SU1299516A3

SU1299516A3 - Способ получени солей мурамилпептидов

Info

Publication number: SU1299516A3
Application number: SU833622707A
Authority: SU
Inventors: Хартманн Альберт; Вакер Оскар; Башанг Герхард; Торчай Лайош
Original assignee: Циба-Гейги Аг (Фирма)
Priority date: 1982-07-23
Filing date: 1983-07-22
Publication date: 1987-03-23
Also published as: NZ205002A; PT77081A; NO167746C; US4548923A; DD210058A5; DE3367596D1; FI832639A0; ES8607980A1; KR910003641B1; IL69292A; HU191371B; EP0099578B1; JPS5933296A; CA1243305A; FI79330B; ATE23536T1; DK167193B1; PL250150A1; FI832639A; IE55838B1

Abstract

Изобретение касаетс замещенных пептидов, в частности натриевых солей мурамилпептидов: N-ацетил-мура- мил-Ъ-аланил-Б-глютамил-(С 1)-L-ала нил-2- (1,2-дипалмитоил-Зп-глицеро-3- -оксифосфорилокси)-этилс1мида (l); N- -аце тил-мурамил-L-аланил-В-глютамил- -(Cot)-алкиловый эфир ( )-(CV)-L- -аланил-2-(I,2-дипальмитош1-5п-глицеро-3-оксифосфорилокс-О-этиламида (и), которые обладают антивирусной активностью и могут быть использованы в медицине. Дл вы влени активности ; среди замещенных пептидов были получены новые соли I и II. Синтез ведут из N-ацетил-мурамил-L-аланил-D-глю- таминовой кислоты или ее С( алкило- вого () эфира, который в среде смеси растворителей (СН 01 + ) в присутствии N-оксисукцинимида и ди- циклогексилкарбодиимида конденсируют с натриевой солью Ь-аланил-2-(1,2- -дипальмитоил-8п-глицеро-3-оксифос- форилокси)-этиламида при комнатной температуре. Испытани I и II показывают , что они обладают лучшей антивирусной активностью, чем известньп Н-ацетил-мурамил-Ь-аланил-2-(1,2-ди- пальмитоил-8п-глицеро-3-оксифосфорил- окси)-зтенсламид (пирогенность в лТ &deg;С, .составл ет 0,48-1,1 против 2). Кроме того, I и II можно использовать против вирусных и бактериальных воз- ,будителей и дл профилактики заболеваний . 4 табл. СО ьо со со СЛ О5 СМ

Description

Изобретение относитс к способу получени солей мурамилпептидов - новых биологических активных соединений , которые могут найти применение в медицине.

Цель изобретени - получение новых производных в р ду мурамилпептидов , обладающих более высокой антивирусной активностью и низкой токсичностью .

Пример 1. 3,60 г(5,66 моль (Со1-)-п-бутилового эфира N-ацетилму- рамил-Ь-аланил-Б-глютаминовой кислоты , 0,6 моль воды и 0,88 г(7,54ммоль) N-оксисукцинимида при непрерывном перемешивании раствор ют в 20 мл сме- си хлороформа и метанола при объемном соотношении 4:К В смесь ввод т 1,6 г (7,54 ммоль) твердого дициклогексил- карбодиимида и по капл м в течение 4 ч при комнатной температуре добавл ют раствор 3,7 (4,72 ммоль) натриевой соли Ь-аланил-2-(1,2-дипальмито- ил-глицеро-3-оксифосфорил-окси)-этил- -амида в 40 мл хлороформа. Смесь вы держивают 1 ч, упаривают на роторном иоплрителе, к остатку добавл ют 200 мл диоксана, раствор лиофилизуют

Продукт суспендируют в 100 мл хло- роформа, добавл ют 600 мл эфира уксусной кислоты, смесь при непрерывном перемешивании охлаждают в лед ной бане в течение 1 ч. Нерастворившиес частичци дициклогексилкарбодиимида отфильтровьшают, фильтрат упаривают Остаток раствор ют в 14 мл смеси хлороформа-метанола и воды 70:30:5 (объемное соотношение) и очищают на колонке (диаметр 4,5 см, длина 80 см) запол14,енную 700 г гел кремневой кислоты 60 (Мерк, 70-230 Меш, ASTM) в указанной смеси растворителей. Прого- ;Н ют 500мл указанной смеси, затем этой же смесьюэлюируют продукт, собира фракции объемом 10 мл № 133-152 и 153- 236, их раздельно подвергают диофильт- радии. Процент основной фракции раствор ют в 300 мл бидистиллированной воды, быстро нагревают до 40 С, после охлаждени центрифугируют, удал нерастворившиес частички дицикло- гексилмочевины.

Надосадочную жидкость подают в диализатор (Амикон Корпорейшн, Дан- вер, Массачуает, 01932 США, модель Ц02, ультрафильтр РМ, 10176 мм диаметр , инертный, неонный полимер на основе полисульфона, средн ве

0

5

личина пор 10 А) ц, подвергают диализу при 4 атм техн. против ,5 л бидистиллированной воды, 0,5 л буферного раствора фосфата-хлорида натри (по 0,1 М, 1:1, рН 7) и 1,5 л воды полного вымывани хлоридов.

Полученный продукт диализа ( 70 мл) стерильно фильтруют на фильтре с милипорами (0,2 мкм) и лиофилизируют. ;Ползгчают натриевую соль N-ацетшт- -мурамил-Ь-аланил-Б-глютамил-(Cd) - -н-бутилэфир-(сг)-Ь-аланин-2-(1,2- -дипалмитоил-Зп-глицеро-З-окси-фос- форилокси)-этиламида (3,4 моль Н О) в виде бесцветного порошка в количестве 4,13 г (67% от теории):

+ 14 + °с (с 0,44; вода);

Rf 0,37 (хлороформ:метанол:во- да 70 : 30 : 5);

Rf 0,64 (этиловый эфир уксусной кислоты : н-бутанол-пиридин:уксусна кислота:вода - 42:21:21:6:10)

Рассчитано, %: С 54,77; Н 8,94; N 5,07; Р 2,24; Н ,0 4,71

СбьН issOjoNsPIIa 0,41 Н20(1381,63)

Найдено, %: С 54,3; Н 9,1; N 5,6; 2,3, H,jO 4,7.

Рассчитано: Na 1,75

.s (1316,59)

Найдено;: Na 1 ,57 .

Исходный продукт получают следующим образом.

5,5 г (8,1 ммоль) (с)-п-бутил-(с)- -бензилэфир-4,б-О-изопропилиден-N- -ацетил-мурамил-Ь-аланил-П-глютами- новой кислоты раствор ют в 60 мл 60%-ной уксусной кислоты и оставл ют на ночь при комнатной температуре. Желтоватый раствор выпаривают приблизительно наполовину на роторном ис-, парителе при , лиофилизуют.

4,8 г (7,5 ммоль) полученного продукта раствор ют в 100 мл смеси диметоксиэтана и воды (9:1), смешивают с 0,8 г катализатора, состо щего из окиси паллади на угле (10%--ный) и в течение 4 ч обрабатывают водородом, катализатор отфильтровьшают . Фильтрат упаривают, остаток чист т дважды хроматографией на геле кремневой кислоты 60 (Мерк, 1:200, фракции 10 и 5 мл) в системе хлороформ: метанол: вода 70:30:5. Фракции, содержашие.продукт, объедин ют , упаривают.

Полученный продукт частично представленный в В1оде натриевой соли

5

0

5

31

(из гел кремневой кислоты) раствор ют в АО мл бндистйллата и пропускают через 50 мл хорошо очищенного ионо- обменника (Dowex 50w х 8 50/100 меш, форма Н) колонку промьгоагот 100 мл бидистиллата, элюат фильтруют через фильтр с миллипорами 0,2 МкМ и ли- офилизуют. Получают 3,7 г (697, от теории) (Со1)-п-6-утиленэфира-Ы-аце- тил-мурамил-Ь-аланил -В-глютаминовой кислоты в виде бесцветного порошка, содержащего 0,6 моль воды.

Сс З +45 j ГС (с 1,142, метанол ) ;

Rf 0,23 (хлороформ:метанол:вода 70:30:5);

Rf 0,40 (Н-бутанол:уксусна кис- лота:вода 75:7,5:21),

Исходный материал получают следующим образом.

4,4 г (11 ммоль) натриевой соли К-ацетил-4,6-0-изопропилиден-мура- миловой кислоты (2,5 моль, 1 г) суспендируют в 60 мл диметилформамида. При интенсивном перемешивании после- довательно добавл ют 4,4 г (П моль) хлоргидрата (Со(.)-п-бутиловый эфир- (Сс.)-бензш1овый эфир Ь-аланил-В-глю таминовой кислоты, 2,53 г (22 ммоль N-оксисукцинимида и 2,5 г (12,1 ммол дициклогексилкарбодиимида , смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре.

