FI79330B - Foerfarande foer framstaellning av farmakologiskt verkande muramylpeptid-n-(2-fosfatidyloxietyl)-amider. - Google Patents

Description

79330

Menetelmä farmakologisesti vaikuttavien muramyylipeptidi-N-(2-fosfatidyylioksietyyli)-amidien valmistamiseksi - Förfa-rande för framställning av farmakologiskt verkande muramyl-peptid-N-(2-fosfatidyloxietyl)-amider

Keksinnön kohteena on menetelmä farmakologisesti vaikuttavien, kaavan I mukaisten muramyylipeptidi-N-(2-fosfatidyylioksietyyli ) -amidien ja/tai niiden suolojen valmistamiseksi |H2-OR6 \ . (O (D) (L)J 0“ \-N-CH-C-NH-CH-CH2-CH2-jJ-X-Y-C-NH-CH2-CH2-0-P-0-CH2 * ίκ21·<!α) 0 *io/S> missä kaavassa R1, R4 ja R6 merkitsevät vetyä, R2 merkitseee C1_4-alkyyliä, R3 merkitsee vetyä tai metyyliä, R5 merkitsee vetyä, R7 merkitsee C1_3-alkyyliä, R8 merkitsee vetyä tai C^y-alkyyliä, X merkitsee ryhmää NH, Y merkitsee Cj^-al-kylideeniä ja R9 ja R10 merkitsevät toisistaan riippumatta Ci;L_17-alkyyliä.

Kaavan I mukaisilla yhdisteillä on substituution ollessa epäsymmetrinen C-R3:ssa (D)-, C-R7:ssä (L)-, C-C-OR8:ssa (D)-, tähteessä Y (L)- ja D-glukoositähteen C-l:ssä a- ja/tai β- 2 79330 konfiguraatio, so. kaavan I mukaiset yhdisteet voivat esiintyä puhtaina anomeereinä tai anomeeriseoksina.

Konfiguraation tunnistamiseksi glyseriiniosan C-atomis-sa käytetään lUPAC-sääntöjen mukaisesti glyseriiniosan C-atomien stereospesifistä numerointia, tunnettu etuliitteestä "sn". Ylin C-atomi pystysuoran hiiliketjun Fisher-projektios-sa, jolloin hydroksiryhmä on C-2:ssa vasemmalle, saa numeron 1. Keksinnön mukaisissa yhdisteissä on fosforihapporyhmä sidottu C-atomiin 3 stereospesifisen numeroinnin mukaisesti.

C1_7-alkyyli on esim. n-propyyli, n-butyyli, isobutyy-li, sek.-butyyli, tert.-butyli, edelleen n-pentyyli, n-hek-syyli tai n-heptyyli, ensisijassa metyyli, etyyli tai iso-propyyli.

Yksityiskohtaisesti alkyylitähde R2 on etenkin metyyli, kun R3 on metyyli tai etyyli, kun R3 on vety, alkyylitähde R7 etenkin metyyli, etyyli tai isopropyyli ja alkyylitähde R8 etenkin C1_4-alkyyli, etenkin suoraketjuinen Cj.^-alkyyli, ensisijassa n-butyyli.

Alkylideenitähde Y on kaksiarvoinen tähde, jossa molemmat sidokset lähtevät samasta C-atomista, mieluimmin 1,1-lii-tetty tähde, kuten etenkin metyleeni tai etylideeni, edelleen propylideeni tai isobutylideeni.

C11_17-alkyylitähde R^ tai R18 on suoraketjulnen tai haarautunut, etenkin kuitenkin suoraketjuinen tähde, ensisijassa suoraketjuinen tähde, jossa on pariton määrä C-atome-ja, kuten n-undekyyli tai n-tridekyyli, ensisijassa suora-ketjuinen C15_17-alkyylitähde, jossa on pariton luku C-ato-meja, so. n-heptadekyyli tai aivan ensisijassa n-pentadekyyli.

Hapen kautta fosforiatomiin sidottu protoni on hapan ja se voidaan lohkaista helposti emäksillä ja korvata toisella kationilla. pH-arvossa 7 kaavan I mukaiset yhdisteet esiintyvät tästä syytä täysin tai suurimmaksi osaksi suolamuodos-sa. Nämä suolat sekä happo-suolaseokset kuuluvat samoin keksinnön piiriin. Etenkin keksinnön kohteena ovat farmaseutti- 3 79330 sesti käytettävät, ei-toksiset kaavan I mukaisten yhdisteiden suolat. Nämä ovat ensisijassa metalli- tai ammoniumsuo-loja, kuten alkalimetalli- tai maa-alkalimetalli-, esim. natrium-, kalium-, magnesium- tai kalsiumsuoloja, sekä ammo-niumsuoloja tai sopivien orgaanisten amiinien, kuten alempi-alkyyliamiinien, esim. trietyyliamiinin kanssa muodostettuja suoloja. Eristämiseksi tai puhdistamiseksi voidaan käyttää myös farmaseuttisesti sopimattomia suoloja. Terapeuttiseen käyttöön tulevat kuitenkin vain farmaseuttisesti käyttökelpoiset, ei-toksiset suolat, joita pidetän tästä syystä parempina .

Keksinnön mukaiset yhdisteet kuuluvat eurooppalaisen patenttihakemuksen 0025 495 yleisiin puitteisiin ja niitä voidaan käyttää immunostimulaattoreina. Yllä olevassa hakemuksessa julkaistuihin yhdisteisiin verrattuna on keksinnön mukaisilla yhdisteillä paljon vähemmän ei-toivottuja sivuvaikutuksia, etenkin ne ovat paljon vähemmän, so. käytännöllisesti katsoen ei ollenkaan pyrogeenisia. Tämä löytö on erittäin merkittävä, koska pyrogeenisen aineen antaminen mahdollisesti voi aiheuttaa termisen shokin, mistä syystä turvallinen käyttö on taattu ainoastaan jatkuvassa lääkärin valvonnassa ja määrätyt antomuodot, kuten intravenöösinen anto, eivät tule kysymykseen.

Pyrogeenisuusstesti voidaan suorittaa julkaisussa Euro-päische Pharmakopöe, osa 2, sivut 56-59 (1971) esitetyn ohjeen mukaisesesti kaneilla. Tämän mukaisesti esim. edes annettaessa subkutaanisesti korkea, kuten 30 mg/kg:n annos N-ase- 4 79330 tyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C^)-n-butyyliesteri-(C^)-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksi-forforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuolaa (yhdiste I) ei voida todeta mitään pyrogeenista vaikutusta.

5 Sitä vastoin sama annos N-asetyyli-muramyyli-L-alanyy- li-D-isoglutaminyyli-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-gly-sero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuolaa on vahvasti pyrogeeninen.

Keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää eurooppa-10 laisessa patenttihakemuksessa 0025 495 esitetyllä tavalla.

Erinomaisen siedettävyytensä johdosta ne sopivat kuitenkin erityisesti infektiosairauksien ehkäisyyn ja hoitoon, jolloin vahva vaikutus ei esiinny ainoastaan bakteerien yhteydessä, vaan yllättävästi myös virusten yhteydessä. Vii-15 meksi mainittua löytöä ei ole tähän mennessä esitetty ja sillä on suurta käytännön merkitystä, koska tähän mennessä farmaseuttisia aineita virusperäisten sairauksien hoitamiseksi on ollut käytössä täysin riittämättömässä määrin. Huomattavaa on ennen kaikkea useita päivä - muutamia viikkoja kestä-20 vä ehkäisevä tai hoitava vaikutus annettaessa kerran keksinnön mukaisia yhdisteitä, ja virusten laaja spektri, jota vastaan yhdisteet vaikuttavat.

Kaavan I mukaisia muramyylipeptidejä voidaan käyttää etenkin sellaisten sairauksien ehkäisyyn ja hoitoon, jotka 25 ovat aiheuttaneet seuraavassa lähemmin nimetyt virukset (nimikkeistön suhteen vrt. J.L.Melnick, Prog.med.Virol, 2j>, 214— 232 (1980) ja 28, 208-221 (1982)): DNA-virukset, joissa on kuutiomainen symmetria ja paljas nukleokapsidi, 30 DNA-virukset, joissa on vaipalla varustettu virioni, sekä RNA-virukset, joissa on kuutiomainen, ja sellaiset, joissa on helikaalinen kapsidin symmetria.

Edullisesti käytetään kaavan «I mukaisia yhdisteitä DNA-virusten yhteydessä, joissa on vaipalla varustettu virioni 35 ja kapsidin kuutiomainen symmetria, RNA-virusten yhteydessä, joissa on kapsidin kuutiomainen symmetria ja paljas virioni sekä RNA-virusten yhteydessä, joissa on kapsidin helikaali- 5 79330 nen symmetria ja joissa nukleokapsidivaippa sijaitsee pinta-kalvossa, mutta myös adenovirusten, poxvirusten ja korona-virusten, etenkin ihmisten sairastamien koronavirusten yhteydessä.

5 Ensisijassa käytetään kaavan I mukaisia yhdisteitä Her pes-virusten, pikornavirusten ja myksovirusten yhteydessä, mutta myös Mastadenovirusten, etenkin ihmisen sairastamien adenovirusten yhteydessä, Chordopox-virusten, kuten pääasiassa Orthopox-virusten, kuten erityisesti esim. Vaccinia-virus-10 ten yhteydessä, reovirusten, etupäässä (etenkin ihmisen sairastamien) rotavirusten yhteydessä, sekä Calici-virusten ja Phabdo-virusten, kuten ennen kaikkea ihmisen sekä hevosten, nautojen ja sikojen Vesiculo-virusten yhteydessä.

Pääasiassa käytetään kaavan I mukaisia yhdisteitä Alfa-15 herpes-virusten, Rhino-virusten, Cardio-virusten ja Ortho-myxo-virusten yhteydessä, mutta myös Betaherpes-virusten, kuten etenkin ihmisen Cytomegalo-virusten yhteydessä, apto-virusten, ensisijassa sorkkaeläinten, kuten pääasiassa nautojen aptovirusten yhteydessä, sekä Paramyxo-virusten, kuten 20 ensisijassa Pneumo-virusten, esim. ihraisen respiratoristen Syncitial-virusten, ja tämän lisäksi morbillivirusten tai paramyksovirusten, kuten esim. ihmisen parainfluessavirusten yhteydessä, mukaanlukien Sendai-virukset.

Aivan ensisijaisesti käytetään kaavan I mukaisia yhdis-25 teitä Simplex-virusten, esim. ihmisen tyypin 1 ja 2 Herpes-simplex-virusten yhteydessä, ihmisen Encefalomyocarditis-virusten yhteydessä ja influenssavirusten, kuten pääasiassa influessa-A- ja influenssa-B-virusten, esim. esimerkeissä mainittujen virusten yhteydessä.

30 Kaavan I mukaisia muramyylipeptidejä voidaan käyttää vi rusinfektioiden ehkäisyyn ja hoitoon siten, että niitä annetaan enteraalisesti tai parenteraalisesti, ensisijassa yhdessä sopivien apu- tai kantoaineiden kanssa. Mieluimmin niitä annetaan limakalvolle, esim. intranasaalisesti, rektaalises-35 ti, vaginaalisesti tai silmän sidekalvolle, tai oraalisesti. Antiviraalinen vaikutus esiintyy kuitenkin annettaessa myös muita teitä, esim. subkutaanisesti, intravenöösisti, intra- 6 79330 muskulaarisesti tai annettesssa normaalille iholle.

Mikä antotapa on sopivin riippuu mm. kulloinkin kyseessä olevan viruksen laadusta, esim. respiratoristen virusten ollessa kyseessä on useissa tapauksissa intranasaalinen anto sopiva. Vaikuttavan aineen annostus riippuu mm. lämminverisen lajista, elimistön vastustustilasta, antotavasta ja viruksen lajista.

Keksinnön mukaisilla yhdisteillä on vielä eräs mielenkiintoinen ominaisuus estää joidenkin tuumorien, etenkin keuhkojen tuumorien metastaasien muodostusta, kuten voidaan osoittaa kokeellisesti B126-BL6-melanooma-mallissa ja Lewis-keuhkokarsinoomien yhteydessä, jolloin liposomeissa tapahtuva anto on erittäin edullista.

Edullisia ovat kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa R1, R4 ja R6 merkitsevät kukin vetyä, R2 merkitsee C1_2-alkyyliä, R3 merkitsee vetyä tai metyyliä, R5 merkitsee vetyä, R7 merkitsee C1_3-alkyyliä, R® merkitsee vetyä tai C1_4-alkyyliä, X merkitsee ryhmää NH, Y merkitsee C1_3-alkylideeniä ja R9 ja R10 merkitsevät toisistaan riippumatta suoraketjuista C^.^-alkyyliä, ja näiden yhdisteiden suolat.

Edullisia ovat erityisesti kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa R1, R4 ja R6 merkitsevät kukin vetyä, R2 merkitsee metyyliä tai etyyliä, R3 merkitsee vetyä tai metyyliä, R® merkitsee vetyä, R7 merkitsee C-^-alkyyliä, R® merkitsee vetyä tai Ci^-alkyyliä, X merkitsee ryhmää NH, Y merkitsee C1_2-alkylideeniä ja R9 ja R10 merkitsevät toisistaan riippumatta suoraketjuista C11_17-alkyyliä, jossa on pariton määrä C-atomeja, ja näiden yhdisteiden suolat.

Erityisen edullisia ovat kaavan I mukaiset yllä mainitut yhdisteet, joissa R® merkitsee jotakin mainituista al-kyylitähteistä, ja näiden yhdisteiden suolat.

Aivan erityisen edullisia ovat kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa R1, R4 ja R6 merkitsevät vetyä, R2 merkitsee metyyliä tai etyyliä, R3 merkitsee vetyä, kun R2 on etyyli, tai metyyliä, kun R2 on metyyli, R5 merkitsee vetyä, R7 mer- 7 79330 kitsee C1_2~alkyyliä, R8 merkitsee suoraketjuista C1_2-alkyy-liä, X merkitsee ryhmää NH, Y merkitsee etylideeniä ja R9 ja R18 merkitsevät toisistaan riippumatta suoraketjuista alkyyliä, joissa on pariton määrä C-atomeja, ja näiden yhdisteiden suolat.

Kaikkein edullisimpia ovat yllä mainitut kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa R8 merkitsee metyyliä, R5 merkitsee vetyä, R8 merkitsee n-butyyliä, X merkitsee ryhmää NH ja/tai R9 samoin kuin R10 merkitsevät n-pentadekyyliä, ja näiden yhdisteiden suolat, sekä esimerkeissä mainitut kaavan I mukaiset yhdisteet.

Kaavan I mukaiset uudet yhdisteet ja niiden suolat voidaan valmistaa sinänsä tunnettujen menetelmien mukaisesti.

Siten ne voidaan valmistaa, kun a) kaavan V

*6och2 k4oSL_,/1 (H,0R) (V) /· LL·

Jt3-CH (D) \ f (L) S'(D) f (L) \X *

C- M- CH-C- / NH-CR-CH.-CH.-C- \ X-Y-C- ) \ OH

!Γ*(Χ Η 'JJl • r q

mukainen yhdiste, jossa s, r, ja q merkitsevät toisistaan riippumatta lukua 0 tai l ja R8 merkitsee C1_7-alkyyliä tai karboksyylisuojaryhmää ja muilla substituenteilla on yllä mainitut merkitykset, edellyttäen, että kaavan V mukaisessa yhdisteessä esiintyvät vapaat funktionaaliset ryhmät lukuunottamatta reaktioon osallistuvaa ryhmää esiintyvät mahdollisesti suojatussa muodossa, tai tämän yhdisteen karboksyyli-happojohdannainen saatetaan reagoimaan kaavan VI

8 79330

Vt IM ? w \(t)» 1 i“

Vi' > a."v u

u ^ t u V

(VI) n ίπ, l· (sn) >-/ mukaisen yhdisteen kanssa, jossa t, u ja v merkitsevät toisistaan riippumatta lukua 0 tai 1 ja substituenteilla on yllä mainitut merkitykset, edellyttäen, että t, u ja v merkitsevät lukua 1, kun kaavan V mukaisessa reaktioon osallistuvassa yhdisteessä q merkitsee lukua 0, tai että t merkitsee lukua 0, u lukua 1 ja v lukua 1, kun q merkitsee lukua 1 ja r lukua 0, tai että u on 0 ja v on 1, kun q merkitsee lukua 1, r lukua 1 ja s lukua 0, tai että v on 0, kun q, r ja s merkitsevät lukua 1, tai tämä yhdisteen reaktiokykyisen johdannaisen kanssa, ja lohkaistaan mahdollisesti esiintyvät suojaryhmät, tai

b) kaavan X

9 79330 jHj-oa6*· j(o /1 (x) R3-c/(D) L-c-r2 \ (L) (D) (L)O OR21

Il 1517 *< 2 2 II 2 2« 2 "“’A.- ‘ v°

Jc-0-£h * ittjl'Un) 0

ti°K

mukaisesta yhdisteestä, jossa R21 merkitsee vetyä tai suoja-ryhmää ja vähintään yksi tähteistä Rla, R4a, R6a ja R8a tarkoittaa helposti lohkaistavaa suojaryhmää ja muut tähteistä Rla, R4a, R6a ja R8a tarkoittavat samaa kuin R1, R4, R6 ja vastaavasti R8 edellä, ja muilla substituenteilla on yllä mainitut merkitykset, lohkaistaan suojaryhraä(t), ja haluttaessa menetelmän a) tai b) suorittamisen jälkeen muunnetaan saatu kaavan I mukainen yhdiste suolakseen tai saatu suola joksikin toiseksi suolaksi.

