PL142641B1 - Process for manufacturing novel muramyl peptides - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych peptydów muramylowych i ich soli, wykazujacych cenne wlasciwosci farmakologiczne.Nowe zwiazki sa objete ogólnym wzorem 1, w którym R1, R4 i R6 oznaczaja atomy wodoru, R2 oznacza rodnik alkilowy o 1—4 atomach wegla, R3 oznacza atom wodoru lub rodnik metylowy, R5 oznacza atom wodoru, R7 oznacza rodnik alki¬ lowy o 1—3 atomach wegla, R8 oznacza atom wo¬ doru lub nizszy rodnik alkilowy, X oznacza gru¬ pe NH, Y oznacza rodnik alkilidenowy o 1—4 ato¬ mach wegla, a R9 i R10 niezaleznie od siebie ozna¬ czaja rodnik alkilowy o 11—17 atomach wegla.Zwiazki o wzorze 1 maja w przypadku asyme¬ trycznego podstawienia konfiguracje: (D) przy atomie wegla laczacym sie z R3, (L) przy atomie wegla laczacym sie z R7, (D) przy atomie wegla laczacym sie z grupa —C—OR8, (L) w rodniku Y, oraz konfiguracje -a i/lub -|3 przy pierwszym ato¬ mie wegla grupy D-glikozy, tzn. zwiazki o wzo¬ rze 1 moga wystepowac jako czyste anomery lub jako mieszaniny anomeryczne.W celu oznaczenia konfiguracji na srodkowym atomie wegla czesci glicerynowej stosuje sie od¬ powiednio do regul IUPAC stereospecyficzna nu¬ meracje atomów wegla czesci glicerynowej, wy¬ rózniona przez przedrostek „sn". Najwyzszy atom wegla w rzucie Fischera pionowego lancucha we¬ glowego, przy czym grupa hydroksylowa przy dru¬ gim atomie wegla zajmuje polozenie z lewej stro- 10 15 ny, otrzymuje numer 1. W przypadku zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku gru¬ pa kwasu fosforowego jest zwiazana z trzecim atomem wegla w mysl numeracji stereospecyficz- nej.Poprzednio i nastepnie stosowany przymiotnik nizszy oznacza rodniki o 1—7, a zwlaszcza o 1—4, atomach wegla.Nizszym rodnikiem alkilowym jest np. rodnik n-propylowy, n-butylowy, izobutylowy, Il-rz.-bu- tylowy, Ill-rz.-butylowy, n-pentylowy, n-heksylo- wy lub n-heptylowy, a przede wszystkim rodnik metylowy, etylowy lub izopropylowy.W szczególnosci rodnikiem alkilowym Ra jest zwlaszcza rodnik metylowy, jezeli R3 stanowi rod¬ nik metylowy, albo rodnikiem R2 jest rodnik ety¬ lowy, jezeli R3 stanowi atom wodoru; rodnikiem alkilowym R7 jest zwlaszcza rodnik metylowy, 20 etylowy lub izopropylowy, a rodnikiem alkilowym R8 jest zwlaszcza rodnik alkilowy o 1—4 atomach wegla, korzystnie prostolancuchowy rodnik alki¬ lowy o 1—4 atomach wegla, przede wszystkim rodnik n-butylowy. 25 Rodnikiem alkilidenowym Y jest rodnik dwu- wartosciowy, w którym oba wiazania wychodza z tego samego atomu wegla, korzystnie rodnik polaczony w polozeniu — 1,1, zwlaszcza zas rodnik metylenowy, etylidenowy, propylidenowy lub izo- 30 butylidenowy. 142 641142 641 3 Rodnikiem alkilowym R9 lub R10 o 11—17 ato¬ mach wegla jest prostolancuchowy lub rozgalezio¬ ny, a zwlaszcza prostolancuchowy rodnik, przy czym R9 lub R10 oznaczaja przede wszystkim pro¬ stolancuchowy rodnik o nierównej liczbie atomów wegla, taki jak rodnik n-undecylowy lub n-tride- cylowy, korzystnie prostolancuchowy rodnik alki¬ lowy o 15—17 atomach wegla i o nierównej liczbie atomów wegla, tzn. rodnik n-heptadecylowy lub w szczególnosci rodnik n-heptadecylowy.Proton zwiazany poprzez tlen z atomem fosforu jest kwasowy i moze byc latwo odszczepiany za pomoca zasad i wymieniany na inny kation. Przy odczynie o wartosci pH = 7 zwiazki o wzorze 1 przeto wystepuja calkowicie lub w przewazajacej czesci w postaci spli. Sole te oraz mieszaniny kwas — sól równiez sa wytworzane sposobem we¬ dlug wynalazku. Korzystnymi sa wytworzone spo¬ sobem wedlug wynalazku, farmakologicznie do¬ puszczalne, nietoksyczne sole zwiazków o wzo¬ rze 1. Sa to przede wszystkim sole metali i sole amoniowe, takie jak sól metalu alkalicznego lub metalu ziem alkalicznych, np. sole sodu, potasu, magnezu lub wapnia, oraz sole amonowe lub sole z odpowiednimi aminami organicznymi, takimi jak nizsze alkiloaminy, np. z trójetyloamina.Do wyodrebnienia lub oczyszczania moga zna¬ lezc zastosowanie takze sole nieodpowiednie far¬ makologicznie. Do terapeutycznego stosowania na¬ daja sie jednak tylko farmakologicznie dopusz¬ czalne, nietoksyczne sole, które tym samym sa ko¬ rzystne.Nowe zwiazki o wzorze 1, w którym wszystkie symbole maja znaczenie podane przy omawianiu wzoru 1, oraz ich sole wytwarza sie sposobem po¬ legajacym wedlug wynalazku na tym, ze zwiazek o wzorze 2, w którym s, r i q niezaleznie od sie¬ bie oznaczaja liczbe 0 lub 1, a R8 oznacza nizszy rodnik alkilowy lub grupe zabezpieczajaca rodnik karboksylowy, zas pozostale podstawniki maja wyzej podane znaczenie, pod warunkiem, ze obec¬ ne w zwiazku « wzorze 2 wolne grupy funkcyjne z wyjatkiem grupy bioracej udzial w reakcji wy¬ stepuja ewentualnie w postaci zabezpieczonej, lub reaktywna pochodna tego zwiazku z kwasem kar- boksylowym, poddaje sie reakcji ze zwiazkiem o wzorze 3, w którym t, u i v niezaleznie od sie¬ bie oznaczaja liczbe 0 lub 1, R8 oznacza nizszy rodnik alkilowy lub grupe zabezpieczajaca rodnik karbafcsyiowy, a pozostale podstawniki maja wy¬ zej podane znaczenie, pod warunkiem, ze t, u i v stanowia liczbe 1, jezeli w reagencie o wzorze 2 symbol q stanowi liczbe 0, lub ze t stanowi licz¬ be fi, u stanowi liczbe 1, a v stanowi liczbe 1, je¬ zeli a stanowi liczbe 1, r stanowi liczbe lis sta¬ nowi liczbe 0, lub ze v stanowi liczbe 8, jezeli q, r i s stanowia liczby 1, lub poddaje sie reakcji z jego sola lub reaktywna pochodna i obecne ewentualnie grupy zabezpieczajacej odszczepia sie, a otrzymany zwiazek o wzorze X ewentualnie przeprowadza sie w sól lub otrzymana sól ewen¬ tualnie przeprowadza sie w inna sól.Reaktywna zestryfikowana grupa hydroksylowa jest np. grupa hydroksylowa zestryfikowana moc¬ nym kwasem nieorganicznym lub organicznym, 4 takim jak kwas nieorganiczny, np. kwas chlorow- cowodorowy, jak kwas chlorowodorowy, bromo- wodorowy lub jodowodorowy, nadto kwas siar¬ kowy, lub kwas chlorowcosiarkowy, np. kwas 5 fluorosiarkowy, albo mocnym organicznym kwa¬ sem sulfonowym, takim jak ewentualnie podsta¬ wiony chlorowcem, np. fluorem, nizszy kwas al- kanosulfonowy, lub jak aromatyczny kwas sulfo¬ nowy, np. ewentualnie podstawiony nizsza grupa 10 alkilowa, taka jak grupa metylowa, atomem chlo¬ rowca, takim jak atom bromu, i/lub grupa nitro¬ wa kwas benzenosulfonowy, np. grupa hydroksy¬ lowa, zestryfikowana kwasem metanosulfonowym, trójfluorometanosulfonowym lub p-toluenosulfono- is wym.W reaktywnej postaci wystepujaca grupa ami¬ nowa jest np. grupa aminowa zaktywowana na drodze reakcji z fosforynem, takim jak chloro- fosforyn dwuetylowy, chlorofosforyn etylenu, chlo- 20 rosulforyn 1,2-fenylenu, dwuchlorofosforyn etylo¬ wy lub pirifosforyn czteroetylowy. Reaktywna grupa aminowa jest np. takze halogenek kwasu karbaminowego lub izocyjanian, przy czym grupa aminowa jest zwiazana z chlorowcokarbonylowa, 25 np. z chlorokarbonylowa, lub wystepuje w postaci grupy izocyjanianu, przy czym w tym ostatnim przypadku dostepne sa tylko zwiazki o wzorze 1, które przy atomie azotu grupy amidowej utwo¬ rzonej w reakcji wykazuja atom wodoru. 30 Reaktywna pochodna kwasu karboksylowego jest np. sól cezowa, jezeli w reagencie o wzorze 2 wystepuje co najmniej jedna grupa hydroksylowa w reaktywnej zestryfikowanej postaci, albo jest reaktywny ester kwasu karboksylowego, reaktyw- 35 ny bezwodnik kwasu karboksylowego lub cyklicz¬ ny amid. Przy tym reaktywne pochodne kwasu mozna wytwarzac in situ.Zaktywowanymi estrami kwasów sa zwlaszcza estry nienasycone przy laczacym atomie wegla 40 rodnika estryfikujacego np. typu estrów winylo¬ wych, takich j,ak same estry winylowe mozna otrzymac np. droga przeestrowania odpo¬ wiedniego estru octanem winylowym; metoda zaktywowanych estrów winylowych), estry karba- 45 moilowinylowe (które mozna otrzymac np. droga traktowania odpowiednich kwasów odczynnikiem izoksazoliowym; metoda 1,2-izoksazoliowa lub me¬ toda Woodward'a), lub nizsze estry 1-alkoksywi- nylowe (które mozna otrzymac np. traktujac od- so powiednie kwasy nizszym alkoksyacetylenem; me¬ toda etoksyacetylenowa), lub estry typu amidyno- wego, takie jak N,N'--dwu-podstawioiie amidyno- estry (które mozna otrzymac np. traktujac odpo¬ wiedni kwas odpowiednim NjN^dwupodstawjgr 55 nym karbodwuimidem, np. N,N'-dwucykloheksylo- karbodwuimidem; metoda karbodwuimidawa), lub N,N-dwupodslawione amidynoestry (Jctóre mozna otrzymac np. traktujac odpowiedni kwas N,N- -dwupodstawionym cyjanamidem; metoda cyjana- oo midowa), odpowiednie estry arylowe, zwlaszcza estry fenylowe odpowiednio podstawione grupami przyciagajacymi elektrony (które mozna otrzymac np. traktujac odpowiedni kwas fenolem odpowied¬ nio podstawionym, np. 4-nitrofenolem, 4-metylo- 65 sulfonylo-fenolem. 2,4,5-trójchlorofenolem, 2,3,4,5,6-142 641 5 -pieciochlorofenolem lub 4-fenylodwuazofenolem, w obecnosci srodka kondensacyjnego, takiego jak N,N'-dwucykloheksylokarbodwuimid; metoda zak- tywowanych estrów arylowych), estry cyjanome- tylowe (które mozna otrzymac np. traktujac od¬ powiedni kwas chloroacetonitrylem w obecnosci zasady; metoda estrów cyjanometylowych), tio- estry, zwlaszcza fenylotioestry ewentualnie pod¬ stawione np. grupa nitrowa (które mozna otrzy¬ mac np. traktujac odpowiednie kwasy tiofenolami ewentualnie podstawionymi np. grupa nitrowa, m.in. za pomoca metody bezwodnikowej lub kar- bodwuimidowej; metoda zaktywizowanych tiolo- estrów), albo amino- lub amidoestry (które mozna otrzymac np. traktujac odpowiedni kwas za po¬ moca N-hydroksyamino- lub N-hydroksyamido- zwiazku, np. za pomoca N-hydroksysukcynimidu, N-hydroksypiperydyny, N-hydroksyftalamidu lub 1-hydroksybenztriazolu, np. wedlug metody bez¬ wodnikowej lub karbodwuimidowej; metoda zak- tywowanych N-hydroksyestrów).Reaktywnymi bezwodnikami moga byc syme¬ tryczne lub korzystnie mieszane bezwodniki tych kwasów, i tak np. bezwodniki z nieorganicznymi kwasami, takimi jak halogenki kwasowe, zwlasz¬ cza chlorki kwasowe (które mozna ctrzymac np. traktujac odpowiednie kwasy chlorkiem tionylu, pieciochlorkiem fosforu lub chlorkiem oksalilu; metoda chlorków kwasowych), azydki (które moz¬ na otrzymac np. z odpowiedniego estru kwasu po¬ przez odpowiedni hydrazyd i jego traktowanie kwasem azotawym; metoda azydkowa), bezwodni¬ ki z monopochodnymi kwasu weglowego, takimi jak odpowiednie estry, np. nizsze monoestry alki¬ lowe kwasu weglowego (które mozna otrzymac np. traktujac odpowiedni kwas nizszymi alkilo¬ wymi estrami kwasu chlorowcomrówkowego, np. chloromrówkowego, lub traktujac nizsza 1-alko- ksykarbonylo-2-alkoksy-l,2-dihydrochinolina, np. nizsza l-alkoksykarbonylo-2-etoksy-l,2-dihydrochi- nolina; metoda mieszanych bezwodników kwasu O-alkiloweglowego), lub bezwodniki z dwuchlo- rowcowanym, zwlaszcza dwuchlorowanym kwasem fosforowym (które mozna otrzymac np. traktujac odpowiedni kwas tlenochlorkiem fosforu; metoda tlenochlorków fosforu), lub bezwodniki z organicz¬ nymi kwasami, takie jak mieszane bezwodniki z organicznymi kwasami karboksylowymi (które mozna otrzymac np. traktujac odpowiedni kwas halogenkiem ewentualnie podstawionego nizszego kwasu alkanokarboksylowego lub fenyloalkano- karboksylowego, np. chlorkiem kwasu fenyloocto¬ wego, piwalinowego lub trójfluorooctowego; meto¬ da mieszanych bezwodników kwasu karboksylo¬ wego- lub bezwodniki z ograniczonymi kwasami sulfonowymi (które mozna otrzymac np. traktu¬ jac sól odpowiedniego kwasu taka jak sól metalu alkalicznego, halogenkiem odpowiedniego orga¬ nicznego kwasu sulfonowego, takim jak chlorek nizszego kwasu alkanosulfonowego lub arylosulfo- nowego, np. metanosulfonowego lub p-toluenosul- fonowego; metoda mieszanych bezwodników kwa¬ su sulfonowego), oraz symetryczne bezwodniki (które mozna otrzymac np. kondensujac odpowied¬ ni kwas w obecnosci karbodwuimidu lub 1-dwu- 6 etyloaminopropynu; metoda symetrycznych bez¬ wodników).Odpowiednimi cyklicznymi amidami sa zwlasz¬ cza amidy z piecioczlonowymi zwiazkami diaza- 5 cyklicznymi o charakterze aromatycznym, takie jak amidy z imidazolami, np. z imidazolem (które mozna otrzymac np. traktujac odpowiedni kwas N,N'-karbonylodwuimidazolem; metoda imidazoli- dowa), lub amidy z pirazolami, np. z 3,5-dwume- 10 tylopirazolem (które mozna otrzymac np. poprzez hydrazyd kwasu droga traktowania acetyloaceto- nem: metoda pirazolidowa).Grupami zabezpieczajacymi ewentualnie obecne grupy funkcyjne sa np. nizej omówione grupy za- 15 bezpieczajace.Reakcje mozna przeprowadzac w znany sposób, przy czym warunki reakcji przede wszystkim za¬ leza od tego, czy i jak jest zaktywowana grupa karboksylowa bioraca udzial w reakcji, zazwyczaj 20 reakcje prowadzi sie w obecnosci odpowiedniego rozpuszczalnika lub rozcienczalnika lub ich mie¬ szaniny, i, w razie potrzeby, w obecnosci srodka kondensujacego, który np., gdy grupa karboksylo¬ wa bioraca udzial w reakcji wystepuje w postaci 25 bezwodnika, moze tez byc srodkiem wiazacym kwas, w warunkach chlodzenia lub ogrzewania, np. w temperaturze od okolo — 30°C do okolo +150°C, w zamknietym naczyniu reakcyjnym i/lub w atmosferze gazu obojetnego, np. azotu. 30 Znanymi srodkami kondensacyjnymi sa np. kar- bodwuimidy, przykladowo N,N'-dwuetylo-, N,N'- -dwupropylo-, N,N'-dwucykloheksylo- lub N-ety- lo-N'-/3-dwumetyloaminopropylo/-karbodwuimid, odpowiednie zwiazki karbonylowe, przykladowo 35 karbonylodwuimidazol, lub zwiazki 1,2-oksazolicwe, np. 3'-sulfonian 2-etylo-5-fenylo-l,2-oksazoliowy i nadchloran 2-III-rz.-butylo-5-metyloizoksazoliowy, lub odpowiedni zwiazek acyloaminowy, np. 2-eto- ksy-l-etoksykarbonylo-l,2-dwuhydroksinolina. 