Дл переработки суспензии последнюю разбавл ют 100 мл этилового зфи- ра уксусной кислоты и после получасового размешивани при О С отфильт- ровьгоают нерастворившиес частички (дициклогексамочевина, хлорид натри Фильтрат упаривают в вакууме при 30°С, остаток ввод т в 400 мл уксусного эфира и экстрагируют биди тил- лированной водой (10x50 мл)о После сушки органической фазы и упаривани растворител остаетс 5,6 г (Cot)-п- -бутилэфира-( Col)-бензилэфира N-аце- ТШ1-4,6,О-изопрополиден-Ъ-аланил-В- -глютаминовой кислоты в виде аморфного порошка (75% от теории).

/ot/ +30 + 1°С (с 0,732; мета- нол);

Rf 0,87 (хлороформ:метанол:во- да 70:30:5);

Rf 0,83 (h-бутанол:уксусна кис лота:вода /5:7,5:21).

Исходный продукт получают следующим обраэом.

5 O

5

0

5 -

0

164

5,6 г (12,1 ммоль) ()-п-бутил- эфир-(су)-бензилэфира N-третичн. бу- тилоксикарбонил-Ь-аланил-В-глютами- новой кислоты раствор ют в 20 мл абс, этилэфира уксусной кислоты, при ин тенсивном перемешивании и исключении попадани влаги по капл м ввод т 50 мл 4,5 н. сол ной кислоты в абс. уксусном эфире и смесь оставл ют сто ть в течение часа при 0°С. Желтоватый раствор упаривают при комнатной температуре приблизительно до 20 мл, смешивают с 150 мл диоксана и лиофилизируют.. Получают 4,75 г (97% от теории) гидрохлорида (Сс)-п-бу- тилэфир-(С J )-бензилэфир-Ь-аланил-В- -глтотаминовой кислоты в виде бесцветного масла

+19 + (С 0,313; метанол ) ;

Rf 0,58 (хлороформ:метанол:вода 70:30:5);

Rf 0,56 (этил-эфир уксусной кислоты: п -бутанол:пиридин:вода 42:21:6:10).

К 8,5 г (25,8 ммоль) гидрохлорида- (Cct)-п-бутилэфир-(С у) -бензилэфир-D- -глютаминовой кислоты и 7,4 г (25,8 ммоль) N-трет.бутилоксикарбо- нил-Ь-аланин-К-оксисукцинимидэфира. растворенных в 150 мл диметилформамида , добавл ют 2,6 г (25,7 ммоль) N- метилморфолина и смесь оставл ют сто ть в течение 20 ч при комнатной температуре. Прозрачный желтый раствор выпаривают в вакууме при 30 С, полутвердый остаток ввод т в 500 мл этилового эфира уксусной кислоты и экстрагируют семь раз безводным сульфатом натри . Остаток после выпаривани уксусного эфира чист т на 600 г гел кремневой кислоты 60 (Мерк, размер зерна 70-230, меш ASTM) в системе хлороформ:метанол 98:2. Продукт в-фракци х 36-82 собирают и высушивают. Получают (Col)- -бутил- эфир- (С 4)-бензилэфир-К-трет. -бутнлок- сика рбонил-Ь-аланин-В-глютаминовой кислоты в виде бесцветного масла (6 г, 50% от теории).

oLl. - 1°С (с 0,315; ди- метилформамид);

. .Rf 0,73 (хлороформ:изопропанол: :уксусна кислота 70:8:2);

Rf 0,75 (п-бутанол:уксусна кислота: вода 75:7,5:21).

К 11,0 г (30 ммоль) (Сы)-п-бутил- эфир-(С3)-бензилэфира Ы-трет.-бути - локсикарбонил-В-глютаминовой кислоты растворенного в 25 мл абс, этилового эфира уксусной кислоты, добавл ют на холоде при посто нном помешивании и исключении попадани влаги 25 мл 4 н.сол ной кислоты в абс. этиловом эфире уксусной кислоты и оставл ют все это сто ть в течение часа. Легколетучие составл ющие упаривают при , масл ный остаток ввод т в 150 мл абс. диэтилового эфира и смес упаривают снова (3 мл). Масл ный остаток высушивают над натровым асбестом при полувакууме. Получают гидрохлорид (Со.)-п-бутиловый эфир-(су)- -бензилового эфира D-глютаминовой кислоты (8,5 г; 92,4% от теории).

9 + ГС (с 0,646; метанол ) ;

Rf 0,82 (хлороформ:метанол:вода 70:30:5);

Rf 0,68 (этил-эфир уксусной кислоты : п-бутанол: пиридин: уксусна кислота:вода 42: 21 : 21:6:10).

Исходный продукт получают .следующим образом.

20,0 г (64,6 ммоль) (сУ)-бензилового эфира N-трет.-бутилоксикарбонил -D-глютаминовой кислоты раствор ют в 750 мл абс.тетрагидрофурана, 25,05 г (64,6 ммоль) карбоната цези (Флука, чистый), растворенных в 80 мл воды ввод т по капл м и всю смесь улари- вают в вакууме. Остаток раствор ют в 200 мл абс.диметилформамида, раство- рител% упаривают и всю операцию повтор ют . Кристаллический остаток, полученный после сушки в высоком вакууме , раствор ют в 1 л абс. диметил- формамида и при посто нном перемешивании по капл м ввод т 13,3 г (97 ммоль) п-бутилбромида.

Суспензию, полученную после 18-ча сового перемешивани при комнатной температуре, фильтруют, фильтрат упаривают наполовину и после добавлени 1 л этилового эфира уксусной кислоты э сстрагируют водой (10x100 мл). Органическую фазу сушат над сульфатом натри и упаривают. Масл ньш остаток ввод т в 100 мл диэтилового эфира и кристаллизуют благодар добавке 1800 мл петролейного эфира и вьщерж- ке при . Кристаллическую массу

5

0

5

0

5

0

5

0

5

отсасывают, промьтвают и высушивают. Получают (Сы)-п-бутил эфир-(с dL)-6eH- зилэфир N-трет.-бутилоксикарбонил-D- -глютаминовой кислоты в виде бесцветных игл (21 г; 89% от теории). То 70-71°С;

20-И°С (с 1,149, мета- . .0 -

Rf 0,77 (хлороформгизопропанол: :уксусна кислота 30:8:2);

Rf 0,92 (этил-эфир уксусной кислоты:1-бутанол:пиридин:уксусна кислота:вода 42:21:21:6:10)о

Ь-аланин-2-(1,2-дипалмитоил-Зп- -глицеро-3-оксифосфорилокси)-этил- амид, служащий в качестве исходного продукта, получают следующим образом.

13,25 г (14,9 ммоль) N-трет.-бу- тршоксикарбонил-Ъ-аланин-2-(1,2-ди- палмитоил-Бп-глицеро-З-оксифосфорил- окси)-этил-,амид ввод т при посто нном перемешивании ввод т в 170 мл охлажденного до 0°С смеси из три- фторуксусной кислоты и хлористого метилена при соотношении 1:3 (V:V), причем получают прозрачный раствор. После выдержки в течение 2 1/2 ч при ко мнатной температуре раствор упаривают на роторном испарителе при . Полутвердый остаток дл удалени избыточной трифторуксусной кислоты смешивают неоднократно каждый раз со 100 мл хлорида метилена и затем выпаривают.

После п тикратного перетирани остатка каждый раз со 100 мл абс. диэтилового эфира и отстаивани полученного продукта получают хорошо фильтруемую суспензию. Ее фильтруют на нутч-фильтре, промывают твердый продукт диэтиловым эфиром, затем дважды раз 100 мл гор чего ацетона и сушат в вакууме при 60- 70°С. Получают 10,9 г Ь-аланин-2- -(1,2-дипальмитоил-Бп-глицеро-З-ок- сифосфорилокси)-этиламид в виде бесцветных кристаллов с Тп 138-147 °С (95,6% от теории).

+30 + I C (с 1, хлоро-. форм:метанол:вода 70:30:5);

Rf 0,14 (хлороформ:метанол 7:3);

Rf 0,40 (хлороформ:метанол:вода 70:30:5).

Полученньй таким образом продукт перевод т в натриевую соль следующим образом,

3,82 г (5 ммоль) Ъ-аланин-2-(1,2- -дипальмитоил-Зп-глицеро-З-оксифосфо рилокси)-этиламида раствор ют в 100 мл смеси хлороформ:метанол 7:3 при кратковременном нагревании до 35 С. Охлаждают и осторожно добавл ют по капл м 5 мл IN натрового щелока . Прозрачный раствор выпаривают приблизительно до 1/3. первоначального объема и после добавлени 200 мл диоксана лиофилизируют. Получают натриевую соль Ь-аланин-2-(1,2-дипaльми тoил-Sn-глш epo-3-oкcифocфopилoкcи)- -этилaмидa в виде рыхлого порошка (0,41 г).