Menetelmä a (SN2t-reaktiot):

Karboksyylihapon reaktiokykyinen johdannainen on esim. reaktiokykyinen karboksyylihappoanhydridi tai syklinen amidi. Tällöin reaktiokykyiset happojohdannaiset voidaan muodostaa myös in situ.

Happojen aktivoituja estereitä ovat etenkin esteröivän tähteen liitäntähiiliatomissa tyydyttämättömät esterit, esim. vinyyliesterityyppiset, kuten varsinaiset vinyyliesterit (jotka voidaan saada esim. uudelleenesteröimällä vastaava esteri vinyyliasetaatilla; aktivoidun vinyyliesterin menetelmä), karbamoyylivinyyliesterit (jotka voidaan saada esim. käsittelemällä vastaava happo isoksatsoliumreagenssilla; 1,2- 79330 oksatsolium- tai Woodward-menetelmä), tai 1-alempialkoksivi-nyyliesterit (jotka voidaan saada esim. käsittelemällä vastaava happo alempialkoksiasetyleenillä; etoksiasetyleenime-netelmä), tai amidinotyyppiset esterit, kuten N,N'-disubsti-tuoidut amidinoesterit (jotka voidaan saada esim. käsittelemällä vastaava happo sopivalla N,N'-disubstituoidulla karbo-di-imidillä, esim. N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidillä; karbodi-imidi-menetelmä), tai Ν,Ν-disubstituoidut amidinoesterit (jotka voidaan saada esim. käsittelemällä vastaava happo Ν,Ν-disubstituoidulla syaaniamidilla; syaaniamidi-mene-telmä), sopivat aryyliesterit, etenkin elektroneja puoleensa vetävillä subsituenteilla sopivasti substituoidut fenyylies-terit (jotka voidaan saada esim. käsittelemällä vastaava happo sopivasti substituoidulla fenolilla, esim. 4-nitrofeno-lilla, 4-metyylisulfonyyli-fenolilla, 2,4,5-trikloorifeno-lilla, 2,3,4,5,6-pentakloori-fenolilla tai 4-fenyylidiatso-fenolilla, kondensointiaineen, kuten N,N*-disykloheksyyli-karbodi-imidin läsnäollessa; aktivoidun aryyliesterin menetelmä), syaanimetyyliesterit (jotka voidaan saada esim. käsittelemällä vastaava happo klooriasetonitriilillä emäksen läsnäollessa; syaanimetyyliesteri-menetelmä), tioesterit, etenkin mahdollisesti, esim. nitrolla substituoidut fenyyli-tioesterit (jotka voidaan saada esim. käsittelemällä vastaava happo mahdollisesti esim. nitrolla, substituoiduilla tio-fenoleilla, mm. anhydridi- tai karbodi-imidi-menetelmän avulla; aktivoitujen tioliestereiden menetelmä), tai amino- tai amidoesterit (jotka voidaan saada esim. käsittelemällä vastaava happo N-hydroksi-amido-yhdisteellä, esim. N-hydroksi-sukkinimidillä, N-hydroksi-piperidiinillä, N-hydroksi-ftali-midillä tai 1-hydroksi-bentstriatsolilla, esim. anhydridi-tai karbodi-imidi-menetelmän mukaisesti; aktivoitujen N-hydroksi-estereiden menetelmä).

Reaktiokykyisiä anhydridejä voivat olla näiden happojen symmetriset tai mieluimmin seka-anhydridit, siten esim. epäorgaanisten happojen kanssa valmistetut anhydridit, kuten 11 79330 happohalogenidit, etenkin happokloridit (jotka voidaan valmistaa esim. käsittelemällä vastaava happo tionyylikloridil-la, fosforipentakloridilla tai oksalyysikloridilla; happo-kloridimenetelmä), atsidit (jotka voidaan valmistaa esim. vastaavasta happoesteristä vastaavan hydratsidin kautta ja käsittelemällä se typpihapokkeella; atsidimenetelmä), hiili-happopuolijohdannaisten, kuten vastaavien estereiden, esim. hiilihappoalempialkyylipuoliestereiden kanssa muodostetut anhydridit (jotka voidaan saada esim. käsittelemällä vastaava happo halogeeni-, kuten kloorimuurahaishappo-alempial-kyyliestereillä tai l-alempialkoksikarbonyyli-2-alempialkok-si-l,2-dihydro-kinoliinillä, esim. l-alempialkoksikarbonyy-li-2-etoksi-l,2-dihydrokinoliinillä, O-alkyyli-hiilihappo-seka-anhydridien menetelmä), tai dihalogenoidun, etenkin di-klooratun fosforihapon kanssa muodostetut anhydridit (jotka voidaan saada esim. käsittelemällä vastaava happo fosforiok-sikloridilla; fosforioksikloridimenetelmä) tai orgaanisten happojen kanssa muodostetut anhydridit, kuten orgaanisten karboksyylihappojen kanssa muodostetut seka-anhydridit (jotka voidaan saada esim. käsittelemällä vastaava happo mahdollisesti substituoidulla alempialkaani- tai fenyylialkaani-karboksyylihappohalogenidilla, esim. fenyylietikka-, piva-liinihappo- tai trifluorietikkahappokloridillä; karboksyyli-happoseka-anhydridien menetelmä) tai orgaanisten sulfonihap-pojen kanssa muodostetut anhydridit (jotka voidaan saada esim. käsittelemällä vastaavan hapon suola, kuten alkalime-tallisuola sopivalla orgaanisella sulfonihappohalogenidilla, kuten alempialkaani- tai aryyli-, esim. metaani- tai p-tolu-eenisulfonihappokloridilla; sulfonihapposeka-anhydridien menetelmä), sekä symmetriset anhydridit (jotka voidaan saada esim. kondensoimalla vastaava happo karbodi-imidin tai 1-di-etyyliaminopropiinin läsnäollessa; symmetristen anhydridien menetelmä).

Sopivia syklisiä amideja ovat etenkin amidit, jotka on muodostettu viisijäsenisten aromaattisluonteisten diatsasyk- i2 79330 lien kanssa, kuten amidit, jotka on muodostettu imidatsolei-den, esim. imidatsolien kanssa (jotka voidaan saada esim. käsittelemällä vastaava happo N,N'-karbonyyli-imidatsolilla; imidatsolidi-menetelmä), tai pyratsolien kanssa, esim. 3,5-dimetyyli-pyratsolin kanssa (jotka voidaan saada esim. hap-pohydratsidin kautta käsittelemällä asetyyliasetonilla; pyratsolidi-menetelmä).

Mahdollisesti esiintyvien funktionaalisten ryhmien suo-jaryhmiä ovat esim. alla mainitut suojaryhmät.

Reaktio voidaan suorittaa sinänsä tunnetulla tavalla, jolloin reaktio-olosuhteet riippuvat ensisijassa siitä, onko reaktioon osallistuva karboksyyliryhmä aktivoitu ja miten se on aktivoitu, tavanomaisesti sopivan liuottimen tai laimen-nusaineen tai näiden seosten läsnäollessa, ja tarvittaessa kondensointiaineen läsnäollessa, joka esim. kun reaktioon osallistuva karboksyyliryhmä esiintyy anhydridinä, voi olla myös happoa sitova aine, jäähdyttämällä tai lämmmittämällä, esim. n. -30 - n. +150eC:n lämpötila-alueella, suljetussa reaktioastiassa ja/tai inertin kaasun, esim. typen atmosfäärissä. Tavanomaisia kondensointiaineita ovat esim. karbodi-imidit, esimerkiksi Ν,Ν'-dietyyli-, N,N'-dipropyyli-, N,N' -disykloheksyyli- tai N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminopropyyli)-karbodi-imidi, sopivat karbonyyliyhdisteet, esimerkiksi kar-bonyylidi-imidatsoli, tai 1,2-oksatsolium-yhdisteet, esim. 2-etyyli-5-fenyyli-l,2-oksatsolium-3'-sulfonaatti ja 2-tert.-butyyli-5-metyyli-isoksatsolium-perkloraatti, tai sopiva asyyliaminoyhdiste, esim. 2-etoksi-l-etoksikarbonyyli-l,2-dihydrokinoliini. Tavanomaisia happoa sitovia kondensointiaineita ovat esim. alkalimetallikarbonaatit tai -vetykarbo-naatit, esim. natrium- tai kaliumkarbonaatti tai -vetykarbo-naatti (tavanomaisesti yhdessä sulfaatin kanssa), tai orgaaniset emäkset, kuten tavallisesti steerisesti estyneet tri-alempialkyyliamiinit, esim. N,N-di-isopropyyli-N-etyyli-amiini.

Suojaryhmiä, niiden liittämistä ja lohkaisemista on esi- i3 79330 tetty esimerkiksi julkaisuissa "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, Lontoo, New York 1973, ja "Methoden der organischen Chemie", Houben-Weyl, 4. painos, osa 15/1, Georg-Thieme-verlag, Stuttgart 1974. Luonteenomaista suoja-ryhmille on, että ne voidaan lohkaista helposti, so. ilman että tapahtuu ei-toivottuja sivureaktioita, esim. solvolyyt-tisesti, pelkistävästi, fotolyyttisesti tai myös fysiologisissa olosuhteissa.

Hydroksisuojaryhmlä ovat esim. asyylitähteet, kuten mahdollisesti esim. halogeenilla substituoitu alempialkano-yyli, kuten 2,2-diklooriasetyyli, tai hiilihappopuolieste-reiden asyylitähteet, etenkin tert.-butyylioksikarbonyyli, mahdollisesti substituoidut bentsyylioksikarbonyyli, esim.

4-nitro-bentsyylioksikarbonyyli, tai difenyylimetoksikarbo-nyyli, tai 2-halogeeni-alempialkoksikarbonyyli, kuten 2,2,2-trikloorietoksikarbonyyli, edelleen trityyli tai formyyli, tai orgaaniset silyyli- tai stanyylitähteet, edelleen helposti lohkaistavat eetteröivät ryhmät, kuten tert.-alempial-kyyli, esim. tert.-butyyli, 2-oksa- tai 2-tia-alifaattiset tai -sykloalifaattiset hiilivetytähteet, ensisijassa 1-alem-pialkoksi-alempialkyyli tai l-alempialkyylitio-alempial-kyyli, esim. metoksimetyyli, 1-metoksietyyli, l-etoksietyy-li, 1-metyylitiometyyli, 1-metyylitioetyyli tai 1-etyylitio-etyyli tai 2-oksa- tai 2-tiasykloalkyyli, jossa on 5-6 ren-gasatomia, esim. tetrahydrofuryyli tai 2-tetrahydropyranyyli tai vastaavat tia-analogit, sekä mahdollisesti substiutoitu l-fenyyli-alempialkyyli, kuten mahdollisesti substituoitu bentsyyli tai difenyylimetyyli, jolloin fenyylitähteiden substituentteina tulevat kysymykseen esim. halogeeni, kuten kloori, alempialkoksi, kuten metoksi ja/tai nitro.

Kuten edellä on mainittu, voidaan kaavan V mukaisten happojen johdannaiset muodostaa myös in situ. Siten voidaan muodostaa esim. N,N'-disubstituoidut amidinoesterit in situ niin, että kaavan VI mukaisen lähtömateriaalin ja kaavan V mukaisen hapon seos saatetaan reagoimaan sopivan N,N'-di- 14 79330 substituoidun karbodi-imidin, esim. Ν,Ν·-disykloheksyylikar-bodi-imidin läsnäollessa. Edelleen voidaan kaavan V mukaisten happojen amino- tai amidoesterit muodostaa kaavan VI mukaisen asyloidun lähtöaineen läsnäollessa niin, että vastaavien happo- ja amino-lähtöaineiden seos saatetaan reagoimaan N,N'-disubstituoidun karbodi-imidin, esim. N,N'-disyklohek-syyli-karbodi-imidin ja N-hydroksi-amiinin tai N-hydroksi-amidin, esim. N-hydroksisukkinimidin läsnäollessa, mahdollisesti sopivan emäksen, esim. 4-dimetyyliamino-pyridiinin läsnäollessa.

Kaavan VI mukaisen yhdisteen johdannainen, jossa reaktioon osallistuva aminoryhmä esiintyy reaktiokykyisessä muodossa, voidaan valmistaa esim. saattamalla reagoimaan fos-fiitin, esim. dietyylikloorifosfiitin, etyleeni-kloori-fos-fiitin, 1,2-fenyleeni-kloori-fosfiitin, etyyli-dikloori-fosfiitin tai tetraetyylipyrofosfiitin kanssa. Kaavan VI mukaisen yhdisteen reaktiokykyinen muoto on esim. myös karba-miinihappohalogenidi tai isosyanaatti, jolloin reaktioon osallistuva aminoryhmä on kaavan VI mukaisessa yhdisteessä sidottu halogeenikarbonyyliin, esim. kloorikarbonyyliin tai vast, se esiityy isosyanatoryhmänä.

Mieluimmin saatetaan kaavan V mukaisen yhdisteen reaktiokykyinen karboksyylihappojohdannainen reagoimaan kaavan VI mukaisen yhdisteen kanssa, jossa reaktioon osallistuva amino- tai hydroksiryhmä esiintyy vapaassa muodossa.

Lopuksi voidaan saattaa myös kaavan V mukainen vapaa happo reagoimaan kaavan VI mukaisen yhdisteen kanssa, missä reaktioon osallistuva ryhmä esiintyy aktivoidussa muodossa.

Kaavojen V ja VI mukaiset lähtöaineet ovat tunnettuja tai ne voidaan valmistaa sinänsä tunnettujen menetelmien, esim. tässä hakemuksessa esitettyjen menetelmien mukaisesti. Menetelmä b (suojaryhmien lohkaisu):

Suojaryhminä käytetään esim. yllä mainittuja. Kaksiarvoisia hydroksisuojaryhmiä ovat etenkin mahdollisesti subs-tituoidut alkylideeni- tai sykloalkylideeniryhmät. Alkyli- 15 79330 deeni on siinä etenkin alempialkylideeni, kuten isopropyli-deeni, ja sykloalkylideeni on ensisijasa syklopentylideeni tai sykloheksylideeni. Alkylideenitähteiden substituentteina mainittakoon etenkin aromaattiset tähteet, esim. fenyylitäh-teet.

Tässä hakemuksessa mainittujen suojaryhmien lohkaisu yleensä ja menetelmän b mukainen lohkaisu etenkin tapahtuu sinänsä tunnetulla tavalla solvolyysillä, etenkin hydrolyy-sillä, alkoholyysillä tai asidolyysillä, tai joissakin tapauksissa myös varovaisen pelkistyksen avulla, mahdollisesti asteittain tai samanaikaisesti. Silyylisuojaryhmät lohkaistaan edullisesti fluorideilla, esim. tetraetyyliammonium-fluoridilla.

Yllä mainittujen menetelmien suorittamiseksi tarvittavat lähtöaineet ovat tunnettuja tai ne voidaan valmistaa sinänsä tunnettujen menetelmien mukaisesti, esim. jonkin edellä selitetyn menetelmän mukaisesti.

Kaavan I mukaisten yhdisteiden suolat syntyvät useimmiten jo viimeistelyssä, esim. dialyysissä pH-arvoltaan 7 olevaa puskuriliuosta vastaan. Ne voidaan valmistaa sinänsä tunnettuna tavalla. Näin voidaan kaavan I mukaisten yhdisteiden suoloja valmistaa esim. käsittelemällä metalliyhdisteil-lä, kuten sopivien orgaanisten karboksyylihappojen alkalime-tallisuoloilla, esim. α-etyyli-kapronihapon natriumsuolalla, tai epäorgaanisilla alkali- tai maa-alkalimetalliyhdisteil-lä, kuten vastaavilla hydroksideilla, karbonaateilla tai ve-tykarbonaateilla, kuten natrium- tai kaliumhydroksidilla, -karbonaatilla tai -vetykarbonaatilla, tai vastaavilla kal-siumyhdisteillä tai ammoniakilla tai sopivilla orgaanisilla amiineilla, jolloin käytetään mieluimmin suolanmuodostavan aineen stökiometrisiä määriä tai pientä ylimäärä.

isomeerien seokset voidaan erottaa sinänsä tunnetulla tavalla, esim. jakokiteytyksellä, kromatografialla jne. yksittäisiksi isomeereiksi, rasemaateiksi esim. muodostamalla johdannaisia optisesti aktiivisten yhdisteiden kanssa ja 16 79330 erottamalla näin saatavat diastereomeeriseokset optiseti aktiivisiksi antipodeiksi.

yllä esitetyt menetelmät, mukaan lukien menetelmät suo-jaryhmien lohkaisemiseksi ja ylimääräiset menetelmävaiheet suoritetaan sinänsä tunnetulla tavalla liuottimien ja lai-mennusaineiden läsnäollessa tai ilman niitä, tarvittaessa kondensointiaineiden tai katalysaattoreiden läsnäollessa, alennetussa tai korotetussa lämpötilassa, esim. n. -20 - n. 150°C:n lämpötila-alueella, suljetussa astiassa ja/tai iner-tin kaasun, esim. typen atmosfäärissä.

Tällöin on käytettävä ottaen huomioon kaikki molekyylissä olevat substituentit, tarvittaessa, esim. helposti hydrolysoitavien lähteiden läsnäollessa, erittäin säästeliäitä reaktio-olosuhteita, kuten lyhyitä reaktioaikoja, mietojen happamien tai emäksisten aineiden käyttöä alhaisemmassa konsentraatiossa, stökiometrisiä määräsuhteita, sopivien katalysaattoreiden, liuottimien, lämpötila- ja/tai pai-neolosuhteiden valintaa.

