選自淋 巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（non_H〇dgkins lymphoma， NHL)、侵襲性NHL、復發的侵襲性NHL、復發的惰性 NHL、難治性NHL、難治的惰性NHL、慢性淋巴細胞性 白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血病、毛細胞 白血病（H C L)、急性淋巴細胞性白血病（A L L)及套細胞淋 巴瘤。 65. 如請求項1、7、42、54或177之抗體，其中該抗體為單 株抗體。 66. 如請求項65之抗體，其中該抗體為選自Fab、Fab，_SH、 Fv、seFv或（Fab’）2片段之抗體片段。 67. 如請求項65之抗體，其中該抗體為人類化抗體。 68. 如請求項i、7、42、54或177之抗體，其中該抗體結合 於與選自ATCC(於2006年7月11曰以PTA-7712寄存）之抗 體及包含SEQ ID NO: 16之重鏈可變域與SEQ ID NO: 12 之輕鏈可變域之抗體相同的抗原決定基。 69· 一種免疫結合物，其包含共價連接於細胞毒性劑之如請 求項1、7、42、54或177之抗體。 70.如請求項69之免疫結合物，其中該細胞毒性劑係選自毒 素、化學治療劑、藥物部分、抗生素、放射性同位素及 132799.doc 200918089 溶核酶。 71. 如請求項70之免疫結合物，其中該免疫結合物具有式 Ab-(L-D)p ’其中：⑷Ab為如請求項1、7、42、54或177 之抗體； (b) L為連接子； (c) D為藥物部分。 72. 如請求項71之免疫結合物，其中[係選自6_順丁烯二醯 亞胺基己酿基（MC)、順丁烯二醯亞胺基丙醯基（mp)、纈 胺酸-瓜胺酸（val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸（ala_phe)、對胺 基节氧幾基（PAB)、4-(2-吡啶基硫基）戊酸N_丁二醯亞胺 ϊ曰（SPP)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基曱基）環己烷]曱酸N_ 丁一醯亞胺酯（SMCC)及（4_碘-乙醯基）胺基苯曱酸N_ 丁二 醯亞胺酯（SIAB)。 73 ·如π求項71之免疫結合物，其中D係選自奥瑞他汀 (auristatin)及海兔毒素（d〇1〇statin)。 74. —種醫藥組合物，其包含如請求項71之免疫結合物及醫 藥學上可接受之载劑。 75. -種如請求項！、7、42、54或177中任一項之抗體的用 途，其係用於製造用以抑制表現CD79b之細胞生長的藥 劑。 76. 如研求項75之用途，其中該抗體與細胞毒性劑結合。 77. 如請求項75之用途，其中該抗體與生長 78. 一種如請求項1、7、一⑽任-二體的用 途其係用於製造用以治療患有癌症之個體的藥劑。 132799.doc 200918089 7 9.如明求項7 8之用途，其中該癌症係選自淋巴瘤、非霍奇 金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發的侵襲性NHL、 復發的惰性NHL、難治性NHL、難治的惰性NHL、慢性 淋巴細胞性白企病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血 病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL) 及套細胞淋巴瘤。 80’如吻求項78之用途，其中該抗體與細胞毒性劑結合。 8 1 ·如吻求項7 8之用途’其中該抗體與生長抑制劑結合。 82.種如3月求項1、7、42、54或177中任一項之抗體的用 途’其係用於製造用以治療個體之增生性病症的藥劑。 83·如明求項82之用途，其中該增生性病症為癌症。 84.如凊求項83之用途’其中該癌症係選自淋巴瘤、非霍奇 金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發的侵襲性NHL ' 復發的惰性NHL、難治性NHL·、難治的惰性NHL·、慢性 木巴細胞性白血病（Cll)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血 病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL) 及套細胞淋巴瘤。 85 ·如研求項82之用途，其中該抗體與細胞毒性劑結合。 86·如μ求項82之用途’其中該抗體與生長抑制劑結合。 87. —種如請求項i、7、42、^或177中任一項之抗體的用 途’其係用於製造用以抑制細胞生長的藥劑，其中該細 胞之生長至少部分視CD79b之生長增強作用而定。 88·如清求項87之用途，其中該抗體與細胞毒性劑結合。 89·如5青求項87之用途，其中該抗體與生長抑制劑結合。 132799.doc 200918089 90· -種如請求項i、7、42、54或177中任一項之抗體的用 途，其係用於製造用以治療性治療哺乳動物之腫瘤的藥 劑，其中該腫瘤之生長至少部分視(：1；)7913之生長增強作 用而定。 91. 如請求項90之用途，其中該腫瘤係與淋巴瘤、非霍奇金 氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發的侵襲性NHL、復 發的惰性NHL、難治性NHL、難治的惰性NHL、慢性淋 巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤、白血 病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性白血病（ALL) 及套細胞淋巴瘤相關。 92. 如請求項90之用途，其中該抗體與細胞毒性劑結合。 93. 如請求項90之用途，其中該抗體與生長抑制劑結合。 94. 一種如請求項70之免疫結合物的用途，其係用於製造用 以抑制B細胞增生之藥劑，其中使待治療之細胞在容許 該免疫結合物與CD79b結合之條件下暴露於該藥劑。 95. 如請求項94之用途，其中該B細胞增生係選自淋巴瘤、 非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發的侵襲性 NHL、復發的惰性NHL、難治性NHL、難治的惰性 NHL、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋 巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性 白企病（ALL)及套細胞淋巴瘤。 96. 如請求項94之用途，其中該B細胞為異種移植物。 97. 如請求項94之用途，其中該暴露在活體外進行。 98. 如請求項94之用途，其中該暴露在活體内進行。 132799.doc -11· 200918089 99. 一種測定懷疑含有CD79b之樣品中CD79b之存在的活體 外方法，該方法包含使該樣品暴露於如請求項1、7、 42、54或1 77中任一項之抗體，及測定該抗體與該樣品 中之CD79b之結合，其中該抗體與該樣品中之CD79b之 結合指示該樣品中存在該蛋白質。 100·如請求項99之方法，其中該生物樣品係來自懷疑患有匕細 胞增生性病症之患者。 101_如請求項100之方法，其中該8細胞增生性病症係選自淋 巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHl、復發的 侵襲性NHL、復發的惰性NHL、難治性NHL、難治的惰 性NHL、慢性淋巴細胞性白血病（Cll)、小淋巴細胞性 淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞 性白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤。 102· —種使如請求項i、7、42、54或177中任一項之抗體與 表現CD79b之細胞結合的方法，該方法包含使該細胞與 如請求項1、7、42、54或177中任一項之抗體接觸。 103. 如請求項1〇2之方法’其中該抗體與細胞毒性劑結合。 104. 如請求項1 〇2之方法，其中該抗體與生長抑制劑結合。 105. —種核酸，其編碼如請求項1、7、42、54或1 77中任一 項之抗體。 106. —種宿主細胞，其包含如請求項1 〇 5之核酸。 107. —種組合物’其包含如請求項丨_43中任一項之抗體。 108. 如請求項107之組合物，其中該組合物包含載劑。 109. 如請求項1、7、42、54或177之抗體，其中該抗體為包 132799.doc -12- 200918089 含一或多個游離半胱胺酸胺基酸之半胱胺酸工程化抗 體，其中該半胱胺酸工程化抗體係藉由包含由游離半胱 胺酸胺基酸置換親本抗體之一或多個胺基酸殘基之方法 來製備。 110·如請求項109之抗體，其中該一或多個游離半胱胺酸胺 基酸具有在0.6至1.0之範圍内的硫基反應性值。 111. 如請求項109之半胱胺酸工程化抗體，其中該半胱胺酸 工程化抗體與硫基反應性試劑之反應性比該親本抗體與 該硫基反應性試劑之反應性大。 112. 如請求項1〇9之半胱胺酸工程化抗體，其中該方法進一 步包含藉由使該半胱胺酸工程化抗體與硫醇反應性試劑 反應來測定該半胱胺酸工程化抗體之硫醇反應性；其中 該半胱胺酸工程化抗體與該硫醇反應性試劑之反應性比 該親本抗體與該硫醇反應性試劑之反應性大。 113. 如請求項1〇9之半胱胺酸工程化抗體，其中該一或多個 游離半胱胺酸胺基酸殘基位於輕鏈中。 114. 如請求項1〇9之半胱胺酸工程化抗體，其中該抗體為包 含共價連接於細胞毒性劑之該半胱胺酸工程化抗體之免 疫結合物。 115. 如請求項114之半胱胺酸工程化抗體，其中該細胞毒性 劑係選自毒素、化學治療劑、藥物部分、抗生素、放射 性同位素及溶核酶。 116. 如請求項i 09之半胱胺酸工程化抗體，其中該抗體共價 連接於捕捉標記、偵測標記或固體支撐物。 