Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nc- ^wych lipofilowych muramylopeptydów o ogólnym wzorze 1 w którym X oznacza grupe karbonylowa lub karbonyloksy- Jowa, Ri oznacza rodnik arylowy lub rodnik alkilowy ewen¬ tualnie podstawiony wolna, zestryfikowana lub zeteryfi- ikowana grupa hydroksylowa lub merkapto albo wolna lub zestryfikowana grupa karboksylowa, R2, R3, R4 i Rc oznaczaja atom wodoru lub nizszy rodnik alkilowy, R5 •oznacza atcm wodoru, nizszy rodnik alkilowy, rodnik cyklo- alkilowy, cykloalkilo(nizszy)alkilowy, arylowy lub aral- kilowy, heterocykliczny lub heterocykliczno(nizszy)alki- lowy o 5 lub 6 czlonach i jednym lub dwóch atomach azo¬ tu w pierscieniu, ewentualnie skondensowany z rodnikiem fenylowym, wolny zestryfikowany lub zeteryfikowany niz¬ szy rodnik hydroksyalkilowy, wolny zestryfikowany lub zeteryfikowany nizszy rodnik merkaptoalkilowy albo wol¬ iny, zalkilowany lub /acylowany nizszy rodnik aminoalki- lowy, albo- R4 i R5 lacznie oznaczaja rodnik alkilenowy o 3—4 atomach wegla, R7 oznacza atom wodoru lub ewentualnie zestryfikowana lub zamidowana grupe karbo¬ ksylowa i jeden z podstawników AL i A2 oznacza rodnik o wzorze 2 lub 2a, w których to wzorach T i Ti niezaleznie oznaczaja grupe HN lub atom tlenu, Y oznacza ewentual¬ nie podstawiony wolna, zeteryfikowana lub zestryfikowana grupa hydroksylowa, nizsza hydroksyalkilowa, merkapto lub nizsza merkaptoalkilowa, wolna, zalkilowana lub za- cylpwana nizsza grupa aminoalkilowa, grupa karbonami- dowa, alkilowa, cykloalkilowa o 5—6 atomach wegla, ary- Jowa lub aralkilowa, rodnik alkilenowy, który moze byc przerwany jedna lub dwiema grupami karbonyloksylowy- mi i/lub karbonyloaminowymi, Yx i Y2 niezaleznie oznacza- ja ewentualnie podstawiony wolna, zeteryfikowana lub zestryfikowana grupa hydroksylowa, nizsza hydroksyalki- owa, merkapto lub nizsza merkaptoalkilowa, wolna, 5 zalkilowana lub zacylowana nizsza grupa aminoalkilowa, grupa karbonamidowa, alkilowa, cykloalkilowa o 5—6 ato¬ mach wegla, arylowa lub aralkilowa, nizszy rodnik alki¬ lenowy, który albo w przypadku Yx albo w przypadku Y2 moze byc równiez przerwany grupa karbonyloksylowa 10 lub karbonyloaminowa, W oznacza atom wodoru, a Z oznacza rodnik 1,2-dwuhydroksyetylowy lub 2-hydroksy- etylowy, w którym co najmniej jedna grupa hydroksylowa jest zestryfikowana ewentualnie nienasyconym dlugolan- cuchowym, alifatycznym kwasem karboksylowym lub 15 zeteryfikowana ewentualnie nienasyconym, dlugolancu* chowym alifatycznym alkoholem, albo W i Z niezaleznie oznaczaja grupe hydroksymetylowa zestryfikowana ewen¬ tualnie nienasyconym, dlugolancuchowym alifatycznym kwasem karboksylowym lub zeteryfikowana ewentualnie 20 nienasyconym, dlugolancuchowym alifatycznym alkoho¬ lem, a drugi z podstawników Ai i A2; oznacza wolna lub zeteryfikowana grupe hydroksylowa,, aminowa, nizsza alkiloaminowa lub nizsza karbonamidoalkiloaminowa oraz ich soli. Zwiazki te wykazuja dzialanie stymulujace ód- 25 pornosc.Rodnikiem alkilowym jest prostolancuchowy lub roz¬ galeziony, w dowolnym miejscu zwiazany rodnik alkilo¬ wy zawierajacy do 18 atomów wegla, jednakze przede wszystkim nizszy rodnik alkilowy. 30 Podstawiony rodnik alkilowy, jak nizszy rodnik alki- 131 613Iowy, moze miec jeden, dwa^ub wiecej jednakowych lub róznych podstawników, zwlaszcza wolnych grup hydro¬ ksylowych.Rodnikami arylowymi sa zwlaszcza jednopierscienio- we, jak równiez dwupierscieniowe rodniki arylowe, przede wszystkim fenylowy, lecz równiez naftylowy.Rodnikiem aralkilowym jest zwlaszcza nizszy rodnik aryloalkilowy, w którym aryl ma wyzej podane znaczenie.Nizszy jo^njfc ifrtoajfcilewy jest przede wszystkim rodni¬ kiem benzylowym lub fenyjoetylowym.Rodnikiem cykloalkilowym jest zwlaszcza rodnik cyklc- ilClowy o 5—6 atomach wegla, jak cyklopentylowy lub ^yklolieksylowy, a "rodnikiem cykloalkilo(nizszym)alkilc- wym zwlaszcza taki, A którym rodnik cykloalkilowy ma 5 ^&atomówwggla, aj nizszy rodnik alkilowy jest przede wszystkim rodriikient metylowym lub etylowym. iRodnik heterocykliczny o 5 lub 6 czlonach i jednym lub dwóch atomach azotu w pierscieniu moze byc niena¬ sycony lub nasycony i ewentualnie skondensowany z rod¬ nikiem fenylowym. Jako takie mozna wymienic np. rodnik pirolilowy, indolilowy, pirydylowy lub imidazolilowy.W rodniku heterocykliczno(nizszym)alkilowym zawie¬ rajacym azot rodnik heterocykliczny ma wyzej podane znaczenie, a nizszym rodnikiem alkilowym jest przede wszystkim metylowy lub etylowy.Rodnik alkilenowy, jaki moga tworzyc rodniki R4 i R5, jest przede wszystkim rodnikiem trójmetylenowym.Ewentualnie zestryfikowana lub zamidowana grupa karboksylowa jest przede wszystkim sama grupa karboksy¬ lowa lub grupa\ karboksylowa zestryfikowana nizszym alkanolem albo takze grupa karbamoilowa, niepodstawio- na przy atomie azotu albo jedno- lub dwupodstawiona rodnikami alkilowymi, zwlaszcza nizszymi alkilowymi, ary¬ lowymi, zwlaszcza fenylowymi, lub aralkilowymi, jak ben¬ zylowymi. Grupy karbamoilowe moga miec równiez pod¬ stawnik alkilenowy, jak rodnik cztero- lub pieciometyle- nowy.Jako zeteryfikowane lub zestryfikowane grupy hydro¬ ksylowe lub merkapto nalezy zwlaszcza wymienic nizsza alkoksyfowa, nizsza acyloksylowa, np. nizsza alkanokar- bonyloksylowa, nizsza alkilomerkapto lub nizsza acylo- merkapto, np. nizsza alkanokarbonylomerkapto.Jako zalkilowane nizsze rodniki aminoalkilowe nalezy wymienic zwlaszcza jedno- lub dwu(nizsze) alkiloamino (nizsze)alkilowe, jak metyloamino-, etyloamino-, dwu- metyloamino-, dwuetyloamino-(nizsze)alkilowe, a jako zacalowane nizsze rodniki aminoalkilowe nalezy wymienic zwlaszcza alkanokarbonyloamino-, np. (nizsze) alkanokar- bonyloamino-(nizsze)alkilowe.Nizsza grupa karbonamidoalkilóaminowa jest przede wszystkim nizsza l-karbonamidoalkijoaniinowa, np. gli- cyloaminowa, alanyloaminowa, waliloaminowa, lub izo- lencylqaminowa.Rodnikiem alkilenowym Y jest zwlaszcza nizszy rod¬ nik alkilenowy, korzystnie o 2 lub 3 atoniach wegla. Rodni¬ kiem alkilenowym Y moze byc równiez nizszy rodnik alki¬ lenowy przerwany jedna lub dworna grupami karbonylo- ksylowymj i/luj karbonyloaminowymi,. a zwlaszcza rod¬ nik o wzorze 3a lub 3b, w których to wzorach jednym z rod¬ ników Yi i Ya moze byc ewentualnie podstawiony nizszy ro^jk alkilenowy, a drugim ewentualnie podstawiony nizszy rodnik alkilenowy, który moze byc przerwany gru¬ pa karbonyloksylowa lub karbonyloaminowa, przy czym YA i Ya lacznie maja.wiecej niz 2 atomy wegla. Jako pod¬ stawniki rodników Yx i Y2 nalezy wymienic zwlaszcza wol- 1 «13 4 ne, zeteryfikowane lub zestryfikowane grupy hydroksylowe^ lub nizsze hydroksyalkilowe, wolne, zeteryfikowane lut* zestryfikowane grupy merkapto, zwlaszcza nizsze merkap- toalkilowe, wolne lub jedno- lub dwualkilowane (nizszym 5 rodnikiem alkilowym) lub acylowane nizsze grupy amino¬ alkilowe, karbonamidowe, alkilowe, cykloalkilowe o 5—6 atomach wegla, arylowe lub aralkilowe, przy czym pojecia ogólne maja wyzej podane znaczenie.Dlugolancuchowym alifatycznym kwasem karboksylo- io wym jest zwlaszcza kwas o 12—90 atomach wegla, który moze miec 1 lub 2 podwójne wiazania i moze byc prosty- lub rozgaleziony. Korzystne sa kwasy o 16—22 atomach wegla oraz naturalne lub syntetyczne kwasy mykolowe.Dlugolancuchowym alifatycznym alkoholem jest zwlasz- 15 cza alkanol o 10—22 atomach wegla, który moze miec Jedno lub dwa podwójne wiazania i byc prosty lub roz¬ galeziony. Korzystne sa alkanole zawierajace 12—18 ato¬ mów wegla z grupa hydroksylowa na koncu lancucha.Rodniki i zwiazki okreslone w niniejszym opisie jako „nizsze" zawieraja korzystnie do 7 wlacznie, a przede wszystkim do 4 wlacznie atomów wegla.Powyzej r- ponizej pojeci* ^dme moga miec nastepu¬ jaceznaczenie: : Nizszym rodnikiem alkilowym jest np. n-propylowy, n-butylowy, izobutylowy, Il-rz.-butylowy lub Ill-rz.-bu- tylowy, dalej n-pentylowy, n-heksylowy, izoheksylowy. lub n-heptylowy, przede wszystkim metylowy lub etylowy- W rodniku arylo-, cykloalkilo- lub heterocykliczno (niz¬ szym) alkilowym nizszym rodnikiem alkilowym jest zwlasz¬ cza metylowy lub etylowy, przy czym rodnik arylowy, cy¬ kloalkilowy lub heterocykliczny maja wyzej podane zna¬ czenie.Nizsza grupa alkoksylowa jest np. n-propoksylowa, 35 n-butoksylowa, izobutoksylowa, II-rz.butoksylowa lub III- -rz.-butoksylowa, a przede wszystkim metoksylowa luq etoksylowa.Nizsza grupa alkilomerkapto jest np. n-propylo-, n-bu tylo-, izobutylo-, Il-rz.-butylo lub Ill-rz.