Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych lipofilowych muramylopeptydów o ogólnym wzorze 1, w którym X oznacza grupe karbonylowa lub karbonyloksylowa, Rj oznacza rodnik alkilowy lub arylowy, R2, R4 i R« oznaczaja atom wodoru lub nizszy rodnik alkilowy, R8 ozna¬ cza atom wodoru lub nizszy rodnik alkilowy, R5 oznacza atom wodoru, nizszy rodnik alkilowy, wol¬ ny, zeteryfikowany lub zestryfikowany nizszy rod¬ nik hydroksyalkilowy, wolny, zeteryfikowany lub zestryfikowany nizszy rodnik merkapto alkilowy, rodnik amino/nizszy/alkilowy, cykloalkilowy, cy- kloalkilo/nizszy/alkilowy, rodnik arylowy lub aral- kilowy, rodnik heterocykliczny lub heterocyklicz- no-/nizszy/alkilowy, o 5 lub 6 czlonach i jednym lub dwóch atomach azotu w pierscieniu, albo R4 i R5 lacznie oznaczaja rodnik alkilenowy o 3—4 atomach wegla, R7 oznacza atom wodoru lub ewen¬ tualnie zestryfikowana lub zamidowana grupe karboksylowa, a jeden z podstawników A± i A2 oznacza rodnik o wzorze 2, gdzie T oznacza -NH lub -O, Y oznacza ewentualnie podstawiony wolna, zeteryfikowana lub zestryfikowana grupe hydrok¬ sylowa, nizsza hydroksyalkilowa, merkapto lub nizsza merkaptoalkilowa, nizsza grupe aminoalkilo- wa, karbonamidowa, alkilowa, cykloalkilowa o 5—6 atomach wegla, arylówa lub aralkilowa rodnik alkilenowy, który moze byc przerwany jedna "lub dwiema grupami oksykarbonylowymi i/lub aminokarbonylowymi, W oznacza atom wo¬ lt 15 doru a Z grupe l,2^dwuhydroksyetylowa lub 2-hy- droksyetylowa, w której co najmniej jedna grupa hydroksylowa jest zestryfikowana ewentualnie nie¬ nasyconym dlugolancuchowym, alifatycznym kwa¬ sem karboksylowym lub zeteryfikowana ewentual¬ nie nienasyconym, dlugolancuchowym alifatycz¬ nym alkoholem, albo W i Z niezaleznie oznaczaja grupe hydroksymetylowa zestryfikowana ewentual¬ nie nienasyconym, dlugolancuchowym alifatycznym kwasem karboksylowym lub zeteryfikowana ewen¬ tualnie nienasyconym, dlugolancuchowym alifatycz¬ nym alkoholem, a drugi z podstawników A4 i A2 oznacza wolna lub zeteryfikowana ^rupe hydroksy¬ lowa, aminowa, nizsza alkiloaminowa" lub karbona- mido/nizsza/alkiloaminowa, oraz ich soli. Zwiazki te wykazuja dzialanie stymulujace odpornosc.Rodnikiem alkilowym jest prostblancuchowy lub rozgaleziony, w dowolnym miejscu przylaczony rodnik alkilowy' zawierajacy do 18 atomów wegla, jednakze przede wszystkim nizszy rodnik alkilowy.Podstawnikami rodników alkilowych sa przede wszystkim wolne lub funkcyjnie przeksztalcone grupy hydroksylowe lub merkapto, jak zeteryfi- kowane lub zestryfikowane grupy hydroksylowe lub merkapto, np. nizsze grupy alkoksylowe lub nizsze alkilomerkapto lub atomy chlorowca albo wolne lub funkcyjnie przeksztalcone grupy karbo¬ ksylowe, jak karbonylo/nizsze/alkoksylowe lub karbamylowe. Przy tym podstawiony rodnik alki¬ lowy, jak nizszy rodnik alkilowy, moze miec jeden, 127 4813 dwa lub wiecej takich samych lub róznych pod¬ stawników, zwlaszcza wolnych grup wodorotleno¬ wych lub atomów chlorowca.Rodnikami arylowymi sa zwlaszcza jedno- pierscieniowe, jak równiez dwupierscieniowe rodni¬ ki arylowe, przede wszystkim fenylowy, lecz rów¬ niez naftylowy. Moga byc one ewentualnie jedno- dwu- lub wielokrotnie podstawione, np. nizszymi grupami alkilowymi, wolnymi zestryfikowanymi lub zeteryfikowany grupami hydroksylowymi, np. nizsze grupa alkoksylowa, nizsza alkilenodioksy- lowa, lub atomami chlorowca i/lub grupami trój- fluorometylowymi.Rodnikiem aralkilowym jest zwlaszcza nizszy arylo-alkilowy, gdzie airyl ma wyzej podane zna¬ czenie. Rodnik arylo/nizszy/-alkilowy jest przede wszystkim rodnikiem benzylowym lub fenyloetylo- wym, których pierscien fenylowy moze byc jedno-, dwu- lub wielokrotnie podstawiony.Rodniki aralkilowe moga byc w pierscieniu aro¬ matycznym ewentualnie jedno-, dwu- lub wielo¬ krotnie podstawione, np. nizszymi rodnikami alki¬ lowymi, wolnymi, zeteryfikowanymi lub zestryfi¬ kowanymi grupami wodorotlenowymi lub merkap- to, np. nizszymi grupami alkoksylowymi lub niz¬ szymi alikilenodioksylowymi, jak równiez nizszymi grupami alkilomerkapto lub trójfluorometylowymi- d/lub atomami chlorowca.Rodnikiem cykloalkilowym jest zwlaszcza rod- niR cykloalkilowy o 5 do 6 atomach wegla, jak cyklopentylowy lub cykloheksylowy, a rodnikiem cykloalkilo-/nizszym/alkilowym zwlaszcza taki, w którym rodnik cykloalkilowy ma 5jio 6 atomów * wegla, a nizszy rodnik alkilowy jest przede wszyst¬ kim rodnikiem metylowym lub etylowym.Rodnikiem heterocyklicznym jest zwlaszcza rod¬ nik 5- lub 6-czlonowego zwiazku heterocykliczne¬ go, majacego w pierscieniu jeden lub dwa atomy azotu. Moze on byc nienasycony lub nasycony i skondensowany, np. z rodnikiem fenylowym.Jako takie mozna wymienic np. rodnik pirolilo- wy, indolilowy, pirydylowy lub imidazolilowy.W rodniku heterocyklicznym^(nizszym)alkilowym rodnik heterocykliczny ma wyzej podane znacze¬ nie, a^ nizszym rodnikiem alkilowym jest przede wszystkim metylowy lub etylowy.Rodnik alkilenowy, jaki moga tworzyc rodniki Ri i R5, jest korzyslaiie niepodstawiony, a przede wszystkim jest to rodnik trójmetylenowy.Ewentualnie zestryfikowana lub zamidowana grupa karboksylowa jest przede wszystkim sama grupa karboksylowa lub grupa karboksylowa ze¬ stryfikowana nizszym alkanolem albo takze grupa karbamylowa, niepodstawiona przy atomie azotu albo jedno- lub dwupodstawiona rodnikami alki¬ lowymi, zwlaszcza nizszymi alkilowymi, arylowy¬ mi, zwlaszcza lenylowymi lub aralkilowymi, jak benzylowymi. Grupy karbamylowe moga miec równiez podstawnik alkilenowy, jak rodnik czte¬ ro- lub pieciometylenowy.Jako zeteryfikowane lub zestryfikowane grupy hydroksylowe lub merkapto nalezy wymienic gru¬ py takie, jak nizsza alkoksylowa, nizsza acyloksy- lowa, np. nizsza atkanokarbonylóksylowa lub ato¬ my chlorowców, nizsza alkilomerkapto lub nizsza n 48i 4 arylomerkapto, np. nizsza alkanokarbonylomer- kapto.Jako funkcyjnie przeksztalcone rodniki amino/ nizszo/alkilowe nalezy wymienic zwlaszcza jedno- I lub dwu-/nizsze/alkiloamino/nizsze/alkilowe, lub acylowane amino/nizsze/alkilowe, jak metyloami¬ no-, etyloamino-, dwumetyloamino-, dwuetyloami- no-, alkanokarbonyloamino-, np. /nizsze/alkanokar- bonyloamino-/nizsze/alkilowe.Grupa karbonamido(nizsza)alkiloaminowa jest przede wszystkim l-karbonamido(nizsza)alkiloami- nowa, np. glicyloaminowa, alanyloaminowa, wali- loaminowa