Keksinnön kohteena ovat myös ne menetelmän suoritusmuodot, joissa lähtöaine käytetään reaktiokykyisen johdannaisen tai suolan muodossa. Tällöin lähdetään mieluimmin sellaisista lähtöaineista, jotka johtavat menetelmän mukaisesti yllä erittäin arvokkaiksi esitettyihin yhdisteisiin.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä ja niiden farmaseuttisesti käyttökelpoisia suoloja voidaan käyttää farmaseuttisina valmisteina, jotka sisältävät farmakologisesti vaikuttavan määrän aktiivista ainetta, mahdollisesti yhdessä farmaseuttisesti käytettävien kantoaineiden kanssa, jotka soveltuvat annettaviksi enteraalisesti, esim. oraalisesti tai rektaalisesti, tai parenteraalisesti ja jotka voivat olla epäorgaanisia tai orgaanisia, kiinteitä tai nestemäisiä. Näin käytetään tabletteja tai gelatiinikapseleita, jotka sisältävät vaikuttavan aineen yhdessä laimennusaineiden, esim. laktoosin, destroosin, 17 79330 sakkaroosin, mannitolin, sorbitolin, selluloosan ja/tai gly-seriinin, ja/tai voiteluaineiden, esim. piimään, talkin, stea-riinihapon tai sen suolojen, kuten magnesium- tai kalsiumstea-raatin, ja/tai polyeteeniglykolin kanssa. Tabletit voivat si-5 sältää samoin sideaineita, esim. magnesiumalumiinisilikaattia, tärkkelyksiä, kuten maissi-, vehnä- tai riisitärkkelystä, gelatiinia, metyyliselluloosaa, natriumkarboksimetyyliselluloo-saa ja/tai polyvinyylipyrrolidonia, ja haluttaessa hajotus-aineita, esim. tärkkelyksiä, agar-agaria, algiinihappoa tai 10 sen suolaa, kuten natriumalginaattia, ja/tai kuohuseoksia, tai adsorptioaineita, väriaineita, makuaineita tai makeuttimia. Edelleen voidaan esillä olevan keksinnön farmakologisesti vaikuttavia yhdisteitä käyttää parenteraalisesti annettavien valmisteiden tai infuusioliuosten muodossa. Tällaiset liuok-15 set ovat etupäässä isotonisia vesipitoisia liuoksia tai suspensioita, jolloin nämä voidaan valmistaa ennen käyttöä esim. lyofilisoitujen valmisteiden ollessa kyseessä, jotka sisältävät vaikuttavan aineen yksinään tai yhdessä kantomateriaalin, esim. manniitin kanssa. Farmaseuttiset valmisteet voivat olla 20 steriloituja ja/tai ne voivat sisältää apuaineita, esim. säilöntä-, stabilointi-, kostutus- ja/tai emulgointiaineita, liukoiseksi tekeviä aineita, suoloja osmoottisen paineen säätämiseksi ja/tai puskuriaineita. Esillä olevat farmaseuttiset valmisteet, jotka haluttaessa voivat sisältää muita farmako-25 logisesti vaikuttavia aineita, kuten antibiootteja, voidaan valmistaa sinänsä tunnetulla tavalla, esim. tavanomaisten sekoitus-, granulointi-, rakeistus-, liuotus- tai lyofilisoin-timenetelmien avulla ja ne sisältävät n. 0,001-99 %, etenkin n. 0,01 - n. 10 %, ensisijassa 0,1-5 % aktiivista ainetta, 30 jolloin alle 1 %:n vaikuttavan aineen konsentraatio soveltuu etenkin paikallisesti käytettäviin valmisteisiin.

Virusinfektioiden ehkäisyyn ja hoitoon soveltuvat etenkin seuraavat paikallisesti annettavat antomuodot: voiteet, salvat tai tahnat, joiden vaikuttavan aineen pitoisuus on 35 0,001-1 %, etenkin 0,01-0,1 %, esim. 0,05 %, esim. salvat, jotka on tarkoitettu annettaviksi intranasaalisesti, tai huu-lipuikot, tai vesipitoiset liuokset, joiden vaikuttavan aineen 18 79330 pitoisuus on 0,001-1 %, etenkin 0,05-0,5 %, esim. 0,1 %, mieluimmin isotoniset, steriilit ja fysiologisesti sopivat liuokset, esim. silmätipat, mieluimmin mikrosäiliöissä, jotka on tarkoitettu kertakäyttöön, tai sprayt, jotka on tarkoitettu 5 käytettäviksi suu- ja nielualueella.

Erittäin sopivia ovat esimerkeissä esitetyt farmaseuttiset valmisteet.

Voiteet ovat öljy-vesi-emulsioita, jotka sisältävät yli 50 % vettä, öljyisenä perustana käytetään ensisijassa rasva-10 alkoholeja, esim. lauryyli-, setyyli- tai stearyylialkoholia, rasvahappoja, esim. palmitiini- tai steariinihappoa, nestemäisiä - kiinteitä vahoja, esim. isopropyylimyristaattia, villavahaa tai mehiläisvahaa, ja/tai hiilivetyjä, esim. vaseliinia (Petrolatum) tai parafiiniöljyä. Emulgaattoreina tule-15 vat kysymykseen pinta-aktiiviset aineet, joilla on etupäässä hydrofiilisiä ominaisuuksia, kuten vastaavat ei-ioniset emul-gaattorit, esim. polyalkoholien rasvahappoesterit tai niiden etyleenioksidiadduktit, kuten polyglyseriinirasvahappoesteri tai polyoksietyleenisorbitaani-rasvahappoesteri (Tweens), 20 edelleen polyoksietyleeni-rasva-alkoholieetterit tai -rasvahappoesterit, tai vastaavat ioniset emulgaattorit, kuten ras-va-alkoholisulfaattien alkalimetallisuolat, esim. natriumlau-ryylisulfaatti, natriumsetyylisulfaatti tai natriumstearyyli-sulfaatti, joita käytetään tavanomaisesti rasva-alkoholien, 25 esim. setyylialkoholin tai stearyylialkoholin läsnäollessa.

Vesifaasin lisäaineita ovat mm. aineet, jotka vähentävät voiteen kuivumista, esim. polyalkoholi, kuten glyseriini, sor-biitti, propyleeniglykoli ja/tai polyeteeniglykoli, edelleen säilöntäaineet, hajusteet jne.

30 Salvat ovat vesi-öljy-emulsioita, jotka sisältävät kor keintaan 70 %, mieluimmin kuitenkin n. 20 - n. 50 % vettä tai vesipitoista faasia. Rasvafaasina tulevat kysymykseen ensisijassa hiilivedyt, esim. vaseliini, parafiiniöljy ja/tai kovaparafiinit, jotka sisältävät vedensitomiskyvyn parantami-35 seksi edullisesti sopivia hydroksiyhdisteitä, kuten rasva-alkoholeja tai niiden estereitä, esim. setyylialkoholia tai villavaha-alkoholeja, tai vast, villavahaa.

19 79330

Emulgaattoreita ovat vastaavat lipofiiliset aineet, kuten sorbitaani-rasvahappoesterit (Spans), esim. sorbitaani-oleaatti ja/tai sorbitaani-isostearaatti. Vesifaasin lisäaineita ovat esim. kosteudenpysyttimet, kuten polyalkoholit, 5 esim. glyseriini, propyleeniglykoli, sorbiitti ja/tai poly-eteeniglykoli, sekä säilöntäaineet, hajusteet jne.

Rasvasalvat ovat vedettömiä ja ne sisältävät perustana etenkin hiilivetyjä, esim. parafiinia, vaseliinia ja/tai nestemäisiä parafiineja, edelleen luonnollisia tai osittain syn-10 teettisiä rasvoja, esim. kookosrasvahappotriglyseridiä, tai mieluimmin kovettuja öljyjä, esim. hydrattua maapähkinä- tai risiiniöljyä, edelleen glyseriinin rasvahappo-osaestereitä, esim. glyseriinimono- tai -distearaattia, sekä esim. salvojen yhteydessä mainittuja, veden sitomiskykyä parantavia ras-15 va-alkoholeja, emulgaattorieta ja/tai lisäaineita.

Tahnat ovat voiteita ja salvoja, joissa on eritteitä absorboivia jauheaineosia, kuten metallioksideja, esim. titaanioksidia tai sinkkioksidia, edelleen talkkia ja/tai alumii-nisilikaatteja, joiden tehtävänä on sitoa esiintyvä kosteus 20 tai eritteet.

Vaahdot annetaan painesäiliöistä ja ne ovat aerosoli-muodossa esiintyviä nestemäisiä öljy-vesi-emulsioita, jolloin ponneaineina käytetään halogenoituja hiilivetyjä, kuten kloo-rifluorialempialkaaneja, esim. diklooridifluorimetaania tai r25 diklooritetrafluorietaania. öljyfaasina käytetään mm. hiili vetyjä, esim. parafiiniöljyä, rasva-alkoholeja, esim. setyy-lialkoholia, rasvahappoestereitä, esim. isopropyylimyristaat-tia, ja/tai muita vahoja. Emulgaattoreina käytetään mm. sellaisten yhdisteiden seoksia, joilla on etupäässä hydrofiilisiä 30 ominaisuuksia, kuten polyoksietyleeni-sorbitaani-rasvahappo-esteriä (Tweens), ja sellaisten yhdisteiden seoksia, joilla on etupäässä lipofiilisia ominaisuuksia, kuten sorbitaaniras-vahappoesteriä (Spans). Tämän lisäksi tulevat tavanomaiset lisäaineet, kuten säilöntäaineet jne.

35 Tinktuuroissa ja liuoksissa on useimmiten vesipitois- etanolinen perusta, joihin on lisätty mm. polyalkoholeja, esim. glyseriiniä, glykoleja, ja/tai polyeteeniglykolia, kos- 20 79330 teudenpysyttimiksi haihtumisen vähentämiseksi/ ja takaisin rasvoittavia aineita/ kuten rasvahappoestereitä alempien po-lyeteeniglykolien kanssa/ so. vesipitoisessa seoksessa liukenevia, lipofiilisia aineita korvaukseksi etanolilla ihosta 5 poistetuille rasva-aineille, ja tarvittaessa muita apu- ja lisäaineita.

Paikallisesti käytettävien farmaseuttisten valmisteiden valmistus tapahtuu sinänsä tunnetulla tavalla, esim. liuottamalla tai suspendoimalla vaikuttava aine perustassa tai sen 10 osassa tarvittaessa. Käsiteltäessä vaikuttavaa ainetta liuoksena tämä liuotetaan yleensä ennen emulgointia toiseen faaseista; käsiteltäessä suspeniota se sekoitetaan emulgoinnin jälkeen perustan osan kanssa ja lisätään sitten valmisteen muuhun osaan.

15 Vaikuttavan aineen annostus riippuu eri tekijöistä, ku ten antotavasta, lajista, elimistön vastustuskyvystä sekä ratkaisevassa määrin käsiteltävän sairauden laadusta. Siten ovat päivittäin annettavat annokset annettaessa oraalisesti n. 70 kg painavalle lämminveriselle n. 0,0001-0,1 g, jolloin alle 20 0,001 g:n annostusta käytetään ensisijassa metastaasien muo dostumisen välttämiseksi primäärituumorin poistamisen jälkeen.

Virusinfektion ennaltaehkäisemiseksi annetaan n. 0,5-n. 50 mg:n, mieluimmin 25-15 mg:n, esim. 7 mg:n kerta-annos vaikuttavaa ainetta n. 70 kg painavalle lämminveriselle, esi-25 merkiksi ihmisille. Tarvittaessa suuremman tartuntavaaran aikoina toistetaan tämän annoksen anto 1-3 viikon välein, esim. joka 2. viikko.

Terapeuttinen annos 70 kg painavalle lämminveriselle on virusinfektiossa 1-50 mg, mieluimmin 5-20 mg, esim. 10 mg, 30 etenkin oraalisesti annettaessa. Annostus intranasaalisesti annettaessa on jopa kummenesosa tästä. Tarvittaessa toistetaan kaavan I mukaisten heksapyranoosiyhdisteiden antaminen muutaman päivän, esim. 1-3 päivän välein, kunnes sairaus paranee.

35 Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä rajoit tamatta sitä missääm muodossa. Rf-arvot selvitetään Kieselgel- ohutkerroslevyillä (Merck). Eluenttien suhde käytetyissä 21 79330 eluenttiseoksissa toisiinsa on esitetty tilavuusosina (V/V), lämpötilat on esitetty Celsius-asteina.

Esimerkki 1; 3,60 g (5,66 mmoolia) N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-5 D-glutamiinihappo-(C )-n-butyyliesteriä (0,6 moolia H^O) ja 0,88 g (7,54 mmoolia) N-hydroksisukkinimidiä liuotetaan sekoittaen 20 ml:an kloroformin ja metanolin 4:1-seosta. Lisätään 1,60 g (7,54 mmoolia) kiinteää disykloheksyylikarbodi-imidiä ja lisätään tipoittain neljän tunnin kuluessa huoneen 10 lämpötilassa yhtäjaksoisesti liuosta, jossa on 3,7 g (4,72 mmoolia) L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydrok-sifosforyylioksi)-etyyli-amidi-natriumsuolaa 40 ml:ssa kloroformia. Tunnin kuluttua haihdutetaan reaktioliuos kiertohaih-duttimessa voimakkaasti, lisätään 200 ml dioksaania ja lyo-15 filisoidaan.

Raakatuote suspendoidaan 100 ml:an kloroformia, lisätään 600 ml etikkahappoetyyliesteriä ja tätä kaikkea sekoitetaan tunnin ajan jääkylvyssä. Liukenematon disykloheksyyli-virtsa-aine suodatetaan pois, suodos haihdutetaan kuivaksi.

20 Jäännös puhdistetaan 700 g:n Kieselgel 60 reinst (Merck, raekoko: 70-230 mesh ASTM) pylväässä, jonka läpimitta on 4,5 cm ja pituus 80 cm, järjestelmässä kloroformi:metanoli:vesi = 70:30.5. Materiaali liuotetaan sitä varten 14 ml:an eluenttia ja saatetaan pylvään päälle. Valutetaan pylvään läpi kaksi 25 kertaa 500 ml seosta, minkä jälkeen otetaan 10 ml:n fraktiot. Fraktioihin 133-152 ja 153-236 sisältyvä materiaali kootaan kulloinkin ja alistetaan erikseen diasuodatukseen. Pääfraktion kohdalla toimitaan seuraavasti: Liuotetaan materiaali 300 ml: an kahdesti tislattua vettä, lämmitetään lyhyesti 40°:n läm-30 potilaan ja poistetaan liukenematon disykloheksyylivirtsa- aine jäähtymisen jälkeen sentrifugoimalla. Päällä oleva aine pannaan dialysointikennoon (valmistaja: Amicon Corporation, Danvers, Massachusetts, 01932 USA, malli 402, ultrasuodatin PM 10/76 mm 0, inertttejä, ei-ionisia polysulfoniperustaisia 35 polymeerejä, keskimääräinen huokoskoko 10 A) ja dialysoidaan 4 atmrssa kahdesti tislattua vettä (1,5 1), fosfaattipuskuri/ natriumkloridia (0,5 1, kumpikin 0,1 molaarinen, 1:1, pH=7) 22 79330 ja vettä vastaan (1,5 1), kunnes kloridivapaa. Sisädialysaat-ti (70 ml) steriili-suodatetaan Millipore-suodattimella (0,2 y) ja lyofilisoidaan. Saadaan N-asetyyli-muramyyli-L-alanyy-li-D-glutamyyli-(C^)-n-butyyliesteri(C^)-L-alaniini-2-(1,2-5 dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliami-di-natriumsuolaa (3,4 moolia H2O) värittömänä jauheena, jonka arvot ovat (a)^ = +14 ± 1° (c = 0,44. vesi), R^ = 0,37 (kloroformi-metanoli:vesi=70:30:5) ja = 0,64 (etikkahappo-etyyl.iesteri:n-butanoli:pyridiini:etikkahappo:vesi = 42:21: 10 21:6:10).

C63H11502()N5PNa · 3,41 H20 (1 381 ,63) laskettu C 54,77 H 8,94 N 5,07 P 2,24 H2<3 4,71 saatu 54,3 9,1 5,6 2,3 4,7 C63H115°20N5PNa (1316,59) 15 laskettu Na 1,75 saatu 1,57.

Lähtömateriaali valmistetaan seuraavasti: 5,5 g (8,1 mmoolia) 4,6-O-isopropylideeni-N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(C^)-n-butyyli-(C^)-20 bentsyyliesteriä, joka on liuotettu 60 ml:aan etikkahappoa, annetaan seistä yön yli huoneen lämpötilassa. Hieman kellertävä liuos haihdutetaan kiertohaihduttimessa 30°:ssa puoleen tilavuuteen, sekoitetaan 300 ml:aan dioksaania ja sitten se lyofilisoidaan. 4,8 g:an (n. 7,5 mmoolia) raakatuotetta, joka 25 on liuotettu 100 ml:aan dimetoksietaanin ja veden seosta (9:1), lisätään 0.8 g palladiumoksidi-hiilikatalysaattoria (10 %:sta) ja sitä käsitellään neljän tunnin ajan vedyllä. Katalysaattori imetään pois, suodos haihdutetaan kuivaksi ja jäännös puhdistetaan suorittamalla kaksi kertaa kromatografia Kieselgel 30 60:11a (Merck, 1:200, 10 ja 5 ml:n fraktiot) järjestelmässä kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5. Tuotteen sisältävät fraktiot yhdistetään ja liuotin haihdutetaan. Raakatuote, joka esiintyy osittain natriumsuolan muodossa (Kieselgel'istä), liuotetaan 40 ml:an kahdesti tislattua vettä ja pannaan hyvin 35 esipuhdistetun, vahvasti happamen ioninvahtimen (50 ml, DOWEX 50 W X8 50/100 mesh, H^-muoto) päälle ja pylväs pestään kaiken kaikkiaan 100 ml:11a kahdesti tislattua vettä. Eluaatti 23 79330 suodatetaan Millipore-suodattimen (0,2 μ) läpi ja lyofilisoi-daan. Saadaan 3,7 g (69 % teoreettisesta) N-asetyyli-muramyy-li-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(C )-n-butyyliesteriä värittömänä jauheena, joka sisältää 0,6 moolia vettä ja jonka ar-5 vot ovat (aj^ = +45 ± 1° (c = 1,142; metanoli) , = 0,23 (kloroformi:metanoli:vesi =70:30:5) ja Rf = 0,40 (n-butano-li:etikkahappo:vesi = 75:7,5:21).