40 Znanymi wiazacymi kwas srodkami kondensa¬ cyjnymi sa np. weglany lub wodoroweglany me¬ tali alkalicznych, np. weglan lub wodoroweglan sodowy lub potasowy (zwykle razem z siarczanem), lub zasady organiczne, takie jak nizsza trójalkilo- amina ze znana zawada przestrzenna np. N,N'- -dwuizopropylo-N-etyloamina.Korzystnie reakcje przeprowadza sie w ten spo¬ sób, ze zaktywowany ester kwasu karboksylowego M lub reaktywny bezwodnik kwasu karboksylowego lub cykliczny amid poddaje sie reakcji ze zwiaz¬ kiem o wzorze 3, w którym biorace udzial w re¬ akcji grupy hydroksylowe i/lub aminowe wyste¬ puja w wolnej postaci. 55 Grupy zabezpieczajace, ich wprowadzanie i od- szczepianie sa przykladowo opisane w „Protective Groups in Organie Chemistry", Plenum Press, Londyn, Nowy York 1973, i w „Methoden der or- ganischen Chemie", Houben-Weyl, 4 wydanie, 60 tom 15/1, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart 1974.Charakterystyczne dla grup zabezpieczajacych jest to, ze one latwo, tzn. bez wystapienia niepo¬ zadanych reakcji ubocznych, daja sie odszczepiac, np. solwolitycznie, redukcyjnie, fotolitycznie lub 65 tez w warunkach fizjologicznych.142 641 7 8 Grupami zabezpieczajacymi grupe hydroksylowa sa np. rodniki acylowe, takie jak ewentualnie pod¬ stawiony, np. chlorowcem, nizszy rodnik acylowy, przykladowo rodnik 2,2-dwuchloroacetylowy, lub rodniki acylowe monoestrów kwasu weglowego, zwlaszcza rodnik Ill-rz.-butyloksykarbonylowy, ewentualnie podstawiony rodnik benzyloksykarbo- nylowy, np. rodnik 4-nitrobenzyloksykarbonylowy, lub rodnik dwufenylometoksykarbonylowy, lub niftszy rodnik 2-chlorowcoalkoksykarbonylowy, ta¬ ki jak 2,2,2-trójchloroetoksykarbonylowy, nadto rodnik trójfenylometylowy lub formylowy, lub organiczne rodniki sililowe lub stannylowe, poza tym latwo odszczepialne grupy eteryfikujace, ta¬ kie jak nizsze grupy Il-rz.-alkilowe, np grupa Ill-rz.-butylowa, dalej 2-oksa- lub 2-tia-alifatycz- ne lub -eykloalifatyczne grupy weglowodorowe, przede wszystkim nizsza grupa 1-alkoksyalkilowa lub nizsza grupa 1-alkilo-tio-alkilowa, np. grupa metoksymetylowa, 1-metoksyetylowa, 1-etoksyety- lowa, 1-metylotiometylowa, 1-mcfrylotio-etylowa lub l-etylotioetylowa, albo grupa 2-oksa- lub 2-tia- cykloalltilowa o 5—6 atomach w pierscieniu, np. grupa tetrahydrofurylowa lub tetrahydropiranylo- wa lub odpowiednie tiaanalogi, oraz ewentualnie podstawiona nizsza grupa l-fenyloalkilowa, taka jak ewentualnie podstawiona grupa benzylowa lub dwufenylometylowa, przy czym jako podstawniki tych rodników fenylowych wchodza w rachube np chlorowce, takie jak chlor, nizsze grupy alko- kaylowe, takie jak grupa metoksylowa, i/lub gru¬ pa nitrowa.Reaktywnymi pochodnymi kwasu karboksylowe- go i zwiazku o wzorce 2 sa reaktywne estry, bez¬ wodniki lub amidy, takie jak wyzej omówione.Pochodne kwasów o wzorze 2 mozna wytwa¬ rzac takze in situ. I tak nao&na np. wytwarzac in situ N,N'-dwupodstawione amidynoestry, wprowa¬ dzajac w reakcje mieszanine substratu o wzorze 6 i kwasu o wzorze 5 w obecnosci odpowiedniego NtN'-dwupodstawionego karbodwuimidu, np. N,N'- -dwucykloheksylokarbodwuimidu.Nacjto mozna amino- lub amidoestry kwasów o wzorze 2 wytwarzac w obecnosci poddawanego acylowaniu substratu o wzorze 3, poddajac reak¬ cji mieszanine odpowiedniego kwasu i aminosub- stratu w obecnosci N,N'-dwupodstawionego karbo¬ dwuimidu, np. N^-dwucykloheksylokarbodwu- imidu, i N-hydroksyaminy lub N-hydroksyamidu, np. N-hydroksysukcynimidu, ewentualnie w obec¬ nosci odpowiedniej zasady, np. 4-dwumetyloamino- pirydyny.Pochodna zwiazku o wzorze 3, w którym grupa aminowa bioraca udzial w reakcji wystepuje w reaktywnej postaci, mozna wytwarzac np. na dro¬ dze reakcji z jednym z wyzej omówionych fosfo¬ rynów. HCaktywna postacia zwiazku o wzorze 3 jest np. tez halogenek kwasu karbaminowego lub izocyjanian, przy czym grupa aminowa bioraca udzial w reakcji jest W zwiazku o Wzorze 3 zwia¬ zana z grupa chlorowcokarbonylowa, np. z grupa chtorókarbonylowa, badz wystepuje w postaci gru¬ py izocyjanianu, przy czym w tym ostatnim przy¬ padku dostepne sa tylko takie zwiazki o wzorze 1, które przy atomie aaotu grupy amidowej utwo¬ rzonej w reakcji wykazuja atom wodoru.Korzystnie poddaje sie reakcji reaktywna po¬ chodna kwasu karboksylowego i zwiazku o wzo¬ rze 2, ze zwiazkiem o wzorze 3, w którym biorace 5 udzial w reakcji grupy aminowe wystepuja w wolnej postaci.Wreszcie wolny kwas o wzorze 2 mozna podda¬ wac reakcji ze zwiazkiem o wzorze 3, w którym grupa bioraca udzial w reakcji wystepuje w po¬ staci zaktywowanej.Acylowanie zwiazku o wzorze 3 lub jego reak¬ tywnej pochodnej zwiazkiem o wzorze 2 lub jego reaktywna pochodna kwasowa mozna przeprowa¬ dzic w znany sposób, przy czym warunki reakcji przede wszystkim zaleza od rodzaju stosowanego srodka acylujacego, zwykle reakcje prowadzi sie w obecnosci odpowiedniego rozpuszczalnika lub rozcienczalnika lub ich mieszaniny, i w razie po¬ trzeby, w obecnosci srodka kondensacyjnego, któ¬ ry np. w przypadku stosowania bezwodnika jako srodka acylujacego moze ewentualnie byc równiez srodkiem wiazacym kwas, w warunkach chlodze¬ nia lub ogrzewania, np. w temperaturze od okolo —30°C do okolo + 150°C, w naczyniu zamknietym i/lub w atmosferze gazu obojetnego, np. azotu.Substraty niezbednego do przeprowadzenia wy¬ zej omówionego sposobu sa znane lub moga byc wytwarzane znanym sposobem, np. analogicznie do poprzednio opisanego sposobu.Sole zwiazków o wzorze 1 przewaznie powstaja juz podczas obróbki, np. podczas dializy wobec roztworu buforowego z odczynem o wartosci pH «* 7. Mozna je wytwarzac w znany sposób.I tak sole zwiazków o wzorze 1 mozna tworzyc np, dzialajac zwiazkami metali, takimi jak sole metali alkalicznych i odpowiednich organicznych kwasów karboksylowych, np. sól sodowa kwasu a-etylokapronowego, lub dzialajac nieorganiczny¬ mi zwiazkami metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych, takimi jak odpowiednie wodorotlen¬ ki, weglany i wodoroweglany, np. wodorotlenek, weglan lub wodoroweglan sodowy lub potasowy, albo odpowiednimi zwiazkami wapniowymi lub amoniakiem lub odpowiednimi aminami organicz¬ nymi, przy czym korzystnie stosuje sie ilosci ste- chiometryczne lub mafy nadmiar srodka solotwór- czego.Mieszaniny izomerów mozna rozdzielac w zna¬ ny sposób, np. na drodze frakcjonowanej krysta¬ lizacji, chromatografii itp. na poszczególne izome¬ ry, racematy, np. tworzac pochodne z optycznie czynnymi zwiazkami i rozdzielajac tak otrzymane mieszaniny diastereoizomerów na optycznie czyn¬ ne enancjomery.Do szczególnie korzystnych postaci wykonania sposobu wedlug wynalazku zaliczaja sie nizej omó¬ wione postepowania a)—£). a) W przypadku wytwarzania soli htowcowej 2-/l)2-dwupalmitoilo-sn-glicero-S-hydroksyfosfory- loksy/-etyloamidu /Ca/-n-butylowego estru N-ace- tylomuramylo-L-alanylo-D-ghatamylo-/C7/-L-alani- ny poddaje sie reakcji /(V«n~butylowy ester kwa¬ su N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-gitxtaminowego z sola litowcowa 2-/l,2-dwupalnritoilo-sn-glicero-3- -hydroksyfosforylóksyAetyloamidu L-alaniny. 15 10 25 30 35 #0 45 •0 55 00142 641 9 b) W przypadku wytwarzania soli litowcowej 2-/l,2-dwupalmitoila-sn-glicero-3-hydroksyfosfory- loksy/-etyloamidu /Ca/-n-butylowego estru N-pro- pionylodezmetylomuramylo-L-alanylo-D-glutamylo- -/Cy-L-alaniny poddaje sie reakcji /C0/-n-butylo- wy ester /CY/-N-hydroksysukcynimidoestru kwasu N-propionylodezmetylomuramylo-L-alanylo-D-glu- taminowego z 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3- -hydroksyfosforyloksyZ-etyloamidem L-alaniny w obecnosci trójetyloaminy i otrzymana sól trójety- loamoniowa przeksztalca sie w sól litowcowa. c) W przypadku wytwarzania soli litowcowej 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosfory- loksy/-etyloamidu /Ca/-metylowego estru N-acety- lomuramylo-L-alanylo-D-glutamylo-/CY/-alaniny poddaje sie reakcji (C0/-metylowy ester /Cy/-N-hy- droksysukcynimidoestru kwasu N-acetylomuramy- lo-L-alanylo-D-glutaminowego z 2-/l,2-dwupalmi- toUo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy/-etyloami- dem L-alaniny w obecnosci trójetyloaminy i otrzy¬ mana sól trójetyloamoniowa przeksztalca sie w sól litowcowa. d) W przypadku wytwarzania soli trójetyloamo- niowej lub litowcowej 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn- -glicero-3-hydroksyfosforyloksy/-etyloamidu /Ca/- -metylowego estru N-propionylodezmetylomuramy- lo-L-alanylo-D-glutamylo-/CY/-L-alaniny poddaje sie reakcji /Cet/-metylowy ester /CY/-N-hydroksy- sukcynoimidoestru kwasu N-propionyladezmetylo- muramylo-L-alanylo-D-glutaminowego z 2-/1,2- -dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy/- -etyloamidem L-alaniny w. obecnosci trójetyloami¬ ny i otrzymana sól trójetyloamoniowa ewentual¬ nie przeksztalca sie w sól litowcowa. e) W przypadku wytwarzania soli trójetyloamo- niowej lub litowcowej 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn- -glicero-3-hydroksyfosloryloksy/-etyloamidu /Ca/- -Ill-rz.-butylowego estru N-acetylomuramylo-L- -alanylo-D-glutamylo-/CY/-L-alaniny reaktywny ester kwasu karboksylowego z /CaMU-rz.-butylo- wym estrem kwasu N-acetylomuramylo-L-alanylo- -D-glutaminowego poddaje sie reakcji z 2-/1,2- -dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy/- -etyloamidem L-alaniny w obecnosci trójetyloami¬ ny i otrzymana sól trójetyloamoniowa ewentual¬ nie przeksztalca sie w sól litowcowa. f) W przypadku wytwarzania soli trójetyloamo- niowej lub litowcowej 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn- -glicero-3-hydroksyfosforyloksy/-etyloamidu /Cc/- -Ill-rz.-butylowego estru N-propionylodezmetylo- muramylo-L-alanylo-D-glutamylo-/CY/-L-alaniny reaktywny ester kwasu karboksylowego z /CJ-llI- -rz.-butylowym estrem kwasu N-propionylodezme- tylomuramylo-L-alanylo<-D-glutaminowego poddaje sie reakcji z 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hy- droksyfosforyloksy/-etyloamidem L-alaniny w obecnosci trójetyloaminy i otrzymana sól trójety¬ loamoniowa ewentualnie przeksztalca sie w sól litowcowa.Omówione wyzej sposoby, wlacznie ze sposobem odszczepiania grup zabezpieczajacych i z dodatko¬ wymi srodkami postepowania przeprowadza sie w znany sposób np. w obecnosci lub bez rozpusz¬ czalników i rozcienczalników, i, w razie potrzeby, w obecnosci srodków kondensacyjnych lub kata- 10 lizatorów, w obnizonej lub podwyzszonej tempe¬ raturze, np. w temperaturze od okolo —209C do okolo +150°C, w zamknietym naczyniu i/lub w atmosferze gazu obojetnego, np. w atmosferze 5 azotu.Przy tym uwzgledniajac wszystkie, w czasteczce znajdujace sie podstawniki nalezy, w razie ko¬ niecznosci, np. w przypadku obecnosci rodników latwo ulegajacych hydrolizie, stosowac szczególnie 10 delikatne warunki reakcji, takie jak krótki czas trwania reakcji, wprowadzanie lagodnych srod¬ ków kwasowych lub zasadowych w niskim steze¬ niu, stechiometryczne stosunki ilosciowe, dobór odpowiednich katalizatorów, rozpuszczalniki, wa- 15 runki temperatury i/lub cisnienia.Chociaz zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalazku podpadaja pod bardzo ogólnie ujete ramy opublikowanego opisu nr 0025 495A europej¬ skiego zgloszenia patentowego, to jednak w opisie 80 tym nie zostal omówiony zaden charakterystyczny przedstawiciel tej klasy zwiazków. Zwiazki te mozna stosowac jako srodki immunostymulujace.W porównaniu ze zwiazkami wspomnianymi w opisie nr 0025 495A zwiazki wytworzone sposobem 25 wedlug wynalazku wykasuja silne zredukowanie niepozadanych dzialan ubocznych, a w szczegól¬ nosci sa one znacznie mniej pirogenlczne. Stwier¬ dzenie to ma wazne znaczenie, bowiem zaapliko¬ wanie substancji pirogenicznej ewentualnie moze 30 sprowokowac szok termiczny, dlatego tez bezpiecz¬ ne stosowanie jest wtedy zapewnione tylko pod stalym nadzorem lekarskim, a pewne postacie po- dawcze, takie jak dawki dozylne, musza byc po¬ mijane. 35 Badanie pirogenicznosci nizej wyszczególnionych substancji A-K mozna przeprowadzic na królikach wedlug przepisów podanych w farmakopei euro¬ pejskiej, tom 2, strony 56—59 (1971): A = sól sodowa 2-/l»2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3- 4« -hydroksyfosforyloksy/-etyloamidu N-acetylomura- mylo-L-alanylQ-D-izoglutaminylQ-L-alaniny, B = sól sodowa 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3- -hydroksyfosforylQksy/-etylQamidu /C0/-metylowe- go estru N-acetylomuramylo-Lralanylo-D-glutamy- 45 lo-/CY/-L-alaniny, C = sól sodowa 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3- -hydroksyfosforyloksy/-etyloamidu /Co/-n-butylo- wego estru N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-gluta- mylo-/CY/-alaniny, 5t D = sól sodowa 2-/ll2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3- -hydroksyfosforyloksyZ-etyloamidu /Ca/-III-rz.-bu- tylowego estru N-acetylomuramylo-L-alanylo-D- -glutamylo-/CY/-L-alaniny, E = sól dwusodowa 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-gli- 55 cero-3-hydroksyfosforyloksy/-etyloamidu kwasu N- -acetylomuramylo-L-alanylo-D-glutaminowego i /CY/-L-alaniny, F = sól sodowa 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3- -hydroksyfosforyloksyZ-etyloamidu N-propionylo- W dezmetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L- -alaniny, G = sól sodowa 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3- -hydroksyfosforyloksy/-etyloamidu /Ca/-metylowe- go estru N-propionylodezmetylomuramylo-L-alany- 65 io-D-glutamylo-/CY/-L-alaniny,142 641 11 H = sól sodowa 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3- -hydroksyfosforyloksy/-etyloamidu /Ca/-n-butylo- wego estru N-propionylodezmetylomuramylo-L- -alanylo-D-glutamylo-/CY/-L-alaniny, I — sól sodowa 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3- -hydroksyfosforyloksy/-etyloamidu /Ca/-III-rz.