200400827 (1) 玖、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於抑制產生佛羅毒素（verotoxin )用劑。 更詳細而言，本發明係關於可作爲可抑制大腸桿菌〇 -157等之產生佛羅毒素菌所產生佛羅毒素的量之醫藥品、 特定保健用食品或健康食品等使用之抑制產生佛羅毒素用 劑。 【先前技術】 19 96年，起因爲腸管出血性大腸桿菌之食物中毒， 於曰本全國發生，因腸管出血性大腸桿菌之溶血性尿毒症 症候群（HU S )或腦症等之發病成爲社會問題。認爲因產 生佛羅毒素菌之一種之腸管出血性大腸桿菌所引起之食物 中毒之腹瀉、血便、HUS及腦症係因所產生之佛羅毒素 (VT)而引起者。該佛羅毒素會引起人體之危篤症狀。 佛羅毒素有VT1及VT2之2種，兩者均具有阻礙真核細 胞合成蛋白質之作用。亦即，佛羅毒素係細菌侵入感染動 物腸管中之上皮細胞，將細胞內之28s rRNA (核糖體 RNA，Ribosomal RNA)之特定的腺嘌D令殘基（adenine residue)及核糖殘基間之N—糖苷鍵結（N-glycosidic bond) 水解而破壞其機能，中止該細胞之合成蛋白質機能而使該 細胞死亡。其結果爲，腸管上皮細胞脫落而發生腹瀉或出 血。另外，有時佛羅毒素侵入血管內而攻擊血管內皮細 胞，因而引起腎障礙，發生溶血性尿毒症症候群（HUS ) (2) (2)200400827 等之危篤疾病。 於曰本曾經大流行之腸管出血性大腸桿菌之80 %以 上爲 Escherichia coli 0157:H7，其他亦發現包含腸管出 血性大腸桿菌之 Escherichia coli 0157:H—、0111 : Η -、026: Η1 1、0 128 ： Η2、01 ： Η20、018 ： Η -、 0114: Η19及 0115: Η10等之多種大腸桿菌。另外，佛 羅毒素不僅於大腸桿菌，已知於細菌性赤痢、甲氧西林 (methicillin) 耐藥性金黃色葡萄球菌（MRSA)及萬古黴 素（vancomycin )耐藥性腸球菌（VRE )中亦可產生。 爲預防及治療因如此產生佛羅毒素菌所產生之佛羅毒 素所引起的疾病，關於以Escherichia coli 0157:117爲首 之產生佛羅毒素菌之檢測方法、解析疾病發病之作用機制 或有效的治療方法之硏究逐漸進行，但仍未發現充份抑制 發病的方法，希望能確立有效的抑制發病的方法。尤其， 因產生佛羅毒素菌所產生之佛羅毒素所引起的疾病之發 病，多爲免疫機能低之乳幼兒或老人，所以希望提供即使 此等乳幼兒或老人亦容易攝取，而且副作用少之安全的抑 制產生佛羅毒素用劑。 至今之硏究，揭示聚合度爲3至20之環狀及/或鏈狀 之聚L -乳酸混合物，作爲抗惡性腫瘍劑係有效的（特開 平9-227388號公報及特開平10— 130153號公報）。然 而，並未揭示聚合度爲3至20之環狀及/或鏈狀之聚乳酸 混合物對於佛羅毒素之產生量所造成的效果。 (3) (3)200400827 【發明內容】 發明之揭示 本發明係以提供可抑制例如大腸桿菌〇 — 1 5 7等之產 生佛羅毒素菌所產生之佛羅毒素的量之新穎的抑制產生佛 羅毒素用劑爲應解決之課題。本發明並且以提供利用上述 之抑制產生佛羅毒素用劑之抑制產生佛羅毒素用之飮食品 爲應解決之課題。 本發明者等，以解決上述課題爲目的而進行檢討，將 聚合度爲3至20之環狀及/或鏈狀之聚乳酸混合物投予無 菌鼠’測定大腸桿菌Ο - 1 5 7所產生之佛羅毒素的量。其 結果認定上述之聚乳酸混合物可抑制佛羅毒素的產生量而 改善感染0—157小鼠之生存率。本發明係基於這些發現 而完成者。 亦即，依據本發明而提供含有聚合度爲3至20之環 狀及/或鏈狀之聚乳酸混合物之抑制產生佛羅毒素用劑。 本發明之抑制產生佛羅毒素用劑係以可使用於抑制〇 -157等之腸管出血性大腸桿菌產生佛羅毒素用爲宜。 聚乳酸中之重覆單位之乳酸，實質上係由L —乳酸所 形成爲宜。 