CS245787B2 - Production method of muramylpetides - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby nových muramylpeptidů obecného vzorce I ch^oh h-o&J''⁰'

IČCH П Q 1 (D) (LO

OH i v němž

0' OR (!)

R² znamená alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxymethylovou skupinu nebo fenylovou skupinu,

R³ znamená vodík nebo pinu,

R⁵ znamená vodík nebo nu s 1 až 3 atomy uhlíku,

R7 znamená popřípadě methylovou skualkylovou skupihydroxyskupinou substituovanou alkylovou skupinou s 1 až 3 atomy uhlíku,

R⁸ znamená vodík nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku,

X znamená kyslík nebo skupinu NH,

Y znamená alkylidenovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku a

R⁹ a. R1° znamenají nezávisle na sobě alkylovou skupinu s 11 až 17 atomy uhlíku nebo alkenylovou skupinu s 11 až 17 atomy uhlíku, jakož i solí těchto sloučenin, které mají cenné farmakologické vlastnosti a mohou se používat jako účinné složky léčiv.

Sloučeniny obecného vzorce I mají v případě asymetrické substituce na C-R3 (D)-konfiguraci, na C-R7 (L)-konfiguraci, na C-C-OR⁸ (D)-konfiguraci, ve zbytku Y (Lj-konfiguraci a na C-l zbytku D-glukózy aa/nebo J-konfiguraci, tzn., že sloučeniny vzorce I se mohou vyskytovat jako čisté anomery nebo jako směsi anomerů.

K rozlišení konfigurace na středním atomu uhlíku glycerinové části se podle pravidel IUPAC v souhlase se stereospecifickým číslováním atomů uhlíku glycerinové části, používá označení prefixem „sn“. Nejhořejší atom uhlíku ve Fischerově projekci vertikálního uhlíkatého řetězce, přičemž hydroxyskupina na atomu uhlíku v poloze 2 je vlevo, dostává číslo 1. U sloučenin podle vynálezu je zbytek fosforečné kyseliny vázán na atom uhlíku v poloze 3 ve smyslu stereospecifického číslování.

Výraz „nižší“ používaný v další části označuje zbytky s 1 až 7 atomy uhlíku, zejména s 1 až 4 atomy uhlíku.

Nižší alkanoylová skupina znamená například propionylovou skupinu, butyrylovou Skupinu nebo hexanoylovou skupinu, především však acetylovou skupinu.

Nižší alkylová skupina je představována například n-propylovou skupinou, n-butylovou skupinou, isobutylovou skupinou, sek.butylovou skupinou, ' terc.butylovou skupinou, dále n-pentyiovou skupinou, n-hexylovou skupinou nebo n-heptylovou skupinou, především methylovou skupinou, ethylovou skupinou nebo isopropylovou skupinou.

Jednotlivě znamená alkylový zbytek ve významu symbolu R² zejména methyl, jestliže R3 znamená methyl, nebo znamená ethyl, jestliže R3 znamená vodík; alkylový zbytek R⁵ znamená zejména methyl, alkylový zbytek R7 znamená zejména methyl, ethyl nebo . isopropyl a alkylový zbytek R⁸ znamená zejména alkylový zbytek s 1 až 4 atomy uhlíku, zejména . přímý alkylový zbytek s 1 až 4 atomy uhlíku, především pak n-butyl.

Alkylovou skupinou s 1 až 3 atomy uhlíku, která je substituována hydroxyskupinou ve významu symbolu . R7 je zejména hydroxymethyiová skupina nebo 1-hydroxyethylová skupina.

Alkylidenovou skupinou ve významu sym bolu Y je dvojvazný zbytek, ve kterém obě vazby vycházejí ze stejného atomu uhlíku, výhodně zbytek vázaný v poloze 1,1, jako zejména methylenový zbytek nebo ethylidenový zbytek, dále propylidenový zbytek nebo isobutylidenový zbytek.

Alkylovou skupinou s 11 až 17 atomy uhlíku ve významu symbolu r9 nebo R1° je přímá nebo ' rozvětvená, zejména však přímá alkylová skupina, především přímá alkylová skupina s lichým počtem atomů uhlíku, jako je n-undecylová skupina nebo n-tridecylová skupina, především přímá alkylová skupina s 15 až 17 atomy uhlíku s lichým počtem atomů uhlíku, tj. n-heptadecylová skupina nebo především n-pentadecylová skupina.

Alkenylovou skupinou s 11 až . 17 atomy uhlíku ve významu symbolů R9 nebo R1° je zejména hepta-8(Z)-decenylová skupina.

Proton vázaný přes atom kyslíku na atom fosforu je kyselý a může se působením bází snadno odštěpit a nahradit jiným kationtem. Při hodnotě pH 7 se sloučeniny vzorce I vyskytují tudíž zcela nebo z převážné části ve formě soli. Tyto soli, jakož i směsi soli a kyseliny náleží rovněž k předmětu vynálezu. Vynález se týká zejména farmaceuticky použitelných, netoxických solí sloučenin vzorce I. Jsou to především soli s kovy nebo amoniové soli, jako jsou soli s alkalickými kovy nebo soli s kovy alkalických zemin, například soli sodné, draselné, hořečnaté nebo vápenaté, jakož i amonné soli nebo soli . s vhodnými organickými aminy, jako s nižšími alkylaminy, například s triethylaminem. Za účelem izolace nebo čištění se mohou používat také farmaceuticky nevhodné soli. K terapeutickému účelu se však používá pouze farmaceuticky použitelných, netoxických solí, které jsou tudíž výhodné.

Sloučeniny obecného vzorce I, vyráběné postupem podle vynálezu, spadají pod obecný rámec evropské přihlášky vynálezu číslo °°25 495 a mohou se používat jako imunostimulátory. Oproti. sloučeninám, které již byly publikovány ve shora uvedené přihlášce vynálezu, mají však sloučeniny podle vynálezu silně snížené nežádoucí vedlejší účinky, zejména pak jsou mnohem méně pyrogenní, tj. prakticky nejsou vůbec progenní. Toto zjištění má značný význam, protože aplikace pyrogenní látky může způsobit podle okolností tepelný šok, takže bezpečné použití je zajištěno jen za stálého lékařského dohledu a použití určitých aplikačních forem, jako intravenosní aplikace, nepřichází v úvahu.

Zkoušení pyrogenity se může provádět podle předpisu, který je uveden v publikaci Europáische Pharmakopěe, sv. 2., str. 56 až 59 (1971) na králících. Podle tohoto předpisu se například . dokonce při subkutánní aplikaci vysoké dávky, jako je 3° mg/kg sodné soli N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (C_a) -n-butylester- (C?) -L-alanin-25

- (l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydi’oxyfosforyloxyjethylamidu (sloučenina I) nedá zjistit žádný pyrogenní účinek.

Naproti tomu je stejná dávka sodné soli N-acetylmuramyl-L-a'anyl-D-isoglutamyl-L-alanin-2- (l,2-dipalmitOyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy Jethylamidu silně pyrogenní.

Sloučeniny vyráběné způsobem podle vynálezu se mohou používat způsobem popsaným v evropské přihlášce vynálezu číslo 0025 495.

Na základě své výtečné snášitelnosti jsou však sloučeniny vyráběné podle vynálezu vhodné zejména к profylaxi a terapii infekčních onemocnění, přičemž к silnému účinku nedochází pouze v případě původců bakteriálních onemocnění, nýbrž i překvapivě v případe původců virových onemocnění. Posléze uvedené zjištění nebylo dosud popsáno a má značný praktický význam vzhledem к tomu, že farmaceutika к léčení chorob způsobených viry byla dosud к dispozici pouze ve zcela nedostatečné míře. Pozoruhodné je především dlouhé profylaktické nebo terapeutické trvání účinku od několika dnů až do několika týdnů po jednorázové aplikaci sloučenin vyráběných podle vynálezu, jakož i široké spektrum původců virových chorob, proti kterým jsou tyto sloučeniny účinné.