-bu- tylowego estru N-propionylodezmetylomuramylo- -L-alanylo-D-glutamylo-/CY/-alaniny, i K = sól dwusodowa 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-gli- cero-3-hydroksyfosforyloksy/-etyloamidu kwasu N- -propionylodezmetylomuramylo-L-alanylo-D-gluta- minowego i /CY/-alaniny.Zwiazki A i F sa opisane w przykladach 4 i 12 opublikowanego opisu nr 0 025 495A europejskiego zgloszenia patentowego, zwiazki B, C, D, E, G, H, Ii K zas wyszczególnione sa w podanych nizej przykladach II, I, III, VIII, IV, VI, V i VII. Dla nowych zwiazków B, C, D i E najblizszym pod wzgledem budowy chemicznej jest zwiazek A zna¬ ny ze wspomnianego opisu nr 0 Q25 495A, dla no¬ wych zwiazków G, H, I i K zas najblizszym pod wzgledem budowy chemicznej jest zwiazek F zna¬ ny z cytowanego opisu nr 0 025 495A.Róznica strukturalna wywodzi sie z innej defi¬ nicji podstawnika R8 w nowych zwiazkach.Próbe pirogenicznosci przeprowadzono na króli¬ kach wedlug szczególowych wskazówek, zawar¬ tych w farmakopei europejskiej, tom 2, strony 56—59 (tekstu niemieckojezycznego), (1971). Reasu¬ mujac, osobnikom grupy trzech SPF-szynszylo- wych mieszanców królika mierzono automatycz¬ nie (w aparacie Hewlett-Packard^ typu 3052 A) co 30 minut temperature odbytu. Króliki utrzymy¬ wano w temperaturze pokojowej 18 ± 2°C przy 60 ± 10% wilgotnosci wzglednej powietrza i przy 14-godzinnym oswietleniu w ciagu doby.Po trzykrotnych pomiarach temperatury odbytu kazdego królika okreslono poczatkowa tempera¬ ture, jako wartosc srednia z dwóch ostatnich tem¬ peratur odbytu, a nastepnie dawke 1 mg/kg testo¬ wanej substancji, rozpuszczonej W fizjologicznym roztworze chlorku sodowego, aplikowano do zyly usznej tylnej kazdego królika. Dalej okreslano temperature 7-krotnie w ciagu nastepnych 3 go¬ dzin. Od najwyzszej temperatury, otrzymanej w okresie tych trzech godzin dla kazdego królika, odejmowano temperature poczatkowa danego kró¬ lika. Sume róznic temperatur, tak otrzymana dla trzech królików, podano nizej w tablicy 1.Tablica 1 Zwiazek A B C D E F G H I K Przyrost temperatury [°C] 2,0 1,0 1,1 0,42 0,55 1,14 0,48 0,69 0,65 0,33 12 Z zestawionych wyników doswiadczalnych widac, ze przyrost temperatury wywolany zwiazkami B, C, D i E stanowi zaledwie 20—50% przyrostu wy¬ wolanego zwiazkiem A, oraz ze przyrost tempe- 5 ratury wywolany zwiazkami G, H, I i K stanowi okolo 30—60°/o przyrostu wywolanego zwiazkiem F.Wyniki te wyraznie swiadcza o tym, ze zwiazki B, C, D, E, G, H, I i K znacznie róznia sie od znanych zwiazków A i F pod wzgledem toksyko¬ logicznych efektów ubocznych.Wytworzone sposobem wedlug wynalazku zwia¬ zki mozna stosowac tak, jak podano w publiko¬ wanym opisie nr 0025 495A europejskiego zglosze¬ nia patentowego.Ze wzgledu na znakomita tolerancje nowych zwiazków nadaja sie one szczególnie do zapobie¬ gania i do leczenia chorób zakaznych, przy czym silne dzialanie wystepuje nie tylko w przypadku bakteryjnych czynników chorobotwórczych, lecz nieoczekiwanie takze w przypadku wirusowych czynników chorobotwórczych. To ostatnie stwier¬ dzenie nie bylo dotychczas znane i ma wielkie znaczenie praktyczne, poniewaz do leczenia chorób wywolanych przez wirusy dotychczas byly do dys¬ pozycji farmaceutyki tylko w zupelnie niedosta¬ tecznej mierze. Godnym zauwazenia jest przede wszystkim dlugi okres trwania dzialania profi¬ laktycznego lub terapeutycznego rzedu wielu dni do kilku tygodni po jednorazowym zaaplikowa¬ niu nowej substancji czynnej wytworzonej sposo¬ bem wedlug wynalazku i szeroki zakres wiruso¬ wych czynników chorobotwórczych, przeciwko któ¬ rym te zwiazki sa skuteczne.Peptydy muramylowe o wzorze 1 mozna stoso¬ wac zwlaszcza do zapobiegania i leczenia chorób, które wywolywane sa przez nizej wyszczególnio¬ ne wirusy [odnosnie nomenklatury porównaj J. L. Melnick, Próg. med. Virol. 26, 214^-232 (1980) i 28, 208—221 (1982)]: DNA-wirusy o symetrii ku- bicznej i o nukleokapsydzie bez blonki, DNA-wi¬ rusy z odslonietym wirionem oraz RNA-wirusy o kubicznej symetrii kapsydu i takze wirusy o spi¬ ralnej symetrii kapsydu.Korzystnie stosuje sie zwiazki o wzorze 1 w przypadku DNA wirusów o oslonietym wirionem i o kubicznej symetrii kapsydu, w przypadku RNA-wirusów o kubicznej symetrii kapsydu i o nieoslonietym wirionie i w przypadku RNA-wiru¬ sów o spiralnej symetrii kapsydu, w których blon- ka nukleokapsydu jest polozona przy blonie ze¬ wnetrznej, ale tez w przypadku wirusów z rodzin Adenoviridae, Poxviridae i Coronaviridae, takich jak ludzkie koronawirusy.Przede wszystkim stosuje sie zwiazki o wzorze 1 w przypadku rodzin Herperveridae, Picornaviri- dae i myksowirusów, ale takze w przypadku ma- stadenowirusów, takich zwlaszcza jak ludzkie ade- nowirusy, w przypadku wirusów z rodziny Chor- dopoxvirinae, takich glównie jak ortokswiurusy, a zwlaszcza np. wakcyniawirusy, w przypadku Reoviridae, szczególnie takich jak rotawirusy (zwlaszcza ludzkie), oraz w przypadku Caliciviri- dae i Rhabdoviridae, przede wszystkim takich jak wirusy pecherzykowego zapalenia jamy ustnej u ludzi oraz u koni, bydla i swin. 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6013 Glównie stosuje sie zwiazki o wzorze 1 w przy¬ padku wirusów z rodziny Alphaherpervirinae, ri- nowirusów, kardiowirusów i wirusów z rodziny Orthomyzoviridae, ale równiez w przypadku Be- taherpesvirinae, zwlaszcza takich jak wirus cyto- megalii ludzkiej, w przypadku wirusów pryszczy¬ cy, przede wszystkim w przypadku wirusów prysz¬ czycy zwierzat parzystokopytnych, glównie takich jak bydlo, oraz w przypadku Paramyxoviridae, przede wszystkim takich jak pneumowirusy, np. oddechowe wirusy oskrzelowe u ludzi, a obok nich wirusy odry lub paramyksowirusy, takie np. jak wirusy parainfluency ludzkiej wlacznie z wirusa¬ mi Sendai.W szczególnosci zwiazki o wzorze 1 stosuje sie w przypadku wirusów Simplex, np. ludzkich wi¬ rusów Herpes simplex typu 1 i 2, w przypadku ludzkich wirusów FMC i w przypadku wirusów grypy, glównie wirusów grypy typu A i B, np, wi¬ rusów nazwanych w przykladach.Peptydy muramylowe o wzorze 1 mozna stoso¬ wac do zapobiegania lub leczenia zakazen wiru¬ sowych aplikujac je dojelitowo lub pozajelitowo, przede wszystkim razem z odpowiednimi nosni¬ kami lub substancjami pomocniczymi.Korzystnie aplikuje sie je na blone sluzowa, np. wewnatrznosowo, doodbytniczo, dopochwowo lub na spojówke oczu, albo doustnie. Efekt antywiru¬ sowy wystepuje jednak takze po zaaplikowaniu na innej drodze, np. podskórnie, dozylnie, domie¬ sniowo lub po zaaplikowaniu, na zwykla skóre.To, który z rodzajów aplikowania jest najodpo¬ wiedniejszy, zalezy m.in. od rodzaju danego wi¬ rusa, np. wzgledem wirusów oddechowych nalezy w wielu przypadkach uznac za najkorzystniejsze podawanie wewnatrznosowe.Dawkowanie substancji czynnej zalezy m.in. od gatunku stalocieplnego, od czasu odpornosci orga¬ nizmu, od sposobu podawania i od rodzaju wirusa.Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalaz¬ ku maja dalsza, bardzo interesujaca wlasciwosc powstrzymywania tworzenia sie metastaz w przy¬ padku kilku guzów, zwlaszcza pluc, co doswiad¬ czalnie mozna wykazac w modelu B16-BL6-czer- niaka i w przypadku Lewis'a raka pluc, przy czym szczególnie korzystne jest aplikowanie w liposo- mach.Wyróznic nalezy zwiazki o wzorze 1, w którym R8 oznacza jeden z omówionych rodników alkilo¬ wych, i ich sole.Korzystnymi sa zwiazki o wzorze 1, w którym R1, R4 i R6 oznaczaja atomy wodoru, R2 oznacza rodnik metylowy lub etylowy, R3 oznacza atom wodoru, jesli R2 oznacza rodnik etylowy, lub R3 oznacza rodnik metylowy, jesli R2 oznacza rodnik metylowy, R5 oznacza atom wodoru, R7 oznacza rodnik alkilowy o 1—2 atomach wegla, R8 oznacza prostolancuchowy rodnik alkilowy o 1—4 atomach wegla, X oznacza grupe NH, Y oznacza rodnik etylidenowy, a R9 i R10 niezaleznie od siebie ozna¬ czaja prostolancuchowy rodnik alkilowy o 15—17 atomach wegla i o nieparzystej liczbie atomów wegla, i ich sole.Szczególnie korzystnymi sa wyzej omówione zwiazki o wzorze" 1, w którym R9 tak samo jak 641 14 R10. oznacza rodnik n-pentadecylowy, i ich sole, oraz zwiazki podane w przykladach.Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalaz¬ ku mozna stosowac w postaci preparatów farma¬ ceutycznych, które zawieraja farmakologicznie sku¬ teczna ilosc nowej substancji czynnej ewentualnie razem z farmakologicznie dopuszczalnymi nosnika¬ mi, nadajacymi sie do podawania dojelitowego, np. doustnego lub doodbytniczego, lub do poda¬ wania pozajelitowego, przy czym nosniki te mo¬ ga byc nieorganiczne lub organiczne, stale lub cie¬ kle. I tak stosuje sie tabletki lub kapsulki zela¬ tynowe, które zawieraja substancje czynna razem z rozrzedzalnikami, takimi jak laktoza, dekstroza, sacharoza, mannit, sorbit, celuloza iflub gliceryna, i/lub ze srodkami poslizgowymi, takimi jak zie¬ mia okrzemkowa, talk, kwas stearynowy, lub jego sole, np. stearynian magnezu lub wapnia, i/lub jak glikol polietylenowy.Tabletki moga równiez zawierac srodki wiazace, np. glinokrzemian manganu, skrobie, takie jak skrobia kukurydziana, pszeniczna lub ryzowa, ze¬ latyny, metyloceluloze, sól sodowa karboksymetylo- celulozy i/lub poliwinylopirolidon, i na zadanie, srodki rozkurczajace, np. skrobie, agar, kwas al¬ ginowy lub jego sól, taka jak alginian sodowy, i/lub mieszaniny musujace, lub srodki adsorpcyj- ne, barwniki, substancje polepszajace smak i sub¬ stancje slodzace.Nadto farmakologicznie czynne substancje wy¬ tworzone sposobem wedlug wynalazku mozna sto¬ sowac w postaci preparatów podawanych pozaje¬ litowo lub w postaci roztworów do wlewu. Taki¬ mi roztworami sa korzystnie izotoniczne wodne roztwory lub zawiesiny, które mozna sporzadzac przed uzyciem, np. z preparatów liofilizowanych, zawierajacych substancje czynna sama lub lacznie z nosnikiem, np. mannitem. Preparaty farmaceu¬ tyczne moga byc wyjalowione i/lub moga zawie¬ rac substancje pomocnicze, np. srodki konserwu¬ jace, stabilizujace, zwilzajace iAub emulgujace, srodki wspomagajace rozpuszczalnosc, sole do re¬ gulowania cisnienia osmotycznego iAub substancje buforowe.Nowe preparaty, które ewentualnie moga zawie¬ rac dalsze substancje farmakologicznie czynne, ta¬ kie jak antybiotyki, sporzadza sie na znanej dro¬ dze, np. za pomoca tradycyjnych sposobów miesza¬ nia, granulowania, rozpuszczania lub liofilizowania, 50 a moga one zawierac okolo 0,001—99%, zwlaszcza okolo 0,01—10°/o, korzystnie 0,1—5% jednej lub wie¬ lu substancji czynnych, przy czym odpowiednie jest stezenie substancji czynnej ponizej 1%, zwlaszcza w przypadku preparatów aplikowanych 55 miejscowo.Dla zapobiegania i leczenia zakazen wirusowych szczególnie odpowiednimi sa nastepujace, miejsco¬ wo aplikowane postacie podawcze: kremy, mascie lub pasty ó zawartosci 0,001—1%, zwlaszcza 0,01— 60 —i«/o, np. 0,05% substancji czynnej, np. mascie do wewnatrznosowego aplikowania lub szminki do ust, albo wodne roztwory o zawartosci 0,001—1%, zwlaszcza 0,05—0,5%, np. 0,1% substancji czynnej, korzystnie izotoniczne roztwory wyjalowione i fi- 65 zjologicznie dopuszczalne, np. krople do oczu, ko-142 641 15 16 rzystnie w mikropojemnikach do jednorazowego uzytku, albo aerozole do stosowania w jamie ust¬ nej i w jamie gardla.Kremami sa emulsje typu olej-w-wodzie, wyka¬ zujace wiecej niz SO^/o wody. Jako oleiste podloze stosuje sie przede wszystkim alkohole tluszczowe, np. alkohol laurylowy, cetylowy lub stearylowy, kwasy tluszczowe, np. kwas palmitynowy lub ste¬ arynowy, ciekle lub stale woski, np. mirystynian izopropylowy, lanoline lub wosk pszczeli i/lub we¬ glowodory, np. wazeline (petrolatum) lub olej pa¬ rafinowy.Jako emulgatory wchodza w rachube substancje powierzchniowo-czynne o wlasciwosciach przewa- zajaco hydrofilowych, takie jak odpowiednie emul¬ gatory niejonowe, np. estry kwasów tluszczowych i polioli lub ich adduktów z tlenkiem etylenu, ta¬ kie jak wieloglicerynowe estry kwasów tluszczo¬ wych lub estry kwasów tluszczowych z polioksy- etylenoanhydrosorbitem (o nazwie handlowej Tweens), polioksyetylenowe estry alkoholi tlusz¬ czowych lub polioksyetylenowe estry kwasów tlusz¬ czowych, albo jak odpowiednie emulgatory jono¬ we, przykladowo sole metalu alkalicznego i siar¬ czanów alkoholi tluszczowych, np. siarczan laury- lowosodowy, siarczan cetylowosodowy lub siarczan stearylowosodowy, które zwykle stosuje sie w obecnosci alkoholi tluszczowych, np. w obecnosci alkoholu cetylowego lub stearylowego. Dodatkami do fazy wodnej sa m.in. srodki, które zmniejszaja wysychanie kremów, np. poliol, taki jak gliceryna, sorbit, glikol propylenowy i/lub glikole polietyle¬ nowe, nadto srodki konserwujace, substancje za¬ pachowe itp.Masciami sa emulsje typu woda-w-oleju, które zawieraja co najwyzej 70*/o, korzystnie jednak okolo 20—50% wody lub fazy wodnej. Jako faza tluszczowa wchodza w rachube przede wszystkim weglowodory, np. wazelina, olej parafinowy i/lub parafina twarda, które w celu polepszenia zdol¬ nosci wiazania wody korzystnie zawieraja odpo¬ wiednie hydroksyzwiazki, takie jak alkohole tlusz¬ czowe lub ich estry, np. alkohol cetylowy lub al¬ kohole lanolinowe, badz lanoline. Emulgatorami sa odpowiednie substancje lipofilowe, takie jak ester kwasu tluszczowego z anhydrosorbitem (o nazwie handlowej Spans), np. oleinian anhydro- sorbitu i/lub izostearynian anhydrosorbitu. Dodat¬ kami do fazy wodnej sa np. srodki utrzymujace wilgoc^ takie iak poliole, np. gliceryna, glikol pro¬ pylenowy, sorbit i/lub glikol polietylenowy, jak srodki konserwujace, substancje zapachowe, itp.Mascie tluste sa bezwodne i jako podloze za¬ wieraja zwlaszcza weglowodory, np. parafine, wa¬ zeline i/lub ciekla parafine, nadto naturalne lub pólsyntetyczne tluszcze, np. trójgliceryd kokoso¬ wego kwasu tluszczowego, lub korzystnie oleje utwardzone, np. uwodorniony olej arachidowy lub racznikowy, dalej estry niepelne gliceryny