聚合度爲3至20之環狀及/或鏈狀之聚乳酸混合物， 係將丙交酯於式（3 ) : Me — N ( W ) ( R2 )(式中，Me 係表示鹼金屬。R1及R2係表示分別獨立之脂肪族基或芳 香族基。）所表示之化合物之存在下聚合所製成之聚乳酸 混合物爲宜。 -6- (4) (4)200400827 上述式中之Me係以鋰爲宜。上述式中之R1及R2係 以分別獨立之碳原子數爲1至6個之烷基爲宜。以上述中 之Me爲鋰，R1及R2爲異丙基尤佳。 依據本發明之另一方面，提供含有上述本發明之抑制 產生佛羅毒素用劑之抑制產生佛羅毒素用之飮食品。 依據本發明之另一方面，提供於製造抑制產生佛羅毒 素用劑或抑制產生佛羅毒素用之飮食品中，使用聚合度爲 3至20之環狀及/或鏈狀之聚乳酸混合物。 依據本發明之另一方面，提供包括將有效量之聚合度 爲3至20之環狀及/或鏈狀之聚乳酸混合物，投予人類等 之哺乳動物之抑制產生佛羅毒素用之方法。 用以實施發明之最佳型態 以下係詳細說明本發明之實施型態及實施方法。 本發明之抑制產生佛羅毒素用劑係含有聚合度爲3至 20之環狀及/或鏈狀之聚乳酸混合物爲有效成份，例如可 使用以抑制大腸桿菌Ο - 157等之產生佛羅毒素菌所產生 佛羅毒素的量。本發明之抑制產生佛羅毒素用劑係可作爲 起因於感染產生佛羅毒素菌之疾病之治療劑或預防劑使 用。 本說明書中所提及之產生佛羅毒素菌之種類，並無特 別的限制。例如，作爲產生佛羅毒素之大腸桿菌，〇 _ 157之其他例，可舉例如表示〇— 1、〇一 18、0— 26、0 — 68、0-111' 0-114、0-115、0-119、0-128、0- (5) (5)200400827 138及Ο— 145等之血淸型之菌。另外，作爲產生佛羅毒 素之赤痢菌（細菌性赤痢），可舉例如志賀氏痢疾桿菌 (Shigella dysenteriae )、弗萊斯納志賀氏菌（Shigella flexneri)、保地氏志賀氏菌（Shigella boydii)及宋納志 賀氏菌（Shigella sonnei)等。作爲其他之產生佛羅毒素 菌，可舉例如甲氧西林（methicillin)耐藥性金黃色葡萄 球菌（MRSA)及萬古黴素（vancomycin)耐藥性腸球菌 (VRE)等。 其中，大腸桿菌爲構成健康人之腸內菌叢之一種菌 種，部份得到特殊病源因子產生能之大腸桿菌引起人腸管 感染症。全國各地發生多起之集體發生之腸管出血性大腸 桿菌（EHEC) 0— 157: H7感染症之1996年以後，雖然 集體發生之件數減少，分散個例依然持續著。EHEC係產 生對於來自非洲綠猴之腎臟細胞之佛羅細胞，顯示強烈細 胞毒性之佛羅毒素爲主要的病源因子，感染時，約5%之 病例，多成爲溶血性尿毒症症候群或極少數倂發腦症之危 篤狀況。本發明之抑制產生佛羅毒素用劑，尤其可使用於 抑制腸管出血性大腸桿菌0 - 1 5 7所產生的毒素。 本發明之抑制產生佛羅毒素用劑對於抑制產生佛羅毒 素菌所產生的毒素係有效的，於感染該菌前，亦可預先攝 取。因此，本發明之抑制產生佛羅毒素用劑係以作爲健康 食品或醫藥品，於日常生活中攝取爲宜。 本發明之抑制產生佛羅毒素用劑以及抑制產生佛羅毒 素用之飮食品中，使用聚合度爲3至20之環狀及/或鏈狀 -8 - 200400827 之聚乳酸混合物爲有效成份。 本說明書中所謂「聚乳酸混合物」係指聚合度爲3至 20之環狀及/或鏈狀之聚乳酸以任何比率下存在之混合 物。亦即，所謂「混合物」之用語係指具有任何聚合度爲 3至20之聚乳酸之混合物的同時，亦作爲包含環狀及/或 鏈狀之聚乳酸之混合物之槪念使用。如此之「聚乳酸混合 物」係如本說明書中以下所述，可脫水聚合乳酸，以適當 的方法精製而得之。另外，本說明書中，於方便上，使用 「聚乳酸混合物」之用語，但其中亦包含具有一定聚合度 之環狀聚乳酸或具有一定聚合度之鏈狀聚乳酸之單一成份 所形成之聚乳酸。 所謂聚合度係指於聚乳酸中，重覆單位之乳酸單位之 數量。例如，推測環狀聚乳酸具有下述之構造式，式中之 η係表示聚合度（亦即，n=3至20)。