132799.doc 13 200918089 117. 如請求項116之半胱胺酸工程化抗體，其中該抗體共價 連接於生物素捕捉標記。 118. 如請求項11 6之半胱胺酸工程化抗體，其中該抗體共價 連接於螢光染料偵測標記。 119. 如請求項118之半胱胺酸工程化抗體，其中該螢光染料 係選自螢光素型、若丹明（rhodamine)型、丹酿 (dansyl)、麗絲胺（Lissamine)、花青、藻紅蛋白、得克薩 斯紅（Texas Red)及其類似物。 (120·如請求項116之半胱胺酸工程化抗體，其中該抗體共價 連接於選自 3H、1!C、14C、18F、32P、35s、64Cu、68Ga、 86Y、99Tc、inIn、123I、124I、丨25i、丨、⑴以、177Lu、 211 At及213Bi之放射性核種偵測標記。 121. 如請求項116之半胱胺酸工程化抗體，其中該抗體係藉 由螯合配位體共價連接於偵測標記。 122. 如請求項121之半胱胺酸工程化抗體，其中該螯合配位 體係選自 DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA及 TETA。 C ; 123. 如請求項i、7、42、54或177之抗體，其包含白蛋白結 合肽。 124. 如請求項123之抗體，其中該白蛋白結合肽係選自SEQ ID NO： 80-84 » 125. 如請求項1、7、42、54或177之抗體，其中該抗體進一 步包含位於一或多個選自根據Kabat編號規則之輕鏈之 15、43、11〇、144、168及205以及根據EU編號規則之重 鏈之 41、88 ' 115、118、120、171、172、282、375 及 132799.doc •14- 200918089 400的位置處之游離半耽胺酸胺基酸。 126. 如請求項125之抗體，其中半胱胺酸位於該輕鏈之位置 205 處。 127. 如請求項125之抗體，其中半胱胺酸位於該重鏈之位置 118 處。 128·如請求項125之抗體，其中半胱胺酸位於該重鏈之位置 400 處。 129. 如請求項125之抗體，其中該抗體係選自單株抗體、雙 特異性抗體、嵌合抗體、人類抗體及人類化抗體。 130. 如請求項1 2 5之抗體，其為抗體片段。 131. 如請求項1 30之抗體，其中該抗體片段為Fab片段。 132. 如請求項1 25之抗體，其係選自嵌合抗體、人類抗體或 人類化抗體。 133. 如睛求項1 25之抗體’其係於細菌中產生。 134. 如請求項1 25之抗體’其係於CHO細胞中產生。 135. —種測定懷疑含有CD79b蛋白質之樣品中該蛋白質之存 在的活體外方法’該方法包含使該樣品暴露於如請求項 12〇之抗體及測定該抗體與該樣品中之該CD79b蛋白質之 結合’其中該抗體與該蛋白質之結合指示該樣品中存在 該蛋白質。 136·如請求項1 35之方法’其中該樣品包含懷疑表現該CD79b 蛋白質之細胞。 137. 如請求項1 3 5之方法，其中該細胞為B細胞。 138. 如請求項1 35之方法，其中該抗體共價連接於選自勞光 132799.doc -15- 200918089 木料、放射性同位素、生物素或金屬錯合配位體之標 記。 139. —種醫藥調配物，其包含如請求項125之抗_cD79b抗體 及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑。 140. 如請求項125之抗體，其中該抗體共價連接於奥瑞他汀 或美登素類（maytansinoid)藥物部分，藉此形成抗體藥物 結合物。 141. 如請求項140之抗體，其中該抗體_藥物結合物包含抗體 (Ab)及奥瑞他汀或美登素類藥物部分（D)，其中該半胱胺 酸工程化抗體係藉由連接子部分經由一或多個游離半 胱fe酸胺基酸連接於D ;該化合物具有式I : Ab-(L-D)p , 其中p為1、2、3或4。 I42·如請求項141之抗體，其中p為2。 143.如請求項ι41之抗體，其中[具有下式： 一Aa — WW一Yy — 其中： A為共價連接於該半胱胺酸工程化抗體(Ab)之半胱胺酸 硫醇之延展基單元（Stretcher unit); a為0或1 ; W各自獨立地為胺基酸單元； w為範圍為〇至12之整數； Y為共價連接於該藥物部分之間隔基單元；且 132799.doc • 16 - 200918089 y為0、1或2。 144.如請求項ι43之抗體，其中該抗體-藥物結合物具有下 式：
    其中ΡΑΒ為對胺基苄基胺曱醯基，且R]7為選自（CH2)r、 CrC8碳環基、〇_(CH2)r、伸芳基、（CH2)r-伸芳基、-伸 芳基-(CH2)r-、（CH2)r-(C3-C8碳環基）、（C3-C8 碳環基）-(CH2)r、<：3-(：8雜環基、（CH2)r-(C3-C8雜環基）、-(c3-C8雜 環基）_(CH2)r-、-(CH2)rC(0)NRb(CH2)r-、-(CH2CH20)r-、-(CH2CH20)r-CH2-、-(CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)r-、 -(CH2)rC(0)NRb(CH2CH2〇)r-CH2- ' -(CH2CH2〇)rC(0)NRb(CH2CH2〇)r-、-(CH2CH20)rC(0)NRb(CH2CH20)r-CH2-及-(CH2CH20)rC (0)NRb(CH2)r-之二價基團；其中Rb為h、c丨-C6烷基、苯 基或苄基；且r獨立地為範圍為1至丨〇之整數。 145.如請求項1 43之抗體，其中^為纈胺酸·瓜胺酸。 146·如請求項143之抗體，其中為（CH2)5或（CH2)2。 147·如請求項143之抗體，其中該抗體-藥物結合物具有下 式：
    132799.doc -17- 200918089 148. 如請求項147之抗體，其中R17為（CH2)5或（CH2)2。 149. 如請求項143之抗體’其中該抗體-藥物結合物具有下 式：
    HN 〇人 nh2 150·如請求項1 4 1之抗體，其中L為SMCC、SPP、SPDB或 BMPEO 〇 151.如請求項141之抗體’其中D為具有以下結構之MMAE:
    其中波形線指不連接至該連接子L之連接位點。 152.如請求項14 1之抗體’其中d為具有以下結構之MMAF
    其中波形線指示連接至該連接子L之連接位點。 153.如請求項141之抗體’其中d為具有以下結構之DM 1或 DM4 ： 132799.doc 200918089
    154.如μ求項140之抗體，其中該抗體係選自單株抗體、雙 I) 特異性抗體、嵌合抗體、人類抗體、人類化抗體及抗體 片段。 155. 如請求項140之抗體，其中該抗體片段為Fab片段。 156. —種抗體-藥物結合物化合物，其係選自下列結構：
    Ab-MC-vc-PAB-MMAF 132799.doc -19- 200918089
    Ab-BMPEO-DMl 其中Val為纈胺酸；Cit為瓜胺酸；p為1、2、3或4 ;且Ab 為如請求項125之抗體。 157. 如請求項140之抗體，其中該奥瑞他汀為MMAE或 MMAF。 158. 如請求項141之抗體，其中L為MC-val-cit-PAB或MC。 159. —種用於偵測B細胞之活體外檢定，其包含： (a)使細胞暴露於如請求項140之抗體-藥物結合物化合 132799.doc -20- 200918089 物；及 (b)測疋該抗體-藥物結合物化合物與該等細胞之結合程 度。 160. 一種抑制細胞増生之活體外方法，其包含用如請求項 140之抗體-藥物結合物化合物處理細胞培養基中之哺乳 動物癌性B細胞，藉此該等癌性B細胞之增生受到抑制。 161. —種t藥調g己物，其&含如請求項14〇之抗體藥物結合 物及醫藥學上可接受之稀釋劑、载劑或賦形劑。 162. —種如請求項161之醫藥調配物之用途，其係用於製造 用以治療癌症之藥劑。 163. 如請求項162之用途，其中該癌症係選自由淋巴瘤、非 霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發的侵襲性 NHL、復發的惰性Nhl、難治性Nhl、難治的惰性 NHL、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、小淋巴細胞性淋 巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性 白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤組成之群。 164. 如請求項162之用途，其中該藥劑進一步包含細胞毒性 劑與該抗體-藥物結合物化合物之組合。 165. —種製品，其包含： 如請求項1 6 1之醫藥調配物； 一容器；及 一包裝插頁或標籤，其指示該化合物可用於治療特徵 為CD79b多肽過度表現之癌症。 166. 如請求項165之製品，其中該癌症係選自由淋巴瘤、非 132799.doc 21 200918089 霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、侵襲性NHL、復發的侵襲性 NHL、復發的惰性NHL、難治性NHL、難治的惰性 NHL、慢性淋巴細胞性白血病（cll)、小淋巴細胞性淋 巴瘤、白血病、毛細胞白血病（HCL)、急性淋巴細胞性 白血病（ALL)及套細胞淋巴瘤組成之群。 167. —種用於製造包含如請求項ι25之抗_CD79b抗體（Ab)及 奥瑞他’汀或美登素類藥物部分（D)之抗體藥物結合物化合 物的方法，其中該抗體係藉由連接子部分（L)經由該一或 多個工程化半胱胺酸胺基酸連接於D;該化合物具有式 Ab-(L-D)p I 其中P為1、2、3或4 ;該方法包含下列步驟： (a) 使該抗體之工程化半胱胺酸基團與連接子試劑反應以 形成抗體-連接子中間物Ab-L ;及 (b) 使Ab-L與活化藥物部分d反應；藉此形成該抗體-藥物 結合物； 或包含下列步驟： (c) 使藥物部分之親核基團與連接子試劑反應以形成藥 物-連接子中間物D-L ;及 (d) 使D-L與該抗體之工程化半胱胺酸基團反應；藉此形 成該抗體-藥物結合物。 