Muramylpeptidy vzorce I se mohou používat zejména к profylaxi zejména к profylaxi a terapii chorob, které jsou vyvolávány dále blíže označenými viry [k nomenklatuře srov. J. L. Melnick, Prog. med. Virol, 26, 214—232 (1980) a 28, 208—221 (1982)]:

DNA viry s kubickou symetrií a neobalenou nukleokapsidou,

DNA-viry s obaleným virionem, jakož i RNA viry s kubickou symetrií a

RNA viry s helikoidální symetrií kapsidy.

Výhodně se sloučeniny vzorce I používají v případě DNA virů s obaleným virionem a kubickou symetrií kapsidy, v případě RNA virů s-kubickou symetrií kapsidy a neobaleným virionem a v případě RNA virů s helikoidální symetrií kapsidy, v nichž je obal nukleokapsidy u povrchové membrány, avšak také v případě čeledí Adenoviridae, Poxviridae a Coronaviridae, jako zejména v případě lidských koronavirů.

Především se sloučeniny vzorce I používají v případě čeledi Herpesviridae, Picornaviridae a myxovirů, avšak také v případě mastedenovirů, jako zejména v případě lidských adenovirů, v případě chordopoxvirů, jako hlavně arthopoxvirů, jako zejména například vacciniavirů, v případě Reoviridae, zvláště (zejména lidských) rotavirů, jakož i v případě Caliciviridae a Rhabdoviridae, jako především vesikulovirů lidí, jakož i koní, hovězího dobytka a prasat.

Hlavně pak se sloučenin vzorce I používá v případě los-herpesvirů, rhinovirů, kardiovirů a Orthomyxoviridae, avšak také v případě β-herpesvirů, jako zejména lidských cy tomegalovirů, v případě afthovirů, především aithovirů sudokopytníků, jako hlavně hovězího dobytka, jakož i v případě Paramykovirldae, především pneumovirů, například respiračních syncitialvirů lidí, a vedle toho morbillivirů nebo paramyxovirů, jako například lidských parainfluenzavirů včetně sendaivirů.

Především pak se sloučenin vzorce I vyráběných postupem podle vynálezu používá v případě slmplexvirů, například lidských Herpes simplex virů typů 1 a 2, dále pak v případě lidských encefalomyocardÍLÍsvirů a v případě virů Influenza, jako je hlavně Influenza A a Influenza В virus, například v případě virů uvedených v příkladech.

Muramylpeptidy vzorce I se mohou používat к profylaxi nebo к terapii virových infekcí tím, že se aplikují enterálně nebo paren lerálně, především společně s vhodnými pomocnými látkami nebo nosnými látkami. Výhodné se aplikují na sliznici, například intranasálně, rektálně, vaginálně nebo na oční spojivku, nebo orálně. К antivirovému účinku dochází však také při aplikaci jinými způsoby, například subkutánně, intravenosně, intramuskulárně nebo při aplikaci na normální pokožku.

Nejvhodnější způsob aplikace závisí kromě jiného na druhu příslušného viru. Tak například v případě respiračních virů je v mnoha případech výhodná intranasální aplikace. Dávkování účinné látky závisí kromě jiného na druhu teplokrevného živočicha, na obranné schopnosti organismu, na způsobu aplikace a na druhu viru.

Sloučeniny vyráběné postupem podle vynálezu mají další velmi zajímavou vlastnost, která spočívá v inhibici tvorby metastáz u některých nádorů, zejména plicních nádorů, jako lze experimentálně prokázat na modelu melanomu B16—BL6 a v případě Lewisova plicního karcinomu, přičemž je zvláště výhodná aplikace do liposomů.

Zejména se vynález týká způsobu výroby sloučenin obecného vzorce I, v němž R² znamená alkylovou skupinu s 1 až 2 atomy uhlíku nebo hydroxymethylovou skupinu, R³ znamená vodík nebo methylovou skupinu, R⁵ znamená vodík nebo methylovou skupinu, R⁷ znamená alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku nebo hydroxymethylovou skupinu, R⁸ znamená vodík nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, X znamená kyslík .nebo skupinu NH, Y znamená alkylidenovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku a R⁹ a R¹⁰ znamenají nezávisle na sobě přímou alkylovou skupinu s 11 až 17 atomy uhlíku nebo deskarbonyloleoylovou skupinu, a jejich solí.

Především pak se vynález týká způsobu výroby sloučenin obecného vzorce I, v němž R² znamená methylovou skupinu nebo ethylovou skupinu, R³ znamená vodík nebo methylovou skupinu, R⁵ znamená vodík nebo methylovou skupinu, R⁷ znamená alkylovou skupinu ' s 1 až · 3 atomy uhlíku, R⁸ znamená vodík nebo· alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, · X znamená kyslík nebo skupinu NH, Y znamená alkylidenovou skupinu s 1 až 2 atomy uhlíku a R⁹ a R¹⁰ znamenají · nezávisle na sobě přímou alkylovou skupinu s 11 až 17 atomy uhlíku s lichým počtem atomů nebo deskarbonyloleoylovou skupinu, a jejich solí.

Zvláště pak se vynález týká způsobu přípravy shora uvedených sloučenin obecného vzorce I, v němž R8 znamená některý z uvedených alkylových zbytků a jejich solí.

Zvláště pak se vynález týká způsobu přípravy sloučenin obecného vzorce I, v němž R2 znamená methylovou skupinu nebo ethylovou skupinu, R3 znamená vodík, jestliže R2 znamená ethylovou skupinu, nebo znamená methylovou skupinu, jestliže R2 znamená methylovou skupinu, R⁵ znamená vo dík nebo methylovou skupinu, R7 znamená alkylovou skupinu s 1 až 2 atomy uhlíku, R8 znamená přímou alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, X znamená kyslík nebo skupinu NH, Y znamená ethylidenovou skupinu a R9 a R10 znamenají nezávisle na sobě přímou alkylovou · skupinu s 15 až 17 atomy uhlíku s lichým počtem atomů uhlíku a jejich solí.

Především se vynález týká způsobu výroby shora uvedených sloučenin obecného vzorce I, v němž R3 znamená methylovou skupinu, R5 znamená vodík, R8 znamená n-butylovou skupinu, X znamená skupinu NH a/nebo R9 stejně jako R^w znamenají n-pentadecylovou skupinu, a jejich solí, jakož i sloučenin vzorce I uvedených v příkladech.

Nové sloučeniny obecného vzorce I a jejich soli se podle vynálezu vyrábějí tím, že se sloučenina obecného vzorce V

HOCH

(H,0H) $ 2

R~CH (D)NH~C-Rr

C —

II

O t

(L)

X.-Y-C(3 oh v němž s, r a q znamenají nezávisle na sobě O nebo 1, a ostatní substituenty mají shora uvedené významy, s tím, že volné funkční skupiny · přítomné · ve sloučenině vzorce V s výjim(V kou skupiny podílející se na reakci jsou popřípadě přítomny v · chráněné formě, nebo její reaktivní derivát karboxylové kyseliny nechá· reagovat se sloučeninou obecného vzorce VI “I

и í⁴ и

I X

U-(V

CO z® í \> 2 ·

I

0=0

I· r h.

g o — ot »

d и Λo.

