FI75578B - Analogifoerfarande foer framstaellning av farmakologiskt verkande lipofila fosfatidylmuramylpeptider. - Google Patents

Description

75578

Analogiamenetelmä farmakologisesti vaikuttavien lipofiilis-ten fosfatidyylimuramyylipeptidien valmistamiseksi -Analogiförfarande för framställning av farmakologiskt ver-kande lipofila fosfatidylmuramylpeptider Tämän keksinnön kohteena on analogiamenetelmä uusien li-pofiilisten fosfatidyylimuramyylipeptidien valmistamiseksi, joita yhdisteitä voidaan käyttää immuniteetin stimuloimisek-si.

Keksintö koskee siten menetelmää yhdisteiden valmistamiseksi, joiden kaava I on

CH2OH

1/—— °\ ζ Vv/ OH (I) ho/1-r g j HN - C - Rl

R3 - CH

\ j*5 CONH2

'CON - CH - CON - im - CH2CH2 - COA2 H H

(D) (L) D) jossa Ri tarkoittaa alempialkyyliä tai fenyyliä, R3 tarkoittaa vetyä tai alempialkyyliä, R5 tarkoittaa alempialkyyliä ja A2 tarkoittaa tähdettä, jonka kaava on 0 -T-Y-O-P-O - CH2 (id

1 I

OH Z

jossa T on NH tai O, Y on alempialkyleeni tai kaavan -Yl - CONH - Y2- mukainen tähde, jossa Yi ja Y2 ovat kumpikin alempialkyleeni ja Z on 1,2-dihydroksietyyli- tai 2-hydroksietyyliryhmä, jos- 2 75578 sa ainakin yksi hydroksiryhmistä on esteröity mahdollisesti yhden kaksoissidoksen sisältävällä alifaattisella karboksyy-lihapolla, jossa on 12-22 hiiliatomia, ja niiden suolojen valmistamiseksi.

Alempialkyyli on suoraketjuinen tai haarautunut ja mielivaltaiseen asemaan sitoutunut.

Alempialkyleenitähde Y on mieluimmin 2 tai 3 hiiliatomia sisältävä.

Tähteessä, jonka kaava on - Yl - CON - Y2 - (IIIc)

H

alempialkyleenitähteet Y^ ja Y2 sisältävät yhdessä useamman kuin kaksi hiiliatomia.

Mieluimmin alifaattiset karboksyylihapot ovat sellaisia, joissa on 16-22 hiiliatomia.

Tämän selityksen ja patenttivaatimusten yhteydessä sanonnalla "alempi" merkityt tähteet ja yhdisteet sisältävät enintään 4 hiiliatomia.

Hakemuksessa käytetyt yleiset käsitteet tarkoittavat seuraavaa:

Alempialkyyli on esim. n-propyyli, n-butyyli, isobutyy-li, sek.-butyyli tai tert.-butyyli ja ensisijassa metyyli tai etyyli.

Alempialkoksi on esim. n-propoksi, n-butoksi, isobutok-si, sek.-butoksi tai tert.-butoksi ja ensisijassa metoksi tai etoksi.

Alempialkyleenidioksi on erityisesti metyleenidioksi, etyleenidioksi tai propyleenidioksi .

Halogeeni on fluori tai bromi, mieluimmin kuitenkin kloori.

Alempialkanoyyli on erityisesti propionyyli tai butyryy-li, ensisijassa kuitenkin asetyyli.

Kaavan I mukaiset uudet yhdisteet voivat olla isomeeri-seosten tai puhtaiden isomeerien muodossa.

Tämän keksinnön mukaiset, uudet, lipofiiliset muramyyli-

II

3 75578 peptidit omaavat joukon arvokkaita, farmakologisia ominaisuuksia, erityisesti huomattavan immuniteettia tehostavan vaikutuksen.

Niinpä näillä yhdisteillä saadaan in vivo hiirten vasta-ainemuodostus huomattavasti lisääntymään: NMRl-hiiret immunisoidaan 0. päivänä intraperitoneaali-sesti ruiskuttamalla 10 /um sakatonta naudanseerumialbumii-nia (BSA), 9, 15 ja 29 päivää myöhemmin otetaan seerumiko-keet ja tutkitaan niiden anti-BSA-vasta-ainepitoisuutta passiivisella hemagglutinaatiotekniikalla. Käytetyssä annoksessa on liukeneva BSA subimmunogeeninen vastaanottajaeläimil-le, so. se ei pysty tuottamaan ollenkaan tai vain hyvin vähän vasta-aineita. Hiirten ylimääräinen käsittely määrätyillä immuniteettia kohottavilla aineilla ennen antigeenin antamista tai sen jälkeen saa aikaan vasta-ainetiitterin kohoamisen seerumissa. Käsittelyn teho ilmaistaan saadun score-arvon avulla, so. log2 tiitterierotusten summan avulla kolmena verenottopäivänä.

Tässä tekstissä kaavan (I) yhdisteet pystyvät annettaessa niitä intraperitoneaalisesti tai subkutaanisesti 0,5-5 mg/eläimen paino-kg viitenä peräkkäisenä päivänä BSA:11a tapahtuvan immunisoinnin jälkeen kohottamaan huomattavasti vasta-ainetuotantoa BSA:ta vastaan. Ne ovat tässä suhteessa huomattavasti parempia kuin tavanomaiset hydrofiiliset mura-myylipeptidit.

Solujen välittämän immuniteetin manifestaatiota voidaan kohottaa myös mainituilla yhdisteillä in vivo:

Marsujen herkistäminen epätäydellisessä Freund'in adjuvan-tissa olevalla BSA:11a johtaa vain humoraaliseen vasta-ainemuodostukseen, kun taas keksinnön mukaisten lipofiilisten mura-myylipeptidien lisääminen 5-50 /ug:n annoksina antigeeni-öljy-emulsioon indusoi myöhäistyyppistä yliherkkyyttä BSA:n suhteen: 3 viikkoa immunisoinnin jälkeen BSA:n intrakutaaninen injektio 4 75578 aiheuttaa näissä eläimissä paikallisen tulehdusreaktion, jolloin esiintyy punoitusta ja ihon paksuuntumia, mikä reaktio saavuttaa 24-48 tunnin kuluessa maksiminsa. Nämä myöhäistyyppiset reaktiot vastaavat kvantitatiivisesti ja kvalitatiivisesti niitä, jotka saadaan tavanomaisesti immunisoitaessa täydellisessä Freund'in adjuvantissa olevalla BSA:11a (s.o. lisäämällä myko-bakteereita). ED^-arvot (tarvittava yg/eläin 200/yl:n reaktio-tilavuuden (punoituspinta x ihon paksuudenkasvu) erotuksen induktiota varten käsitellyissä ja käsittelemättömissä eläimissä, 24 tuntia aiheuttamisen jälkeen) ovat 10-20 yg.

Erityisesti on korostettava myös tällaisten lipofiilisten muramyylipeptidien kykyä annettaessa niitä yhdessä BSA:n kanssa liposomeissa (valkuaislesitiini:kolesteroli 4:1, 4 mg/eläin) ja ilman toksisia mineraaliöljykomponentteja indusoida marsuissa myöhäistyyppistä yliherkkyyttä BSA:ta vastaan. Kvantitatiivisesti ja kvalitatiivisesti nämä myöhäistyyppiset reaktiot ovat samoin identtisiä niiden kanssa, jotka saadaan immunisoitaessa täydellisessä Freund'in adjuvantissa olevalla BSA:11a. ED^Q-ar-vot ovat 100 - 300 yg/eläin.

Kaavan (I) mukaiset yhdisteet osoittavat muita ylimääräisiä laadun parannuksia verrattuina hydrofiilisiin muramyylipeptidei-hin.

Balb/c-hiiret immunisoidaan antamalla niille intraperitone- 4 aalisena injektiona 2x10 (P815 mastocytomsoluja 0. päivänä.

15. päivänä tutkitaan näin immunisoitujen eläinten pernasolut in vitro solutoksisten, P815 mastocytomsoluja vastaan suunnattujen T-lymfosyyttien esiintymisen suhteen. Tätä varten merka-taan P815 kohdesolut Cr:lla ja solutoksisen reaktion laajuus selvitetään mittaamalla radioaktiivisuus viljelyn päällä olevassa osassa. Käytetyssä annoksessa ovat P815 mastocytomsolut subimmunogeeneja vastaanottaja-hiirille, s.o. ne eivät indusoi mitään tai vain aivan vähäistä solutoksisten T-solujen muodostumista. Annettaessa samanaikaisesti intraperitoneaalisesti 1 - 50 yg mainittuja kaavan I mukaisia muramyylipeptidejä tämä saa aikaan huomattavaa solutoksisten T-solujen muodostuksen kohoamista (kerroin 10-30 käsittelemättömiin hiiriin verrattuna) .

Il 5 75578

Kaavan (I) mukaisten uusien yhdisteiden immuniteettia kohottavat ominaisuudet voidaan esittää myös erityisen immuu-nitoleranssin induktiossa transplantaatioantigeenejä vastaan immunisoimalla hiiret adjuvantilla käsitellyillä autoblasteil-la:

Seka-lymfosyyttiviljelyssä inkuboidaan tulevan kudossiir-rännäisen vastaanottajan (C57B1/6J hiirten) pernalymfosyytte-jä tulevan kudossiirrännäisen antajan (CBA/J hiirten) säteily-tetyillä pernasoluilla. T-lymfosyytit, jotka sisältävät antajan kudossopivuusantigeenejä varten erityisiä reseptoreita, lisääntyvät ja kehittyvät blasteiksi. Nämä voidaan erottaa myös muiden solujen sakkautumisen avulla. Spesifiset blastit pusertavat ulos membraanireseptorien relevantit idiotyyppiset spesifisyydet ja ne ruiskutetaan täydellisellä Freund'in adjuvantilla (CFA) käsiteltyinä autoimmunogeeneinä spesifisen toleranssin indusoimiseksi kyseisiä kudossiirrännäisantigeene-ja vastaan prospektiivisiin kudossiirrännäisen vastaanottajiin (C 57 B1/6J). Immunisointi tapahtuu neljä kertaa neli-viikkoisin välein autologisilla anti-CBA/J T-lymfoblasteilla. T-autoblastien adsorbaatit kaavan (I) mukaisten uusien yhdis- 9 teiden kanssa (10 blastia suspendoidaan liuokseen, jossa on 20 mg substanssia 20 ml:ssa PBS:a. Kaksituntisen inkuboinnin jälkeen solut sentrifugoidaan ja pestään kaksi kertaa PSB:llä) pystyvät indusoimaan spesifisen immuunitoleranssin CFA:n puuttuessa, jolloin adsorbaatit ovat yhtä tehokkaita kuin lymfo-blastit CBAsssa.

Kaavan (I) mukaiset uudet yhdisteet pystyvät tämän lisäksi konsentraation ollessa 0,5 - 100 yg/ml normaalien hiirten pernasoluviljelyissä indusoimaan vasta-ainetta tuottavien solujen muodostumista (19S-täpliä muodostavien solujen lisääntyminen kertoimella 10-30 kontrolliarvon yli (stimuloivien substanssien puuttuessa)): siten muodostuu mainittujen yhdisteiden läsnäollessa esim. spesifisiä vasta-aineita lampaan erytrosyyttejä vastaan, ilman että viljelyihin lisätään lampaan erytrosyyttejä immunisointia varten. Toisaalta pystyvät mainitut substanssit samalla konsentraatioalueella myös kohottamaan (kongenitaalisten athymisten nu/nu-hiirten) T-solu-köyhien pernasoluviljelyiden immunologista reaktiivisuutta normaalisti thymusriippuvaisaen antigeeniin (lampaan erytro- 6 75578 syyttiin) nähden (kerroin 10-30 suhteessa käsittelemättömiin kontrolliviljelyihin). Mainittujen yhdisteiden avulla ei indusoida kuitenkaan in vitro suoraan tai välillisesti vain B-lymfosyyttien (s.o. potentiaalisesti vasta-ainetta muodostavien solujen) uudiskasvu- ja synteesisuorituksia, vaan niiden avulla vaikutetaan myös T-lymfosyytteihin (joihin kuuluvat regulatoorisesti aktiivit apu- ja suppressorisolut sekä syto-toksiset efektorisolut). Siten mainitut yhdisteet pystyvät esim. konsentraatioalueella 1-20 pg/ml kohottamaan huomattavasti (jopa 10-kertaisesti) kortisoniresistenttien thymus-solujen reaktiivisuutta verrattuna allogeeneihin säteilytettyi-hin stimulaattorilymfosyytteihin.