本說明書中僅稱爲「乳酸」時，該乳酸係包含全部的 L -乳酸、D -乳酸或此等之任何比例之混合物。本發明 中之乳酸係貫質上以L -乳酸所形成爲宜。在此，所謂 「實質上」係指聚乳酸混合物中之L 一乳酸單位之比率 [亦即’ （L 一乳酸單位數/ L ~乳酸單位數+ D —乳酸單位 -9- (7) (7)200400827 數）x 1 00]，例如爲70%以上，以80%以上爲宜，以85 %以上尤佳，以90%以上更好，尤其以95%以上最好。 另外，聚乳酸混合物中之L -乳酸單位之比率係依作爲開 始物質使用之乳酸中所存在之 L -乳酸及D -乳酸之比 率而定。 聚合度爲3至20之環狀及/或鏈狀之聚乳酸混合物之 製造方法，並無特別的限制，例如，依據特開平 9 -227388號公報、特開平10 - 130153號公報、或特願平11 — 3 9894號說明書（包含全部引用此等專利說明書所記載 之內容，作爲本說明書之揭示。）等所記載之製造方法而 可得之。 更具體而言，例如，聚合度爲3至20之環狀及/或鏈 狀之聚乳酸混合物係依據下述之方法A而可得之。 方法A : 首先，將乳酸（實質上以L -乳酸所形成之乳酸爲 宜）於不活性環境下脫水聚合。作爲不活性環境下，可舉 例如氮氣及氬氣等，以使用氮氣爲宜。 脫水聚合反應係於常壓至1 mmHg程度的減壓下，以 110至210°C，以130至190°C爲宜之溫度下進行，依據 階段性地減壓及階段性地升溫進行尤佳。反應時間可適當 地設定，可進行如1至2 0小時之反應。使用階段性地減 壓及階段性地升溫時，將反應時間分爲2部份以上之反應 時間，於各部份，設定壓力及溫度進行反應。使用階段性 -10 - (8) (8)200400827 地減壓時，例如可減壓爲常壓->150mmHg-^3mmHg，使用 階段性地升溫時，例如可升溫爲1 4 5 °C — 1 5 5 °C — 1 8 5 °C。 實際上，組合這些時，例如可於1451之常壓下3小時， ]45°C之150mmHg下3小時，155°C之3mmHg下3小時及 185°C之3mmHg下1.5小時，進行反應。 其次，依據此脫水聚合反應所得之反應混合物中，加 入乙醇及甲醇，過濾後，乾燥濾液而可得到可溶於乙醇及 甲醇之部份。亦即，本說明書中所謂「可溶於乙醇及甲醇 之部份」係指可溶於乙醇及甲醇之混合液之部份。另外， 得到可溶於乙醇及甲醇之部份時，脫水聚合反應之反應混 合物係與乙醇及甲醇混合，此時，可適當地設定乙醇及甲 醇之混合比率，例如乙醇：甲醇=1: 9。另外，反應混合 物中添加乙醇及甲醇之順序及方法等並無限制，可適當地 選擇，例如於脫水聚合反應之反應混合物中，可先添加入 乙醇，其次再添加甲醇。 將上述所得之可溶於乙醇及甲醇之部份，交予逆相管 柱層析儀，尤其係使用OctaDecylSilane ( ODS )管柱之層 析儀，首先除去以pH爲2至3之25至50重量％之乙腈 水溶液所溶離的部份，其次，採取以pH爲2至3之90 重量％以上之乙腈水溶液，以99重量％以上之乙腈水溶 液爲宜，所溶離出之部份，而得到聚合度爲3至2 0之環 狀及/或鏈狀之聚乳酸混合物。 如上述所得之環狀及/或鏈狀之聚乳酸混合物係以氫 氧化鈉等之鹼性物質中和，減壓乾燥後，可依據常法，製 -11 - 200400827 Ο) 劑化成如下所述之所需型態。 製造本發明所使用之聚合度爲3至20之環狀及/或鏈 狀之聚乳酸混合物用之其他方法，可舉例如特願平η — 265 7 1 5號說明書所記載之方法（爲方法B)或特願平„ 一 265 732號說明書所記載之方法（爲方法C )(包含全部 引用此等專利說明書所記載之內容，作爲本說明書之揭 示。）。以下，具體地說明方法B及方法C。 方法B : 本方法係將丙交酯以RYLi(式中，R係表示脂肪族 基或芳香族基’ Y係表示氧原子或硫原子）所表示之鋰化 物之存在下，使之聚合之製造環狀乳酸低聚物之方法。