Пример 2. 3,5гСб,9 ммоль -(СсЛ)-метилового эфира N-ацетил-му- рамил-Ь-этенил-Б-глутаминовой кислоты и 1,2 г N-оксисукцинимида раствор ют в 50 мл смеси, состо щей, из ди- метилформамида, изопропанола и хлороформа (-1:3:6; V:V:V), добавл ют 2,10 г (10,35 ммоль) дициклогексил- карбодиимида и при исключении попадани вЛаги при помепшвании выдерживаю 1 ч при комнатной температуре. Суспензию смешивают с 50 мл этилового эфира уксусной кислоты, 30 мин вьщер живают при перемешивании в лед ной ванне-и затем отфильтровывают нераст воримые частицы дициклогексилмочеви- ны. Фильтрат упаривают на роторном испарителе приблизительно до 40 мл, в результате добавлени 150 абс. ди- этилового эфира выпадает сложный активный эфир (дважды), фильтруют и высушивают, в результате получают эфир с N-окси-сукцинимидом с Rf 0,43 (хлороформ:метанол:вода 70:30:5) - сырьевой продукт в ко- личестве 5,1 .г.

3,43 г (4,4 ммоль) Ъ-аланин-2- -(1,2-дипалмитоил-Зп-глицеро-3-окси- фосфорилокси)-этиламида суспендируют в 45 мл хлороформа и при 40°С в те- чение 5 мин по капл м ввод т 0,86 мл (6,1 ммоль) триэтиламина, растворенного в 5 мл хлороформа, при этом получают прозрачный раствор. К нему по капл м при интенсивном метании при исключении попадани влаги в течение 5 мин добавл ют раствор указанного активного сложного эфнра в 100 Мл смеси, состо щей из диметил фбрмамида, хлороформа и диоксана (1:14:6; V:V:V).

После 2 1/2 ч перемешивани при комнатной температуре несколько мутный раствор упаривают на роторном испарителе до сухого состо ни (30° Полученный продукт очищают на геле кремневой кислоты 60 (Мерк, размер зерен 70-230 Меш, ASTM) в системе хлороформ:метанол:вода 70:30:5 (5 мл фракций). Фракции содержащие продукт, собирают (ДС). Остаток после вьтаривани растворител раствор ют в 250 мл дважды дистиллированной воды и очищают аналогично тому, как это описано в примере 1, путем ди- фильтрации (AMICON-мешалка, тип 402 ультрафильтр 0.30/76 мм). Раствор, остающийс в мешалке, фильтруют через фильтр с миллипорами (0,2 МКм) и лиофилизируют. Получают натриевую соль Ш-ацети.п-мурамил-Ь-аланил-В- -глютамид-(Со.)-метилэфир-(С 5: )-1-ала- нин-2-(1,2-дипальмитоил-5п-глицеро- -3-оксифосфорилокси)-этил-амида, 2,96 моль Но в виде бесцветного порошка .

ы. +11 j Гс (с 0,285; 10%-на уксусна кислота);

Rf 0,25 (хлороформ:метанол:во- да 70:30:5);

Rf 0,39 (этиловый эфир уксусной кислоты: п -бутанол-пиридин:уксусна кислота:вода 42:21:21:6:10) (в кол-ве 3,1 г; 55% от теории).

Исходные соединени получают, следующим образом.

7,7 г (21,2 ммоль) гидрохлорида (CoL} -метилэфира- (С V) -бензил эфира Ъ-аланил-В-глютаминовой кислоты и 8,96 г (23,3 ммоль) натриевой соли К-ацетил-4,6-0-изопропйлиден-мурами- новой кислоты соедин ют аналогично примеру 1 по методу дициклогексикар- бодиимид): N-окси-суксинимид. Полученный продукт без дальнейшей очистки расщепл ют в 100 мл 60%-ной уксусной кислоты. После 5 1/2 ч меша- ни при комнатной температуре раствор упаривают, смешивают с водой, вновь упаривают и после добавки 100 мл диоксана лиофилизируют.-Остаток чист т на 60 мл гел кремневой кислоты в системе хлороформ:метанол: . :вода 70:30:5 (7 мл фракций), процесс проводитс дважды.

Фракции, содержание необходимый продукт, объедин ют, растворитель упаривают. В остатке (Со(.)-метилэфир- (С)-бензилэфир N-aцeтил-мypaмил-L- -аланил-В-глютаминовой кислоты в ви- де бесцветной пены с Rf 0,63 хлореформ:метанол:вода 70:30:5) в количестве 6,9 г.

6,0 г (10 ммоль) (Со()-метилэфир- -(СУ)-бензилэфир N-ацетил-мурамилхроматографе на 550 г гел кремневой кислоты 60„

Получаемьп продукт собирают, сме шивают с 200 мл бидистиллированной

fO

услови х (о,45 мкм) и лиофилизируют Получают натриевую соль N-ацетил-му рамил-Ъ-ал анил-Б-глютамил- (Cot) -трет -бутилэфир-(су)-Ь-аланин-2-(1,2-ди- палмитоил-8п-глицеро-3-оксифосфорил окси)-этил-амида в виде бесцветного порошка, содержащего 3,4 моль воды.

j° -1-14 1°С (С 0,817; .10%-на уксусна кислота);

f5

-Ъ аланил-Б-глютаминовой кислоты, ра- воды (), фильтруют в стерильных створенного в смеси 1,2 диметоксиэта- на и воды 95,5 (V:V), гидрируют в присутствии 0,6 г катализатора палладий на угле (10%-ный) в течение 1 1/2 ч при нормальном давлении. Катализатор отфильтровывают и фильтрат упаривают при комнатной температуре при повышенном давлении. Остаток чист т на 400 г гел кремневой кислоты 60 в системе хлороформ:метанол:вода 70:30:5 (10 мл фракций), как было указано вьше.

Фракции, содержащие продукт, объедин ют , растворитель упаривают. Остаток в форме соли натри чист т от солей, как описано в примере 1, на 50 мл Dowex 50 WX 8 (50/100 Меш, форма Н, сильнокислотный катионооб- менник). Фильтрат пропускают через фильтр с миллипорами (0,45 мкм) и . лиофилизируют. Получают (Cot)-метиловый эфир Н-ацетил-мурамил-Ь-аланил- -Б глютаминовой кислоты (1,27 моль

20

25

Rf 0,29 (хлороформ:метанол:вода 70:30:5);

Rf 0,53 (этиловый эфир уксусной кислоты: П -бутанол:пиридин:уксусна кислота:вода 42:21:21:6:10). Выход натриевой соли 8,39 г 78% от теории Пептидпроизводное, используемое в качестве исходного продукта, получают следующим образом.

38,3 г (63,5 ммоль) (Со()-трет.- -бутилэфир-(С У)-бензилэфира (4- -бифенилил)-пропилоксикарбонил -Ь- -аланил-Б-глютаминовой кислоты раствор ют в 700 м смеси из трифторэтана 30 и воды 9:1 (V/V) и в результате до бавлени по капл м 1,23 н.сол ной кислоты в такой же смеси растворителей (1 об. ч. концентрированной сол ной кислоты и 9 об. ч. трифторэтано- 35 ла) значение рН уменьшаетс до 1,5 ( 2 1/2 ч, расход 51,66 мл, т.е. 81% от теории).

Н„0) в виде бесцветного порошка с +47 - 1°С (С 1,249; мета -

(58%

от тенол ) в количестве 3,1 г ории).

Rf - 0,80 (хлороформ:метанол:вода 70:30:5);

Rf 0,30 (ацетоннитрил:вода 3:1);

Rf rr 0,43 (этиловый эфир уксусной кислоты:уксусна кислота:вода:метанол 67:10:23:12)о

Светложелтоватый раствор на ротор

ном испарителе в вакууме, создаваеП р и м е р 3. 9,4 г (11,1 ммоль)0 мом водоструйным насосом, при ЗО с (Cot)-Трет.-бутилэфира N-ацетил-мура- упаривают почти до 100 мл, затем до- мил-Ь-аланил-Б-глютаминовой кислоты перевод т аналогично примеру 2 в активный эфир и затем, как описано. соедин ют с 6.48 г (8,2 ммолй) L- -аланин-2-(1,2-дипалмитоил-Зп-глице- ро-3-оксифосфорилокси)-этиламида в присутствии триэтиламина. Полученный продукт суспендируют в 250 мл бидисбавл ют 200 мл диоксана, смесь высушивают на холоде.

Полутвердый остаток раствор ют в 30 мл абс. диэтилового эфира и при 0-5°С при посто нном перемешивании, и продукт осаждают 150 мл петролей- ного.эфира. Вьщерживают на холоде (-2б°С), декантируют и повтор ют эту

( процедуру дважды. Масл ный остаток затем ввод т в 100 мл. трет.-бутанотиллата воды и быстро нагревают до 37°С, перемешивают 15 мин в лед ной ванне, отфильтровьгеают нерастворимые частички дициклогексилмочевины и фильтрат подвергают диафильтрации.