-butylomerkapto 40 a przede wszystkim metylomerkapto lub etylomerkapto^ Nizsza grupa alkilenodioksylowa jest zwlaszcza grupa metylenodioksylowa, etylenodioksylowa lub propyleno dioksylowa.Atomem chlorowca jest atom fluoru lub bromu, a ko- 45 rzystnie chloru.Nizsza grupa alkanokarbonylowa jest zwlaszcza pro- pionylowa lub butyrylowa, a przede wszystkim acetylpwa.Syntetycznymi kwasami mykolowymi sa zwlaszcza kwa- bA sy a-alkilo-/?-hydroksyalkanokarboksylowe, gdzie rodnik 50 alkilowy w polozeniu a ma 1—20, przede wszystkim 1-^Aly, sl kwas alkanokarboksylowy 20—80, zwlaszcza: 30-^34 atomów wegla. Moga one zawierac dalsze grupy hydro¬ ksylowe, jak równiez grupy okso, metylenowe lub etylem nowe. 55 Naturalnymi kwasami mykolowymi sa zwlaszcza takie; które mozna wyodrebnic z zywych organizmów, jak bakterie;. np. mykobakterie.Nowe zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku 60 moga miec postac mieszanin izomerów lub czystych izo¬ merów. Nowe lipofilowe muramylopeptydy p wzorze 1 wykazuja szereg cennych wlasciwosci farmakologicznych zwlaszcza wybitne dzialanie wzmagajace odpornosc.Tak wiec zwiazki te in vivo znacznie zwiekszaja zdolnosc" 65 wytwarzania przeciwcial u myszy:131 613 5 Myszy NMRI uodporniono w dniu 0 przez dootrzewno¬ we wstrzykniecie 10 ug wolnego od osadu BSA. Dnia 9, 15 i 29 pobrano próbki osocza i zbadano je na zawartosc przeciwcial anty-BSA, technika pasywnej hemoaglutynacji.W stosowanej dawce rozpuszczalny BSA jest dla zwie¬ rzat—biorców subimmunogenny, tj. wymaga wyzwolenia jedynie bardzo malej produkcji przeciwcial lub nie wy¬ maga jej w ogóle. Dodatkowe traktowanie myszy okreslo¬ nymi substancjami o dzialaniu wzmagajacym odpornosc, przed lub po podaniu antygenu, prowadzi do wzrostu miana przeciwcial w osoczu. Efekt traktowania wyrazono poprzez uzyskana wartosc, tj. suma log2 róznic miana w trzech dniach pobierania krwi.W próbie tej zwiazki o wzorze 1 przy dootrzewnowym lub podskórnym podaniu 0,5—5 mg/kg zwierzecia w ciagu pieciu kolejnych dni po uodpornieniu za pomoca BSA znacznie zwiekszaja produkcje przeciwcial wobec BSA.W tym wzgledzie znacznie przewyzszaja dostepne mura- mylopeptydy hydrofilowe (zwiazki wyjsciowe w procesie wedlug wynalazku). I tak, jak podano w opisie patentowym RFN DOS nr 2 655 500 (str. 24 fragment 1) i w odpowia¬ dajacym mu polskim opisie patentowym nr 100 353, (kol. 5 w .1) w wyzej opisanym tescie te znane zwiazki wykazuja dzialanie w dawce 100—300 mg/kg. W przeciwienstwie do tego ustalona empirycznie w dniu 18 i 28 krwawienia jako wartosc odniesienia 10 niezbedna dla uzyskania wy¬ raznego efektu dawka muramylopeptydu, wytworzonego sposobem wedlug wynalazku, wynosi: a) w przypadku podawania dootrzewnowego: 0,1 mg/kg N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo- -L-alanino-2(l\ 2,-dwupalmitoilo-sn-glicero-3, -fosforylo)- -etyloamidu (zwiazku A) 0,6 mg/kg N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo- -Y-oksymetylokarbonylo-2-(r,2'-dwupalmitoilo-sn-glicero- -3'-fosforyloetyloamidu (zwiazku B) 0,8 mg/kg N-acetylomuramylo-L-a-aminobutyrylo-D-izo- glutaminylo-L-alanino-2-(r,2'-dwupalmitoilo-sn-glicero—3'- -fosforylo)-etyloamidu (zwiazku C) 0,9 mg/kg N-acetylo-desmetylomuramylo-L-alanylo-D- -izoglutaminylo-L-alanino-2-(l\2'-dwupalmitoilo-sn-glicero- -3'-fosforylo)-etyloamidu 2,0 mg/kg N-acetylomuralmylo-L-alanylo-D-izoglutaminy- lo-L-alanino-2-(3'-palmitoilo-rac-glicero-1 -fosforylo)-etylo- amidu (zwiazku D) 2,5 mg/kg N-propionylo-desmetylomuramylo-L-alanylo-D- -izoglutaminylo-L-alanino-2-(l\2'-dwupalmitoilo-sn-glicero- -34-fosforylo)-etyloamidu (zwiazku E) 3,8 mg/kg N-acetylomaramylo-L-alanylo-D-izoglutaminy- ló-2-(r,2'-dwupalmitoilo-sn-glicero-3'-fosforylo)-etyloamidu lub 5 mg/kg N-acetylo-desmetylomuramylo-L-alanylo-D-izo- glutaminylo-L-alanino-2-(3 '-palmitoilo-rac-glicero-1'-fosfo- ryloetyloamidu b) w przypadku podawania podskórnego: 0,3 mg/kg zwiazku A 0,8 mg/kg zwiazku C 1,5 mg/kg zwiazku B lub 1,5 mg/kg zwiazku D.Równiez objawy odpornosci za posrednictwem komórek moga byc in vivo zwiekszone przez wymienione zwiazki.Podczas, gdy sensybilizacja swinek morskich za pomoca BSA w niekompletnym adjuwancie Freunda prowadzi jedynie do humoralnej produkcji przeciwcial, domieszanie nowych lipofilowych muramylopeptydów do emulsji anty¬ genu, W dawce 5—50 fig, hidukuje fiadwrazKftbsc typtt 6 póznego wobec BSA: 3 tygodnie po immunizacji pod¬ skórna iniekcja BSA prowadzi do miejscowej reakcji za¬ palnej z rumieniem i zgrubienia skóry, które osiagaja mak¬ simum w ciagu 24 do 48 godzin. Te reakcje typu póznego ^ 5 ilosciowo i jakosciowo odpowiadaja reakcjom zwykle uzys¬ kiwanym przez immunizowanie za pomoca BSA w komplet¬ nym adjuwancie Freunda (tzn. z dodatkiem mykobakterii).Wartosci ED50 [ilosc w //g/zwierze] konieczna do indukcji róznicy objetosci reakcji (powierzchnia rumienia xzwiek- 10 szenie grubosci skóry) przy traktowanych i nietraktowa- nych zwierzetach, 200 ug, 24 godziny po wywolaniu) wy¬ nosza 10—20 //g.Wartosci ED50 [lig muramylopeptydu/zwierze] wynosza przykladowo 7 dla zwiazku C i zwiazku E, 15 dla zwiazku B 15 i 25 dla zwiazku A i zwiazku D.Szczególnie nalezy podkreslic równiez zdolnosc takich lipofilowych muramylopeptydów do wywolania u swinek morskich, przez stosowanie lacznie z BSA w liposomach (eilecytyna:cholesteryna 4:1; 4 mg/zwierze) i bez toksycz- 20 nego skladnika — oleju mineralnego, nadwrazliwosci typu póznego wobec BSA. Ilosciowo i jakosciowo równiez te reakcje typu póznego sa identyczne z reakcjami uzyskiwa¬ nymi przez immunizacje za pomoca BSA w kompletnym adjuwancie. Wartosci ED50 wynosza 100—300 ug na 25 zwierze.Nowe zwiazki o wzorze 1 wykazuja w porównaniu z hydrofilowymi muramylopeptydami dalsze zalety jakoscio¬ we: Myszy Balb/c immunizowano w dniu 0 przez dootrzew 30 nowa iniekcje 2xl04 komórek tucznych P815. Dla 15 zba¬ dano komórki sledziony tak immunizowanych zwierzat, jn vitro, na obecnosc cytotoksycznych, ukierunkowanych przeciwko komórkom tucznym P815 limfocytów T. W tym celu komórki P815 znakowano za pomoca 51Cr i okreslo- 85 no wielkosc reakcji cytotoksycznej przez pomiar radioak¬ tywnosci w plynie nad hodowla. W stosowanej dawce ko¬ mórki tuczne P815 sa dla biorcy-myszy subimmunogenne, tzn. nie wywoluja lub wywoluja bardzo male tworzenie cytotoksycznych komórek T. Równoczesne dootrzewnowe 40 podanie 1 do 50 jag wymienionych muramylopeptydów o wzorze 1 prowadzi do znaczacego zwiekszenia produkcji cytotoksycznych komórekT (wspólczynnik 10 do 30 w sto¬ sunku do myszy nie traktowanych).Wzmagajace odpornosc wlasciwosci nowych zwiazków 45 o wzorze 1 przejawiaja sie równiez w przypadku indukcji specyficznej immunotolerancji wobec antygenów trans. plantacyjnych, przez immunizowanie za pomoca auto blastów z adjuwantem u myszy: W mieszanej hodowli limfocytów inkubowano limfo- 50 cyty sledziony przyszlych transplantobiorców (myszy C57B1/ /6J) z napromieniowanymi komórkami sledziony przyszlych transplantodawców (myszy CBA/J). Antygeny dawcy o zgodnosci tkankowej rozmnazaly sie i tworzyly blastule; te mozna bylo przez sedymentacje oddzielic od innych 55 komórek. Specyficzne blastule wyrazaja idiotypowa spe¬ cyficznosc receptorów membranowych. Mieszano je z kom. pletnym adjuwantem Freunda (CFA) i wstrzykiwano jako autoimmunogeny do indukcji specyficznej tolerancji wobec danych antygenów transplantacyjnych u przewidzianego 60 transplantobiorcy (C57 B1/6J). Immunizacji dokonuje sie czterokrotnie w czterotygodniowych odstepach, za pomo¬ ca autologicznych limfoblastów z anty-CBA/J. Adsor- baty T-autoblastów z nowymi zwiazkami o wzorze 1 (109 blastów zawieszano w roztworze 20 mg substancji w 20 ml 6$ PBS; po dwugodzinnej inkubacji komórki odwirowano131 613 7 i dwukrotnie przemyto PBS) moga indukowac specyficzna immunotolerancje w nieobecnosci CFA, przy czym adsor- baty sa tak samo skuteczne jak limfoblasty w CFA.Nowe zwiazki o wzorze 1 sa równiez zdolne do induko¬ wania, w stezeniu 0,5—100 //g/ml, produkcji komórek wy¬ twarzajacych przeciwciala w hodowlach komórek normal¬ nych myszy. (Zwiekszenie liczby tworzacych plytki komó¬ rek 19S o wspólczynnik 10 do 30 w stosunku do wartosci kontrolnej, tj. w nieobecnosci substancji stymulujacych): tak wiec w obecnosci wymienionych zwiazków, powstaja specyficzne przeciwciala wobec erytrocytów owcy, bez wprowadzania do hodowli erytrocytów owcy w celu immu- nizacji. Z drugiej strony, wymienione substancje w tym sa¬ mym stezeniu wywoluja zwiekszenie immunologicznej reaktywnosci hodowli komórek sledziony zubozonych w komórki T (kongencjalnie atymicznych myszy nu/ nu w stosunku do antygenu normalnie zaleznego od grasicy (erytrocytu owcy) (wspólczynnik 10 do 30 w stosunku do nie traktowanych hodowli kontrolnych). Wymienione zwiazki nie tylko indukuja in vitro, bezposrednio lub po¬ srednio, zdolnosc proliferacji i syntezy limfocytów B (tj. potencjalnych komórek produkujacych przeciwciala), lccz równiez wywieraja Wplyw na limfocyty T (do których na¬ leza regulatorycznie aktywne komórki pomocnicze i su- presorowe, jak równiez cytotoksyczne komórki efektoro- we). Tak wiec wspomniane zwiazki w zakresie stezenia 1—20 fig/ml znacznie zwiekszaja reaktywnosc opornych na kortizon komórek grasicy wobec alogenowych, napro¬ mieniowanych limfocytów stymulatorowych (do 19-krot- nie).Wyzej wspomniane dzialania sa prawdopodobnie po¬ srednie; wywoluje je aktywacja makrofagów przez lipofi- lowe muramylopeptydy. Makrofagi z kolei wywoluja reak¬ tywnosc limfocytów T i B. W rzeczywistosci mozna wyka¬ zac, ze wymienione zwiazki juz w niskim stezeniu (0,5—10 //g/ml) wyzwalaja z makrofagów myszy w duzej ilosci aktywnosc stymulujaca kolonizacje „colony stimulating activity" (CSA). (Indukcja do 150—200 koloniii w ciagu 7 dni z 105 komórek szpiku myszy po dodaniu 20% plynu znad hodowli makrofagów inkubowanej w ciagu 24 godzin z substancja, w porównaniu z 0—5 koloniami przy doda¬ niu plynu znad nie potraktowanych hodowli makrofagów).CSA jest biologicznym mediatorem, który jest konieczny do zróznicowania komórek szpiku kostnego na makro¬ fagi i pólimorficzne leukocyty. W taki sposób wymienione zwiazki wywoluja zwiekszona produkcje komórek maja¬ cych centralne znaczenie dla niespecyficznej odpornosci orazy indukcji, amplifikacji i ekspresji specyficznych (za posrednictwem limfocytów) reakcji immunologicznych.Wzmagajace odpornosc dzialanie nowych zwiazków mozna wykazac in vivo: tak wiec iniekcja fosfolipidowej pochodnej muramylopeptydu prowadzi w ciagu 3—9 go¬ dzin do znacznego wzrostu stezenia CSA w osoczu (do 120 kolonii na 105 komórek szpiku po dodaniu osocza ekstrahowanego chloroformem (stezenie koncowe 5%), w porównaniu z 0—5 koloniami u zwierzat nie traktowa¬ nych). Tak wiec podawanie tych zwiazków in vivo znacznie zwieksza zdolnosc myszy do produkcji przeciwcial.Wzmagajace odpornosc wlasciwosci nowych zwiazków o wzorze 1 mozna równiez wykazac na modelach nowo¬ tworowych, np. w przypadku nowotworu Ehrlich Ascites u myszy (wodobrzusze na tle raka Ehrlicha).Dootrzewnowa iniekcja 106 syngenicznych komórek nowotworowych Ehrlich Ascites prowadzi u myszy Balb/c do padniecia zwierzat w ciagu przecietnie 18 dni. Gdymy- 8 szom wstrzykuje sie dootrzewnowo 107 (grupa 1), 105 (grupa 2) i 105 (grupy 3) komórek nowotworu Ascites które in vitro obsadzono nowymi zwiazkami o wzorze 1 (109 komórek nowotworu Ascites zawiesza sie w roztwo- 5 rze 40 mg badanej substancji w 20 ml fizjologicznego roz¬ tworu soli kuchennej buforowanego fosforanem (PBS) i po dwugodzinnej inkubacji w 37 °C komórki odwirowuje sie i dwukrotnie przemywa PBS; wskutek tego zabiegu ko¬ mórki wlaczaja badana substancje w swoja blone), to pa 10 18 dniach nie dochodzi do wzrostu nowotworu. 19 dnia zwierzeta obciaza sie 106 rodzimych komórek nowotworu Ehrlich Ascites, dootrzewnowo. Obserwuje sie nastepujace efekty: Grupa 1: 8 z 10 zwierzat przezywa 80 dzien 15 Grupa 2: 6 z 10 zwierzat przezywa 80 dzien Grupa 3: zwierzeta umieraja, jak kontrolne, po 18 dniach.Zwiazki o wzorze 1 sa przy tym malo toksyczne: 5-krot„ ne dootrzewnowe podanie w dawce 100 mg/kg/dzien w ciagu 5 kolejnych dni przechodzilo u myszy bezobjawowo. 20 Poniewaz dawki wymagane do immunostymulacji sa bar. dzo male, zakres terapeutyczny nowych zwiazków jest bardzo duzy.Nowe zwiazki o wzorze 1 moga znacznie podwyzszyc odpornosc komórkowa, a zwlaszcza humoralna i to za- 25 równo w mieszaninie z samym antygenem (efekt adjuwan- towy w wezszym znaczenju) jak równiez przy doprowadze¬ niu czasowo i miejscowo oddzielonym od iniekcji antyge¬ nu (systemowe wzmaganie odpornosci).Nowe zwiazki o wzorze 1 moga byc jako adjuwanty 30 w mieszaninie ze szczepionka stosowane do polepszania efektu szczepienia i polepszania ochrony przed zakazeniem bakteryjnym, wirusowym lub pasozytniczym przez odpor¬ nosc komórkowa i/lub humoralne przeciwciala.Wreszcie, opisane zwiazki nadaja sie do stosowania 35 jako adjuwanty, w mieszaninie z róznymi antygenami, przy doswiadczalnym i przemyslowym wytwarzaniu prze- ciwsurowic dla lecznictwa i diagnostyki oraz przy indukcji immunologicznie aktywowanych populacji limfocytów dla transportu komórkowego. 40 Nowe zwiazki moga byc równiez bez równoczesnego doprowadzania antygenu stosowane do przyspieszania reakcji immunologicznych u czlowieka i zwierzecia. Zwiaz¬ ki nadaja sie szczególnie do stymulacji obrony organizmu, np. przy przewleklych lub ostrych zakazeniach lub przy 45 selektywnych (antygenospecyficznych) defektach immuno¬ logicznych, jak równiez wrodzonych lecz równiez i naby¬ tych ogólnych (tj. nie antygenospecyficznych) stanach de¬ fektów immunologicznych, jakie wystepuja w starosci, w przebiegu ciezkich schorzen pierwotnych, a przede wszyst- 50 kim terapii promieniowaniem jonizujacym lub hormonami dzialajacymi immunosupresyjnie. Wspomniane substancje mozna wiec z korzyscia stosowac równiez lacznie z anty¬ biotykami, chemoterapeutykami lub przy innych zabie¬ gach leczniczych, dla przeciwdzialania uszkodzeniom 55 immunologicznym. Wreszcie, opisane substancje nadaja sie do ogólnej profilaktyki chorób zakaznych u czlowieka i zwierzecia.Sposobem wedlug wynalazku korzystnie wytwarza sie zwiazki o wzorze 1, w którym X oznacza grupe karbony- ^ Iowa, Ri oznacza rodnik aklilowy lub arylowy, R2, R3^ R* i R5 oznaczaja atom wodoru lub nizszy rodnik alki¬ lowy, R5 oznacza atom wodoru, nizszy rodnik alkilowy ewentualnie podstawiony grupa hydroksylowa, nizsza alko' ksylowa, merkapto lub nizsza alkilomerkapto, rodnik 55 cykloalkilpwy lub cykloalkilo(nizszy)alkilowy, przy czym131 613 9 Todnik cykloalkilowy zawiera 4—6 atomów wegla, rodnik fenylowy lub nizszy fenyloalkilowy, rodnik heterocyklicz¬ ny lub heterocykliczno(nizszy)alkilowy o 5 lub 6 czlonach i 1 lub 2 atomach azotu w pierscieniu heterocyklicznym ewentualnie skondensowany z rodnikiem fenylowym, albo R4 i k5 lacznie stanowia rodnik alkilenowy o 3—4 atomach wegla, R7 oznacza atom wodoru i jeden z podstawników Ai i A2 oznacza rodnik o wzorze 2, w którym T i Y maja wyzej podane znaczenie, W oznacza atom wodoru, a Z oznacza rodnik 1,2-hydroksyetylowy lub 2-hydroksyety- lowy, w którym co najmniej jedna grupa hydroksylowa jest zestryfikówana lub zeteryfikowana w wyzej podany sposób, a drugi z podstawników Ai i A2 oznacza grupe hydrolcsylowa, nizsza alkoksylowa, aminowa, nizsza alki- loaminowa lub nizsza karbonamidoalkiloaminowa.W szczególnosci wytwarza sie zwiazki o wzorze 1, w którym X oznacza grupe karbonylowa, Rx oznacza rod¬ nik alkilowy ewentualnie podstawiony grupa hydroksylowa lub nizsza alkoksylowa albo rodnik fenylowy, R2, R4. i Ró oznaczaja atomy wodoru, R3 oznacza atom wodoru lub nizszy rodnik alkilowy, R5 oznacza atom wodoru, nizszy rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla ewentualnie pod¬ stawiony grupa hydroksylowa, nizsza alkoksylowa, mer- kapto, lub nizsza alkilomerkapto; rodnik cykloalkilowy lub cykloalkilo(nizszy)alkilowy, przy czym rodnik cyklo¬ alkilowy zawiera 4—6 atomów wegla, a nizszy rodnik alki¬ lowy zawiera 1^3 atomy wegla; rodnik fenylowy lub niz¬ szy fenyloalkilowy o 1—3 atomach wegla w rodniku alki¬ lowym, zawierajacy jeden lub dwa atomy azotu rodnik heterocykliczny lub heterocykliczno(nizszy)alkilowy o 5—6 czlonach w pierscieniu i 1—3 atomach wegla w rodniku alkilowym, albo R4 i R5 lacznie oznaczaja takze rodnik alkilenowy o 3—4 atomach wegla, R7 oznacza atom wodoru i jeden z podstawników Ai i A2 oznacza rodnik o wzorze 2, w którym T oznacza HN lub 0, Y oznacza nizszy rodnik alkilenowy lub rodnik o wzorze 3a lub 3b, w których to wzorach Yi i Y2 oznaczaja nizszy rodnik alkilenowy, W oznacza atom wodoru, a Z oznacza rodnik 1,2-dwuhydro- ksyetylowy lub 2-hydroksyetylowy, w którym co najmniej jedna grupa hydroksylowa jest zestryfikówana ewentual¬ nie jedno- lub dwukrotnie nienasyconym alifatycznym kwasem karboksylowym o 16—22 atomach wegla lub naturalnym lub syntetycznym kwasem mykolowym lub zeteryfikowana ewentualnie jedno- lub dwukrotnie nie¬ nasyconym, alifatycznym alkoholem o 12—18 atomach wegla, a drugi z podstawników Ai i A2 oznacza grupe hy¬ droksylowa, nizsza alkoksylowa, aminowa, nizsza alkilo- aminowa lub nizsza karbonamidoalkiloaminowa.Przede wszystkim wytwarza sie zwiazki o wzorze 1, w którym X oznacza grupe karbonylowa, Ri nizszy rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla lub fenylowy, R2, R4 i R3 oznaczaja atomy wodoru, R3 oznacza atom wodoru lub nizszy rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, R5 