^xo ó4 ^;И' v němž t, u a v znamenají nezávisle na sobě 0 nebo 1 a

R® znamená alkylovou skuoinu s 1 až 4 atomv uhlíku nebo chránící skupinu karboxvlové skupiny, a ostatní substituentv maií shora uvedený význam s tím. že t, u a v znamenají číslo 1. jestliže v reakční složce vzorce v znamená q nulu, nebo že t znamená nulu, u znamená 1 a v znamená 1, jestliže q znamená 1 a r znamená nulu, nebo že u znamená nulu a v znamená 1. jestliže q znamená 1, r znamená las znamená nulu, že v znamená nulu, jestliže q, r a s znamenají 1, nebo- s jereaktivním derivátem, načež se ponříoajím dě přítomné chránicí skupiny odštěpí, načež se popřípadě získaná sloučenina obecného vzorce I převede na sůl nebo· se získaná sůl převede na jinou sůl.

Reaktivní esterifikovanou hvdroxyskupinou je například hvdroxyskupina esterifikovaná silnou anorganicko·” nebo organickou kyselinou. iako minerální kvselinou, nanříklad halogenovodíkovou kvselinou, jako chlorovodíkovou kvselinou. bromovodíkovou kyselinou nebo jodovodíkovou kvselinou, dále kyselinou sírovou nebo halogensírovou kyselinou, například fluorsírovou kyselinou, nebo silnou organickou sulfonovou kyselinou, jako popřípadě, například halogenem, jako fluorem, substituovanou nižší alkansulfonovou kyselinou nebo aromatickou sulfonovou kyselinou, například popřípadě nižší alkylovou skupinou, jako methylovou skupinou, halogenem, jako bromem, a/nebo nitroskupinou substituovanou benzensulfonovou kyselinou, například methansulfonovou kyselinou, trifluormethansulfonovou kyselinou nebo p-toluensulfonovou kyselinou esterifikovaná hydroxyskupina.

Aminoskupinou přítomnou v reaktivní formě je například aminoskupina aktivovaná reakcí s fosfitem, jako s diethylchlorfosfitem, ethylen-chlorfosfitem, 1,2-fenylenchlorfosfitem, ethyldichlorfosfitem nebo tetraethylpyrofosfitem. Reaktivní aminoskupinou je například také halogenid karbamové kyseliny nebo isokyanát, přičemž aminoskupina je přítomna ve formě vázaná na halogenkarbonyl, například chlorkarbonyl, popřípadě ve formě isokyanátové skupiny, přičemž v posléze uvedeném případě jsou dostupné pouze sloučeniny vzorce I, které na atomu dusíku amidoskupiny vzniklé reakcí obsahují atom vodíku.

Reaktivním derivátem karboxylové kyseliny je například sůl, například česná sůl, jestliže v reakční složce vzorce II je přítomna alespoň jedna hydroxyskupina v reaktivní esterifikované formě, nebo reaktivní ester karboxylové kyseliny, reaktivní anhydrid karboxylové kyseliny nebo cyklický amid. Přitom se mohou reaktivní deriváty kyseliny tvořit také in šitu.

Aktivovanými estery kyselin jsou zejména nenasycené estery obsahující nenasycenou vazbu na atomu uhlíku, na který se váže esterifikující zbytek, například typu vinylesterů, jako jsou vlastní vinylestery [které lze získat například reakcí příslušného esteru s vinylacetátem; metoda aktivovaného vinylesteru), dále karbamoylvinylestery (které lze získat například reakcí příslušné kyseliny s isoxazoliumderivátem; 1,2-oxazoliová metoda nebo Woodwardova metoda), nebo l-( nižší Jalkoxy vinylestery (které lze získat například reakcí příslušné kyseliny s nižším alkoxyacetylenem; ethoxyacetylenová metoda), nebo estery amidinového typu, jako N,N‘-disubstituované amidinoestery (které lze získat například reakcí odpovídající kyseliny s vhodným N,N‘-disubstituovaným karbodiimidem, například N,N‘-dicyklohexylkarbodiimidem; karbodiimidová metoda), nebo N,N-disubstituované amidinoestery (které lze získat například reakcí příslušné kyseliny s N,N-disubstituovaným kyanamidem; kyanamidová metoda), vhodné arylestery, zejména fenylestery, které jsou vhodně substituovány substituenty přitahujícími elektrony (které lze získat například reakcí příslušné kyseliny s vhodně substituovaným fenolem, například 4-nitrofenolem, 4-methylsulfonylfenolem, 2,-

4,5-trichlorfenolem, 2,3,4,5,6-pentachlorfe nolem nebo 4-fenyldiazofenolem, v přítomnosti kondenzačního činidla, jako N,N‘-dicyklohexylkarbodimidu; metoda aktivovaných arylesterů), dále kyanmethylestery (které lze získat například reakcí příslušné kyseliny s chloracetonitrilem v přítomnosti báze; kyanmethylesterová metoda), thioestery, zejména popřípadě například nitroskupinou, substituované fenylthioestery (které lze získat například reakcí příslušné kyseliny s případně, například nitroskupinou, substituovanými thiofenoly, kromě jiného pomocí anhydridové nebo karbodiimidové metody; metoda aktivovaných thiolesterů), amino- nebo amidoestery. (které lze získat například reakcí příslušné kyseliny s N-hydroxyaminoderivátem, popřípadě s N-hydroxyamidoderivátem, například s N-hydroxysukcinimidem, N-hydroxypiperidinem, N-hydroxyftalimidem nebo 1-hydroxybenztriazolem, například anhydridovou nebo karbodimidovou metodou; metoda aktivovaných N-hydroxyesterů.

Reaktivními anhydridy mohou být symetrické nebo výhodně smíšené anhydridy těchto kyselin, jako například anhydridy s anorganickými kyselinami, jako jsou halogenidy kyseliny, zejména chloridy kyseliny (ty lze získat například reakcí příslušné kyseliny s thionylchloridem, chloridem fosforečným nebo oxalylchloridem; metoda chloridů kyseliny), azidy (které lze získat například z příslušného esteru kyseliny přes odpovídající hydrazid a reakcí tohoto hydrazidu s kyselinou dusitou; azidová metoda), dále anhydridy s monoderiváty kyseliny uhličité, jako s odpovídajícími estery, například s nižšími alkylpoloestery kyseliny uhličité [které lze získat například reakcí příslušné kyseliny s nižšími alkylestery halogen-, jako chlormravenčí kyseliny nebo s 1- (nižší) alkoxykarbony 1-2- (nižší) alkoxy-1,2-dihydrochinolinem, například s l-(nižší)alkoxykarbonyl-2-ethoxy-l,2-dihydrochinO’linem; metoda smíšených anhydridů O-alkyluhličité kyseliny], nebo anhydridy s dihalogenovanou, zejména s dichlorovanou fosforečnou kyselinou, (které lze získat například reakcí příslušné kyseliny s oxychloridem fosforečným; fosforoxychloridová metoda), nebo anhydridy s organickými kyselinami, jako jsou smíšené anhydridy s organickými karboxylovými kyselinami, (které lze získat například reakcí příslušné kyseliny s popřípadě substituovaným halogenidem (nižší)alkan- nebo fenylalkankarboxylové kyseliny, například s chloridem fenyloctové kyseliny, pivalové kyseliny nebo trifluoroctové kyseliny; metoda smíšených anhydridů karboxylové kyseliny) nebo s organickými sulfonovými kyselinami, (které lze získat například reakcí soli, jako soli s alkalickým kovem, příslušné kyseliny, s vhodným organickým halogenidem sulfonové kyseliny, jako s chloridem nižší alkansulfonové kyseliny nebo arylsulfonové ky243787 seliny, například s chloridem methansulfonové kyseliny nebo s chloridem p-toluensulfonové kyseliny; metoda smíšených anhydridů sulfonové kyseliny), jakož i symetrické anhydridy, (které lze získat například kondenzací příslušné kyseliny v přítomnosti karbodiimidu nebo 1-diethylaminopropinu; metoda symetrických anhydridů).