Lähtömateriaali valmistetaan seuraavasti: 4,4 g (11 mmoolia) N-asetyyli-4,6-O-isopropylideeni-10 muramiinihappo-natriumsuolaa (2,5 mmoolia/g) suspendoidaan 60 ml:an abs. dimetyyliformamidia. Sekoittamalla hyvin lisätään peräkkäin 4,4 g (11 mmoolia) L-alanyyli-D-glutamiinihap-po-(C^)-n-butyyliesteri-(C^)-bentsyyliesteri-hydrokloridia, 2,53 g (22 mmoolia) N-hydroksisukkinimidiä ja lopuksi 2,5 g 15 (12,1 mmoolia) disykloheksyylikarbodi-imidiä ja tätä kaikkea sekoitetaan yön yli huoneen lämpötilassa. Viimeistelyä varten 4 suspensio laimennetaan 100 ml:11a etikkahappoetyyliesteriä ja sekoitetaan puoli tuntia 0°:ssa, minkä jälkeen liukenematon (disykloheksyylivirtsa-aine, natriumkloridi) suodatetaan pois. 20 Suodos haihdutetaan suurtyhjössä 30°:ssa, jäännös otetaan 400 ml:an etikkaesteriä ja uutetaan kymmenen kertaa kulloinkin 50 ml:11a kahdesti tislattua vettä. Orgaanisen faasin kuivattamisen ja liuottimen haihduttamisen jälkeen jää jäljelle 5,6 g N-asetyyli-4,6,-O-isöpropylideeni-L-alanyyli-D-glutamiinihap-25 po-(C )-n-butyyliesteri-(C )-bentsyyliesteriä amorfisena jauhee- / Ct O Λ Ύ na, jonka arvot ovat (a)D = +30 ± 1° (c = 0,932: metanoli),

Rf = 0,87 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5) ja R^ = 0,83 (n-butanoli:etikkahappo:vesi = 75:7,5:21).

Lähtötuote saadaan seuraavasti: 30 5,6 g:an (12,1 mmoolia) N-tert.butyylioksikarbonyyli-

L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(C )-n-butyyliesteri-(C )-bentos Y

syyliesteriä, joka on liuotettu 20 ml:an abs. etikkahappoetyyliesteriä, lisätään tipoittain sekoittaen hyvin ja sulkemalla kosteus pois 50 ml 4,5N suolahappoa abs. etikkaesteris-35 sä ja tämän kaiken annetaan seistä tunnin ajan 0°:ssa. Kellertävä liuos haihdutetaan huoneen lämpötilassa n. 20 ml:ksi, sekoitetaan 150 ml:an dioksaania ja lyofilisoidaan. Saadaan 24 79330 4,75 g (97% teoreettisesta) L-alanyyli-D-glutamiinihappo- (C )-n-butyyliesteri-(C )-bentsyyliesteri-hydrokloridia et y värittömänä öljynä, jonka arvot ovat (a)p^ = +19 +1° (c = 0,313; metanoli), 5 = 0,58 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5) ja =0,56 (etikkahappoetyyliesteri:n-butanoli:pyridiini: vesi = 42:21:6:10) Lähtötuote saadaan seuraavasti: 8,5 g:aan (25,8 mmoolia) D-glutamiinihappo-(C^)-n-10 butyyliesteri-(C^)-bentsyyliesteri-hydrokloridia ja 7,4 g:aan (25,8 mmoolia) N-tert.butyylioksikarbonyyli-L-alanii-ni-N-hydroksisukkinimidiesteriä, jotka on liuotettu 150 ml:aan abs. dimetyyliformamidia, lisätään 2,6 g (25,8 mmoolia) N-metyyli-morfoliinia ja tämän kaiken annetaan seistä 15 20 tuntia huoneenlämpötilassa. Kirkas, keltainen liuos haihdutetaan suurtyhjössä 30°C:ssa, puolikiinteä jäännös otetaan 500 ml:aan etikkahappoetyyliesteriä ja uutetaan seitsemän kertaa kulloinkin 50 ml:11a vettä. Orgaaninen faasi kuivataan vedettömällä natriumsulfaatilla. Etikka-20 esterin haihduttamisen jälkeen jäljelle jäävä jäännös puhdistetaan kromatografiällä 600 g:ssa Kieselgel 60:a (Merck, raekoko 70-230 mesh ASTM) järjestelmässä kloroformi:metano-li= 98:2. Fraktioihin 36 - 82 sisältyvä materiaali kootaan ja kuivataan. Saadaan N-tert.-butyylioksikarbonyyli-L- 25 alanyyli-D-glutamiinihappo-(C )-n-butyyliesteri-(C )- ot y bentsyyliesteriä värittömänä öljynä, jonka arvot ovat (a)j^ = +7 +1° (c = 0,315; dimetyyliformamidi), =0,73 (kloroformi:isopropanoli:etikkahappo=70:8:2) ja Rf =0,75 (n-butanoli:etikkahappo:vesi = 75:7,5:21).

30 Lähtömateriaali saadaan seuraavasti: 11,0 g:aan (30 mmoolia) N-tert.butyylioksikarbonyyli- D-glutamiinihappo-(C )-n-butyyliesteri-(C )-bentsyyliesteriä, oi y joka on liuotettu 25 ml:aan abs. etikkahappoetyyliesteriä, lisätään kylmässä sekoittaen ja sulkemalla kosteus pois 35 25 ml 4N HCl:a abs. etikkahappoetyyliesterissä ja annetaan tämän kaiken seistä tunnin ajan. Helposti haihtuvat osat haihdutetaan pois 25°C:ssa, öljyinen jäännös otetaan 150 25 7 9 3 3 0 ml:aan abs. dietyylieetteriä ja viimeksi mainittu haihdutetaan jälleen (3 kertaa). öljyinen jäännös kuivataan nat-ronasbestin päällä puolityhjössä. Saadaan D-glutamiinihap-po-(Ca)-n-butyyliesteri-(C^)-bentsyyliesteri-hydrokloridia, 5 jonka arvot ovat (a)p^ = -9 +1° (c = 0,646; metanoli),

Rj = 0,82 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5) ja =0,68 (etikkahappoetyyliesteri:n-butanoli:pyridiini: etikkahappo:vesi = 42:21:21:6:10).

10 Lähtömateriaali saadaan seuraavasti: 20,0 g (64,6 mmoolia) N-tert.butyylioksikarbonyyli-D-glutamiinihappo-(C^)-bentsyyliesteriä liuotetaan 750 ml:aan abs. tetrahydrofuraania, 21,05 g (64,6 mmoolia) cesium-karbonaattia (Fluka, purum), joka on liuotettu 80 ml:aan 15 vettä, lisätään tipoittain ja tämä kaikki haihdutetaan vesi-suihkutyhjössä kuivaksi. Jäännös otetaan 200 ml:aan abs. dimetyyliformamidia, liuotin haihdutetaan ja tämä toiminta toistetaan. Suurtyhjössä suoritetun kuivauksen jälkeen saatu kiteinen jäännös liuotetaan litraan abs. dimetyyliforma-20 midia ja lisätään tipoittain siihen sekoittaen 13,3 g (97 mmoolia) n-butyylibromidia. 18 tuntia huoneenlämpötilassa kestävän sekoituksen jälkeen muodostunut suspensio suodatetaan, suodos haihdutetaan puoleen tilavuuteen ja kun on lisätty litra etikkahappoetyyliesteriä uutetaan kymmenen ker-25 taa nopeasti kulloinkin 100 ml:11a vettä. Orgaaninen faasi kuivataan natriumsulfaatin päällä ja haihdutetaan, öljyinen jäännös otetaan 100 ml:aan dietyylieetteriä ja saatetaan kiteytymään lisäämällä 1800 ml petrolieetteriä ja jättämällä seisomaan -10°:ssa. Kidemassa imetään pois, pestään ja 30 kuivataan. Saadaan N-tert.butyylioksikarbonyyli-D-glutamii-nihappo-(Ca)-n-butyyliesteri-(C^)-bentsyyliesteriä värittöminä neulasina, sp. 70-71° arvoilla (a)^ = 20 +1° (c = 1,149; metanoli) , R^ =0,77 (kloroformi:isopropanoli:etikkahappo=30:8:2) ja 35 = 0,92 (etikkahappoetyyliesteri:n-butanoli:pyridiini: etikkahappo:vesi = 42:21:21:6:10).

Tämän valmistus on esitetty lyhyesti jo julkaisussa 26 7 9 3 3 0 P. Lefrancier ja E. Lederer, Fortschritte d. Chem. org. Naturst. 4£, 1 - 47, ks. s. 13 (1980).

Lähtöaineena toimiva L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi saadaan 5 seuraavasti: 13,25 g (14,9 mmoolia) N-tert.butyylioksi- karbonyyli-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidia lisätään sekoittaen 170 ml:aan 0°:n lämpötilaan jäähdytettyyn trifluorietikka-hapon ja metyleenikloridin l:3-seokseen (v/v), jolloin muo-10 dostuu kirkas liuos. Jätetään seisomaan 2 1/2 tuntia huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen reaktioliuos haihdutetaan 30°C:ssa kiertohaihduttimessa. Puolikiinteään jäännökseen sekoitetaan ylimääräisen trifluorietikkahapon poistamiseksi useita kertoja kulloinkin 100 ml metyleenikloridia ja vii-15 meksi mainittu haihdutetaan pois. Hierretään jäännöstä viidesti kulloinkin 100 ml:11a abs. dietyylieetteriä ja dekan-toidaan päällä oleva pois, minkä jälkeen saadaan hyvin suodatettava suspensio. Imetään pois, pestään kiinteä materiaali ensin dietyylieetterillä, sitten kaksi kertaa kulloin-20 kin 100 ml:11a kuumaa asetonia ja kuivataan vesisuihkutyh-jössä 60 - 70°:ssa. Saadaan 10,9 g L-alaniini-2-(1,2-di-palmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidia värittömien kiteiden muodossa, sp. 138-147°, arvoilla (a)^° = +30 +1° (c = lj kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5), 25 Rf =0,14 (kloroformi:metanoli = 7:3) ja

Rf = 0,40 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5).

Näin saatu tuote muunnetaan seuraavasti natriumsuoläksi: 3,82 g (5 mmoolia) L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidia saatetaan 30 liuokseksi 100 ml:ssa kloroformin ja metanolin 7:3-seosta lämmittämällä lyhyesti 35°:n lämpötilaan. Jäähdytetään ja lisätään tipoittain varovasti 5 ml IN natriumhydroksidia. Kirkas liuos haihdutetaan n. 1/3-tilavuuteen alkuperäisestä tilavuudesta ja lyofilisoidaan sen jälkeen, kun on lisätty 35 200 ml dioksaania. Saadaan L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli- sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natrium-suolaa kuohkeana jauheena.

27 79330

Esimerkki 2:

Esimerkin 1 mukaisesti voidaan valmistaa esimerkeissä 3-10 mainitut sekä seuraavat yhdisteet: N-asetyyli-muramyyli-N-metyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C^)- 5 etyyliesteri-(C^)-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero- 3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuola, N-asetyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C^)- metyyliesteri-(C^)-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glyse- ro-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuola, 10 N-asetyyli-muramyyli-L-seryyli-D-glutamyyli-(C^)-n-butyyli- esteri-(C^)-L-alaniini-2-(1,2-dipaImitoyyli-sn-glysero-3- hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuola, N-asetyyli-muramyyli-L-kysteinyyli-D-glutamyyli-(C^)-n- butyyliesteri-(C^)-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn- 15 glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuola, N-asetyyli-muramyyli-L-metionyyli-D-glutamyyli-(C^)-n-butyy- lxesteri-(C )-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-Ύ hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuola, N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C )-n-butyyli- a 20 esteri-(C^)-L-alaniini-2-(1,2-dimyristoyyli-sn-glysero-3- hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuola, N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C )-n-butyyli- ot esteri-(C )-L-alaniini-2-(l,2-distearoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuola, 25 N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C )-n-butyyli-

Ot esteri-(C^)-L-alaniini-2-(l,2-dioleyyli-sn-glysero-3-hydrok-sifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuola, N-bentsoyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C )-n-butyy-liesteri-(C^)-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-30 hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuola, N-glykolyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C )-n-butyy-

Ot liesteri- (C ) -L-alaniini-2-(l,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi) -etyyliamidi-natriumsuola ja N-asetyyli-1,4,6-O-triasetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-35 glutamyyli-(C^)-n-butyyliesteri-(C )-L-alaniini-2-(1,2-dipalmi toyyli-sn-glysero-3-hydroksif osf oryylioksi) -etyyliamidi-natriumsuola.

28 7 9 3 3 0

Esimerkki 3; Silmätipat Koostumus: N-asetyyli-muramyyli-L-a-aminobutyryyli-D-glutamyyli-(Ca)-n-butyyliesteri-(C^)-L-alaniini-5 2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosfo- ryylioksi)-etyyliamidi-natriumsuolaa (yhd. II) 0,10 mg boorihappoa 30,00 mg natriumtetraboraatti·lOI^O 0,10 mg bentsalkoniumkloridia 0,20 mg 10 vettä injektioon ad.1,0 ml

Valmistus;

Osaän yllä mainittua vesimäärää, joka on tarkoitettu injektointiin, liuotetaan aseptisissa olosuhteissa ja sekoittaen boorihappo, natriumtetraboraatti ja bentsalkoniumklori-15 di huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen liuotetaan näin saadussa liuoksessa yhdiste II ja täydennetään injektiotarkoi-tukseen olevalla vedellä 1,0 ml:n lopputilavuuteen.

Liuos tai sen osa tai monikerta suodatetaan kal- vosuodattimen läpi ja täytetään puhdistettuihin säiliöihin.

20 Sopivia säiliöitä ovat esim.

- joustavasta muovista olevat säiliöt (ä5 ml tai 10 ml), joissa on tiputusosa, - lasista olevat säiliöt (ä5 ml tai 10 ml), joissa on lasista tai muovista oleva tiputuspipetti ja elastomeerinen 25 pipetti-imulaite, tai - muoviset kerta-annospipetit (sisältö 1-2 pisaraa). Esimerkki 4: Ei-vesipitoiset yksittäisannokset nasaaliseen käyttöön

Koostumus: 30 N-propionyyli-desmetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D- glutamyyli-(C )-n-butyyliesteri-(C )-L-alaniini-2-

U, Y

(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyyli-oksi)-etyyliamidi-natriumsuolaa (yhd. III) 0,03 mg

Miglyol 812 ad. 30,00 mg 35 Valmistus: 0,03 mg yhdistettä III liuotetaan aseptisissa olosuhteissa 29,97 mg:an Miglyol 812:ta.

29 7 9 3 3 0 Tämä liuos täytetään markkinoilta saatavaan kertakäyttöiseen nenäapplikaattoriin, esim. US-patentin n:o 3 739 951 mukaiseen, joka asetetaan ennen käyttöä ponneai-nepurkin päälle.

5 Esimerkki 5: Nenätipat

Koostumus: I II

N-asetyyli-muramyyli-L-valyyli-D-glutamyy-li-(Ca)-n-butyyliesteri-(C^)-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksi-10 fosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuolaa (yhd. IV) 0,15 mg 0,10 mg tiomersaali 0,02 mg natriummonovetyfosfaatti'2H20 0,30 mg 0,30 mg natriumdivetyfosfaatti·12H20 10,10 mg 10,10 mg 15 bentsalkoniumkloridi — 0,10 mg etyleenidiamiinitetraetikkahappo- dinatriumsuolaa (EDTA) 0,50 mg 0,50 mg natriumkloridia 3,70 mg 4,50 mg demineralisoitua vettä 988,30 mg 987,60 mg 2 0 pH-arvo: 5,0+0,3 5,0+0,3

jäätymispisteen lasku At -0,51°C -0,56°C

Valmistus:

Osaan yllä mainittua demineralisoidun veden määrää liuotetaan sekoittaen natriumdivetyfosfaatti, dinatriumvety-25 fosfaatti, natriumkloridi, tiomersaali ja EDTA-natriumsuola huoneenlämpötilassa.

Tähän liuokseen liuotetaan yhdiste IV ja täydennetään lopulla demineralisoitua vettä.

Liuos tai sen osa tai monikerta suodatetaan kalvo- 30 suodattimen läpi ja täytetään puhdistettuihin säiliöihin. Sopivia säiliöitä ovat esim.

a) lasi- tai muovisäiliöt (ä. 5 ml tai 10 ml), joissa on lasista tai muovista oleva pipetti ja elastomeerinen pipetti-imulaite, 35 b) muovista olevat poimupullot, joissa on nousuputki ja muovista oleva suihkutuspää, 3o 79330 c) yksittäisannospullot muovista (sisältö 2-3 pisaraa) tai d) lasi- tai muovipullot, jotka on varustettu muovista olevalla normitetulla pumppuannosspraylla (ilman ponnekaasua) .