Yllä esitetyt vaikutukset tapahtuvat todennäköisesti välillisesti siten, että sellaiset lipofiiliset muramyylipeptidit aktivoivat makrofageja, jotka puolestaan edistävät T- ja B-lymfosyyttien reaktiivisuutta. Voidaan itse asiassa osoittaa, että mainitut yhdisteet vapauttavat jo vähäisissä konsentraa-tioissa (0,5 - 10 yg/ml) suuria määriä "colony stimulating activity" (CSA) hiiren makrofageista (150 - 200 pesäkkeen induktio 7 päivän kuluessa 10^ hiirten luuydinsoluista, sen jälkeen kun on lisätty 20% 24 tunnin ajan substanssilla inku-boitujen makrofagiviljelyiden päällä olevaa osaa, verrattuna 0-5 pesäkkeeseen lisättäessä käsittelemättömien makrofagiviljelyiden päällä olevia osia). CSA on biologinen välittäjä, joka on tarpeellinen luuydinkantasolujen differentioimiseksi makrofageiksi ja liuskatumaisiksi (polymorphkernig) leukosyyteiksi. Siten mainitut yhdisteet saavat aikaan solujen kohotetun lisäyksen, jotka solut ovat keskeisesti merkittäviä ei-spesifiselle resistenssille ja spesifisten (lymfosyyttien välittämien) immuunireaktioiden induktiolle, amplifikaatiolle ja ilmaisulle.

Uusien yhdisteiden immuniteettia kohottava vaikutus voidaan osoittaa in vivo: Siten saa keksinnön mukaisen muramyyli-peptidien fosfolipidi-johdannaista sisältävä injektio 3-9 tunnin kuluessa aikaan seerumin CSA-konsentraation huomattavan nousun (aina 120 pesäkkeeseen/10^ hiiren luuydinsolua sen jälkeen, kun on lisätty kloroformilla uutettua seerumia (5% loppu-konsentraatio) verrattuna 0-5 pesäkkeeseen käsittelemättömissä eläimissä). Tämän mukaisesti antamalla samoja yhdisteitä

II

7 75578 kohotetaan huomattavasti in vivo hiirten vasta-aineen muodostuskykyä .

Kaavan I mukaisten uusien yhdisteiden immuniteettia kohottavat ominaisuudet voidaan osoittaa myös tuumori-malleissa, esim. hiiren Ehrlich Ascites-tuumorissa.

Intraperitoneaalinen, "ΙΟ** syngeenistä Ehrlich Ascites-tuu-morisolua sisältävä injektio johtaa balb/c-hiirissä keskimäärin 18 päivässä eläinten kuolemaan. Jos hiirille ruiskutetaan

7 fi S

intraperitoneaalisesti 10 (ryhmä 1), 10 (ryhmät 2) ja 10

(ryhmät 3) Ascites-tuumorisoluja, joihin on lisätty kaavan I

9 mukaisia uusia yhdisteitä in vitro (10 Ascites-tuumorisoluja suspendoidaan liuokseen, jossa on 40 mg koesubstanssia 20 ml: ssa fosfaatilla puskuroitua fysiologista keittosuolaliuosta (PBS) ja kaksituntisen inkubaation jälkeen 37°C:ssa solut sentrifugoidaan ja pestään kaksi kertaa PBS:llä. Solut sisällyttävät tässä käsittelyssä koeyhdisteen membraaniinsa), niin tuumorikasvua ei esiinny 18 päivässä. 19. päivänä eläimille annetaan kulloinkin 10^ natiivisia Ehrlich Ascites-tuumorisoluja intraperitoneaalisesti. Voitiin havaita seuraavat vaikutukset:

Ryhmä 1: 8 eläintä kymmenestä eli yli 80. päivän Ryhmä 2: 6 eläintä kymmenestä eli yli 80. päivän Ryhmä 3: eläimet kuolivat, kuten kontrollieläimetkin 18 päi vän kuluttua

Keksinnön mukaiset yhdisteet ovat lisäksi vähän toksisia: hiiret kestivät jopa 5-kertaisen intraperitoneaalisen annostuksen annoksen ollessa 100 mg/kg/päivä viitenä peräkkäisenä päivänä ilmeisesti oireettomasti. Koska immuniteetin stimulointia varten tarvittavat annokset ovat hyvin pienet, uusien yhdisteiden terapeuttinen ulottuvuus on hyvin suuri.

Keksinnön mukaiset uudet yhdisteet voivat siten kohottaa huomattavasti sellulaarista ja etenkin humoraalista immuniteettia, nimenomaan sekä seoksena itse antigeenin kanssa (adjuvant-ti-efekti ahtaammassa mielessä) että myös ajallisesti ja paikallisesti antigeeni-injektiosta erillisenä annettuna (systeeminen immuniteetin kohottaminen).

8 75578

Keksinnön mukaisia uusia yhdisteitä voidaan siten käyttää adjuvantteina sekoitettuina rokotteisiin rokotuksen tuloksen parantamiseksi ja humoraalisten vasta-aineiden ja/tai sellulaarisen immuniteetin välittämän infektiosuojän parantamiseksi bakteeri-, virus- tai parasiitti-taudinaiheuttajiin nähden.

Lopuksi soveltuvat esitetyt yhdisteet sekoitettuina erilaisten antigeenien kanssa adjuvanteiksi terapiaan ja diagnostiikkaan tarkoitettujen antiseerumien kokeelliseen ja teolliseen valmistukseen ja immunologisesti aktivoitujen lymfo-syyttipopulaatioiden induktioon solunsiirtomenetelmiä varten .

Tämän lisäksi voidaan uusia yhdisteitä käyttää ilman että lisätään samanaikaisesti antigeenejä, edistämään ihmisten ja eläinten jo tiedottomasti tapahtuvia immuunireaktioita. Yhdisteet soveltuvat siten etenkin ruumiillisen torjunnan stimuloimiseksi, esim. kroonisissa tai akuuteissa infektioissa tai selektiivisissä (antigeeni-spesifisissä) immunologisissa puutoksissa, sekä synnynnäisissä, mutta myös hankituissa yleisissä (so. ei antigeeni-spesifisissä) immunologisissa puutostiloissa, kuten ne esiintyvät ikäännyttäessä, vaikeissa primäärisairauksissa ja ennen kaikkea ionisoivilla säteillä tai immunosuppressiivisesti vaikuttavilla hormoneilla tapahtuvan terapian jälkeen. Mainitut aineet voidaan siten antaa mieluimmin myös yhdistettyinä antibiootteihin, kemotera-peuttisiin aineisiin tai muihin lääkeaineisiin immunologisten vahinkojen vastustamiseksi. Esitetyt aineet soveltuvat myös ihmisten ja eläinten infektiosairauksien yleiseen profylaksiaan (ennakkoehkäisyyn).

Erityisesti keksintö koskee analogiamenetelmää uusien, esimerkeissä kuvattujen muramyylipeptidien ja niiden suolojen valmistamiseksi.

Uudet, kaavan (I) mukaiset yhdisteet ja niiden suolat voidaan saada sinänsä tunnettujen menetelmien mukaisesti.

Niinpä niitä voidaan saada, kun a) kaavan (VII) mukainen yhdiste

II

9 75578 CH2ORn Λ——°v Υ ^vORio (VII) —/, / ΗΝ - C - Ri

R3 - CH

NSS^cooh jossa kaavassa Ri ja R3 tarkoittavat samaa kuin edellä ja Rg, Rig ja Rn tarkoittavat vetyä tai helposti lohkaistavaa suojaryhmää, tai sen aktivoitu happojohdannainen kondensoi-daan kaavan (VIII) mukaisen yhdisteen kanssa R5 conh2 HN - CH - CON - CH - CH2CH2 - COA2 (VIII)

H H

jossa kaavassa R5 ja A2 tarkoittavat samaa kuin edellä, tai sen aktivoidun johdannaisen kanssa, ja lohkaistaan esiintyvät suojaryhmät.

Kondensaatio tapahtuu tällöin esim. siten, että kaavan (VII) mukainen happo, aktivoidussa muodossa, saatetaan reagoimaan kaavan (VIII) mukaisen aminoyhdisteen kanssa, tai happo (VII) saatetaan reagoimaan kaavan (VIII) mukaisen yhdisteen kanssa, jonka aminoryhmä on aktivoidussa muodossa. Aktivoitu karboksyyliryhmä voi olla esimerkiksi happoanhyd-ridi, mieluimmin sekahappoanhydridi, kuten esim. hiilihappo-alempialkyyliesterillä, kuten hiilihappoetyyli- tai isobutyy-liesterillä aktivoitu, happoatsidi, happoamidi, kuten imi-datsolidi, tai se voi olla aktivoitu esteri. Aktivoituina estereinä mainitakoon erityisesti: syaanimetyyliesteri, kar-boksimetyyliesteri, p-nitrofenyylitioesteri, p-nitrofenyyli-esteri, 2,4,5-trikloorifenyyliesteri, pentakloorifenyylies-teri, N-hydroksi-sukkinimidiesteri, N-hydroksi-ftaali-imidi-esteri, 8-hydroksi-kinoliiniesteri, 2-hydroksi-l,2-dihydro- 10 755 78 1- karboetoksi-kinoliiniesteri, N-hyroksipiperidiiniesteri tai enoliesterit, jotka muodostetaan N-etyyli-5-fenyyli-iso-oksatsoloium-3'-sulfonaatin kanssa. Aktivoituja estereitä voidaan myös saada mahdollisesti karbodi-imidin kanssa lisättäessä samalla N-hydroksisukkinimidiä tai substituoimatonta tai esim. halogeenilla, metyylillä tai nietoksilla substituoi-tua 1-hydroksibentsotriatsolia tai 3-hydroksi-4-okso-3,4-di-hydro-bentso[d]-l,2,3-triatsiinia.

Aminoryhmä on aktivoitu esimerkiksi reaktiolla fosfiitin kanssa.

Reaktiomenetelmistä aktivoitujen happojen kanssa mainittavia ovat erityisesti menetelmät N-etyyli-5-fenyyli-iso-oksatsoloium-3'-sulfonaatin kanssa (Woodward Reagens K) tai 2- etoksi-l,2-dihydro-l-krboetoksi-kinoliinin tai karbodi-imidin kanssa.

Helposti poislohkaistavissa olevia suojaryhmiä ovat sellaiset, jotka ovat tunnettuja peptidi- tai sokerikemiasta. Hydroksiryhmille on mainittava erityisesti asyylitähteet, esim. alempialkanoyyli-tähteet, kuten asetyyli, aroyylitäh-teet, kuten bentsoyyli, ja ennen kaikkea hiilihappojohdannaisista johdetut tähteet, kuten bentsyylioksikarbonyyli tai alempialkoksikarbonyyli tai alkyyli, erityisesti tert.-butyy-li, mahdollisesti nitrolla, alempialkoksilla tai halogeenilla substituoitu bentsyyli, mahdollisesti halogeenilla tai alempialkoksilla, kuten nietoksilla, substituoitu trifenyyli-metyyli tai tetrahydropyranyyli tai mahdollisesti substituoi-dut alkylideenitähteet, jotka sitovat happiatomit 4- ja 6-asemaan. Tällaisia alkylideenitähteitä ovat erityisesti alempialkylideeni-, ensisijassa metylideeni-, isopropylidee-ni- tai propylideenitähde tai myös mahdollisesti substituoitu, mieluimmin p-asemassa substituoitu bentsylideenitähde.

Nämä suojaryhmät voidaan lohkaista pois sinänsä tunnetulla tavalla. Niinpä ne voidaan poistaa happamella hydro-lyysillä, bentsyyli- tai bentsylideenitähteet voidaan poistaa myös hydrogenolyyttisesti, esim. vedyllä jalometalli-, kuten palladium- tai platinakatalysaattorin läsnäollessa.

Käytetyt lähtöaineet ovat tunnettuja tai niiden voidaan

II

11 75578 valmistaa sinänsä tunnetulla tavalla.