Vhodnými cyklickými amidy jsou zejména amidy s pětičlennými dlazacykly aromatického charakteru, jako jsou amidy s imidazoly, například s imidazolem, (které lze získat například reakcí příslušné kyseliny s N,N^<-karbonyldiimidazolem; imidazolidová metoda), nebo s pyrazoly, například s 3,5-dimethylpyrazolem, (které lze získat například přes hydrazid kyseliny reakcí s acetylacetonem; pyrazolidová metoda).

Chránícími skupinami případně přítomných funkčních skupin jsou například dále uvedené chránící skupiny.

Reakce se může provádět o sobě známým způsobem, přičemž reakční podmínky závisí především na tom. zda a jak je karboxylová skupina podílející se na reakci aktivována, obvykle v přítomnosti vhodného rozpouštědla nebo ředidla nebo směsi takových rozpouštědel nebo ředidel a popřípadě v přítomnosti kondenzačního činidla, kterým může být například, jestliže je karboxylová skupina podílející se na reakci přítomna ve formě anhydridů, také činidlo vázající kyselinu, za chlazení nebo za zahřívání, například v rozsahu teplot asi od —30 do 150 °C, v uzavřené reakční nádobě a/nebo v atmosféře inertního· plynu, například dusíku.

Obvyklými kondenzačními činidly jsou například karbodiimidy, například N,iV-diethyl-, N,N‘-dipropyl-, N,N‘-dícyklohexylnebo N-ethyl-N‘- (3-cl im e t hylamino prop у I) karbodlimid, vhodné karbonylové sloučeniny, například karbonyldiimidazol, nebo 1,2-oxazóliové sloučeniny, například 2-ethyl-5-fenyl-l,2-oxazolium-3^<-sulfonát a 2-terc.butyl-5-methyllsoxazollumperchlorát nebo vhodný acylaminodrrivát, například 2-ethoxy-l-ethoxykarbonyl-l,2-dihydrochinolm.

Obvyklými kondenzačními činidly vázajícími kyselinu jsou například uhličitany alkalických kovů nebo hydrogmuhličitany alkalických kovů, například uhličitan nebo hydrogenuhličitan sodný nebo draselný (obvykle společně se sulfátem), nebo organické báze, jako obvykle sféricky bráněné tri(nižší jalkylaminy, například N,N‘-diisopropropyl-N-ethylamin.

Výhodně se reakce provádí tak, že se nechá reagovat ’ aktivovaný ester karboxylové kyseliny nebo reaktivní anhydrid karboxylové kyseliny nebo cyklický amid sloučeniny vzorce VI, v němž jsou hydroxyskupiny a/nebo aminoskupiny zúčastňující se reakce přítomny ve volné formě.

Chrániči skupiny, jejich zavedení a odštěpování se popisuje například v , „Protoctive Groups in Organic Chemistry“, Plenům .

Press London, New York 1973, a v „Methoden der organischen Chemie“, Houben-Weyl,

4. yydání, sv , · 55H , 6ό0Γ--Τ1ήθΐη-ν^Γ^, Stuttgart 1974.

Charakteristické pro chránící skupiny je, že jsou snadno, tj. aniž by docházelo k nežádoucím vedlejším reakcím, odštěpitelné například solvolyticky, redukčně, fotolyticky nebo také za fyziologických podmínek.

Chránícími skupinami hydroxyskupiny jsou například acylové skupiny, jako· popřípadě například , halogenem substituovaná nižší alkanovlová skupina, jako 2,2-dichloracetylová skupina, nebo acylové zbytky polo-esterů kyseliny uhličité, zejména terc.butyloxykarbonylosá skupina, popřípadě substituovaná benzyloxykarbonylosá skupina, například 4-nitrobenzyloxykarbonylosá skupina, nebo difenylmethoxykarboáylosd skupina, nebo 2*halogen(nl.žší) alkoxykarbonylová skupina, jako 2,2,í^-t]^i^(^hlorethoxykarbonylová skupina, dále tritylová skupina nebo formylová skupina, nebo organické silylové nebo stannylové skupiny,, dále snadno odštěpitelné etherifikující skupiny, · jato terč.fnižšíjalkylová skupina, například terč.butylová skupina, 2-oxa- nebo 2-thia-alifat tické nebo -cykloalifatické uhlovodíkové zbytky, především l-(áižší)alkoxy(nižší)alkylová skupina nebo l-( nižší jalkylthio (nižší) alkylová skupina, například methoxymrt thylová skupina, /-methoxyethylosá · skupina, /-Cihoxye]hylová skupina, /-methylkhiomethylová skupina, /-methylthioethylosá skupina nebo /-ethylthioethylovd skupina, nebo 2-oxa- nebo 2-thiacykioalkylosd skupina s 5 až 6 atomy v kruhu, například tétrahydrofuranylová skupina nebo 2-tetrahydropyranylová skupina nebo odpovídající thiaanalogy, jakož i popřípadě substituovaná ltfr.áyl(áižší)alkylosά skupina, jako· popřípadě substituovaná benzylová skupina nebo difenylmethylová skupina, přičemž jako substitumty fenylových skupin přichází v úvahu například halogen, jako· chlor, nižší alkoxyskupina, jako mekhoxyekupina a/ /nebo nitroskupina.

Reaktivní deriváty karboxylové kyseliny sloučeniny vzorce V jsou představovány reaktivními estery, anhydridy nebo amidy, jak je popsáno shora.

Deriváty kyselin vzorce V se mohou tvořit také in sítu. Tak lze například NX-disubstituované amidiáoestrry tvořit in šitu tím, že se uvede v reakcí směs výchozí látky vzorce VI a kyseliny vzorce V v přítomnosti vhodného N,N‘-dieubstikuovaáé karbódiimidu, například N,N‘-dicykiohexylkarbodiimidu.

Dále lze tvořit aminoestery nebo amidoestery kyselin vzorce V v přítomnosti výchozí látky vzorce VI, která má být acylována tím, že se nechá reagovat směs odpovídající kyseliny a aminoeloučeniáy jakovýchozích látek v přítomnosti N^N^-disubstituovaného karbodiimidu, například N,N‘245787

1’5

1G

-dicyklohexylkarbodiimldu, a N-hydroxyaminu nebo N-hydroxyamidu, například N-hydroxysukcinimidu, popřípadě v · přítomnosti vhodné báze, například 4-dimethylaminopyridinu.

Derivát sloučeniny vzorce VI, v němž aminoskupina zúčastňující se reakce je přítomna v reaktivní formě, se může vyrobit například reakcí· se shora uvedenými fosfity. Reaktivní formou sloučeniny vzorce VI je například také halogenid karbamové kyseliny. · nebo . isokyanát, přičemž aminoskupina zúčastňující se reakce je ve sloučenině vzorce · VI vázána na halogenkarbonylovou skupinu, . například chlorkarbonylovou skupinu, ·.popřípadě přítomná jako isokyanatoskupina, přičemž v posléze uvedeném případě jsou dostupné jen ty sloučeniny vzorce I, které obsahují na atomu dusíku reakcí vzniklé amidoskupiny atom vodíku.

Výhodně se používá k reakci reaktivního derivátu karboxylové kyseliny sloučeniny vzorce V, který se uvádí v reakci se sloučeninou vzorce VI, v němž je aminoskupina nebo hydroxyskupina zúčastňující se reakce přítomna · ve volné formě.

Alternativně lze uvádět . v reakci také sůl, například česnou sůl, sloučeniny vzorce V, v němž q a r znamenají číslo las znamená 0, se sloučeninou vzorce VI, v němž X znamená kyslík, v znamená číslo 1 a u a t znamenají 0, přičemž se hydroxyskupina podílející se na reakci, vyskytuje v reaktivní esterifikované formě.

Konečně lze uvádět v reakci také volnou kyselinu vzorce V se sloučeninou vzorce VI, ve které je skupina zúčastňující se reakce přítomna v aktivované formě.