lub izoleucyloaminowa.Rodnikiem alkilenowym Y jest zwlaszcza niz- 15 szy rodnik alkilenowy, korzystnie o 2 lub 3 ato¬ mach wegla. Rodnikiem alkilenowym Y moze byc równiez nizszy rodnik alkilenowy przerwany grupa oksykarbonyIowa lub N-Rs-karbonamidowa, a zwlaszcza rodnik o wzorze 3a, 3b, 3c lub 3d, gdzie jg jednym z rodników Yt i Y2 moze byc ewentual¬ nie podstawiony nizszy rodnik alkilenowy, a dru¬ gim ewentualnie podstawiony nizszy rodnik alki¬ lenowy, który moze byc przerwany grupa oksykar- bonylowa lub N-Rg-karbonamidowa, a Yt i Ya 2g lacznie maja wiecej niz 2 atomy wegla, a R8. jest atomem wodoru lub nizszym rodnikiem alkilowym, jako podstawniki rodników Yj i Yt nalezy wymie¬ nic uwlaszcza wolne lub funkcyjnie przeksztalcone grupy hydroksylowe lub nizsze hydroksyalkilowe, ^ wolne lub funkcyjnie przeksztalcone grupy mer¬ kapto, wolne lub jedno- lub dWualkilowane (niz¬ szym rodnikiem alkilowym), lub acylowane grupy nizsze amino^alkilowe, karbonamidowe, alkilowe, cykloalkilowe o 5—6 atomach wegla, arylowe lub. aralkilowe, przy czym pojecia ogólne maja wyzej podane znaczenie.Dlugolancuchowym alifatycznym kwasem karbo- ksylowym jest zwlaszcza kwas o 12—90 atomach wegla, który moze miec 1 lub 2 podwójne wiaza- nia i moze byc prosty lub rozgaleziony. Korzyst¬ ne sa kwasy o 16—22 atomach wegla oraz natu¬ ralne lub syntetyczne kwasy mykolowe.Dlugolancuchowym alifatycznym alkoholem jest zwlaszcza alkanol o 10—22 atomach wegla, który moze miec jedno lub dwa podwójne wiazania i byc prosty lub rozgaleziony. Korzystne sa alka- nole zawierajace 12—18 atomów wegla z grupa hydroksylowa na koncu lancucha.Rodniki i zwiazki okreslone w niniejszym opisie jako „nizsze" zawieraja korzystnie do 7 wlacznie, a przede wszystkim do 4 wlacznie atomów wegla.Powyzej i ponizej pojecia ogólne moga miec. na¬ stepujace znaczenie: Nizszym rodnikiem alkilowym jest np. n-propy- 55 Iowy, n-butylowy, izobutylowy, Ill-rz.-butylowy lub III-rz.-butylowy, dalej n-pentylowy, n-heksy- lowy, izoheksylowy lub n-heptylowy, przede wszy¬ stkim metylowy lub etylowy. W rodniku arylo-, cykloalkilo- lub heterocykliczno(nizszym)alkilowym 00 nizszym rodnikiem alkilowym jest zwlaszcza me¬ tylowy lub etylowy, przy czym rodnik arylowy, cykloalkilowy lub heterocykliczny maja wyzej po¬ dane znaczenie.Nizsza grupa alkoksylowa jest np. n-propoksy- 35 Iowa', nnbutoksylowa, izobufcaksylowa, 11-rz.^butolk-127 481 6 sylowa lub Illnrz.-butoksylowa, przede wszystkim metoksylowa lub etoksylowa.Nizsza grupa alkilomerkapto jest np. n-propylo-, n-butylo-, izobutylo-, II-rz.-butylo lub Ill-rz.-buty- lomeffkapto, a przede wszystkim metylomerkapto lub etylomerkapto.Nizsza grupa alkilenodioksylowa jest zwlaszcza grupa metylenodioksylowa, etylenodioksylowa lub prapylenodioksylowa. Atomem chlorowca jest'atom fluoru lub bromu, a korzystnie chloru.Nizsza grupa alkanokarbonylowa jest zwlaszcza propionylowa lub butyrylowa, przede wszystkim acetylowa.Syntetycznymi kwasami nykolowymi sa zwlasz¬ cza kwasy a-alkilo-|l-hydroksyalkanokarboksylo- wa, gdzie rodnik alkilowy w polozeniu a ma 1—20, przede wszystkim 1—14, a kwas alkanokarboksy- lowy 20—80, zwlaszcza 30—34 atomów wegla. Mo¬ ga one zawierac dalsze grupy hydroksylowe, jak równiez grupy okso, metylenowe lub etylenowe.Naturalnymi kwasami mykolowymi sa zwlasz¬ cza takie, które mozna wyodrebnic z zywych orga¬ nizmów, jak bakterie, np. mykobakterie. Nowe zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku moga miec postac mieszanin izomerów lub czy¬ stych izomerów.Nowe lipofilowe muramylopeptydy o wzorze 1 wykazuja szereg cennych wlasciwosci farmakolo¬ gicznych, zwlaszcza wybitne dzialanie wzmagajace odpornosc.Tak wiec zwiazki te in vivo znacznie zwiekszaja zdolnosc wytwarzania przeciwcial u myszy.Myszy NMRI uodpornione w dniu 0 przez do¬ otrzewnowe wstrzykniecie ilO pg wolnego od osadu BSA. Dnia 9, 15 i 29 pobrano próbki osocza i zba¬ dano je na zawartosc przeciwcial anty-BSA, tech¬ nika pasywnej hemoaglutynacji. W stosowanej dawce rozpuszczalny BSA jest dla zwierzat-bior- ców subimmunogenny, tj. wymaga wyzwolenia je¬ dynie bardzo malej produkcji przeciwcial lub nie wymaga jej w ogóle. Dodatkowe traktowanie my¬ szy okreslonymi substancjami o dzialaniu wzma¬ gajacym odpornosc, przed lub po podaniu anty¬ genu, prowadzi do wzrostu miana przeciwcial w osoczu. Efekt traktowania wyrazono poprzez uzy¬ skana wartosc, tj. suma log2 róznic miana w trzech dniach pobierania krwi.W próbie tej zwiazki o wzorze 1 przy dootrzew¬ nowym lub podskórnym podaniu 0,5—5 mg/kg zwierzecia w ciagu pieciu kolejnych dni po uod¬ pornieniu za pomoca BSA znacznie zwiekszaja produkcje przeciwcial wobec BSA. W tym wzgle¬ dzie znacznie przewyzszaja dostepne muramylo¬ peptydy hydrofilowe.Równiez objawy odpornosci za posrednictwem komórek moga byc in vivo zwiekszone przez wy¬ mienione zwiazki.Podczas gdy sensybilizacja swinek morskich za pomoca BSA w niekompletnym adjuwancie Freun- da prowadzi jedynie do humoranej produkcji prze¬ ciwcial, domieszanie nowych lipofilowych mura- mylopeptydów do emulsji antygenu, w dawce 5— 50 \ig, indukuje nadwrazliwosc typu póznego wobec BSA: 3 tygodnie po immunizacji podskórna iniek¬ cja BSA prowadzi do miejscowej reakcji zapalnej 10 15 20 30 40 45 50 55 60 65 z rumiencem i zgrubienia skóry, które osiagaja maksimum w ciagu 24 do 48 godzin. Te reakcje typu póznego ilosciowo i jakosciowo odpowiadaja reakcjom zwykle uzyskiwanym przez immunizo- wanie za pomoca BSA w kompletnym adjuwancie Frounda (tzn. z dodatkiem mykobakterii). Wartosci ED50 {ilosc w ^g/zwierze) konieczna do indukcji róznicy objetosci reakcji (powierzchnia rumienia X zwiekszenie grubosci skóry) przy traktowanych i niebraktowanych zwierzetach (200 |il, 24 godziny po wywolaniu) wynosza 10—20 \ig.Szczególnie nalezy podkreslic równiez zdolnosc takich lipofilowych murymylopep^ydów do wywo¬ lania u swinek morskich, przez stosowanie lacznie z BSA w liposomach (edlecytyna : cholesteryna 4:1; 4 mg/zwierze) i bez toksycznego skladnika — oleju mineralnego, nadwrazliwosci typu póznego wobec BSA. Ilosciowo i jakosciowo równiez te re¬ akcje typu póznego sa identyczne z reakcjami uzy¬ skiwanymi przez immunizacje za pomoca BSA w kompletnym adjuwancie. Wartosci EDM wynosza 100—300 fig na zwierze.Nowe zwiazki o wzorze 1 wykazuja w porów¬ naniu z hydrofilowymi