Toinen menetelmätapa näiden uusien yhdisteiden valmistamiseksi perustuu siihen, että b) kaavan (IX) mukainen yhdiste CH2ORii / \rx/OR10 (IX) R«°/l-r ° / HN - C - Rl

R3 - CH

\ f5

CON - CH - COOH H

jossa kaavassa Ri, R3 ja R5 tarkoittavat samaa kuin edellä, ja R9, Rio ja Rn tarkoittavat vetyä tai helposti lohkaistavaa suojaryhmää tai sen aktivoitu happojohdannainen konden-soidaan kaavan (X) mukaisen yhdisteen kanssa CONH2 HN - CH - CH2CH2 - COA2 (X)

H

jossa kaavassa A2 tarkoittaa samaa kuin edellä, ja lohkaistaan esiintyvät suojaryhmät.

Kondensaatio suoritetaan tällöin esim. siten, että kaavan (IX) mukainen happo, aktivoidussa muodossa, saatetaan reagoimaan kaavan (X) mukaisen aminoyhdisteen kanssa, tai että kaavan (IX) mukainen happo saatetaan reagoimaan kaavan (X) mukaisen yhdisteen kanssa, jonka aminoryhmä on aktivoidussa muodossa. Aktivoitu karboksyyliryhmä voi olla esimerkiksi happoanhydridi, mieluimmin sekahappoanhydridi, happo-amidi tai aktivoitu esteri. Tällaisina kysymykseen tulevat erityisesti edellä mainitut happoanhydridit, amidit tai esterit. Aminoryhmä on aktivoitu esimerkiksi reaktiolla fos- 12 7557 8 fiitin kanssa.

Myös helposti poislohkaistavissa olevat suojaryhmät vastaavat jo edellä mainittuja. Ne voidaan lohkaista pois sinänsä tunnetulla tavalla; happamella hydrolyysillä, bentsyyli-tai bentsylideenitähteet myös hydrogenolyyttisesti, esimerkiksi vedyllä jalometalli-, kuten palladium- tai platinaka-talysaattorin läsnäollessa.

Lähtöaineet voidaan saada sinänsä tunnetulla tavalla. Niinpä voidaan esim. vastaavat 3-asemassa substituoimattomat sokerit saattaa reagoimaan halogeeni-R3-asetamido-R5-etikka-hapon kanssa, tai kaavan (VII) mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan amino-Rs-etikkahapon kanssa, jonka karboksyyliryh-mä on suojattu edellä esitetyllä tavalla, ja suojaryhmät lohkaistaan pois.

c) Kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa T on NH, voidaan valmistaa siten, että kaavan (XI) mukainen yhdiste CH2ORn s V ORio (XI) 4>f-/1 / HN - C - Rl

R3 ” CH

\ Rs conh2 XCON - CH - CON - CH - CH2CH2 - COA2°

H H

jossa Ri, R3 ja R5 tarkoittavat samaa kuin edellä, Rg, Riq ja Rh tarkoittavat vetyä tai helposti lohkaistavaa suoja-

O

ryhmää ja COA2 tarkoittaa aktivoitua karboksyylihapporyhmää, kondensoidaan kaavan (XII) mukaisen yhdisteen kanssa 11 13 75578 o

II

H2N -Y-O-P-0- CH2 (XII)

OH Z

jossa kaavassa Y ja Z tarkoittavat samaa kuin edellä, ja lohkaistaan esiintyvät suojaryhmät.

Aktivoitu karboksyylihapporyhmä COA20 voi olla esimerkiksi happoanhydridi, esim. hiilihappoalempialkyyliesterillä aktivoitu, kuten hiilihappoetyyli tai isobutyyliesteri, hap-poatsidi, happoamidi, kuten imidatsolidi, iso-oksatsolidi tai aktivoitu esteri. Aktivoituina esterinä mainittakoon erityisesti: syaanimetyyliesteri, karboksimetyyliesteri, p-nit-rofenyylitioesteri, metoksietyylitioesteri, asetyyliamino-etyylitioesterit, p-nitrofenyyliesteri, 2,4,5-trikloorifenyy-liesteri, N-hydroksi-sukkinimidiesteri, N-hydroksi-ftaali-imidiesteri, 8-hydroksi-kinoliiniesteri, N-hydroksi-piperi-diiniesteri. Aktivoidut esterit voidaan myös saada mahdollisesti karbodi-imidillä lisäämällä samanaikaisesti N-hydrok-sisukkinimidiä tai substituoimatonta tai esim. halogeenilla, metyylillä tai metoksilla substituoitua 1-hydroksibentsotri-atsolia tai 3-hydroksi-4-okso-3,4-dihydro-bentso[d]-l,2,3-triatsiinia.

Aktiivisina esterinä käytetään mieluimmin sellaisia, jotka saadaan N-hydroksisukkinimidin tai sen C-substituutiotuot-teiden, kuten N-hydroksi-metyyli- tai -dimetyylisukkinimidin kanssa, tai estereitä, jotka saadaan reaktiolla karbodi-imi-dien, kuten itse karbodi-imidin tai l-etyyli-3-(3-dimetyyli-aminopropyyli)-karbodi-imidin kanssa.

Tällöin käytetyt lähtöaineet ovat tunnettuja tai niitä voidaan valmistaa sinänsä tunnetulla tavalla.

d) Kaavan (I) mukaisia yhdisteitä, joissa T on happi, voidaan valmistaa siten, että kaavan (Xla) mukainen yhdiste 14 755 7 8 ch2orh / yv OR10 (Xla) R*°/t-t i? / HN - C - Ri

R3 - CH

\ R5 conh2

CON - CH - CON - CH - CH2CH2 - COOH

i i, jossa kaavassa R3, R3 ja R5 tarkoittavat samaa kuin edellä, R9, r10 ia R11 tarkoittavat vetyä tai helposti lohkaistavaa suojaryhmää, esteröidään kaavan (Xlla) mukaisen yhdisteen kanssa i? HO - Y - 0 - P - 0 - CH2 (XIIa)

OH Z

jossa kaavassa Y ja Z tarkoittavat samaa kuin edellä, jolloin happo (Xla) tai alkoholi (Xlla) ovat reaktiokykyisessä muodossa, ja lohkaistaan mahdollisesti esiintyvät suojaryhmät.

Tämä reaktio voidaan suorittaa siten, että vapaa happo esteröidään alkoholilla vettä poislohkaisevan aineen, kuten karbodi-imidin, esim. disykloheksyylikarbodi-imidin ja amiinin, kuten pyridiinin tai dimetyyliaminopyridiinin, trial-kyyliamiinin, esim. trimetyyliamiinin läsnäollessa. Karbok-syylihappo voidaan myöskin saattaa reagoimaan esim. suolan, kuten natrium- tai kaliumsuolan muodossa alkoholin reaktio-kykyisen esterin, esim. vahvan epäorgaanisen tai orgaanisen hapon, kuten halogeenivetyhapon, esim. kloori-, bromi tai jodivetyhapon tai orgaanisen sulfonihapon, kuten p-tolueeni-sulfonihapon tai metaani- tai etaanisulfonihapon kanssa saadun esterin kanssa.

Edelleen on myös mahdollista saattaa alkoholi reagoimaan mahdollisesti suolana, esim. natrium- tai kaliumsuolana, ak- n 15 755 78 tivoidun karbonihapon kanssa. Aktivoituina karbonihappoina mainittavia ovat erityisesti anhydridit, ensi sijassa seka-happoanhydridit, kuten happoatsidi tai halogenidi tai aktivoitu esteri, kuten syaanimetyyliesteri, karboksimetyylies-teri, p-nitrofenyylitioesteri, p-nitrofenyyliesteri, 2,4,5-trikloorifenyyliesteri, pentakloorifenyyliesteri, N-hydrok-si-sukkinimidiesteri, N-hydroksi-ftaali-imidiesteri, 8-hyd-roksi-kinoliiniesteri, 2-hydroksi-l,2-dihydro-l-karboetoksi-kinoliiniesteri, N-hydroksi-piperidiiniesterit, tai enoli-esterit, jotka saadaan N-etyyli-5-fenyyli-iso-oksatsolium-3'-sulfonaatin kanssa. Aktivoidut esterit voidaan myös saada mahdollisesti karbodi-imidillä lisäämällä samanaikaisesti N-hydroksisukkinimidiä tai substituoimatonta tai esim. halogeenilla, metyylillä tai nietoksilla substituoitua 1-hydrok-sibentsotriatsolia, 3-hydroksi-4-okso-3,4-dihydro-bentso[d]-1,2,3-triatsiinia.

Helposti poislohkaistavissa olevat suojaryhmät ovat sellaisia, jotka ovat tunnettuja peptidi- tai sokerikemiasta. Hydroksiryhmille on mainittava erityisesti asyylitähtet, esim. alempialkanoyylitähteet, kuten asetyyli, aroyylitähteet, kuten bentsoyyli, ja ennen kaikkea hiilihapoista johdettu tähde, kuten bentsyylioksikarbonyyli tai alempialkoksikarbonyy-li, tai alkyyli, erityiseti tert.-butyyli, mahdollisesti nitrolla, alempialkoksi11a tai halogeenilla substituoitu bent-syyli, mahdollisesti halogeenilla tai alempialkoksilla, kuten nietoksilla substituoitu trifenyylimetyyli tai tetrahyd-ropyranyyli tai mahdollisesti substituoidut alkylideenitäh-teet, jotka sitovat happiatomit 4- ja 6-asemaan. Tällaisia alkylideenitähteitä ovat erityiseti alempialkylideeni-, ensi sijassa etylideeni-, isopropylideeni- tai propylideenitähde tai myös mahdollisesti substituoitu, mieluimmin p-asemassa substituoitu bentsylideenitähde.

Nämä suojaryhmät voidaan sinänsä tunnetulla tavalla lohkaista pois. Niinpä ne voidaan lohkaista pois happamella hyd-rolyysillä, bentsyyli- tai bentsylideenitähde myös hydroge-nolyyttisesti, esim. vedyllä jalometalli-, kuten palladium-tai platinakatalysaattorin läsnäollessa.

ie 755 7 8 e) Kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa Y tarkoittaa tähdettä -Y1-CONH-Y2-, voidaan valmistaa siten, että kaavan XIV mukainen yhdiste

CHoOH

J——% r \λ/οη (xiv) H0/l t i? / HN - C - R]_

R3 - CH

\ Rs CONH2

'CON - CH - CON - CH - CH2CH2 - CO-T-Yi-COOH i H

jossa kaavassa R3, R5, T ja Y^ tarkoittavat samaa kuin edellä, tai sen aktivoitu karboksyylihappojohdannainen kon-densoidaan kaavan XVI mukaisen yhdisteen kanssa 0 H2n -Y2-0-Ip-0- CH2 (XVI) OH ί jossa kaavassa Υ2 ja Z tarkoittavat samaa kuin edellä, jolloin näissä esiintyvät hydroksiryhmät on mahdollisesti suojattu helposti lohkaistavilla suojaryhmillä, tai sen aktivoidun johdannaisen kanssa, ja lohkaistaan esiintyvät suoja-ryhmät .

Helposti poislohkaistavissa olevia suojaryhmiä ovat sellaiset, jotka ovat tunnettuja peptidi- tai sokerikemiasta. Hydroksiryhmille on mainittava erityisesti asyylitähteet, esim. alempialkanoyylitähteet, kuten asetyyli, aroyylitähteet, kuten bentsoyyli, ja ennen kaikkea hiilihaposta johdettu tähde, kuten bentsyylioksikarbonyyli tai alempialkok-sikarbonyyli tai alkyyli, erityisesti tert.-butyyli, mahdollisesti nitrolla, alempialkoksilla tai halogeenilla substi-tuoitu bentsyyli tai tetrahydropyranyyli tai mahdollisesti 11 17 75578 substituoidut alkylideenitähteet, jotka sitovat happoatornit 4-asemaan ja 6-asemaan. Tällaisia alkylideenitähteitä ovat erityisesti alempialkylideeni-, ensisijassa etylideeni-, iso-propylideni- tai propylideenitähde tai myös mahdollisesti substituoitu, mieluimmin p-asemassa substituoitu bentsyli-deenitähde.