Acyl-ace sloučeniny vzorce VI · nebo reaktivního derivátu této sloučeniny · sloučeninou vzorce V nebo reaktivním derivátem kyseliny této sloučeniny, se může provádět o sobě známým způsobem, přičemž reakční podmínky závisí především na druhu použitého acylačního činidla, obvykle v přítomnosti vhodného rozpouštědla nebo ředidla nebo směsi takových rozpouštědel nebo ředidel a · popřípadě v přítomnosti kondenzačního činidla, například při použití anhydridu jako acylačního činidla, popřípadě jako činidla vázajícího kyselinu, za chlazení nebo za zahřívání, například v rozsahu teplot asi od —30 do· -(-150 °C v uzavřené reakční nádobě a/nebo v atmosféře inertního· plynu, například dusíku.

Kyselá skupina fosforečné kyseliny může být chráněna v esterifikované formě, přičemž jako esterifikující zbytky jsou výhodné takové zbytky, které se mohou regioselektivně odštěpit, například methylesterová skupina, která se může odštěpit například alkalickým zmýdelněním, nebo zejména hydrogenolytlcky odštěpitelné skupiny, například benzylesterové skupiny nebo fenylesterové skupiny, přičemž benzylesterové skupiny se mohou odštěpit například v pří tomnosti paládiových katalyzátorů, jako paládia na uhlí a fenylesterové skupiny se mohou odštěpit například v přítomnosti platinových katalyzátorů nebo smíšených katalyzátorů obsahujících platinu a paládium.

Dvojvaznými chránícími skupinami hydroxyskupiny jsou zejména popřípadě substituované alkylidenové nebo cykloalkylidenové skupiny. Alkylidenovou skupinou je v nich zejména nižší alkylidenová skupina a cykloalkylidenovou skupinou je především cyklopentylidenová nebo cyklohexylidenová skupina. Jako substituenty alkylidenových zbytků nutno uvést zejména aromatické zbytky, například fenylové zbytky.

Odštěpení chránících skupin uvedených v popisu vynálezu se daří o sobě známým způsobem solvolýzou, zejména hydrolýzou, alkoholýzou nebo· acidolýzou, nebo v některých případech také opatrnou redukcí, popřípadě postupně nebo současně. Silylové chránící skupiny se odštěpují výhodně působením fluoridů, například působením tetraethylamoniumfluoridu.

Odštěpování shora uvedených dvojvazných chránících skupin hydroxyskupiny se provádí například zředěnou kyselinou, nejlépe při pH 2 až 4, například při pH 3, o sobě známým způsobem, například pomocí kyselého iontoměniče, · zejména iontoměniče se zbytky sulfonové kyseliny, jako je Amberlite IR-120 (styrenová pryskyřice se silně kyselými sulfoskupinami) nebo Dowex 50 (polystyrensulfonové kyseliny] nebo působením silné anorganické nebo· organické · kyseliny, jako chlorovodíkové kyseliny, bromovodíkové kyseliny, sírové kyseliny nebo sulfonové kyseliny, například methansulfonové kyseliny, nebo působením fenylsulfonové kyseliny, která je popřípadě substituována v aromatickém kruhu, jako p-toluensulfonové kyseliny, nebo trifluoroctové kyseliny.

Výchozí látky potřebné k provádění shora uvedeného postupu jsou známé nebo se mohou vyrábět o sobě známými postupy, například analogicky podle shora uvedeného postupu.

Soli sloučenin vzorce I vznikají většinou již při zpracování, například při dialýze proti roztoku pufru o· pH 7. Tyto soli se mohou vyrábět o sobě známým způsobem. Tak lze vyrábět soli sloučenin vzorce I, například reakcí se sloučeninami kovů, jako· se solemi vhodných organických karboxylových kyselin s alkalickým kovem, například se sodnou solí α-ethylkapronové kyseliny, nebo s anorganickými sloučeninami alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, jako jsou odpovídající hydroxidy, uhličitany nebo hydrogenuhličitany, jako je hydroxid, uhličitan nebo hydrogenuhličitan sodný nebo draselný, nebo s příslušnými sloučeninami vápníku nebo s amoniakem nebo s vhodnými organickými aminy, přičemž se používá výhodně stechiometrických množství nebo malého nadbytku solitvorného činidla.

Směs isomerů se mohou dělit -o sobě známým způsobem, například trakční krysíalizací, chromatografií atd. na jednotlivé isomery, racemáty, například za vzniku derivátů s opticky aktivními sloučeninami a dělením takto získaných směsi diastereomerů - na ripctckv aktivní antipody.

Shora popsané postupy, včetně postupů k odštěpení chránících skupin a přídavná . opatření těchto postnjsů se provádějí -o sobě známým způsobem, například v přítomnosti nebo - v nepřítomnosti rozpouštědel a ředidel, a pokud je to nutné, v přítomnosti kondenzačních činidel nebo katalyzátorů, při snížené nebo zvýšené teplotě, například v rozsahu teplot asi - od. --20 do 150 C, v uzavřené nádobě a/nebo v atmosféře inertního plynu, například v atmosféře dusíku.

Přitom se s přihlédnutím ke všem substituentům nacházejících se v molekule pracuje, pokud je to potřebné, například za přítomnosti snadno hydrolýzovatelných zbytků, zejména za - šetrných - reakčních podmínek, jako- jsou krátké reakční doby, za použití mírně kyselých nebo bazických činidel v - nízkých koncentracích, za použití stechiometrických vzájemných poměrů a stejně tak se přihlíží k volbě vhodných katalyzátorů, rozpouštědel, podmínek teplotních - a/nebo tlakových.

Vynález se týká také těch provedení postupu, - při kterých se jako výchozí látky používá sloučeniny, která byla získána jako meziprodukt na libovolném stupni postupu a provedou se chybějící stupně postupu nebo se postup na libovolném stupni přeruší nebo se výchozí látka tvoří za reakčních podmínek nebo se používá ve formě reaktivního derivátu nebo soli. Přitom se vychází výhodně z takových výchozích - látek, které postupem podle vynálezu poskytují sloučeniny, které byly shora označeny jako zvláště cenné.

Vynález se rovněž týká farmaceutických přípravků, které obsahují farmakologicky účinné množství účinné látky, popřípadě společně s farmaceuticky použitelnými nosnými látkami, které jsou vhodné pro enterální, například orální nebo rektální, nebo parenterální -aplikaci a které mohou být anorganického nebo organického původu v pevném nebo kapalném stavu.

Tak se používá tablet nebo želatinových kapslí, které -obsahují účinnou látku společně s ředidly, například s laktózou, dextrózou, sacharózou, mannitem, sorbitem, celulózou a/nebo glycerinem, a/nebo lubrikačními látkami, jako je například křemelina, mastek, stearová kyselina nebo jejich soli, jako je horečnatá nebo vápenatá sůl stearové kyseliny, a/nebo- s polyethylenglykolem.

Tablety mohou rovněž obsahovat pojidla, například křemičitan hořečnato-hlinitý, škroby, jako je kukuřičný škrob, pšeničný škrob nebo rýžový škrob, želatinu, methylprostředky, emulgátory, regulaci oscelulózu, natriumkarboxymethylcelulózu a/nebo polyvlnylpyrrolidon a popřípadě látky umožňující - rozpad, jako- jsou například škroby, agar, kyselina alginová nebo její sůl, jako· alginát sodný a/nebo šumivé směsi, nebo -adsorpční prostředky, barviva, chuťové přísady a sladidla.

Dále je možné používat farmakologicky účinné sloučeniny, vyráběné podle vynálezu ve formě parenterálně - aplikovatelných - přípravků nebo ve formě infusních roztoků. Takovými roztoky jsou výhodně isotonické vodné roztoky nebo suspenze, přičemž tyto přípravky se mohou vyrábět před upotřebením, jako je tomu například v případe lyofilisovaných přípravků, které -obsahují účinnou látku samotnou nebo společně s nosnou látkou, například s mannitem.