muramylopeptydarni dalsze zalety, jakosciowe.Myszy Balb/C immunizowano w dniu 0 przez dootrzewnowa iniekcje 2X10* komórek tucznych P815. Dla 15 zbadano komórki sledziony tak immu- nizowanych zwierzat, in vitro, na obecnosc cytc*- toksycznych, ukierunkowanych przeciwko komór¬ kom tucznym P815 limfocytów T. W tym celu ko¬ mórki P815 znakowano za pomoca 51Cr i okreslono wielkosc reakcji cytotoksycznej przez pomiar ra¬ dioaktywnosci w plynie nad hodowla* W stoso¬ wanej dawce komórki tuczne P815 sa dla biorcy- -myszy subimmunogenne, tzn, nie wywoluja lub wywoluja bardzo male tworzenie eytotoksycznych komórek T. Równoczesne dootrzewnowe podanie 1 do 50 ^g wymienionych muramylopeptydów o wzo¬ rze 1 prowadzi do znaczacego zwiekszenia produk¬ cji cytotoksycznych komórek T (wspólczynnik 10 do 30 .w stosunku do myszy nie traktowanych).Wzmagajace odpornosc wlasciwosci -owych zwiazków ó wzorze 1 przejawiaja, sia równiez w przypadku indukcji specyficznej immunotolerancji wobec antygenów transplantacyjnych, przez; immu- nizowanie za pomoca autoblastów z adjnwansen omyszy. ^s W mieszanej hodowli limfocytów inkubowano limfocyty sledziony przyszlych transplantpbiorców rfmyszy C57B1/6J) z napromieniowanymi fcomórlca- mi sledziony przyszlych transplantodawców (myszy GBA/J). Antygeny dawcy o zgodnosci tkankowej rozmnazaly sie i tworzyly blastulo; te*, mozna bylo przez sedymentacje oddzielic- od innych komórek.Specyficzne blastule wyrazaja idiotypowa specy¬ ficznosc receptorów membranowych. Mieszano je z kompletnym adjuwantem Freunda (CFA) i wstrzykiwano jako autóimmunogenny do induk¬ cji specyficznej tolerancji wobec danych antyge¬ nów transplantacyjnych u przewidzianego transpla- tobiorcy (C57B1/6J). Immunizacji dokonuje sie czterokrotnie w czterotygodniowych odstepach, za pomoca autologicznych limfoblastów Z antyrCBA/J.Adsorbaty T-autoblastów z nowymi zwiazkami7 127 481 s o wzorze 1/109 blastów zawieszano w roztworze 20 mg substancji w 20 ml PBS. Po dwugodzinnej inkubacji komórki odwirowano i dwukrotnie prze¬ myt© PBS (moga indukowac specyficzna immuno- tolerancje w nieobecnosci CFA), przy czym adspr- baty sa tak samo skuteczne jak Umfoblasty w CFA.Nowe zwiazki o wzorze 1 sa równiez zdolne do . indukowania, w stezeniu 0,5—400 ug/ml, produkcji komórek wytwarzajacych przeciwciala w hodow¬ lach komórek normalnych myszy (zwiekszenie licz¬ by tworzacych plytki komórek 10S o wspólczynni¬ ku 10 do 30 w stosunku do wartosci kontrolnej, tj. w nieobecnosci substancji stymulujacych): tak wiec w obecnosci wymienionych zwiazków powsta¬ ja specyficzne przeciwciala wobec erytrocytów owcy, bez wprowadzania do hodowli erytrocytów owcy w celu immunizacji. Z drugiej strony, wy¬ mienione substancje w tym samym stezeniu wy¬ woluja zwiekszenie immunologicznej reaktywnosci hodowli komórek sledziony zubozonych w komórki T (kongencjalnie atymicznych myszy nu/nu) w stosunku do antygenu normalnie zaleznego od gra¬ sicy (erytrocytu owcy) (wspólczynnik 10 do 30 w stosunku do nie traktowanych hodowli kontrol- ftych). Wymienione zwiazki nie tylko indukuja in vitro, bezposrednio lub posrednio, zdolnosc profi- lerancji i syntezy limfocytów B (tj. potencjalnych komórek produkujacych przeciwciala), lecz równiez wywieraja wplyw na limfocyty T (do których na- leaa regulatorycznie aktywne komórki pomocnicze i supresorowe, jak równiez cytotoksyczne komórki efekterowe).Tak wiec wspomniane zwiazki w zakresie steze¬ nia/ 1—20 fig/ml znacznie zwiekszaja reaktywnosc opornych na kortizon komórek grasicy wobec alo- ^enowyeh, napromieniowanych limfocytów stymu- latorewych (do 10-krotnie).Wycef wspomniane dzialania sa prawdopodob¬ nie posrednie; wywoluje je aktywacja makrofagów przes lipefilewe muramylopeptydy. Mikrofagi z ko¬ lei wywoluja reaktywnosci limfocytów T i B. W reeezywistosoi mosna wykazac, ze wymienione zwiazki Jul w niskim stezeniu (0,5—10 ng/ml) wyzwalaja a makrofagów. myszy duze ilosci „colo- ny ttrimulating activityu 809 kolonii w ciagu 7 dni z 10* komórek szpiku myszy po dodaniu 20% plynu znad hodowli makro¬ fagów mkubowanej w ciagu 14 godzin z substan¬ cja, w porównaniu z M koloniami przy dodaniu *&** siad nie potraktowanych hodowli majproia- sjów). OSA jest biologicznym mediatorem, który Jest konieczny de zróznicowania komórek szpiku kostnego na mafcrofagi i poUmerfiezzie leukocyty.W taki sposób wymienione zwiazki wywoluja zwiekszona produkcje komórek majacych centralne siaeaenie dla niespecyficznej odpornosci oraz in¬ dukcji, ampliftkacji i ekspresji specyficznych (za poAredniotwem limfocytów) reakcji immunoiogicz- nych.Wzmagajace odpornosc dzialanie nowych zwiaz¬ ków mozna wykazac in vivoc tafle wiec iniekcja fosto&pidowej pochodnej muramylopeptydu prowa- dssi w ciagu 3—8 godzin do znacznego wzrostu ste¬ zenia CSA w osoczu (do 120 kolonii na 10* ko¬ mórek szpiku po dodaniu osocza ekstrahowanego chloroformem (stezenie koncowe 5%), w porówna¬ niu z 0—5 koloniami u zwierzat nie traktowanych).Tak wiec podawanie tych zwiazków in vivo znacz- i nie zwieksza zdolnosc myszy do produkcji przeciw¬ cial.Wzmagajace odpornosc wlasciwosci nowych zwiazków o wzorze 1 mozna równiez wykazac na modelach nowotworowych, np. w przypadku nowo- lf tworu Ehrlich Ascites u myszy (wodobrzusze na tle raka Ehrlicha).Dootrzewnowa iniekcja 106 synergicznych ^omó- rek nowotworowych Ehrlich Ascites prowadzi u myszy Balb/c do padniecia zwierzat w ciagu prze- 15 cietnie 18 dni. Gdy myszom wstrzykuje sie do- otrzewnowo 107 (grupa 1), 10« (grupy Z) i 10* (gru¬ py 3) komórek nowotworu Ascites, które in vitro obsadzono nowymi zwiazkami o wzorze 1 (10* ko¬ mórek nowotworu Ascites zawiesza sie w roztwo- II rze 40 mg badanej substancji w 20 ml fizjologicz¬ nego roztworu soli kuchennej buforowanego fosfo¬ ranem (PBS) i po dwugodzinnej inkubacji w 37°C komórki odwirowuje sie i dwukrotnie przemywa PBS; wskutek tego zabiegu komórki wlaczaja 25 badana substancje w swoja Mone), to po 18 dniach nie dochodzi do wzrostu nowotworu. 