oznacza atom wodoru, nizszy rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla ewentualnie podstawiony grupa hydroksylowa, me- toksylowa, merkapto lub metylomerkapto, rodnik feny¬ lowy lub fenylometylowy, zawierajacy jeden lub dwa ato¬ my azotu rodnik heterocykliczny lub heterocyklicznome- tylowy o 5 czlonach w pierscieniu, albo R4 i R5 lacznie tworza rodnik trójmetylenowy, R7 oznacza atom wodoru i jeden z podstawników Ax i A2 oznacza rodnik o wzorze 2, w którym T oznacza HN lub 0, Y oznacza nizszy rodnik alkilenowy o 2—3 atomach wegla lub rodnik o wzorze 3a lub 3b, w których to wzorach Yi i Y2 niezaleznie oznaczaja rodnik alkilenowy o 1—3 atomach wegla podstawiony 10 nizszym rodnikiem alkilowym o 1—3 atomach wegla ewen¬ tualnie podstawionym grupa hydroksylowa, nizsza alko¬ ksylowa, merkapto lub nizsza alkilomerkapto albo pod¬ stawiony rodnikiem fenylowym, nizszym fenyloalkilowym 5 lub zawierajacym jeden lub dwa atomy azotu rodnikiem heterocyklicznym lub nizszym heterocyklicznoalkilowym o 5—6 czlonach w pierscieniu i 1—3 atomach wegla w niz¬ szym rodniku alkilowym, W oznacza atom wodoru, a Z oznacza rodnik 1,2—dwuhydroksyetylowy lub 2-hydroksy- 10 etylowy, w którym co najmniej jedna grupa hydroksylowa Jest zestryfikówana ewentualnie jedno- lub dwukrotnie nienasyconym alifatycznym kwasem karboksylowym o 16—20 atomach wegla lub zeteryfikowana ewentualnie jedno- lub dwukrotnie nienasyconym alifatycznym alko- 15 holem o 12—18 atomach wegla, a drugi z podstawników Ai i A2 oznacza grupe hydroksylowa, nizsza alkoksylowa* aminowa nizsza alkiloaminowa lub nizsza karbonamido¬ alkiloaminowa.W szczególnosci wynalazek dotyczy sposobu wytwarza- 20 nia nowych muramylopeptydów opisanych w przykladach.Nowe zwiazki o wzorze 1 mozna wytwarzac ogólnie znanymi sposobami.Sposób wytwarzania zwiazków 6 wzorze 1 polega we¬ dlug wynalazku & fjjrm, ze zwiazek o wzorze 4, w którym 25 X, Ri, R2, R4, R4, R5, R6 i R7 maja wyzej podane znaczenie, R9, Rio i Ru oznaczaja atomy wodoru i jedna z grup — COA°i i -COA°2 oznacza grupe karboksylowa, jej aktywowa na pochodna lub grupe o wzorze 5, w którym T i Yx maja wyzej podane znaczenie, a Mi oznacza grupe karboksylowa 30 Jub jej aktywowana pochodna, a druga z grup -COA* i -COA°2 oznacza zestryfikówana grupe karboksylowa, karbamoilowa, nizsza N-alkilokarbamoilowa lub' nizsza N-aminokarboiloalkilo-karbamoilowa, kondensuje sie ze zwiazkiem o wzorze 6, w którym W i Z maja wyzej podane 35 znaczenie, a T2 i Y3 maja znaczenie takie jak wyzej podane dla symbolu T wzglednie Y, gdy grupa -COA°i, lub -COA°2 oznacza grupe karboksylowa lub jej aktywowana pochod¬ na, albo T2 i Y3 maja znaczenie takie jak wyzej podane dla symbolu Ti wzglednie Y2, gdy grupa-COA°i lub-COA°2 40 oznacza wyzej okreslona grupe o wzorze 5, albo z aktywo¬ wana pochodna tego zwiazku i otrzymany zwiazek o wzo¬ rze 1 ewentualnie przeprowadza sie w sól.Korzystna podgrupe zwiazków o wzorze 1 otrzymuje sie tak ze zwiazek o wzorze 4, w którym Ri oznacza nizszy 45 rodnik alkilowy o 3 atomach wegla lub rodnik fenylowy, R3 oznacza nizszy rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, R5 oznacza nizszy rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla ewentualnie podstawiony grupa hydroksylowa, metoksy- lowa* merkapto lub metylomerkapto, rodnik fenylowy lub 50 fenylometylowy, albo R* i R5 lacznie oznaczaja rodnik trójmetylenowy, a Yi oznacza rodnik alkilenowy o 1—3 atomach wegla podstawiony nizszym rodnikiem alkilo¬ wym o 1—3 atomach wegla ewentualnie podstawionym grupa hydroksylowa, nizsza alkoksylowa, merkapto lub 55 nizsza alkilomerkapto albo podstawiony rodnikiem feny¬ lowym lub nizszym fenyloalkilowym, poddaje sie reakcji z3 zwiazkiem o wzorze 6, w którym Y3 oznacza rodnik alkilenowy o 2—3 atomach wegla lub grupe o wzorze -Yi-CO-Ti-Y2, w którym Yi i Y2 niezaleznie oznaczaja 60 nizszy rodnik alkilenowy o 1—3 atomach wegla podsta¬ wiony nizszym rodnikiem alkilowym o 1—3 atomach wegla ewentualnie podstawionym grupa hydroksylowa, nizsza alkoksylowa, merkapto lub nizsza alkilomerkapto albo podstawiony rodnikiem fenylowym lub nizszym fe- 65 nyloalkilowym albo zawierajacym jeden lub dwa atomy131613 11 12 azotu rodnikiem heterocyklicznym lub nizszym hetero- cyklicznoalkilowym o 5—6 czlonach w pierscieniu i 1—3 atomach wegla w nizszym rodniku alkilowym, gdy w sub" stracie o wzorze 4 jedna z grup -COA0! i -COA°2 oznacza grupe karboksylowa lub jej aktywowana pochodna, albo Y3 oznacza nizszy rodnik alkilenowy o 2—3 atomach wegla podstawiony nizszym rodnikiem alkilowym o 1—3 ato¬ mach wegla ewentualnie podstawionym grupa hydroksy¬ lowa, nizsza alkoksylowa, merkapto lub nizsza alkilomer" kapto albo podstawiony rodnikiem fenylowym lub nizszym fenyloalkilowym albo zawierajacym jeden lub dwa atomy azotu rodnikiem heterocyklicznym lub nizszym hetero- cyklicznoalkilowym o. 5—6 czlonach w pierscieniu i 1—3 atomach wegla w nizszym rodniku alkilowym, gdy jedna z grup -COA°i i -COA°2 oznacza grupe o wzorze 5, a Z ozna¬ cza grupe 1,2-dwuhydroksyetylowa lub 2-hydroksyetylowa, w której co najmniej jedna grupa hydroksylowa jest zes- tryfikowana ewentualnie jedno- lub dwukrotnie nienasy¬ conym alifatycznym kwasem karboksylowym o 16—20 atomach wegla lub zeteryfikowana ewentualnie jedno- lub dwukrotnie nienasyconym alifatycznym alkoholem o 12—18 atomach wegla.Szczególnie korzystna podgrupe zwiazków otrzymuje sie tak, ze zwiazek o wzorze 4, w którym Ri i R3 oznaczaja rodniki metylowe, R5 oznacza rodnik alkilowy o 1—4 atomach wegla, grupa -COA0! oznacza grupe karbomoilo- wa, a Yi oznacza grupe o wzorze -(Rl2-)CH-, w którym R12 oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, poddaje sie reakcji ze zwiazkiem o wzorze 6, w któ¬ rym Ys oznacza grupe o wzorze -(R12-)CH-C(=0)-NH- -CH2-CH2-, w którym R12 oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, gdy grupa-COA °2 oznacza grupe karboksylowa lub jej aktywowana pochodna, albo Y3 oznacza rodnik etylenowy, gdy grupa-COA °2 oznacza grupe o wzorze 5, a Z oznacza grupe 1,2-dwuhydroksyety¬ lowa, w której obie grupy hydroksylowe sa zestryfikowane kwasem alkano-wzglednie alkenokarboksylowym o 16—20 atomach wegla.Wynalazek dotyczy przede wszystkim wariantu sposobu wedlug wynalazku polegajacego na tym, ze N-acetylomura- mylo-L-alanylo-D-izoglutamine lub jej aktywowana po¬ chodna kwasowa poddaje sie reakcji z L-alanylo-2-(r,2- -dwupalmitoilo-sn-glicero^-fosforyloj-etyloamidem albo N- -acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanine lub jej aktywowana pochodna kwasowa poddaje sie reakcji z 2-(l\2'-dwupalmitoilo-sn-glicero-3'-fosforylo)-etyloamina.Zgodnie ze szczególnie korzystnym wariantem sposobu wedlug wynalazku jako substrat stosuje sie zwiazek o wzo¬ rze 4, w którym ugrupowanie kwasu karboksylowego ma postac ugrupowania bezwodnika, azydku, aktywowanego amidu lub aktywowanego estru* a zwlaszcza zwiazek o wzo¬ rze 4, w którym ugrupowanie majace postac bezwodnika kwasowego jest ugrupowaniem bezwodnika z nizszym estrem alkilowym kwasu weglowego, ugrupowanie majace postac amidu kwasowego jest ugrupowaniem imidazolidu lub izooksazolklu, a ugrupowanie majace postac aktywo¬ wanego estru jest ugrupowaniem estru cyjano- lub karbo- ksymetylowego, tioestru acetyloaminoetylowego, estru p- nitro lub 2,4,5-trójchlorofenylowego, N-hydroksysukcy- nimidowegó, N-hydroksyftalimidowego lub N-hydroksy- piperydynowego, estru 8-hydroksychinolinowego, tioestru metoksyetylowego albo estru otrzymanego przez reakcje z karbodwuimidem z dodatkiem N-hydroksysukcynimidu lub 1-hydroksy benzotriazolu lub 3-hydroksy-4-keto-3,4- -dwuwodorobenzoEd]-l,2,3-triazyny.Kondensacje zwiazku o wzorze 6, w którym T oznacza NH przeprowadza sie np. w taki sposób, ze kwas o wzorze 4 w postaci aktywowanej poddaje sie reakcji ze zwiazkiem aminowym o wzorze 6 lub kwas o wzorze 4 poddaje sie 5 reakcji ze zwiazkiem o wzorze 6, którego grupy aminowe sa w postaci aktywowanej. Aktywowana grupa karboksy¬ lowa moze byc przykladowo grupa bezwodnika kwasowego korzystnie mieszanego bezwodnika kwasowego, np. z niz¬ szym estrem alkilowym kwasu weglowego, jak ester ety- 10 Iowy lub izobutylowy kwasu weglowego, grupa azydku kwasowego, amidu kwasowego, jak imidazolidu lub akty¬ wowanego estru. Jako aktywowany ester wymienia sie szcze¬ gólnie ester cyjanometylowy, ester karboksymetylowy, tioester p-nitrofenylowy, ester ^-nitrofenylowy, ester 2,4,5- 15 -trójchlorofenylowy, ester pieciochlorofenylowy, ester ,N- -hydroksysukcynimidowy, ester N-hydroksyftalimidowy, es¬ ter 8-hydroksychinolinowy, ester 2-hydroksy-l,2-dwuwodo- ro-1-karboetoksychinolinowy, ester