實 施聚合反應時，鋰化物（RYLi )之使用比率係相當於每1 莫耳之丙交酯爲1至0.1莫耳，以0.2至0.3莫耳之比率 爲宜。反應溫度係一100至0°C，以—78至一50°c爲宜。 反應係以- 78至-5(TC之溫度開始，實施係以緩緩地升 溫至室溫爲宜。反應係於反應溶媒之存在下實施爲宜。作 爲反應溶媒，可使用四氫呋喃等之環狀醚以外，如二乙基 醚及二甲氧基乙烷等。作爲反應氣體，可使用氮氣或氬氣 等之不活性氣體環境。反應壓力並無特別的限制，以常壓 爲宜。 另外，如上述所得之乳酸低聚物之組成（環狀乳酸低 聚物及鏈狀乳酸低聚物之比率）係依作爲反應助劑使用之 鋰化物而變動。使用碳原子數爲1至3個之烷基醇之鋰化 -12- (10) (10)200400827 物（ROLi)(式中之R係碳原子數爲1至3個之烷基） 作爲鋰化物時’可得到環狀乳酸低聚物及鏈狀低聚物之混 合物（環狀乳酸低聚物之比率：80至85重量％)。另一 方面，使用如叔丁醇等之碳原子數爲4個以上之烷基醇之 鋰化物作爲鋰化物或苯硫酚化合物時’實質上可選擇性地 僅得到環狀乳酸低聚物。 方法C : 本方法係以 (I )將乳酸於3 5 0至400mmHg之壓力條件下，於 120至140°C之範圍之溫度加熱，使之脫水聚合，並且不 餾出丙交酯而僅餾出除去副生成物水之第1加熱步驟， (E )於第1加熱步驟終了後，將反應生成物加熱至 150至160 °C之溫度，將該反應壓力，以降壓速度0.5至 lmmHg/分，降低至15至20mmHg，並且於降壓之際，避 免丙交酯的餾出而僅餾出除去副生成物水，該反應壓力降 至15至20mmHg後，於同壓力條件及反應溫度150至 160 °C下，再繼續進行反應，而生成以鏈狀乳酸低聚物爲 主要成份之脫水聚合物之第2加熱步驟， (皿）該第2加熱步驟終了後，於0.1至3mmHg之 壓力條件下，於1 50至1 60°C下加熱，環化該鏈狀乳酸低 聚物而生成環狀低聚物之第3加熱步驟， 所形成爲特徵之方法。 本方法係首先於第〗加熱步驟中，於減壓下加熱乳 -13- (11) (11)200400827 酸’進行脫水聚合反應。此時之反應時間爲3至12小 時’以5至6小時爲宜。此第1加熱下之反應，爲使該反 應順利地進行，將乳酸之脫水聚合時所生成之副生成物水 餾去’此時係於不餾去爲2分子乳酸之脫水聚合物之丙交 酯下實施。因此，將反應壓力減壓，以保持300至 500mmHg爲宜，以保持3 5 0至4 0 0 m m H g尤佳，於此壓力 條件下，於100至140 °C，以130至140 °C之範圍加熱爲 宜。依據此第1反應步驟中之反應，主要係生成以3至 23個乳酸分子之脫水聚合物爲主要成份之反應生成物。 上述之第1加熱步驟終了後，於第2加熱步驟中，爲 得到提升平均聚合度之低聚物，加熱成比上述之第1加熱 步驟中之反應溫度較高之溫度，以145至180 °C爲宜，以 150至160 °C之溫度尤佳，並且降低反應壓力至10至 5 0mmHg，以15至20mmHg之壓力爲宜，再繼續脫水聚合 反應。 此反應亦與上述之第1加熱步驟之反應時同樣地，爲 使反應順利地進行，於餾去副生成物水，不餾去丙交酯之 條件下實施。將反應壓力降低至上述壓力範圍之速度（降 壓速度），爲避免餾出丙交酯而且提高反應效率，通常必 須保持於0.25至5mmHg/分，以0.5至ImmHg /分之範圍 爲宜。比上述範圍低之降壓速度時，因降壓至所定壓力之 所需時間變長，並不適宜，另一方面，比上述範圍高之降 壓速度時，因爲丙交酯亦隨著副生成物水餾去，並不適 宜。 -14- (12) (12)200400827 反應壓力降低至所定壓力後，於此反應壓力下，再繼 續進行反應。此時之加熱時間爲3至1 2小時，以5至ό 小時爲宜。 依據上述之第2加熱步驟之反應，得到平均聚合度爲 3至3 0，以3至2 3之乳酸低聚物爲宜，此時之低聚物中 之環狀低聚物之比率通常爲70至80重量％程度。 