19 dnia zwie¬ rzeta obciaza sie 10» rodzimych komórek nowotwo¬ ru Ehrlicha Ascites, dootrzewnowo. Obserwuje sie nastepujace efekty: a Grupa 1: 8 z 10 zwierzat przezywa 80 dzien Grupa 2: 6 z 10 zwierzat przezywa 80 dzien Grupa 3: zwierzeta umieraja, jak kontrolne, po 18 dniach.Zwiazki o wzorze 1 sa przy tym malo toksyczne: p 5-krotne dootrzewnowe podanie w dawce 100 mg/kG-4zien w ciagu 5 kolejnych dni prze¬ chodzilo u myszy bezobjawowo. Poniewaz dawki wymagane do immunostymulacji sa bardzo male, zakres terapeutyczny nowych zwiazków jest bardzo it duzy.Nowe zwiazki o wzorze 1 moga znacznie pod- wyzszyc odpornosc komórkowa, a zwlaszcza hu- moralna i to zarówno w mieszaninie z samym an¬ tygenem (efekt adjuwantowy o wezszym znacze- is ni i miejscowo oddzielonym od iniekcji antygenu (sy¬ stemowe wzmaganie odpornosci).Nowe zwiazki o wzorze 1 moga byc jako adju- wanty w mieszaninie ze szczepionka stosowane do 5f potepaaanja efektu szczepienia i polepszania ochro¬ ny przed zakazeniem bakteryjnym, wirusowym lub pasozytniczym przez odpornosc komórkowa i/lub humoralne przeciwciala.Wreszcie, opisane zwiazki nadaja sie do stoso- H wania jako adjuwanty, w mieszaninie z róznymi antygenami, przy doswiadczalnym i przemyslo¬ wym wytwarzaniu przeciwsurowic dla lecznictwa i diagnostyki oraz przy indukcji immunologicznie aktywowanych populacji limfocytów dla transpor- M tu komórkowego.Nowe zwiazki moga byc równiez bez równoczes¬ nego doprowadzania antygenu stosowane do przy¬ spieszania reakcji immunologicznych u czlowieka i zwierzecia. Zwiazki nadaja sie szczególnie do sty- m mulacji obrony organizmu, np. przy przewleklych9 lub ostrych zakazeniach lub przy selektywnych (antygenospecyficznych) defektach immunologicz¬ nych, jak równiez wrodzonych lecz równiez i na¬ bytych ogólnych (tj. nie antygenospecyficznych) stanach defektów immunologicznych, jakie wyste- 5 puja w starosci, w przebiegu ciezkich schorzen pierwotnych, a przede wszystkim terapii promie¬ niowaniem jonizujacym lub hormonami dzialajacy¬ mi immunospupresyjnie. Wspomniane substancje mozna wiec z korzyscia stosowac równiez lacznie 1Q z antybiotykami, chemoterapeutykami lub przy in¬ nych zabiegach leczniczych, dla przeciwdzialania uszkodzeniom immunologicznym. Wreszcie, opisane substancje nadaja sie do ogólnej profilaktyki, cho¬ rób zakaznych u czlowieka i zwierzecia.Wynalazek dotyczy szczególnie zwiazków o wzo¬ rze 1, w którym X oznacza grupe karbonylowa, Rj oznacza ewentualnie podstawiony rodnik alkilo¬ wy lub arylowy, R2, Rs, R4 i Re oznaczaja atom wodoru lub nizszy rodnik alkilowy, R5 oznacza 20 atom wodoru, ewentualnie podstawiony grupa hy¬ droksylowa, nizsza alkoksylowa, merkapto lub niz¬ sza alkilomerkapto lub atomem chlorowca nizszy rodnik alkilowy, cykloalkilowy lub cykloalkilo(niz- szy)alkilowy, przy czym rodnik cykloalkilowy za- • wiera 4—6 atomów wegla, ewentualnie podstawio¬ ny rodnik fenylowy lub nizszy/fenyloalkilowy, za¬ wierajacy jeden lub dwa atomy azotu rodnik he¬ terocykliczny lub heterocykliczno(nizszy)alkilowy < albo R4 i R5 lacznie stanowia rodnik alkilenowy 30 o 3—4 atomach wegla, R7 oznacza atom wodoru, a jeden z podstawników A± i Ag oznacza rodnik o wzorze 2, gdzie T oznacza -NH lub -O, Y ozna¬ cza ewentualnie podstawiony nizszy rodnik alkile¬ nowy, który moze byc przerwany grupa karboksy- 35 Iowa i karbonamidowa. W oznacza atom wo¬ doru, a Z oznacza rodnik 1,2-hydroksyetylowy lub 2-hydroksyetylowy, w którym co najmniej jedna grupa hydroksylowa jest zestryfikowana lub zete- ryfikowana w wyzej podany sposób a jeden z pod- 40 stawników At i A2 jest grupa hydroksylowa, nizsza alkoksylowa, aminowa, nizsza alkiloaminowa lub karbonamido(nizsza)alkiloaminowa.Wynalazek dotyczy zwlaszcza zwiazków o wzo- 45 rze 1, w którym X oznacza grupe karbonylowa, Ri oznacza ewentualnie podstawiony grupa hydro¬ ksylowa, nizsza alkoksylowa lub atomem chlorow¬ ca rodnik alkilowy albo ewentualnie podstawiony grupa wodorotlenowa, nizsza alkoksylowa lub ato- ^ mem chlorowca rodnik fenylowy, R2, R4 i R6 ozna¬ czaja atomy wodoru, R3 oznacza atom wodoru lub nizszy rodnik alkilowy, R5 oznacza atom wodoru, ewentualnie podstawiony grupa hydroksylowa, niz¬ sza alkoksylowa, merkapto, (nizszo)alkilomerkapto 55 lub atomem chlorowca nizszy rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, cykloalkilowy lub cykloalki- lo(nizszy)alkilowy, przy czym rodnik cykloalkilowy zawiera 4—6 atomów wegla a nizszy rodnik alki¬ lowy zawieTa 1—3 atomy wegla, ewentualnie pod- 60 stawiony grupa hydroksylowa, nizsza alkoksylowa lub atomem chlorowca rodnik fenylowy lub nizszy fenyloalkilowy o 1—3 atomach wegla w rodniku alkilowym, zawierajacy jeden luib dwa atomy azotu rodnik heterocykliczny lub heterocyklicz- ^5 ie no(nizszy)alkilowy o 5—6 czlonach w pi^rjeleniu i 1—3 atomach wegla w rodniku alkilowym albo R4 i R5 lacznie oznaczaja takze rodnik alkilenowy o 3—4 atomach wegla, R7 oznacza atom wodoru a jeden z podstawników Aj i A2 oznacza rodnik o wzorze 2, w którym T oznacza NH lub O, Y oznacza ewentualnie podstawiony nizszy rodnik al¬ kilenowy lub rodnik o wzorze 3b lub 3d', gdzie Y1 i Y2 oznaczaja ewentualnie podstawiony nizszy rodnik alkilenowy, W oznacza atom wodoru, a Z oznacza rodnik 1,2-dwuhydroksyetylowy lub 2-hy¬ droksyetylowy, w którym co najmniej jedna grupa hydroksylowa jest zestryfikowana ewentualnie jedno- lub dwukrotnie nienasyconym alifatycznym kwasem karboksylowym o 16—22 atomach wegla lub naturalnym lub syntetycznym kwasem mykolo- wym lub zeteryfikowana ewentualnie jedno- lub dwukrotnie nienasyconym, alifatycznym alkoholem o 12—18 atomach wegla, a drugi z podstawników Aj i A2 jest grupa hydroksylowa, nizsza alkoksy¬ lowa, aminowa, (nizszy)alkiloaminowa lub karbona- mido(nizszy)alkiloaminowa.Wynalazek dotyczy przede wszystkim zwiazków o wzorze 1, w którym X oznacza grupe karbony¬ lowa, R! nizszy rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla lub fenylowy, Rg, R4 i R6 oznaczaja atomy wodoru, R3 oznacza atom wodoru lub nizszy rod¬ nik alkilowy o 1—3 atomach wegla, R5 oznacza atom wodoru, ewentualnie podstawiony grupa hy¬ droksylowa, {metoksylowa, merkapto, metylomerkap- to lub atomem chlorowca nizszy rodnik alkilowy p ii—3 atomach wegla, ewentualnie podstawionygrupa hydroksylowa, metoksylowa lub atomem chlorowca rodnik fenylowy lub fenylometylowy, zawierajacy jeden lub dwa atomy azotu rodnik heterocykliczna lub heterocyklometylowy o 5 czlonach pierscienia albo R4 i R5 lacznie tworza rodnik trpjmetylenqwy? R7 oznacza atom wodoru, a jeden z podstawników At i A2 oznacza rodnik o wzorze 2, gdzie T ozna¬ cza HN lub O, Y nizszy rodnik alkilenowy o 2—3 atomach wegla lub rodnik o wzorce 3b lub 