z kwa¬ sem tluszczowym, np. mono* i dwustearynian gli¬ ceryny, oraz np. wspomniane przy omawianiu ma¬ sci alkohole tluszczowe, emulgatory i/lub dodatki, zwiekszajace zdolnosc wchlaniania wody.Pastami sa kremy i mascie, zawierajace pudro¬ we skladniki o wlasciwosciach absorbujacych wy¬ dzieline, takie skladniki, jak tlenki metali, np. tle¬ nek tytanu lub tlenek cynku, nadto talk i/lub gli- nokrzemiany, których zadaniem jest zwiazanie 5 obecnej wilgoci lub wydzieliny.Pianki aplikuje sie ze zbiorniczków cisnienio¬ wych i sa one cieklymi emulsjami typu olej-w- -wodzie, wystepujacymi w postaci aerozolu, przy czym jako propelent aerozolowy stosuje sie chlo¬ rowcowane weglowodory, takie jak nizsze chloro- fluoroalkany, np. dwuchlorodwufluorometan i dwu- chloroczterofluoroetan. Jako faze olejowa stosuje sie m.in. weglowodory, np. olej parafinowy, alko¬ hole tluszczowe, np. alkohol cetylowy, estry kwa¬ sów tluszczowych, np. mirystynian izopropylowy, iAub inne woski. Jako emulgatory stosuje sie m.in. emulgatory o wlasciwosciach przewazajaco hy¬ drofilowych, takie jak estry kwasu tluszczowego z polioksyetylenoanhydrosorbitem (o nazwie han¬ dlowej Tweens) i emulgatory o wlasciwosciach przewazajaco lipofilowyeh, takie jak estry kwasu tluszczowego z anhydrosorbitem (o nazwie handlo¬ wej Spans). Do tego dochodza znane dodatki, takie jak srodki konserwujace itp.Nalewki i roztwory wykazuja przewaznie podlo¬ ze wodno-etanolowe, do których dodaje sie min. poliole, np. gliceryne, glikole iAub glikol poliety¬ lenowy, jako srodki utrzymujace wilgoc w celu obnizenia parowania dyfuzyjnego i substancje na¬ tluszczajace, takie jak estry kwasów tluszczowych z nizszymi glikolami polietylenowymi, tzn. roz¬ puszczalne w wodnej mieszaninie substancje lipo¬ filowe w zamian za substancje tluszczowe zdjete ze skóry za pomoca etanolu i w razie potrzeby inne substancje pomocnicze i dodatki.Sporzadzenie miejscowo stosowanych prepara¬ tów farmaceutycznych nastepuje w znany sposób, np. na drodze rozpuszczania lub sporzadzania za¬ wiesiny substancji czynnej w podlozu lub, w razie koniecznosci, w jego czesci.W przypadku przetwarzania substancji czynnej w postaci roztworu rozpuszcza sie ja z reguly w jednej z obu faz przed zezulgowaniem; w przypad¬ ku przetwarzania w postaci zawiesiny, miesza sie ja po zemulgowaniu z jedna czescia podloza, a na¬ stepnie dodaje sie do pozostalej czesci preparatu.Dawkowanie substancji czynnej zalezy od róz¬ nych czynników, takich jak sposób aplikowania, gatunek, stan obronny organizmu, oraz w rozstrzy¬ gajacej mierze od rodzaju leczonej choroby. I tak w doustnym aplikowaniu podaje sie stalocieplne¬ mu o ciezarze 70 kg dziennie dawki okolo 0,0001— —0,1 g, przy czym dawkowanie mniejsze niz 0,001 g stosuje sie przede wszystkim dla zapobiegania tworzenia sie metastai po usunieciu guza pier¬ wotnego.W celu zapobiezenia zakazeniom wirusowym aplikuje sie jednorazowa dawke okolo 0,5—50 mg, korzystnie 25—15 mg, np. 7 mg substancji czynnej stalocieplnemu o ciezarze ciala okolo 70 kg, np. czlowiekowi. W razie potrzeby w okresie zwiek¬ szonego niebezpieczenstwa zakazenia powtarza sie podawanie tej dawki w odstepie 1—9 tygodni, np. co dwa tygodnie.Terapeutyczna dawka dla stalocieplnego o de- 15 to 2S 30 35 45 50 55 W142 641 17 zarze ciala okolo 70 kg w przypadku zakazenia wirusowego wynosi 1—50 mg, korzystnie 5—20 mg, np. 10 mg, zwlaszcza przy podawaniu doustnym.Dawkowanie w przypadku podawania wewnatrz- nosowego moze byc nawet 10-krotnie nizsze.W razie potrzeby powtarza sie podawanie zwiaz¬ ków heksopiranozowych o wzorze 1 w odstepie kilku dni, np. 1—3 dni, az do wystapienia popra¬ wy stanu chorego.Podane nizej przyklady objasniaja blizej wyna¬ lazek, nie ograniczajac jego zakresu. Wartosci chro¬ matograficznego wspólczynnika Rf okresla sie na cienkowarstwowych plytkach zelu krzemionkowe¬ go firmy Merck. Wzajemny stosunek czynników obiegowych w stosowanej mieszaninie czynników obiegowych jest podany w udzialach objetoscio¬ wych [objetosc/objetosc], zas temperature podano w stopniach Celsjusza.Przyklad I. 3,60 g {5,66 mmola) (Ca)-n-butylo- wego estru kwasu N-acetylomuramylo-L-alanylo- -D-glutaminowego (0,6 mola HaO) i 0,88 g (7,54 mmola) N-hydTaksysukcynimidu mieszajac roz¬ puszcza sie w 20 ml mieszaniny chloroform : meta¬ nol = 4 : 1. Do roztworu dodaje sie 1,60 g (7,54 mmola) stalego dwucykloheksylokarbodwuimidu i nieprzerwanie w ciagu 4 godzin w temperaturze pokojowej wkrapla sie roztwór 3,7 g (4,72 mmola) soli sodowej 2-(l,2-palmitoilo-sn-glicero-3-hydroksy- fosforyloksy)-etyloamidu L-alaniny w 40 ml chlo¬ roformu. Po uplywie dalszej godziny roztwór re¬ akcyjny silnie zateza sie na wyparce obrotowej, dodaje 200 ml dioksanu i liofilizuje.Z surowego produktu sporzadza sie zawiesine w 100 ml chloroformu, do zawiesiny dodaje sie 600 ml octanu etylowego i calosc miesza sie na lazni lodowej w ciagu 1 godziny. Nierozpuszczalny dwucykloheksylomocznik odsacza sie, przesacz od¬ parowuje sie do sucha. Pozostalosc oczyszcza sie na 700 g zelu krzemionkowego o nazwie handlowej Kieselgel 60 reinst (firmy Merck, uziarnienie: 70— —230 mesz wedlug normy ASTM) w kolumnie o srednicy 4,5 cm i o dlugosci 80 cm w ukladzie chloroform : metanol: woda = 70 : 30 : 5. W tym ce¬ lu material surowy rozpuszcza sie w 14 ml czyn¬ nika obiegowego i wprowadza na kolumne. Po przedgonie w ilosci dwóch porcji po 500 ml mie¬ szaniny zbiera sie frakcje po 10 ml.Substancje zawarta we frakcjach 133—152 i we frakcjach 153—236 zbiera sie kazdorazowo i od¬ dzielnie poddaje diafiltracji. W przypadku frakcji glównej postepuje sie nastepujaco: substancje roz¬ puszcza sie w 300 ml redestylowanej wody, ogrze¬ wa w ciagu chwili do temperatury 40°C i po ochlo¬ dzeniu usuwa sie nierozpuszczalny dwucykloheksy¬ lomocznik droga odwirowania.Ciecz pozostala nad osadem wprowadza sie do dializera [produkcji firmy: Amicon Corporation, Danvers, Massachissets, 01932, St. Zjedn. Am. Mo¬ deli 402, Ultrafilter PM 10/76 srednicy, obojetne niejonowe polimery na osnowie polisuflonów, sre¬ dnia wielkosc porów 1 mm] i poddaje dializie pod nadcisnieniem 392 kPa wobec 1,5 litra rede¬ stylowanej wody, 0,5 litra ukladu bufor fosfora¬ nowy (chlorek sodowy), (po 0,1 molowy, 1:1 pH =» ** t) i 1,5 wody az do zaniku chlorków. Dializat 18 wewnetrzny (70 ml)) saczy sie sterylnie na saczku miliporowym (0,2 \i) i poddaje liofilizacji. Otrzy¬ muje sie sól sodowa (Ca)-n-butylowego estru 2-(l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosfory- 5 loksy)-etyloamidu N-acetylomuramylo-L-alanylo-D- -glutamyl-(Cy)-L-alaniny (3,4 mola HaO) w postaci bezbarwnego proszku o skrecalnosci [a]aoo = + 14 {± 1° (c = 0,44 w wodzie), Rf = 0,37 (chloroform : : metanol: woda, 70 : 30 : 5) i Rf = 0,64 (octan etylo- 10 wy : n-butanol-pirydyna : kwas octowy : woda = 42 : : 21 : 21 : 6 :10).Analiza elementarna wykazuje: CeaHuOtaNsPNa, 3,41 HjKD (1381,63) Obliczono: C 54,77 H 8,94 N 5,07 P 2,24 H20 4,71 15 znaleziono: C 54,3 H 9,1 N 5,6 P 2,3 H*0 4,7 CeaHiuOjoNsPNa (1316,59) obliczono: Na 1,75 znaleziono: Na 1,57.Substrat wytwarza sie w sposób omówiony nizej. 20 5,5 g (CJ-n-butylowo-(Cy)-benzylowego dwuestru kwasu 4,6-0-izopropylideno-N-acetylomuramylo-L- -alaniny-D-glutaminowego, rozpuszczonego w 60 ml 60% kwasu octowego, pozostawia sie w ciagu nocy w temperaturze pokojowej. Lekko zóltawo zabar- 25 wiony roztwór zateza sie do polowy objetosci w wyparce obrotowej w temperaturze 30°C, zada¬ je sie za pomoca 300 ml dioksanu i liofilizuje. 4,8 g (~7,5 mmola) surowego produktu, rozpusz¬ czonego w 100 ml mieszaniny dwumetoksyetan: 38 : woda =9:1, zadaje sie za pomoca 0,8 g katali¬ zatora (10*/t) z tlenku palladu na nosniku weglo¬ wym i w ciagu 4 godzin traktuje wodorem.Katalizator odsacza sie pod zmniejszonym cisnie¬ niem, przesacz odparowuje sie do sucha, a pozo- 35 stalosc oczyszcza sie na drodze dwukrotnej chro¬ matografii na zelu krzemionkowym 60 (firmy Merck, 1:200, frakcje 10 i 5 ml), w ukladzie chlo- rofom : metanol: woda «* 70 : 30 : 5. Frakcje zawie¬ rajace produkt oczyszcza sie, a rozpuszczalnik od- 40 parowuje sie.Surowy produkt, czesciowo wystepujacy w posta¬ ci soli sodowej (z zelu krzemionkowego), rozpusz¬ cza sie w 40 ml redestylowanej wody i wprowa¬ dza na 50 ml uprzednio starannie oczyszczonego, 45 mocno kwasnego jonitu [o nazwie handlowej Do- wóx 50 W XB 50/100 mest, postac—H], a kolumne plucze sie za pomoca lacznie 100 ml redestylowa¬ nej wody. Eluat saczy sie przez saczek miliporowy (0,2 ii) i poddaje liofilizacji* Otrzymuje sie 3,7 g 50 (69Vo wydajnosci teoretycznej) (CJ-n-butylowego estru kwasu N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-glu- tarninowego w postaci bezbarwnego proszku, za¬ wierajacego 0,6 mola wody i wykazujacego skrecal- nosc [a]^ °f + 45 + l° (c =-1,142 w metanolu), 55 Rf — 0,23 (chloroform : metanol: woda =» 70 : 30 : 5) i Rf =* 0,40 (n-butanol: kwas octowy : woda ™ 75 : : 7,5 :21).Substrat wytwarza sie w sposób omówiony nizej.Z 4,4 g (11 mmoli) soli sodowej kwasu N-acetylo- 60 4,6-O-izopropylidenomuraminowego [2,5 mmola/g] sporzadza sie zawiesine w 60 ml absolutnego dwu- metyloformamidu. Do calosci energicznie miesza¬ jac dodaje sie kolejno 4,4 g (11 mmoli) chlorowo¬ dorku (Ca)-n-butylowego-(Cy)-benzylowego dwu- *b estru kwasu L-alanylo-D-glutaminowego, 2,53 g142 641 19 (22 mmole) N-hydroksysukcynoimidu i wreszcie 2,5 g (12,1 mmola) dwucykloheksylokarbodwuimidu, a calosc miesza sie w ciagu nocy w temperaturze pokojowej.W celu obróbki zawiesine rozciencza sie za po¬ moca 100 ml octanu etylowego i po pólgodzinnym mieszaniu w temperaturze 0°C odsacza sie sub¬ stancje nierozpuszczone (dwucykloheksylomocznik, chlorek sodowy). Przesacz odparowuje sie w wy¬ sokiej prózni, w temperaturze 30°C, pozostalosc rozpuszcza sie w 400 ml octanu etylowego i dzie¬ sieciokrotnie ekstrahuje porcjami po 50 ml rede- stylowanej wody. Po suszeniu warstwy organicz¬ nej i po odparowaniu rozpuszczalnika otrzymuje sie jako pozostalosc 5,6 g (Ca)-n-butylowo-(Cy)-ben- zylowego dwuestru kwasu N-acetylo-4,6-0-izopro- pylideno-L-alanylo-D-glutaminowego w postaci amorficznego proszku o skrecalnosci [a]20D = + 30 ±1° (c = 0,732 w metanolu), Rf = 0,87 (chloroform : : metanol: woda = 70 : 30 : 5) i Rf = 0,83 (n-butanol: : kwas octowy : woda = 75 : 7,5 :21).Substrat wytwarza sie w sposób omówiony nizej.Roztwór 5,6 g (12,1 mmola) (Ca)-n-butylowo-(Cy)- -benzylowego dwuestru kwasu N-III-rz.-butoksy- karbonylo-L-alanylo-D-glutaminowego i 20 ml ab¬ solutnego octanu etylowego energicznie mieszajac i wykluczajac dostep wilgoci zadaje sie kroplami 50 ml 4,5 N roztworu kwasu solnego w absolut¬ nym octanie etylowym i pozostawia sie calosc w ciagu 1 godziny w temperaturze 0°C. Zóltawo za¬ barwiony roztwór zateza sie w temperaturze po¬ kojowej do objetosci okolo 20 ml, zadaje za po¬ moca 150 ml dioksanu i liofilizuje. Otrzymuje sie 4,75 g (97°/o wydajnosci teoretycznej) chlorowodor¬ ku (Ca)-n-butylowo-(Cy)-benzylowego dwuestru kwasu L-alanylo-D-glutaminowego w postaci bez¬ barwnego oleju o skrecalnosci [a]20D = + 19 ± 1° (c = 0,313 w metanolu), Rf = 0,58 (chloroform : me¬ tanol : woda = 70 : 30 : 5) i Rf = 0,56 (octan etylowy : : n-butanol: pirydyna : woda = 42 : 21: 6 :10).Substrat wytwarza sie w sposób omówiony nizej.Do 8,5 g (25,8 mmola) chlorowodorku (Ca)-n-bu- tylowo-(Cy)-benzylowego dwuestru kwasu D-gluta- minowego i 7,4 g (25,8 mmola) N-hydroksysukcyno- imidoestru N-III-rz.-butyloksykarbonylo-L-alaniny, rozpuszczonych w 150 ml absolutnego dwumetylo- formamidu dodaje sie 2,6 g (25,8 mmola) N-metylo- morfoliny, a calosc pozostawia sie w ciagu 20 go¬ dzin w temperaturze pokojowej. Przejrzysty, zólto zabarwiony roztwór odparowuje sie w tempera¬ turze 30°C w wysokiej prózni, pólstala pozostalosc rozpuszcza sie w 500 ml octanu etylowego i sied¬ miokrotnie ekstrahuje ja porcjami po 50 ml wody.Warstwe organiczna suszy sie za pomoca siarcza¬ nu sodowego. Pozostalosc po odparowaniu octanu etylowego oczyszcza sie na drodze chromatografii na 600 g zelu krzemionkowego 60 (firmy Merck, granulacja 70—230 mesz wedlug normy ASTM) w ukladzie chloroform : metanol = 98: 2. Substancje zawartal we frakcjach 36—82 zbiera sie i suszy.Otrzymuje sie (Co)-n-butylowo-(Cy)-benzylowy dwu- ester kwasu N-III-rz.-butyloksykarbonylo-L-alany- lo-D-glutaminowego w postaci bezbarwnego oleju o skrecalnosci [a]20D = + 7 ± 1° (c = 0,315 w dwu- metyloformamidzie), Rf = 0,73 (chloroform : izopro- 20 panol: kwas octowy = 70 :8 :2) i Rf = 0,75 (m- -butanol: kwas octowy : woda = 75 : 7,5 : 21).Substrat wytwarza sie w sposób omówiony nizej.Do roztworu 11,0 g (30 mmoli) (Ca)-n-butylowo- 5 (Cy)-benzylowego dwuestru kwasu N-III-rz.-butylo- ksykarbonylo-D-glutaminowego w 25 ml absolut¬ nego octanu etylowego chlodzac, mieszajac i wy¬ kluczajac dostep wilgoci dodaje sie 25 ml 4N roz¬ tworu HC1 w absolutnym octanie etylowym i po- 10 zostawia sie calosc w ciagu 1 godziny. Latwolotne skladniki odparowuje sie w temperaturze 25°C, oleista pozostalosc rozpuszcza sie w 150 ml abso¬ lutnego eteru etylowego, który ponownie (3-krotnie) odparowuje sie. Oleista pozostalosc suszy sie na 15 azbescie sodowym w pólprózni. Otrzymuje sie chlo¬ rowodorek (Ca)-n-butylo-(Cy)-benzylowego dwuestru kwasu D-glutarninowego o skrecalnosci [ = + 9 ± 1° (c = 0,646 w metanolu), Rf = 0,82 (chlo¬ roform : metanol: woda = 70 : 30 : 5) i Rf = 0,68 20 (octan etylowy : n-butanol: pirydyna : kwas octowy : : woda = 42 : 21: 21 : 6 :10).Substrat wytwarza sie w sposób omówiony nizej. 20,0 g (64,5 mmola) (Ga)^benzylowego estru kwasu N-III-rz.