5 Esimerkki 6: Geeli

Koostumus: N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli- (C )-n-butyyliesteri-(C )-L-alaniini-2-(1,2-

Ot Y

dilauroyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyyli-10 oksi)-etyyliamidi-natriumsuolaa (yhd. V) 0,01 g glyseriini 85% 10,00 g metyyliparabeenia 0,12 g propyyliparabeenia 0,03 g natriumkarboksimetyyliselluloosaa (korkea 15 viskositeetti) 2,50 g demineralisoitua vettä 87,34 g

Valmistus:

Metyyli- ja propyyliparabeeni liuotetaan osaan kuumaa demineralisoitua vettä. Tämän jälkeen saatuun liuokseen 20 lisätään natriumkarboksimetyyliselluloosa voimakkaasti sekoittaen. Annetaan liman turvota sekoittaen. Jäähtymisen jälkeen lisätään glyseriini ja vaikuttavan aineen liuos (yhdiste V) jäljellä olevaan veteen.

Esimerkki 7: Voide 25 Koostumus; N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli- (C )-n-butyyliesteri-(C )-L-alaniini-2-(1-

ct Y

palmitoyyli-2-oleyyli-sn-glysero-3-hydroksi-fosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuolaa (yhd. VI) 0,10 g 30 sorbitaanimonostearaattia 0,60 g metyylialkoholia 3,00 g isopropyylipalmitaattia 2,00 g metyyliparabeenia 0,12 g parafiiniöljyä, sitkasjuoksuista 10,00 g 35 PEG (20)-sorbitaanimonostearaattia 4,40 g propyyliparabeenia 0,03 g 3! 79330 kiteisen sorbiitin 70%:nen liuos demineralisoidussa vedessä 6,00 g steariinihappoa 9,00 g demineralisoitua vettä 64,67 g 5 Valmistus;

Rasvafaasi, joka koostuu sorbitaanimonostearaatista, setyylialkoholista, steariinihaposta, PEG (20)-sorbitaanimonostearaatista, isopropyylipalmitaatista ja parafiiniöljystä, sulatetaan yhdessä. Tämän jälkeen liuotetaan metyyli-10 ja propyyliparabeeni osaan kuumaa demineralisoitua vettä. Vesifaasiin lisätään sorbiittiliuos. N. 75°C:ssa lisätään sitten sekoittaen vesifaasi rasvafaasiin. Voideperustan annetaan tämän jälkeen jäähtyä sekoittaen. N. 40°:ssa lisätään vaikuttavan aineen (yhdiste VI) liuos jäljellä olevassa 15 vedessä voideperustaan.

Esimerkki 8: Nenäsalva

Koostumus: N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamyylife )-metyyliesteri-(C )-L-alaniini-2-(1,2-

ot Y

20 dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyyli- oksi)-etyyliamidi-natriumsuolaa (yhd. VII) 0,03 g parafiiniöljyä, sitkasjuoksuista 20,00 g valkoista vaseliinia 30,00 g villarasvaa, vedetöntä 40,00 g 25 demineralisoitua vettä 19,97 g

Valmistus:

Rasvafaasi, joka koostuu parafiiniöljystä, vaseliinista ja villarasvasta, sulatetaan yhdessä. Vaikuttavan aineen vesipitoinen liuos lisätään n. 50°C:ssa rasvafaasiin.

30 Esimerkki 9: Ihosalva

Koostumus: N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C )-n-butyyliesteri-(C )-glysiini-2-

ot Y

(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyy-35 lioksi)-etyyliamidi-natriumsuolaa (yhd. VIII) 0,25 g 32 7 9 3 3 0 sorbitaaniseskvioleaattia 10,00 g valkoista mehiläisvahaa 5,00 g setyylialkoholia 2,50 g metyyliparabeenia 0,15 g 5 parafiiniöljyä, sitkasjuoksuista 20,00 g propyyliparabeenia 0,02 g stearyylialkoholia 2,50 g valkoista vaseliinia 40,00 g demineralisoitua vettä 19,58 g 10 Valmistus:

Rasvafaasi, joka koostuu sorbitaaniseskvioleaatista, valkoisesta mehiläisvahasta, setyylialkoholista, parafiiniöljystä, stearyylialkoholista ja valkoisesta vaseliinista, sulatetaan yhdessä. Tämän jälkeen liuotetaan metyyli- ja 15 propyyliparabeeni kuumana pääosaan vettä. N. 80°C:ssa vesifaasi lisätään rasvafaasiin. N. 40°:ssa vaikuttavan aineen (yhdiste VIII) liuos jäljellä olevassa vedessä lisätään näin saatuun voideperustaan.

Esimerkki 10: Huulipuikko 20 Koostumus: N-asetyyli-muramyyli-N-metyyli-L-alanyyli-D- glutamyyli-(C )-n-butyyliesteri-(C )-L-alaniini- ot y 2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosfo-ryylioksi)-etyyliamidi-natriumsuolaa (yhd. IX) 1,00 g 25 polyetyleeniglykolia, keskimääräinen molekyyli- paino 400 15,00 g polyetyleeniglykolia, keskimääräinen molekyyli-paino 1000 83,00 g polyetyleeniglykolia, keskimääräinen molekyyli-30 paino 4000 1,00 g

Valmistus:

Vaikuttava aine jaetaan hienosti polyetyleeniglykolien sulaan. Sitkasjuoksuinen sula valetaan sitten sopiviin puik-kohylsyihin ja annetaan jähmettyä.

33 79330

Esimerkki 11: 3,50 g (6,9 mmoolia) N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(Ca>-metyyliesteriä ja 1,20 g N-hydroksi-sukkinimidiä liuotetaan 50 ml:aan seosta, jossa on dimetyy-5 liformamidia, isopropanolia ja kloroformia (1:3:6; v/v), lisätään 2,10 g (10,35 mmoolia) disykloheksyylikarbodi-imidiä ja sekoitetaan sulkemalla kosteus pois tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Suspensioon lisätään 50 ml etikkahap-poetyyliesteriä, sekoitetaan 30 minuuttia jääkylvyssä ja 10 suodatetaan liukenematon disykloheksyylivirtsa-aine pois. Suodos haihdutetaan kiertohaihduttimessa n. 40 ml:ksi, aktiiviesteri saostetaan lisäämällä 150 ml abs. dietyyli-eetteriä (kaksi kertaa), suodatetaan pois ja kuivataan, minkä jälkeen saadaan N-hydroksisukkinimidin esteri R^-15 arvolla 0,43 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5).

3,43 g (4,4 mmoolia) L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidia suspen-doidaan 45 ml:aan kloroformia ja lisätään tipoittain 40°:ssa 0,86 ml (6,1 mmoolia) trietyyliamiinia, joka on liuotettu 20 5 ml:aan kloroformia, 5 minuutin kuluessa, jolloin muodostuu kirkas liuos. Tähän lisätään tipoittain sekoittaen hyvin ja sulkemalla kosteus pois viiden minuutin kuluessa yllä olevan aktiiviesterin liuos 100 ml:ssa dimetyyliformamidin, kloroformin ja dioksaanin (1:14:6; v/v) seosta. Sekoitetaan 25 2 1/2 tuntia huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen hieman samea liuos haihdutetaan kiertohaihduttimessa (30°) kuivaksi. Raakatuote puhdistetaan Kieselgel'illä (60 reinst, Merck, raekoko: 70-230 mesh ASTM) järjestelmässä kloroformi^etanoillesi = 70:30:5 (5 ml:n fraktiot). Tuotteen sisältävät 30 fraktiot kerätään (DC). Liuottimen haihduttamisen jälkeen jäljelle jäävä jäännös liuotetaan 250 ml:aan kahdesti tislattua vettä ja puhdistetaan esimerkin 1 mukaisesti diasuo-datuksella (AMICON-sekoituskenno, tyyppi 402, ultrasuodatin PM 30/76 mm φ). Kennoon jäävä liuos suodatetaan Millipore-35 suodattimen (0,2 μ) läpi ja lyofilisoidaan. Saadaan N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C^)-metyyli-esteri- (C^) -L-alaniini-2- (l,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3- 34 7 9 3 3 0 hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuola·2,96 moolia H20:a värittömänä jauheena arvoilla (a)^ = +11 +1° (c = 0,285; 10%:nen etikkahappo), = 0,25 (kloroformi: metanoli:vesi =70:30:5) ja R^ = 0,39 (etikkahappoetyyli-5 esteri:n-butanoli:pyridiini:etikkahappo:vesi = 42:21:21:6:10). Lähtöyhdiste saadaan seuraavasti: 7,7 g (21,2 mmoolia) L-alanyyli-D-glutamiinihappo- (C )-metyyliesteri-(C )-bentsyyliesteri-hydrokloridia ja

oi Y

8,96 g (23,3 mmoolia) N-asetyyli-4,6-O-isopropylideeni-10 muramiinihappo-natriumsuolaa liitetään esimerkin 1 mukaisesti disykloheksyylikarbodi-imidi/N-hydroksi-sukkinimidi-menetelmän mukaisesti. Raakatuote lohkaistaan ilman lisä-puhdistusta 100 ml:ssa 60%:sta etikkahappoa. Sekoitetaan 5 1/2 tuntia huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen liuos 15 haihdutetaan voimakkaasti, siihen lisätään vettä, haihdutetaan jälleen ja lyofilisoidaan sen jälkeen, kun on lisätty 100 ml dioksaania. Jäännös puhdistetaan 600 g:ssa Kieselgel 60:a järjestelmässä kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5 (7 ml:n fraktiot) (kaksi kertaa).

20 Halutun materiaalin sisältävät fraktiot yhdistetään ja liuotin haihdutetaan. Jäljelle jää N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(C )-metyyliesteri-(C )-bentsyy-

01 Y

liesteri värittömänä jauheena arvolla Rf 0,63 (kloroformi: metanoli:vesi = 70:30:5).

25 6,0 g (10 mmoolia) N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D- glutamiinihappo-(C )-metyyliesteri-(C )-bentsyyliesteriä,

ot Y

joka on liuotettu 1,2-dimetoksietaanin ja veden 95:5-seokseen (v/v), hydrataan palladium-hiili-katalysaattorin (0,6 g, 10%) läsnäollessa 1 1/2 tuntia normaalipaineessa. Kataly-30 saattori suodatetaan pois ja suodos haihdutetaan huoneenlämpötilassa alennetussa paineessa. Jäännös puhdistetaan yllä esitetyllä tavalla 400 g:ssa Kieselgel 60:a järjestelmässä kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5 (10 ml:n fraktiot). Tuotteen sisältävät fraktiot yhdistetään ja liuotin haihdu-35 tetaan. Jäljelle jäävästä jäännöksestä, osittain Na-suolan muodossa, poistetaan suola esimerkissä 1 esitetyllä tavalla 50 ml:ssa DOWEX 50 W X 8 (50/100 mesh, H-muoto, vahvasti 35 7 9 3 3 0 hapan kationinvaihdin). Suodos suodatetaan Millipore-suodattimen (0,45 μ) läpi ja lyofilisoidaan. Saadaan N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(Ca)-metyy-liesteri (1,27 moolia HjOita) värittömänä jauheena arvoilla 5 = +47 +1° (c = 1,249; metanoli) ,

Rf = 0,08 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5), = 0,30 (asetonitriili:vesi = 3:1) ja =0,43 (etikkahappoetyyliesteri:etikkahappo:vesi: metanoli = 67:10:12) 10 Esimerkki 12: 9,4 g (11,1 mmoolia) N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(Ca)-tert.butyyliesteriä muunnetaan esimerkissä 11 esitetyllä tavalla aktiiviesteriksi ja liitetään siinä esitetyllä tavalla 6,48 g:n kanssa (8,2 mmoolia) 15 L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosfo- ryylioksi)-etyyliamidia trietyyliamiinin läsnäollessa. Raa-katuote suspendoidaan 250 ml:aan kahdesti tislattua vettä ja lämmitetään lyhyesti 37°:n lämpötilaan. Sekoitetaan 15 minuuttia jääkylvyssä, suodatetaan liukenematon disyklo-20 heksyylivirtsa-aine pois ja alistetaan suodos esimerkissä 1 esitettyyn diasuodatukseen (AMICON-sekoituskenno 402, ultra-suodatin PM 30/76 mm φ) . Kennoon jäävä liuos (120 ml) lyofilisoidaan ja tuote kromatografoidaan 550 g:ssa Kieselgel 60:a tavanomaisella tavalla. Haluttu materiaali 25 kootaan, otetaan 200 ml:aan kahdesti tislattua vettä (pH = 7), steriilisuodatetaan (0,45 μ) ja lyofilisoidaan. Saadaan N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C )-tert.-butyyliesteri-(C )-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuola 30 värittömänä jauheena, joka sisältää 3,4 moolia vettä, arvoilla (aj^ = +14 +1° (c = 0,817; 10%:nen etikkahappo) , R^ =0,29 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5) ja R^ =0,53 (etikkahappoetyyliesteri:n-butanoli:pyridiini: 35 etikkahappo:vesi = 42:21:21:6:10).

36 7 9 3 3 0 Lähtömateriaalina tarvittava muramyylidipeptidijohdannainen saadaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla liittämällä N-asetyyli-4,6-O-isopropylideeni-muramiinihappo-natriumsuola ja L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(C^)-tert 5 butyyliesteri-(C^)-bentsyyliesteri disykloheksyylikarbodi-imidi/N-hydroksisukkinimidi-menetelmän mukaisesti. Sen jälkeen kun on lohkaistu isopropylideenitähde 60%:sella etikkahapolla ja poistettu bentsyylitähde katalyyttisellä hydrauksella esimerkin 1 mukaisesti, saadaan N-asetyyli-10 muramyyli-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(Ca)-tert.butyyliesteri värittömänä jauheena arvoilla (a)p^ = +44 +1° (c = 1,004; metanoli),

Rf = 0,20 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5) ja Rf = 0,41 (asetonitriili:vesi = 3:1).

15 Lähtömateriaalina tarvittava dipeptidijohdannainen saadaan seuraavasti: 38,3 g (63,5 mmoolia) N-(2-(4-bifenylyyli)-propyyli-oksikarbonyyli)-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(C)-tert.-butyyliesteri-(C^,)-bentsyyliesteriä liuotetaan 700 ml:aan 20 trifluorietanolin ja veden 9:l-seosta (v/v), ja lisäämällä tipoittain 1,23-normaalista suolahappoa samassa liuotinseok-sessa (1 tilavuusosa kons. suolahappoa ja 9 tilavuusosaa trifluorietanolia) alennetaan "pH"-arvo arvoon 1,5 (2 1/2 tuntia, kulutus 51,66 ml, s.o. 81% teoreettisesta). Hieman 25 kellertävä liuos haihdutetaan kiertohaihduttimessa vesisuih-kutyhjössä 30°:ssa vajaaseen 100 ml:aan, lisätään 200 ml dioksae.nia ja tämä kaikki jäädytyskuivataan. Puolikiinteä jäännös Otetaan 30 ml:aan abs. dietyylieetteriä ja saoste-taan 0 - 5°:ssa sekoittaen lisäämällä 150 ml petrolieetteriä. 30 Annetaan seistä kylmässä (-20°), dekantoidaan ja toistetaan sama käsittely vielä kaksi kertaa, öljyinen jäännös otetaan tämän jälkeen 100 ml:aan tert.-butanolia, lyofilisoidaan ja jäännös kuivataan natronasbestin (Merck) päällä suurtyhjössä.

Saadaan L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(Ca)-tert.butyy-35 liesteri-(C^)-bentsyyliesteri-hydrokloridi vahvasti hygroskooppisena jauheena arvoilla (a)^® = +7 +1° (c = 1,630; kloroformi), 37 79330

Rf = 0,60 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5) ja Rf = 0,45 (n-butanoli:etikkahappo:vesi = 10:1:2,8). Suojattu yhdiste saadaan seuraavasti: 0°:n lämpötilaan jäähdytettyyn liuokseen, jossa on 5 65,96 g (0,2 moolia) D-glutamiinihappo-(Ca)-tert.butyyli- esteri-(C )-bentsyyliesteri-hydrokloridia ja 65,47 g (0,2 moolia N-(2-(4-bifenylyyli)-propyylioksikarbonyyli)-L-alaniinia 650 ml:ssa abs. dimetyyliformamidia, lisätään sekoittaen 22 ml (0,24 moolia) N-metyylimorfoliinia ja lopuksi 10 59,11 g (0,24 moolia) 2-etoksi-N-etoksikarbonyyli-l,2- dihydro-kinoliinia (EEDQ). Sekoitetaan 7 tuntia huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen keltainen liuos haihdutetaan kiertohaihduttimessa 30°:ssa. Jäännös otetaan litraan etikkahappoetyyliesteriä, uutetaan viisi kertaa kulloinkin 15 200 ml:11a vettä, vesifaasi uutetaan takaisin 0,5 1:11a etikkaesteriä ja yhdistetyt orgaaniset faasit kuivataan. Liuottimen haihduttamisen jälkeen saatava raakatuote (150 g) puhdistetaan usealla kromatografiällä Kieselgel 60:ssa (1:20). Saadaan N-(2-(4-bifenylyyli)-propyylioksikarbonyy-20 li-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(Cft)-tert.butyyliesteri-(C )-betsyyliesteri värittömänä öljynä arvoilla = -14 +1° (c = 1,625; etikkahappoetyyliesteri),

Rj =0,73 (kloroformi:isopropanoli:etikkahappo = 70:8:2) ja 25 = 0,51 (toluoli:etikkaesteri = 1:1).

Lähtömateriaalina toimiva D-glutamiinihappo-(C^)-tert.-butyyliesteri-(C^)-bentsyyliesteri-hydrokloridi valmistetaan kirjallisuudessa (r. Roeske, J. Org. Chem. 28, 1251 (1963)) esitetyn L-johdannaisen mukaisesti saattamalla D-glutamiini-30 happo-(0^)-bentsyyliesteri reagoimaan isobuteenin kanssa 1,4-dioksaanista ja rikkihaposta valmistetussa seoksessa värittömien neulasten muodossa, sp. 108-109°, arvoilla (a)p^ = -16 +1° (c = 1,235; etanoli),

Rf = 0,84 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5) ja 35 Rf =0,64 (etikkahappoetyyliesteri:n-butanoli:pyridiini: etikkahappo:vesi = 42:21:21:6:10).