上述之第2加熱步驟終了後，於第3加熱步驟中，保 持反應壓力於0.25至5mmHg，以0.5至1mmHg爲宜，於 145至180°C，以150至16(TC爲宜之溫度下，再繼續進 行反應。反應時間爲3至12小時，以5至6小時爲宜。 此時亦餾去所生成之副生成物水。雖然此時以避免亦餾去 丙交酯爲宜，因爲反應生成物幾乎不含有丙交酯，所以其 降壓速度並不需要特別慢。 依據上述之第3加熱步驟之反應，生成平均聚合度爲 3至30，以3至23爲宜，而且環狀低聚物之比率爲90重 量％以上，以9 9重量％以上之乳酸低聚物尤佳。 方法D : 本發明中最適宜之型態，係使用將丙交酯於式 (3) ： Me- N ( R1 ) ( R2 )(式中，Me係表示鹼金屬。 R1及R2係表示分別獨立之脂肪族基或芳香族基。）所表 示之化合物之存在下聚合所製成之聚乳酸混合物。以下係 說明關於式（3) : Me— NCR1) (R2)。 於式（3)中，Me係表示鹼金屬。R1及R2係表示分 -15- (13) (13)200400827 別獨立之脂肪族基或芳香族基。R】及R2係表示分別獨立 之脂肪族基或芳香族基。 在此作爲脂肪族基，可舉例如碳原子數爲1至12 個’以1至6個爲宜之直鏈狀、支鏈狀、環狀或其組合之 飽和或不飽和之脂肪族烴基，具體上可舉例如甲基、乙 基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、辛基及 十二基等之烷基、環丙基、環丁基' 環辛基及環十二基等 之環烷基。脂肪族基亦可爲具有雙重鍵結或三重鍵結之不 飽和烴基。 在此作爲芳香族基，可舉例如碳原子數爲6至30 個，以6至20個爲宜，以6至12尤佳，以6至10之芳 基及芳烷基最好。作爲芳基，可舉例如苯基、甲苯基及萘 基，作爲芳烷基，可舉例如苄基、苯乙基及萘甲基等。 脂肪族基或芳香族基亦可具有1個以上之取代基。取 代基之種類並無特別的限定，可舉例如直鏈或支鏈或環狀 之烷基、直鏈或支鏈或環狀之烯基、直鏈或支鏈或環狀之 炔基、芳基、醯氧基、烷氧羰氧基、芳氧羰氧基、氨基甲 醯氧基、羰醯胺基、磺胺基、氨基甲醯基、氨磺醯基、烷 氧基、芳氧基、芳氧羰基、烷氧羰基、N—醯基氨磺醯 基、N -氨磺醯基氨基甲醯基 '烷基磺醯基、芳基磺醯 基、烷氧基羰胺基、芳氧基羰胺基、胺基、銨基、氰基、 硝基、羧基、羥基、磺基、氫硫基、烷基亞硫醯基、芳基 亞硫醯基、烷基硫基、芳基硫基、脲基、雜環基（例如含 有至少1個以上之氮、氧及硫等之3至12個圓環之單 -16- (14) (14) 200400827 環、聚合環）、雜環氧基、雜環硫基、醯基 '氨磺醯胺 基、甲矽烷基及鹵原子等。上述中之烷基 '烯基、炔基及 烷氧基之碳原子數一般爲1至12個，以1至6個爲宜， 芳基之碳原子數一般爲6至20個，以6至10個爲宜。 式（3 )中’ M e係表示鹼金屬。作爲鹼金屬，可舉例 如鋰、鈉或鉀，以鋰爲宜。 以式（3)所表示之化合物中，具有不對稱碳原子 者’分別爲（R)體、（S)體或（R)體、（S)體之任 何者均可。 以式（3 )所表示之鹼金屬化合物之取得方法，並無 特別的限制’只要係該業者即可適當地取得。可使二異丙 月女等之一丨兀基ffe與正丁鋰等之院基化驗金屬反應而得之。 更具體而言’此反應係例如於氮氣環境下等之反應，於不 活性之條件下’於THF等之不活性溶媒中含有二烷基胺 之溶液’與己烷等之不活性溶媒中含有烷基化鹼金屬之溶 液混合攪拌而可進行。反應溫度係只要反應進行，並無特 別的限制’但以一 7 8 t至室溫爲宜。反應時間能適當地設 /^-r 疋〇 丙交醋於式（3)之化合物之存在下進行聚合時，式 (3)之化合物（Me-NCR1) (R2))之使用量，相當 於每1莫耳之丙交酯係以1至莫耳爲宜，以〇.2至 〇 . 3莫耳尤佳。 Μ Θ丙交酯之聚合反應時之反應溫度係只要反應進 行’並無特別的限制，但以-1 〇〇。(：至室溫爲宜，以—78 -17- (15) 200400827 °C至室溫尤佳。 丙交酯之聚合反應係於反應溶媒之存在下實施爲宜。 反應溶媒係只要對反應爲不活性溶媒，並無特別的限制， 可使用四氫夫喃等之環狀醚、二乙基醚及二甲氧基乙烷 等。作爲反應氣體，可使用氮氣或氬氣等之不活性氣體環 境。反應壓力並無特別的限制，以常壓爲宜。 上述方法所得之鏈狀及環狀乳酸低聚物混合物之組成 係依作爲反應助劑使用之式（3 )之化合物之種類或反應 條件等而變化，但以鏈狀低聚物之含量比環狀乳酸低聚物 高爲宜。 依據上述之方法，下述式（1)或式（2): 0