N-hydroksypiperydyno- wy lub enoloester utworzony z N-etylo-5-fenylorizoksazp- 20 lino-3'-sulfonianem. Aktywowane estry mozna otrzymac ewentualnie równiez przez reakcje z karbodwuimidem, stosujac dodatek N-hydroksysukcyniamidu lub niepod- stawionego lub podstawionego np. atomem chlorowca, rodnikiem metylowym lub grupa metoksylowa l-hydroksy- 25 benzotriazolu lub 3-hydroksy-4-keto-3,4-dwuwodoro-benzo [d]-l,2triazyny.Grupe aminowa aktywuje sie np. przez reakcje z ami¬ dem kwasu fosforowego.Sposród metod reakcji z aktywowanymi kwasami nalezy 30 wymienic zwlaszcza metody z uzyciem N-etylo-^-fenylo- -izoksazolino-3'-sulfonianu (odczynnik K Woodwar^a), 2-etoksy-1,2-dwuwodoro-1-karboetoksy-chinoliny lub Ifar- bodwuimidu.Jako aktywne estry korzystne sa estry z N-hydroksy-sukcy- 35 nimidem lub ich produkty C-podstawienia, jak N-hydroksy- metylo- lub -dwumetylosukcynimid lub reakcji z karbo. dwuimidem, jak sam karbodwuimid lub l-etylo-3-(3-dwu- metyloaminopropylo)-karbodwuimid.Stosowane do tego zwiazki wyjsciowe sa znane lub moz- 40 na je wytworzyc ogólnie znanymi sposobami.W przypadku wytwarzania nowych zwiazków o wzorze 1, w którym T oznacza atom tlenu, reakcje mozna przepro¬ wadzic w taki sposób, ze wolny kwas estryfikuje sie alko¬ holem o wzorze 6, w którym T2 oznacza atom tlenu, w obec- 45 nosci srodka odciagajacego wode, jak karbodwuimid^ np. dwucykloheksylokarbodwuimid, i aminy, jak pirydyna lub dwumetyloaminopirydyna, lub trójalkiloaminy, np* trójmetyloaminy. Mozna równiez kwas karboksylowy np. w postaci soli, jak sól sodowa lub potasowa, poddac reakcji 50 z reaktywnym estrem alkoholu, np. estrem z mocnym kwa¬ sem nieorganicznym lub organicznym, jak kwas chlorowcom wodorowy, np. chloro-, bromo- lub jodowodorowy, lub ograniczony kwas sulfonowy, jak p-toluenosulfonowy lub metano- lub etanosulfpnowy. 55 Mozna równiez alkohol o wzorze 6, w którym T ozna¬ cza atom tlenu, ewentualnie w postaci soli, np. soli sodo¬ wej lub potasowej, poddac reakcji z aktywowanym kwasem karboksylowym. Jako aktywowane kwasy karboksylowe nalezy wymienic zwlaszcza bezwodniki, przede wszystkim 60 mieszane bezwodniki kwasowe, jak azydek kwasowy lub halogenek kwasowy lub aktywowany ester, jak ester cyjano¬ metylowy, ester karboksymetylowy, tioester p-nitrofenylowy, ester p-nitrofenylowy, ester 2,4,5-trójchlorofenylowy, ester pieciochlorofenylowy, ester N-hydroksysukcynimidowy, es- 65 ter N-hydroksyftalimidowy, ester 8-hydroksychinolinowy,.131 613 13 ester 2rhydroksy-l,2-dwuwodoro-l-karboetoksychinolino- wy, ester N-hydroksypiperydynowy lub enoloester utwa- rzony z N-etylo-5-fenyloizoks^olino-3'-sulfonianem. Akty¬ wowane estry mozna równiez otrzymywac przez reakcje 2 karbodwuimidem, stosuje sie dodatek N-hydroksysuk- cynimidu lub nie podstawionego lub podstawionego, np. atomem chlorowca, rodnikiem metylowym lub grupa me- toksylowa 1-hydroksybenzotriazolu lub 3-hydroksy-4-keto- -3,4-dwuwodorobenzo[d]-l,2,3-triazyny.Wyzej opisany proces przeprowadza sie znanymi meto¬ dami, w nieobecnosci lub korzystnie w obecnosci rozcien¬ czalników lub rozpuszczalników, jezeli to jest konieczne- podczas chlodzenia lub ogrzewania, pod zwiekszonym cisnieniem i/lub w atmosferze gazu obojetnego, takiego jak azot Przy tym, uwzgledniajac wszystkie podstawniki znajdu¬ jace sie w czasteczce, zwlaszcza obecnosc latwo hydroli- zujacych rodników 0-acylowych, nalezy stosowac szczegól¬ nie chroniace warunki reakcji, jak krótki czas reakcji, stosowanie lagodnych srodków kwasowych lub zasado¬ wych w niskim stezeniu, stechiometryczne stosunki iloscio¬ we, odpowiednio dobrane katalizatory, rozpuszczalniki, temperature i/lub cisnienie.Zwiazki o wzorze 1 stosuje sie do wytwarzania prepara¬ tów farmaceutycznych. Sa to preparaty, które nadaja sie do doustnego, donosowego lub doodbytniczego, jak rów¬ niez pozajelitowego podawania cieplokrwistym i które zawieraja substancje czynna sama lub z nosnikiem stoso¬ wanym w farmacji. Dawkowanie substancji czynnej za¬ lezy od gatunku zwierzecia cieplokrwistego, wieku i indy¬ widualnego stanu, jak równiez od sposobu podania.Nowe preparaty farmaceutycczne zawieraja okolo 10% do okolo 95%, korzystnie od okolo 20% do okolo 90% substancji czynnej. Preparaty farmaceutyczne moga miec np. postac dawek jednostkowych, jak drazetki, tabletki, kapsulki, czopki lub ampulki.Preparaty farmaceutyczne sporzadza sie ogólnie znany, mi sposobami, np. przez konwencjonalne mieszanie, gra¬ nulowanie, drazetkowanie, rozpuszczanie lub liofilizo¬ wanie. Oprócz wyzej podanych sposobów podawania mozna rpwniez otrzymywac preparaty farmaceutyczne zwlaszcza do podawania doustnego tak, ze substancje czynna laczy sie ze stalymi nosnikami, otrzymana miesza¬ nine ewentualnie granuluje, a mieszanine lub granulat* jezeli to jest pozadane lub konieczne, po dodaniu odpo¬ wiednich substancji pomocniczych przetwarza w tabletki lub rdzenie drazetek. Mozna je przy tym wbudowac w two¬ rzywo sztuczne, które oddaje skladnik czynny w sposób dozowany lub z którego w sposób dozowany ten czynnik dyfunduje.Odpowiednimi nosnikami sa zwlaszcza wypelniacze, iak cukier, np. laktoza, sacharoza, mannit lub sorbit, pre¬ paraty^ celulozy i/lub fosforan wapnia, np. fosforan trójwapniowy lub wodorofosforan wapniowy, dalej srodki wiazace, jak klajster ze skrobi np. kukurydzianej, pszennej, ryzowej lub ziemniaczanej, zelatyna, tragant, metylocelu¬ loza, hydroksypropylo-metyloceluloza, karboksymetyloce- luloza sodowa i/lub poliwinylopirolidon i/lub, jezeli to je&t pozadane, srodki zwiekszajace objetosc, jak wyzej wy¬ mienione skrobie, dalej skrobia karboksymetylowa, po¬ przecznie sieciowany poliwinylopirolidon, agar, kwas algi¬ nowy lub jego sól, jak alginian sodu.Srodkami pomocniczymi sa przede wszystkim srodki regulujace plynnosc i srodki smarne, np. krzemionka, talk* kwas stearynowy lub jego sole, jak stearynian magne- 14 zu lub wapnia i/lub glikol polietylenowy. Rdzenie draze¬ tek powleka sie odpowiednimi powlokami, ewentualnie odpornymi na sok zoladkowy, przy czym stosuje sie miedzy innymi stezone roztwory cukru, ewentualnie z domieszka 5 gumy arabskiej, talku, poliwinylopirolidonu, glikolu poli¬ etylenowego i/lub dwutlenku tytanu, roztwory laku w od¬ powiednich rozpuszczalnikach organicznych lub miesza¬ ninach rozpuszczalników lub, w celu wytworzenia powlok* odpornej na sok zoladkowy, roztwory odpowiednich pre- 10 paratów celulozowych, jak ftalan acetylocelulozy lub fta- lan hydroksypropylometylocelulozy. Do tabletek lub po¬ wlok drazetek mozna dodawac barwniki lub pigmenty* np. dla identyfikacji lub oznaczenia róznych dawek sklad¬ nika czynnego. 15 Nastepujace przyklady ilustruja wyzej opisany wynala¬ zek, jednakze w zadnym przypadku nie ograniczaja one jego zakresu. Temperature podano w stopniach Celsjusza.Zwiazki o wzorze 1 nie moga byc scharakteryzowane ani temperatura topnienia ani danymi spektroskopowymi 20 jak widma NMR i IR, które nie sa odpowiednie do jedno¬ znacznego okreslenia tych zwiazków.Po dokladnego scharakteryzowania tych zwiazków nie jest takze odpowiednie podanie wartosci Rf, ze wzgledu na dominujaca nature, cze&ilipidowej. 25 Jednakze budowa zwjazjtciw wyjsciowych jest doklad¬ nie znana (por. opis patentowy RFN DOS nr 2 655 500 stosowane w tym wypadku skladniki fosfolipidowe sa do¬ stepne w handlu), a polaczenie fosfolipidu i muramylopep- tydujestjednoznaczne, tak wiec sekwencja elementów w pro- 30 dukcie koncowym i jego budowa sa jednoznacznie okres¬ lone.W zwiazkach o wzorze 1 proton zwiazany poprzez atom tlenu z fosforem mozna latwo odszczepic za pomoca za¬ sady. Zazwyczaj zwiazki o wzorze 1 wystepuja w postaci 35 mieszaniny wolnych zwiazków i ich soli. Tak wiec opisane w przykladach muramylopeptydy wystepuja do okolo 40—95% jako sól sodowa. Wytwarzanie tych soli wchodzi w zakres wynalazku.Wynalazek dotyczy ogólnie takze wytwarzania soli zwiaz- 40 ków o wzorze 1 z jakimikolwiek innymi grupami twórza_ cymi sole, np. wolnymi grupami karboksylowymi, przede wszystkim stosowanych w farmacji nietoksycznych soli, np. soli z metalami lub soli amonowych.Przyklad I. Do roztworu 1,4 mmola 1,2-dwupal- 45 mitoilo-sn-glicero-3-fosforylo-etanoloaminy i 2,5 ml trój- etyloaminy w 25 ml mieszaniny chlorofprm-metanol-woda 65:25:4 wkrapla sie roztwór 2 mmoli N-tiydroksysukcyni- midowego estru N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglu- taminy w 6,5 ml dwumetyloacetamidu. Po 18 godzinach 50 mieszania w temperaturze 20°C pod zmniejszonym cisnie¬ niem odparowuje sie roztwór do okolo 15 ml; powstaje przy tym emulsja. Rozciencza sie ja woda (200 ml) i liofili- zuje. Pozostalosc dysperguje sie w 