Farmaceutické přípravky se · mohou -sterilovat a/nebo mohou -obsahovat pomocné látky, -například konzervační stabilizátory, smáčedla a/nebo pomocná rozpouštědla, -soli k motického tlaku a/nebo- pufry.

Uvedené farmaceutické přípravky, které, pokud - je to žádoucí, mohou obsahovat další - farmakologicky účinné látky, jako antibiotika, - se vyrábějí -o- sobě známým způsobem, například běžnými mísícími, granulačními, dražovacími, rozpouštěcími nebo - lyofilizačními -postupy a obsahují - asi 0,001 - až 99 °/o, zejména 0,01 až 10 %, - především. . 0,1 až -5 % účinné látky, popřípadě účinných látek, přičemž koncentrace účinné látky pod 1 % je vhodná zejména pro přípravky, které se aplikují místně.

Pro - profylaxi a terapii - virových infekcí jsou zvláště vhodné následující místně aplikovatelné aplikační formy:

krémy, masti - nebo pasty s -obsahem účinné - látky od 0,001 až - do - 1 %, zejména - -0,01 až 0,1 %, například 0,05 %, například masti- k - intranasální aplikaci nebo rtěnky, nebo- vodné roztoky s obsahem účinné látky 0,001 až 1%, zejména 0,05 až 0,5 - %, - například 0,1 %, výhodně isotonické, - sterilní a fyziologicky použitelné roztoky, například -oční kapky, výhodně v mikronádobkách pro· - jednorázové použití, nebo spreje -k aplikaci v dutině ústní a hltanu.

Zvláště vhodné jsou farmaceutické přípravky popsané v příkladech.

Krémy jsou představovány emulzemi oleje ve vodě, které obsahují více než 50 % vody. Jako· -olejový základ se používá především mastný alkohol, například laurylalkohol, cetylalkohol, nebo· stearylalkohol, mastné kyseliny, například -palmitová kyselina- nebo stearová kyselina, kapalné až pevné vosky, například isopropylmyristát, vosk z ovčí vlny nebo včelí vosk a/nebo uhlovodíky, například vaselina (petrolátum) nebo parafinový olej.

Jako emulgátory přicházejí v úvahu povrchově aktivní látky s převážně hydrofilními vlastnostmi, jako jsou příslušné neiono genní emulgátory, například estery mastných kyselin s polyalkoholy nebo· s jejich adukty s ethylenoxidem, jako· jsou estery mastných kyselin s polyglycerinem nebo estery mastných kyselin polyoxyethylensorbitanu (Tweens), dále polyoxyethylenethery mastných alkoholů nebo polyoxyethylenestery mastných kyselin, nebo odpovídající ionogenní emulgátory, jako jsou soli sulfatovaných mastných alkoholů s alkalickými kovy, například natriumlaurylsulfát, natriumcetylsulfát ' nebo ' natriumstearylsufát, které se používají obvykle v přítomnosti mastných alkoholů, například cetylalkoholu nebo stearylalkoholu.

Přídavky k vodné fázi jsou kromě jiného prostředky, které zabraňují vysychání krémů, například polyalkohol, jako glycerin, sorbit, propylenglykol a/nebo polyethylenglykoly, dále konzervační prostředky, vonné látky, atd.

Mastmi jsou emulze vody v oleji, které obsahují až 70 %, výhodně však asi od 20 do 50 % vody nebo vodné fáze. jako· mastná fáze přicházejí v ' úvahu především uhlovodíky, například vaselina, parafinový olej a/nebo· tvrdý parafin, přičemž mastná fáze obsahuje ke zlepšení schopnosti vázat vodu, výhodně vhodné hydroxysloučeniny, ' jako mastné alkoholy, nebo jejich estery, ' například cetylalkohol nebo alkoholy vosku z ovčí vlny, ipcipřípadě vosk z ovčí vlny.

Emulgátory jsou představovány odpovídajícími lipofilními látkami, jako je ester mastné kyseliny a sorbitaňu ' ' (Spans), 'například sorbitanoleát á/nebo sorbitanisostearát. jako přídavků k vodné ' fázi ' se ' používá například prostředků udržujících vlhkost, jako jsou polyalkoholy, například ' glycerin, propylenglykol, · sorbit a/nebo ' polyěthylenglykol, dále konzervační ·prostředky, ' vonné látky atd.

Masti s mastnou složkou jsou bezvodé a obsahují jako základ zejména uhlovodíky, například parafin, vaselinu a/nebo kapalné parafiny, dále přírodní nebo polosyntetické tuky, například ' triglycerid kyseliny kokosového tuku nebo výhodně ztužené oleje, například hydrogenovaný podzemnicový olej nebo ricinový olej, dále parciální estery glycerinu s mastnými kyselinami, například glycerinmo-nostearát a glycerindistearát, jakož i například v souvislosti s mastmi zmíněné mastné alkoholy, které zvyšují schopnost přijímat vodu, emulgátory a/nebo přísady.

Pasty jsou představovány krémy a mastmi · se složkami pudrů absorbujícími sekrety, jako jsou oxidy kovů, například oxid titaničitý, nebo oxid zinečnatý, dále · mastek a/nebo křemičitany hlinité, které mají za úkol vázat přítomnou vlhkost nebo sekrety.

Pěny se aplikují z tlakových nádob a jsou představovány emulzemi kapalných olejů ve vodě, které jsou přítomné v aerosolové formě, přičemž se jako propelentu používá ha logenovaných uhlovodíků, jako chlorfluor(nižsích)alkanů, například dichlordifluormethanu a dichlortetrafluorethanu.

jako olejové fáze se používá kromě jiného uhlovodíků, například parafinového oleje, mastných alkoholů, například cetylalkoholů, esterů mastných kyselin, například·' isopropylmyristátu a/nebo dalších vosků.

Jako emulgátorů se používá kromě jiného směsí emulgátorů s převážně hydrofilními vlastnostmi, jako jsou polyoxyethylenestery mastné kyseliny a sorbitaňu (Tweens j, a emulgátory · s převážně lipofilními vlastnostmi, jako jsou estery sorbitaňu s mastnými kyselinami (Spans). Navíc se přidávají obvyklé přísady, jako jsou konzervační prostředky atd.

Tinktury a roztoky obsahují většinou vodné ethanolický základ, ke kterému se přidávají kromě jiného polyalkoholy, například glycerin, glykoly a/nebo polýethylenglykol, · jako prostředky udržující vlhkost ke snížení odpařování a látky vracející tuk, jako jsou estery mastné kyseliny s nižšími polyethylenglykoly, tj. ve vodné směsi ' rozpustné, lipofilní látky, jako náhrada za mastné látky, které byly pokožce odejmuty ethanolem, a popřípadě další pomocné látky a přísady.

Pro· výrobu místně použitelných farmaceutických · přípravků se ' postupuje o · sobě známým způsobem, například tak, že · se . . účinná látka rozpustí nebo suspenduje v základové · látce nebo v její části, pokud je to nutné. · Při · aplikaci účinné látky ve formě roztoku se účinná látka zpravidla· · rozpustí před emulgováním v některé z těchto· . dvou fází. ' Při aplikaci ve formě suspenze se ' účinná · látka smísí po emulgaci s částí · základu a potom se přidá zbytek přípravku.

Dávkování účinné látky závisí na různých faktorech, jako je způsob aplikace, ' · 'druh, obranná schopnost organismu a v rozhodující míře povaha ošetřované choroby. Tak se denní aplikované dávky pohybují ' · při ' orální aplikaci teplokrevným o hmotnosti asi 70 kg v rozmezí asi 0,0001 až 0,1 · g, · přičemž se používá dávky méně než 0,001 g především k zabránění · tvorby metastas, · po odstranění primárního nádoru.