38 79330

Esimerkki 13:

Liuokseen, jossa on 4,62 g (6,05 mmoolia) L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidia 100 mltssa kloroformin, isopropanolin ja veden 5 70:30:5-seosta lisätään tipoittain sekoittamalla 15°:ssa 10 minuutin kuluessa 14,52 ml (7,26 mmoolia) 0,5-molaarista trietyyliamiiniliuosta kloroformin, isopropanolin ja veden 70:30:5-seoksessa.

Tämän jälkeen lisätään 20 minuutin kuluessa 6,0 g 10 (7,26 mmoolia) N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli- D-glutamiinihappo-(Ca)-metyyliesteri-(C^)-N-hydroksisukkin-imidiesteriä, joka sisältää vielä vähän disykloheksyylivirt-sa-ainetta, 4 annoksena äl,5 g kiinteässä muodossa, jolloin liuos muuttuu nopeasti sameaksi.

15 N. 15 minuuttisen sekoittamisen jälkeen 15°:ssa pois tetaan jäähdytys ja sekoitetaan edelleen 2 1/2 tuntia huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen haihdutetaan näin saatu samea reaktioliuos tyhjössä 30°:ssa. Raakatuote (10,75 g) suspendoidaan tämän jälkeen 170 ml:aan kahdesti tislattua 20 vettä (pH 5,5) , suspensio saatetaan pH-arvoon 6,0 lisäämällä 0,3 ml trietyyliamiinia, suodatetaan pois liukenemattomasta (disykloheksyylivirtsa-aine) ja suodos lyofilisoidaan tyhjössä .

Näin saatu lyofilisaatti liuotetaan 300 ml:aan kah-25 desti tislattua vettä ja liuos haihdutetaan AMICON-diasyloin-tikennossa (malli 402, ultrasuodatin PM 10/76 mm 0) 3 atm:ssä (ilmakehän ylipaineessa) 75 ml:aan, sitten suodatetaan 250ml fosfaattipuskuri:natriumkloridia vastaan (kumpikin 0,1-molaa-rinen, 1:1, pH 7) ja 1750 ml kahdesti tislattua vettä vastaan 30 kloridittomaksi. Kennoon jäävä liuos (n. 75 ml) suodatetaan tämän jälkeen peräkkäin kahden Millipore-suodattimen (NALGENE S, 0,45 y ja 0,2 y) läpi ja näin saatu kirkas, väritön liuos lyofilisoidaan suurtyhjössä.

Saadaan 7,36 g vielä epäpuhdasta N-propionyyli-desmetyy- 35 limuraniyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli- (C ) -metyyliesteri- (C ) -

oi Y

L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyy-lioksi)-etyyliamidi-natriumsuolaa värittömänä jauheena, joka 39 79330 puhdistetaan edelleen CRAIG-jaolla seoksella hiilitetra-kloridi:kloroformi smetanoli;0,5-prosenttinen natriumkloridi-liuos = 7:17:18;6. 547 vaiheen jälkeen on haluttu tuote fraktioissa 160-220, K= 0,58. Tuotteen sisältävät fraktiot 5 yhdistetään ja haihdutetaan suurtyhjössä ilman kuumentamista (jäähdyttäminen) kuivaksi. Saadaan väritön jauhe, joka sisältää vielä natriumkloridia. Sen poistamiseksi tuote liuotetaan 600 ml saan kahdesti tislattua vettä ja suodatetaan AMICON-dialysointikennossa (malli 402, ultrasuodatin Ph 10 30/76 mm ¢) 3 atmsssä ensin n. 50 ml:n sisätilavuuteen, sit ten kaiken kaikkiaan 1750 ml:11a kahdesti tislattua vettä kloridivapaaksi.

Kennoon jäävä liuos (n. 50 ml) steriilisuodatetaan tämän jälkeen peräkkäin kahdella Millipore-suodattimella 15 (NALGENE S, 0,45μ tai vast. 0,2 μ) ja lyofilisoidaan suur-tyhjössä .

Saadaan N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli- D-glutamyyli-(C )-metyyliesteri-(C )-L-alaniini-2-(1,2-di-

Ct Y

palmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-20 natriumsuola värittömänä jauheena, joka sisältää 1,90 moolia vettä, arvoilla (oi)p^ = +3,7 +0,1° (c = 0,672; kloroformi), (ot)p° = +1,7 +0,1° (c = 1,044; vesi), =0,42 (kloroformiimetanoli:vesi = 70:30:5) ja 25 =0,62 (etikkaesteri:n-butanoli:pyridiini:etikkahappo: vesi = 42:21:21:6:10).

Lähtömateriaali saadaan seuraavasti: 5,12 g (10,1 mmoolia) N-propionyyli-desmetyylimuramyy-li-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-a-metyyliesteriä otetaan 30 100 ml saan kloroformin ja isopropanolin 7:3-seosta ja liuote taan täysin lisäämällä 10 ml dimetyyliformamidia.

Tähän liuokseen lisätään 2,68 g (13 mmoolia) disyklo-heksyylikarbodi-imidiä ja 1,50 g (13 mmoolia) N-hydroksi-sukkinimidiä ja näin saatua kirkasta, väritöntä liuosta se-35 koitetaan 1 1/2 tuntia huoneenlämpötilassa ja tämän jälkeen sen annetaan seistä 17 tuntia 4°:ssa.

40 79330 Näin saatuun suspensioon lisätään 400 ml dietyylieet-teriä ja sekoitetaan tämän jälkeen vielä tunnin ajan huoneenlämpötilassa.

Tämän jälkeen imetään kiteytymä pois, pestään dietyyli-5 eetterillä ja kuivataan tyhjössä fosforipentoksidin päällä.

Saadaan N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(C )-metyyliesteri-(C )-N-hydroksisukkin-

(X Y

imidiesteri värittömien kiteiden muodossa, jotka sisältävät pääasiassa vielä hieman disykloheksyylivirtsa-ainetta ja 10 jotka käytetään ilman lisäpuhdistusta; arvot Rf = 0,46 (kloroformi:metanoli =5:1) ja Rf = 0,72 (kloroformi:metanoli = 7:3).

Lähtömateriaali saadaan seuraavasti:

Liuosta, jossa on 13,0 g (21,75 mmoolia) N-propionyyli-15 desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(C^)-metyyliesteri- (C^) -bentsyyliesteriä 250 ml:ssa dimetoksietaanin ja veden 20:l-seosta, hydrataan 2,5 g:11a 10-prosenttista palladiumhiili-katalysaattoria tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja normaalipaineessa.

20 Tämän jälkeen suodatetaan erilleen katalysaattorista, suodos haihdutetaan tyhjössä kuivaksi ja näin saatu jäännös otetaan kolme kertaa kulloinkin 50 ml:aan vettä ja haihdutetaan uudestaan. Liuotetaan uudestaan n. 100 ml:aan kahdesti tislattua vettä, suodatetaan tämä liuos Millipore-suodatti-25 mella (NALGENE S, 0,2 μ) ja lyofilisoidaan suurtyhjössä.

Saadaan N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-a-metyyliesteriä (0,68 moolia vettä) värittömänä lyofilisaattina arvoilla (ot)£° = +14,9 +0,1° (c = 1,067; metanoli), 30 =; 0,78 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5) ja

Rf = 0,57 (etikkaesteri:n-butanoli:pyridiini:etikkahappo: vesi = 42:21:21:6:10).

Lähtömateriaali saadaan seuraavasti:

Liuosta, jossa on 20,7 g (32,46 mmoolia) 4,6-O-iso-35 propylideeni-N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(Ca)-metyyliesteri-(C,^)-bentsyyliesteriä 400 ml:ssa 60%:sta etikkahappoa, sekoitetaan 21 tuntia huo- 41 79330 neen lämpötilassa, sitten se haihduetaan 30°:ssa tyhjössä ja näin saatuun jäännökseen sekoitetaan peräkkäin kolme kertaa kulloinkin 100 ml vettä ja haihdutetaan uudestaan. Raakatuo-te puhdistetaan tämän jälkeen pylväskromatografiällä 1000 g: 5 ssa Kieselgel'iä (60 reinst, Merck, 0,063-0,200 mm) järjestelmässä metyleenikloridismetanoli = 85:15 (15 ml:n fraktiot). Fraktiot 207-290 yhdistetään ja haihdutetaan tyhjössä 30°:ssa.

Saadaan N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D- glutamiinihappo-(C )-metyyliesteri-(C )-bentsyyliesteri, joka

ot Y

10 sisältää 0,24 moolia vettä, arvoilla (ot)p° = +16,1 ± 0,1° (c = 1 ,463; metanoli) ,

Rj = 0,24 (kloroformi-metanoli = 9:1), R^ = 0,55 (kloroformi:metanoli = 5:1), ja = 0,94 (kloroformi.Metanoli:vesi = 70: 30:5).

15 Lähtömateriaali saadaan seuraavasti:

Suspensioon, jossa on 13,2 g (35,77 mmoolia) 4,6-O-iso-propylideeni-N-propionyyli-desmetyylimuramiinihappo-natrium-suolaa 200 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään huoneen lämpötilassa sekoittaen 9,6 g (46,5 mmoolia) disykloheksyylikar-20 bodi-imidiä, 5,35 g (46,5 mmoolia) N-hydroksisukkinimidiä ja 12,8 g (35,77 mmoolia) L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(Ca)-metyyliesteri- (C^,) -bentsyyliesteri-hydrokloridia ja sekoitetaan tätä kaikkea 21 tuntia huoneen lämpötilassa.

Näin saatuun valkoiseen suspensioon sekoitetaan 200 ml 25 etikkaesteriä, sekoitetaan tunnin ajan 0°:ssa, imusuodatetaan kiteytymästä (disykloheksyylivirtsa-aine), pestään jääkylmällä etikkaesterillä ja haihdutetaan suodos tyhjössä 30°:ssa.

Näin saatu jäännös otetaan 300 ml:aan etikkaesteriä ja pestään kaksi kertaa tämän jälkeen kulloinkin 50 ml:11a 2 N 30 sitruunahappoa, vettä, 10 %:sta natriumvetykarbonaattiliuosta ja vettä.

Etikkaesterifaasit yhdistetään, kuivataan natriumsulfaa-tin päällä, suodatetaan ja haihdutetaan tyhjössä.

Saadaan 4,6-O-isopropylideeni-N-propionyyli-desmetyyli-35 muramyyli-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(C )-metyyliesteri-(C )- 0C y bentsyyliesteriä arvoilla 42 79330

Rjp = 0,65 (kloroformirmetanoli = 9:1) ja = 0,86 (kloroformirmetanoli = 5:1).

Molemmat lähtötuotteet saadaan seuraavasti:

Liuokseen, jossa on 20,3 g (48,0 mmoolia) N-tert.-bu-5 tyylioksikarbonyyli-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(C )-metyy-liesteri-(C^)-bentsyyliesteriä (p.Lefrancier, M.Derrien, I.Lederman, F.Nief, J-Choay ja E.Lederer, Int.J.Peptide Protein Res. J_1_, 289-296 (1978)) 100 mlrssa absoluuttista etik-kaesteriä, lisätään 0°:ssa 100 ml n. 5 N suolahappoa absoluut-10 tisessa etikkaesterissä, ja sekoitetaan 2 tuntia 0°:ssa.

Kellertävä liuos haihdutetaan sitten tyhjössä, näin saatu jäännös otetaan kaksi kertaa kulloinkin 100 ml:aan absoluuttista etikkaesteriä ja haihdutetaan uudestaan. Uuttamisen jälkeen, joka suoritetaan kaksi kertaa kulloinkin 100 ml:11a 15 absoluuttista dietyylieetteriä, kuivataan jäännös suurtyhjös-sä, jolloin saadaan L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(C^)-metyy-liesteri-(C^)-bentsyyliesteri-hydrokloridia, joka sisältää 0,31 moolia vettä, arvoilla (a)p^ = +18,6 ± 0,1° (c = 0,043; metanoli), 20 R^ = 0,72 (kloroformirmetanoli:vesi = 70:30:5), R^ = 0,44 (kloroformi-metanoli =5:1) ja Rf = 0,31 (kloroformirmetanoli = 9:1).

Liuosta, jossa on 34,4 g (73,8 mmoolia), 2,14 mmoolia/ g, sisältää vielä natriumkloridia) 1a-O-bentsyyli-4,6,-O-iso-25 propylideeni-N-propionyyli-desmetyylimuramiinihappo-natrium- suolaa 340 mlrssa vettä, hydrataan vakiossa pH-arvossa 7,1 6,0 g:11a 10 %:sta palladiumhiili-katalysaattoria 23 tuntia huoneen lämpötilassa ja normaalipaineessa.

Tämän jälkeen suodatetaan erilleen katalysaattorista, 30 suodos haihdutetaan pH-arvossa 7,1 tyhjössä 30°:ssa ja näin saatu jäännös kuivataan suurtyhjössä fosforipentoksidin päällä.

Saadaan 4,6-O-isopropylideeni-N-propionyyli-desmetyyli-muramiinihappo-natriumsuolaa värittömänä jauheena arvoilla 35 R^ = 0,50 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5) ja Rj = 0,66 (asetonitriili:vesi = 3:1).

Lähtömateriaali saadaan seuraavasti: 43 79330

Liuokseen, jossa on 14,3 g (32,7 mmoolia) 1α-0-bentsyy-li-4,6-0-isopropylideeni-N-propionyyli-desmetyylimuramiini-happo-metyyliesteriä 130 ml:ssa metanolia, sekoitetaan 24,4 ml (48,7 mmoolia) 2N natriumhydroksidia ja sekoitetaan 1$ 5 tuntia huoneen lämpötilassa.

Tämän jälkeen saatetaan näin saatu kirkas, hieman keltainen liuos 1 N suolahapolla pH-arvoon 7,0 ja haihdutetaan tyhjössä 30°:ssa. Fosforipentoksidin päällä suoritetun kuivatuksen jälkeen saadaan 1a-0-bentsyyli-4,6-O-isopropylidee-10 ni-N-propionyyli-desmetyylimuramiinihappo-natriumsuolaa värittömien kiteiden muodossa arvoilla Rf = 0,67 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5) ja Rf =0,74 (asetonitriili:vesi = 3:1).

Lähtötuote saadaan seuraavasti: 15 Suspensioon, jossa on 6,75 g (224,7 mmoolia) natrium- hydridiä 120 ml:ssa absoluuttista tetrahydrofuraania, lisätään tipoittain 5°:ssa typpiatmosfäärissä ja sekoittaen 5 minuutin kuluessa liuos, jossa on 31,3 g (85,65 mmoolia) 1a-0-bentsyyli-2-desoksi-4,6-0-isopropylideeni-2-propioniamido-a-20 D-glukopyranosidia 200 ml:ssa absoluuttista tetrahydrofuraania, jolloin lämpötila nousee 20°:seen.

Näin saatua suspensiota sekoitetaan vielä kaksi tuntia 40°:ssa, sitten jäähdytetään 0°:n lämpötilaan ja lisätään tipoittain typpiatmosfäärissä sekoittaen 30 minuutin kuluessa 25 -15°:n lämpötilaan jäähdytettyyn liuokseen, jossa on 20,7 g (135,77 mmoolia) bromietikkahappometyyliesteriä 95 ml:ssa absoluuttista tetrahydrofuraania.

Näin saatua liuosta sekoitetaan vielä 3 tuntia 0-5°:ssa, sitten lisätään 20 ml metanolia ja 20 ml tetrahydrofuraania.

30 Saatetaan 4,5 ml:11a jääetikkaa pH-arvoon 6 ja haihdutetaan tyhjössä 30°:ssa.

Jäännös liuotetaan tämän jälkeen 200 ml:an metyleeni-kloridia ja pestään näin saatu liuos kolme kertaa kulloinkin 125 ml:11a vettä. Metyleenikloridifaasit yhdistetään, kuiva-35 taan natriumsulfaatin päällä, suodatetaan ja haihdutetaan tyhjössä 30°:ssa.

Saadaan raakatuote hieman keltaisten kiteiden muodossa, 44 7 9 3 3 0 jotka puhdistetaan pyiväskromatografiällä 500 g:ssa neutraalia alumiinioksidia (Woelm N/ Super 1) käyttämällä eluointi-aineena etikkaesteriä (10 ml; n fraktiot). Fraktiot 14-36 yhdistetään ja haihdutetaan tyhjössä.

5 Saadaan 1a-0-bentsyyli-4,6,-O-isopropylideeni-N-propio- nyyli-desmetyylimuramiinihappo-metyyliesteriä värittömien kiteiden muodossa, sul.p. 121-123° (dietyylieetterin ja petro-lieetteri 1:2-seoksesta) arvoilla (a)p^ = +146,9 ± 0,1° (c = 0,849; kloroformi) ja 10 Rj = 0,67 (kloroformi:metanoli = 9:1).

Esimerkki 14:

Esimerkin 13 mukaisesti saadaan 5,525 g:sta (6,43 mmoo-lia) raakaa (sisältää vielä hiukan disykloheksyylivirtsa-ainetta) N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glu- 15 taniimihappo-(C )-tert.-butyyliesteri-(C )-N-hydroksisukkin-

ot Y

imidiesteriä ja 3,78 g:sta (4,95 mmoolia) L-alaniini-2-(1 ,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliami-dia N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyliD-glutamyyli-(C )-tert.-butyyliesteri-(C )-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyy-

CL Y

20 li-sn-glusero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natrium-suola värittömänä jauheena, joka sisältää 2,64 moolia vettä, arvoilla (a)D° = +2'5 ± 0,1° (c = 0,649; vesi), (a)2® = +5,8 + 0,1° (c = 0,694; kloroformi) ja 25 = 0,60 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5).