3d' gdzie Y-i, Y2, Y8 i Y4 niezaleznie od siebie ozna¬ czaja ewentualnie podstawiony grupa hydroksylo¬ wa, nizsza alkoksylowa, merkapto lub nizsza aHci- lomerkapto nizszy rodnik alkilowy o l—3 atomach wegla albo ewentualnie podstawiony grupa hydro¬ ksylowa, metoksylowa lub atomem chlorowca rod¬ nik fenylowy lub fenylo(nizszy)alkiJowy lub zawie¬ rajacy jeden lub dwa atomy a za rodnik hetero¬ cykliczny lub heterocykliczno(nizszyalkilowy o 5— "6 czlonach w pierscieniu i 1—3 atomach wegla w nizszym rodniku alkilowym, lub nizszy rodnik alkilenowy o 1—3 atomach wegla, W oznacza atom wodoru, a Z oznacza rodnik 1,2-dwuhydroksyety¬ lowy lub 2-hydroksyetylowy, w którym co naj- niej jedna grupa wodorotlenowa jest zestryfiko¬ wana ewentualnie jedno- lub dwukrotnie niena¬ syconym alifatycznym kwasem karboksylowym ,0 16 do 20 atomach wegla lub zestryfikowana ewentualnie jedno- lub dwukrotnie nienasyconym alifatycznym alkoholem o 12—18 atomach wegla, a drugi z podstawników -A± i A2 jest grupa hy¬ droksylowa, nizsza alkoksylowa, aminowa, nizsza alkiloaminowa lub nizsza karbonamidoalkiloami- nowa.127 11 W szczególnosci wynalazek dotyczy nowych mu- ramylopeptydów opisanych w przykladach.Nowe zwiazki o wzorze 1 mozna wytwarzac ogólnie znanymi sposobami.Sposób wytwarzania zwiazków o wzorze 1 pole- s ga wedlug wynalazku na tym, ze zwiazek o wzo¬ rze 4, w którym X, Rlf R, i Rf maja wyzej poda¬ ne znaczenie, R,, R10 i Ru oznaczaja atom wodoru lub latwo odszczepialna grupe ochronna a L ozna¬ cza grupe hydroksylowa lub rodnik o wzorze 5, lf w którym R* i Rf maja wyzej podane znaczenie, przy czym obecne w rodniku R* grupy karboksy¬ lowe i ewentualnie wolne grupy hydroksylowe sa zabezpieczone latwo odszczepialnymi grupami ochronnymi, lub reaktywna kwasowa pochodna te- 1S go zwiazki* kondensuje sie ze zwiazkiem o wzo¬ rze 6, w którym R* R7, Aj i A, maja wyzej poda¬ ne znaczenie, przy czym obecne w rodnikach R7, Ai i At wolne grupy karboksylowe zabezpieczone latwo odszczepialnymi grupami ochronnymi, a R M Oznacza rodnik o wzorze 7, w którym R4 i R5 maja wyzej podane znaczenie, przy czym obecne w rodniku Rg grupy karboksylowe i ewentualnie wolne grupy hydroksylowe sa zabezpieczone latwo odszczepialnymi ochronnymi, gdy grupa -COL u oznacza grupe karboksylowa ewentualnie wystepu¬ jaca w reaktywnej postaci, i E oznacza atom wo¬ doru gdy L oznacza rodnik o wzorze 5 lub jego reaktywna kwasowa pochodna, albo z sola lub reaktywna pochodna zwiazku o wzorze 6, i ewen- M tualnie odszczepia sie grupy ochronne i ewentual¬ nie otrzymany zwiazek o wzorze 1 przeprowadza sie w sóL Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wyna¬ lazku wyfcazuja znacznie lepsze wlasciwosci niz w zwiazki wyjsciowe o wzorze 4. Jak juz podano powyzej, zwiazki o wzorze 1 zwiekszaja produk¬ cje przeciwcial w dawce 0,5—5 mg/kg. Natomiast z opisu patentowego RFN DOS nr 2655500 (odpo¬ wiadajacego pottiemu opisowi patentowemu nrr M 100353) wynika, ze w podobnym tescie zwiazki wyjsciowe wykazuja dzialanie w dawce 100—300 mg/kg.Kondensacje przeprowadza sie np. w taki spo¬ sób, ze kwas o wzorze 4 w postaci aktywowanej « poddaje sie reakcji ze zwiazkiem aminowym o wzorze 6 lub kwas o wzorze 4 poddaje sie reak¬ cji ze zwiazkiem o wzorze 6, którego grupy ami¬ nowe sa w postaci aktywowanej. Aktywowana gru¬ pa karboksylowa moze byc przykladowo bezwod- §* nik kwasowy, korzystnie mieszany bezwodnik- kwasowy, np. z nizszym estrem alkilowym kwasu weglowego, jak ester etylowy lub izobutylowy kwasu weglowego, azydek kwasowy, amid kwaso¬ wy, jak imidazolid lub aktywowany ester. Jako u aktywowany ester wymienia sie szczególnie ester cyjanometylowy, ester karboksymetylowy, tioester p-nitrofenylowy, ester p-nitrofenylowy, ester 2,4,5- -trójchlorofenylowy, ester pieciochlorofenylowy, ester N-sukcynimidowy, ester N-ftalimidowy, ester w 8-chinolinowy, ester 2-hydroksy^l,2-dwuwodoro^l- -karbotoksychinolinowy, ester N-hydroksypiperydy- nowy lub etoloester utworzony z N-etylo-5-fenylo- -izoksezoliono-^-eulfonianem. Aktywowane estry mozna otrzymac ewentualnie równiez z karbodwu- n 481 12 imidem, przy dodaniu N-hydroksysukcynimidu lub . niepodstawionego lub podstawionego np. atomem chlorowca, rodnikiem metylowym lub grupa me- toksylowa 1-hydroksybenzotriazolu lub 3-hydrok- sy-4-keto-3,4-dwuwodoro-benzo[d]-l,2,3-triazyny.Grupe aminowa aktywuje sie np. przez reakcje z amidem kwasu fosforawego.Sposród metod reakcji z aktywowanymi kwasa¬ mi nalezy wymienic zwlaszcza metody z uzyciem N-etylo-5-fenylo-izoksazolino-3'-sulfonianu (odczyn¬ nik K Woodwarda), 2-etoksy-l,2-dwuwodoro-l-kar- betoksy-chinoliny lub karbodwuimidu.Latwo odszczepialnymi grupami ochronnymi sa grupy znane z chemii peptydów lub chemii cu¬ krów. Dla grup karboksylowych nalezy wymienic zwlaszcza trzeciorzedowa butylowa, benzylowa lub benzyhydrylowa, a dla grup wodorotlenowych zwlaszcza rodniki acylpwe, np. nizsze rodniki alka- nokarbonylowe, jak acetylowy, arylokarbonylowe, jak benzoilowy, a przede wszystkim pochodne kwa¬ su weglowego, jak benzotksykarbonylowy lub (niz¬ szy) alkoksykarbonylowy lub rodniki alkilowe, zwlaszcza Ill-rz.-butylowy, ewentualnie podstawio¬ ny grupa nitrowa, nizsza grupa alkoksylowa lub atomem chlorowca rodnik benzylowy, ewentualnie podstawiony atomem chlorowca lub nizsza grupa alkoksylowa, jak metoksylowa, rodnik trójfenylo- metylowy lub czterowodoropiranylowy lub ewentu¬ alnie podstawione rodniki alkilidenowe, które wia¬ za atomy tlenu w polozeniu 4- i 6-. Takimi rod¬ nikami alkilidenowymi sa zwlaszcza nizsze rodniki alkilidenowe, przede wszystkim metylidenowy, izo- propylidenowy lub propylidenowy lub ewentualnie podstawiony, korzystnie w polozeniu p, rodnik benzylidenowy.Powyzsze grupy ochronne mozna odszczepiac ogólnie znanymi sposobami. Tak wiec mozna je odszczepiac przez kwasowa hydrolize, rodniki ben¬ zylowe i benzylidenowe równiez hydrogenolitycz- nie, np. za pomoca wodoru w obecnosci kataliza¬ tora — metalu szlachetnego, jak pallad lub pla¬ tyna.Stosowane zwiazki wyjsciowe sa znane lub moz¬ na je otrzymac znanymi sposobami.Wyzej opisany proces przeprowadza sie ogólnie znanymi metodami, w nieobecnosci lub korzystnie w obecnosci rozcienczalników lub rozpuszczalni¬ ków, jezeli to jest konieczne, podczas chlodzenia lub ogrzewania, pod zwiekszonym cisnieniem i/lub w atmosferze