( процедуру дважды. Масл ный остаток затем ввод т в 100 мл. трет.-бутанола , лиофилизируют и остаток высушивают над натровым асбестом в высоком вакууме. Получают гидрохлорид

как описано в ripHMepe 1 (AMICON - ме--5-5 (СоО-трет.-бутилэфира (СУ)-бензил- шалка 402, ультрафильтр РМ И 30/76 мм эфира Ь-аланил-В-глютаминовой кисло- Остающийс в мешалке раствор (120 мл) ты в виде сильно гигроскопич юго по- лиофилизируют и продукт чист т на рошка.

хроматографе на 550 г гел кремневой кислоты 60„

Получаемьп продукт собирают, смешивают с 200 мл бидистиллированной

услови х (о,45 мкм) и лиофилизируют. Получают натриевую соль N-ацетил-му- рамил-Ъ-ал анил-Б-глютамил- (Cot) -трет- -бутилэфир-(су)-Ь-аланин-2-(1,2-ди- палмитоил-8п-глицеро-3-оксифосфорил- окси)-этил-амида в виде бесцветного порошка, содержащего 3,4 моль воды.

j° -1-14 1°С (С 0,817; .10%-на уксусна кислота);

воды (), фильтруют в стерильных

f5

воды (), фильтруют в стерильных

0

5

Rf 0,29 (хлороформ:метанол:вода 70:30:5);

Rf 0,53 (этиловый эфир уксусной кислоты: П -бутанол:пиридин:уксусна кислота:вода 42:21:21:6:10). Выход натриевой соли 8,39 г 78% от теории. Пептидпроизводное, используемое в качестве исходного продукта, получают следующим образом.

38,3 г (63,5 ммоль) (Со()-трет.- -бутилэфир-(С У)-бензилэфира (4- -бифенилил)-пропилоксикарбонил -Ь- -аланил-Б-глютаминовой кислоты раствор ют в 700 м смеси из трифторэтана 0 и воды 9:1 (V/V) и в результате добавлени по капл м 1,23 н.сол ной кислоты в такой же смеси растворителей (1 об. ч. концентрированной сол ной кислоты и 9 об. ч. трифторэтано- 5 ла) значение рН уменьшаетс до 1,5 ( 2 1/2 ч, расход 51,66 мл, т.е. 81% от теории).

Светложелтоватый раствор на ротор )0 мом водоструйным насосом, при ЗО с упаривают почти до 100 мл, затем до-

бавл ют 200 мл диоксана, смесь высушивают на холоде.

( процедуру дважды. Масл ный остаток затем ввод т в 100 мл. трет.-бутано11

20

Cdl-j j: 1°C (C 1,630; хлороформ);

Rf 0,60 (хлороформ:метанол:вода 70:30:5);

Rf 0,45 (п-бу,танол:уксусна кис- лота:вода 10:1:2:8) 19,25 г (76,5% от теории).

fO

К охлажденному до 0°С раствору, состо щему из 65,96 г (0,2 моль) гидрохлорида (Сы)-трет.-бутилэфира- -(СУ)-бензилэфира D-глютаминовой кислоты и 65,47 г (0,2 моль) (4-бифенилил)-пропилркси-кар6онилЗ- -L-аланина в 650 мл абс. диметилформ- амида, добавл ют при посто нном помешивании 22 мл (0,24 моль) И-метил- формалина и затем 59,11 г (0,24 моль) 2-этокси-Н-этокси-карбонил-1,2-дигид- , рохинолина. После 10-часового разме- шивани при комнатной температуре желтый раствор упаривают на роторном испарителе при 30°С. Остаток ввод т в 1 л этилового эфира уксусной кислоты , экстрагируют водой (5x200 мл), водную фазу экстрагируют 0,5 л уксусного -эфира и собранные органические фазы высушивают.

Продукт, полученный после упари- вани растворител (продукта 150 мл) чист т многократно на хроматографе на геле кремневой кислоты 60 (1:20) с уксусным эфиром. Получают (Coi)- -трет. -бутилэфир- (с If -бензилэфир-NПример 4. К раствору 4,62 г (6,05 ммоль) 1,-аланин-2-( 1 ,2-дипaлми- тoил-Sn-глицepo-3-oкcифocфopилoкcи)- -этилaмидa в 100 м смеси хлороформ: :изопропанол:вода 70:30:2 при помешивании при 15 С в течение 10 мин по капл м добавл ют 14,52 г (7,26 ммоль) 0,5 М раствора триэтил- амина в смеси хлороформ:изопропанол: :вода 70:30:-2. Затем в течение |20 мин добавл ют 4-м порци ми.по 1,5 г в твердом виде 6,0 г (7,26 ммоль) (Со1)-метилэфир-(С)-К- -гидрооксисуксинимидэфира N-пропио- нил-дезметилмурамил-Ь-аланил-В-глю- таминовой кислоты, содержащий еще ди- циклогексилмочевину, причем раствор мутнеет на глазах.

Затем после 15-минутного помешивани при 15°С охлаждение прекращают и продолжают перемешивание еще 2 1/2 ч при комнатной температуре. Затем полученный таким образом мутньй раствор упаривают в вакууме при ЗО С. Остаток (10,75 г) суспендируют в 170 мл бидистиллированной воды (рН 5,5), суспензию путем добавки 0,3 мл триэтиламина довод т до рН 6,0; отфильтровывают нерастворимые частицы (дициклогексилмочевины) и

25

(4-бифенилил)-пропш10ксикарбонил- 5 фильтрат лиофилизируют в высоком ва-Ь-аланил-В-глютаминовой кислоты в виде бесцветного масла, oi. -14 + 1°С (С 1,625; эти- ловьй эфир уксусной кислоты) (100 г, 83% от теории);

Rf 0,73 (хлороформ:изопропанол: :уксусна кислота 70:8:2);

Rf 0,51 (толуол:уксусный эфир 1:1).

Используемый в качестве исходного продукта гидрохлорид (Сс/.)-трет.-бу- тилэфира-(СУ)-бензш1эфира D-глютаминовой кислоты получают путем проведени реакции между (су)-бензиловым эфиром D-глютаминовой кислоты и изо- бутанолом в смеси, состо щей из 1,4- -диоксана и серной кислоты, выдел ют продукт в виде бесцветных игл с Т;, 108-109°С.

10

-16 + (с 1,235;

этанол);

Rf 0,84 (хлороформ-метанол:вода 70:30:5);

- 5

fO

- 29951612

Rf 0,64 (этиловьш эфир уксусной кислоты:h-бутанол:пиридин:уксусна кислота:вода 42:21:21:6:10) в количестве 61% от теории).

Пример 4. К раствору 4,62 г (6,05 ммоль) 1,-аланин-2-( 1 ,2-дипaлми- тoил-Sn-глицepo-3-oкcифocфopилoкcи)- -этилaмидa в 100 м смеси хлороформ: :изопропанол:вода 70:30:2 при помешивании при 15 С в течение 10 мин по капл м добавл ют 14,52 г (7,26 ммоль) 0,5 М раствора триэтил- амина в смеси хлороформ:изопропанол: :вода 70:30:-2. Затем в течение |20 мин добавл ют 4-м порци ми.по 1,5 г в твердом виде 6,0 г (7,26 ммоль) (Со1)-метилэфир-(С)-К- -гидрооксисуксинимидэфира N-пропио- нил-дезметилмурамил-Ь-аланил-В-глю- таминовой кислоты, содержащий еще ди- циклогексилмочевину, причем раствор мутнеет на глазах.

25

0

5

кууме.

Полученный таким образом лиофили- зат раствор ют в 300 мл, затем лиофилизируют в глубоком вакууме.

Получают натриевую соль N-пропио- нил-дезметилмурамил-Ъ-аланил-В-глю- тамил-(Со1)-метилэфир-(с)-Ь-аланин- -2-(1,2-дипалмитоил-8п-глицеро-3-ок- сифосфорилокси)-этиламида в виде бесцветного порошка, содержащего 1,90 моль воды.

3,7 + О,ГС (С 0,672; хлороформ);

0 ° +1,7 Т О, ГС-(С 1,044; вода);

Rf 0,42 (хлороформ:метанол:вода 70:30:5);

Rf 0,62 (уксусный эфир:п-бута- нол:пиридин:уксусна кислота:вода 42:21:21:6:10) в количестве 5,64 г (71,2% от теории).

5

5,12 г (10,1 ммоль) dL-метилового эфира М-пропионилдезметилмурамил-Ъ- -аланил -В-глютаминовой кислоты полностью раствор ют в то мл смеси хлороформ:изопропанол 7:3 и в результате добавлени 10 мл диметил- формамида.

К этому раствору добавл ют 2,68 г (13 ммоль) дициклогексилкарбодиимида и 1,50 г (13 ммоль) N-оксисукциними- да и полученный в результате этого прозрачный бесцветный раствор мешают в течение 1 1/2 ч при комнатной температуре и затем вьщерживают 17 ч при 4° С..