30 ml wody i wyczerpu¬ jaco dializuje wobec wody. Dializat wewnetrzny zawiera- 55 Jacy zadany produkt liofilizuje sie. N-acetylomuramylo-L- -alanylo-P-izoglutaminylo-2-(r,2'-dwupalmitoilo-sn-gficero" -3'-fosforylo)etyloamid oczyszcza sie przez chromatografie na kolumnie zawierajacej Sephadex LK-20. Mieszanina elucyjna: chloroform-metanol-kwas octowy-woda, 25:15:4:2* 60 W chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionko¬ wym zwiazek wykazuja nastepujace wartosci Rf = 0,31 (chloroform-metanol-woda, 65:25:4) lub 0,64 (chloroform- -metanol-kwas octowy-woda, 25:15:4:2).Nowy zwiazek charakteryzuje sie analitycznie w ten 65 sposób, ze ilosciowo oznacza sie jego skladniki: kwas N-131613 15 -acetylomuraminowy, kwas palmitynowy, fosforan, L- -alanine i kwas D-glutaminowy. Kwas N-acetylomurami- nowy oznacza sie spektrofotometrycznie za pomoca reakcji Morgana-Elsona, wedlug modyfikacji J.M. Ghuysena i in¬ nych (w „Methods in Enzymology", 8, 629 (1966)).Fosforan oznacza sie ilosciowo wedlug Lowry'ego i in¬ nych (J.Biol.Chem. 207, 1 (1954)). ltwas palmitynowy i aminokwasy oznacza sie iloscio¬ wo w calkowitym hydrolizacie (6n HC1, 24 godziny, 110°Q przez chromatografie gazowa lub za pomoca analizatora aminokwasów, stosujac jako standardy wewnetrzne kwas pentadekanowy lub norleucyne.Znalezione stosunki molowe, w odniesieniu do fosfo¬ ranu sa nastepujace: PCV": kwas N-acetylomuraminowy:L-alanina:kwas D- -glutaminowyikwas palmitynowy=l :0,92:0,91:0,95:2,18.Stosowany jako zwiazek wyjsciowy N-hydroksysukcyn- imidowy ester N-acetylómuramylo-L-alanylo-D-izogluta- miny mozna otrzymac np. w nastepujacy sposób: 2 mmole N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminy» 2,2 mmola N-hydroksysukcynimidu i 2,2 mmola dwucyklo- heksylokarbodwuimidu rozpuszcza sie w 6,5 ml dwume- tyloacetamidu i w cia&u 18 godzin miesza w temperaturze 20°C. Wytracony dwucykloheksylomocznik oddziela sie, a roztwór stosuje bezposrednio do kondensacji z fosfoli- pidem.Stosowana jako substancja wyjsciowa 1,2-dwupiwalo- ilb-sn-gJicero-3-fosforylo-etanoloamina jest syntetycznym preparatem dostepnym w handlu.Przyklad II. W sposób analogiczny jak w przy¬ kladzie I otrzymuje sie N-acetylo-desmetylomuramylo-L_ -alanylo-D-izoglutaminylo-2-(r,2'-dwupalmitoilo-sn-glicero- _3'-fosforylo)etyloamine, wychodzac z 1,2-dwupalmitoilo- -sn-glicero-3-fosforylo-etanoloaminy i N-hydroksysukcyni- midowego estru N-acetylb-desmetylomuramylo-L-alanylo- -D-izoglutaminy. Produkt wykazuje na zelu krzemionko¬ wym nastepujace wartosci Rf=0,29 (chloroform-metanol- -woda, 65:25:4) lub 0,65 (chloroform-metanol-kwas octowy" -wocfc, 25:15:4:2).Przyklad III. W sposób analogiczny jak w przy¬ kladzie I otrzymuje sie N-acetylo-muramylo-L-alanylo-D- .izoglutaminylo-y-oksy-metylokarbonylo-2/1\2'-dwupalmi- toilo-sn-glicero-3'-fosforylo/etyloamid, wychodzac z 1,2- dwupalmitoilo-sn-glicero-3-fosforyloetanoloaminy i N-hy- "droksysukcynimidowego estru y-karboksymetyloestru N- -acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminy.Zwiazek wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym nastepujace wartosci Rf=0,28 (chloroform-metanol-woda, 65:25:4) lub 0,68 (chloroform- -metanol-kwas octowy-woda, 25:15:4:2).Przyklad IV. W sposób analogiczny jak w przy¬ kladzie I otrzymuje sie N-acetylomuramylo-L-alanylo-D- -izoglutaminylo-L-alanylo-2-/1 ',2*-dwupalmitoilo-sn-gIicero- -3'-fosforylo/etyloamid, wychodzac z 1,2-dwupalmitoilo- -sn-glicero-3-fosforylo-etanoloaminy i N-hydroksysukcyni- midowego estru N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izogluta- minylo-L-alaniny. W chromatografii cienkowarstwowej na zelu Krzemionkowym wartosc Rf = 0,3 (w ukladzie chloroform-metanol-woda, 65:25:4).Przyklad V. W sposób analogiczny jak w przykla¬ dzie I otrzymuje sie N-acetylodesmetylomuramylo-L-ala- nylo-D-izoglutaminylo-2-(l\T -0-heksadecylo-sn-glicero-3'- JFosforylo)etyloamid wychodzac' z N-hydroksysukcynimido- wego estru 1,2-0 heksadecylideno-sn-glicero-3-fosforylo-eta- noloaminy. W chromatografii cienkowarstwowej na zelu 16 krzemionkowym wartosc Rf = 0,43 (chloroform-metanol- -woda, 65:25:4).Stosowana jako substancja wyjsciowa 1,2-0-dwuheksa- decylo-sn-glicero-3-fosforylo-etanoloamina jest produktem 5 syntetycznym dostepnym w handlu.Przyklad VI. W sposób analogiczny jak w przy¬ kladzie I otrzymuje sie N-acetylodesmetylomuramylo-L- "alanylo-D-izoglutaminylo-2-(3'-palmitoilo-nuglicero-r- fosforylo)etyloamid, wychodzac z 3-palmitoilo-rac-glicero- 10 -1-fosforylo-etanoloaminy i N-hydroksysukcynimidowego estru N-acetylo-desmetylomuramylo-L-alanylo-D-izogluta- miny. W chromatografii cienkowarstwowej na zelu krze¬ mionkowym Rf = 0,47 (chloroform-metanol-woda, 65:25:4).Stosowana jako substancja wyjsciowa 3-palmitoilo-rac- 15 -glicero-1-fosforylo-etanoloamina jest preparatem synte¬ tycznym dostepnym w handlu.Przyklad VII. W sposób analogiczny jak w przy¬ kladzie I otrzymuje sie N-acetylo-desmetylomuramylo-L- -alanylo-D-izoglutaminylo-2-( 1 '-palmitoilo-2'-oleoilo-sn-gli- 20 cero-3'-fosforylo)etyloamid, wychodzac z l-palmitoilo-2- -oleoilo-sn-glicero-3-fosforylo-etanoloaminy i N-hydroksy¬ sukcynimidowego estru N-acetylo-desmetylomuramylo-L- -afcmyto-D-izoglutaniiny. W chromatografii cienkowar¬ stwowej na zelu krzemionkowym wartosc Rf = 0,33 (chlo. 25 roform-metanól-woda, 65:25:4).Stosowana jako substancja wyjsciowa l-palmitoilo-2- -oleoilo-sn-glicero-3-fosforylo-etanoloamina jest prepara¬ tem syntetycznym dostepnym w handhi.Przyklad VIII. W sposób analogiczny jak w przy" kladzie I otrzymuje sie N-acetylo-desmetylomuramylo-L" -alanylo-D-izoglutaminylo-2-(r-palmitoilo-propanodiolo-3'-. -fosforylo)etyloamid, wychodzac z 1-palmitoilo-propano- diolo-3-fosforylo-etanoloaminy i N-hydroksysukcynimido wego estru N-acetylo-desmetylomuranylo-L-alanylo-D-izo 35 glutaminy.W chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemion¬ kowym wartosc Rf = 0,49 (chloroform-metanol-woda» 65:25:4).Przyklad IX. W sposób analogiczny jak w poprzed- 40 nich przykladach otrzymuje sie N-acetylomuramylo-L" -alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanynino-2-(3'-palmitoilo- -rac-glicero-r-fosforylo)-etyloamid, przez kondensacje N- acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alaniny z 3- -palmitoilo-rac-glicero-1-fosforylo-etanoloamina. 45 Rf = 0,22 (chloroform-metanol-woda, 65:25:4).Przyklad X. W sposób analogiczny jak w poprzed¬ nich przykladach otrzymuje sie pochodne N-acetylo-desme- tylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanylo-glice- rofosfolipidu, przez kondensacje N-acetylomuramylo-L- 50 -alanylo-D-izoglutaminylo-L-alaniny z nastepujacymi fos¬ folipidami : 1,2-dwupalmitoilo-sn-glicero-3-fosforylo-etano* loamina, otrzymujac produkt o Rf = 0,39 (chloroform-eta- nol-woda 65:25:4), lub 3-palmitoilo-rac-glicero-l-fosforylo- -etanoloamina, otrzymujac produkt o Rf = 0,16 (chloro- 55 form-metanol-woda, 65:25:4).Zwiazki wyjsciowe mozna otrzymac w nastepujacy spo¬ sób: A) Do roztworu 6 g (10 mmoli) a-benzylo-N-acetylo- -muramylo-L-alanylo-D-izoglutaminy i 1,75 ml (11 mmoli) *° estru benzylowego kwasu bromooctowego w 100 ml dwu- metyloformamidu wkrapla sie w ciagu 11/4 godziny, usu¬ wajac wilgoc i dobrze mieszajac, 1,87 ml (11 mmoli) N,N- -dwuizopropyloetyloaminy rozpuszczonej w 50 ml dwume- 65 tyloformamidu. Po mieszaniu W ciagu nocy w tempera-131 613 17 turze pokojowej, pod wysoka próznia uwalnia sie miesza¬ nine reakcyjna od dwumetyloformamidu, a pozostalosc zadaje 100 ml wody. Wydzielony olej szybko zestala sie i krystalizuje. Po mieszaniu w kapieli lodowej zawiesine saczy sie, otrzymane krysztaly przemywa mala iloscia wody i suszy nad pieciotlenkiem fosforu.Po ponownym zdyspergowaniu krysztalów w eterze naf¬ towym, odsaczeniu i wysuszeniu (50°) pozostaje 6,2 g (85% wydajnosci teoretycznej) bezbarwnych krysztalów o tempe- turze topnienia 195—198° [aj^0 = +1 ° (C=l,3, metanol).B) 6,5 g (8,85 mM)y-benzoksykarbonylometylowego estru a-benzylo-N-acetylo-muramylo-L-alanylo-D-izoglu- taminy w 200 ml mieszaniny metanol-woda 1:1, w obec¬ nosci 0,5 g 10% Pd/C, traktuje sie w ciagu 40 godzin (40°) wodorem. Mieszanine reakcyjna w zwykly sposób uwal¬ nia sie od katalizatora, a przesacz odparowuje do sucha.Wydzielony olej rozpuszcza sie w 75 ml Il-rz.