Nämä suojaryhmät voidaan lohkaista pois sinänsä tunnetulla tavalla. Niinpä ne voidaan poistaa happamella hydro-lyysillä, bentsyyli- tai bentsylideenitähtet myös hydrogeno-lyyttiseti, esim. vedyllä jalometalli-, kuten palladium- tai platinakatalysaattorin läsnäollessa.

Käytetyt lähtöaineet ovat tunnettuja, tai niitä voidaan valmistaa sinänsä tunnetulla tavalla.

Kondensaatio suoritetaan tällöin esim. siten, että kaavan (XIV) mukainen yhdiste aktivoidun karboksyylihapon muodossa saatetaan reagoimaan kaavan (XVI) mukasen aminoyhdis-teen kanssa, tai kaavan (XIV) mukainen happo saatetaan reagoimaan kaavan (XVI) mukaisen yhdisteen kanssa, jonka amino-ryhmä on aktivoidussa muodossa. Aktivoitu karboksyyliryhmä voi olla esimerkiksi happoanhydridi, mieluimmin sekahappoan-hydridi, kuten esim. hiilihappoalempialkyyliesterin kanssa saatu, kuten hiilihappoetyyli, tai isobutyyliesteri, happo-atsidi, happoamidi, kuten imidatsolidi, iso-oksatsolidi tai aktivoitu esteri. Aktivoituna esterinä voidaan mainita erityisesti: syaanimetyyliesteri, karboksimetyyliesteri, p-nit-rofenyylitioesteri, p-nitrofenyyliesteri, 2,4,5-trikloorife-nyyliesteri, pentakloorifenyyliesteri, N-hydroksi-sukkinimi-diesteri, N-hydroksi-ftaali-imidiesteri, 8-hydroksi-kinolii-niesteri, 2-hydroksi-l,2-dihydro-l-karboetoksi-kinoliinies-teri, N-hydroksi-piperidiiniesterit tai enoliesterit, jotka saadaan N-etyyli-5-fenyyli-iso-oksatsolium-3'-sulfonaatin kanssa. Aktivoituja estereitä voidaan myös saada mahdollisesti reaktiolla karbodi-imidin kanssa lisäämällä samanaikaisesti N-hydroksisukkinimidiä tai substituoimatonta tai esim. halogeenilla, metyylillä tai nietoksilla substituoitua 1-hydroksibentsotriatsolia, 3-hydroksi-4-okso-3,4-dihydro-bentso[d]-l,2,3-triatsiinia.

18 75578

Aminoryhmä on aktivoitu esimerkiksi reaktiolla fosfiitin kanssa.

Aktivoitujen happojen reaktiomenetelmistä mainittavia ovat erityisesti ne, jotka suoritetaan käyttäen 5-etyyli-5-fenyyli-iso-oksatsolium-31-sulfonaattia (Woodward Reagens K) tai 2-etoksi-l,2-dihydro-l-karboetoksi-kinoliinia tai karbo-di-imidiä.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan valmistaa myös siten, että f) kaavan XX mukainen yhdiste CH2ORn / \a/OR10 (XX) R9°/1-τ f / HN - C - Rl

R3 - CH

\ R5 <j:ONH2

'CON - CH - CON - CH - CH2CH2 - CO - T - Y - OH H H

jossa kaavassa Ri, R3, R5, T ja Y tarkoittavat samaa kuin edellä, Rg, Riq ja Rn tarkoittavat helposti lohkaistavia suojaryhmiä, saatetaan reagoimaan tähteen ? - P - 0 - CH2 (XXI) l ·

OH Z

jossa Z tarkoittaa samaa kuin edellä, luovuttavan yhdisteen kanssa, ja lohkaistaan esiintyvät suojaryhmät.

Kaavan (XXI) mukaisen tähteen luovuttavina yhdisteinä on mainittava erityisesti yhdisteet, joiden kaava on 11 1? 19 7 5 5 7 8 M7 - P - O - <pH2 (XXII) om6 z jossa Z tarkoittaa samaa kuin edellä, Mg on helposti pois-lohkaistavissa oleva suojaryhmä ja M7 on mahdollisesti reak-tiokykyinen, muunnettu hydroksi.

Helposti poislohkaistavissa oleva suojaryhmä Mg on erityisesti alempialkyyli, kuten metyyli tai etyyli, alempial-kenyyli, kuten etenyyli tai 1-metyyli, -propenyyli tai bent-syyli.

Mahdollisesti reaktiokykyinen, muunnettu hydroksi M7 on erityisesti vapaa hydroksiryhmä, vahvalla epäorgaanisella tai orgaanisella hapolla esteröity hydroksi, kuten halogee-nivety-, alempialkaanikarbonihapolla tai aryylillä tai alky-laanisulfonihapolla, esim. p-tolueenisulfonihapolla, metaani- tai etaanisulfonihapolla esteröity hydroksiryhmä. Se voi myös olla fenoksi tai alempialkoksiryhmä.

Tämä reaktio suoritetaan mieluimmin happoasitovan aineen, kuten pyridiinin, trialempialkyyliamiini, esim. trietyyli-amiinin tai trimetyyliamiinin, imidatsolin tai epäorgaanisen emäksen, kuten natrium- tai kaliumhydroksidin tai natrium-tai kaliumalkoholaatin läsnäollessa, jolloin liuottimena käytetään aproottista liuotinta, kuten dimetyylisulfoksidia tai asetonitriiliä.

Suojaryhmän Mg poislohkaiseminen tapahtuu enimmäkseen yhdessä muiden suojaryhmien poislohkaisun kanssa. Nämä voidaan poistaa sinänsä tunnetulla tavalla, esim. hydrogenolyyt-tisesti, esim. vedyllä jalometalli-, kuten palladium- tai platinakatalysaattorin läsnäollessa tai happamella hydrolyy-sillä.

Lähtöaineet ovat tunnettuja niitä voidaan valmistaa sinänsä tunnetuilla tavoilla esim. jollain edellä mainitulla, vastaavasti muunnetulla menetelmällä.

g) Kaavan I mukaisia yhditeitä voidaan valmistaa myös siten, että kaavan XXVI mukainen yhdiste 20 75578 CH2ORh \o / (XXVI) R9o/j-J 0 / HN - C - Rl

R3 - CH

\ R5 conh2 O

' CON - CH - CON - CH - CH2CH2-Co-T-Y-0-!|>-0-CH2 H H OH Z' jossa kaavassa R^, R3, R5, T ja Y tarkoittavat samaa kuin edellä, R9, R^q 3a R11 tarkoittavat helposti lohkaistavia suojaryhmiä, ja Z' tarkoittaa 1,2-dihydroksietyyliryhmää, jossa yksi hydroksiryhmä on esteröity mahdollisesti yhden kaksoissidoksen sisältävällä alifaattisella karboksyyliha-polla, jossa on 12-22 hiiliatomia, 1,2-dihydroksietyyliryhmä tai 2-hydroksietyyliryhmä, esteröidään mahdollisesti yhden kaksoissidoksen sisältävällä alifaattisella karboksyyliha-polla, jossa on 12-22 hiiliatomia, ja lohkaistaan suojaryh-mät.

Esteröinti suoritetaan sinänsä tunnetulla tavalla. Niinpä mieluimmin käytetään alifaattista karboksyylihappoa reak-tiokykyisen johdannaisen, kuten anhydridin, mieluimmin seka-anhydridin muodossa, esim. halogeenivetyhapon kanssa.

Suojaryhmien, jotka vastaavat edellä mainittuja, pois-lohkaiseminen voidaan suorittaa tavalliseen tapaan, erityisesti hydrogenolyyttisesti tai happamella hydrolyysillä.

Lähtöaineet voidaan valmistaa esim. jonkin edellä mainitun, vastaavasti muunnetun menetelmän mukaisesti.

h) Edelleen kaavan I mukaisessa yhdisteessä, jossa yksi tai useampia funktionaalisia ryhmiä on suojattu suojaryhmil-lä, lohkaistaan nämä suojaryhmät.

Mahdolliset suojaryhmät ja niiden lohkaisu on kuvattu edellä. Lähtöaineet saadaan esim. siten, että jokin yllä kuvatuista menetelmistä keskeytetään ennen ennen suojaryhmien täydellistä lohkaisemista.

Il 21 755 7 8

Haluttaessa kaavan I mukainen yhdiste, joka on saatu jollain yllä kuvatuista menetelmistä, muutetaan suolakseen.

Edellä esitetyt menetelmät suoritetaan sinänsä tunnettujen menetelmien mukaisesti, ilman laimennusaineita tai liuottimia, tai, mieluimmin laimennusaineiden tai liuottimien läsnäollessa, tarvittaessa, jäähdyttäen tai lämmittäen, korotetussa paineessa ja/tai inerttikaasu-, kuten typpiatmosfäärissä .

Tällöin huomioonottaen kaikki molekyylissä esiintyvät substituentit, tarvittaessa, erityisesti helposti hydrolysoitavien O-asyylitähteiden läsnäollessa, valitaan erityisen tarkat reaktio-olosuhteet, kuten lyhyet reaktioajat, käytetään heikkoja happamia tai emäksisiä aineita alhaisemmissa konsentraatioissa, stökiömetrisiä paljoussuhteita, valitaan sopivat katalysaattorit, liuottimet, lämpötila- ja/tai paine-olosuhteet.

Keksintö koskee myös menetelmän niitä suoritusmuotoja, joissa lähtöainetta käytetään suolan muodossa. Tällöin lähdetään mieluimmin sellaisista lähtöaineista, joista saadaan menetelmän mukaisesti edellä erityisen arvokkaina pidettyjä yhdisteitä.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää esim. farmaseuttisten valmisteiden muodossa, jotka sisältävät kaavan (I) mukaisia yhdisteitä. Tällaisia farmaseuttisia valmisteita ovat sellaiset, jotka on tarkoitettu enteraaliseen, kuten oraaliseen, nasaaliseen tai rektaaliseen, sekä parenteraali-seen annostukseen lämminverisille, ja jotka sisältävät pelkkää farmakologista aktiiviainetta tai aktiiviainetta yhdessä jonkin farmaseuttisesti käyttökelpoisen kantaja-aineen kanssa. Aktiiviaineen annostus riippuu lämmiverisen lajista, iästä ja yksilöllisestä olotilasta, sekä lääkkeenantotavasta.

Farmaseuttiset valmisteet sisältävät aktiiviainetta noin 10 - noin 95 %, mieluimmin noin 20 - noin 90 %, ja ne voivat olla esim. yksikköannosmuodoissa, kuten rakeina, tabletteina, kapseleina, suppositoreina tai ampulleina.

Kyseiset farmaseuttiset valmisteet valmistetaan sinänsä tunnetulla tavalla, esim. tavallisten sekoitus-, granuloi-mis-, rakeistamis-, liuottamis- tai lyofilisoimismenetelmien mukaisesti. Edellä mainituista annostamismuodoista 22 7 5 5 7 8 voivat myös farmaseuttiset valmisteet, erityisesti oraaliseen käyttöön tarkoitetut saada siten, että aktiiviaine yhdistetään kiinteisiin kantaja-aineisiin, saatu seos mahdollisesti granuloidaan ja seos tai granulaatti, haluttaessa tai tarvittaessa, sopivien apuaineiden lisäyksen jälkeen, valmistetaan tableteiksi tai raeytimiksi. Tällöin nämä voidaan myös sulkea muovikantajiin, jotka voivat antaa aktiiviainetta annoksittain tai ne voivat hajoittaa aktiiviaineen.