-butyloksykarbonylo-D-glutaminowego roa- 25 puszcza sie w 750 ml absolutnego czterowodorofu- ranu, wkrapla sie roztwór 21,05 g (64,6 mmola) weglanu cezowego (Fluka, purum) w 70 ml wody, a calosc odparowuje sie do sucha pod próznia wy¬ tworzona za pomoca strumieniowej pompki wodnej. 30 Pozostalosc rozpuszcza sie w 200 ml absolutnego dwumetyloformamidu, rozpuszczalnik odparowuje sie i powtarza sie te operacje. Krystaliczna pozo¬ stalosc, otrzymana po suszeniu w wysokiej prózni, rozpuszcza sie w litrze absolutnego dwumetylo- 35 formamidu i do roztworu mieszajac wkrapla sia 13,3 g (97 mmola) bromku n-butylu. Zawiesine, po¬ wstala po 18 godzinnym mieszaniu w temperaturze pokojowej, saczy sie, przesacz zateza sie do polowy objetosci i po dodaniu 1 litra octanu etylowego nie- 40 przerwanie ekstrahuje sie dziesieciokrotnie porcja¬ mi po 100 ml wody. Warstwe organiczna suszy sie nad siarczanem sodowym i odparowuje. Oleista pozostalosc rozpuszcza sie w 100 ml eteru etylo¬ wego i po dodaniu 1800 ml eteru naftowego i po- 45 zostawieniu w temperaturze — 10°C doprowadza sie do krystalizacji. Mase krystaliczna odsacza sie pod zmniejszonym cisnieniem, przemywa i suszy.Otrzymuje sie (Ca)-n-butylowo-(Cy)-benzylowy dwuester kwasu N-III-rz.-butyloksykarbonylo-D- 50 -glutaminowego w postaci bialych igiel o tempe¬ raturze topnienia 70—71°C, o skrecalnosci [a]MD = = 20 ± 1° (c = 1,149 w metanolu), Rf = 0,7» (chloro¬ form : izopropanol: kwas octowy = 36 : 8 :2) i Rf = = 0,92 (octan etylowy : n-butanol: pirydyna : kwas 55 octowy : woda = 42 : 21: 21 : 6 :10), którego wytwa¬ rzanie jest juz krótko opisane przez P. Lefrancier'a i F. Laderer'a w Fortschritte d. Chem. org. Naturst. 40, 1—47, patrz strona 13/1980.Jako substrat stosowany 2-(l,2-dwupalmitoilo-sn- 60 -glicero-3-hydroksyfosforyloksy)-etyloamid L-alani- ny otrzymuje sie w nizej podany sposób. 13,25 g (14,9 mmola) 2-(l,2-dwupalmitoilo-sn-gli- cero-3-hydroksyfosforyloksy)-etyloamidu N-III-rz.- -butyloksykarbonylo-L-alaniny mieszajac wprowa- 65 dza sie do 170 ml ochlodzonej do temperatury 0°C142 641 21 22 mieszaniny kwasu trójfluorooctowego i chlorku metylenu 1 : 3 (objetosc : objetosc), przy czym po¬ wstaje klarowny roztwór. Po 2,5-godzinnym pozo¬ stawieniu w temperaturze pokojowej roztwór re¬ akcyjny odparowuje sie w temperaturze 30°C w wyparce obrotowej. Pólstala pozostalosc w celu usu¬ niecia nadmiaru kwasu trójfluorooctowego kilka¬ krotnie zadaje sie porcjami po 100 ml chlorku me¬ tylenu, a ten kazdorazowo odparowuje sie.Po pieciokrotnym rozcieraniu pozostalosci z por¬ cjami po 100 ml absolutnego eteru etylowego i zla¬ niu cieczy pozostajacej nad osadem, otrzymuje sie zawiesine latwo dajaca sie saczyc. Odsacza sie ja na nuczy, stala substancje przemywa sie najpierw eterem etylowym, po czym dwukrotnie porcjami po 100 ml goracego acetonu i suszy w temperatu¬ rze 60—70°C pod próznia wytworzona za pomoca strumieniowej pompki wodnej.Otrzymuje sie 10,9 g 2-(l,2-dwupalmitoilo-sn-gli- cero-3-hydroksyfosforyloksy)-etyloamidu L-alaniny w postaci bezbarwnych krysztalów o temperaturze topnienia 138—147°C, o skrecalnosci [a]l0D = + 39 ±1° (c = 1 w ukladzie chloroform : metanol: woda, 70 : 30 : 5), Rf = 0,14 (chloroform : metanol = 7:3) i Rf = 0,40 (chloroform : metanol: woda = 70 : 30 : 5).Tak otrzymany produkt mozna przeprowadzic w sól sodowa w nizej podany sposób. 3,82 g (5 mmoli) 2-(l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero- -3-hydroksyfosforyloksy)-etyloamidu L-alaniny roz¬ puszcza sie w 100 ml mieszaniny chloroform : me¬ tanol = 7:3 na drodze krótkotrwalego ogrzewania w temperaturze 35 °C. Calosc chlodzi sie i do niej ostroznie wkrapla sie 5 ml IN lugu sodowego.Klarowny roztwór zateza sie do okolo 1/3 pierwot¬ nej objetosci i po dodaniu 200 ml dioksanu pod¬ daje sie liofilizacji. Otrzymuje sie sól sodowa 2-(l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosfory- loksy)-etylcamidu L-alaniny w postaci pulchnego proszku.Przyklad II. 3,50 g (6,9 mmola) estru (Ca)-me- tylowego kwasu N-acetylomuramylo-L-alanylo-D- -glutaminowego i 1,20 g N-hydroksysukcynimidu rozpuszcza sie w 50 ml mieszaniny dwumetylofor- mamidu, izopropanolu i chloroformu [1:3:6; obje¬ tosc/objetosc], dodaje sie 2,10 g (10,35 mmola) dwu- cykloheksylokarbodwuimidu i wykluczajac dostep wilgoci miesza sie w temperaturze pokojowej w ciagu 1 godziny.Zawiesine te zadaje sie za pomoca 50 ml octanu etylowego, miesza w ciagu 30 minut na lazni lo¬ dowej i odsacza nierozpuszczalny dwucykloheksylo- mocznik. Przesacz zateza sie do objetosci okolo 40 ml na wyparce obrotowej, aktywny ester straca sie dodatkiem 150 ml absolutnego eteru etylowego (dwukrotnie), odsacza i suszy, po czym za pomoca N-hydroksysukcynimidu otrzymuje sie ester óRf = = 0,43 (chloroform : metanol: woda = 70 : 30 : 5).Z 3,43 g (4,4 mmola) 2-(l,2-dwupalmitoilo-sn-gli- cero-3-hydroksyfosforyloksy)-etyloamidu L-alaniny sporzadza sie zawiesine w 45 ml chloroformu i w temperaturze 40°C w ciagu 5 minut wkrapla sie roztwór 0,86 g (6,1 mmola) trójetyloaminy w 5 ml chloroformu, przy czym powstaje klarowny roz¬ twór. Do niego energicznie mieszajac i wyklucza¬ jac dostep wilgoci wkrapla sie w ciagu 5 minut roztwór wyzej omówionego aktywnego estru w 100 ml mieszaniny dwiimetyloformamidu, chloro¬ formu i dioksanu [1 :14 : 6, objetosc/objetosc]. Po uplywie 2,5 godzin mieszania w temperaturze po- 5 kojowej odparowuje sie do sucha lekko metny roz¬ twór w temperaturze 30°C na wyparce rotacyjnej.Surowy produkt oczyszcza sie na zelu krzemion¬ kowym (o nazwie 60 reinst, firmy Merck, granu¬ lacja: 70—230 mesz wedlug normy ASTM) w ukla¬ dzie chloroform : metanol: woda = 70 : 30 : 5 (frak¬ cje po 5 ml). Frakcje (chromatografia cienkowar¬ stwowa), zawierajace produkt, zbiera sie. Pozosta¬ losc, otrzymana po odparowaniu rozpuszczalnika, rozpuszcza sie w 250 ml redestylowanej wody i oczyszcza analogicznie jak w przykladzie I droga diafiltracji (mieszalnik firmy Amicon, typ 402, Ultrafilter PM 30/76 mm srednicy). Roztwór pozo¬ stajacy w mieszalniku saczy sie przez filtr milipo- rowy (0,2 \i) i liofilizuje. Otrzymuje sie sól sodowa 2-(l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydróksyfosfory- loksy)-etyloamidu (Ca)-metylowego estru N-acetylo- muramylo-L-alanylo-D-glutamylo-(Cy)-L-alaniny, 2,96 mola H20 w postaci bezbarwnego proszku o skrecalnosci [ kwasie octowym), Rf = 0,25 (chloroform : metanol: : woda -= 70 : 30 : 5) i Rf = 0,39 (octan etylowy : n- -butanol: pirydyna : kwas octowy : woda = 42 : 21: ; 6 ; 10).Substrat wytwarza sie w sposób omówiony nizej. 7,7 g (21,2 mmola) chlorowodorku (Ca)-metylowo^ -(Cy)-benzylowego dwuestru kwasu L-alanylo-D- -glutaminowego i 8,6 g (23,3 mmola) soli sodowej kwasu N-acetylo-4,6-0-izopropylidenomuraminowe- go laczy sie analogicznie jak w przykladzie I me¬ toda dwucykloheksylokarbodwuimido/N-hydroksy- sukcynimidowa. Surowy produkt bez dalszego oczyszczania rozszczepia sie w 100 ml 60% kwasu octowego. Po 5,5-godzinnym mieszaniu w tempe¬ raturze pokojowej roztwór silnie zateza sie, zada¬ je woda, ponownie zateza i po dodaniu 100 ml dioksanu liofilizuje. Pozostalosc dwukrotnie oczysz¬ cza sie na 600 g zelu krzemionkowego (typu 60) w ukladzie chloroform : metanol: woda = 70 : 30 : 5 (frakcje po 7 ml).Frakcje, zawierajace zadana substancje, laczy sie, a rozpuszczalnik odparowuje sie. Jako pozo¬ stalosc otrzymuje sie (CJ-metylowo-(Cy)-benzylowy dwuester kwasu N-acetylomuramylo-L-alanylo-D- -glutaminowego w postaci bezbarwnej pianki o Rf = 0,63 (chloroform : metanol: woda — 70 : 30 : 5). 6,0 g (10 mmoli) (Ca)-metylowo-(Cy)-berizylowego dwuestru kwasu N-acetylomuramylo-L-alanylo-D- -glutarhinowego, rozpuszczonego w mieszaninie 1,2- -dwumetóksyetanu i wody 95 :5 [objetosc/objetosc], uwodornia sie w obecnosci 0,6 g katalizatora '(l-O*/*)* palladowego na nosniku weglowym w ciagu 1,5 gd^ dziny pod cisnieniem normalnym. katalizator odsacza sie, a przesacz odparowuje sie w temperaturze pokojowej pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc oczyszcza sie jak wyzej na 400 g zelu krzemionkowego (typu 60) w ukladzie chloroform : metanol: woda = 70 :30 :5 (frakcje po 10 ml). Frakcje, zawierajace produkt, laczy sie, a rozpuszczalnik odparowuje sie.. i 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60142 641 23 Otrzymana pozostalosc, czesciowo w postaci soli sodowej, odsala sie analogicznie jak w przykladzie I na 60 ml srodka o nazwie Dowex 50WX8 [50/100 mesz, postac — H, silnie kwasny kationit].Przesacz saczy sie przez filtr miliporowy (0,45 \i) i liofilizuje. Otrzymuje sie (CJ-metylowy ester kwasu N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-glutamino- wego. 1,27 mola HaO w postaci bezbarwnego prosz¬ ku o skrecalnosci ([a]20D = + 47 ± 1° (c = 1,249 w metanolu), Rf = 0,08 (chloroform : metanol: woda = = 70 : 30 : 5), Rf = 0,30 (acetonitryl: woda : 3;1) i Rf = 0,43 (octan etylowy : kwas octowy : woda : me¬ tanol = 67 :10 : 23 :12).Przyklad III. 9,4 g (11,1 mmola) (Ca)-III-rz.- -butylowego estru kwasu N-acetylomuramylo-L-ala- nylo-D-glutaminowego, analogicznie jak w przy¬ kladzie II, przeprowadza sie w ester aktywny, po czym jak tamze opisano, laczy sie z 6,48 g (8,2 mmola) 2-(l ,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksy- fosforyloksy)-etyloamidu L-alaniny w obecnosci trójetyloaminy. Z surowego produktu sporzadza sie zawiesine w 250 ml redestylowanej wody i ogrzewa w ciagu chwili w temperaturze 37°C. Calosc mie¬ sza sie w ciagu 15 minut na lazni lodowej, odsa¬ cza nierozpuszczalny dwucykloheksylomocznik, a przesacz poddaje sie diafiltracji opisanej w przy¬ kladzie I [mieszalnik firmy Amicon typ 402, Ultra- filter PM 30(76) mm srednicy]. Roztwór pozosta¬ jacy w mieszalniku (120 ml) poddaje sie liofilizacji, a produkt w znany sposób chromatografuje sie na 950 g zelu krzemionkowego (typu 60). Zadana sub¬ stancje zbiera sie, rozprowadza w 200 ml redesty¬ lowanej wody (pH **= 7), saczy w warunkach ste¬ rylnych (0,45 (i) i liofilizuje. Otrzymuje sie sól sodowa 2-(l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksy- forforyloksy)-etyloamidu (Ca)-III-rz.-butylowego estru N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-glutamylo- -(Cy)-L-alaniny w postaci bezbarwnego proszku, zawierajacego 3,4 mole wody, o skrecalnosci [ wym), Rf = 0,29 (chloroform : metanol: woda = =¦ 70:30 : 5) i Rf* 0,53 (octan etylowy : n-butanol: : pirydyna, kwas octowy : woda = 42 :21:21:6 :10).Dwupeptydowa pochodna muramylowa, niezbed¬ na jako substrat, otrzymuje sie analogicznie jak w przykladzie I droga polaczenia soli sodowej kwa¬ su N-acetylo-4,6-0-izopropylidenomuraminowego i {Cft)-III-rL-butylowo-(Cr)-benzylowego dwuestru kwasu L-alanylo-D-glutaminowego wedlug metody dwucykloheksylokarbodwumido/-N-hydroksysukcy- nimidowej. Po kwasowym odszczepieniu rodnika izopropylidenowego za pomoca 60% kwasu octo¬ wego i po usunieciu rodnika benzylowego dro¬ ga katalitycznego uwodorniania analogicznie jak W przykladzie I otrzymuje sie (CftHII-rz.-butylowy ester kwasu N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-gluta- minowego w postaci bezbarwnego proszku o skre¬ calnosci [a]»D — + 44 ± 1° (c = 1,004 w metanolu), Rf = 0,20 (chloroform: metanol: woda = 70 :30 :5) i Rf ^ 0,41 (acetonitryl: woda = 3:1).Pochodna dwupeptydowa, niezbedna jako sub¬ strat, Otrzymuje sie w sposób omówiony nizej. 38,3 g (63,5 mmola) (Co)-III-rz.-butylowo-(Cy)-ben- zylowego dwuestru kwasu N-[2-(4-bifenylilo)-pro- pyloksykarbonylo]-L-alanylo-D-#utaminowego roz- 24 puszcza sie w 700 ml mieszaniny trójfluoroetanol: : woda = 9:1 [objetosc/objetosc] i wkraplajac 1,23 N roztwór kwasu solnego w takiej samej miesza¬ ninie rozpuszczalnikowej (1 czesc objetosciowa ste- 5 zonego kwasu solnego i 9 czesci objetosciowych trójfluoroetanolu) doprowadza sie odczyn do war¬ tosci pH = 1,5 (2,5 godziny, zuzycie 51,66 ml, co oznacza 81*/o wydajnosci teoretycznej). Lekko zól¬ tawo zabarwiony roztwór zateza sie w wyparce 10 obrotowej w temperaturze 30°C pod cisnieniem wytworzonym za pomoca strumieniowej pompki wodnej do objetosci prawie 100 ml, dodaje sie 200 ml dioksanu, a calosc suszy sie droga liofili¬ zacji. 15 Pólstala pozostalosc rozpuszcza sie w 30 ml abso¬ lutnego eteru etylowego i mieszajac w tempera¬ turze 0—5°C straca sie dodatkiem 150 ml eteru naftowego. Calosc pozostawia sie w chlodzie (w temperaturze —20°C), ciecz zlewa sie znad osa- 20 du i te sama procedure powtarza sie jeszcze dwu¬ krotnie. Oleista pozostalosc ostatecznie rozpuszcza sie w 100 ml Ill-rz.-butanolu, liofilizuje, a te po¬ zostalosc suszy sie w wysokiej prózni nad azbe¬ stem sodowym (firmy Merck). 25 Otrzymuje sie chlorowodorek /Ca/-III-rz.-butylo- wo-/Cy/-benzylowego dwuestru kwasu L-alanylo- -D-glutaminowego w postaci silnie higroskopijne- go proszku o skrecalnosci [a]D20 — +7 ± 1° (c = = 1,630 w chloroformie), Rf = 0,60 (chloroform : me- 30 tanol: woda — 70 : 30 : 5) i Rf = 0,45 (n-butanol: kwas octowy : woda = 10 :1 : 2,8).Zabezpieczony zwiazek otrzymuje sie w sposób omówiony nizej.Do ochlodzonego do temperatury 0°C roztworu 35 65,96 g (0,2 mola) chlorowodorku /Ca/-III-rz.-buty- lowo-/Cy/-benzylowego dwuestru kwasu D-gluta- minowego i 65,47 g (0,2 mola) N-[2-/4-bifenylilo/- -propyloksykarbonylo]-L-alaniny w 650 ml abso¬ lutnego dwumetyloformamidu mieszajac dodaje sie 40 22 ml (0,24 mola) N-metylomorfoliny i wreszcie 59,11 g (0,24 mola) 2-etoksy-N-etoksykarbonylo-l,2- -dwuhydrochinoliny (EEDQ)% Po 10-godzinnym mieszaniu w temperaturze pokojowej zólto zabar¬ wiony roztwór odparowuje sie w temperaturze 45 30°C na wyparce obrotowej. Pozostalosc rozpusz¬ cza sie w 1 litrze octanu etylowego, pieciokrotnie przemywa porcjami po 200 ml wody, warstwe wodna ponownie ekstrahuje sie za pomoca 0,5 li¬ tra octanu etylowego, a polaczone warstwy orga- 50 niczne suszy sie.Surowy produkt (150 g), otrzymany po odparo¬ waniu rozpuszczalnika, oczyszcza sie droga kilka¬ krotnej chromatografii na zelu krzemionkowym typu 60 (1 :20) za pomoca octanu etylowego. Otrzy- 55 muje sie /Ca/-III-rz.