Полученную таким образом суспензию смешивают с 400 мл диэтилового эфира и затем перемешивают еще в течение 1 ч при комнатной температуре .

Затем кристаллизат отсасьшают, промывают диэтиловым эфиром и высушивают в вакууме над п тиокисью фосфора .

Получают сьгрой (CdO-метилэфир-. . -4с у) -К-оксисукцинимидэфир-М-пропио- ннп-дезметилмурамил-Ь-аланил-О-глюта миновой кислоты в виде бесцветных кристаллов, содержащий в виде примеси дициклогексилмочевину и используемый без последующей очистки.

Rf 0,46 (хлороформ:метанол 5:1);

Rf 0,72 (хлороформ:метанол 7:3) Выход сложного эфира 8,34 г,

Раствор 13,0 г (21,75 ммоль) (Cot) -метилэфир-(С)-бензилэфира N-пропио нил-д зметилмурамил-Ъ-аланил-Б-глю- тамииовой кислоты в 250 мл смеси ди- метоксиэтан:вода 20:1 гидрируетс 2,5 г катализатора палладий на угле (10%-ный) в течение 1 ч при комнатной температуре и нормальном давлении .

Затем катализатор отфильтровьшают фильтрат упаривают в вакууме до сухого состо ни и полученньй остаток трижды смешивают с водой в количестве по 50 мл и снова упаривают.

Осадок раствор ют в приблизительно 100 мл бидистиллированной вода, фильтруют этот раствор через фильтр с миллипорами (NAL GENES: 0,2 мкм) и лиофилизируют в глубоком вакууме. Получают ot-метиловый эфир N-пропио- нил-дезметилмурамил-Ъ-аланил-Б-глю

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

таминовой кислоты (0,68 моль воды) в виде бесцветного лиоЛилизата +14,9 4. 0,°С (с 1,067; метанол), в количестве 11,0 г(96% от теории).

Rf 0,78 (хлороформ:метанол:вода 7,:30:5);

Rf 0,57 (уксусный эфир:п-бута- нол:пиридин:уксусна кислота:вода 42:21:.21:6:10).

Раствор 20,7 г (32/46 ммоль) (СЫ)- -метилэфир-(С)-бензилэфира 4,6-0- -изопропиллиден-И-пропионил-дезме- тилмурамил-Ь-аланил-Б-глютаминовой кислоты в 400 мл 60%-ной уксусной кислоте мешают в течение 21 ч при комнатной температуре, затем упаривают в вакууме при 30°С и полученный остаток последовательно трижды смешивают каждый раз со .100 мл воды и снова упаривают. Полученный сырой продукт очишают путем хроматографии на колонне на 1000 г гел кремневой кислоты 60 (Мерк, 0,063-0,200 мм) в системе метиленхлорид:метанол 85: :15 (15 мл фракции) Фракции 207-290 собираютс и вьтариваютс в вакууме при 30°С. Получают (Сс1)-метилэфир- -(с)-бензилэфир N-пропионил-дезме- тилмурамил-Ъ-аланил-Б-глютаминовой кислоты, содержащей 0,24 моль воды

+16 + 0,1 С (С 1,463;. метанол);

Rf 0,24 (хлороформ:метанол 9:1);

Rf 0,53 (хлороформ:метанол 5:1);

Rf 0,94 (хлороформ:метанол:вода 70:30:5) в количестве 13,7 г (70,1% от теории).

Исходньй продукт получают следующим образом,

В суспензию из 13,2 г (35,77 ммоль) натриевой соли 4,6-0 изопропилиден- -Н-пропиони,п-дезметилмураминовой кислоты в 200 мл диметилформамида добавл ют при комнатной температуре при мешании 9,6 г (46,5 ммоль) дициклогексилкарбодиимида , 5,35 г (46,5 ммоль) N-оксисукцинимида и 12,8 г (35,77 ммоль) гидрохлорида (СсА)метилэфир-(С11)-бе:нзилэфира L- аланин-Б-глютаминовой кислоты и все мешают в течение 21.ч при комнатной температуре,

Полученную таким образом белую суспензию смешивают с 200 мл уксус151

ного эфира, перемешивают в течение 1 ч при , отдел ют от кристаллизатора (дит иклогексилмочевины), на нутч-фильтре, промьшают лед ным уксусным эфиром и фильтрат упаривают в вакууме при 30 С. Полученный таким образом остаток ввод т в 300 мл уксусного эфира и дважды последовательно промьшают 50 мл 2 н. лийонной кислоты , водой, 10%-ным раствором гидро карбоната натри и снова водой.

Эфирные слои объедин ют, высушивают над сульфатом натри , фильтруют и упаривают в вакууме.

Получают (Сс)1)-метилэфир-(С }1)-бен- зилэфир 4,6-0-изопропилиден-М-пропио нил-дезметилмурамил-Ь-аланил-В-глю- таминовой кислоты.

Rf 0,65 (хлороформ:метанол 9:1);.

Rf 0,86 (хлороформ:метанол 5:1) в количестве 21,3 г (93,3% от теории).

Оба исходных продзпста получают следующим образом.

К раствору 20,3 г (48,0 ммоль) (Сс)-метилэфир-(су)-бензш1эфира N- -трет.-бутилоксикарбонила-Ъ-аланил- -D-глютаминовой кислоты в 100 мл абсолютного уксусного эфира добавл ют при 0°С 100 мл приблизительно 5 N сол ной кислоты в абсолютном эфире и мешают 2 ч при 0°С.

Желтоватьй раствор упаривают в вакууме , полученный остаток дважды сме шивают каждый раз со 100 мл абсолютного эфира и снова упаривают. После дигерировани с абсолютным диэтиловы

эфиром (2x100 мл) остаток высушивают

в вакууме и получают гидрохлорид

(Сс1)-метилэфир-(С} )-бензилэфира L- -аланил-В-глютаминовой кислоты, соде р «гашэ1й 0,31 моль воды.

(с 0,043

метанол);

Rf 0,72 (хлороформ:метанол:вода 70:30:5);

Rf 0,44 (хлороформ:метанол 5:1);

Rf 0,31 (хлороформ: метанол 9:1) в количестве 1,7 г (94,8% от теории).

Раствор 34,4 г (73,8 ммоль, 2,14 ммоль), содержащий хлорид натри натриевой соли 1оС-О-бензил-4,6- -0-изопропилиден N-пропионил-дезме- тилмураминовой кислоты в 340 мл воды гидрируют при посто нном значении

1616

рН 7,1 6,0 г 10%-ного катализатора палладий на угле в течение 23 ч при комнатной температуре и нормальном давлении. Затем катализатор отфильтровывают , фильтрат упаривают в вакууме при ЗО С и при рН 7,1; и полученный таким образом остаток высушивают в высоком вакууме над п тиоки- сью фосфора. Получают натриевую соль 4,6-0-изопропилиден-Ы-пропионил-дез- метилмураминовой кислоты (16,6 г, 94,8% от теории)

Rf 0,50 (хлороформ:метанол:вода 70:30:5);.

Rf 0,66 (ацетонитрил:вода 3:1).

Исходньй продукт получают следующим образом.

Раствор 14,3 г (32,7 ммоль) метилового эфира 1 с.-0-бензил-4,6-0-изо- пропилиден-М-пропионил-дезметилмура- миновой кислоты в 130 мл метанола смешивают с 24,4 мл (48,7 ммоль) 2 н натрового щелока и перемешивают в течение 1 1/2 ч при комнатной температуре .

Затем полученный таким образом прозрачный желтоватьй раствор с помощью 1 н. сол ной кислоты довод т до значени рН 7,0 и упаривают в вакууме при 30 С.

После сушки над п тиокисью фосфора получают натриевую соль I -0- г-бензил-4,6-0-изoпpoпилидeн-N-пpoпиo нил-дезметилмураминовой кислоты в виде бесцветных кристаллов в количеств 27,2 г.

Rf 0,67 (хлороформ:метанол:вода 70:30:5);

Rf « 0,74 (ацетонитрил:вода 3:1

К суспензии из 6,75 г (224,7 ммол гидрида натри в 120 мл абсолютного тетрагидрофурана добавл ют по капл м при 5 С в атмосфере азота при посто нном помешивании в течение 5 мин раствор 31,3 г (85,65 ммоль) 1Ы.-0- -бензил-2-дезокси-4,6-0-изопропили- ден-2-пропионамид-Ы-В-глюкопиранози- да в 200 мл абсол)отного тетрагидрофурана , причем температура повышаетс до 20°С.

Полученную таким образом суспензию перемешивают еще 2 ч при 40°С, затем охлаждают до 0°и добавл ют по капл м в атмосфере азота и непрерывном помешивании в течение 30 мин

171

к охлажденному до -15°С раствору 20,7 г (135,77 ммоль) метилового эфира бромуксусной кислоты в 95 мл абс. тетрагидрофурана. Полученную таким образом суспензию размешивают еще в течение 3 ч при 0-5°С, затем добавл етс 20 мл метанола и 20 мл тетрагидрофурана . С помощью 4,5 мл лед ной уксусной кислоты устанавливают значение рН-6 и раствор упаривают в ва- кууме при .