К profylaxi virových infekcí se aplikuje jednorázová dávka asi od 0,5 mg do· 50 mg, výhodně 25 až 15 mg, například 7 ' mg, účinné látky teplokrevnému živočichu ' o hmotnosti asi 70 kg, například lidem. Pro potřebu v dobách zvýšeného nebezpečí nákazy opakuje se aplikace této dávky v intervalech 1 až 3 týdnů, například 2 týdnů.

Terapeutická dávka pro teplokrevhé o tělesné hmotnosti asi 70 kg se v případě virové infekce pohybuje v rozmezí 1 ' mg až 50 mg, výhodně 5 až 20 mg, například činí 10 mg, zejména při orální aplikaci. Dávka při intranasáiní aplikaci se snižuje o faktor 10. Při potřebě opakuje se aplikace derivátů hexopyranosy vzorce I v intervalu několika dnů, například 1 až 3 dnů až do začátku zlepšení stavu onemocnění.

Následující příklady vynález blíže ilustrují, aniž by nějakým způsobem omezovaly jeho rozsah. Hodnoty R_f se zjišťují na šilikagelových destičkách pro chromatografii na tenké vrstvě. Poměr rozpouštědel v používané rozpouštědlové směsi je vyjádřen v objemových dílech.

Příklad 1

3,60 g (5,66 mmol) (CJ-n-butylesteru N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny (0,6 mol H2O) a 0,88 g (7,54 mmol) N-hydroxysukcinimidu se rozpustí za míchání ve 20 ml směsi chloroformu a methanolu v poměru 4 : 1. Potom se přidá 1,60 g (7,54 mmol) pevného dicyklohexylkarbodiimidu a během 4 hodin se při teplotě místnosti kontinuálně přikapává roztok 3,7 g (4,72 mmol) sodné soli L-alanin-2-(l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy )ethylamidu ve 40 ml chloroformu. Po další hodině se reakční roztok silně zahustí na rotační odparce, přidá se 200 ml dioxanu a provede se lyofilizace.

Surový .produkt se suspenduje ve 100 ml chloroformu, přidá se 600 ml ethylacetátu a vše se míchá po dobu 1 hodiny na ledové lázni. Nerozpustná dicyklohexylmočovina se odfiltruje a filtrát se odpaří к suchu. Zbytek se čistí na 700 g silikagelu (velikost částic 0,210 až 0,062 mm) na sloupci o průměru 4,5 cm a výšce 80 cm za použití rozpouštědlového systému tvořeného směsí chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5. Za tím účelem se látka rozpustí ve 14 ml rozpouštědlové směsi a v tomto stavu se přenese na sloupec. Po přední frakci (dvakrát 500 ml směsi) se odebírají frakce po 10 ml.

Produkt obsažený ve frakcích 133 až 152 a 153 až 236 se vždy shromáždí a odděleně se podrobí dialyzační filtraci. V případě hlavní frakce se postupuje následujícím způsobem: produkt se rozpustí ve 300 ml dvojnásobně destilované vody, roztok se zahřeje krátce na 40 °C a po ochlazení se nerozpustná dicyklohexylmočovina odstraní odstředěním. Zbytek se přenese do dialyzačního filtru (ultrafiltr PM 10/76 mm 0, inertní nei-onogenní polymery na bázi polysulfonu, střední velikost pórů 10 X 10¹⁰ m) a při tlaku 0,4 MPa se provádí dialýza proti 1,5 litru dvojnásobně destilované vody, 0,5 litru směsi fosfátového pufru a chloridu sodného (vždy 0,1 M, poměr 1 : 1, pH = 7) a 1,5 litru vody až do stavu, kdy nejsou přítomny chloridové ionty.

Vnitřní dialysát (70 ml) se sterilně filtruje miliporesním filtrem (0,2 μπι) a poté se lyofilizuje. Získá se sodná sůl N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (C_a)-n-butylester- (C_y) -L-alanin-2- (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyf osforyloxy) ethylamidu (3,4 mol H2O) ve formě bezbarvého prášku.

[+d²⁰ - +14 + Г (c = 0,44, voda).

R_ř = 0,37 (směs chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5) a

R_ř — 0,64 (směs ethylacetátu, n-butanolu, pyridinu, -octové kyseliny a vody v poměru 42 : 21 : 21 : 6 : 10).

Analýza pro

C63Hii502oN5PNa . 3,41 H2O (1 381,63):

vypočteno:

54,77 % C, 8,94 % H, 5,07 % N, 2,24 % P,

4,71 % H2O;

nalezeno:

54,3 % C, 9,1 % H, 5,6 % N, 2,3 % P,

4,7 % H2O.

Analýza pro

C63Hii5O20N5PNa (1316,59):

vypočteno:

1,75 % Na; nalezeno:

1,57 % Na.

Výchozí látka se připraví následujícím způsobem:

5,5 g (8,1 mmol) (C_a)-n-butyl-(C_Y)benzylesteru 4,6-0-isopropyliden-N-acetylmura- mvl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny, který je rozpuštěn v 60 ml 60% octové kyseliny, se nechá v klidu přes noc při teplotě místnosti. Slabě nažloutlý roztok se zahustí na rotační odparce při teplotě 30^э C asi na polovinu původního objemu, přidá se 300 ml dioxanu a provede se lyofilizace; 4,8 g (asi

7,5 mmol) surového produktu, který je rozpuštěn ve 100 ml směsi dimethoxyethanu a vody v poměru 9:1, se smísí s 0,8 g 10% oxidu paládia na uhlí jako katalyzátoru a po dobu 4 hodin se působí vodíkem.

Katalyzátor se odfiltruje, filtrát se odpaří к suchu a zbytek se podrobí dvojnásobné chromatografii na silikagelu 60 (1:200, frakce 10 a 5 ml) v rozpouštědlovém systému tvořeném směsí chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5. Frakce obsahující produkt se spojí a rozpouštědlo se odpaří.

Surový produkt, který je částečně přítomen ve formě sodné soli (ze silikagelu) se rozpustí ve 40 ml dvakrát destilované vody a promývá se přes 50 ml dobře předem vyčištěného, silně kyselého iontoměniče (DOWEX 50 W X8, 0,297 až 0,149 mm, H-forma) celkem 100 ml dvojnásobné destilované vody. Eluát se filtruje přes miliporesní filtr (0,2 ^m] a filtrát se lyofilizuje. Získá se

3,7 g (C_a)-n-butylesteru N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny (69 % teorie) ve formě bezbarvého prášku, který obsahuje 0,6 mol vody.

[«]d²⁰ = +45 +Г (c = 1,142, methanol).

R_f — 0,23 (směs chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5) a

R_f — 0,40 (směs n-butanolu, octové kyseliny a vody v poměru 75 : 7,5 : 21).

Výchozí látka se získá následujícím způsobem:

4,4 g (11 mmol) sodné soli N-acetyl-4,6-O-isopropylidenmuramové kyseliny (2,5 mmol/g) se suspenduje v 60 ml absolutního dimethylformamidu. Za dobrého míchání se postupně přidá 4,4 g (11 mmol) hydrochloridu (C_a)-n-butylester-(C_Y)-benzylesteru-L-alanyl-D-glutamové kyseliny, 2,53 g (22 mmol) N-hydroxysukcinimidu a konečně

2,5 g (12,1 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu a směs se míchá přes noc při teplotě místnosti.

Za účelem zpracování se suspenze zředí 100 ml ethylacetátu a po půlhodinovém míchání při teplotě 0 °C se nerozpuštěný podíl (dicyklohexylmočovina, chlorid sodný) odfiltruje. Filtrát se odpaří ve vysokém vakuu při 30 ^ÓC, zbytek se vyjme 400 ml ethylacetátu a desetkrát se extrahuje vždy 50 ml dvakrát destilované vody. Po vysušení organické fáze a po odpaření rozpouštědla zbude 5,6 g (C_u)-n-butylester-(C_Y)-benzylesteru N-acetyl-4,6-O-isopropyliden-L-alanyl-D-glutamové kyseliny ve formě amorfního prášku.