-butylowo-/CY/-benzylowy dwu- ester kwasu N-[2-/4-bifenylilo/-propyloksykarbony- lo]-L-alanylo-D-glutaminowego w postaci bez¬ barwnego oleju o skrecalnosci [a]20© =" —14 ± 1° (c *- 1,625 w octanie etylowym), Rf — 0,73 Cchloro- 60 form : izlopropanol: kwas octowy *¦» 70 :8 :2) i Rf — ¦* 0,51 (toluen: octan etylowy — 1:1).Stosowany jako substrat, chlorowodorek /CJ- -III-rz.-butylowo-/CY/-benzylowy dwuestru kwasu D-glutaminowego otrzymuje sie, analogicznie do 65 opisanej w literaturze [R. Roeske, J. Org. Chem.142 641 25 28, 1251 (1963)] jego L-pochodnej na drodze reak¬ cji /CY/-benzylowego estru kwasu D-glutaminowe- go z izobutenem w mieszaninie 1,4-dioksanu i kwa¬ su siarkowego, w postaci bezbarwnych igiel o tem¬ peraturze topnienia 108—109°C, o skrecalnosci [ (chloroform : metanol: woda = 70 : 30 : 5) i Rf = 0,64 (octan etylowy : n-butanol: pirydyna : kwas octo¬ wy : woda «= 42 : 21: 21: 6 :10).Przyklad IV. Do roztworu 4,62 g (6,05 mmo- la) 2-/1,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosfo- ryloksy/-etyloamidu L-alaniny w 100 ml miesza¬ niny chloroform: izopropanol: woda 70 : 30 : 2 mie¬ szajac w temperaturze 15°C wkrapla sie w ciagu 10 minut 14,52 ml (7,26 mmola) 0,5-molowego roz¬ tworu trójetyloaminy w mieszaninie chloroform: izopropanol: woda ** 70 : 30 : 2.Nastepnie w ciagu 20 minut w postaci 4 porcji po 1,5 g dodaje sie 6,0 g (7,26 mmola) /C0/-metylo- wego estru /CY/-N-hydroksysukcynimidoestru kwa¬ su N-propionylodezmetylomuramylo-D-glutamino- wego, który zawiera jeszcze nieco dwucykloheksy- lomocznika, przy czym roztwór zauwazalnie met¬ nieje.Po okolo 15-minutowym mieszaniu w tempera¬ turze 15°C calosc nadal miesza sie w temperatu¬ rze pokojowej w ciagu 2,5 godziny.Tak otrzymany metny roztwór reakcyjny odpa¬ rowuje sie, nastepnie w temperaturze 30°C pod próznia. Z surowego produktu (10,75 g) sporzadza sie zawiesine w 170 ml redestylowanej wody (pH = 5,5), zawiesine te z dodatkiem 0,3 ml trój¬ etyloaminy doprowadza sie do odczynu o wartosci pH =6,0, nierozpuszczalna substancje (dwucyklo- heksylomocznik) odsacza sie, a przesacz poddaje sie liofilizacji w wysokiej prózni. Tak otrzymany liofilizat rozpuszcza sie w 300 ml redestylowanej wody, a roztwór zateza sie do objetosci 75 ml w dializerze firmy Amicon [Modeli 402, Ultrafilter PM 10/76 mm srednicy] pod nadcisnieniem 294 kPa, po czym saczy wobec 250 ml ukladu bufor fosforanowy: chlorek sodowy (po 0,1 molowy, 1:1, pH = 7) i 1750 ml redestylowanej wody az do usu¬ niecia chlorków. Roztwór pozostajacy w dializerze (okolo 75 ml) saczy sie nastepnie przez dwa filtry miliporowe (o nazwie Nalgene S, 0,45 \k i 0,2 |i) i tak otrzymany klarowny, bezbarwny roztwór lio¬ filizuje sie w wysokiej prózni.Otrzymuje sie 7,36 g jeszcze zanieczyszczonej soli sodowej 2-/l,2-dwupalmitoilo-glicero-3-hydro- ksyfosforyloksy/-etyloamidu /cy-metylowego estru N-propionylodezmetylomuramylo/L-alanylo-D-glu- tamylo-/CY/-L-alaniny w postaci bezbarwnego proszku, który droga rozdzialu Craig'a za pomoca ukladu czterochlorek wegla : chloroform : meta¬ nol : 0,5°/o roztwór chlorku sodowego = 7 :17 :18 : 6 poddaje sie dalszemu oczyszczeniu. Po 547 stop¬ niach zadany produkt znajduje sie we frakcjach 160—220, K « 0,58.Frakcje, zawierajace produkt, laczy sie i bez ogrzewania (chlodzenia) odparowuje sie do sucha w wysokiej prózni. Otrzymuje sie bezbarwny pro¬ szek, który zawiera jeszcze chlorek sodowy. W ce¬ lu jego usuniecia produkt rozpuszcza sie w 600 ml redestylowanej wody [Modeli 402, Ultrafilter ph 26 30/76 mm srednicy] pod nadcisnieniem 294 kPa najpierw do okolo 50 ml objetosci wewnetrznej, a nastepnie lacznie z 1750 ml redestylowanej wody.Roztwór pozostajacy w dializerze (okolo 50 ml) 5 nastepnie saczy sie w warunkach sterylnych przez dwa filtry miliporowe (o nazwie Nalgene S, 0,45 \x wzglednie 0,2 \i) i poddaje liofilizacji w wysokiej prózni.Otrzymuje sie sól sodowa 2-/l,2-dwupalmitoilo- !• -sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy/-etyloamidu /Co/-metylowego estru N-propionylo-dezmetylomu- ramylo-L-alanylo-D-glutamylo/Cv/-L-alaniny w po¬ staci bezbarwnego proszku, zawierajacego 1,90 mola wody, o skrecalnosci [a]20D ^ +3,7 ± 1° (C = 15 =0,672 w chloroformie), [aF°D- +1,7 ± 1° (c = = 1,044 w wodzie), Rf = 0,42 (chloroform : meta¬ nol : woda « 70 : 30 :5) i Rf = 0,62 (octan etylo¬ wy : n-butanol: pirydyna : kwas octowy : woda =» =* 42 : 21 : 21: 6 :10). w Substrat wytwarza sie w sposób omówiony nizej. 5,12 g (10,1 mmola) a-metylowy ester kwasu N-propionylodezmetylomuramylo-L-alanylo-D-glu- taminowego rozpuszcza sie w 100 ml mieszaniny chloroform: izopropanol = 7:3 i dodajac 10 ml 25 dwumetyloformamidu doprowadza do calkowitego rozpuszczenia.Do tego roztworu dodaje sie 2,68 g (13 mmoli) dwucykloheksylokarbodwuimidu i 1,50 g (13 mmo¬ li) N-hydroksysukcynimidu, i tak otrzymany kia- 80 równy, bezbarwny roztwór miesza sie w ciagu 1,5 godziny w temperaturze pokojowej, po czym pozostawia w ciagu 17 godzin w temperaturze 4°C.Tak otrzymana zawiesine zadaje sie za pomoca 35 400 ml eteru etylowego, po czym nadal miesza sie w ciagu 1 godziny w temperaturze pokojowej.Nastepnie krystalizat odsacza sie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem, przemywa eterem etylowym i su¬ szy pod próznia nad pieciotlenkiem dwufosforu. 40 Otrzymuje sie surowy /Ca/-metylowy ester /CY/- -N-hydroksysukcynimidoestru kwasu N-própiony- lo-dezmetylomuramylo-L-alanylo-D-glutaminowe- go w postaci bezbarwnych krysztalów, które za¬ wieraja jeszcze nieco dwucykloheksylomocznika 45 i sa stosowane bez dalszego oczyszczania, a wyka¬ zuja Rf = 0,46 (chloroform : metanol — 5:1) i Rf = =¦ 0,72 (chloroform : metanol =* 7 :3).Substrat wytwarza sie w sposób omówiony ni¬ zej. 50 Roztwór 13,0 g (21,75 mmola) /Ca/-metylowo-/Cv/- -benzylowego dwuestru kwasu N-propionylo-dez- metylomuramylo-L-alanylo-D-glutaminowego w 250 ml mieszaniny dwumetoksyetan: woda = 20 :1 uwodornia sie za pomoca 2,5 g l*/t katalizatora 55 palladowego na nosniku weglowym w ciagu 1 go^ dziny w temperaturze pokojowej pod cisnieniem, normalnym.Nastepnie odsacza sie katalizator, przesacz od¬ parowuje sie pod próznia, do sucha, a tak otrzy- * mana pozostalosc rozprowadza sie trzykrotnie yr porcjach po 30 ml wody i ponownie odparowuje.Calosc rozpuszcza sie w okolo 100 ml redestylo¬ wanej wody, saczy ten roztwór przez filtr miHpo- rowy (o nazwie Nalgene S, 0,2 p) i poddaje lioflli- * zacji w wysokiej prózni.142 641 27 Otrzymuje sie a-metylowy ester kwasu N-pro- pionylodezmetylomuramylo-L-alanylo-D-glutamino- wego (0,68 mola wody) w postaci bezbarwnego liofilizatu o skrecalnosci [a]20D = +14 ± 1° (c = 1,067 w metanolu), Rf = 0,78 (chloroform : meta¬ nol : woda = 70 : 30 : 5) i Rf = 0,57 (octan etylo¬ wy : n-butanol: pirydyna : kwas octowy : woda = = 42 :21: 21 : 6 :10).Substrat otrzymuje sie w sposób omówiony ni¬ zej.Roztwór 20,7 g (32,46 mmola) /Ca/-metylowo-/CY/- -benzylowego dwuestru kwasu 4,6-0-izopropylide- iio-N-propionylo-dezmetylomuramylo-L-alanylo-D- glutaminowego w 400 ml 60% kwasu octowego miesza sie w ciagu 21 godzin w temperaturze pokojowej, po czym odparowuje sie w tempe¬ raturze 30°C pod próznia i tak otrzymana pozo¬ stalosc kolejno trzykrotnie zadaje sie porcjami po 100 ml wody i ponownie odparowuje. Surowy pro¬ dukt oczyszcza sie nastepnie na drodze chromato¬ grafii kolumnowej na 1000 g zelu krzemionkowe¬ go (typu 60 reinst. firmy Merck, 0,063—0,200 mm) w ukladzie chlorek metylenu : metanol = 85 :15 (frakcje po 15 ml).Frakcje 207—290 laczy sie i odparowuje pod próznia w temperaturze 30°C. Otrzymuje sie ICJ- -metylowo-/CY/-benzylowy dwuester kwasu N-pro- pionylo-dezmetylomuramylo-L-alanylo-D-glutami- nowego, zawierajacy 0,24 mola wody, o skrecalno¬ sci [a]20D = +16,l±l° (c = 1,463 w metanolu), Rf = 0,24 (chloroform : metanol = 9 :1), Rf = 0,55 (chloroform : metanol = 5:1) i Rf = 0,94 (chloro¬ form : metanol: woda = 70 : 30 : 5).Substrat otrzymuje sie w sposób omówiony ni¬ zej.Do zawiesiny 13,2 g (35,77 mmola) soli sodowej kwasu 4,6-0-izopropylideno-N-propionylo-dezmety- lomuraminowego w 200 ml dwumetyloformamidu mieszajac w temperaturze pokojowej dodaje sie 9,6 g (46,5 mmola) dwucykloheksylokarbodwuimi- du, 5,35 g (46,5 mmola) N-hydroksysukcynimidu i 12,8 g (35,77 mmola) chlorowodorku /Ca/-metylo- wo-/Cy/-benzylowego dwuestru kwasu L-alanylo- -D-glutaminowego, a calosc miesza sie w ciagu 21 godzin w temperaturze pokojowej.Tak otrzymana biala zawiesine zadaje sie 200 ml octanu etylowego, miesza w ciagu 1 godziny w temperaturze 0°C, krystalizat dwucykloheksylo- mocznik odsacza sie na nuczy, przemywa ochlodzo¬ nym na lazni lodowej octanem etylowym, a prze¬ sacz odparowuje sie pod próznia w temperaturze 30°C.Tak otrzymana pozostalosc rozprowadza sie w 300 ml octanu etylowego i dwukrotnie kolejno przemywa porcjami po 50 ml 2N roztworem kwa¬ su cytrynowego, wody, 10% roztworu' weglanu sodowego i wody. Warstwy octanowe laczy sie, suszy nad siarczanem sodowym, saczy i odpa¬ rowuje pód próznia. Otrzymuje sie /Ca/-metylo/ /CY/-benzylowy dwuester kwasu 4,6-0-izopropylide- no-N-propionylo-dezmetylomuramylo-L-alanylo-D- * glutaminowego(o! Rf = 0,65 (chloroform : metanol = = 9:1) i Rf = 0,86 (chloroform : metanol = 5 :1).Oba substraty! otrzymuje sie w sposób omówio¬ ny nizej. 28 Do roztworu 20,3 g (48,0 mmola) /Ca/-metylo- wo-/CY/-benzylowego dwuestru kwasu N-III-rz.- -butyloksykarbonylo/L-alanylo-D-glutaminowego [P. Lefrancier, M. Derrien, I. Lederman, F. Nief, 5 J. Vhoay i E. Lederer, Int. J. Peptide Protein Res. 11, 289—296 (1978)] w 100 ml absolutnego octanu etylowego dodaje sie w temperaturze 0°C 100 ml okolo 5N kwasu solnego w absolutnym octanie etylowym i miesza w ciagu 2 godzin w temperatu- 10 rze 0°C. Zóltawo zabarwiony roztwór odparowuje sie nastepnie pod próznia, tak otrzymana pozosta¬ losc dwukrotnie rozprowadza sie w porcjach po 100 ml absolutnego octanu etylowego i ponownie odparowuje. Po przemywaniu na cieplo za pomo- 15 ca dwóch porcji po 100 ml absolutnego eteru ety¬ lowego suszy sie pozostalosc w wysokiej prózni, otrzymujac chlorowodorek /Ca/-metylowo-/CY/-ben- zylowego dwuestru kwasu L-alanylo-D-glutamino- wego, zawierajacy 0,31 mola wody, o skrecalnosci 20 [a]2°D =+18,6 ±0,1° (c = 0,043 w metanolu), Rf = = 0,72 (chloroform : metanol: woda = 70 : 30 : 5), Rf = 0,44 (chloroform : metanol = 5:1) i Rf = 0,31 (chloroform : metanol = 9:1).Roztwór 34,4 g [73,8 mmola, 2,14 mmola/g] soli 25 sodowej kwasu la-0-benzylo-4,6-0-izopropylideno- -N-propionylo-dezmetylomuraminowego w 340 ml wody, zawierajacy jeszcze chlorek sodowy, uwo¬ dornia sie wobec odczynu o stalej wartosci pH = = 7,1, za pomoca 6,0 g 10% katalizatora pallado- 30 wego na nosniku weglowym w ciagu 23 godzin w temperaturze pokojowej pod cisnieniem nor¬ malnym.Nastepnie katalizator odsacza sie, przesacz od¬ parowuje sie w temperaturze 30°C wobec odczy- 35 nu o wartosci pH = 7, i pod próznia, i tak otrzy¬ mana pozostalosc suszy sie w wysokiej prózni nad pieciotlenkiem dwufosforu. Otrzymuje sie sól so¬ dowa kwasu 4,6-0-izopropylideno-N-propionylodez- metylomuraminowego w postaci bezbarwnego 40 proszku o Rf = 0,50 (chloroform : metanol: woda = = 70 : 30 : 5) i Rf = 0,66 (acetonitryl: woda = 3:1).Substrat otrzymuje sie w sposób omówiony ni¬ zej.Roztwór 14,3 g (32,7 mmola) la-0-benzylo-4,6-0- 45 -izopropylideno-N-propionylo-dezmetylomuraminia- nu metylowego w 130 ml metanolu zadaje sie za pomoca 24,4 ml (48,7 mmola) 2N lugu sodowego i miesza w ciagu 1,5 godziny w temperaturze po¬ kojowej. Nastepnie tak otrzymany, klarowny, lek- 5« ko zólto zabarwiony roztwór doprowadza sie za pomoca IN kwasu solnego do odczynu o wartosci pH = 7,0 i odparowuje pod próznia w temperatu¬ rze 30°C. Po wysuszeniu nad pieciotlenkiem dwu¬ fosforu otrzymuje sie sól sodowa kwasu la-0-ben- 55 zylo-4,6-0-izopropylideno-dezmetylomuraminowego w postaci bezbarwnych krysztalów o Rf —1),67 (chloroform : metanol: woda = 70 : 30 : 5) i Rf = 0,74 (acetonitryl: woda = 3:1).Substrat otrzymuje sie w sposób omówiony hi- 60 zej. r Do zawiesiny 6,75 g (224,7 mmola) wodorku so¬ dowego w 120 ml absolutnego czterówódorófuranii mieszajac w temperaturze 5°C w atmosferze azo¬ tu wkrapla sie w ciagu 5 minut roztwór 31,3 g 65 (85,65 mmola) l'a-0-benzylo-2-dezoksy-4,6-0-lz^bpró-142 641 29 pylideno-2-propionamido-D-glikopiranozydu w 200 ml absolutnego czterowodorofuranu, przy czym temperatura wzrasta do 20°C. Tak otrzymana za¬ wiesine miesza sie nadal w ciagu 2 godzin w tem¬ peraturze 40 °C, po czym chlodzi do temperatury 0°C i mieszajac w atmosferze azotu wkrapla sie w ciagu 30 minut do ochlodzonego do temperatury —15°C roztworu 20,7 g (135,77 mmola) bromoocta- nu metylowego w 95 ml absolutnego czterowodo¬ rofuranu. Tak otrzymana zawiesine miesza sie na¬ dal w ciagu 3 godzin w temperaturze 0—5°C, po czym dodaje sie 20 ml metanolu i 20 ml cztero¬ wodorofuranu. Calosc doprowadza sie za pomoca 4,5 ml kwasu octowego lodowatego do odczynu o wartosci pH = 6 i odparowuje pod próznia w temperaturze 30°C. Pozostalosc te rozpuszcza sie nastepnie w 200 ml chlorku metylenu i tak otrzy¬ many roztwór przemywa sie trzykrotnie porcjami po 125 ml wody. Warstwy chlorku metylenu la¬ czy sie, suszy nad siarczanem sodowym, saczy i odparowuje pod próznia. Otrzymuje sie surowy produkt w postaci lekko zólto zabarwionych krysz¬ talów, które oczyszcza sie na drodze chromato¬ grafii kolumnowej na 500 g obojetnego tlenku gli¬ nowego (o nazwie Woelm N, Super 1) za pomoca octanu etylowego jako eluenta (frakcje po 10 ml).Frakcje 14—36 laczy sie i odparowuje pod próz¬ nia. Otrzymuje sie la-0-benzylo-4,6-0-izopropylide- no-N-propionylo-dezmetylomuraminian metylowy w postaci bezbarwnych krysztalów o temperatu¬ rze topnienia 121—123°C (z ukladu eter etylo¬ wy : eter naftowy — 1: 2), o skrecalnosci [a]20D = = +146,9 ±0,1° (c = 0,849 w chloroformie) i Rf = = 0,67 (chloroform : metanol = 9 : 1).Przyklad V. Analogicznie jak w przykla¬ dzie IV z 5,525 g (6,43 mmola) surowego (zawiera¬ jacego jeszcze nieco dwucykloheksylomocznika) /Ca/-III-rz.