Остаток раствор ют 200 мл метилен хлорида и промывают полученный раствор водой (3x125 мл). Собранные ме- тиленхлоридные фракции высушивают над сульфатом натри , фильтруют и упаривают в вакууме при 30 С.

Получают сьфой продукт в виде желтоватых кристаллов, которые затем очищают хромотографией на колонне на 500 г нейтральной окиси алюмини (Йоелм N, супер 1), использу эфир в качестве. элюента (Ю мл фракций). Фракции 14-36 объедин ют и упаривают в вакууме.

Получают метиловый эфир 1ot-0- -бензил-4,б-О-изопропилиден-N-npo- пионил-дезметилмураминовой кислоты в виде бесцветных кристаллов с Тп 121-123° (диэтилэфир:нефт ной эфир 1:2).

+147,9 + 0,1°С (С 0,849; хлороформ) - 32,2 г (86,2% от теории).

Rf 0,67 (хлороформ:метанол 9:1).

Пример 5. Аналогично примеру 4 получают из 5,525 г (6,43 ммоль) сырого (содержит еще , незначительное количество дициклогек силмочевины) (СЫ.)-трет-бутилэфир- -(СУ)-И-окси-сукцинимидэфира N-npo- пионил-дезметилмурамил-Ъ-аланил-Б- -глютаминовой кислоты и 3,78 г (4,95 ммоль) Ь-аланин-2-(1,2-дипаль- митоил-5п-глицерр-3-оксифосфорилок- си)-этиламида натриевую соль N-npo- пионил-дезметилмурамил-Ь-аланил-Б- -глютамил-(Сd) -трет.-бутилэфир-(С у) - -Ь-аланин-2-( 1 ,2-дипальмитоил-5п.- -глицеро-3-оксифосфорилокси)-этил- амида в виде бесцветного порошка, содержащего 2,64 моль воды.

LuLl ° +2,5 + 0,1°С (с 0,649; .вода);

+5,8 ;+ 0,1°С (С 0,694; хлороформ);

1618

Rf 0,60 (хлороформ:метанол:во- да 70:30:5), в количестве 4,32 г (64,0% от теории).

Ис лодный продукт получают следующим образом.

Аналогично примеру 3 из 3,44 г (6,15 ммоль) cat-трет.-бутилэфира Н-пропионил-дезметилмурам ил-Ъ-аланил -D-глютаминовой Кислоты, 1,68 г (8,14 ммоль) дициклогексилкарбодими- да и 0,94 г (8,14 ммоль) N-оксисук- цинимида получают сырой ()-трет.- -бутилэфир-(су)-К-оксисукцинимидэфир N-пропионил-дeзмeтилмypaмил-L-aлaнил -D-глютaминoвoй кислоты в количестве 5,38 г в виде бесцветных кристаллов, содержащих дициклогексилмочевину, и используемьпс без дальнейшей очистки.

Rf 0,61 (хлороформ:метанол:во- да 70:30:5).

Раствор 5,1 г (7 ммоль) (СсА)-трет -бутилэфир-(Су)-бензилэфира d -0- -бензил-К-пропионил-дезметилмурамш1- -Ь-аланил-В-глютаминовой кислоты в 100 мл смеси диметоксиэтан:вода 9:1 гидрируют с 1,5 г 5%-ного катализатора палладий на угле (Е 101N, Дегусса) в течение 20 ч при комнатной температуре и нормальном давлении Через 20 ч катализатор отфильт- ровьгоают и снова производ т гидрирование с 1,5 г свежего катализатора в течение 26 ч как указано. Затем катализатор отфильтровьшают и фильтрат упаривают в вакууме до сухого состо ни при 30°С.

Полученный таким образом остаток раствор ют в смеси, состо щей из 100 мл метиленхлорида и 5 мл изопро- панола, раствор смешивают с 500 мл смеси из дизтилового н петролейного эфира 3:2 и перемешивают еще 1 ч при комнатной температуре. Затем от- сасьшают вьшавший в осадок продукт и промьюают его диэтиловым эфиром. Получают с -трет- бутилэфир N-npo- пионилдезметилмурамил-1-алканил-D- -глютаминовой кислоты в виде бесцветг ного порошка, содержащего 0,52 моль воды (3,7 г, 94,7,от теории).

+20,2 + 0,1°С (С 0,902; вода);

Rf 0,32 (хлороформ:метанол:вода 70:30:5);

Rf 0,54 (ацетонитрил:вода 3:1).

191

Получают исходный продукт следу- кнцим образом.

Аналогично примеру 4 получают из 7,3 г (9,5 ммоль) (Cdl)-трет.-бутил- эфир-(С у)-бензил эфир-1 oL-0-бензил- -4,6-0-изопропш1иден-пропионил-дез- метилмурамил-1-аланил-Б-глютаминовой кислоты и 150 мл 60%-ной уксусной кислоты (Cot.) -трет. -бутилэфи р- f С у) - -бензилэфир 1оС-О-бензил-К-пропно- нил-дезметилмурамил-Ъ-аланил-В-глю- таминовой кислоты в виде бесцветных кристаллов с Т 152-153 С (метанол: :вода 1:5).

Со. +68,9 J- 0,ГС (с 0,991; метанол);

Rf 0,40 (хлороформ:метанол 9:1);

Rf 0,70 (анетонитрил:вода 3:1), количество кислоты 5,9 г (85,3% от теории).

Аналогично примеру 4 из 4,65 г (9,62 ммоль, 2,066 ммоль/г, содержит еще хлорид натри ) натриевой соли 1с.-0-бензил-4, б-О-изопропилиден-N- -пропионил-де зме тилмураминов ой кис- лоты, 2,38 г (11,54 ммоль) дицикло- гексилкарбодиимида, 1,33 г (11,54 ммоль) N-оксисукцинимида и 3,86, г (9,62 ммоль) гидрохлорида (Cot) -трет. -бутилэфир- (С %) -бензилэфи- ра Ъ-аланил-Б-глютаминовой кислоты получают (Сct)-трет.-бутилэфир-(СV)- -бензилэфир 1с«.-0-бензил-4,6-0-изo- пpoпилидeн-N-пpoпиoнил-дeзмeтилмypa- мил-aлaнил-D-глютaминoвoй кислоты, содержащей О, 31 моль воды.

+38,4 + 0,1°С (С 1,086 метиленхлорид); ,86 (ацетонитрил : вода 3 : 1)

Rf 0,83 (хлороформ:метанол 9:1), выход кислоты 7,3 г (97,9% от теории).

Пример 6. Аналогично примеру 4 из 3,07 г (4 ммоль) сырого (еще содержит дициклогексилмочевину) (Cot) -п-бутилэфир-()-М-оксисук11инимид- эфира Ш-пропионил-дезмётилмурамил- -Ь-апанил-Б-глютаминовой кислоты и 2,37 г (3,1 ммоль) Ь-аланил-2-(1,2- -дипалмитоил-Зп-глицеро-З-оксифосфо- рилокси)-этиламида получают натриевую соль N-пропионил-дезметилмурамил

-Ъ-аланил-Б-глютамил- (Col) -h -бутил- эфир-(С 4)-Ъ-аланин-2-( 1,2-дипальми- тоил-Бп-глицеро-3--оксифосфорилокси)1620

-этиламид в виде бесцветного порошка , содержащего 2,93 моль воды.

20- +6,9 -f (с 0,504; метиленхлорид);

Rf 0,65 (хлороформ:метанол:вода 70:30:5);

Rf 0,63 (хлороформ:метанол 7:3), выход порошка 2,93 г (70,9%)

Аналогично примеру 4 из 2,2 г (3,9 ммоль) dt--п-бутилэфира N-npo- пион ил-д е зм е тилмур амил-L-аланил-D- -глютаминовой -кислоты, 1,2 г (5,8 ммоль) дициклогексилкарбодиими- да и 0,69 г (5,8 ммоль) N-оксисукцинимида получают сырой (СЫ)-п-бутил- эфир-(сУ)-И-оксисукцинимидзфир N- -пропионил-дезметилмурамил-Ъ-аланил- -D-глютаминовой кислоты в виде бесцветных кристаллов, содержащих дициклогексилмочевину и используемых без дополнительной очистки (количество кристаллов 3,07 г).

Rf 0,66 (хлороформ:метанол:вЬ- да 70:30:5).

Аналогично примеру 5 (продолжительность гидрировани 20 мин) из 7,3 г (11,3 ммоль) (Со(.)-п-бутил-эфир- -(су)-бензилэфира TJ-пропионил-дезме- тилмурамил-Ъ-аланил-Л-глютаминовой кислоты получают oL-n-бутилэфир N- -пропионил-дезметилмурамил-L-аланил- -D-глютаминовой кислоты в виде бес,- цветного порощка, содержащего 0,88 моль воды, с выходом кислоты 5,8 гС90,9% от теории).