(式中，m係表示1至18之整數，η係表示1至18 之整數） 所表示之所製造之鏈狀及環狀乳酸低聚物混合物。 另外，上述方法之A、Β、C及D係僅表示本發明所 使用之聚乳酸混合物之製造方法之具體例之一部份者，本 發明亦可使用其他方法所製造之聚乳酸混合物。 本發明之抑制產生佛羅毒素用劑，於上述之必須成份 加上，因應需要時，於不損及本發明功效之範圍內，任意 -18- (16) (16)200400827 選擇及倂用醫藥品類 '醫藥部外用品類等之製劑所使用之 成份或添加劑而可製造。本發明之抑制產生佛羅毒素用劑 係除了可作爲單獨的醫藥品類使用以外，亦可配合醫藥品 類、醫藥部外用品類等使用。 本發明之抑制產生佛羅毒素用劑的型態並無特別的限 制’可由經口投予或非經口投予用之製劑型態中，選擇最 適合目的之適合型態者。 適合經口投予之製劑型態，可舉例如錠劑、膠囊劑、 散劑、口服液劑、顆粒劑、細粒劑、糖漿劑、溶液劑、乳 劑、懸濁劑及口嚼劑等，適合非經口投予之製劑型態，可 舉例如注射劑（皮下注射、肌肉注射或靜脈內注射等）、 外用劑、點滴劑、吸入劑及噴霧劑等，但不以此爲限。 適合經口投予之液體製劑，例如溶液劑、乳劑或糖漿 劑等係可使用水、蔗糖、山梨糖醇及果糖等之糖類、聚乙 二醇及丙二醇等之甘醇類、芝麻油及大豆油等之油類、對 羥基苯甲酸酯等之防腐劑、草莓香料及薄荷等之香料類而 製造。另外，於製造膠囊劑、錠劑、散劑或顆粒劑等之固 體製劑時，可使用乳糖、葡萄糖、蔗糖及甘露糖醇等之賦 形劑、澱粉及褐藻酸蘇打等之崩壞劑、硬脂酸鎂及滑石等 之滑澤劑、聚乙烯醇、羥丙基纖維素及明膠等之結合劑、 脂肪酸酯等之界面活性劑及甘油等之可塑劑等。 適合非經口投予之注射用或點滴用之製劑係與接受者 之血液成等張之滅菌性溶媒中，以溶解或懸濁狀態含有有 效成份之上述之物質。例如注射劑時，可使用鹽溶液 '葡 -19- (17) (17)200400827 萄糖溶液或鹽水及葡萄糖溶液之混合物所形成之水性溶媒 等而調製成溶液。腸內投予用之製劑，例如可使用可可 脂、氫化脂肪或氫化羧酸等之載體而調製成座劑提供。另 外，製造噴霧劑時，可將有效成份之上述物質分散成微細 粒子，可使用不剌激接受者之口腔及氣道粘膜，而且容易 吸收有效成份之載體。作爲載體，具體上可舉例如乳糖或 甘油等。因應有效成份之物質及所使用載體之性質，可調 製氣凝膠或乾燥粉末等型態的製劑。此等非經口投予用製 劑中’亦可添加1種或2種以上選自甘醇類、油類、香料 類、防腐劑、賦形劑、崩壞劑、滑澤劑、結合劑、界面活 性劑及可塑劑等之飮食品。 本發明之抑制產生佛羅毒素用劑之投予量及投予次數 係因應包括投予目的、投予型態、攝取者的年齡' 體重或 性別等之條件等之各種主要因素而可適當地設定，一般而 言，有效成份之投予量係每日爲1至10,〇〇〇mg/kg，以10 至2000 mg/kg爲宜，以1〇至200mg/kg尤佳。上述之投 予量之製劑係以1日分爲1至4次程度投予爲宜。 本發明之抑制產生佛羅毒素用劑之投予時期並無特別 的限制，感染產生佛羅毒素菌前或感染後均可。 本發明另外亦關於含有聚合度爲3至20之環狀及/或 鏈狀之聚乳酸混合物之抑制產生佛羅毒素用之飮食品。本 發明中所使用之聚合度爲3至20之環狀及/或鏈狀之聚乳 酸混合物係不僅如上述之單獨製劑之型態使用，亦可配合 飮食物中使用。 -20- (18) (18)200400827 本發明之抑制產生佛羅毒素用劑用之飲食品係只要不 分解聚乳酸混合物而可配合者，其配合型態並無特別的限 制。 本發明之抑制產生佛羅毒素用劑用之飮食品製品之具 體例，可舉例如一般稱爲淸涼飮料'口服液劑' 健康食 品、特定保健用食品、機能性食品、機能活性型食品、營 養補助食品、營養補助品、飼料及飼料添加物等之包含飮 料之健康食品或補助食品。 飮食品之具體例，可舉例如口香糖、巧克力、糖果、 糖錠、果凍、軟式餅乾、硬式餅乾及優酪乳等之點心類、 冰淇淋及冰果等之冰品類、茶、淸涼飲料（包含果汁、咖 啡及可可等）、營養口服液劑及美容口服液劑等之飮料、 麵包 '火腿、湯、果醬、義大利麵及冷凍食品等之任何飮 食品。或是’本發明中所使用之聚乳酸混合物亦可添加於 調味料或食品添加劑等使用。依據攝取本發明之抑制產生 佛羅毒素用之飮食品，可發揮抑制產生佛羅毒素的功效， 可提供實質上不顯示有害副作用之安全飮食品。 本發明之抑制產生佛羅毒素用劑用之飮食品係可將聚 乳酸混合物直接混合、分散於一般使用於食品之原料後， 以已知之方法，加工成所需型態而得之。 本發明之抑制產生佛羅毒素用劑用之飮食品係包含所 有型態之飲食品者，其種類並無特別的限制，如上述之各 種飲食物、或各種營養組成物，例如各種之經口或經腸營 養劑或飮料等中，可配合本發明之抑制產生佛羅毒素用 -21 - (19) 200400827 劑，作爲飮食品而提供。如此之飮食品之組成係可除了聚 合度爲3至20之環狀及/或鏈狀之聚乳酸混合物之外，並 包含蛋白質、脂質、糖質、維生素及/或礦物質類等。飮 食品之型態並無特別的限制，只要爲容易攝取之型態，任 何固體、粉末、液體、膠狀及漿狀等均可。 飲食品中之聚乳酸混合物之含量並無特別的限制，一 般爲0.1至20重量％，以0.1至10重量％程度尤佳。 飮食品中所包含之聚乳酸混合物的量係以包含可發揮 本發明之目的之抑制產生佛羅毒素的作用程度爲宜，每餐 份所攝取之飮食物中以O.ig至log程度爲宜，以0.5g至 3 g程度尤佳。 [實施方式】 依據下述之實施例更具體地說明本發明，但本發明之 所有內容並不局限於實施例。 實施例 製造例1 :聚乳酸混合物（以下亦稱爲CPL )之製造 製造例1之反應圖如下所示。 ΗΝ(ΑΡγ〉2 ch3ch2ch2ch2u LiN(APr)2 + CH3CH2CH2CH3
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於氮氣環境’ 〇°C下’ O.lOlg(lmmol)之二異丙胺之 5ml之THF溶液中，加入〇.63ml(lmmol)之正丁鋰（1.6M 之己烷溶液），攪拌10分鐘成二異丙胺鋰（LDA)後， 加入0.577g(4mmol)之L—(—)丙交醋之4ml之THF溶 液，攪拌1 5分鐘，使之反應。該反應混合物中，加入 20ml之飽和氯化銨水溶液，處理反應，再加入l〇ml的 水。以THF ( 5 0ml )萃取5次，將有機層以無水硫酸鈉乾 燥。過濾無水硫酸鈉後，將有機溶媒減壓濃縮，而得 〇 . 5 3 g之粗生成物。所得之粗生成物，加入6 m丨之乙醚， 於超音波洗淨器浸漬10分鐘後過濾，而得0.39g之融點 爲125至129 °C之白色固體生成物。 所得生成物之物性資料如圖1至圖7所示。由圖1至 圖7所示之FABMS及NMR資料，確認固體生成物中存 在著3量體至21量體之環狀乳酸低聚物及3量體至27量 體之鏈狀乳酸低聚物。 試驗例1 : (材料及方法） 實驗動物（日本Clea)係使用5至12週齡之無菌 8八1^/(；系小鼠。€?1^組係自由攝取混入0.1%之〇?1^(製 造例1所製造者）之預先高壓蒸氣滅菌（121 °C ’ 1〇分 鐘）後之標準固形餌（CE - 2)及滅菌自來水。另外，對 照組係自由攝取放射線滅菌（C 〇 6 0 )之標準固形餌（C E -2)及滅菌自來水。所有實驗中使用之小鼠均於乙稀製 -23- (21) (21)200400827 隔離操作箱（vinyl Isolator )內飼育管理。 