Sopivia kantaja-aineita ovat erityisesti täyteaineet, kuten sokerit, esim. laktoosi, sakkaroosi, manniitti tai sorbiitti, selluloosavalmisteet ja/tai kalsiumfosfaatit, esim. trikalsium-fosfaatti tai kalsiumvetyfosfaatti, edelleen sideaineet, kuten tärkkelysliisterit, joina käytetään esim. maissi-, vehnä-, riisi- tai perunatärkkelystä, liivate, tragantti, metyyliselluloo-sa, hydroksipropyyli-metyyliselluloosa, natriumkarboksimetyyli-selluloosa ja/tai polyvinyylipyrrolidoni ja/tai, haluttaessa, hajotusaineet, kuten edellä mainitut tärkkelykset, myös karbok-simetyylitärkkelys, ristiinkytketty polyvinyylipyrrolidoni, agar, algiinihappo tai sen suola, kuten natriumalginaatti, apuaineita ovat ensi sijassa juoksevuutta säätelevät aineet ja voiteluaineet, esim. piihappo, talkki, steariinihappo tai sen suolat, kuten magnesium- tai kalsiumstearaatti ja/tai polyetyleenigly-koli. Raeytimet varustetaan sopivilla, mahdollisesti mahanestettä kestävillä päällysteillä, jolloin käytetään mm. konsentroituja sokeriliuoksia, jotka mahdollisesti sisältävät arabi-kumia, talkkia, polyvinyylipyrrolidonia, polyetyleeniglykolia ja/tai titaanidioksidia, lakkaliuoksia sopivissa orgaanisissa liuottimissa tai liuotinseoksissa, tai mahanestettä kestävien päällysten valmistamiseen käytetään sopivien selluloosvalmis-teiden, kuten asetyyliselluloosaftalaatin tai hydroksipropyyli-metyyliselluloosaftalaatin liuoksia. Tabletit tai raepäällys-teet voivat lisäksi sisältää väriaineita tai pigmenttejä, esim. erilaisten aktiiviaineannosten identifioimiseksi tai tunnistamiseksi .

Seuraavat esimerkit kuvaavat edellä esitettyä keksintöä. Lämpötilat on annettu Celsius-asteina.

il 23 75578

Keksinnön mukaisia, kaavan (I) mukaisia yhdisteitä ei voida kuvata sulamispisteellä eikä spektroskopiset arvotkaan, kuten NMR- ja IR-spektrit, ole sopivia virheettömään kuvaamiseen.

Rf-arvojen antaminen on myös epäsopiva yhdisteiden tarkempaan kuvaamiseen, lipidiosan dominoivan luonteen takia.

Koska kuitenkin lähtöaineen rakenne on täysin tunnettu (vrt. saksalainen julkaisuhakemus 26 55 500; kulloinkin käytetty fosfolipidikomponentti on saatavissa kaupallisesti) ja koska fosfolipidin ja muramyylipeptidin liittyminen on yksiselitteinen, on täten myös lopputuotteen rakenneosan sekvenssi ja sen rakenne yksiselitteisesti vahvistettu.

Kaavan (I) mukaisissa yhdisteissä voidaan happiatomista fos-foriatomiin sitoutunut protoni helposti lohkaista pois emäksillä.

Yleensä ovat kaavan (I) mukaiset yhdisteet vapaiden yhdisteiden ja niiden suolojen seoksen muodossa. Niinpä on seuraavissa esimerkeissä esitetyt, kaavan (I) mukaiset muramyylipeptidit noin 40-55-prosenttisesti suolana. Nämä suolat, esim. natriumsuo-lat, kuuluvat keksinnön mukaisesti saataviin lopputuotteisiin.

Edullisia ovat farmaseuttisesti käyttökelpoiset, myrkyttömät suolat, esim. tällaiset metalli- tai ammoniumsuolat. Esimerkki 1;

Liuokseen, jossa on 1,4 mmoolia 1,2-dipalmitoyyli-sn-gly-sero-3-fosforyyli-etanoliamiinia ja 2,5 mmoolia trietyyliamii-nia 25 ml:ssa kloroformi-metanoli-vesi-seosta, 65:25:4, lisätään tipoittain liuos, jossa on 2 mmoolia N-asetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutamiini-N-hydroksisukkinimidiesteriä 6,5 ml: ssa dimetyyliasetamidia. Hämmennetään 18 tuntia 20°:ssa, jonka jälkeen liuos haihdutetaan alennetussa paineessa noin 15 ml: aan; tällöin muodostuu emulsio. Tämä laimennetaan 200 ml:11a vettä ja syväjäädytyskuivataan. Jäännös suspendoidaan 30 ml: aan vettä ja dialysoidaan laajasti (ekstensiivisesti) vettä vastaan. Sisäinen dialysaatti, joka sisältää toivotun tuotteen, syväjäädytyskuivataan. N-asetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-iso-glutaminyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi puhdistetaan kromatograafisesti Sephadex LH-20 pylväässä. Eluointiseos: kloroformi-metanoli-etikkahappo-vesi, 24 7 5 5 7 8 25:15:4:2. Yhdisteellä on ohutkerroskromatografiässä piihappo-geelillä seuraavat Rf-arvot: 0,31 (kloroformi-metanoli-vesi 65:25:4) tai 0,64 (kloroformi-metanoli-etikkahappo-vesi 25:15: 4:2) .

Uusi yhdiste kuvataan analyyttisesti siten, että rakenneosat - N-asetyylimuramiinihappo, palmitiinihappo, fosfaatti, L-ala-niini ja D-glutamiinihappo - määritetään kvantitatiivisesti: - N-asetyylimuramiinihappo määritetään spektrofotometrisesti Morgan-Elson-reaktion avulla, muunnoksen mukaan, jonka ovat esittäneet J. M. Ghuysen et ai. (julkaisussa "Methods in Enzymology" 8, 629 (1966)).

Fosfaatti määritetään kvantitatiivisesti menetelmällä, jonka ovat esittäneet Lowry et ai. (j. Biol. Chem. 207, 1 (1954)).

Palmitiinihappo ja aminohapot määritetään kaasukromatografisesta kokonaishydrolysaatissa (6N HCl, 24 tuntia, 110°) tai kvantitatiivisesti aminohappoanalysaattorin avulla käyttäen pen-tadekaanihappoa tai norleusiinia sisäisenä standardina.

Saadut molaariset suhteet laskettuna fosfaatista ovat seuraavat: P0^,M : N-asetyylimuramiinihappo:L-alaniini;D-glutamiinihappo: palmitiinihappo = 1:0,92:0,91:0,95:2,18.

N-asetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutamiini-N-hydroksi-sukkinimidiesteri, jota käytetään lähtöaineena, voidaan valmistaa esim. seuraavasti: 2 mmoolia N-asetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutamiinia, 2,2 mmoolia N-hydroksisukkinimidiä ja 2,2 mmoolia disykloheksyy-likarbodi-imidiä liuotetaan 6,5 ml:aan dimetyyliasetamidia ja hämmennetään 18 tuntia 20°:ssa. Saostunut disykloheksyylikarba-midi erotetaan ja liuosta käytetään suoraan fosfolipidin kanssa tapahtuvaan kondensaatioon.

1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-fosforyyli-etanoliamiini, jota käytetään lähtöaineena, on kaupallisesti saatavissa oleva synteettinen valmiste.

Esimerkki 2:

Esimerkissä 1 esitetyllä tavalla saadaan N-asetyylidesmetyy-limuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamiinia, lähtemällä 1,2-dipalmi-toyyli-sn-glysero-3-fosforyyli-etanoliamiinista ja N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutamiini-N-hydroksisukkin- ti 25 75578 imidiesteristä, piihappogeeIillä seuraavat Rf-arvot: 0,29 (kloroformi-metanoli-vesi, 65:25:4) tai 0,65 (kloroformi-meta-noli-etikkahappo-vesi, 25:15:4:2).

Esimerkki 3:

Esimerkissä 1 esitetyllä tavalla saadaan N-asetyyli-muramyy-li-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-Y-oksi-metyylikarbonyyli-2-(1', 2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-31-fosforyyli)-etyyliamidia, lähtemällä 1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-fosforyyli-etanoliamiinis-ta ja N-asetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutamiini-y-karboksi-metyyliesterin N-hydroksisukkinimidiesteristä.

yhdisteellä on ohutkerroskromatografiässä piihappogeelillä seuraavat Rf-arvot: 0,29 (kloroformi-metanoli-vesi, 65:25:4) tai 0,68 (kloroformi-metanoli-etikkahappo-vesi, 25:15:4:2).

Esimerkki 4:

Esimerkissä 1 esitetyllä tavalla saadaan N-asetyylimuramyy-li-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3 ' -fosforyyli) -etyyliamidia, lähtemällä 1,2-di-palmitoyyli-sn-glysero-3-fosforyyli-etanoliamiinista ja N-ase-tyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alaniini-N-hyd-roksisukkinimidiesteristä. Rf-arvo ohutkerroskromatografiässä piihappogeelillä: 0,3 (systeemissä kloroformi-metanoli-vesi, 65:25:4).

Esimerkki 5:

Esimerkissä 1 esitetyllä tavalla saadaan N-asetyyli-desmetyy-limuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-2-(11,2'-O-di-heksade-kyyli-sn-glyseroli-3'-fosforyyli)-etyyliamidia, lähtemällä 1,2— O-heksadekylideeni-sn-glyseroli-3-fosforyyli-etanoiiamiinistä ja N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutamiini-N-hydroksisukkinimidiesteristä. Rf-arvo ohutkerroskromatografiässä piihappogeelillä: 0,43 (kloroformi-metanoli-vesi, 65:25:4).

1,2-0-diheksadekyyli-sn-glyseroli-3-fosforyyli-etanoliamiini, jota käytetään lähtöaineena, on kaupallisesti saatavissa oleva, synteettinen valmiste.

Esimerkki 6:

Esimerkissä 1 esitetyllä tavalla saadaan N-asetyyli-desme-tyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-2-(3'-palmitoyyliras -glysero-1 '-fosforyyli) -etyyliamidia, lähtemällä 3-palmito-yyli-ras-glysero-1-fosforyyli-etanoliamiinista ja N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutamiini-N-hydroksisukkin-imidiesteristä. Rf-arvo ohutkerroskromatografiässä piihappo- 26 75578 geelillä: 0,47 (kloroformi-metanoli-vesi, 65:25:4).

3-palmitoyyli-ras-glysero-1-fosforyyli-etanoliamiini, jota käytetään lähtöaineena, on kaupallisesti saatavissa oleva, synteettinen valmiste.

Esimerkki 7:

Esimerkissä 1 esitetyllä tavalla, saadaan N-asetyyli-des-metyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-2-(1'-palmitoyy-li-2'-oleoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidia, lähtemällä 1-palmitoyyli-2-oleoyyli-sn-glysero-3-fosforyyli-etanoli-amiinista ja N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-iso-glutamiini-N-hydroksisukkinimidiesteristä. Rf-arvo ohutkerros-kromatografiässä piihappogeelillä 0,33 (kloroformi-metanoli-vesi, 65:24:4).

1-palmitoyyli-2-oleoyyli-sn-glysero-3-fosforyyli-etanoliamiini, jota käytetään lähtöaineena, on kaupallisesti saatavissa oleva, synteettinen valmiste.

Esimerkki 8:

Esimerkissä 1 esitetyllä tavalla saadaan N-asetyyli-des-metyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-2-(11-palmitoyy-li-propaanidioli-3'-fosforyyli)-etyyliamidia, lähtemällä 1-pal-mitoyyli-propaanidioli-3-fosforyyli-etanoliamiinista ja N-ase-tyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutamiini-N-hydrok-sisukkinimidiesteristä. Rf-arvo ohutkerroskromatografiässä piihappogeelillä: 0,49 (kloroformi-metanoli-vesi, 65:25:4).

1-palmitoyyli-propaanidioli-3-fosforyyli-etanoliamiini, jota käytetään lähtöaineena, on kaupallisesti saatavissa oleva, synteettinen valmiste.

Esimerkki 9:

Edellä olevien esimerkkien mukaisesti saadaan N-asetyylimura-myyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-glysero-fosfolipidi-johdannaisia kondensoimalla N-asetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isogluta-miini seuraavien fosfolipidien kanssa: 1,2-0-heksadekylideeni-sn-glysero-3-fosforyyli-etanoliamiini, 1-palmitoyyli-2-oleoyyli-sn-glysero-3-fosforyyli-etanoliamiini, 3-palmitoyyli-ras-glysero-1-fosforyyli-etanoliamiini, 1-palmitoyyli-propaanidioli-3-fosforyyli-etanoliamiini.

Il 27 755 78

Esimerkki 10:

Edellä olevien esimerkkien mukaisesti saadaan N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-glyserofosfo-lipidi-johdannaisia kondensoimalla N-asetyylimuramyyli-L-alanyy-li-D-isoglutaminyyli-L-alaniini seuraavien fosfolipidien kanssa: 1.2- 0-heksadekylideeni-sn-glysero-3-fosforyyli-etanoliamiini, 1-palmitoyyli-2-oleoyyli-sn-glysero-3-fosforyyli-etanoliamiini, - Rf (loppu' 1-palmitoyyli-propaanidioli-3-fosforyyli-etanoliamiini.