Lähtömateriaali saadaan seuraavasti:

Esimerkin 13 mukaisesti saadaan 3,44 g:sta (6,15 mmoolia) N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutamii-nihappo-a-tert.-butyyliesteriä, 1,68 g:sta (8,14 mmoolia) di-30 sykloheksyylikarbodi-imidiä ja 0,94 g:sta (8,14 mmoolia) N-hydroksisukkinimidiä raakaa N-propionyyli-desmetyylimuramyy-li-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(C )-tert.-butyyliesteri-

Ut (Cy)-N-hydroksisukkinimidiesteriä värittömien kiteiden muodossa, jotka sisältävät pääasiassa vielä vähän disykloheksyy-35 livirtsa-ainetta ja jotka käytetään ilman lisäpuhdistusta; R^-arvo = 0,61 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5). Lähtömateriaali saadaan seuraavasti: 45 79330

Liuosta, jossa on 5,1 g (7 mmoolia) 1a-0-bentsyyli-N- propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-aXanyyli-D-glutamiinihappo-

(C )-tert.-butyyliesteri-(C )-bentsyyiiesteriä 100 mX:ssa diet Y

metoksietaanin ja veden 9:1-seosta, hydrataan 1,5 g:XXa 5 %: 5 sta palladiumhiilikatalysaattoria (E 101 N, Degussa) 20 tuntia huoneen lämpötilassa ja normaaiipaineessa. 20 tunnin ku-luttua suodatetaan eriiieen kataiysaattorista ja sitten hydrataan uudestaan edelleen yiiä esitetyXXä tavalla 1,5 g:XXa tuoretta kataXysaattoria 26 tuntia. Tämän jäXkeen suodatetaan 10 taas eriXieen kataiysaattorista ja suodos haihdutetaan tyhjössä 30°:ssa kuivaksi.

Näin saatu jäännös liuotetaan seokseen, jossa on 100 mi metyieenikioridia ja 5 mi isopropanoiia, iiuokseen sekoitetaan 500 mi dietyyiieetterin ja petroiieetterin 3:2-seosta ja 15 sekoitetaan vieiä tunnin ajan huoneen XämpötiXassa.

Tämän jäikeen imetään saostunut tuote pois ja pestään dietyyiieetteriiiä. Saadaan N-propionyyli-desmetyylimuramyy-ii-L-aianyyli-D-giutamiinihappo-a-tert.-butyyliesteriä värittömän jauheen muodossa, joka sisäitää 0,52 mooiia vettä, ar-20 voiiia (a)p° = +20,2 ± 0,1° (c = 0,902; vesi),

Rf = 0,32 (kloroformirmetanoii:vesi = 70:30:5) ja = 0,54 (asetonitriili:vesi = 3:1).

Lähtömateriaali saadaan seuraavasti: 25 Vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 13 saadaan 7,3 g: sta (9,5 mmoolia) 1a-0-bentsyyli-4,6-0-isopropylideeni-N-pro-pionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(C )-tert.-butyyliesteri-(C)-bentsyyiiesteriä ja 150 ml:sta

u Y

60 %:sta etikkahappoa 1α-0-bentsyyli-N-propionyyli-desmetyy- 30 limuramyyli-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(C )-tert.-butyyli- et esteri-(C )-bentsyyliesteri värittämien kiteiden muodossa,

Q

sul.p. 152-153 (metanolin ja veden 1:5-seoksesta) arvoilla (ajp° = +68,9 ± 0,1° (c = 0,991; metanoli),

Rf = 0,40 (kloroformi:metanoli = 9:1) ja 35 Rf = 0,70 (asetonitriili:vesi = 3:1).

Lähtötuote saadaan seuraavasti:

Esimerkin 13 mukaisesti saadaan 4,65 g:sta (9,62 mmoo- 46 79330 lia, 2,066 mmoolia/g, sisältää vielä natriumkloridia) 1α-0-bentsyyli-4,6-Q-isopropylideeni-N-propionyyli-desmetyylimu-ramiinihappo-natriumsuolaa, 2,38 g:sta (11,54 mmoolia) disyk-loheksyylikarbodi-imidiä, 1,33 g:sta (11,54 mmoolia) N-hyd-5 roksisukkinimidiä ja 3,86 g:sta (9,62 mmoolia) L-alanyyli-D- glutaniinihappo-(C )-tert.butyyliesteri-(C )-bentsyyliesteri- CC γ hydrokloridia 1a-O-bentsyyli-4,6,-O-isopropylideeni-N-propio- nyyli-desmetyylimuramyyli-L-'alanyyli-D-glutamiinihappo- (Ca) - tert.-butyyliesteri-(C^)-bentsyyliesteriä, joka sisältää 0,31 10 moolia vettä, arvoilla o n (a)D = +38,4 + 0,1° (c = 1,086; metyleenikloridi), R^ = 0,86 (asetonitriili:vesi = 3:1) ja Rj = 0,83 (kloroformi:metanoli = 9:1).

Esimerkki 15: 15 Esimerkin 13 mukaisesti saadaan 3,07 g:sta (4 mmoolia) raakaa (sisältää vielä vähän disykloheksyylivirtsa-ainetta) N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutamiinihap- po-(C )-n-butyyliesteri-(C )-N-hydroksisukkinimidiesteriä ja οι γ 2,37 g:sta (3,1 mmoolia) L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-20 glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidia N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C )-n-butyylies-teri-(C^)-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hyd-roksiforforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuola värittömänä jauheena, joka sisältää 2,93 moolia vettä, arvoilla 25 (a)^ = +6,9 + 0,1° (c = 0,504; metyleenikloridi), R^ = 0,65 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5) ja Rf = 0,63 (kloroformi:metanoli = 7:3).

Lähtömateriaali saadaan seuraavasti:

Esimerkin 13 mukaisesti saadaan 2,2 g:sta (3,9 mmoolia) 30 N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyliD-glutamiinihap-po-a-n-butyyliesteriä, 1,2 g:sta (5,8 mmoolia) disykloheksyy-likarbodi-imidiä ja 0,69 g:sta (5,8 mmoolia) N-hydroksisuk-kinimidiä raakaa N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyy-li-D-glutamiinihappo-(C )-n-butyyliesteri-(C )-N-hydroksisuk-

Oi Y

35 kinimidiesteriä värittömien kiteiden muodossa, jotka sisältävät pääasiassa vielä vähän disykloheksyylivirtsa-ainetta ja jotka käytetään ilman lisäpuhdistusta, 47 79330 p,£ = 0,66 (kloroformismetanoin.:vesi = 70: 30:5).

Lähtömateriaali saadaan seuraavasti:

Esimerkin 14 mukaisesti (hydräuksen kesto 20 minuuttia) saadaan 7,3 g:sta (11,3 mmoolia) N-propionyyli-desmetyylimu- 5 ramyyli-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(C )-n-butyyliesteri- ex (C^)-bentsyyliesteriä N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-a-n-butyyliesteriä värittömänä jauheena, joka sisältää 0,88 moolia vettä, arvoilla (a)p^ = +16,4 ± 0,1° (c = 0,959; vesi), 10 R- = 0,61 (metyleenikloridi:metanoli:vesi = 70:30:5) ja R^ = 0,52 (asetonitriili:vesi = 3:1).

Lähtömateriaali saadaan seuraavasti:

Vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 13 saadaan 9,5 g: sta (13,97 mmoolia) 4,6-O-isopropylideeni-N-propionyyli-des- 15 metyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(C )-n-butyyli- ex esteri-(C^)-bentsyyliesteriä ja 120 ml:sta 60 %:sta etikka-happoa N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli^D-gluta-miinihappo-(Ca)-n-butyyliesteri-(C^)-bentsyyliesteriä, joka sisältää 0,41 moolia vettä, arvoilla 20 (ct)^° = +15,7 ± 0,1° (c = 1,019; metanoli) , R^ = o,23 (metyleenikloridi:metanoli = 9:1), R^ = 0,45 (metyleenikloridi:metanoli =5:1) ja R^ = 0,82 (metyleenikloridi:metanoli:H20 = 70:30:5).

Lähtötuote saadaan seuraavasti: 25 Vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 13 saadaan 3,81 g: sta (10,76 mmoolia, 2,72 mmoolia/g, sisältää vielä natrium-kloridia) 4,6-O-isopropylideeni-N-propionyyli-desmetyylimura-miinihappo-natriumsuolaa, 2,44 g:sta (11,83 mmoolia) disyklo-heksyylikarbodi-imidiä, 1,36 g:sta (11,83 mmoolia) N-hydrok-30 sisukkinimidiä ja 4,3 g:sta (10,76 mmoolia) L-alanyyli-D-glu-tamiinihappo-(C^)-n-butyyliesteri-(C^)-bentsyyliesteri-hyd-rokloridia, 4,6-O-isopropylideeni-N-propionyyli-desmetyylimu-ramyyli-L-alanyyli-D-glutamiinihappo-(Ca>-n-butyyliesteri-(C )-bentsyyliesteriä arvoilla 35 (°0ρ^ = +10»6 + 0,1° (c = 0,928; metanoli),

Rf = 0,81 (metyleenikloridi:metanoli:vesi = 70:30:5) ja Rf = 0,57 (metyleenikloridi:metanoli = 5:1).

48 79330

Esimerkki 16;

Liuokseen, jossa on 2,85 g (2,09 mmoolia) esimerkin 14 mukaisesti saatua N-propionyyli—desmetyylimuramyyli-L-ala-nyyli-D-glutamyyli-(C )-tert.-butyyliesteri-(C )-L-alaniini-5 2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)- etyyliamidi-natriumsuolaa 112 ml:ssa absoluuttista metyleeni-kloridia, lisätään 28 ml trifluorietikkahappoa ja tätä kaikkea sekoitetaan 3 tuntia huoneen lämpötilassa.

Väritön, kirkas liuos haihdutetaan sitten tyhjössä 30°: 10 ssa ja näin saatu jäännös otetaan useita kertoja metyleeni-kloridiin ja haihdutetaan uudestaan.

Saadaan 3,0 g väritöntä öljyä, joka suodatetaan liuotettuna 350 ml:aan fosfaattipuskuria/natriumkloridia (kumpikin 0,1 molaarinen, 1:1, pH 7) AMICON-dialysointikennossa 15 (malli 402, ultrasuodatin PM 30/76 mm 0) 3 atm:ssä. Tämän jälkeen suodatetaan kloridivapaaksi vielä kaiken kaikkiaan 2,1 litraa kahdesti tislattua vettä vastaan. Kennoon jäävä liuos (n. 50 ml) lyofilisoidaan suurtyhjössä.

Saadaan väritön lyofilisaatti, joka puhdistetaan edel-20 leen pylväskromatografiällä 260 g:ssa Kieselgel'ia (60 reinst, Merck, 0,063-0,200 mm) järjestelmässä kloroformi:metanoli:ve-si = 70:30:5 (10 ml:n fraktiot).

Fraktiot 90-260 yhdistetään ja haihdutetaan suurtyhjössä kuumentamatta (jäähdytys) kuivaksi. Jäännös otetaan ensin 25 250 ml:aan kahdesti tislattua vettä ja haihdutetaan AMICON- dialysointikennossa (malli 402, ultrasuodatin PM 30/76 mm 0) 3 atm:ssä ensin n. 50 ml:ksi, sitten peräkkäin suodatetaan kloridivapaaksi 250 ml:aan fosfaattipuskuri/natriumkloridia vastaan (kumpikin 0,1 molaarinen, 1:1, pH 7) ja 1750 ml:aa 30 kahdesti tislattua vettä vastaan. Kennoon jäävä liuos sterii-lisuodatetaan tämän jälkeen kahdella Millipore-suodattimella (NALGENE S, 0,45 μ tai vast. 0,2 μ) ja lyofilisoidaan suurtyhjössä.

Saadaan N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-35 glutairiinihappo- (C^) -L-alaniini-2- (1 ,2-dipalmitoyyli-sn-gly-sero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-dinatriumsuola värittömänä, hygroskooppisena jauheena, joka sisältää 4,80 moo- 49 79330 lia vettä, arvoilla (ot)p° = -6,1 + 0,1° (c = 0,489; metyleenikloridi:etanoli = 1:1) ,

Rf = 0,28 (etikkaesteri:n-butanoli:pyridiini:etikkahappo:ve-5 si = 42:21:21:6:10) ja

Rf = 0,62 (asetonitriili: vesi = 3:1).

Esimerkki 17: 4,5 g (34 mmoolia) esimerkin 12 mukaisesti saatua N- asetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C )-tert.butyyli- et 10 esteri-(C^)-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hyd-roksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuolaa, joka on kuivattu suurtyhjössä fosforipentoksidin päällä, liuotetaan 75 ml:ssa kuivaa dikloorimetaania. Jäähdytetään 0°:n lämpötilaan ja lisätään sekoittaen ja sulkemalla kosteus pois 25 ml vede-15 töntä trifluorietikkahappoa ja annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan. 2i tunnin kuluttua haihdutetaan voimakkaasti kirkas väritön liuos kiertohaihduttimessa huoneen lämpötilassa (n. 10 ml), lisätään useita kertoja kulloinkin 100 ml dikloorimetaania ja haihdutetaan viimeksi mainittu jälleen pois.

20 Jäljelle jäävä öljy otetaan 100 ml:aan tert.-butanolia ja lyofilisoidaan. Raakatuote puhdistetaan kaksinkertaisella kromatografiällä kulloinkin 400 g:ssa Kieselgel 60:a järjestelmässä kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5. Fraktioihin 92-172 sisältyvä materiaali liuotetaan 100 ml:aan kahdesti tis-25 lattua vettä ja puhdistetaan diasuodatuksella (AMICON-sekoi-tuskenno 402, ultrasuodatin PM 10/76 mm 0) esimerkin 1 mukaisesti. Kennoon jäävä liuos suodatetaan Millipore-suodattimen (0,2 μ) läpi ja lyofilisoidaan.

Saadaan N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamiini-30 happo-(C )-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hyd-roksifosforyylioksi)-etyyliamidi-dinatriumsuola, joka sisältää 4,89 moolia vettä, värittömänä kuohkeana jauheena arvoilla (α)ο° = +1° ± 1° <c = 0,675; metanoli),

Rf = 0,08 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5), 35 Rf = 0,15 (etikkahappoetyyliesteri:n-butanoli:pyridiini:etik-kahappo:vesi = 42:21:21:6:10) ja Rf =0,30 (kloroformi:metanoli:vesi:etikkahappo =70:40:9:1).

so 79330

Esimerkki 18:

Alveolaarisia rotan makrofageja saadaan keuhkopesuilla, maljataan ja inkuboidaan in vitro 24 tuntia joko liposo- mien kanssa, joissa on vaikuttavaa ainetta, tai 5 vaikuttavan aineen kanssa, joka on fysiologisessa suolaliuok- 125 sessa (phosphate buffered saline, PBS). Lisätään I-merkit-tyjä tuumorisoluja ja inkuboidaan vielä 72 tuntia. Tämän jälkeen pestään kuolleet tuumorisolut pois ja määritetään vielä elävien tuumorisolujen määrä niiden radioaktiivisuuden perus-10 teella. Makrofagi-aktivointi määritetään sytotoksisuuden perusteella, so. kokeen lopussa kuolleiden tuumorisolujen osuuden mukaan. Spesifinen sytotoksisuus {%) lasketaan seuraavasti: cpm makrofagien ja vaikuttavan aineen kanssa inkuboi-duissa tuumorisoluissa 15 ioo 1-- cpm makrofagien ja PBS:n kanssa inkuboiduissa tuumo-risoluissa _

Yllä olevan testimenetelmän muut yksityiskohdat on esitetty julkaisuissa I.J.Fidler et ai., J.Biol.Response Modi-20 fiers J_, 43-55 (1982). Muutamia allamainttuja vaikuttavia aineita koskevia koetuloksia on esitetty seuraavassa taulukossa: I. N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(Ca>-n-bu-tyyliesteri-(C^)-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero- 25 3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuola, II. N-propionyyli-normuramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C )-n-butyyliesteri-(C^)-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-gly-sero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuola, III. N-propionyyli-normuramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C^)- 30 n-metyyliesteri-(C^)-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-gly- sero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuola ja IV. N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C )-tert.-butyyliesteri-(C^)-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero- 3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuola.

si 79330

Vaikut- Spesifinen sytotoksisuus (%) tava Vaikuttava aine 0,2 Vaikuttava aine 100 yg: aine ml:ssa PBS:a ssa liposomeja 0,2 ml:a kohden 5 ug/viljely yg/viljely 0,02 0,2 2 20 0,02 0,2 2 20 I 39 59 56 51 44 II 21 48 74 10 23 11 III 3 81 47 64 76 79 10 IV 23 18 20 64 68 52

Esimerkki 19: 1000 tabletin valmistus, jotka sisältävät 0,5 % vaikuttavaa ainetta.

Koostumus 1000 tablettia kohden: 15 N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli- (C„)-metyyliesteri-(Cy)-L-alaniini-2-(1,2-di-paImitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuolaa 0,5 g jauhettua laktoosia 43,0 g 20 maissitärkkelystä 52,0 g

Pharmacoat 603 (hydroksipropyylimetyyliselluloosa, sisältäen 28-30 % metyyliryhmiä, valmistaja Shinetsu Chemical Company, Tokio, Japani) 3,0 g ®

Aerosil (kolloidinen piidioksidi, valmistaja Degussa, 25 Frankfurt, BRD) 1,0 g magnesiumstearaattia 0,5 g

Valmistus:

Vaikuttava aine ja 15 g laktoosia esisekoitetaan. Näin saatu esiseos sekoitetaan yhteen laktoosin (28 g) ja mais- 30 sitärkkelyksen (47 g) kanssa. Näin saadulla seoksella ja Phar-macoafilla valmistetaan granulointivalmis massa, joka granuloidaan, kuivataan ja jauhetaan. Tähän sekoitetaan 5 g maissitärkkelystä, Aerosil ja magnesiumstearaatti ja puristetaan 1000 tabletiksi, joista kukin painaa 100 mg.