168.如請求項167之方法，其進一步包含使該抗體表現於中 國倉鼠卵巢（CHO)細胞中之步驟。 169·如請求項167之方法，其進一步包含用還原劑處理該經 132799.doc -22- 200918089 表現之抗體之步驟。 170·如請求項169之方法，其中該還原劑係選自TCEP及 DTT。 171. 如請求項1 69之方法，其進一步包含在用該還原劑處理 後用氧化劑處理該經表現之抗體之步驟。 172. 如請求項ι71之方法，其中該氧化劑係選自硫酸鋼、脫 氫抗壞jk酸及空氣。 173. 如請求項125之抗體，其中該抗體包含與選自SEQ ID NO: 90或85中之任一者之胺基酸序列具有至少90%序列 一致性的重鏈序列。 174. 如請求項125之抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 89 之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之輕鏈序列及與 SEQ ID NO: 85之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之 重鏈序列。 175. 如請求項125之抗體，其中該抗體包含與選自SEQ ID NO: 89或88中之任一者之胺基酸序列具有至少90%序列 一致性的輕鏈序列。 176. 如請求項125之抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 88 之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之輕鏈序列及與 SEQ ID NO: 90之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之 重鏈序列。 177. —種結合於CD79b之抗體’其中該抗體包含與選自seq ID NO: 14之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之重鍵 可變域及與選自SEQ ID NO: 10之胺基酸序列具有至少 132799.doc -23- 200918089 9 0 %序列一致性之輕鏈可變域。 178, —種組合物，其包含如請求項1、7、42、54或177中任 一項之抗體。 179. 如請求項1 78之組合物，其中該組合物包含載劑。
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Families Citing this family (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110045005A1 (en) 2001-10-19 2011-02-24 Craig Crowley Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
US20090068178A1 (en) * 2002-05-08 2009-03-12 Genentech, Inc. Compositions and Methods for the Treatment of Tumor of Hematopoietic Origin
US20100111856A1 (en) * 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
DK2474557T3 (da) * 2007-07-16 2014-11-10 Genentech Inc Anti-CD79b-antistoffer og immunkonjugater og fremgangsmåder til anvendelse
WO2009012256A1 (en) 2007-07-16 2009-01-22 Genentech, Inc. Humanized anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
WO2009052249A1 (en) * 2007-10-19 2009-04-23 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-tenb2 antibodies and antibody drug conjugates
ES2618292T3 (es) 2008-01-31 2017-06-21 Inserm - Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Anticuerpos contra CD39 humano y uso de los mismos para inhibir la actividad de las células T reguladoras
DK2657253T3 (en) 2008-01-31 2017-10-09 Genentech Inc Anti-CD79b antibodies and immune conjugates and methods of use
KR20100137585A (ko) * 2008-04-30 2010-12-30 이뮤노젠 아이엔씨 강력한 복합체 및 친수성 링커
US20100092495A1 (en) * 2008-04-30 2010-04-15 Immunogen Inc. Potent cell-binding agent drug conjugates
AU2010213656B2 (en) 2009-02-11 2015-04-23 Xyleco, Inc. Saccharifying biomass
WO2010126552A1 (en) * 2009-04-30 2010-11-04 Immunogen, Inc. Potent cell-binding agent drug conjugates
EP2448966B1 (en) 2009-07-03 2018-11-14 Avipep Pty Ltd Immuno-conjugates and methods for producing them
CN105440133A (zh) 2009-07-15 2016-03-30 Aimm医疗股份公司 革兰氏阳性细菌特异性结合化合物
EP2486023A4 (en) * 2009-10-06 2014-05-07 Immunogen Inc EFFICIENT CONJUGATES AND HYDROPHILIC BINDER
BR112012012983A2 (pt) 2009-12-04 2020-09-15 Genentech Inc método para sintetizar um anticorpo multiespecífico, método para sintetizar um painel de anticorpos multiespecíficos, método para sintetizar um análogo de anticorpo, método para sintetizar um painel de análogos de anticorpo e composições
AU2010336029B2 (en) * 2009-12-23 2011-10-13 Avipep Pty Ltd Immuno-conjugates and methods for producing them 2
MA34057B1 (fr) 2010-02-23 2013-03-05 Genentech Inc Compositions et methodes pour le diagnostic et le traitement d'une tumeur
PE20130460A1 (es) * 2010-05-03 2013-04-26 Genentech Inc Composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de tumores
WO2011146568A1 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Genentech, Inc. Predicting response to a her inhibitor
EP2579897A1 (en) 2010-06-08 2013-04-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
WO2012019184A2 (en) * 2010-08-06 2012-02-09 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for detecting, diagnosing, and treating cancer
ES2684602T3 (es) * 2010-12-22 2018-10-03 Orega Biotech Anticuerpos contra CD39 humano y uso de los mismos
DK2707031T3 (da) 2011-05-08 2019-10-07 Legochem Biosciences Inc Protein-active agent conjugates and method for preparing the same
CA2836927A1 (en) * 2011-06-21 2012-12-27 Immunogen, Inc. Novel maytansinoid derivatives with peptide linker and conjugates thereof
MX2015001407A (es) * 2012-08-02 2015-05-08 Genentech Inc Inmunoconjugados y anticuerpos anti-etbr.