Esimerkki 11;

Edellä olevien esimerkkien mukaisesti saadaan N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-gly-serofosfolipidi-johdannaisia kondensoimalla N-asetyylidesmetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alaniini seuraavien fosfolipidien kanssa: 1.2- dipalmitoyyli-sn-glysero-3-fosforyyli-etanoliamihi, R* (lopputuote) = 0,39 (kloroformi/metanoli/vesi = 65:25:4), £ 1.2- 0-heksadekylideeni-sn-glysero-3-fosforyyli-etanoliamiini, 1-palmitoyyli-2-oleoyyli-sn-glysero-3-fosforyyli-etanoliamiini, j-ni' Rf ,loppu' 1-palmitoyyli-propaanidioli-3-fosforyyli-etanoliamiini.

Lähtöaineet voidaan saada seuraavasti: A) Liuokseen, jossa on 6 g (10 mM) a-bentsyyli-N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutamiinia ja 1,75 ml (11 mM) bromi-etikkahappobentsyyliesteriä 100 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään tipoittain 1 1/4 tunnin kuluessa, samalla kosteudelta suojaten ja hyvin hämmentäen, 1,87 ml (11 mM) N,N-di-isopropyyli-etyyliamiinia, liuotettuna 50 ml:aan dimetyyliformamidia. Hämmennetään yön yli huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen reaktio-seoksesta poistetaan dimetyvliformamidi suurtyhjössä ja jäännökseen lisätään 100 ml vettä. Saostunut öljy kiinteytyy nopeasti ja kiteytyy. Suspensiota hämmennetään jäähauteessa, jonka jälkeen imusuodatetaan, saadut kiteet pestään pienellä määrällä vettä ja kuivataan fosforipentoksidin päällä.

Kiteet suspendoidaan uudelleen petrolieetteriin, jonka jälkeen ne suodatetaan ja kuivataan (50°), jäljelle jää 6,2 g (85% teor.) värittömiä kiteitä, sul.p. 194°; 195-198°, (a) ^+1° (C = 1,3; metanoli).

28 7 5 5 7 8 B) 6/5 g:aa (8,85 mM) α-bentsyyli-N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutamiini-γ-bentsyylioksikarbonyylimetyyli-esteriä käsitellään vedyllä 40 tunnin ajan (40°) 200 ml:ssa metanoli-vesi-seosta (1:1) 0,5 g:n 10%:sta Pd-hiili-katalysaat-toria läsnäollessa.

Reaktioseoksesta poistetaan katalysaattori tavalliseen tapaan ja suodos haihdutetaan kuiviin.

Saostunut öljy liuotetaan 75 ml:aan sek.-butanolilla kyllästettyä vettä, uutetaan 6 kertaa, joka kerta 50 ml:11a vedellä kyllästettyä sek.-butanolia ja kerran etikkahappoetyylies-terillä. Orgaaniset faasit uutetaan uudestaan vedellä (katso edellä) ja selkeät, vesipitoiset faasit, sen jälkeen kun ne on käsitelty hiilellä (Darco G 60) haihdutetaan kuiviin. Jäännökseen lisätään kaksi kertaa vettä, haihdutetaan ja lopuksi lyo-filisoidaan. Saadaan 4,0 g (82% teor.) valkeata lyofilisaattia (a)p^ = +34 + 1° (C=0,8; vesi).

C) 6,1 g a-bentsyyli-N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutamiinia ja 3,5 g L-alaniinibentsyyliesteri-hydrokloridia liuotetaan 30 ml:aan dimetyyliformamidia, liuos jäähdytetään 0°:een ja siihen lisätään peräkkäin 1,4 ml trietyyliamiinia, 1,1 g N-hydroksisukkinimidiä ja lopuksi 2,3 g disykloheksyyli-karbodi-imidiä.

Hämmennetään 48 tuntia huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen suspensio suodatetaan, sakka pestään pienellä määrällä dimetyyliformamidia ja suodos haihdutetaan suurtyhjössä kuiviin. Jäännös suspendoidaan 0°:ssa 100 ml:aan vettä, sakka suodatetaan ja kuivumisen jälkeen kiteytetään uudelleen metanoli/vedestä.

O Λ

Saadaan 5,5 g (74% teor.) (a)^ +70 + 1° (C = 0,5: metanoli) .

D) 3,4 g a-bentsyyli-N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alaniinibentsyyliesteriä, joka on liuotettu 100:aan metanoli/vettä, 2:1, käsitellään vedyllä 40 tunnin ajan 10%:n Pd-hiili-katalysaattorin läsnäollessa. Katalysaattori imusuodatetaan, suodos haihdutetaan melkein kuiviin ja jäännös liuotetaan 40 ml:aan sek.-butanolilla kyllästettyä vettä, jonka jälkeen uutetaan 3 kertaa, joka kerta 40 ml:11a vedellä kyllästettyä sek.-butanolia. Orgaaniset faasit uutetaan uudestaan vedellä (3x40 ml, katso edellä), jonka jälkeen yhdistetyt vesi-uutteet haihdutetaan ja lyofilisoidaan. Saadaan 2,2 g (80% teor.)

(I

29 7 5 5 7 8 valkeata jauhetta;(α)^ +9 +1° (C=1,1; vesi).

Esimerkki 12:

Vastaavalla tavalla saadaan seuraavat yhdisteet. (Analyy-siarvojen tutkiminen kuten esimerkissä 1): -N-bentsoyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-2-(1',2'-di-palmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi -N-bentsoyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-2-(1'-pal-mitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi -N-bentsoyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-2-(1 ' -palmitoyyli-propaanidioli-3'-fosforyyli)-etyyliamidi -N-bentsoyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-2-(1' ,2'-diheksadekyyli-ras-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi -N-bentsoyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-2-(1 ' -heksadekyyli-ras-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi -N-bentsoyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-2-(1' ,2'-dipalmitoyyli-glysero-2'-fosforyyli)-etyyliamidi -N-bentsoyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli- 2-Π',2 '-dipalmitoyyli-sn-glysero-31-fosforyyli)-etyyliamidi,

Rf = 0,48 (kloroformi/metanoli/vesi = 65:25:4) -N-bentsoyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1'-palmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi -N-bentsoyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1'-palmitoyyli-propaanidioli-3'-fosforyyli)-etyyliamidi -N-bentsoyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyy-li-2-(1·,2'-diheksadekyyli-ras-glysero-3*-fosforyyli)-etyyliamidi -N-bentsoyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyy-li-2-(1'-heksadekyyli-ras-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi -N-bentsoyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyy- li-2-(1',3'-dipalmitoyyli-glysero-2'-fosforyyli)-etyyliamidi, 30 7 5 5 7 8 -N-bentsoyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutaminyyli-L-alanyyli-2- Π ' , 2 ' -dipalmitoyyli-sn-glysero-3 '-fosforyyli) -etyyliainidi, -N-bentsoyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutaminyyli-L-alanyyli-2-(1 '-palmitoyyli-sn-glysero-3 ' -fosforyyli) -etyyliamidi, -N-bentsoyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutaminyyli-L-alanyyli-2-(1'-palmitoyyli-propaanidioli-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-bentsoyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutaminyyli-L-alanyyli-2-(1',21-diheksadekyyli-ras-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-bentsoyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutaminyyli-L-alanyyli-2-(11-heksadekyyli-ras-glysero-31-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-bentsoyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutaminyyli-L-alanyyli-2—(11,3'-dipalmitoyyli-glysero-2'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-seryyli-D-isoglutaminyyli-2 —(11,2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-seryyli-D-isoglutaminyyli-2-(1'-palmitoyyli-sn-glysero-31-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-seryyli-D-isoglutaminyyli-2-(1'-palmitoyyli-propaanidioli-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-seryyli-D-isoglutaminyyli-2-(1',21-diheksadekyyli-ras-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-aestyyli-desmetyylimuramyyli-L-seryyli-D-isoglutaminyyli-2-(1'-heksadekyyli-ras-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-seryyli-D-isoglutaminyyli-2-(1',3'-dipalmitoyyli-glysero-2'-fosforyyli)-etyyliamidi, \\ -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-seryyli-D-isoglutaminyyli-L- alanyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyy liamidi, 31 75578 -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-seryyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1'-palmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-seryyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1'-palmitoyyli-propaanidioli-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-seryyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1',21-diheksadekyyli-ras-glysero-3'-fosforyyli)-etyy-liamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-seryyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1'-heksadekyyli-ras-glysero-3'-fosforyyli)-etyyli-amidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-seryyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(11,3'-dipalmitoyyli-glysero-2'-fosforyyli)-etyyli-amidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-seryyli-D-glutaminyyli-L-ala-nyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyli-amidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-seryyli-D-glutaminyyli-L-ala-nyyli-2-(1'-palmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-seryyli-D-glutaminyyli-L-ala-nyyli-2-(1'-palmitoyyli-propaanidioli-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-seryyli-D-glutaminyyli-L-ala-nyyli-2-(1',2'-diheksadekyyli-ras-glysero-3’-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-seryyli-D-glutaminyyli-L-ala-nyyli-2-{1'-heksadekyyli-ras-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-seryyli-D-glutaminyyli-L-alanyyli-2- (1',3'-dipalmitoyyli-glysero-2'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutami- nyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyli- amidi, 32 75578 -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutami-nyyli-2-(1'-palmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutami-nyyli-2-(1'-palmitoyyli-propaanidioli-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutami-nyyli-2-(1',2'-diheksadekyyli-ras-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi , -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutami-nyyli-2-(1'-heksadekyyli-ras-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutami-nyyli-2-(1',31-dipalmitoyyli-glysero-2'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutami-nyyli-L-alanyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli) -etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutami-nyyli-L-alanyyli-2-(1'-palmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutami-nyyli-L-alanyyli-2-(1'-palmitoyyli-propaanidioli-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutami-nyyli-L-alanyyli-2-(11,21-diheksadekyyli-ras-glysero-3'-fosforyyli) -etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutami-nyyli-L-alanyyli-2-(11-heksadekyyli-ras-glysero-31-fosforyyli)-etyyliamidi,

II

-N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutami- 33 75578 nyyli-L-alanyyli-2-(1',3'-dipalmitoyyli-glysero-2'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-glutaminyy-li-L-alanyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli) -etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-glutaminyy-li-L-alanyyli-2-(1'-palmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-glutaminyy-li-L-alanyyli-2-(1'-palmitoyyli-propaanidioli-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-glutaminyy-li-L-alanyyli-2-(11,2'-diheksadekyyli-ras-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-glutaminyy-li-L-alanyyli-2-(1'-heksadekyyli-ras-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi , -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-glutaminyy-li-L-alanyyli-2-(1',31-dipalmitoyyli-glysero-2'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-muramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutaminyyli-2-(1 ' , 2 '-dipalmitoyyli-sn-glysero-31-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-muramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutaminyyli-2-(1'-palmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-muramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutaminyyli-2-(11-palmitoyyli-propaanidioli-31-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-muramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutaminyyli-2-(1',2'-diheksadekyyli-ras-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-muramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutaminyyli-2- 34 7 5 5 7 8 (1 ' -heksadekyyli-ras-glysero-3 ' -fosforyyli) -etyyliaxnidi, -N-asetyyli-muramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutaminyyli-2-(11,3'-dipalmitoyyli-glysero-2'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-muramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, Rj = 0,32 (kloroformi/metanoli/vesi = 65:25:4) -N-asetyyli-muramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1'-palmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-muramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1'-palmitoyyli-propaanidioli-31-fosforyyli)-etyyli-amidi , -N-asetyyli-muramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(11,2'-diheksadekyyli-ras-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-muramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1'-heksadekyyli-ras-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-muramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1',3'-dipalmitoyyli-glysero-2'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-muramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-glutaminyyli-L-ala-nyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-muramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-glutaminyyli-L-ala-nyyli-2-(1'-palmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-murämyyli-L-a-aminobutyryyli-D-glutaminyyli-L-ala-nyyli-2-(1'-palmitoyyli-propaanidioli-3'-fosforyyli)-etyyliamidi,

II

-N-asetyyli-muramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-glutaminyyli-L-ala- nyyli-2-(1',2'-diheksadekyyli-ras-glysero-3'-fosforyyli)-etyy liamidi , 35 75578 -N-asetyyli-muramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-glutaminyyli-L-ala-nyyli-2-(1'-heksadekyyli-ras-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-muramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-glutaminyyli-L-ala-nyyli-2-(11,3'-dipalmitoyyli-glysero-2’-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutamyylta-glysiiniamidi-y-2-(1',2’-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-a-gly-siiniamidi-Y-L-alanyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-31 -fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutaminyyli-L-alanyyli-2-(11,2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi , -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutaminyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-31-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-seryyli-D-glutaminyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-glutami-nyyli-2-(1',21-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyylimuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-glutaminyyli-2-(1',21 -dipalmitoyyli-sn-glysero-31-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-muramyyli-L-valyyli-D-isoglutaminyyli-2-(1',21 — dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-muramyyli-L-valyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli- 2-(1’,2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3’-fosforyyli)-etyyliamidi, 36 7 5 5 7 8 -N-propionyyli-normuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-propionyyli-normuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-ala-nyyli-2-(1', 2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, Rf = 0,16 (kloroformi/metanoli/vesi = 65:25:4) -N-asetyyli-muramyyli-L-propyyli-D-isoglutaminyyli-2-(1' ,2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-muramyyli-L-propyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-bentsoyyli-normuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutaminyyli-2-(11,2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-bentsoyyli-normuramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi , -N-asetyyli-muramyyli-L-treonyyli-D-isoglutaminyyli-2-(1' ,2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-31-fosforyyli)-etyyliamidi, -N-asetyyli-muramyyli-L-treonyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi.