35 Puristeet voidaan lakata sinänsä tunnetulla tavalla ma hanestettä kestäviksi.

52 79330

Esimerkki 20:

Vaikuttava aine lyofilisoiduri kuiva-aineen muodossa.

1 mg N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C )-metyyliesteri-(C^)-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glyse-5 ro-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuolaa ja 500 mg manniittia (pyrogeenitonta) liuotetaan injektiotarkoi-tuksiin olevassa vedessä ja suodatetaan steriiliksi kalvosuo-dattimen läpi. Aseptisissa olosuhteissa täytetään steriili-suodatettu liuos steriloituun lasiampulliin tai lasiseen pien-10 pulloon ja jäädytyskuivatetaan. Lyofilisoinnin jälkeen ampulli suljetaan tai vast, pienpullo suljetaan kumielastomeeri-sella tulpalla ja alumiinisuojuksella.

53 79330

Esimerkki 21: 1,0 g (0,7 mmoolia) 4,6-O-isopropylideeni-N-propionyy-1i-desmetyy1imuramyyli-L-alanyy1i-D-glutamyy1i-(Ca)-n-butyy-liesteri-iCy)-L-alaniini-2-(l,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuolaa, joka sisältää vielä 0,8 moolia vettä, sekoitetaan 2 tuntia 50%:ises-sa etikkahapossa huoneenlämmössä, sitten lisätään 4Ö ml vettä ja näin saatu reaktioseos lyofilisoidaan. Raakatuote puhdistetaan sitten pylväskromatografiällä 50 g:11a piihappo-geeliä (Tyyppi 60, purissum (reinst), Merck, Darmstadt, Saksa; 0,063 - 0,200 mm) systeemillä kloroformismetanoli:vesi -70:30:2-5 (5 ml fraktiot). Halutun tuotteen sisältävät fraktiot yhdistetään ja haihdutetaan kuiviin tyhjössä 30 °:ssa.

Jäännös otetaan 100 ml:aan kahdesti tislattua vettä, suodatetaan Millipore-suodattimella (0,2 /um) ja näin saatu liuos lyofilisoidaan vielä.

Saadaan 0,91 g (86,8 %) puhdasta N-propionyyli-desmetyy 1imuramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(Ca)-n-butyyli-esteri- (Cy )-L-alaniini-2-(l, 2-dipalmitoyyli-sn-glyserO-3*-hydrok-sifosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuolaa värittömänä jauheena, joka sisältää vielä 4,41 moolia vettä.

[α]ρ20 =+6,9 ° (c = 0,504, metyleenikloridi) ' ; Rf - 0,65 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5)

Rf = 0,63 (kloroformi :metanoli = 7:3) Lähtöaine saadaan seuraavasti: \* 13,0 g 4,6-O-isopropylideeni-N-propionyyli-desmetyyli- :m‘/- muramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C ) -n-butyyli-(Cv ) -bent- syyliesteriä hydrataan katalyyttisesti 250 ml:ssa seosta, jossa on dimetoksietaania:vettä = 2:1, käyttäen katalysaattorina 2,5 g palladium-hiiltä (10 S Pd), huoneenlämmössä ja normaalipaineessa. Hydrauksen päätyttyä (2 tuntia) katalysaattori suodatetaan pois ja näin saatu suodos haihdutetaan kuiviin suurtyhjössä 20 °:ssa.

" Saatu 4,6-O-isopropylideeni-N-propionyyli-desmetyyli- mur amyyl i-L-alanyyli-D-glutami inihappo-(Ca)-n-butyy1i ester i muutetaan kloroformi:isopropanolissa = 7:3, johon on lisätty 54 79330 hiukan dimetyyliformamidia, disykloheksyylikarbodi-imidin ja N-hydroksisukkinimidin avulla N-hydroksi-sukkinimidiesterik-si, joka vähän kerrallaan kiinteässä muodossa sekoitetaan liuokseen, jossa on L-alaniini-2-(l,2-dipalmitoyyli-sn-gly-sero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi/trietyyliamiinia kloroformi:isopropanoli:vedessä = 70:30:2. Sekoitetaan 3 tuntia huoneenlämmössä.

Lopuksi näin saatu samea reaktioliuos haihdutetaan kuiviin tyhjössä 30 °:ssa. Raakatuote suspendoidaan sitten kahdesti tislattuun veteen (pH 5,5), suspension pH säädetään arvoon 6,0 lisäämällä trietyyliamiinia, liukenematon osa (disykloheksyyliurea) suodatetaan pois ja suodos lyofilisoi-daan suurtyhjössä.

Näin saatu lyofilisaatti liuotetaan kahdesti tislattuun veteen ja liuos haihdutetaan 75 ml:aan AMICON-dialyysi-kennossa (Malli 402, ultrasuodatin PM 10/76 mm 3 Atti (ilmakehän ylipaineessa), sitten suodatetaan 250 ml:aa fosfaattipuskuri :natriumkloridia vastaan (kumpikin 0,1 molaari-sia), 1:1, pH 7) ja kloridivapaaksi 1750 ml:aa kahdesti tislattua vettä vastaan. Kennoon jäljelle jäävä liuos (n. 75 ml) suodatetaan sitten peräkkäin kahden Millipore-suodatti-men läpi (NALGENE S, 0,45 /um ja 0,2 /um) ja näin saatu kirkas, väritön liuos lyofilisoidaan suurtyhjössä.

Lyofilisaatti puhdistetaan edelleen CRAIG-erotuksella liuoksessa hiilitetrakloridi:kloroformismetanoli:0,5-prosent-tinen natriumkloridi = 7:17:18:6. Tuotteen sisältävät frak-- tiot yhdistetään ja haihdutetaan kuiviin suurtyhjössä kuu mentamatta (jäähdytys). Saadaan väritön jauhe, joka sisältää vielä natriumkloridia. Sen poistamiseksi tuote liuotetaan 600 ml:aan kahdesti tislattua vettä ja suodatetaan AMICON-dialyysikennossa (Malli 402, ultrasuodatin Ph 30/76 mm ¢) 3 Atu:ssä ensin noin 50 ml:aan (sisätilavuus) ja sitten yhteensä 1750 ml:aa kahdesti tislattua vettä vastaan kloridivapaaksi .

Kennoon jäljelle jäävä liuos (noin 50 ml) steriilisuo-datetaan lopuksi peräkkäin kahdella Millipore-suodattimella 55 79330 (NALGENE S, 0,45 /um ja 0,2 /um) ja lyofilisoidaan suurtyh-jössä.

Saadaan 4,6-O-isopropylideeni-N-propionyyli-desmetyy-1imuramyy1i-L-alanyyli-D-glutamyyli-(Ca)-n-butyy1iester i-(Cy)-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksi-fosforyylioksi)-etyyliamidi-natriumsuola värittömänä jauheena, joka sisältää 1,2 moolia vettä.

Esimerkki 22i 0,6 g (0,5 mmoolia) N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(Ca)-metyyliesteri-(Cy)-L-alaniini-2—(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-metoksifosforyylioksi)-etyyliamidia suspendoidaan 100 ml:aan asetonia, lisätään 0,45 g (3,0 mmoolia) natriumjodidia ja näin saatua seosta kuumennetaan palautusjäähdyttäen. Aluksi syntyy kirkas liuos, josta haluttu tuote vähitellen saostuu. Reaktion loputtua (4 tuntia) seos jäähdytetään jäähauteessa, saatu sakka suodatetaan ja pestään asetonilla. Jäljellä olevan natriumjodidin poistamiseksi näin saatu raakatuote liuotetaan metyleeniklo-ridiin, seuraavaksi saostetaan asetonilla ja puhdistetaan pylväskromatografiällä piihappogeelillä 60, purissum (Merck; 0,063-0,200 mm) systeemissä kloroformi:metanoli:vesi = 70: 30:2-5. Halutun tuotteen sisältävät fraktiot (kukin 5 ml) yhdistetään ja haihdutetaan kuiviin tyhjössä 30 °:ssa.

Jäännös otetaan 100 ml:aan kahdesti tislattua vettä, suodatetaan Millipore-suodattimen läpi (0,2 /um) ja näin saatu liuos lyofilisoidaan. Saadaan 0,62 g (91,9 %) kroma-tografisesti puhdasta N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C )-metyyliesteri-(Cy)-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroks i fos foryylioks i)-etyy-liamidi-natriumsuolaa värittömänä jauheena, joka sisältää vielä 2,87 moolia vettä.

‘ [alp20 = + 3,7° (c = 0,672; kloroformi)

Rf = 0,42 (kloroformi :metanoli:vesi = 70:30:5) Lähtöaine saadaan seuraavasti:

Liuokseen, jossa on 1,0 g (0,8 mmoolia) 4,6-O-isopro-pylideeni-N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glu- 56 79330 tamyyli-(Ca)-metyyliesteri-(C^)-L-alaniini-2-(1,2-dipalmito-yyli-sn-glysero-3-metoksifosforyylioksi)-etyyliamidia 10 ml: ssa etikkahappoa, lisätään sekoittaen 10 minuutin aikana 6 ml vettä. 12 tunnin kuluttua otetaan liuoksesta syntynyt geeli seokseen, jossa on kloroformia, metanolia ja vettä, 12 ml kutakin, orgaaninen faasi erotetaan ja haihdutetaan sitten kuiviin tyhjössä 30 °:ssa. Näin saatu jäännös puhdistetaan sitten pylväskromatografiällä 50 g:lla piihappogeeliä 60, purissum (Merck; 0,063-0,200 mm) systeemissä metyleeni-klo-ridi:metanoli =5:1 (5 ml:n fraktiot). Halutun tuotteen sisältävät fraktiot yhdistetään ja haihdutetaan kuiviin tyhjössä 30 °:ssa. Saadaan 0,92 g (95,4 %) N-propionyyli-desmetyy-limuramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C )-metyyliesteri-(C )-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-metoksi-fosfo-ryylioksi)-etyyliamidia.

Lähtöaine saadaan seuraavasti: 1,1-mmoolia 4,6-O-isopropylideeni-N-propionyyli-desme-tyylimuramiinihappoa suspendoidaan 20 ml:aan absoluuttista metyleenikloridia. Sitten lisätään peräkkäin 0,17 ml (1,2 mmoolia) trietyyliamiinia (vedetön, d = 0,73), 1,0 mmoolia L-alanyyli-D-glutamyyli-(Ca)-metyyliesteri-(CY)-L-alaniini-2—(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-metoksifosforyylioksi)-etyyliamidihydrokloridia ja 0,12 g (1,0 mmoolia N-hydroksi-sukkinimidiä, jolloin syntyy kirkas liuos. Tähän liuokseen lisätään 10 minuutin aikana liuos, jossa on 0,25 g (1,2 mmoolia) disykloheksyylikarbodi-imidiä 5 ml:ssa absoluuttista metyleenikloridia ja sekoitetaan 12 tuntia huoneenlämmössä. Seuraavaksi suodatetaan saostunut disykloheksyyliurea pois ja suodos uutetaan vedellä. Orgaaninen faasi erotetaan, kuivataan magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutetaan kuiviin tyhjössä jäähdyttäen 20 °:seen.

Näin saatu raakatuote puhdistetaan pylväskromatografi-alla 80 g:lla piihappogeeliä 60, purissum (Merck; 0,063-0,200 mm) systeemissä metyleenikloridi:metanoli = 8:1. Halutun tuotteen sisältävät fraktiot (kukin 10 ml) yhdistetään ja haihdutetaan tyhjössä kuiviin jäähdyttäen 20 °:seen.

Claims (5)

57 79330 Saadaan 4,6-isopropylideeni-N-propionyyli-desmetyy1i-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(Ca)-metyyliesteri-(CY )-L-alaniini-2-(l,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-metoksifosforyy-lioksi)-etyyliamidi. Lähtöaineen natriumsuola saadaan kuten esimerkissä 13 on kuvattu.

1. Menetelmä kaavan I mukaisten farmakologisesti vaikuttavien muramyylipeptidi-N-(2-fosfatidyylioksietyyli)-amidien ja/tai niiden suolojen valmistamiseksi j«2-OR6 . /: ».o»1) (i> R4-o\? l/' , 7hi 2 R -CH (D) ÄH-C-R \ . (L) (D) (L)fl Il I5I7 H I 2 2 S 2 2 li 2 0RR 0 J\ 8 ° 0 cf or V R ra2i'(sn) o »loAx, missä kaavassa R1, R4 ja R6 merkitsevät vetyä, R2 merkitseee C1_4-alkyyliä, R3 merkitsee vetyä tai metyyliä, R5 merkitsee vetyä, R7 merkitsee C^.g-alkyyliä, R8 merkitsee vetyä tai Cj__7-alkyyliä, X merkitsee ryhmää NH, Y merkitsee C1-4-al-kylideeniä ja R9 ja R10 merkitsevät toisistaan riippumatta C11_17-alkyyliä, tunnettu siitä, että a) kaavan V 58 79330 Α|η2 |/!~\| 1 R4o\£ ι/' <H,0R) (V) , / Πη-cV R3-(/ (D) \ Γ (L) /"(D) f <L> \X 1 C- N- CH-C- (NH-CH-CH.-CH -c- \ X-Y-C- ) \ OH " 15 <7 H I 2 2 II / II f 0. v/v (. 0 Jy • r q mukainen yhdiste, jossa s, r, ja q merkitsevät toisistaan riippumatta lukua 0 tai 1 ja R® merkitsee C1_7-alkyyliä tai karboksyylisuojaryhmää ja muilla substituenteilla on yllä mainitut merkitykset, edellyttäen, että kaavan V mukaisessa yhdisteessä esiintyvät vapaat funktionaaliset ryhmät lukuunottamatta reaktioon osallistuvaa ryhmää esiintyvät mahdollisesti suojatussa muodossa, tai tämän yhdisteen karboksyyli-happojohdannainen saatetaan reagoimaan kaavan VI 7t ? (D) \(L)® 1 f* l\r *’' !λ· v 1 U (VI) n L·H, 1' (sn) y/ y mukaisen yhdisteen kanssa, jossa t, u ja v merkitsevät toisistaan riippumatta lukua 0 tai 1 ja substituenteilla on yllä mainitut merkitykset, edellyttäen, että t, u ja v merkitsevät lukua 1, kun kaavan V mukaisessa reaktioon osallistuvassa yhdisteessä q merkitsee lukua 0, tai että t merkitsee lukua 0, u lukua 1 ja v lukua 1, kun q merkitsee lukua 1 ja r lukua 0, tai että u on 0 ja v on 1, kun q merkitsee lukua 59 79330 1, r lukua l ja s lukua O, tai että v on O, kun q, r ja s merkitsevät lukua 1, tai tämä yhdisteen reaktiokykyisen johdannaisen kanssa, ja lohkaistaan mahdollisesti esiintyvät suoj aryhmät, tai b) kaavan X ^Hj-OR6^ 3 / Π. * 2 R -CÄ (D) RH-C-R (L) (D) (L)O 0R u-N-CH-C-NH-CH-CH,-CH,-C-X-Y-C-NH--CH -CH_-0-P-0-CH,, Il 15 f 7 It I 2 2 II 2 2 „ 2 °RR 0 A 8=υ ö 0° <r or \ /Jc-o-ch R £h« 1' (sn) I ^ o *ιο/\> mukaisesta yhdisteestä, jossa R^l merkitsee vetyä tai suoja-ryhmää ja vähintään yksi tähteistä Rla, R4a, R6a ja R8a tarkoittaa helposti lohkaistavaa suojaryhmää ja muut tähteistä Rla, R4a, R6a ja R8a tarkoittavat samaa kuin R1, R4, R6 ja vastaavasti R8 edellä, ja muilla substituenteilla on yllä mainitut merkitykset, lohkaistaan suojaryhmä(t), ja haluttaessa menetelmän a) tai b) suorittamisen jälkeen muunnetaan saatu kaavan I mukainen yhdiste suolakseen tai saatu suola joksikin toiseksi suolaksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaineet valitaan niin, että saadaan kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa R8 merkitsee näissä vaatimuksissa mainittua alkyylitähdettä, ja/tai niiden suoloja.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaineet valitaan niin, että saadaan kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa R1, R4 ja R6 mer- 60 79330 kitsevät vetyä, R2 merkitsee metyyliä tai etyyliä, R3 merkitsee vetyä, kun R2 merkitsee etyyliä, tai metyyliä, kun R2 merkitsee metyyliä, R5 merkitse vetyä, R7 merkitsee C-j^-al-kyyliä, R8 merkitsee suoraketjuista C1_4-alkyyliä, X merkitsee ryhmää NH, Y merkitsee etylideeniä ja R9 ja R10 merkitsevät toisistaan riippumatta suoraketjuista C15_17-alkyyliä, jossa on pariton määrä C-atomeja, ja/tai näiden yhdisteiden suoloja.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaineet valitaan niin, että saadaan kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa R9 samoin kuin R10 merkitsee n-pentadekyyliä, ja/tai niiden suoloja.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaineet valitaan niin, että saadaan jokin seuraavista yhdisteistä N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(Ca)-n-butyyli-esteri-(Ογ)-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi, N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C )-n-butyyliesteri-(Cv)-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi, N-asetyyli-muramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(Ca)-n-metyyli-esteri-(C^)-L-alaniini-2-(l,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi, N-propionyyli-desmetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-glutamyyli-(C^)-n-metyyliesteri-(C^)-L-alaniini-2-(1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)-etyyliamidi, ja/tai niiden suoloja.