BR112015002193A2 (pt) 2012-08-02 2017-07-04 Genentech Inc anticorpos anti-etbr e imunoconjugados
US9353150B2 (en) 2012-12-04 2016-05-31 Massachusetts Institute Of Technology Substituted pyrazino[1′,2′:1 ,5]pyrrolo[2,3-b]-indole-1,4-diones for cancer treatment
CN105452293B (zh) 2013-07-03 2021-03-16 首尔大学校产学协力团 转化为半胱氨酸的鸡抗体和使用其的位点特异性缀合
KR20160122127A (ko) * 2013-12-23 2016-10-21 자임워크스 인코포레이티드 C-말단의 경쇄 폴리펩타이드 연장부를 포함하는 항체 및 이의 컨쥬게이트 및 이들의 사용방법
US10030076B2 (en) 2014-01-07 2018-07-24 Oklahoma Medical Research Foundation Antibodies against glioma biomarkers
EP2940128A1 (en) 2014-04-30 2015-11-04 Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) Adenovirus comprising an albumin-binding moiety
GB201412659D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
GB201412658D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
MY198629A (en) * 2014-07-24 2023-09-11 Genentech Inc Methods of conjugating an agent to a thiol moiety in a protein that contains at least one trisulfide bond
AR101844A1 (es) 2014-09-12 2017-01-18 Genentech Inc Anticuerpos y conjugados modificados genéticamente con cisteína
SG11201701958VA (en) 2014-09-19 2017-04-27 Xyleco Inc Saccharides and saccharide compositions and mixtures
PT3262071T (pt) 2014-09-23 2020-06-16 H Hoffnabb La Roche Ag Métodos de utilização de imunoconjugados anti-cd79b
BR112017011326A2 (pt) * 2014-12-05 2018-07-31 Genentech, Inc. anticorpo, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método para produzir o anticorpo, imunoconjugado, composição farmacêutica, usos do anticorpo, métodos para tratar ou retardar a progressão de distúrbio proliferativo celular e para intensificar a função imune
GB201601077D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecule
GB201601075D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies molecules
GB201601073D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
US11583593B2 (en) 2016-01-14 2023-02-21 Synthis Therapeutics, Inc. Antibody-ALK5 inhibitor conjugates and their uses
US10918627B2 (en) 2016-05-11 2021-02-16 Massachusetts Institute Of Technology Convergent and enantioselective total synthesis of Communesin analogs
CN106085415B (zh) * 2016-07-16 2018-11-16 北京化工大学 一种小檗碱亲和标记探针及其制备方法
CN117398475A (zh) * 2016-10-08 2024-01-16 四川百利药业有限责任公司 半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物及其制备方法
KR20190122739A (ko) 2017-02-28 2019-10-30 시애틀 지네틱스, 인크. 컨쥬게이션을 위한 시스테인 변이된 항체
KR102584011B1 (ko) 2017-03-16 2023-09-27 이나뜨 파르마 에스.에이. 암 치료를 위한 조성물 및 방법
US11932650B2 (en) 2017-05-11 2024-03-19 Massachusetts Institute Of Technology Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis
EP3624854A1 (en) 2017-05-16 2020-03-25 Université de Strasbourg Protein-drug conjugates and their use in the treatment of cancers
CN110869394A (zh) * 2017-06-16 2020-03-06 伊莱利利公司 工程改造的抗体化合物及其缀合物
CA3071852A1 (en) * 2017-08-04 2019-02-07 Amgen Inc. Method of conjugation of cys-mabs
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
WO2019135159A2 (en) * 2018-01-04 2019-07-11 Shanghai Lumosa Therapeutics Co., Ltd. Single-domain antibody-cytosine deaminase fusion proteins
JP7500442B2 (ja) 2018-06-18 2024-06-17 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニム 癌を処置するための組成物及び方法
CA3107383A1 (en) * 2018-07-23 2020-01-30 Magenta Therapeutics, Inc. Use of anti-cd5 antibody drug conjugate (adc) in allogeneic cell therapy
AU2019355115A1 (en) * 2018-10-03 2021-03-04 Nepenthe Bioscience LLC Anti-CD79 antibodies and their uses
WO2020092467A1 (en) * 2018-10-30 2020-05-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-cd79b antibodies and chimeric antigen receptors and methods of use thereof
CN111116745B (zh) * 2018-11-01 2022-10-14 上海新理念生物医药科技有限公司 抗CD79b抗体、其药物偶联物及其应用
US20220162304A1 (en) * 2019-01-28 2022-05-26 Tuojie Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Anti-cd79b antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof
WO2020247054A1 (en) 2019-06-05 2020-12-10 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof
WO2020256721A1 (en) * 2019-06-19 2020-12-24 Synthis, Llc Antib0dy-alk5 inhibitor conjugates and their uses
JP2023525496A (ja) * 2020-04-30 2023-06-16 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 抗ｃｄ７９ｂ抗体およびキメラ抗原レセプターならびにそれらの使用方法
CN112094345B (zh) * 2020-06-01 2024-01-05 普众发现医药科技(上海)有限公司 可应用于肿瘤细胞捕获的小鼠抗免疫球蛋白关联βCD79b的单克隆抗体
CN112798377B (zh) * 2021-01-29 2023-03-17 四川大学华西医院 一种荧光淬灭恢复剂及其应用
WO2022205316A1 (en) * 2021-04-01 2022-10-06 Shanghai Allygen Biologics Co., Ltd. Targeting conjugates comprising effector molecules and uses thereof
CN115349490B (zh) * 2022-07-14 2024-01-12 成都中医药大学 一种卵巢储备功能低下动物模型的建立方法
WO2024046468A1 (en) * 2022-09-02 2024-03-07 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Fusion proteins targeting lysosomal degradation pathway
WO2024129756A1 (en) 2022-12-13 2024-06-20 Seagen Inc. Site-specific engineered cysteine antibody drug conjugates
CN116990512B (zh) * 2023-09-25 2023-12-08 聚诚(北京)生物科技有限责任公司 一种基质金属蛋白酶-9检测试剂盒

Family Cites Families (355)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US633410A (en) 1898-09-22 1899-09-19 George A Ames Ice-cutter.