-butylowego estru /CY/-N-hydroksysuk- cynimidoestru kwasu N-propionylodezmetylomura- mylo-L-alanylo-D-glutaminowego i z 3,78 g (4,95 mmola) 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksy- formyloksy/-etyloamidu L-alaniny otrzymuje sie sól sodowa 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydro- ksyfosforyloksy/-etyloamidu /Ca/-III-rz.-butylowego estru N-propionylo-dezmetylomuramylo-L-alanylo- -D-£lutamylo-/CY/-L-alaniny w postaci bezbarw¬ nego proszku, zawierajacego 2,64 mola wody, o skrecalnosci [ dzie), [a]2°D = +5,8 ± 0,1° (c = 0,694 w chlorofor¬ mie) i Rf = 0,60 (chloroform : metanol: woda = = 70 : 30 : 5).Substrat wytwarza sie w sposób omówiony ni¬ zej.Z 3,44 g (6,15 mmola) a-III-rz.-butylowego estru kwasu N-propionylo-dezmetylomuramylo-L-alany- lo-D-glutaminowego, 1,68 g (8,14 mmola) dwucy- kloheksylokarbodwuimidu i 0,94 g (8,14 mmola) N-hydroksysukcynimidu otrzymuje sie analogicz¬ nie jak w przykladzie IV surowy /Ca/-butylowy ester /Cy/-N-hydroksysukcynimidoestru kwasu N- -propionylo-dezmetylomuramylo-L-alanylo-D-gluta- minowego w postaci bezbarwnych krysztalów o skrecalnosci Rf = 0,61 (chloroform : metanol: wo¬ da = 70 : 30 : 5), zawierajacych jeszcze nieco dwu- 30 cykloheksylomocznika i stosowanych bez dalszego oczyszczania.Substrat wytwarza sie w sposób omówiony ni¬ zej. 5 Roztwór 5,1 g (7 mmoli) /Ca/-III-rz.-butylowo- -/CY/-benzylowego dwuestru kwasu la-0-benzylo- -N-propionylo/dezmetylomuramylo/L-alanylo-D-glu- taminowego w 100 ml mieszaniny dwumetoksy- etan : woda = 9:1 uwodornia sie za pomoca 1,5 g io 5% katalizatora palladowego (o nazwie E 101 M. firmy Degussa) w ciagu 20 godzin w temperaturze pokojowej pod cisnieniem normalnym. Po uplywie 20 godzin katalizator odsacza sie, po czym po¬ nownie uwodornia sie jak wyzej za pomoca 15 1,5 g swiezego katalizatora w ciagu 20 godzin.Nastepnie katalizator odsacza sie, a przesacz od¬ parowuje sie do sucha pod próznia w tempera¬ turze 30°C.Tak otrzymana pozostalosc rozpuszcza sie w 20 mieszaninie 100 ml chlorku metylenu i 5 ml izo- propanolu, roztwór ten zadaje sie za pomoca 500 ml mieszaniny eter etylowy: eter naftowy = 3:2 i nadal miesza sie w ciagu 1 godziny w tempera¬ turze pokojowej. Nastepnie odsacza sie wytracony 25 produkt i przemywa eterem etylowym.Otrzymuje sie a-III-rz.-butylowy ester kwasu N-propionylo-dezmetylomuramylo-L-alanylo-D-glu- taminowego w postaci bezbarwnego proszku, któ¬ ry zawiera 0,52 mola wody i wykazuje skrecalnosc 30 [a]20D = +20,2 ± 0,1° (c = 0,902 w wodzie), Rf = 0,32 (chloroform : metanol: woda = 70 :30 :5) i Rf = 0,54 (acetonitryl: woda = 3:1).Substrat wytwarza sie w sposób omówiony ni¬ zej. 35 Z 7,3 g (9,5 mmola) /Ca/-IU-rz.-butylowo-/Cy/- -benzylowego dwuestru kwasu la-0-benzylo-4,6-0- -izopropylideno-N-propionylo-dezmetylomuramylo- -L-alanylo-D-glutaminowego w 150 ml 60% kwa¬ su octowego analogicznie jak w przykladzie VI 40 otrzymuje sie /Ca/-III-rzed-butylowego-/CY/-benzy- lowy dwuester kwasu la-0-benzylo-N-propionylo- -dezmetylomuramylo-L-alanylo-D-glutaminowego w postaci bezbarwnych krysztalów o temperaturze topnienia 152—153°C (z ukladu metanol: woda = 45 = 1 : 5) i o skrecalnosci [ = 0,991 w metanolu), Rf = 0,40 (chloroform : meta¬ nol = 9 :1) i Rf = 0,70 (acetonitryl: woda = 3:1).Substrat wytwarza sie w sposób omówiony ni¬ zej. 50 Z 4,65 g [9,62 mmola, 2,066 mmola/g] soli kwasu la-0-benzylo-4,6-0-izopropylideno-N-propionylo-dez- metylomuraminowego, zawierajacej jeszcze nieco dwucykloheksylomocznika, 2,38 g (11,54 mmola) dwucykloheksylokarbodwuimidu, 1,33 g (11,54 mmo- 55 la) N-hydroksysukcynimidu i 3,86 g (9,62 mmola) chlorowodorku /C0/-III-rz.-butylowo-/CY/-benzylo- wego dwuestru kwasu L-alanylo-D-glutaminowego analogicznie jak w przykladzie VI otrzymuje sie /Ca/-III-rz.-butylowo-/CY/-benzylowy dwuester kwa- 60 su la-0-benzylo-4,6-0-izopropylideno-N-propionylo- -dezmetylomuramylo-L-alanylo-D-glutaminowego, zawierajacy 0,31 mola wody i wykazujacy skre¬ calnosc [ metylenu), Rf = 0,86 (acetonitryl: woda = 3:1) i 65 Rf — 0,83 (chloroform : metanol = 9:1).142 641 31 Przyklad VI. Z 3,07 g (4 mmoli) surowego /CJ-n-butylowego estru /Cy-N-hydroksysukcyn- imidoestru kwasu N-propionylo-dezmetylomuramy- lo-L-alanylo-D-glutaminowego i 2,37 g (3,1 mmo- la) 2-/1,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosfo- ryloksy/-etyloamidu L-alaniny otrzymuje sie ana¬ logicznie jak w przykladzie IV sól sodowa 2-/1,2- -dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy/- -etyloamidu /Ca/-n-butylowego estru N-propiony- lo-dezmetylomuramylo-L-alanylo-D-glutamylo-/CY/- -L-alaniny w postaci bezbarwnego proszku, za¬ wierajacego 2,93 mola wody i wykazujacego skre- calnosc [a]20D = +6,9 ± 0,1° (c = 0,504 w chlorku metylenu), Rf = 0,65 (chloroform : metanol: woda = = 70 : 30 : 5) i Rf = 0,63 (chloroform : metanol = = 7:3).Substrat wytwarza sie w sposób omówiony ni¬ zej.Analogicznie jak w przykladzie IV, z 2,2 g (3,9 mmola) n-butylowego estru kwasu N-propionylo- -dezmetylomuramylo-L-alanylo-D-glutaminowego, 1,2 g (5,8 mmola) dwucykloheksylokarbodwuimidu i 0,69 g (5,8 mmola) N-hydroksysukcynimidu otrzy¬ muje sie surowy /Ca/-n-butylowy ester /Cy/-hydro- ksysukcynimidoestru kwasu N-propionylo-dezme- tylomuramylo-L-alanylo-D-glutaminowego w po¬ staci bezbarwnych krysztalów o Rf = 0,66 (chloro¬ form : metanol: woda = 70 : 30 :5), które zawieraja jeszcze nieco dwucykloheksylomocznika i sa sto¬ sowane bez dalszego oczyszczania.Substrat otrzymuje sie w sposób omówiony ni¬ zej.Analogicznie jak w przykladzie V czas trwania uwodorniania (20 minut), z 7,3 g (11,3 mmola) /Ca/-n-butylowo-/CY/-benzylowego dwuestru kwasu N-propionylo-dezmetylomuramylo-L-alanylo-D-glu- taminowego otrzymuje sie a-n-butylowy ester kwasu N-propionylo-dezmetylomuramylo-L-alany- lo-D-glutaminowego w postaci bezbarwnego prosz¬ ku, zawierajacego 0,88 mola wody i wykazujacego skrecalnosc [a]*D- +16,4 ± 0,1° (c = 0,959 w wo¬ dzie), Rf = 0,61 (chlorek metylenu : metanol: wo¬ da = 70 :30 :5) i Rf33 0,52 (acetonitryl: woda = = 3:1).Substrat otrzymuje sie w sposób omówiony ni¬ zej.Analogicznie jak w przykladzie TV, z 9,5 g (13,97 mmola) /Ca/-n-butylowo-/CY/-benzylowego dwuestru kwasu 4,6-0-izopropylideno-N-propionylo-dezmety- lomuTamylo-L-alanylo-D-glutaminowego i 120 ml 50Vt kwasu octowego otrzymuje sie /Ca/-n-butylo- wo-ZCyZ-benzylowy dwuester kwasu N-propionylo- -dezmetylomuramylo-Lr-alanylo-D-glutaminowego, zawierajacy 0,41 mola wody i wykazujacy skre¬ calnosc [a]»D «= +15,7 ± 0,1° (c =1,019 w metano¬ lu), Rf = 0,23 (chlorek metylenu : metanol = 9:1), Rf = 0,45 (chlorek metylenu : metanol = 5:1), Rf = = 0,45 (chlorek metylenu : metanol = 5:1), Rf = = 0,82 (chlorek metylenu : metanol: HaO = 70 : 30 : :5).Substrat otrzymuje sie w sposób omówiony ni¬ zej.Analogicznie jak w przykladzie IV, z 3,81 g (10,76 mmola; 2,72 mmola/g] soli sodowej kwasu 4,6-0-izopropylldeno-N-propionylo-dezmetylomura- 32 minowego (zawierajacej jeszcze chlorek sodowy), 2,44 g (11,83 mmola) dwucykloheksylokarbodwu¬ imidu, 1,36 g (11,83 mmola) N-hydroksysukcynimi¬ du i 4,3 g (10,76 mmola) chlorowodorku /Ca/-n-bu- 5 tylowo-/CY/-benzylowego dwuestru kwasu L-alany- lo-D-glutaminowego otrzymuje sie /Ca/-n-butylo- wo-/Cy/-benzylowy dwuester kwasu 4,6-0-izopropy- lideno-N-propionylo-dezmetylomuramylo-L-alanylo- -D-glutaminowego o skrecalnosci [ 10 (c = 0,928 w metanolu), Rf = 0,81 (chlorek metyle¬ nu : metanol: woda = 70 : 30 : 5) i Rf = 0,57 (chlorek metylenu : metanol = 5:1).Przyklad VII. Do roztworu 2,85 g (2,09 mmo¬ la) otrzymanej wedlug przykladu VII soli sodowej 2-/-,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforylo- ksy/-etyloamidu /Ca/-III-rz.-butylowego estru N- -propionylo-dezmetylomuramylo-L-alanylo-D-gluta- mylo-/CY/-L-alaniny w 112 ml absolutnego chlor- ku metylenu dodaje sie 28 ml kwasu trójfluoro- octowego i calosc miesza sie w ciagu 3 godzin w temperaturze pokojowej. Bezbarwny klarowny roz¬ twór zateza sie nastepnie pod próznia w tempera¬ turze 30°C i tak otrzymana pozostalosc kilkakrot- nie ekstrahuje sie chlorkiem metylenu i ponownie odparowuje.Otrzymuje sie 3,0 g bezbarwnego oleju, który po rozpuszczeniu w 350 ml ukladu bufor fosforano¬ wy/chlorek sodowy (po 0,1 molowe, 1:1), pH = 7 30 saczy sie w dializerze firmy Amicon [Modeli 402, Ultrafilter PM 30/76 mm srednicy] pod nadcisnie¬ niem 294 kPa. Nastepnie saczy sie jeszcze wobec lacznie 2,1 litra redestylowanej wody, az do usu¬ niecia chlorków. Roztwór pozostajacy w dializerze 35 (okolo 50 ml) liofilizuje sie w wysokiej prózni.Otrzymuje sie bezbarwny liofilizat, który dalej oczyszcza sie droga chromatografii kolumnowej na 260 g zelu krzemionkowego (typu 60 reinst, firmy Merck, 0,063—0,200 mm) w ukladzie chloroform: ^ : metanol: woda = 70 : 30 : 5 (frakcja po 10 ml).Frakcje 90—260 laczy sie i w wysokiej prózni bez ogrzewania (chlodzenie) odparowuje sie do sucha.Pozostalosc ekstrahuje sie w 250 ml redestylo¬ wanej wody i najpierw do okolo 50 ml zateza 45 w dializerze firmy Amicon [Modeli 402, Ultrafilter PM 30/76 mm srednicy] pod nadcisnieniem 294 kPa, po czym do usuniecia chlorków saczy sie kolsjno wobec 250 ml ukladu bufor fosforanowy/chlorek sodowy (po 0,1 molowe, 1:1, pH = 7) i 1750 ml so redestylowanej wody.Roztwór pozostajacy w dializerze saczy sie w warunkach sterylnych przez dwa filtry miliporo- we (o nazwie Nalgene S, 0,45 \i wzglednie 0,2 \i) i liofilizuje w wysokiej prózni. 65 Otrzymuje sie dwusodowa sól 2-/l,2-dwupalmi- toilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy/-etyloamidu kwasu N-propionylo-dezmetylomuramylo-L-alanylo- -D-glutaminowego i /Ctt/-L-alaniny w postaci bez¬ barwnego, higroskopijnego proszku, zawierajacego 80 4,80 mola wody i wykazujacego skrecalnosc [ metylenu : metanol = 1:1), Rf = 0,28 (octan etylo¬ wy : n-butanol: pirydyna : kwas octowy : woda = = 42:21:21:6:10) i Rf=0,62 (acetonitryl: wo- ® da = 3:1).142 641 33 34 Przyklad VIII. 4,5 g (34 mmola) otrzymane¬ go wedlug przykladu III soli sodowej 2-/l,2-dwu- palmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy/-etylo- amidu /Ca/-III-rz.-butylowego estru N-acetylomu- ramylo-L-alanylo-D-glutamylo-/CY/-L-alaniny, któ¬ ra uprzednio osuszono w wysokiej prózni nad pie¬ ciotlenkiem dwufosforu, rozpuszcza sie w 75 ml bezwodnego dwuchlorometanu. Calosc chlodzi sie do temperatury 0°C i mieszajac oraz wykluczajac dostep wilgoci dodaje sie 25 ml bezwodnego kwa¬ su trójfluorooctowego i pozostawia do ogrzania do temperatury pokojowej.Po uplywie 2,5 klarowny, bezbarwny roztwór silnie zateza sie w temperaturze pokojowej na wyparce obrotowej (do okolo 10 ml), kilkakrotnie zadaje sie porcjami po 100 ml dwuchlorometanu i ten ostatni rozpuszczalnik ponownie odparowuje sie. Pozostajacy olej ekstrahuje sie za pomoca 100 ml Ill-rz.-butanolu i liofilizuje. Surowy pro¬ dukt oczyszcza sie na drodze dwukrotnej chroma¬ tografii na kazdorazowo 400 g zelu krzemionko¬ wego (typu 60) w ukladzie chloroform: meta¬ nol : woda = 70 : 30 : 5.Produkt zawarty we frakcjach 92—172 rozpusz¬ cza sie w 100 ml redestylowanej wody i oczysz¬ cza droga diafiltracji [mieszalnik typ 402 firmy Amicon, Ultrafilter PM 10/76 mm srednicy], ana¬ logicznie jak w przykladzie I. Roztwór pozostajacy w mieszalniku saczy sie przez filtr miliporowy (0,2 \x) i liofilizuje.Otrzymuje sie sól dwusodowa 2-/l,2-dwupalmi- toilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy/-etyloamidu kwasu N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-glutamino- wego i /Cy/-L-alaniny, zawierajacej 4,89 mola wo¬ dy i stanowiaca bezbarwny, pulchny proszek o skrecalnosci [ tanolu), Rf = 0,08 (chloroform : metanol: woda = = 70 : 30 : 5), Rf = 0,15 (octan etylowy : n-buta- nol: pirydyna : kwas octowy : woda = 42 : 21: 21: 6 : : 10) i Rf = 0,30 (chloroform : metanol: woda : kwas octowy = 70 : 40 : 9 :1).Przyklad IX. Szczurze makrofagi pecherzy¬ kowe otrzymuje sie przez przemywanie pluc, umie¬ szcza in vitro w ciagu 24 godzin, inkubuje albo z liposomami, które sa zaladowane substancja czynna, albo z substancja czynna w fizjologicznym roztworze soli (sól buforowana fosforanami, PBS).Do calosci dodaje sie komórki guza znaczone jo¬ dem 125J i inkubuje nadal w ciagu 72 godzin. Na¬ stepnie obrywa sie usmiercone komórki £uza i okresla sie liczbe jeszcze zyjacych komórek guza na podstawie ich radioaktywnosci. Zaktywowanie makrofagów ocenia sie na podstawie cytotoksycz- nosci, tzn. wedlug udzialu komórek guza usmier¬ conych pod koniec prób. Cytotoksycznosc wlasci¬ wa (•/&) oblicza sie wedlug równania: cpm w komórkach guza inkubowanego Imikrofagami i substancja czynna 1 [cpm w komórkach guza inkubowanegoJ makrofagami i PBS Dalsze szczególy powyzszej metody testowej sa opisane w: I. L. Fidler i wspólpracownicy, J. Biol.Response Modifiere, 1, 43—55 (1982). Niektóre wy¬ niki badan, dotyczace omówionych substancji sa zestawione w podanej nizej tablicy 2.I sól sodowa 2-/1,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3- -hydroksyfosforyloksyetyloamidu /Ca/-n-butylowego estru N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-glutamylo- -/CY/-L-alaniny; II sól sodowa 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3- -hydroksyfosforyloksy-etyloamidu /Ca/-n-butylowe- go estru N-propionylo-normuramylo-L-alanylo-D- -glutamylo-/CY/-L-alaniny; III sól sodowa 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3- -hydroksyfosforyloksy/-etyloamidu /Ca/-n-metylo- wego estru N-propionylo-normuramylo-L-alanylo- -D-glutamylo-/CY/-L-alaniny i IV sól sodowa 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3- -hydroksyfosforyloksy/-etyloamidu /Ca/-III-rz.