+16,4 j 0,Гс (с 0,959; вода);

Rf 0,61 (метиленхлорид:метанол: :вода 70:30:5);

Rf 0,52 (ацетонитрил:вода 3:1).

Аналогично примеру 4 из 9,5 г ((3,97 ммоль) (Со1)-п-бутилэфир-(С)- -бензилэфир 4,б-О-изопропилиден-N- -пропионил-дезметил-мурамил-Ъ-аланил -D-глютаминовои кислоты и 120 мл 60%-ной уксусной кислоты получают (С.о(.) -г-п-бутилэфир- (С у) -бензг-лэфир К-пропионил-дезметилмурамил-Ъ-ала- нил-Б-глютаминовой кислоты, содержащий 0,41 моль воды, (7,5 г, 83%).

+15,7 + n,l«C (С 1,019; метанол);.

Rf 0,23 (метиленхлорид:метанол 9:1);

Rf 0,Д5 (метиленхлорид:метанол 5:1);

R.f 0,82 (метиленхлорид:метанол: :вода 70:30:5).

Аналогично примеру 4 из 3,81 г (10,76 ммоль V 2,72 ммоль/г, содержит еще хлорид натри ) натриевой соли 4,б-0-изопропилиден-К-пропионил- -дезметилмураминовой кислоты, 2,44 г (11,83 ммоль) дициклокарбодиимида, 1,36 г (11,83 ммоль) N-оксисукииними да (10,76 ммоль) гидрохлорида (СЯ)- -п-бутилэфира-(Со(,)-бензил-Ъ-аланнл- -D-глютаминовой кислоты получают (CoL) -п-бутилзфир-( С V) -бензилэфир, 4,6-0-изопропилиден-К-пропионил-дес- метилмурамил-Ь-аланил-Б-глютаминовой кислоты (4,1 г, 56,2%).

Coi.° +10,,1 С (С 0,928; метанол).;

Rf 0,81 (метиленхлорид:метанол: :вода 70:30:5);

Rf 0,57 (метиленхлорид:метанол 5:1).

Пример 7. К раствору, состо щему из 2,85 г (2,09 ммоль) полученной согласно примеру 5 натриевой соли N-пропионил-десметилмурамил -L-аланил-Б-глютамил-( Col.)-трет.-бу- тилэфир-(С у)-Ъ-аланин-2-(1,2-дипал- митоил-Зп-глицеро-З-оксифосфорилок- си) этиламида и 112 мл абс, метилен- хлорида, добавл ют трифторуксусной кислоты и все перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре. Затем бесцветный прозрачный раствор упаривают в вакууме при 30°С и полученный таким образом остаток несколько раз ввод т в метиленхлорид и снова упаривают .

Получают 3,0 г бесцветного масла, растворенного в 350 мл смеси фосфат- буферного раствора хлорида натри

(по 0,1 М, 1:1, рН 7), фильтруют в AMICON-диализаторе (модель 402, ультрафильтр РМ 0 30/76 мм) при 3 атм. Затем фильтруют дл удалени хлоридов в противотоке з общей слож- ности 2,1 л бидистиллированной БОДЫ. Раствор, оставшийс в диализаторе (приблизительно 50 мл) лиофилизируют в высоком вакууме. Получают бесцвет

0

5

,

п

д г

л

г

ный лиофилизлт, который очищают методом хроматографии на колонне на 260 г гел кремневой кислоты (60, 0,063-0,200 мм) в системе хлороформ: :метанол:вода 70:30:5 (10 мл фракций ) .

Фракции 90-260 объедин ют и упаривают в глубоком вакууме без нагрева (охла дение) до сухого состо ни . Остаток ввод т в 250 мл бидистиллированной воды и затем в AMICON-диализаторе (модель 402, ультрафильтр ПМ 0 30/76 мм) упаривают при 3 атм до ;приблизительно 50 мл, затем последовательно фильтруют дл удалени хлоридов в противотоке 250 мл фосфатного буферного раствора - хлорид натри (по 0,1 М 1:1, ) и 175 мл бидистиллированной воды. Раствор, оставшийс в диализаторе, стерильно, фильтруют, затем;пропускают через два фильтра с миллипорами (NAL GENES, 0,45 мкм соответственно 0,2 мкм) и лиофилизируют в высоком вакууме.

Получают динатриевую соль (Cii)-L- -аланин-2-(1,2-дипальмитоил-8п-глице- ро-3-оксифосфорилокси)-этиламида Н-пропионилдезметилмурамил-Ь-аланил- D-глютаминовой кислоты в виде бесцветного гидроскопического порощка, со- деркап.его 4,8 моль воды.

ы-

40

-6,1 + 1°С (с 0,489;

метиленхлорид:этанол 1:1);

Rf 0,28 (уксусный эфир:и-бута- нол:пиридин:уксусна кислота:вода 41:21:21:6:10);

Rf 0,62 (ацетонитрил:вода 3:1), выход соли 1,04 г (36,4%).

Пример 8. 4,5 г(ммоль) натриевой соли N-aцeтил-мypaмил-L-aлa- нил-В-глютамил-(С Ы) -трет.-бутилзфир- -(С1)-Ь-аланин-2-( 1 ,2-дипалмитоил- -Sn-глицеро-З-оксифосфорилокси)-этил- амида, высушенной в высоком вакууме над п тиокисью фосфора, раствор ют в 75 мл сухого дихлорметана. Охлаждают до 0°С и при помешивании в абсолютных услови х ввод т 25 мл безводной трифторуксусно КИСЛОТЫ И за- тем нагревают до комнатной температуры . Через 2 1/2 ч прозрачный бесцветный раствор упаривают в роторном испарителе при комнатной температуре (приблизительно до 10 мл), многократно смешивают с дихлорметаном в количестве по 100 мл и наконец снова упаривают.

23

Сырой продукт дважды очищают путем хроматографии на 400 г гел коем- невой кислоты 60 (дл каждого раза 400 г) в системе хлороформ:метанол: :вода 70:30:5. Продукт, содержащийс во фракци х 9-172,-раствор ют в 100 мл дважды дистиллированной воды и чист т путем фильтрации (AMICON - мешалка 402, ультрафильтр РМ 10/76 мм) аналогична примеру 1. Раствор фильтруют с помощью фильтра с миллипорами (0,2 мкм) и лиофилизи- руют. Получают ..динатриевую соль ( -Ь-аланин-2-(1,2-дипалмитоил-Бп-гли- церо-3-оксифосфорилокси)-этиламида К-ацетил-мурамил-Ь-аланил-В-глютами- новой кислоты, содержащую 4,89 моль воды, в виде бесцветного рыхлого порошка .

2.О

Ccilj, 10+1 С°(С 0,675; мета нол), выход соли 1,1 г (25%);

Rf 0,08 (хлороформ:метанол:во- да 70:30:5);

Rf 0,15 (этиловый эфир уксусной кислоты:h-бутанол:пиридин:уксусна кислота:вода 42:21:21:6:10);

Rf 0,30 (хлороформ:метанол:вода :уксусна кислота 70:40:9:1).

Проведены биологические испытани полученных предложенным способом солей мурамилпептидов.

Альвеол рные макрофаги крыс,полу- ченные при промывке легких, инкубируют 24 ч ли бо с липосомами, включающими активное вещество, либо в физи ологическом растворе с активным веще ством. Ввод т опухолевые клетки, мар Кированные I. Инкубируют 72 ч. По гибшие опухолевые клетки отмывают, определ ют число живых клеток по их радиоактивности. Активность макрофагов оценивают на основе клеточной токсичности., т.е. по числу животных, погибщих при опытах. Удельна клеточ на токсичность (%) рассчитьшалась следующим образом:

100

срм в опухолевых клетках, ин кубированных макрофаги актив ным началом

срм в опухолевых клетках, ин кубированных макрофаги и PBS Опыты проведены со следующими соединени ми:

I - натриева соль N-ацетил-му рамил-Ь-аланил-В-глютамил -(СУ)-Ъ-аланил-2-(1,2-ди- палмитоил-Бп-глииеро-З-ок- сифосфорилокси)-этиламида;

15

25

9951624

11 - натриева соль N-пропионил-нормурамил-11-аланил-В- . -глютамил (Сс)1)-п-бутиловьпт эфир-(СУ)-Ь-аланил-2-( 1 ,2- 5-дипальмитоил-Зп-глицеро-3-оксифосфорилокси )-этил- амида, (пример 5); III - натриева соль N-пропионил-нормурамил-Ь-аланил-В -глютамил ( COL)-п-метил эфир- -(С)-Ь-аланил-2-(1 ,2-ди- пальмитоил-Бп-глицеро-З- -оксифосфорилокси)-этил- амида (пример 4); IV - натриева соль N-ацетил- -мурамил-Ь-аланил-Б-глю- тамил-(Cd) -трет.-бутилэфир -(су) -Ь-аланин-2-(1,2-ди- пальмитоил-Зп-глицеро-З- 20 -оксифосфорилокси)-этил- амида (пример 3); V - натриева соль N-ацетил-г -мурамил-Ь-аланил-р-глюта- мил-(Со1.)метш10вый сложный эфир (СУ)-Ь-аланин-2-(1 ,2- -дипaльмитoил-Sn-глицepo- -3-oкcифocфopилoкcи)-этил- амида (пример 2); VI - натриева соль N-пропионил-нормурамил-Ъ-аланил-Б- -глютамил-(Col)-сложный трет.-бутиловый эфир-(су)- -аланин-2-(I,2-дипальмит- тоил-8п-глицеро-3-оксифос- 35 форилокси)- этиламида (пример 6).