US3445518A (en) 1966-05-06 1969-05-20 Warner Lambert Pharmaceutical P-acylphenylethylamines
US3720760A (en) 1968-09-06 1973-03-13 Pharmacia Ab Method for determining the presence of reagin-immunoglobulins(reagin-ig)directed against certain allergens,in aqueous samples
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4414205A (en) 1981-08-28 1983-11-08 University Patents, Inc. Cell growth inhibitory substances
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4943529A (en) 1982-05-19 1990-07-24 Gist-Brocades Nv Kluyveromyces as a host strain
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
AU2353384A (en) 1983-01-19 1984-07-26 Genentech Inc. Amplification in eukaryotic host cells
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
AU3145184A (en) 1983-08-16 1985-02-21 Zymogenetics Inc. High expression of foreign genes in schizosaccharomyces pombe
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
DE3587657D1 (de) 1984-01-30 1993-12-23 Imp Cancer Res Tech Verbesserungen an wachstumsfaktoren.
US6054561A (en) 1984-02-08 2000-04-25 Chiron Corporation Antigen-binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens
US5169774A (en) 1984-02-08 1992-12-08 Cetus Oncology Corporation Monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US4753894A (en) 1984-02-08 1988-06-28 Cetus Corporation Monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4764368A (en) 1984-08-29 1988-08-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US5342606A (en) 1984-10-18 1994-08-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Polyazamacrocyclic compounds for complexation of metal ions
US5316757A (en) 1984-10-18 1994-05-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Synthesis of polyazamacrocycles with more than one type of side-chain chelating groups
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5583024A (en) 1985-12-02 1996-12-10 The Regents Of The University Of California Recombinant expression of Coleoptera luciferase
US5091178A (en) 1986-02-21 1992-02-25 Oncogen Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies
JPS63502716A (ja) 1986-03-07 1988-10-13 マサチューセッツ・インステチュート・オブ・テクノロジー 糖タンパク安定性の強化方法
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US5401638A (en) 1986-06-04 1995-03-28 Oncogene Science, Inc. Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US4946783A (en) 1987-01-30 1990-08-07 President And Fellows Of Harvard College Periplasmic protease mutants of Escherichia coli
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US4816444A (en) 1987-07-10 1989-03-28 Arizona Board Of Regents, Arizona State University Cell growth inhibitory substance
US5010182A (en) 1987-07-28 1991-04-23 Chiron Corporation DNA constructs containing a Kluyveromyces alpha factor leader sequence for directing secretion of heterologous polypeptides
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
GB8724885D0 (en) 1987-10-23 1987-11-25 Binns M M Fowlpox virus promotors
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5283187A (en) 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
EP0397687B1 (en) 1987-12-21 1994-05-11 The University Of Toledo Agrobacterium mediated transformation of germinating plant seeds
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
IL106992A (en) 1988-02-11 1994-06-24 Bristol Myers Squibb Co Noble hydrazonic history of anthracycline and methods for their preparation
US4943628A (en) 1988-06-13 1990-07-24 Ortho Pharmaceutical Corporation HIV peptide-inducted T cell stimulation
AU4005289A (en) 1988-08-25 1990-03-01 Smithkline Beecham Corporation Recombinant saccharomyces
AU632065B2 (en) 1988-09-23 1992-12-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4978744A (en) 1989-01-27 1990-12-18 Arizona Board Of Regents Synthesis of dolastatin 10
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
EP0394538B1 (en) 1989-04-28 1996-10-16 Rhein Biotech Gesellschaft Für Neue Biotechnologische Prozesse Und Produkte Mbh A yeast cell of the genus schwanniomyces
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
EP0739904A1 (en) 1989-06-29 1996-10-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
FR2649120B1 (fr) 1989-06-30 1994-01-28 Cayla Nouvelle souche et ses mutants de champignons filamenteux, procede de production de proteines recombinantes a l'aide de ladite souche et souches et proteines obtenues selon ce procede
US5286637A (en) 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
DE68926248T2 (de) 1989-09-29 1996-12-19 Oncogene Science Inc p100 "neu" menschlisches Protein and Verwendung dieses Proteins zum Nachweis von preneoplasmatischen- oder neoplasmatischen beim Menschen
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5208020A (en) * 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5165923A (en) 1989-11-20 1992-11-24 Imperial Cancer Research Technology Methods and compositions for the treatment of hodgkin's disease
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5767236A (en) 1990-05-09 1998-06-16 Biomeasure, Inc. Linear therapeutic peptides
US5179774A (en) 1990-05-24 1993-01-19 Ford Motor Company Apparatus and method for mechanically applying a sealing strip
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
US5206161A (en) 1991-02-01 1993-04-27 Genentech, Inc. Human plasma carboxypeptidase B
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DE69233750D1 (de) 1991-04-10 2009-01-02 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer Rezeptoren mittels Phagemiden
EP0586505A1 (en) 1991-05-14 1994-03-16 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
JP3050424B2 (ja) 1991-07-12 2000-06-12 塩野義製薬株式会社 ヒトエンドセリンリセプター
DE69230824T2 (de) 1991-08-09 2000-07-27 Teikoku Hormone Mfg Co Ltd Neue tetrapeptidderivate
AU669124B2 (en) 1991-09-18 1996-05-30 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing humanized chimera antibody
CA2116774C (en) 1991-09-19 2003-11-11 Paul J. Carter Expression in e. coli antibody fragments having at least a cysteine present as a free thiol. use for the production of bifunctional f(ab') 2 antibodies
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DK1136556T3 (da) 1991-11-25 2005-10-03 Enzon Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multivalente antigen-bindende proteiner
US5739294A (en) 1991-12-10 1998-04-14 The Dow Chemical Company Bicyclopol yazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as contrast agents
US5480990A (en) 1991-12-10 1996-01-02 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclocarboxylic acid complexes for use as contrast agents
US5428139A (en) 1991-12-10 1995-06-27 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as radiopharmaceuticals
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
CA2129663C (en) 1992-02-06 2005-07-05 James S. Huston Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
IL105914A0 (en) 1992-06-04 1993-10-20 Univ California Methods and compositions for in vivo gene therapy
ATE149570T1 (de) 1992-08-17 1997-03-15 Genentech Inc Bispezifische immunoadhesine
NZ258392A (en) 1992-11-13 1997-09-22 Idec Pharma Corp Chimeric and radiolabelled antibodies to the b lymphocyte cellsurface antigen bp35 (cd-20) and their use in the treatment of b cell lymphona