EHEC ( 5·0Χ 1 〇cfu6/小鼠）係開始投予CPL後第7 天’使用胃探棒經口投予，觀察生死。 作爲阻止腸管附著實驗，使無菌小鼠感染EHEC後第 4天屠殺’將腸管各部位（十二指腸、空腸 '回腸及大 腸）切成約4cm之長度，打開腸管，將內容物以PBS充 份洗淨。以濾紙吸取腸管之水份，測量重量，加入1 〇倍 量之PBS勻漿化，將其之0.1 ml塗抹於營養瓊脂培養基 上，計數菌落數。 另外，使用大腸桿菌佛羅毒素檢測用試劑組合 (DENKA生硏），測定肓腸內容物中所產生之佛羅毒素 (VII，VI2 )，使用IgA試劑組合，測定腸管所分泌之 IgA。 (結果及考察） (1) CPL對於感染EHEC小鼠之生存率之功效 CPL投予組及對照組之生死觀察（生存率）之結果如 圖8所示。於15日之觀察期間之感染EHEC小鼠之生存 率，相對於對照組之2 0 % ( 2 /1 0 ) ’ C P L投予組爲8 8.9 % (16/18)。依據此結果認爲，顯示CPL對於EHEC之感 染具有防禦功效。 (2 ) CPL對於EHEC之腸管附著之功效 關於腸管各部位（十二指腸、空腸、回腸及結腸）中 之附著菌數及腸管所分泌之IgA ’認爲CPL投予組及對照 -24- (22) (22)200400827 組之間並無差異（圖9及圖10)。依據此結果認爲，顯 示CPL不能阻止腸管粘膜附著。 (3) CPL對於佛羅毒素（VT1，VT2)之功效 測定CPL投予組及對照組之盲腸內容物中所產生之 佛羅毒素（VT1，VT2 )之結果如圖11所示。對照組中之 VT1之稀釋倍率爲64倍，CPL投予組之稀釋倍率爲32 倍。另外，對照組中之VT2之稀釋倍率爲256倍，CPL 投予組之稀釋倍率爲128倍。依據此結果証實，顯示CPL 抑制佛羅毒素（VT1，VT2 )的量。由以上結果認爲作爲 CPL投予組之生存率高之主要原因之一係CPL抑制EHEC 產生佛羅毒素的量。 產業上利用性 本發明之抑制產生佛羅毒素用劑係可使用於抑制產生 佛羅毒素菌（例如- 1 5 7等之腸管出血性大腸菌）產生佛 羅毒素用。另外，於本發明中，作爲有效成份之聚乳酸混 合物係因爲來自生物體成份之乳酸低聚物，所以生物體適 合性局，副作用少。 【圖式簡單說明】 圖1係表示製造例1所得之生成物之positive mode 快速原子撞擊質譜分析（FABMS )光譜之整體圖。 Range:m/z 10.0000 至 1305.5900 圖2係表示製造例1所得之生成物之negative mode (23) (23)200400827 快速原子撞擊質譜分析（FABMS )光譜之整體圖。 Range:m/z 10.0000 至 2000.0000 圖3係表示製造例1所得之生成物之negative mode 快速原子撞擊質譜分析（FABMS )光譜之擴大圖。 Range：m/z 1 0.0000 至 50 1.9260 圖4係表示製造例1所得之生成物之negative mode 快速原子撞擊質譜分析（FABMS )光譜之擴大圖。 Range:m/z 490.2980 至 1003.7700 圖5係表示製造例1所得之生成物之negative mode 快速原子撞擊質譜分析（FABMS )光譜之擴大圖。 Range:m/z 999.9500 至 1504.3400 圖6係表示製造例1所得之生成物之negative mode 快速原子撞擊質譜分析（FABMS )光譜之擴大圖。 Range:m/z 1484.5300 至 2000.0000 圖7係表示製造例1所得之生成物之NMR光譜之整 體圖。 圖8係表示CPL影響感染0 — 157小鼠生存率之效果 圖。 圖9係表示CPL對於EHEC之腸管粘膜附著之效果 圖。 圖10係表示CPL對於分泌型IgA之效果圖。 圖 Π係表示CPL對於盲腸內容物中之佛羅毒素 (VT1及VT2 )之效果圖。 -26-