gazu obojetnego, takiego jak azot.Przy tym, uwzgledniajac wszystkie podstawni¬ ki znajdujace sie w czasteczce, zwlaszcza obecnosc latwo hydrolizujacych rodników O-acylowych, na¬ lezy stosowac szczególnie chroniace warunki reak¬ cji, jak krótki czas reakcji, stosowanie lagod¬ nych srodków kwasowych lub zasadowych w nis¬ kim stezeniu, stechiometryczne stosunki ilosciowe, odpowiednio dobrane katalizatory, rozpuszczalniki, temperature i/lub cisnienie.Zwiazki o wzorze 1 stosuje sie do wytwarzania preparatów farmaceutycznych. Sa to preparaty, które nadaja sie do doustnego, dpnosowego lub do- odbytniczego, jak równiez pozajelitowego podawa¬ nia cieplokrwistym i które zawieraja substancje czynna sama lub z nosnikiem stosowanym w far-127 481 13 :macji. Dawkowanie substancji czynnej zalezy od [gatunku zwierzecia cieplokrwistego, wieku i indy¬ widualnego stanu, jak równiez od sposobu poda¬ nia.Nowe preparaty farmaceutyczne zawieraja okolo 10% do okolo 95%, korzystnie od okolo 20% do -okolo 90% substancji czynnej. Freparay farmaceu¬ tyczne moga miec np. postac dawek jednostko¬ wych, jak drazetki, tabletki, kapsulki, czopki lub ampulki.Preparaty farmaceutyczne sporzadza sie ogólnie znanymi sposobami, np. przez konwencjonalne mieszanie, granulowanie, drazetkcwanie, rozpusz¬ czanie lub liofilizowanie. Oprócz wyzej podanych -sposobów podawania, mozna równiez otrzymywac preparaty farmaceutyczne zwlaszcra do podawa¬ nia doustnego tak, ze substancje czynna laczy sie ze stalymi nosnikami, otrzymana mieszanine ewen¬ tualnie granuluje, a mieszanine lub granulat, je¬ zeli to jest pozadane lub konieczne, po dodaniu odpowiednich substancji pomocniczych 'przetwarza w tabletki lub rdzenie drazetek. Affozna je przy tym wbudowac w tworzywo sztuczne, które oddaje skladnik czynny w sposób dozowany lub z którego w sposób dozowany ten czynnik dyfunduje.Odpowiednimi nosnikami sa zwlaszcza wypel¬ niacze, jak cukier, np. laktoza, sacharoza, mannit lub sorbit, preparaty celulozy i/lub fosforan wa¬ pnia, np. fosforan trójwapniowy lub wodorofosfo- nian wapniowy, dalej srodki wiazace, jak klajster ze skrobi np. kukurydzianej, pszennej, ryzowej lub ziemniaczanej, zelatyna, tragant, metyloceluloza, hy»droksyprpipylo-metyloceluloza, karboksymetylo- celuloza sodowa i/lub poliwinylopirolidón i/lub je¬ zeli to jest pozadane, srodki zwiekszajace objetosc, jak wyzej wymienione skrobie, dalej skrobia kar- boksymetylowa, poprzecznie sieciowany poliwinylo¬ pirolidón, agar, kwas alginowy lub jego sól, jak alginian sodu.Srodkami pomocniczymi sa przede wszystkim -srodki regulujace plynnosc i srodki smarne, np.Jtrzemionka, talk, kwas stearynowy lub jego sole, jak stearynian magnezu lub wapnia i/lub glikol polie¬ tylenowy. Rdzenie drazetek powleka sie odpowied¬ nimi powlokami, ewentualnie odpornymi na sok zoladkowy, przy czym stosuje sie miedzy innymi stezone roztwory cukru, ewentualnie z domieszka gumy arabskiej, talku, poliwinylopirolidonu, gli¬ kolu polietylenowego i/lub dwutlenku tytanu, roz¬ twory laku w odpowiednich rozpuszczalnikach or¬ ganicznych lub mieszaninach rozpuszczalników lub, w celu wytworzenia powloki odpornej na sok zo¬ ladkowy, roztwory odpowiednich preparatów celu¬ lozowych, jak ftalan acetylocelulozy lub ftalan hy- droksypropylometylocelulozy. Do tabletek lub po¬ wlok drazetek mozna dodawac barwniki lub pig¬ menty, np. dla identyfikacji lub oznaczenia róz¬ nych dawek skladnika czynnego.Nastepujace przyklady ilustruja wyzej opisany wynalazek, jednakze w zadnym przypadku nie ograniczaja one jego zakresu. Temperature poda¬ no w stopniach Celsjusza.Zwiazki o wzorze 1 nie moga byc scharakteryzo¬ wane ani temperatura topnienia ani danymi spek¬ troskopowymi jak widma NMR i IR, które nie sa 14 odpowiednie do jednoznacznego okreslenia tych zwiazków.Do dokladnego scharakteryzowania tych zwiaz¬ ków nie jest takze odpowiednie podanie wartosci 5 Rf, ze wzgledu na dominujaca nature czesci lipi- dowej.Jednakze budowa zwiazków wyjsciowych jest dokladnie znana (por. opis patentowy RFN DOS nr 2655500; stosowane w tym wypadku skladniki ir fosfolipidowe sa dostepne w handlu), a polacze¬ nie fosfolipidu i muramylopeptydu jest jednoznacz¬ ne, tak wiec sekwencja elementów w produkcie koncowym i jego budowa sa jednoznacznie okres¬ lone.I5 W zwiazkach o wzorze 1 proton zwiazany poprzez atom tlenu z fosforanem mozna latwo odszczepic za pomoca zasady. Zazwyczaj zwiazki o wzorze 1 wystepuja w postaci mieszaniny wolnych zwiazków i ich soli. Tak wiec opisane w przykladach mura- 20 mylopeptydy wystepuja do okolo 40—95 procent jako sól sodowa. Sole te naleza do zakresu wyna¬ lazku.Wynalazek dotyczy takze soli zwiazków o wzo¬ rze 1 z jakimikolwiek innymi grupami tworzacymi s sole, hp. wolnymi grupami karboksylowymi, prze¬ de wszystkim stosowanych w farmacji, nietok¬ sycznych soli, np. soli z metalami lufo soli amo¬ niowych.Przyklad I. Do roztworu 1 mmola kwasu 30 !ia^benzylo-N-acetylo-4,6-izopropylidenomuramino- wego, 0,9 mmola L-alamylo-D-izoglutaminylo-L- -alanylo-2-(l/,2/^dwupalmitoilo^Sn-glicero-3'-hydro- ksyfosforyloksy)-etyloamidu w mieszaninie 15 ml dwumetyloformamidu, 10 mi tetrahydrofuranu i 35 2 ml pirydyny dodaje sie 1,2 mmola dwucyklo- heksylokarbodwuimidu i 1,3 mmola N/hydroksy- sukcynimidu. Po 24 godzinach mieszania w tempe¬ raturze pokojowej reakcja zakonczyla sie. Do mie¬ szaniny poreakcyjnej dodaje sie kilka kropli wody, 40 odsacza sie wytworzony dwucykloheksylomocznik a przesacz odparowuje sie do sucha pod zmniej¬ szonym cisnieniem. Pozostalosc oczyszcza sie przez chromatografie na zelu krzemionkowym (firmy Merck) przy uzyciu ukladu rozpuszczalników chlo- 45 roform-metanol 7:3. Frakcje zawierajace poszuki¬ wany produkt koncowy reagowaly dodatnio na cienkowarstwowych plytkach firma Merck) z odczynnikiem fósforanowyna wg V.E. Yaskoysky^ego i E,Y. Kostetskyego, J. Lipid. 