US6034065A (en) 1992-12-03 2000-03-07 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of antineoplastic tetrapeptide phenethylamides of dolastatin 10
US6569834B1 (en) 1992-12-03 2003-05-27 George R. Pettit Elucidation and synthesis of antineoplastic tetrapeptide w-aminoalkyl-amides
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
CA2109861C (en) 1992-12-04 1999-03-16 Shu-Hui Chen 6,7-modified paclitaxels
ATE199392T1 (de) 1992-12-04 2001-03-15 Medical Res Council Multivalente und multispezifische bindungsproteine, deren herstellung und verwendung
US5644033A (en) * 1992-12-22 1997-07-01 Health Research, Inc. Monoclonal antibodies that define a unique antigen of human B cell antigen receptor complex and methods of using same for diagnosis and treatment
US5410024A (en) 1993-01-21 1995-04-25 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
JPH06234790A (ja) 1993-02-09 1994-08-23 Teikoku Hormone Mfg Co Ltd 新規テトラペプチドアミド誘導体
US5869445A (en) 1993-03-17 1999-02-09 University Of Washington Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein
ATE186219T1 (de) 1993-03-24 1999-11-15 Berlex Biosciences Kombination von antihormonale und bindende moleküle zur krebsbehandlung
US5462725A (en) 1993-05-06 1995-10-31 The Dow Chemical Company 2-pyridylmethylenepolyazamacrocyclophosphonic acids, complexes and derivatives thereof, for use as contrast agents
US5385893A (en) 1993-05-06 1995-01-31 The Dow Chemical Company Tricyclopolyazamacrocyclophosphonic acids, complexes and derivatives thereof, for use as contrast agents
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
JPH0719832A (ja) 1993-06-21 1995-01-20 Canon Inc 複数画像の対応点抽出方法
EP0731106B1 (en) * 1993-10-01 2004-11-17 Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. Dolastatin derivatives
US5553097A (en) 1994-06-01 1996-09-03 International Business Machines Corporation System and method for transporting high-bandwidth signals over electrically conducting transmission lines
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5521284A (en) 1994-08-01 1996-05-28 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide amides and esters
US5504191A (en) 1994-08-01 1996-04-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide methyl esters
US5530097A (en) 1994-08-01 1996-06-25 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory peptide amides
US5910486A (en) 1994-09-06 1999-06-08 Uab Research Foundation Methods for modulating protein function in cells using, intracellular antibody homologues
US5554725A (en) 1994-09-14 1996-09-10 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Synthesis of dolastatin 15
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
US5599902A (en) 1994-11-10 1997-02-04 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Cancer inhibitory peptides
EP1241264A1 (en) 1994-12-02 2002-09-18 Chiron Corporation Monoclonal antibodies to colon cancer antigen
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
ES2141467T5 (es) 1995-01-18 2006-07-16 Roche Diagnostics Gmbh Anticuerpos anti-cd30 que evitan la escision proteolitica y liberacion del antigeno cd30 fijado a la membrana.
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
JPH08336393A (ja) 1995-04-13 1996-12-24 Mitsubishi Chem Corp 光学活性なγ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
ES2150664T3 (es) 1995-04-21 2000-12-01 Teikoku Hormone Mfg Co Ltd Nuevos derivados peptidos.
US5837234A (en) 1995-06-07 1998-11-17 Cytotherapeutics, Inc. Bioartificial organ containing cells encapsulated in a permselective polyether suflfone membrane
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
FR2737588B1 (fr) 1995-08-01 2001-11-02 Kodak Pathe Nouveau produit pour radiographie industrielle
JPH0977791A (ja) 1995-09-08 1997-03-25 Nippon Kayaku Co Ltd ペプチド誘導体及びその用途
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
DE19544393A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide Mischungen
US5783186A (en) 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
US6083502A (en) 1996-01-05 2000-07-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Mesothelium antigen and methods and kits for targeting it
US5834456A (en) 1996-02-23 1998-11-10 The Dow Chemical Company Polyazamacrocyclofluoromonoalkylphosphonic acids, and their complexes, for use as contrast agents
AU2660397A (en) 1996-04-05 1997-10-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
US5741892A (en) 1996-07-30 1998-04-21 Basf Aktiengesellschaft Pentapeptides as antitumor agents
US6239104B1 (en) 1997-02-25 2001-05-29 Arizona Board Of Regents Isolation and structural elucidation of the cytostatic linear and cyclo-depsipeptides dolastatin 16, dolastatin 17, and dolastatin 18
US6183744B1 (en) 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US5994071A (en) 1997-04-04 1999-11-30 Albany Medical College Assessment of prostate cancer
US6319688B1 (en) 1997-04-28 2001-11-20 Smithkline Beecham Corporation Polynucleotide encoding human sodium dependent phosphate transporter (IPT-1)
US6184105B1 (en) 1997-05-22 2001-02-06 Advanced Micro Devices Method for post transistor isolation
US6083715A (en) 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
US6172213B1 (en) 1997-07-02 2001-01-09 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies and method of improving polypeptides
US6143721A (en) 1997-07-18 2000-11-07 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin 15 derivatives
US6248564B1 (en) 1997-08-29 2001-06-19 Harvard University Mutant MHC class I molecules
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
US7052873B2 (en) * 1997-10-03 2006-05-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Natural human antibody
EP1045858B1 (en) 1998-01-09 2004-12-08 ARIZONA BOARD OF REGENTS, A BODY CORPORATE OF THE STATE OF ARIZONA acting for and on behalf of ARIZONA STATE UNIVERSITY Anti-cryptococcal peptides
US6051228A (en) * 1998-02-19 2000-04-18 Bristol-Myers Squibb Co. Antibodies against human CD40
US6162930A (en) 1998-03-06 2000-12-19 Baylor University Anti-mitotic agents which inhibit tubulin polymerization
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP1086223B1 (en) 1998-06-01 2009-07-29 Agensys, Inc. Novel serpentine transmembrane antigens expressed in human cancers and uses thereof
US5985837A (en) 1998-07-08 1999-11-16 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin 15 derivatives
WO2000012130A1 (en) 1998-08-27 2000-03-09 Smithkline Beecham Corporation Rp105 agonists and antagonists
WO2001057188A2 (en) 2000-02-03 2001-08-09 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
US20040141983A1 (en) 1999-03-15 2004-07-22 Protein Design Labs, Inc. Compositions against cancer antigen LIV-1 and uses thereof
BR0010017A (pt) 1999-04-28 2002-06-11 Univ Texas Composições e processos para o tratamento de câncer por inibição seletiva de vegf
SI1189641T1 (sl) 1999-06-25 2009-12-31 Genentech Inc Humanizirana protitelesa proti ErbB2 in zdravljenje s protitelesi proti ErbB2
US6323315B1 (en) 1999-09-10 2001-11-27 Basf Aktiengesellschaft Dolastatin peptides