-bu- tylowego estru N-acetylomuramylo-L-alanylo-D- -glutamylo-/CY/-L-alaniny.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych peptydów mura- mylowych o wzorze 1, w którym R1, R4 i R8 ozna¬ czaja atomy wodoru, R2 oznacza rodnik alkilowy o 1—4 atomach wegla, R3 oznacza atom wodoru lub rodnik metylowy, RB oznacza atom wodoru, R7 oznacza rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, R8 oznacza atom wodoru lub nizszy rodnik alkilo¬ wy, X oznacza grupe NH, Y oznacza rodnik alki- lidenowy o 1—4 atomach wegla, a R9 i R10 nieza¬ leznie od siebie oznaczaja rodnik alkilowy o 11—17 atomach wegla, i/lub ich soli, znamienny tym, ze zwiazek o wzorze 2, w którym s, r i q niezaleznie od siebie oznaczaja liczbe 0 lub 1, a R8 oznacza nizszy rodnik alkilowy lub grupe zabezpieczajaca rodnik karboksylowy, zas pozostale podstawniki maja wyzej podane znaczenie, pod warunkiem, ze obecne w zwiazku o wzorze 2 wolne grupy fun^ kcyjne z wyjatkiem grupy bioracej udzial w reak¬ cji wystepuja ewentualnie w postaci zabezpieczo¬ nej, lub reaktywna pochodna tego zwiazku z kwa¬ sem karboksylowym, poddaje sie reakcji ze zwiaz¬ kiem o wzorze 3, w którym t, u i v niezaleznie od siebie oznaczaja liczbe 0 lub 1, a podstawniki maja wyzej podane znaczenie, pod warunkiem, ze t, u i v stanowia liczbe 1, jezeli w reagencie o wzo¬ rze 2 symbol q stanowi liczbe 0, lub ze t stanowi liczbe 0, u stanowi liczbe 1, a v stanowi liczbe 1, jezeli q stanowi liczbe 1, r stanowi liczbe lis sta¬ nowi liczbe 0, lub ze v stanowi liczbe 0, jezeli q, r i s stanowia liczby 1, lub poddaje sie reakcji z jego sola lub reaktywna pochodna i obecne ewentualnie grupy zabezpieczajace odszczepia sie, a otrzymany zwiazek o wzorze 1 ewentualnie przeprowadza sie w sól lub otrzymana sól ewen¬ tualnie przeprowadza sie w inna sól. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania farmakologicznie do¬ puszczalnych soli zwiazku o wzorze 1, w którym R8 oznacza nizszy rodnik alkilowy, a pozostale symbole maja znaczenie podane w zastrz. 1, zwia¬ zek o wzorze 2, w którym R8 oznacza nizszy rod¬ nik alkilowy, a pozostale symbole maja wyzej po¬ dane znaczenie, lub reaktywna pochodna tega zwiazku z kwasem karboksylowym, poddaje sie reakcji ze zwiazkiem o wzorze 3, w którym R* oznacza nizszy rodnik alkilowy, a pozostale sym- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60142 641 35 bole maja wyzej podane znaczenie, albo farmako¬ logicznie dopuszczalna sola tego zwiazku, i, w ra¬ zie potrzeby, otrzymany zwiazek o wzorze 1 prze¬ prowadza sie w jego farmakologicznie dopuszczal¬ na sól. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania soli litowcowej 2-/1,2- -dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy/- -etyloamidu /Ca/-n-butylowego estru N-acetylomu- ramylo-L-alanylo-D-glutamylo-/CY/-L-alaniny pod¬ daje sie reakcji /Ca/-n-butylowy ester kwasu N- -acetylomuramylo-L-alanylo-D-glutaminowego z sola litowcowa 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hy- droksyfosforyloksy/-etyloamidu L-alaniny. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania soli litowcowej 2-/1,2- -dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy/- etyloamidu /Ca/-n-butylowego estru N-propionylo- dezmetylomuramylo-L-alanylo-D-glutamylo-/CY/-L- alaniny poddaje sie reakcji /Ca/-n-butylowy ester /CY/-N-hydroksysukcynimidoestru kwasu N-propio- nylodezmetylomuramylo-L-alanylo-D-glutaminowe- go z 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfos- foryloksy/-etyloamidem L-alaniny w obecnosci trój¬ etyloaminy i otrzymana sól trójetyloamoniowa prze¬ ksztalca sie w sól litowcowa. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania soli litowcowej 2-/1,2- dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy/- etyloamidu /Ca/-metylowego estru N-acetylomura- mylo-L-alanylo-D-glutamylo-/CY/-alaniny poddaje sie reakcji /Ca/-metylowy ester /CY/-N-hydroksy- sukcynimidoestru kwasu N-acetylomuramylo-L-ala- nylo-D-glutaminowego z 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn- glicero-3-hydroksyfosforyloksy/-etyloamidem L-ala¬ niny w obecnosci trójetyloaminy i otrzymana sól trójetyloamoniowa przeksztalca sie w sól litowco¬ wa. 10 15 20 35 36 6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania soli trójetyloamoniowej lub litowcowej 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hy- droksyfosforyloksy/-etyloamidu /Ca/-metylowego estru N-propionylodezmetylomuramylo-L-alanylo-D -glutamylo-/Cy/-L-alaniny poddaje sie reakcji ICJ- metylowy ester /CY/-N-hydroksysukcynoimidoestru kwasu N-propionylodezmetylomuramylo-L-alanylo- D-glutaminowego z 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero- 3-hydroksyfosforyloksy/-etyloamidem L-alaniny w obecnosci trójetyloaminy i otrzymana sól trójetylo¬ amoniowa ewentualnie przeksztalca sie w sól li¬ towcowa. 7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania soli trójetyloamoniowej lub litowcowej 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3- hydroksyfosforyloksy/-etyloamidu /Ca/-III-rz.-buty- lowego estru N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-gluta- mylo-/Cy/-L-alaniny reaktywny ester kwasu karbo- ksylowego z /Ca/-III-rz.-butylowym estrem kwasu N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-glutaminowego poddaje sie reakcji z 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glice- ro-3-hydroksyfosforyloksy/-etyloamidem L-alaniny w obecnosci trójetyloaminy i otrzymana sól trój¬ etyloamoniowa ewentualnie przeksztalca sie w sól litowcowa. 8. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania soli trójetyloamoniowej lub litowcowej 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3- hydroksyfosforyloksy/-etyloamidu /Ca/-III-rz.-buty- lowego estru N-propionylodezmetylomuramylo-L- alanylo-D-glutamylo-/Cy/-L-alaniny reaktywny ester kwasu karboksylowego z /Ca/-III-rz.-butylowym estrem kwasu N-propionylodezmetylomuramylo-L- alanylo-D-glutaminowego poddaje sie reakcji z 2-1 l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforylo- ksy/-etyloamidem L-alaniny w Obecnosci trójetylo¬ aminy i otrzymana sól trójetyloamoniowa ewen¬ tualnie przeksztalca sie w sól litowcowa. ch2-or6 . O (H.0R1) / NH-C-R2 R3-CH (D) OH O^-O-P-O-CHj \ (D (D) (U0CH2 Ó C-N-CH-C-NH-CH-CH,-OL-C-X-Y-C-NH 11 I I a 1 I 0 Rs R7 0 C 0 OR8 Wzór 1 C-O-CH R9 CH,1' (sn) i 0 i R* 0142 641 R6OCH2 O ) (H.OR1) NH-C-R2 R*-CH (D) c- ii O (L) N-CH-C- i i " Rs R7 O (D) NH-CH-CH,-CH,-C- i L u C O // \ O OR8 ( (L)/1 !X-Y-C- ii 0 \1 1 w OH s r Wzór 2 H- L\ (L) N-CH-C- Rs R7 O (D) NH-CH-rCK,-CH,-e- li 7 2 11 OH -„ CH2-0-P-0-CH2 \ (L)0]CH2 0 O X-Y-C- 0 OR8 NH ^-O-CH Wzór 3 CH21*(sn) % RIO c-o PL PL

Claims (8)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych peptydów mura- mylowych o wzorze 1, w którym R1, R4 i R8 ozna¬ czaja atomy wodoru, R2 oznacza rodnik alkilowy o 1—4 atomach wegla, R3 oznacza atom wodoru lub rodnik metylowy, RB oznacza atom wodoru, R7 oznacza rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, R8 oznacza atom wodoru lub nizszy rodnik alkilo¬ wy, X oznacza grupe NH, Y oznacza rodnik alki- lidenowy o 1—4 atomach wegla, a R9 i R10 nieza¬ leznie od siebie oznaczaja rodnik alkilowy o 11—17 atomach wegla, i/lub ich soli, znamienny tym, ze zwiazek o wzorze 2, w którym s, r i q niezaleznie od siebie oznaczaja liczbe 0 lub 1, a R8 oznacza nizszy rodnik alkilowy lub grupe zabezpieczajaca rodnik karboksylowy, zas pozostale podstawniki maja wyzej podane znaczenie, pod warunkiem, ze obecne w zwiazku o wzorze 2 wolne grupy fun^ kcyjne z wyjatkiem grupy bioracej udzial w reak¬ cji wystepuja ewentualnie w postaci zabezpieczo¬ nej, lub reaktywna pochodna tego zwiazku z kwa¬ sem karboksylowym, poddaje sie reakcji ze zwiaz¬ kiem o wzorze 3, w którym t, u i v niezaleznie od siebie oznaczaja liczbe 0 lub 1, a podstawniki maja wyzej podane znaczenie, pod warunkiem, ze t, u i v stanowia liczbe 1, jezeli w reagencie o wzo¬ rze 2 symbol q stanowi liczbe 0, lub ze t stanowi liczbe 0, u stanowi liczbe 1, a v stanowi liczbe 1, jezeli q stanowi liczbe 1, r stanowi liczbe lis sta¬ nowi liczbe 0, lub ze v stanowi liczbe 0, jezeli q, r i s stanowia liczby 1, lub poddaje sie reakcji z jego sola lub reaktywna pochodna i obecne ewentualnie grupy zabezpieczajace odszczepia sie, a otrzymany zwiazek o wzorze 1 ewentualnie przeprowadza sie w sól lub otrzymana sól ewen¬ tualnie przeprowadza sie w inna sól.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania farmakologicznie do¬ puszczalnych soli zwiazku o wzorze 1, w którym R8 oznacza nizszy rodnik alkilowy, a pozostale symbole maja znaczenie podane w zastrz. 1, zwia¬ zek o wzorze 2, w którym R8 oznacza nizszy rod¬ nik alkilowy, a pozostale symbole maja wyzej po¬ dane znaczenie, lub reaktywna pochodna tega zwiazku z kwasem karboksylowym, poddaje sie reakcji ze zwiazkiem o wzorze 3, w którym R* oznacza nizszy rodnik alkilowy, a pozostale sym- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60142 641 35 bole maja wyzej podane znaczenie, albo farmako¬ logicznie dopuszczalna sola tego zwiazku, i, w ra¬ zie potrzeby, otrzymany zwiazek o wzorze 1 prze¬ prowadza sie w jego farmakologicznie dopuszczal¬ na sól.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania soli litowcowej 2-/1,2- -dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy/- -etyloamidu /Ca/-n-butylowego estru N-acetylomu- ramylo-L-alanylo-D-glutamylo-/CY/-L-alaniny pod¬ daje sie reakcji /Ca/-n-butylowy ester kwasu N- -acetylomuramylo-L-alanylo-D-glutaminowego z sola litowcowa 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hy- droksyfosforyloksy/-etyloamidu L-alaniny.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania soli litowcowej 2-/1,2- -dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy/- etyloamidu /Ca/-n-butylowego estru N-propionylo- dezmetylomuramylo-L-alanylo-D-glutamylo-/CY/-L- alaniny poddaje sie reakcji /Ca/-n-butylowy ester /CY/-N-hydroksysukcynimidoestru kwasu N-propio- nylodezmetylomuramylo-L-alanylo-D-glutaminowe- go z 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfos- foryloksy/-etyloamidem L-alaniny w obecnosci trój¬ etyloaminy i otrzymana sól trójetyloamoniowa prze¬ ksztalca sie w sól litowcowa.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania soli litowcowej 2-/1,2- dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy/- etyloamidu /Ca/-metylowego estru N-acetylomura- mylo-L-alanylo-D-glutamylo-/CY/-alaniny poddaje sie reakcji /Ca/-metylowy ester /CY/-N-hydroksy- sukcynimidoestru kwasu N-acetylomuramylo-L-ala- nylo-D-glutaminowego z 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn- glicero-3-hydroksyfosforyloksy/-etyloamidem L-ala¬ niny w obecnosci trójetyloaminy i otrzymana sól trójetyloamoniowa przeksztalca sie w sól litowco¬ wa. 10 15 20 35 36

6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania soli trójetyloamoniowej lub litowcowej 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hy- droksyfosforyloksy/-etyloamidu /Ca/-metylowego estru N-propionylodezmetylomuramylo-L-alanylo-D -glutamylo-/Cy/-L-alaniny poddaje sie reakcji ICJ- metylowy ester /CY/-N-hydroksysukcynoimidoestru kwasu N-propionylodezmetylomuramylo-L-alanylo- D-glutaminowego z 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero- 3-hydroksyfosforyloksy/-etyloamidem L-alaniny w obecnosci trójetyloaminy i otrzymana sól trójetylo¬ amoniowa ewentualnie przeksztalca sie w sól li¬ towcowa.

7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania soli trójetyloamoniowej lub litowcowej 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3- hydroksyfosforyloksy/-etyloamidu /Ca/-III-rz.-buty- lowego estru N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-gluta- mylo-/Cy/-L-alaniny reaktywny ester kwasu karbo- ksylowego z /Ca/-III-rz.-butylowym estrem kwasu N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-glutaminowego poddaje sie reakcji z 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glice- ro-3-hydroksyfosforyloksy/-etyloamidem L-alaniny w obecnosci trójetyloaminy i otrzymana sól trój¬ etyloamoniowa ewentualnie przeksztalca sie w sól litowcowa.

8. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania soli trójetyloamoniowej lub litowcowej 2-/l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3- hydroksyfosforyloksy/-etyloamidu /Ca/-III-rz.-buty- lowego estru N-propionylodezmetylomuramylo-L- alanylo-D-glutamylo-/Cy/-L-alaniny reaktywny ester kwasu karboksylowego z /Ca/-III-rz.-butylowym estrem kwasu N-propionylodezmetylomuramylo-L- alanylo-D-glutaminowego poddaje sie reakcji z 2-1 l,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforylo- ksy/-etyloamidem L-alaniny w Obecnosci trójetylo¬ aminy i otrzymana sól trójetyloamoniowa ewen¬ tualnie przeksztalca sie w sól litowcowa. ch2-or6 . O (H.0R1) / NH-C-R2 R3-CH (D) OH O^-O-P-O-CHj \ (D (D) (U0CH2 Ó C-N-CH-C-NH-CH-CH,-OL-C-X-Y-C-NH 11 I I a 1 I 0 Rs R7 0 C 0 OR8 Wzór 1 C-O-CH R9 CH,1' (sn) i 0 i R* 0142 641 R6OCH2 O ) (H.OR1) NH-C-R2 R*-CH (D) c- ii O (L) N-CH-C- i i " Rs R7 O (D) NH-CH-CH,-CH,-C- i L u C O // \ O OR8 ( (L)/1 !X-Y-C- ii 0 \1 1 w OH s r Wzór 2 H- L\ (L) N-CH-C- Rs R7 O (D) NH-CH-rCK,-CH,-e- li 7 2 11 OH -„ CH2-0-P-0-CH2 \ (L)0]CH2 0 O X-Y-C- 0 OR8 NH ^-O-CH Wzór 3 CH21*(sn) % RIO c-o PL PL