59 Res., 9, 386 (1986) i reagowaly dodatnio z 2N kwa¬ sem siarkowym podczas ogrzewania (brunatne za¬ barwienie cukru). Frakcje te odparowuje sie i po usunieciu grup ochronnych najpierw utrzymuje sie w mieszaninie 12 ml lodowatego kwasu octowego 55 i 8 ml wody w ciagu 1 godziny w temperaturze 50°C, a nastepnie w temperaturze pokojowej uwo¬ dornia sie w obecnosci 10% Pd/C pod normalnym cisnieniem. Po 20 godzinach grupa a-benzylowa ulega odszczepieniu. Katalizator odsacza sie, aprze- M sacz odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem do syropu. Tak otrzymuje sie syropowata sól piry- dyniowa N-acetylo-muramylo-L-alanylo-D-izogluta- minylo-Li-alanylo-2-(l',2/^dwu|almitoilo-SN-glicero- -3/-hydroksyforyloksy)-etyloamidu, która rozpusz- 05 cza sie w 150 ml wody.127 481 15 16 Wodny roztwór saczy sie przez miliporowaty filtr teflonowy (wielkosc porów 5 |ini). Przesacz poddaje sie dializie w komorze ultrafiltracyjnej . Amicon przez membrane Amicon YMIO w procesie diafiltracji najpierw wobec wody (400 ml), nastep¬ nie wobec roztworu 0,1 M fosforan sodowy (bufor) — 0,1 M NaCl, pH7, (200 ml) i w koncu wobec wody (850 ml). Dializat wewnetrzny zawierajacy N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L- -alanylo-2n(l',2/-dwupalmitoilo-Sn-glicero-3,-hydro- ksyfosforyloksy)-etyloamid w mieszaninie z jego sola sodowa, saczy sie przez miliporowaty filtr o wielkosci porów 0,45 pm i suszy sie sublimacyj¬ nie. Rf = 0,30 (chloroform — metanol — woda, 65:25:4).Nowy zwiazek charakteryzuje sie analitycznie w ten sposób, ze ilosciowo oznacza sie jego skladniki: kwas N-acetylomuraminowy, kwas palmitynowy, fosforan, L-alanine i kwas D-glutaminowy. Kwas N-acetylomuraminowy oznacza sie spektrofotome¬ trycznie za pomoca reakcji Morgan-Elsons, wedlug modyfikacji J.M. Ghuysena i innych (w „Methods in Enzymology", 8, 629 (1966)).Fosforan oznacza sie ilosciowo wedlug Lowry'- ego i innych (J. Biol. Chem. 207, 1 (1954)).Kwas palmitynowy i aminokwasy oznacza sie ilosciowo w calkowitym hydrolizacie (6N NC1, 24 godziny, 110°C) przez chromatografie gazowa lub za pomoca analizatora aminokwasów, stosujac jako standardy wewnetrzne kwas pentadekanowy ^b norleucyne.Znalezione stosunki molowe, w odniesieniu do fosforanu sa nastepujace: 20/": kwas N-acetylomuraminowy L-alenine: kwas D-glutaminowy: kwas parnitynowy = 1 : 0,92 : : 0,91 : 0,95 : 2,18.Stosowany jako zwiazek wyjsciowy L-alanylo- -D-izoglutaminylo-L-alanylo-2-(l',2'-dwupalmitoilo- -Sn-glicero-3'-hydroksyfosforyloksy)etyloamid otrzy¬ muje sie z 2-(l,2-dwupalmitoilo-Sn-glicero-3-hydro- ksyfosforyloksy)-etyloaminy, która jest dostepna w handlu i L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alaniny po¬ stepujac w znany sposób.' Przyklad II. W sposób analogiczny jak w przykladzie I otrzymuje sie N-cetylo-desmetylomu- ramylo-L-alenylo-D-izoglutaminylo-2-(l',2'-dwupal- mitoilo-sn-glicero-3r-hydroksyfosforyloksy)etylo- amid, który wykazuje na zelu krzemionkowym na¬ stepujace wartosci Rf: 0,29 (chloroform-metanol- woda, 65 : 25 : 4) lub 0,65 (chloroform-metanol-kwas octowy-woda, 25 : 15 : 4.: 2).Przyklad III. W sposób analogiczny jak w przykladzie I otrzymuje sie N-acetylo-muramylo- -L-alanylo-D-izoglutaminylo-/-oksy-metylokarbony- lo-2/r,2'-dwupalmitoilo-sn-glicero-3'-hydroksyfosfo- ryloksy/etyloamid. Zwiazek ten wykazuje w chro¬ matografii cienkowarstwowej na zelu krzemionko¬ wym nastepujace wartosci Rf: 0,28 (chloroform-me- tanol-woda, 65 : 25 : 4) lub 0,68 (chloroform-meta- nol-kwas octowy-woda, 25 : 15 : 4 : 2).Przyklad IV. W sposób analogiczny jak w przykladzie I otrzymuje sie N-acetylomuramylo-L- -alanylo-D-izoglutaminylo-2-/l',2'-dwupalmitoilo- -sn-glicero-3'-hydroksy fosforyloksy-etyloamid. W chromatografii cienkowarstwowej na zelu krze- 10 15 20 25 , 30 35 40 50 55 60 mionkowym wykazuje on wartosci Rf = 0,31 (chlo— roform-metanol^woda, 65 : 25 : 4) lub 0,64 (chloro- form-metanol-kwas octowy-woda, 25: 15.: 4 : 2).Przyklad V. W sposób analogiczny jak w przykladzie I otrzymuje sie N-acetylodesmetylomu- ramylo-L-aIanylo-D-izoglutaminylo-2-/l',2'-heksade- cylo-sn-glicero-3'-hydroksyfosforyloksy/etyloamid.W chromatografii cienkowarstwowej na zelu krze¬ mionkowym wartosc Rf = 0,43 (chloroform-meta- nol-woda, 65 : 25 : 4).Przyklad VI. W sposób analogiczny jak w przykladzie 1 otrzymuje sie N-cetylodesmetylomu- ramylo-L-analylo-D-izoglutaminylo-2-/3'-palmitoilo- -rac-glicero-l'-hydroksyfosforyloksy/etyloamid. W chromatografii cienkowarstwowej na zelu krze¬ mionkowym Rf = 0,47 (chloroform-metanol-woda,, 65 : 25 : 4).Przyklad VII. W sposób analogiczny jak w przytkladzie I otrzymuje sie N-acetylo-desmetylo- muramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-2-/l'-palmi- toilo-2'-olecilo-sn-glicero-3'-hydroksyfosforyloksy/e- tyloamid. W chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym wartosc R* = 0,33 (chloro- form-metanol-woda, 65 : 25 :4).Przyklad VIII. W sposób analogiczny jak w przykladzie I otrzymuje sie N-acetylo-desmetylo- muramylo-L-alsnylo-D-izoglutaminylo-2-/l'-palmi- toilo-propanodiolo-3'-hydroksyfosforyloksy/etylo- amid. W chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym wartosc Rf = 0,49 (chloroform— -metanol-woda, 65:25:4).Przyklad IX. W sposób analogiczny *jak w poprzednich przykladach otrzymuje sie N-acetylo- muramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanylo-2- -(3'-palmitoilo-rac-glicero-l'-hydroksyfosforyIoksy)- -etyloamid, Rf = 0,22 (chloroform-metanol-woda, 65 : 25 :4).Przyklad X. W sposób analogiczny jak w poprzednich przykladach otrzymuje sie N-acetylo- -desmetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L- -alanylo-2-(l',2/-dwupalmitoilo-sn-glicero-3/-hydro- ksyfosforyloksy)-etyloamid, Rf = 0,39 (chloroform- me+anol-woda, 65 : 25 : 4), i N-acetylo-desmetylomu- ramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alanylo-2-(3'- -palmitoilo-rac-glicero-l'-hydroksyfosforyloksy)- -etyloamid, Rf = 0,16 (chloroform-metanol-woda, 65 : 25 : 4).Przyklad XI. W sposób analogiczny jak w przykladzie I otrzymuje sie nastepujace zwiazki (ustalenie Wartosci analitycznych, jak w przykla¬ dzie I): N-benzoilo-muramylp-L-alanylo-D-izogluta- minylo-L-alanylo-2-(l',2'-dwupalmitoilo-sn-glicero- -3'-hydroksyfosforyloksy)-etyloamid, IR (KBr) : 3400 (OH, NH, H20), 2925, 2355, 1740 (C=0), 1655 (C=0), 1545 (C=0), 1470, 1460, 1380; 1240 (P=0), 1170, 1100, 1070, 720, 700 cm-i i N-acetylo-muramylo-L- -a-aminobutyrylo-D-izoglutaminylo-2-l',2'-dwupal- mitoilo-sn-glicero-3'-hydroksyfosforyloksy/-etylo- amid, Rf=0,32 (chloroform^metainol-woda, 65 : 25 : 4).N-propionylo-normuramylo-L-alanylo-D-izogluta- iminylo-L-alanylo-2-(l',2'-dwupalmitoilo-sn-glicero- -3^ycrcksyfosforyloksy)-etyloamid, Rf = 0,13 (chlo¬ roform, metanol, woda, 65 : 25 : 4).Przyklad XII. Do roztworu 