-butanolu wysyconego woda, ekstrahuje 6 razy po 50 ml Il-rz. buta" nolu wysyconego woda i 1 raz octanem etylu. Fazy orga¬ niczne ekstrahuje sie zwrotnie woda, a polaczone fazy wodne po potraktowaniu weglem (Darco Q 60) odparowu¬ je do sucha. Pozostalosc zadaje sie 2 razy woda, odparowu¬ je i \io$iti^4Q&jQ^& i»e 4,0g (8^,% wydajnosci teor^ tycznej) bialego, liofiliizatu. ¦-, , ^/ ? [a&0= +34*44 (G -,0,8, wojflW, Q 6,1 gN a-benzylc*N-acetylo-rnuramylo-L-alanylo-D- -izoglutaminy i 3,$ g chlorowodorku estru benzylowego L-alaniny rozpuszcza sie w 30 ml dwumetyloformamidu, roztwór oziebia sie do temperatury 0° i zadaje kolejno 1.4 ml trójetyloaminy, 1,1 g N-hydroksysukcynimidu i 2.5 g dwucykloheksylokarbodwuimidu.Po 48 godzinach mieszania w temperaturze pokojowej zawiesine saczy sie, osad przemywa mala iloscia dwume¬ tyloformamidu, a przesacz pod wysoka próznia odparowuje do sucha. Pozostalosc dysperguje sie w 100 ml wody w tern" peraturze 0°, osad odsacza sie i po wysuszeniu przekrysta- lizowuje z mieszaniny metanol-woda. Otrzymuje sie 5,5 g (74% wydajnosci teoretycznej) produktu. [a]20 = +70±1° (C = 0,5, metanol).D) 3,4 g estru benzylowego a-benzylo-N-acetylo-mura- mylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alaniny, rozpuszczone¬ go w 100 ^ml mieszaninyj metanol-woda 2:1, traktuje sie w ciagu 40 godzin wodorem, w obecnosci 10% Pd-C. Od¬ sacza sie katalizator, przesacz odparowuje prawie do su¬ cha, a pozostalosc, po rozpuszczeniu w 540 ml II-rz.-buta- nolu wysyconego woda, ekstrahuje 3 razy po 40 ml Il-rz. butanolu wysyconego woda. Po zwrotnej ekstrakcji [fazy organicznej woda (3x40 ml) polaczone ekstrakty wodne odparowuje sie i liofilizuje.Otrzymuje sie 2,2 g (80% wydajnosci teoretycznej) bez¬ barwnego proszku. [afrS = +9°=bl° (C = 1,1, woda).Przyklad XI. W sposób analogiczny jak w przy¬ kladzie I otrzymuje sie nastepujace zwiazki (ustalenie war¬ tosci analitycznych jak w, przykladzie I): N-benzoilo-muramylo-L-alanylo-D^izoglutaminylo-L-alany- lo-2-(r,2'-dwupalmitoilo-sn-glicero-3'-fosforylo)-etyloamid, IR (KBR):3400 (OH, NH, H20), 2925, 2855; 1740 (C = 0), 1655 (C = 0), 1545 (C = 0), 1470,1460,1380; 1240 (P = 0), 1170, 1100, 1070, 720, 700 cm"1.N-acetylo-muramylo-L-a-aminobutyrylo-D-izoglutaminylo- -2-(r-2,-dwupalmitoilo-sn-glicero-3'-fosforylo)-etyloamid, Rf = 0,32 (chloroform-metanol-woda, 65:25:4X kwas L- -a-aminomaslowy:kwas D-glutaminowy:L-alanina:kwas pal¬ mitynowy:ff0,9:1:0,8:1,8;i -,<. 18 N-propionylo-normuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L- -alanylo-2-(l\2'-dwupalmitoilo-sn-glicero-3Mbsforylo)-ety- loamid, Rf = 0,16 (chloroform-metanol-woda, 65:25:4).Przyklad XII. Roztwór 1,5 mola N-hydroksysukcy- 5 nimidowego estru N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglu- taminylo-L-alaniny w 6 ml dwumetyloacetamidu wkrap- la sie do roztworu 1 mmola 2-(l\2'-dwupalmitoilo-sn-gli- cero-3'-fosforylo)-etyloamidu i 3,5 mmola N-etylomorfoliny w 25 ml mieszaniny chloroform-metanol-woda 65:25:4 10 w temperaturze pokojowej. Calosc miesza sie w ciagu 8 go¬ dzin w temperaturze pokojowej (okolo 22°), po czym do mieszaniny reakcyjnej dodaje sie 130 ml wody.Po usunieciu organicznych rozpuszczalników pod zmniej¬ szonym cisnieniem, otrzymany wodny roztwór, który 15 moze jeszcze zawierac nieco metanolu, saczy sie przez mi- liporowaty filtr teflonowy, (5 #m). Mieszajac, przesacz poddaje sie dializie w komorze ultfafiltracyjnej Amicon przez przepone Amicon YM10, kolejno wobec 400 ml wody^ 200 ml wodnego roztworu 0,1 m fosforan sodowy (bufor) — 20 0,1 m chlorek sodowy (pH=7) oraz 830 ml wody w proce¬ sie diafiltracji. Dializat wewnetrzny saczy sie przez filtr rmlipotowaty (0,45 i*m) i liofilizuje, otrzymujac N-acetylo- -litóarrrjfl^ - ;dwii£iitótoflo^^ wystepu- 85 J#£y trzewsiznie lub calkowicie w postaci soli sodowej.Analiza produktu (wartosci obliczono dla 100% soli sodowej zawierajacej trzy mole wody na mol soli.).C59H114N6022P Na (1315, 55) obliczono: C 53,59 H 8,75 N 6,40 P 2,36 Na 1,75 znaleziono: C 53,89 H 8,63 N 6,40 P 2,22 Na 1,58 Przyklad XIII. 0,386 g (0,75 mmola) N-acetylomu- ramylo-L-alanylo-D-izoglutaminy • 1,2 H20 i 0,172 g (1,5 mmola) N-hydroksysukcynimidu rozpuszcza sie w 3 ml 35 absolutnego dwumetyloacetamidu i w temperaturze 0° do¬ daje sie 0,232 g (1,13 mmola) dwucykloheksylokarbodwui¬ midu. Mieszanine miesza sie w ciagu 8 godzin w tej samej temperaturze (aktywowanie wstepne), po czym dodaje sie roztwór skladajacy sie z 0,382 g (0,5 mmola) L-alanino-2- 40 -(l\2'-dwupalmitoilo-sn-glicero-3'-fosforylo)etyioamidu i 0,07 ml (0,5 mmola) trójetyloaminy w 12 ml mieszaniny chloroform-metanol-woda- 65:25:4 (objetosciowo). Calosc miesza sie w ciagu 24 godzin w temperaturze pokojowej (okolo 22°), po czym dodaje sie 60 ml octanu etylu, po krót- l5 kim mieszaniu w kapieli lodowej odsacza sie substancje nierozpuszczalne, a do przesaczu dodaje sie 65 ml wody* Po odparowaniu latwolotnych substancji pod próznia pozostaly wodny roztwór, mieszajac, poddaje sie dializie w komorze ultrafiltracyjnej Amicon przez przepone Ami" 10 eon YM10, kolejno wobec 200 ml wody, 100 ml roztworu 0,1 m fosforan sodowy (bufor) — 0,1 m chlorek sodowy (pH=7) oraz 425 ml wody. Dializat wewnetrzny saczy sie przez filtr miliporowaty (0,45 pxri) i liofilizuje. Otrzymuje sie 0,546 g (83 % wydajnosci teoretycznej) N-acetylomuranylo- i5 -L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanino-2(r,2'-dwupalmito- ilo-sn-glicero-3'-fosforylo)-etyloamidu w postaci soli so¬ dowej zawierajacej 3 mole wody.Rf = 0,45 (acetonitryl-woda, 3:1) Dane fizyczne dla tego zwiazku sa takie same jak dla sub- l0 stancji otrzymanej w przykladzie XII.Zwiazek wyjsciowy otrzymuje sie w nastepujacy sposób: Do ochlodzonego do temperatury 0° roztworu 0,500 g (0,0579 mmola) III-rz.-butyloksykarbonylo-L-alanino-2- :(r,2'-dwupalmitoilo-sn-glicero-3'-fosforylo)-etyloamidu w 8 -5 ml chlorku metylenu w trakcie mieszania dodaje sie 2 ml131613 19 kwasu trójfluorooctowego. Calosc miesza sie w ciagu 1 go¬ dziny w tej samej temperaturze, po czym odparowuje latwo- lotne substancje w temperaturze pokojowej.Galaretowata pozostalosc rozprowadza sie w chlorku metylenu i rozpuszczalnik ponownie odparowuje sie (3- -krotnie) usuwajac nadmiar kwasu trójfluorooctowego.Po wysuszeniu nad azbestem sodowanym (drobnoziar¬ nisty, art. 1567, Merck) pod wysoka próznia powstala piane rozciera sie na zimno dwukrotnie z 5 ml wody i mie¬ szaniny woda-dioksan 5:1. Osad za kazdym razem odwi¬ rowuje sie.Osad rozprowadza sie w mieszaninie woda-dioksan 1:1 i otrzymana zawiesine podaje sie na nucze /filtr: 2892 Schleicher und Schull) przemywajac mieszanine wodna o wzrastajacym stezeniu dioksanu.Po dwukrotnym przemyciu eterem etylowym bezbarwna pozostalosc suszy sie nad azbestem sodowanym pod wy¬ soka próznia. Otrzymuje sie 0,39 g (88% wydajnosci teo¬ retycznej) L-alanino-2-(l',2'-dwupalmitoilo-sn-glicero-3'- -fosforylo)-etyloamidu o temperaturze rozkladu 140—141 °# Rf = 0,47 (chloroform-metanol-woda 70:30:5). 0,692 g (1 mmol) 2-(r,2'-dwupalmitoilo)-sn-glicero-3'- -fosforylo)-etyloaminy (produkt handlowy o nazwie Kep- halin) dysperguje sie w 15 ml mieszaniny chloroform-eta- nol-woda 65:25:4 i dodaje sie 0,14 ml (1,05 mmola) trój- etyloaminy. Zawiesine krótko ogrzewa sie w temperaturze okolo 40°, otrzymujac roztwór. Po ochlodzeniu do tempe¬ ratury pokojowej dodaje sie 0,372 g (1,3 mmola) sukcyimi- dowego estru Ill-rz. butoksykarbonylo-L-alaniny i calosc pozostawia sie na 6 godzin. Roztwór reakcyjny odparowu¬ je sie do sucha, pozostalosc rozprowadza sie w 200 ml octanu etylu na zimno (stosujac kapiel lodowa) i trzykrot¬ nie ekstrahuje sie 5 ml mieszaniny 0,5 m wodorosiarczan potasowy — 0,5 m siarczan potasowy (pH = 1,5).Warstwe octanu etylu przemywa sie woda i nasyconym roztworem chlorku potasowego i suszy nad siarczanem sodowym. Po odparowaniu rozpuszczalnika pozostaly sypki proszek (0,8 g) oczyszcza sie metoda chromatografii na zelu krzemionkowym 60 (Merck, uziarnienie 0,063— —0,200 mm) stosujac uklad chloroform-metanol 95:5 do 70:30 (frakcje 3 ml).Frakcje zawierajace produkt laczy sie i odparowuje roz¬ puszczalnik. Otrzymuje sie 0,65 g (75% wydajnosci teore¬ tycznej) Ill-rz. butoksykarbonylo-L-alanino-2-(r,2'-dwupal- mitoilo-sn-glicero-3'-fosforylo) etyloamidu w postaci bez¬ barwnego proszku. [alg* = +10±1 ° (C = 0,974, chloroform) Rf = 0,42 (chloroform-metanol-woda 70:30:5) Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych muramylopeptydów o ogólnym wzorze 1, w którym X oznacza grupe karbony- lowa lub karbonyloksylowa, Ri oznacza rodnik arylowy lub rodnik alkilowy ewentualnie podstawiony wolna, zes¬ tryfikowana lub zeteryfikowana grupa hydroksylowa lub merkapto albo wolna lub zestryfikowana grupa karboksy¬ lowa, R2, R3, R4 i Ró oznaczaja atom wodoru lub nizszy rodnik alkilowy, R5 oznacza atom wodoru, nizszy rodnik alkilowy, rodnik cykloalkilowy, cykloalkilo(nizszy)alkilowy, arylowy lub aralkilowy, heterocykliczny lub