Полученные результаты сведены в табл. 1.

40

Проведено сравнение производных

мурамилпептидов обшей формулы I с известным соедийением.

Испытание на пирогенность проведе- но на кроликах и показало, что при подкожном введении высоких доз, как 30 мг/кг К-ацетил-мурамил-Ь-аланил- -D-глютамил- (Cd.) -м-Путил эфир- (C,V} -L- -аланин-2-(1,2-дипальмитоил-5п-гли- Q церр-3-оксифосфорилокси)-этиламид- -соль натри (соединение II) не наблюдаетс пирогенного эффекта.

В противоположность этому при тех же дозах натриевой соли N-ацетил- j -мурамил-Ь-аланил-В-изоглютаминил-Ь- -аланин-2-(1,2-дипалмитоил-Зп-глице- ро-3-оксифосфорилокси)-этиламида (VIl) наблюдаетс сильное повьш1ение температуры.

30

25

Результаты испытани на пироген- ность при внутривенном введении испытуемых соединений в дозе 1 мг./кг показаны в табл. 2.

Результаты показьшают, что измен ние температуры ( лТ С) в случае предложенных соединений примерно в 2-4 раза ниже, чем в случае известнго соединени уНо Кроме того, мура илпептиды формулы I могут успешно примен тьс дл профилактики и лечени заболеваний, вызьшаемых ДНК - врусами с кубической симметрией и ну леокапсидом без оболочки, ДНК - вирусами с вирионом в оболочке, а также РНК - вирусами с кубической сим- метрией капсида и РНК - вирусами со спиральной симметрией капсида.

Соединени формулы I предпочтительно использовать в случае ДНК- вирусов с вирионом в оболочке и кубческой симметрией капсида, в случае РНК-вирусов с кубической симметрией капсида и варионом без оболочки, а также в случае РНК-вирусов со спиральной симметрией капсида, в котор нуклеокапсидна оболочка расположен у наружной поверхности мембраны, и, кроме того, в случае Adenoviridae, Poxvirides, Coronaviridae, в частности , при человеческих Coronaviren.

В первую очередь соединени сЬор- fyлы I примен ют в случае Herpesvir dae, picornaviridae, Myxoviren, a

также в сл. учае masfadenviren, в час

ности человеческих заболеваний, причем сильное действие про вл етс не только в случае бактериальных возбудителей , но и против вирусных возбудителей . Эти-соединени про вл ют длительное профилактическое или терпевтическое действие, дл щеес от многих дней до нескольких недель после однократного приема соединений формулы I, получаемых предложенным способом, а такхе эффективное воздействие на широкий спектр вирусных возбудителейо

Проведены испытани антивирусной активности предложенных соединений.

А натриева соль N-ацетилмура- мил-Ъ-аланил-С-глютаминовой кислоты -(СУ)-Ъ-аланил-2-(1,2-дипальмитоил- -сн глицеро-3-оксифосфорш1окси) - -этиламид.

В натриева соль N-ацетилмура- мил-Ъ-аланил-Б-глютамил-(Су)- -бутил овьй сложный эфир-(Сс1-)-Ь-аланин

26

0

15

5

35 фдр

-2-(1,2-дипальмитоил-сн-глицеро-З- -оксифосфорилокси)-этиламид.

С натриева соль N-ацетилмура- мил-Ьаланил-В-глютамил-(G У)-метиловый сложный эфир-(Сс1)-Ь-аланин-2- (1,2-дипальмитош1-сн-глицеро-3-окси- фосфорилокси)-этиламидо Каждую из 20 и 30 самок мышей - MF-2f SPP весом кажда по 1А-16 г заражают через нос, примен легкую анастезию и использу смесь из равных частей ди- этилового эфира, этанола и хлороформа , образующих пластинки единицами вирусовых штамов Influenza А(Texas) 1/77 (адаптирующихс мьппами) в количестве 1- в виде 0,05 мл взвеси вирусов .

В указанный срок дл заражени в организм каждой их мышей ввод т единожды (единична доза) согласно табл. 1 количестт о активного ингредиента в 0,2 мл 0,005%-ного по весу раствора натрий-карбоксиметилцеллюло- уе зы В дважды дистиллированной воде через нос или через рот.

Остальные из числа указанных мышей , т.е. 10 или 20 животных служат в качестве контрольных: им ввод т плацебо (0,005%-ный по массе раствор натрий-карбоксиметилцеллюлозы)„

Через нос активный ингредиент ввод т , примен легкую анестезию с использованием смеси из равных частей диэтилового эфира, этанола и хлоро0

30

0

5

0

5

Процентное количество мьш1ей, оставшихс в живых через 24 дн. после заражени , приведено в табл. 3.

Проведено сравнение с известным антивирусным агентом (действует на вирусы Influenza А) - амантадином. Действие амантадина начинаетс только при дозе в несколько мг/кг, значение ЛДдд дл мыгаей составл ет 700 мг/кг.

Предложенное соединени действуют уже при дозе 0,1 мг/кг, в определенных случа х уже при 0,01 мг/кг, в то врем как значени дл мышей составл ет более 3000 мг/кг. Это значит , что диапазон терапевтического действи предложенных соединений по сравнению с амантадином значительно шире. К тому же, предложенные соединени про вл ют антивирусное действие уже после их однократного применени не более чем за 7 дн, до зара27

жени или после него, в то врем как амантадип необходимо вводить уже до заражени , например за 24ч до заражени , и продолжать ежедневное введение в течение не менее 5дн., т.е. предложенные соединени про вл ют как терапевтическое , так и профилактическоедействие, в то врем как амантадин про вл ет только поофилактическое действие.

Ш20Н

29951628

Кроме того, производные мурамил- пептидов обпей (Формулы I малотоксичны . В табл. А показана остра токсичность , определ енна на мышах.

Claims

Формула изобретени

Способ получени солей мурамилпеп- тидов общей формулы I

)

дС-ш (DI) TQH-ef-Bi

/(D)

а)

O-TSJ-CH- C- IH-CH-CH CH -C-NH- II I 1 и с . о

/

о R

п .п

о Н СН.З о

где R, - С -С -алкил;

E - водород или с,-С -алкил, отличающийс тем, чтс. соединение общей формулы Л

снгОН

(HiOH)

/

НзС-Ш Ш) -NH-C-Ri

а) (D)он

O- -N-CH- C-TQH-CH-CHr-CHz-C

f IT rvr

0 H CHa 0

/Ч 0 ORj

о

он

-CH-C-Ml-CH -CHj-Q-p-OCH

снзQ

HM

:-o-CH

0

n I

Hsi-Cjs-C-O-CHj l (Stv)

где R, - имеет указанное значение; RJ.- С,-С,-алкил или защитна

группа карбоновой кислоты, ввод т во взаимодействие с L-аланил- -2-(1,2-дипальмитоил-3 -глицеро-3- -оксифосфорилокси)этиламидом формулы

(L) Н И H- N-CH-C-ИН-СНг-ШгО-Р-О-СНг

н снз О о о I

4iiCi5-l -0-СН

V I .

H3iCe-C-0-CH2 llSn)

или его солью, имеющие защитные груп- вьщ ел ют в виде соли.

группы отщепл ют и целевой продукт

40

29

Активное вещество

Удельна клеточна токсичность, %

0,2 мл РВ активного вещества, мг/культура

0,021 0, 2

3 23

39 21 81 18 5 29

Таблица2 СоединениеМ, °С

II+1,1

III+1,0

IV+0,69

V, +0,65

VI+0,48

Известное VII -+2,0

Таблица 3

Активный Вид ввода Врем вво-Процентное кол-во мьшей, оставшихс в жиингреди- да(кол-вовых после заражени и обработанных колиент дней)чеством активного ингредиента, мг/кг

перед зара-(n.t - not tested - испытани не проводи- жениемлись + после заражени )100 10 I 1 0,1 0,01 . 0-контроль

Оральный Оральный

+7

+7

129951630

Таблица i

Активное вещество в 100 мг липосомы на 0,2 мл, мг/культу- ра

20

0,02 0,2 1 2 J

20

74

64 64

56 10 76 68 60 73

51 23 79 52

44 11

80 70 80 n.t n.t 15 n.t n.t 58 30 30 О