US7303749B1 (en) 1999-10-01 2007-12-04 Immunogen Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
AU775373B2 (en) 1999-10-01 2004-07-29 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US6346249B1 (en) * 1999-10-22 2002-02-12 Ludwig Institute For Cancer Research Methods for reducing the effects of cancers that express A33 antigen using A33 antigen specific immunoglobulin products
US6372907B1 (en) 1999-11-03 2002-04-16 Apptera Corporation Water-soluble rhodamine dye peptide conjugates
DK1244705T3 (da) 1999-12-06 2010-05-31 Agensys Inc Serpentintransmembrane antigener udtryk i human prostatacancere og anvendelser deraf
JP2003518075A (ja) 1999-12-24 2003-06-03 ジェネンテック・インコーポレーテッド 生理活性化合物の消失半減期延長のための方法及び組成物
US20040001827A1 (en) 2002-06-28 2004-01-01 Dennis Mark S. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
CA2406993A1 (en) * 2000-03-24 2001-09-27 Micromet Ag Multifunctional polypeptides comprising a binding site to an epitope of the nkg2d receptor complex
CA2404365A1 (en) 2000-03-31 2001-10-11 Idec Pharmaceutical Corporation Combined use of anti-cytokine antibodies or antagonists and anti-cd20 for the treatment of b cell lymphoma
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US20020150573A1 (en) 2000-11-10 2002-10-17 The Rockefeller University Anti-Igalpha-Igbeta antibody for lymphoma therapy
US20070258987A1 (en) 2000-11-28 2007-11-08 Seattle Genetics, Inc. Recombinant Anti-Cd30 Antibodies and Uses Thereof
US7090843B1 (en) 2000-11-28 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
US20040018194A1 (en) 2000-11-28 2004-01-29 Francisco Joseph A. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
RU2285541C2 (ru) 2000-12-22 2006-10-20 Байоджен Айдек Инк. Комбинированная терапия для лечения аутоиммунных заболеваний с использованием комбинации элиминирующего в-клетки/иммунорегуляторного антител
AU2002250078A1 (en) 2001-02-13 2002-08-28 Children`S Hospital Research Foundation Quantitative epstein barr virus pcr rapid assay
JP5232350B2 (ja) 2001-04-17 2013-07-10 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー Ｃａ１２５遺伝子のリピート配列並びに診断および治療的介入のためのその使用
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US20030083263A1 (en) 2001-04-30 2003-05-01 Svetlana Doronina Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
US20050107595A1 (en) 2001-06-20 2005-05-19 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US7803915B2 (en) 2001-06-20 2010-09-28 Genentech, Inc. Antibody compositions for the diagnosis and treatment of tumor
EP2298809A3 (en) 2001-07-12 2012-02-15 FOOTE, Jefferson Super humanized antibodies
US6737409B2 (en) 2001-07-19 2004-05-18 Hoffmann-La Roche Inc. Dolastatin 10 derivatives
US20040235068A1 (en) 2001-09-05 2004-11-25 Levinson Arthur D. Methods for the identification of polypeptide antigens associated with disorders involving aberrant cell proliferation and compositions useful for the treatment of such disorders
US7098305B2 (en) 2001-09-06 2006-08-29 Ardana Bioscience Limited Sustained release of microcrystalline peptide suspensions
ES2537074T3 (es) 2001-09-06 2015-06-02 Agensys, Inc. Ácido nucleico y proteína correspondiente denominados STEAP-1 útiles en el tratamiento y la detección de cáncer
NZ531674A (en) 2001-09-18 2009-03-31 Genentech Inc Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2003026577A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Seattle Genetics, Inc. P-amidobenzylethers in drug delivery agents
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
US20050238650A1 (en) 2002-04-17 2005-10-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
US20050123925A1 (en) 2002-11-15 2005-06-09 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20110045005A1 (en) 2001-10-19 2011-02-24 Craig Crowley Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
JP5355839B2 (ja) 2001-10-23 2013-11-27 ピーエスエムエー デベロプメント カンパニー， エル．エル．シー． Ｐｓｍａ抗体およびタンパク質マルチマー
EP1482972A4 (en) 2001-11-20 2005-11-23 Seattle Genetics Inc TREATMENT OF IMMUNOLOGICAL DISORDERS USING ANTI-CD30 ANTIBODIES
WO2003072736A2 (en) 2002-02-21 2003-09-04 Duke University Reagents and treatment methods for autoimmune diseases
EP2308898B1 (en) 2002-03-01 2016-06-08 Immunomedics, Inc. Internalizing anti-CD74 antibodies and methods of use
IL163902A0 (en) 2002-03-08 2005-12-18 Protein Design Labs Inc Antibodies against cancer antigen tmeff2 and uses thereof
WO2003080856A2 (en) 2002-03-19 2003-10-02 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
US20090068178A1 (en) 2002-05-08 2009-03-12 Genentech, Inc. Compositions and Methods for the Treatment of Tumor of Hematopoietic Origin
US20070207142A1 (en) * 2002-05-08 2007-09-06 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
AU2003245441A1 (en) 2002-06-12 2003-12-31 Avalon Pharmaceuticals, Inc. Cancer-linked gene as target for chemotherapy
CA2489792C (en) 2002-06-20 2012-05-15 Snaptrack Incorporated Reducing cross-interference in a combined gps receiver and communication system
EP2365004B1 (en) 2002-06-21 2016-01-06 Johns Hopkins University School of Medicine Membrane associated tumor endothelium markers
EP1536814A4 (en) 2002-07-03 2006-02-15 Immunogen Inc ANTIBODIES AGAINST MUC1 AND MUC16 NOT RELEASED AND USES THEREOF
CA2494104A1 (en) 2002-07-31 2004-04-22 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
AU2003263964C1 (en) 2002-07-31 2010-08-19 Seagen Inc. Drug conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
AU2003259163B2 (en) 2002-08-16 2008-07-03 Immunogen, Inc. Cross-linkers with high reactivity and solubility and their use in the preparation of conjugates for targeted delivery of small molecule drugs
CA2495389A1 (en) 2002-08-19 2004-02-26 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
AU2003287345A1 (en) 2002-10-31 2004-06-07 Genentech, Inc. Methods and compositions for increasing antibody production
AU2003282624A1 (en) 2002-11-14 2004-06-03 Syntarga B.V. Prodrugs built as multiple self-elimination-release spacers
EP1567556A4 (en) 2002-12-02 2006-03-22 Us Gov Health & Human Serv RECOMBINANT IMMUNOTOXIN AND USE IN THE TREATMENT OF TUMORS
CA2510315C (en) 2002-12-20 2014-01-28 Protein Design Labs, Inc. Antibodies against gpr64 and uses thereof
JPWO2004060919A1 (ja) 2002-12-26 2006-05-11 中外製薬株式会社 ヘテロ受容体に対するアゴニスト抗体
US20040191328A1 (en) 2002-12-31 2004-09-30 Warrell Raymond P. Combination of gallium compounds with nonchemotherapeutic anticancer agents in the treatment of neoplasia
WO2004065417A2 (en) 2003-01-23 2004-08-05 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
US20080025989A1 (en) 2003-02-20 2008-01-31 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders
CA2516455C (en) 2003-02-20 2012-05-01 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders
EP3000886A1 (en) 2003-03-19 2016-03-30 Amgen Fremont Inc. Antibodies against t cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (tim-1) antigen and uses thereof
US20110042260A1 (en) 2003-04-10 2011-02-24 Craig Crowley Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
US7755007B2 (en) 2003-04-17 2010-07-13 K&H Manufacturing, Inc Heated pet mat
US7432088B2 (en) 2003-05-08 2008-10-07 Immunogen Inc. Methods for the production of ansamitocins