0,89 g (1 mmol) D-izoglutaminylo-L-alanino-2-(l',2'-dwupalmitoilo-127 481 17 18 —sn-glicero-3'-hydroksyfosfcryloksy)-etyloamidu i 3—5 mmola N-etylomorfoliny w 25 ml mieszaniny chloroform-metanol-woda o stosunku 65 : 25 : 4 wkrapla sie roztwór 1,5 mmola N-hydroksysukcyn- imidowego estru N-acetylomuramylo-L-alaminy.Calosc miesza sie w ciagu 8 godzin w tempera¬ turze pokojowej, po czym do'mieszaniny reakcyj¬ nej dodaje sie 130 ml wody. Chloroform i czesc metanolu odparowuje sie pod zmniejszonym cis¬ nieniem. Roztwór wodny saczy sie przez miliporo- waty filtr teflonowy (wielkosc porów 5 mm).Przesacz poddaje sie dializie w komorze ultrafil- tracyjnej Amicon przez przepone Amicon YMIO w procesie diafiltracji, kolejno wobec wody (400 ml) roztworu 0,1-M fosforanu sodowego (bufor) 0,1 M NaCl, pH7, (200 ml) oraz wody 850 ml. Dia¬ lizat wewnetrzny saczy sie przez filtr miliporo- waty, o wielkosci porów 0,45 mm i suszy sie sublimacyjnie, otrzymujac 1,20 g (91%) hydratu soli sodowej N-acetylo-muramylo-L-alanylo-D-izo- glutaniinylo-L-alamino-2- cero-3'-hydroksyfosforyloksy)etyloamidu, który ma identyczne wlasnosci fizyczne jak zwiazek otrzy¬ many w przykladzie I.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych muramylopep- tydów o ogólnym wzorze 1, w którym X oznacza grupe karbonyIowa lub karbonyloksyIowa, Ri ozna- ¦ cza rodnik alkilowy lub arylowy, R2, R4 i Re ozna¬ czaja atom wodoru lub nizszy rodnik alkilowy, R8 oznacza atom wodoru lub nizszy rodnik alkilo¬ wy, R5 oznacza atom wodoru* nizszy rodnik alki¬ lowy, wolny, zeteryfikowany lub zestryfikowany nizszy rodnik hydroksyalkilowy, wolny, zeteryfiko¬ wany lub zestryfikowany nizszy rodnik merkap- to/alkilowy, rodnik amino(nizszy)alkilowy, cykloal- kilowy, cykloalkilo-(nizszy)alkilowy, rodnik arylo¬ wy Tub aralkilowy, rodnik heterocykliczny lub he- terocykliczno- i jednym lub dwóch atomach azotu w pierscieniu, albo R4 i Rs *aczi:ie oznaczaja rodnik alkilenowy o 3—4 atomach wegla, R7 oznacza atom wodoru lub ewentualnie zestryfikowana lub zamidowana :grupe karboksylowa, a jeden z podstawników Ax i A2 oznacza rodnik o wzorze 2, w którym T ozna¬ cza -NH lub -O, Y oznacza ewentualnie podstawio¬ ny wolna zeteryfikowana lub zestryfikowana gru¬ pe hydroksylowa, nizsza hydroksyalkilowa, mer- kapto lub nizsza merkaptoalkilowa nizsza grupe aniinoalkilowa, karbonamidowa, alkilowa, cykloal- kilowa o 5—6 atomach wegla, arylowa lub aralki- lowa rodnik alkilenowy, który moze byc przerwa¬ ny jedna lub dwiema grupami oksykarbónylowy- mi i/lub aminokarbonylowymi, W oznacza atom wodoru, Z oznacza rodnik l,2^dwuhydroksyetylowy, lub 2-hydroksxetylowy, w którym co najmniej jedna grupa hydroksylowa jest zestryfikowana ewentualnie nienasyconym alifatycznym dlugolan- cuchowym kwasem karboksylowym lub zeteryfi- iowana ewentualnie nienasyconym, dlugolancucho- Tvym alifatycznym alkoholem, albo W i Z ozna¬ czaja grupe hydroksymetylowa zestryfikowana ewentualnie nienasyconym, dlugolancuchowym ali¬ fatycznym kwasem karboksylowym lub zeteryfi¬ kowana ewentualnie nienasyconym, alifatycznym s alkoholem, a drugi z podstawników Ai i Aa ozna¬ cza wolna lub zeteryfikowana grupe hydroksylo¬ wa, aminowa, nizsza alkiloaminowa lub karbona- mido(nizsza)alkiloaminowa, oraz ich soli, znamien¬ ny tym, ze zwiazek o ogólnym wzorze 4, w którym 1§ X, Rj, Rz i Rj maja wyzej podane znaczenie, R9, Rio i Ru oznaczaja atom wodoru lub latwo od- szczepialna grupe ochronna, a L oznacza grupe hy¬ droksylowa lub rodnik o wzorze 5, w którym R4 i R5 maja wyzej podane znaczenie, przy czym J5 obecne w rodniku R5 grupy karboksylowe i ewen¬ tualnie wolne grupy hydroksylowe sa zabezpieczo¬ ne latwo odszczepialnymi grupami ochronnymi, lub reaktywna kwasowa pochodna tego zwiazku kon- densuje sie ze zwiazkiem o ogólnym wzorze 6, w aa którym R6, R7, Aj i A^ maja wyzej podane zna¬ czenie, przy czym obecne w rodnikach R7, Ax i A2 wolne grupy karboksylowe sa zabezpieczone.latwo odszczepialnymi grupami ochronnymi, a E oznacza rodnik o wzorze 7, w którym R4 i Rj maja wyzej 25 podane znaczenie, przy czym obecne w rodniku R5 grupy karboksylowe i ewentualnie wolne grupy hydroksylowe sa zabezpieczone latwo odszczepial¬ nymi grupami ochronnymi, gdy grupa -COL ozna¬ cza grupe karboksylowa ewentualnie wystepujaca 30 w--reaktywnej postaci, i E oznacza atom wodoru, gdy L oznacza rodnik o wzorze 5 lub jego reak¬ tywna kwasowa pochodna, albo sola lub reaktyw¬ na pochodna zwiazku o wzorze 6 i ewentualnie odszczepia sie grupy ochronne i ewentualnie otrzymany zwiazek o wzorze 1 przeprowadza sie w sól. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze zwiazek o wzorze 4, w którym Rx oznacza rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla lub rodnik feny- m Iowy, R8 oznacza rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla lub rodnik fenylowy, a R5 oznacza rodnik alkilowy o 1—3 atomach wegla, jezeli L oznacza rodnik o wzorze 5, lub jego reaktywna kwasowa pochodna poddaje sie reakcji ze zwiazkiem o wzo- ^ rze 6, w którym Ax oznacza grupe aminowa a A2 oznacza rodnik o wzorze 2, w którym Y oznacza ewentualnie podstawiony grupa alkilowa o 1—3 atomach wegla rodnik alkilenowy o 1—3 atomach wegla, który moze byc przerwany grupa oksykar- w bonylowa lub aminokarbonylowa, a Z oznacza rodnik l,2^dwuhydroksyetylowy lub 2-hydroksyety- lowy, w którym co najmniej jedna grupa hydrok¬ sylowa jest zestryfikowana kwasem alkano- wzgled¬ nie alkenokarboksylowym o 16—20 atomach wegla. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze kwas N-acetylomuraminowy lub jego reaktywna pochodna kwasowa poddaje sie reakcji, z L-alany- lo-D-izoglutaminylo-L-alamino-2-(l',2'-dwupahnito- ilo-sn-glicero-3'-hydroksyfosforyloksy)-etyloamidem 60 lub jego sola. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze N-acetylomuramylo-L-alamina lub jej reaktywna pochodna kwasowa poddaje sie reakcji z D-izoglu- tamina-L-alamin'o-2- 65 -3'-hydroksyfosforyloksy)etyloamidem lub jego sola. 55127 481 CH^OH R3-CH Rz \ R5 COAi R7 C0lNhCH-C0N-CH-CHfH-C0A2 «4 Re /Yztfr / T-Y-O- YrCXD0-Y2- /Yzcr 3 Yr CON-\ Re 0 W ii 1 -P-O-CH OH Z Wzór 2 -YrOOC- Ya- wzersb Y,-HNCO-Yz -YrN'OC-Yr wzorsa' 1 l z *K, CH.OR,, / N-X-R, R3" -N-CH-COOK R4 COL Wzór 4 COA, R7 EN-CH-CH„CH-COAz I Cm ^- R, Wzór 5 *S HN-CH-CO- R, Wzór 7 PZGraf. Koszalin A-165 85 A-4 Cena 100 zl PL PL