II

37 75578

Esimerkki 13:

Liuos, jossa on 1,5 mmoolia N-asetyylimuramyyli-L-ala-nyyli-D-isoglutaminyyli-L-alaniini-N-hydroksisukkin-imidies-teriä 5 mltssa dimetyyliasetamidia lisätään tipoittain liuokseen, jossa on 1 mmooli 2-(l',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)etyyliamidia ja 3,5 mmoolia N-etyylimorfolii-nia 25 ml:ssa kloroformi/metanoli/vettä = 65:25:4 huoneenlämmössä. Kun on sekoitettu 8 tuntia huoneenlämmössä (n. 22

O

C), reaktio lopetetaan. Reaktioseokseen lisätään 130 ml vettä.

Kun orgaaniset liuottimet on poistettu alennetussa paineessa, saatu vesipitoinen liuos, joka voi vielä sisältää hieman metanolia, suodatetaan teflon-Millipore-suodattimen läpi (5 /um). Suodos dialysoidaan sekoittaen Amicon ultrasuo-datuskennossa Amicon YM 10-membraanin läpi peräkkäin 400 ml: aa vettä, 200 ml:aa vesipitoista, 0,1-molaarista natriumfos-faattipuskuria/0,1-molaarista natriumkloridiliuosta, pH 7, ja 850 ml:aa vettä vastaan diasuodatusmenetelmällä. Sisädia-lysaatti suodatetaan Millipore-suodattimen läpi (0,45 m) ja kylmäkuivataan, jolloin saadaan N-asetyylimuramyyli-L-alanyy-li-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi, joka suurimmaksi osaksi tai kokonaan esiintyy natriumsuolansa muodossa, Rf = 0,30 (kloroformi/metanoli/ vesi * 65:25:4).

Esimerkki 14: 1 mmooliin la-bentsyyli-N-asetyyli-4,6-isopropylideeni-muramiinihappoa , 0,9 mmooliin L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidia seoksessa, jossa on 15 ml dimetyyliformamidia, 10 ml tetrahydrofuraania ja 2 ml pyridiiniä, lisätään 1,2 mmoolia disykloheksyylikarbodi-imidiä ja 1,3 mmoolia N-hyd-roksisukkinimidiä. 24 tunnin kuluttua huoneenlämmössä on reaktio kulunut loppuun. Siihen lisätään muutamia tippoja vettä, imetään erilleen muodostuneesta disykloheksyyliureasta ja haihdutetaan suodos tyhjössä kuiviin. Jäännös puhdistetaan kromatografisesti Merckin piihappogeelillä kloroformi/meta- 38 755 7 8 nolissa = 7:3. Halutun lopputuotteen sisältävät fraktiot reagoivat ohutkerroslevyllä (Kieselgel, Merck) positiivisesti fosfaattireagenssin kanssa (V.E. Vaskovsky ja E.Y. Kostets-ky, J. Lipid. Res. 9), 396 (1968) ja positiivisesti 2N rikkihapon kanssa kuumennettaessa (sokerin värjäytyminen ruskeaksi). Fraktiot haihdutetaan ja suojaryhmien poistamiseksi pidetään ensin seoksessa, jossa on 12 ml jääetikkaa ja 8 ml vettä, 1 tunti 50 °:ssa ja hydrataan sitten huoneenlämmössä 10-%:sella Pd/C:llä normaalipaineessa. 20 tunnin kuluttua on α-bentsyyliryhmä poistunut; katalysaattori suodatetaan pois ja suodos haihdutetaan tyhjössä siirapiksi. Näin saadaan N-asetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli- 2-(l',2'-dipalmitoyyli-sn- glysero-3'-fosforyyli)-etyyliami-din siirappimainen pyridiniumsuola, joka liuotetaan 150 ml: aan vettä.

Vesipitoinen liuos suodatetaan teflon-Millipore-suodat-timen läpi (huokoskoko 5 /um) . Suodos dialysoidaan Amicon ultrasuodatuskennossa sekoittaen Amicon YM 10-membraanin läpi diasuodatusmenetelmällä ensin vettä vastaan (400 ml), sen jälkeen 0,1 M natriumfosfaattipuskuria - 0,1 M NaCl:a, pH 7 vastaan (200 ml) ja lopuksi vettä vastaan (850 ml). Sisädia-lysaatti, joka sisältää N-asetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glyse-ro-3'-fosforyyli)-etyyli-amidin natriumsuolaa, suodatetaan Millipore-suodattimen läpi (huokoskoko 0,45 /um), ja kylmä-kuivataan, Rf = 0,30 (kloroformi/metanoli/vesi = 65:25:4). Esimerkki 15:

Liuokseen, jossa on 0,89 g (1 mmooli) D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidia ja 3,5 mmoolia N-etyylimorfoliinia 25 ml:ssa kloroformi/metanoli/vettä = 65:25:4 lisätään tipoittain liuos, jossa on 1,5 mmoolia N-asetyylimuramyyli-L-alaniini-N-hydroksisukkinimidiesteriä 5 ml:ssa dimetyyliasetamidia. 8 tunnin huoneenlämmössä sekoittamisen jälkeen reaktio on kulunut loppuun. Reaktioseokseen lisätään 130 ml vettä. Kloroformi ja osa metanolista tislataan pois alennetussa painees- li 39 75578 sa. Vesipitoinen liuos suodatetaan teflon-Millipore-suodat-timen läpi (huokoskoko 5 /um). Suodos dialysoidaan Amicon ultrasuodatuskennossa sekoittaen Amicon YM 10-membraanin läpi diasuodatusmenetelmällä ensin vettä vastaan (400 ml), sen jälkeen 0,1 M natriumfosfaattipuskuria - 0,1 M NaCl, pH 7 vastaan (200 ml) ja lopuksi vettä vastaan (850 ml). Sisädia-lysaatti suodatetaan Millipore-suodattimen läpi (huokoskoko 0,45 /um) ja kylmäkuivataan, jolloin saadaan N-asetyylimura-myyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(11,21-di-palmitoyyli-sn-glysero-31-fosforyyli)-etyyli-amidi-natrium-suolahydraatti, joka fysikaalisten vakioidensa perusteella on identtinen esimerkissä 13 saadun yhdisteen kanssa. Esimerkki 16: 1,245 g (2 mmoolia) N-asetyyli-la-O-bentsyyli-4,6-di-O-isopropylideenimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutamiinia, 1,500 g (2 mmoolia) glykolihappo-2-(l',2'-dipalmitoyyli-sn-glyse-ro-3'-fosforyyli)-etyyliamidia ja 0,279 ml (2 mmoolia) tri-etyyliamiinia liuotetaan seokseen, jossa on dimetyyliforma-midia ja kloroformia (3:1, v/v). Kun on lisätty 0,613 g (4 mmoolia) 1-hydroksibentstriatsolia ja 0,244 g (2 mmoolia) 4-dimetyyliaminopyridiiniä, lisätään 0,454 g (2,2 mmoolia) di-sykloheksyylikarbodi-imidiä ja sekoitetaan koko seosta 24 tuntia huoneenlämmössä. Saostunut disykloheksyyliurea suodatetaan pois ja suodos haihdutetaan kuiviin. Suojaryhmien poistamiseksi jäännös otetaan 40 ml:aan 80-%:sta etikkahap-poa, liuosta pidetään ensin yksi tunti 60 °:ssa, sitten hyd-rataan huoneenlämmössä Pd/C:n (10-%:nen) läsnäollessa normaalipaineessa. 24 tunnin kuluttua on α-bentsyyliryhmä poistunut. Katalysaattori suodatetaan pois ja suodos haihdutetaan. Muodostunut trietyyliammoniumsuola otetaan kahdesti tislattuun veteen ja sitten tavanomaisella tavalla muutetaan natriumsuolaksi dialysoimalla puskuroitua NaCl-liuosta vastaan pH:ssa 7 ja sitten vettä vastaan. Kun kylmäkuivataan Millipore-suodattimen läpi (0,45 /um) suodatettu kennon sisältö, jää jäljelle N-asetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglu-taminyyli-Y-oksimetyylikarbonyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn- 40 75578 glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi Na-suolan muodossa juoksevana jauheena. Yhdisteelle saadaan piihappogeelillä seu-raavat Rf-arvot:

Rf = 0,28 (kloroformi/metanoli/vesi * 65:25:4) ja

Rf = 0,68 (kloroformi/metanoli/etikkahappo/vesi = 25:15:4:2).

Esimerkki 17: 2,50 g (2,5 mmoolia) 1,4,6-O-tribentsyylimuramyyli-L-ala-nyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(sn-glysero-3'-fosforyy-li)-etyyliamidia liuotetaan 20 ml:aan liuosta, jossa on kuivaa pyridiiniä ja metyleenikloridia (4:1, v/v). Lisätään 0,061 g (0,5 mmoolia) 4-dimetyyliaminopyridiiniä (DMAP) ja lisätään tipoittain 1,82 ml (6 mmoolia) palmitiinihappoklo-ridia liuotettuna 5 ml:aan metyleenikloridia, samalla sulkien kosteuden pois, jolloin lämpötila pidetään 15 ja 20 °:n välillä. Kun reaktioseosta on seisotettu huoneenlämmössä 20 tuntia, siihen lisätään 2 ml metanolia ja koko seos haihdutetaan kuiviin puolen tunnin sekoittamisen jälkeen. Jäännös otetaan kloroformiin, pyridiini ja DMAP poistetaan uuttamalla kylmällä IN suolahapolla, osittain vielä esiintyvä palmi-tiinihappo poistetaan varovasti laimennetulla kaliumvetykar-bonaattiliuoksella. Kloroformiliuos haihdutetaan natriumsul-faatilla kuivaamisen jälkeen kuiviin, siihen lisätään 2 ti-lavuusosaa dimetyyliformamidia ja sitten bentsyylitähteet hydrataan pois 30 tunnin kuluessa Pd/C:n (10-%:nen) läsnäollessa. Katalysaattori suodatetaan pois ja suodos haihdutetaan kuiviin. Jäännös hierretään monta kertaa petroolieette-rin kanssa ja otetaan sitten kahdesti tislattuun veteen (1-2-%:nen liuos), dialysoidaan tavanomaiseen tapaan ensin puskuroitua keittosuolaliuosta vastaan (pH = 7), sitten vettä vastaan ja lyofilisoidaan, kun on suodatettu Millipore-suo-dattimen (0,45 /um) läpi. Saadaan N-asetyylimuramyyli-L-ala-nyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyy-li)-etyyliamidi-natriumsuola, joka on identtinen esimerkissä 13 saadun yhdisteen kanssa.