heterocyklicz- no(nizszy)alkilowy o 5 lub 6 czlonach i jednym lub dwóch atomach azotu w pierscieniu, ewentualnie skondensowany z rodnikiem fenylowym, wolny, zestryfikowany lub zete- ryfikowany nizszy rodnik hydroksyalkilowy, wolny, zes¬ tryfikowany lub zeteryfikowany nizszy rodnik merkaptoal- 20 kilowy albo wolny, zalkilowany lub zacylowany nizszy rod¬ nik aminoalkilowy, albo R4 i R5 lacznie oznaczaja rodnik alkilenowy o 3—4 atomach wegla, R7 oznacza atom wo¬ doru lub ewentualnie zestryfikowana lub zamidowana 5 grupe karboksylowa i jeden z podstawników Ax i A2 ozna¬ cza rodnik o wzorze 2 lub 2a, w których to wzorach T i Ti niezaleznie oznaczaja grupe HN lub atom tlenu, Y oznacza ewentualnie podstawiony wolna, zeteryfikowana lub zes¬ tryfikowana grupa hydroksylowa, nizsza hydroksyalkilowa, 10 merkapto lub nizsza merkaptoalkilowa, wolna, zalkilowana lub zacylowana nizsza grupa aminoalkilowa, grupa karbo" namidowa, alkilowa, cykloalkilowa o 5—6 atomach wegla, arylowa lub aralkilowa,nizszy rodnik alkilenowy, który mo¬ ze byc przerwany jedna lub dwiema grupami karbonyloksy- 15 iowymi i/lub karbonyloaminowymi, Y± i Y2 niezaleznie oznaczaja ewentualnie podstawiony wolna, zeteryfikowana lub zestryfikowana grupa hydroksylowa, nizsza hydroksyal- kilowa, merkapto lub nizsza merkaptoalkilowa, wolna^ zalkilowana lub zacylowana nizsza grupa aminoalkilowa, 20 grupa karbonamidowa, alkilowa, cykloalkilowa o 5—6 ato¬ mach wegla, arylowa lub aralkilowa nizszy rodnik alkile¬ nowy, który albo w przypadku Yi albo w przypadku [Y2 moze byc równiez przerwany grupa karbonyloksylowa lub karbonyloaminowa, W oznacza atom wodoru, a Z oznacza 25 rodnik 1,2-dwuhydroksyetylowy lub 2-hydroksyetylowy, w którym co najmniej jedna grupa hydroksylowa jest zes¬ tryfikowana ewentualnie nienasyconym, dlugolancuchowym alifatycznym kwasem karboksylowym lub zeteryfikowana ewentualnie nienasyconym, dlugolancuchowym alifatycz- 30 nym alkoholem, albo W i Z oznaczaja grupe hydroksyme- tylowa zestryfikowana ewentualnie nienasyconym, dlugo¬ lancuchowym alifatycznym kwasem karboksylowym lub zeteryfikowana ewentualnie nienasyconym, dlugolancu¬ chowym alifatycznym alkoholem, a drugi z podstawników 35 Ai i A2 oznacza wolna lub zeteryfikowana grupe hydroksy¬ lowa, aminowa, nizsza alkiloaminowa lub nizsza karbo- namidoalkiloaminowa, oraz ich soli, znamienny tym, ze zwiazek o ogólnym wzorze 4, w którym X, Rl5 R2, R3 R4, R5, R5 i R7 rnaja wyzej pDdans zniczenie, R9, Ri0 40 Rn oznaczaja atomy wodoru i jedna z grup -COA°i i -COA2 oznacza grupe karboksylowa, jej aktywowana pochodna lub grupe o wzorze 5, w którym T i Yx maja wyzej podane znaczenie, a Mx oznacza grupe karboksylowa lub jej akty¬ wowana pochodna, a druga z grup -COA°! i COA°2 ozna- 45 cza zestryfikowana grupe karboksylowa, karbamoilowa, nizsza N-alkilokarbamoilowa lub nizsza N-aminokarbo- nyloalkilo-karbamoilowa, kondensuje sie ze zwiazkiem o ogólnym wzorze 6, w którym W i Z maja wyzej podane znaczenie, a T2 i Y3 maja znaczenie takie jak wyzej podane 50 dla symbolu T wzglednie Y, gdy grupa -COA\ lub -COA°2 oznacza grupe karboksylowa lub jej aktywowana pochod¬ na, albo T2 i Y3 maja znaczenie takie jak wyzej podane dla symbolu TL wzglednie Y2, gdy grupa -COA0! lub -COA°2 oznacza wyzej okreslona grupe o wzorze 5, albo z aktywo- 55 wana pochodna tego zwiazku, i otrzymany zwiazek o wzo¬ rze 1 ewentualnie przeprowadza sie w sól. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze zwiazek o wzorze 4, w którym R* oznacza nizszy rodnik alkilowy o 3 atomach wegla lub rodnik fenylowy, R3 oznacza nizszy 60 rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, R5 oznacza nizszy rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla ewentualnie pod¬ stawiony grupa hydroksylowa, metoksylowa, merkapto lub metylomerkapto, rodnik fenylowy lub fenylometylowy, albo R4 i R5 lacznie oznaczaja rodnik trójmetylenowy, «5 a Yi oznacza rodnik alkilenowy o 1—3 atomach Weglal31 Ci3 21 podstawiony nizszym rodnikiem alkilowym o 1—3 ato¬ mach wegla ewentualnie podstawionym grupa hydroksy Iowa, nizsza alkoksylowa, merkapto lub nizsza alkilomer. kapto albo podstawiony rodnikiem fenylowym lub niz¬ szym fenyloalkilowym, poddaje sie reakcji ze zwiazkiem o wzorze 6, w którym Y3 oznacza rodnik alkilenowy o 2—3 atomach wegla lub grupe o wzorze -Yi-CO-Ti-Y^ w którym Yx i Y2 niezaleznie oznaczaja nizszy rodnik alkile¬ nowy o 1—3 atomach wegla podstawiony nizszym rod¬ nikiem alkilowym o 1—3 atomach wegla ewentualnie pod¬ stawionym grupa hydroksylowa, nizsza alkoksylowa, mer¬ kapto lub nizsza alkilomerkapto albo podstawiony rod¬ nikiem fenylowym lub nizszym fenyloalkilowym albo za¬ wierajacym jeden lub dwa atomy azotu rodnikiem hete¬ rocyklicznym lub nizszym heterocyklicznoalkilowym o 5—6 czlonach w pierscieniu i 1—3 atomach wegla w niz¬ szym rodniku alkilowym, gdy w substracie o wzorze 4 jedna z grup -COA0! i -COA°2 oznacza grupe karboksy¬ lowa lub jej aktywowana pochodna, albo Y3 oznacza nizszy rodnik alkilenowy o 1—3. atomach wegla podstawiony nizszym rodnikiem alkilowym o 1—3 atomach wegla ewen¬ tualnie podstawionym grupa hydroksylowa, nizsza alko¬ ksylowa, merkapto lub nizsza alkilomerkapto albo pod¬ stawiony rodnikiem fenylowym lub nizszym fenyloalki¬ lowym albo zawierajacym jeden lub dwa atomy azotu rod¬ nikiem heterocyklicznym lub nizszym heterocyklicznoal¬ kilowym o 5—6 czlonach w pierscieniu i 1—3 atomach wegla w nizszym rodniku alkilowym, gdy jedna z grup -COA°i i -COA°2 oznacza grupe o wzorze 5, a Z oznacza grupe 1,2-dwuhydroksyetylowa lub 2-hydroksyetylowa, w której co najmniej jedna grupa hydroksylowa jest zestry- fikowana ewentualnie jedno- lub dwukrotnie nienasyco¬ nym alifatycznym kwasem karboksylowym o 16—20 ato¬ mach wegla lub zeteryfikowana ewentualnie jedno- lub dwukrotnie nienasyconym alifatycznym alkoholem o 12— 18 atomach wegla. 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze zwiazek o wzorze 4, w którym Rx i R3 oznaczaja rodniki metylo¬ we, R5 oznacza rodnik alkilowy o 1—4 atomach wegla grupa -COA0! oznacza grupe karbamoilowa, a Yi oznacza 22 grupe o wzorze -(Ri2-)CH-, w którym R12 oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, podda¬ je sie reakcji ze zwiazkiem o wzorze 6, w którym Y3 ozna¬ cza grupe o wzorze -/R12-/CH-C/=0/-NH-CH2-CH2-, 5 w którym R12 oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, gdy grupa -COA°i oznacza grupe karboksylowa lub jej aktywowana pochodna, albo Y3 oznacza rodnik etylenowy, gdy grupa -COA°2 oznacza gru¬ pe o wzorze 5, a Z oznacza grupe 1,2-dwuhydroksyetylo. io wa, w której obie grupy hydroksylowe sa zestryfikowane kwasem alkano- wzglednie alkenokarboksylowym o 16—20 atomach wegla. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze N-acety- lomuramylo-L-alanylo-D-izoglutamine lub jej aktywowana 15 pochodna kwasowa poddaje sie reakcji z L-alanylo-2-(r, 2'-dwupalmitoilo-sn-glicero-3'-fosforylo)-etyloamidem. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze N-ace- tylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanine lub jej aktywowana pochodna kwasowa poddaje sie reakcji 20 z 2-(l\2'-dwupalmitoilo-sn-glicero-3'-fosforylo)-etyloamina. 6^ Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako sub- strat stosuje sie zwiazek o wzorze 4, w którym ugrupo¬ wanie kwasu karboksylowego ma postac ugrupowania bezwodnika, azydku, aktywowanego amidu lub aktywo- 2* wanego estru. ; 7. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze stosuje sie zwiazek o wzorze 4, w którym ugrupowanie majace pos¬ tac bezwodnika kwasowego jest ugrupowaniem bezwod¬ nika z nizszym estrem alkilowym kwasu weglowego, ugru- 30 powanie majace postac amidu kwasowego jest ugrupowa¬ niem imidazolidu lub izooksazolidu, a ugrupowanie ma" jace postac aktywowanego estru jest ugrupowaniem estru cyjano- lub karboksymetylowego, tioestru acetyloamino- etylowego, estru p-nitro- lub 2,4,5-trójchlorofenylowego, 35 N-hydroksysukcynimidowego, N-hydroksyftalimidowego lub N-hydroksypiperydynowego, estru 8-hydroksychino. linowego, tioestru metoksyetylowego albo estru otrzyma¬ nego przez reakcje z karbodwuimidem z dodatkiem N- -hydroksysukcynimidu lub 1-hydroksybenzotriazolu lub 40 3-hydroksy-4-keto-3,4-dwuwodorobenzo[d]-l ,2,3-triazyny.131 613 COAi R7 CON-CH-CON-CH-CH^H- COA2 i I R4 Re . ¦¦ Wiór 1 9 vf T-Y-O-P-OCH . .'i j_ OH Z Wiór 2 ¦ O W' .T-Y^CO-TrYe-O-P-O-CH OH Z Wzór 2a -Y-COO-Y,- -YfCONH-Yr WiOr 3 b Wiór 3a CH^Rn O R*Q OR 10 R3-RH R.N-K-R, 2Rs COA° R7 C0N-CH-C0N-CH-CH2CH-C0A2 I i R4 R^ Wzór 4 -CO-T-^-Mt Wzór 5 o w I H-TL-Y.-O-P-O-CH OH Z Wzór 6 LDD Z-d 2, z. 256/1400/86/3, n. 85+20 egz.Cena 130 zl PL PL PL PL PL PL PL PL PL