US8088387B2 (en) * 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
WO2005044859A2 (en) 2003-11-05 2005-05-19 Glycart Biotechnology Ag Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
SI1725249T1 (sl) 2003-11-06 2014-04-30 Seattle Genetics, Inc. Spojine monometilvalina, sposobne konjugacije na ligande
JP4901478B2 (ja) 2003-11-17 2012-03-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド 造血系起源の腫瘍の治療のための組成物と方法
US20060204496A1 (en) 2003-11-28 2006-09-14 Tetsuo Kojima Agonist antibody against heteroreceptor
WO2005082023A2 (en) 2004-02-23 2005-09-09 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
EP1725586B1 (en) 2004-03-02 2015-01-14 Seattle Genetics, Inc. Partially loaded antibodies and methods of their conjugation
US7399469B2 (en) 2004-03-26 2008-07-15 Pdl Biopharma, Inc. Anti-LFL2 antibodies for the diagnosis, prognosis and treatment of cancer
WO2005101017A1 (en) 2004-04-07 2005-10-27 Genentech, Inc. Mass spectrometry of antibody conjugates
EP2286844A3 (en) 2004-06-01 2012-08-22 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
EP1756038A1 (en) 2004-06-02 2007-02-28 F.Hoffmann-La Roche Ag Synthesis of amino-alkoxy-heptanoic alkyl ester
DE602005023488D1 (de) 2004-06-17 2010-10-21 Mannkind Corp Tumorassoziierte antigenprofile in der krebsdiagnostik und immuntherapie
US7410772B2 (en) 2004-07-02 2008-08-12 Genentech, Inc. Compositions and methods for treatment of non-Hodgkin's lymphoma
AU2005271892A1 (en) 2004-07-10 2006-02-16 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for discovering antibodies specific to cancer cells and antibodies discovered thereby
DK1773885T3 (da) 2004-08-05 2010-08-16 Genentech Inc Humaniserede anti-c-met-antagonister
WO2006034488A2 (en) 2004-09-23 2006-03-30 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
JP2008515889A (ja) 2004-10-05 2008-05-15 ジェネンテック・インコーポレーテッド 毒性の低下した治療剤
CA2586909A1 (en) 2004-11-12 2006-12-14 Seattle Genetics, Inc. Auristatins having an aminobenzoic acid unit at the n terminus
DE602005022928D1 (de) 2004-11-30 2010-09-23 Abgenix Inc Antikörper gegen gpnmb und ihre verwendungen
JP4993645B2 (ja) 2004-12-01 2012-08-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗体薬剤結合体および方法
US7947839B2 (en) 2004-12-01 2011-05-24 Genentech, Inc. Heterocyclic-substituted bis-1,8 naphthalimide compounds, antibody drug conjugates, and methods of use
US20070134243A1 (en) 2004-12-01 2007-06-14 Gazzard Lewis J Antibody drug conjugates and methods
KR20070086128A (ko) 2004-12-13 2007-08-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 3-피롤리딘-2-일-프로피온산 유도체의 신규 제조 방법
EA200701211A1 (ru) 2004-12-31 2007-12-28 Дженентек, Инк. Полипептиды, которые связываются с br3, и их применение
US7301019B2 (en) 2005-01-21 2007-11-27 Immunogen, Inc. Method for the preparation of maytansinoid esters
AU2006210837B2 (en) 2005-01-31 2012-07-12 Genentech, Inc. Anti-EphB2 antibodies and methods using same
JP2008535823A (ja) 2005-03-25 2008-09-04 キュラジェン コーポレイション テネイシンの主要な抗原に対する抗体
CA2611778C (en) 2005-06-20 2012-11-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
AU2006262231B2 (en) 2005-06-20 2013-01-24 Psma Development Company, Llc PSMA antibody-drug conjugates
EP3498289A1 (en) 2005-07-07 2019-06-19 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine side-chain modifications at the c-terminus
WO2007008848A2 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus
CA2616005C (en) 2005-07-18 2015-09-22 Seattle Genetics, Inc. Beta-glucuronide-linker drug conjugates
CA2617953C (en) 2005-08-09 2013-12-17 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Method of acylating maytansinol with chiral amino acids
JP2009506790A (ja) 2005-09-07 2009-02-19 メディミューン，エルエルシー 毒素とコンジュゲートしたｅｐｈ受容体抗体
JP5129143B2 (ja) 2005-10-07 2013-01-23 エグゼリクシス， インコーポレイテッド Ｍｅｋインヒビターおよびその使用方法
US20090226465A1 (en) 2005-10-31 2009-09-10 Jackson David Y Macrocyclic depsipeptide antibody-drug conjugates and methods
EP1957115B8 (en) 2005-11-10 2014-03-05 Celldex Therapeutics, Inc. Method of treating ovarian and renal cancer using antibodies against t cell immunoglobulin domain and mucin domain 1 (tim-1) antigen
WO2007062138A2 (en) 2005-11-23 2007-05-31 Applera Corporation Methods and compositions for treating diseases targeting human prominin-1(cd133)
AU2006342792A1 (en) 2005-12-02 2007-11-08 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of diseases and disorders associated with cytokine signaling involving antibodies that bind to IL-22 and IL-22R
DOP2006000277A (es) 2005-12-12 2007-08-31 Bayer Pharmaceuticals Corp Anticuerpos anti mn y métodos para su utilización
US7750116B1 (en) 2006-02-18 2010-07-06 Seattle Genetics, Inc. Antibody drug conjugate metabolites
AR059900A1 (es) 2006-03-17 2008-05-07 Genentech Inc Anticuerpos anti-tat226 e inmunoconjugados
US8263038B2 (en) 2006-04-18 2012-09-11 Delta-Energy Holdings, Llc Method of devolatilizing recycled carbon black and associated method
MX2008015132A (es) 2006-05-30 2008-12-10 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados y sus usos.
US9382327B2 (en) 2006-10-10 2016-07-05 Vaccinex, Inc. Anti-CD20 antibodies and methods of use
PL2099823T5 (pl) 2006-12-01 2023-02-20 Seagen Inc. Wariant środków wiążących cel i jego zastosowania
WO2009012256A1 (en) 2007-07-16 2009-01-22 Genentech, Inc. Humanized anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
DK2474557T3 (da) 2007-07-16 2014-11-10 Genentech Inc Anti-CD79b-antistoffer og immunkonjugater og fremgangsmåder til anvendelse
JP5485897B2 (ja) 2007-10-12 2014-05-07 シアトル ジェネティクス，インコーポレーテッド 抗体−薬物複合体の併用療法
KR101658083B1 (ko) 2007-10-19 2016-09-30 시애틀 지네틱스, 인크. 씨디19 결합제 및 그의 용도
DK2657253T3 (en) 2008-01-31 2017-10-09 Genentech Inc Anti-CD79b antibodies and immune conjugates and methods of use
WO2009099741A1 (en) 2008-02-01 2009-08-13 Genentech, Inc. Nemorubicin metabolite and analog reagents, antibody-drug conjugates and methods
TWI409079B (zh) 2009-08-14 2013-09-21 Roche Glycart Ag 非典型岩藻醣化ｃｄ２０抗體與苯達莫斯汀（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）之組合療法
JP2013505944A (ja) 2009-09-24 2013-02-21 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド Ｄｒ５リガンド薬物結合体
EA031737B1 (ru) 2010-06-03 2019-02-28 Фармасайкликс, Инк. Применение ингибиторов тирозинкиназы брутона (btk) для лечения лейкоза и лимфомы
MA37840B1 (fr) 2012-07-09 2020-05-29 Genentech Inc Immunoconjugués comprenant des anticorps anti-cd79b
WO2014039855A1 (en) 2012-09-07 2014-03-13 Genentech, Inc. Combination therapy of a type ii anti-cd20 antibody with a selective bcl-2 inhibitor
WO2015084892A1 (en) 2013-12-02 2015-06-11 Cornell University Methods for treating b cell proliferative disorders
PT3262071T (pt) 2014-09-23 2020-06-16 H Hoffnabb La Roche Ag Métodos de utilização de imunoconjugados anti-cd79b
BR112017011326A2 (pt) 2014-12-05 2018-07-31 Genentech, Inc. anticorpo, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, método para produzir o anticorpo, imunoconjugado, composição farmacêutica, usos do anticorpo, métodos para tratar ou retardar a progressão de distúrbio proliferativo celular e para intensificar a função imune

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