Il 41 75578

Esimerkki 18:

Seos, jossa on 0,693 g (1 mmooli) 1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-fosforihappo-dinatriumsuolaa, 1,332 g (2 iranoolia) N-asetyyli-la-O-bentsyyli-4,6-O-isopropylideeni-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alaniini-etanoli-amiinia ja 0,908 g (3 mmoolia) 2,4,6-tri-isopropyyli-bentseenisulfoklo-ridia, kaikki komponentit hyvin kuivattuja, liuotettuna 25 mitään kuivaa pyridiiniä, kuumennetaan nopeasti 35 - 40 °:seen, samalla sulkien pois kosteuden. Kun reaktioseosta on seisotettu 5 tuntia huoneenlämmössä, siihen lisätään 5 ml vettä ja puolen tunnin seisottamisen jälkeen haihdutetaan kuiviin. Kun loppuvaiheet on suoritettu ja suojaryhmät poistettu samoin kuin esimerkissä 16, saadaan N-asetyylimuramyy-li-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(1',2'-dipalmi-toyyli-sn-glysero-3·-fosforyyli)-etyyliamidi-natriumsuola, joka on identtinen esimerkissä 13 saadun yhdisteen kanssa. Esimerkki 19: 1 mmooli N-asetyyli-la-0-bentsyyli-4,6-di-0-isopropyli-deenimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(11,21-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi-natriumsuolaa otetaan 40 mitään 80-%:sta etikkahappoa, liuosta pidetään ensin yksi tunti 60 °tssa, sitten hydrataan huoneenlämmössä Pd/C:n (10-%:nen) läsnäollessa normaalipaineessa. 24 tunnin kuluttua on α-bentsyyliryhmä poistunut. Katalysaattori suodatetaan pois ja suodos haihdutetaan. Jäännös liuotetaan 150 mitään vettä ja suodatetaan Millipore-suodat-timen läpi (huokoskoko 5 /um). Suodos dialysoidaan Amicon ultrasuodatuskennossa sekoittaen Amicon YM 10-suodattimen läpi diasuodatusmenetelmällä ensin vettä vastaan (400 ml), sitten 0,1 M natriumfosfaattipuskuria - 0,1 M NaClta, pH 7, vastaan (200 ml) ja lopuksi vettä vastaan (850 ml). Sisädia-lysaatti, joka sisältää N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(11,2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3 ' -fosforyyli)-etyyli-amidi-natriumsuolaa, suodatetaan Millipore-suodattimella, huokoskoko 0,45 yam, ja kylmäkuiva-taan, Rf = 0,30 (kloroformi/metanoli/vesi = 65:25:4).

Claims (11)

42 755 78 Patenttivaatimukset;

1. Analogiamenetelmä farmakologisesti vaikuttavien lipo-fiilisten fosfatidyylimuramyylipeptidien valmistamiseksi, joiden kaava I on CH2OH ]/ OH (I) -)f—f, / HN - C - Rx R3 - CH \ *5 CONH2 'CON - CH - CON - CH - CH2CH2 - COÄ2 H H (D) (L) D) jossa Rx tarkoittaa alempialkyyliä tai fenyyliä, R3 tarkoittaa vetyä tai alempialkyyliä, R5 tarkoittaa alempialkyyliä ja Ά2 tarkoittaa tähdettä, jonka kaava on 0 -T-Y-O-P-O-CH2 (II) I 1 OH Z jossa T on NH tai 0, Y on alempialkyleeni tai kaavan -Υχ_ C0NH-Y2- mukainen tähde, jossa Υχ ja Y2 ovat kumpikin alempialkyleeni ja Z on 1,2-dihydroksietyyli- tai 2-hydroksietyy-liryhmä, jossa ainakin yksi hydroksiryhmistä on esteröity mahdollisesti yhden kaksoissidoksen sisältävällä alifaatti-sella karboksyylihapolla, jossa on 12-22 hiiliatomia, jolloin etuliite "alempi" tarkoittaa kulloinkin tähdettä, jossa on 1-4 hiiliatomia, ja niiden suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että sinänsä tunnetulla tavalla a) kaavan VII mukainen yhdiste II 75578 CH20RU / y^ORio (VII) R9<y| \ o / HN - C - Rl R3 - CH ^^COOH jossa kaavassa Rl ja R3 tarkoittavat samaa kuin edellä ja R9' R10 3a R11 tarkoittavat vetyä tai helposti lohkaistavaa suojaryhmää, tai sen aktivoitu happojohdannainen kondensoi-daan kaavan Vili mukaisen yhdisteen kanssa R5 conh2 HN - CH - CON - CH - CH2CH2 - COA2 (VIII) t 1 H H jossa kaavassa R5 ja A2 tarkoittavat samaa kuin edellä, tai sen aktivoidun johdannaisen kanssa, ja lohkaistaan esiintyvät suojaryhmät, tai b) kaavan IX mukainen yhdiste CH20Rn Jh—n / Vn/ORio (IX) R9o/l I 0 / HN - C - Rl r3 - CH \ ·5 XCON - CH - COOH H jossa kaavassa Ri, R3 ja R5 tarkoittavat samaa kuin edellä, ja R9, Rio ja Ru tarkoittavat vetyä tai helposti loh- 44 7 5 5 7 8 kaistavaa suojaryhmää tai sen aktivoitu happojohdannainen kondensoidaan kaavan X mukaisen yhdisteen kanssa CONH2 HN - CH - CH2CH2 - COA2 (X) H jossa kaavassa A2 tarkoittaa samaa kuin edellä, ja lohkaistaan esiintyvät suojaryhmät, tai c) kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa T on NH, kaavan XI mukainen yhdiste CH2ORn /H—°\ / VUORIO (XI) R9<yt 1 o / HN - C - Rl R3 - CH \ R5 CONH2 'CON - CH - CON - CH - CH2CH2 - COA2° 1 1 H H jossa Ri, R3 ja R5 tarkoittavat samaa kuin edellä, Rj, Riq ja Rh tarkoittavat vetyä tai helposti lohkaistavaa suoja- O ryhmää ja COA2 tarkoittaa aktivoitua karboksyylihapporyhmää, kondensoidaan kaavan XII mukaisen yhdisteen kanssa 0 H2N -Y-O-P-O- CH2 (XII) OH Z jossa kaavassa Y ja Z tarkoittavat samaa kuin edellä, ja lohkaistaan esiintyvät suojaryhmät, tai d) kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa T on happi, kaavan Xla mukainen yhdiste 11 45 7557 8 CH2ORn °N. ζ >OR10 (Xla) R9°/^ I 0 y HN - C - Ri R3 - CH \ R5 conh2 'CON - CH - CON - CH - CH2CH2 - COOH H H jossa kaavassa Ri» R3 ja R5 tarkoittavat samaa kuin edellä, R9, Rio 3a Rll tarkoittavat vetyä tai helposti lohkaistavaa suojaryhmää, esteröidään kaavan Xlla mukaisen yhdisteen kanssa 0 HO - Y - 0 - P - O - CH2 (XIIa) 1 · OH Z jossa kaavassa Y ja Z tarkoittavat samaa kuin edellä, jolloin happo Xla tai alkoholi Xlla ovat reaktiokykyisessä muodossa, ja lohkaistaan mahdollisesti esiintyvät suojaryhmät, tai e) kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa Y tarkoittaa tähdettä -Yi~CONH-Y2-, kaavan XIV mukainen yhdiste 46 75578 CH20H Jr—~°\ / >vOH (XIV) HI ? / HN - C - Ri R3 - CH \ R5 conh2 'CON - CH - CON - CH - CH2CH2 - CO-T-Y^-COOH 1 H H jossa kaavassa R\, R3, R5, T ja Υχ tarkoittavat samaa kuin edellä, tai sen aktivoitu karboksyylihappojohdannainen kon-densoidaan kaavan XVI mukaisen yhdisteen kanssa 0 h2n -y2-o-p-o- CH2 (XVI) • 1 OH Z jossa kaavassa Y2 ja Z tarkoittavat samaa kuin edellä, jolloin näissä esiintyvät hydroksiryhmät on mahdollisesti suojattu helposti lohkaistavilla suojaryhmillä, tai sen aktivoidun johdannaisen kanssa, ja lohkaistaan esiintyvät suoja-ryhmät, tai f) kaavan XX mukainen yhdiste CH2OR11 / y^ORio (XX) *9°/Γ-f ? / HN - C - Rl R3 - CH \ R5 conh2 XCON - CH - CON - CH - CH2CH2 - CO - T - Y - OH I I H H II 47 75578 jossa kaavassa Ri, R3, R5, T ja Y tarkoittavat samaa kuin edellä, R9, R^q 3a R11 tarkoittavat helposti lohkaistavia suojaryhmiä, saatetaan reagoimaan tähteen 0 II - P - 0 - CHo (XXI) I I OH Z jossa Z tarkoittaa samaa kuin edellä, luovuttavan yhdisteen kanssa, ja lohkaistaan esiintyvät suojaryhmät, tai g) kaavan XXVI mukainen yhdiste CH2OR11 |/^°>»>· \o / (XXVI) R90/I ( 0 / HN - C - Rl R3 - CH \ R5 conh2 O CON ~ CH — CON ~ CH — CH2CH2—CO-T—Y—O—P—o—CHo H H OH Z' jossa kaavassa Ri, R3, R5, T ja Y tarkoittavat samaa kuin edellä, R9, Rio ia R11 tarkoittavat helposti lohkaistavia suojaryhmiä, ja Z' tarkoittaa 1,2-dihydroksietyyliryhmää, jossa yksi hydroksiryhmä on esteröity mahdollisesti yhden kaksoissidoksen sisältävällä alifaattisella karboksyyliha-polla, jossa on 12-22 hiiliatomia, 1,2-dihydroksietyyliryhmää tai 2-hydroksietyyliryhraää, esteröidään mahdollisesti yhden kaksoissidoksen sisältävällä alifaattisella karboksyyliha-polla, jossa on 12-22 hiiliatomia, ja lohkaistaan suojaryhmät, tai h) kaavan I mukaisessa yhdisteessä, jossa yksi tai useampia funktionaalisia ryhmiä on suojattu suojaryhmillä, lohkaistaan nämä suojaryhmät, ja haluttaessa saatu kaavan I mukainen yhdiste muutetaan 48 75578 suolakseen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että valmistetaan N-asetyylimuramyyli-L-alanyy-li-D-isoglutaminyyli-2-(l',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi tai sen suola.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että valmistetaan N-asetyyli-desmetyylimuramyy-li-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-2-(1',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3' -fosforyyli) -etyyliamidi tai sen suola.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että valmistetaan N-asetyylimuramyyli-L-alanyy-li-D-isoglutaminyyli-Y-oksi-metyylikarbonyyli-2-(1',2'-dipal-mitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi tai sen suola.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että valmistetaan N-asetyylimuramyyli-L-alanyy-li-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(l',2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3' -fosforyyli ) -etyyliamidi tai sen suola.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että valmistetaan N-propionyyli-desmetyylimura-myyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alanyyli-2-(l',2'-dipal-mitoyyli-sn-glysero-3'-fosforyyli)-etyyliamidi tai sen suola .

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että N-asetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isogluta-minyyli-L-alaniini tai sen aktivoitu karboksyylihappojohdannainen saatetaan reagoimaan l,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3- fosforyyli-etanoliamiinin kanssa.

8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että N-asetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isogluta-miini tai sen aktivoitu karboksyylihappojohdannainen saatetaan reagoimaan L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero- 3-fosforyyli)-etyyliamidin kanssa.

9. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että N-asetyylimuramyyli-L-alaniini tai sen aktivoitu karboksyylihappojohdannainen saatetaan reagoimaan D-isoglutaminyyli-L-alaniini-2-(l,2-dipalmitoyyli-sn-glyse- li 49 755 78 ro-3-fosforyyli)-etyyliamidin kanssa.

10. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että N-asetyylimuramiinihappo tai sen aktivoitu karboksyylihappojohdannainen saatetaan reagoimaan L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alaniini-2-( 1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-fosforyyli)-etyyliamidin kanssa.

11. Jonkin patenttivaatimuksista 1 ja 7-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan N-asetyy- limuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L-alaniini-2-(l ,2- dipaImitoyyli-sn-glysero-3-fosforyyli>-etyyliamidi-natr ium-suola. 75578