[_α]_Ω2θ ₌ φ_{3Ο (c = 0732}, _methanol).

R_f = 0,87 (směs chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5) a

R_f = 0,83 (směs n-butanolu, octové kyseliny a vody v poměru 75 : 7,5 : 21).

Výchozí látka se vyrobí následujícím způsobem:

К 5,6 g (12,1 mmol) (C_a)-n-butylester- (C_Y) -benzylesteru N-terc.butyloxykarbonyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny, který je rozpuštěn ve 20 ml absolutního ethylacetátu, se za dobrého míchání a za vyloučení vlhkosti přikape 50 ml 4,5 N roztoku chlorovodíkové kyseliny v absolutním ethylacetátu a směs se nechá v klidu 1 hodinu při 0 °C. Nažloutlý roztok se při teplotě místnosti zahustí na objem asi 20 ml, přidá se 150 ml dioxanu a provede se lyofilizace. Získá se

4,75 g (97 % teorie) hydrochloridu (CJ-n-butylester- (C_Y) -benzylesteru L-alany 1-D-

-glutamové kyseliny ve formě bezbarvého oleje.

[α]υ²⁰ - H-19 +1° (c = 0,313, methanol).

Rř = 0,58 (směs chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 :5) a

Rř = 0,56 (směs ethylacetátu, n-butanolu, pyridinu a vody v poměru 42 : 21 : 6 : 10).

Výchozí látka se připraví následujícím způsobem:

К 8,5 g (25,8 mmol) hydrochloridu (CJ-n-butylesteru- (C_Y)-benzylesteru D-glutamové kyseliny a 7,4 g (25,8 mmol) N-hydroxysukcinimidesteru N-terc.butyloxykarbonyl-L-alaninu, který je rozpuštěn ve 150 ml absolutního dimethylformamidu, se přidá

2,6 g [25,8 mmol) N-methylmorfolinu a směs se nechá v klidu 20 hodin při teplotě místnosti. Čirý, žlutý roztok se odpaří ve vysokém vakuu při teplotě 30 °C polopevný zbytek se vyjme 500 ml ethylacetátu a sedmkrát se extrahuje vždy 50 ml vody. Organická fáze se vysuší bezvodým síranem sodným. Zbytek získaný po odpaření ethylacetátu se čistí chromatografií na 600 g silikagelu (silikagel 60, velikost částic 0,210 až 0,062 mm) za použití rozpouštědlového systému tvořeného směsí chloroformu a methanolu v poměru 98 : 2. Produkt obsažený ve frakcích 36 až 82 se spojí a vysuší se. Získá se {C„) -n-butylester (C_Y) -benzylester N-terc.butyloxykarbonyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny ve formě bezbarvého oleje.

[orlu²⁰ = -I- 7 + 1= (c = 0,315, dimethylformamid).

R_ř - 0,73 (směs chloroformu, isopropylalkoholu a octové kyseliny v poměru 70 : 8 : 2) a

Rf = 0,75 (směs n-butanolu, octové kyseliny a vody v poměru 75 : 7,5 : 21).

Výchozí látka se vyrobí následujícím způsobem:

К 11,0 g (CcJ-n-butylester-fCJbenzylesteru N-terc.butyloxykarbonyl-D-glutamové kyseliny, který je rozpuštěn ve 25 ml absolutního ethylacetátu, se přidá za chlazení a za míchání a za vyloučení vlhkosti 25 ml 4N roztoku chlorovodíkové kyseliny v absolutním ethylacetátu a směs se ponechá v klidu 1 hodinu. Snadno těkavé podíly se odpaří při teplotě 25 °C, olejovitý zbytek se vyjme 150 ml absolutního diethyletheru a posléze uvedený diethylether se znovu odpaří, přičemž tato operace se provádí třikrát. Olejovitý zbytek se vysuší za středního vakua pomocí natronového asbestu. Získá se hydrochlorid (C_a)-n-butylester- (C_Y)benzylesteru D-glutamové kyseliny.

[a]n²⁰ = — 9 ± Г (c = 0,646, methanol).

Rí = 0,82 (směs chloroformu, methanolu a vody 70 : 30 : 5) a

Rř = 0,68 (směs ethylacetátu, n-butanolu, pyridinu, octové kyseliny a vody v poměru 42 : 21 : 21 : 6 : 10).

Výchozí látka se vyrobí následujícím způsobem:

20,0 g (64,6 mmol) (CJbenzylesteru N-terc.butyloxykarbonyl-D-glutamové kyselí25 ny se rozpustí v 750 ml absolutního tetrahydrofuranu, přlkape se roztok 21,05 gramu (64,6 mmol) uhličitanu česného v 80 ml vody a směs se odpaří ve vakuu vodní vývěvy k suchu. ' Zbytek se vyjme 200 ml absolutního dimethylformamidu, rozpouštědlo se odpaří a tato operace se opakuje. Krystalický zbytek získaný po vysušení ve vysokém vakuu se rozpustí v 1 litru absolutního dimethylformamidu a za míchání se k tomuto roztoku přikape 13,3 g (97 mmol) · n-butylbromidu. Suspenze Vzniklá po 18 hodinách míchání při teplotě místnosti se zfiltruje, ' filtrát se zahustí na pblovinu původního· objemu a. · po přidání 1 litru ethylacetátu se extrahuje desetkrát vždy 100 ml vody. Organická fáze se vysuší síranem sodným a •odpaří se. Olejovitý zbytek se vyjme 100 ml diethyletheru a přidáním 1800 ml petroletheru a stáním při teplotě —10 °C se přivede ke krystalizací. Krystalická hmota se odfiltruje, · promyje se a vysuší. Získá se (C,)-n-butylester-(Ó_Y)be;nzylester N-terc.butyloxykarbonyl-D-glutamové kyseliny ve^ formě bezbarvých jehlic o teplotě tání 70 až 71 °C.

[a] o20 — · 20 + 1° (c ~ 1,149, methanol).

Rf = 0,77 (směs chloroformu, isopropylalkoholu a · octové kyseliny v poměru 30 · : : 8 : -2) a

Rf = 0j92 (směs ethylacetátu, n-butanolu, pyridinu, octové kyseliny v poměru · 42 : : 21 · : 21 : 6 : 10).

Výroba této látky je již krátce popsána (srov. ·· P.· Lefrancier a E. Lederer, Fortschrittte d. Chem. · org. Naturst. 40, 1 až · 47, str. 13 /1980/).

L-alanin-2- (l,2-dipa.lmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)ethylamid, · který slouží jako · · výchozí látka, · se získá následujícím způsobem:

13,25 g · (14,9 mmol) N-terc.buttyloxykarbonyl-L-:ala.nin-2-(l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy) ethylamidu se za míchání vnese do 170 ml směsi trifluoroctové kyseliny a methylenchloridu v poměru 1 : 3 (obj./obj.), -ochlazené na 0 °C, přičemž vznikne čirý roztok. Po ¥2 hodinovém stání při teplotě místnosti se reakční roztok odpaří při 30 °C na rotační odparce. K polopevnému zbytku se za účelem odstranění nadbytečné· trifluoroctové kyseliny přidá několikrát vždy 100 ml methylenchloridu a methylenchlorid se vždy -odpaří. Po pětinásobném roztírání zbytku vždy se 100 ml absolutního diethyletheru a po- oddekantování se získá · dobře filtrovatelná suspenze. Tato· suspenze -se zfiltruje, pevný produkt se promyje nejdříve diethyletherem, potom dvakrát vždy · 100 ml horkého acetonu a vysuší se ve vakuu vodní vývěvy při teplotě 60 až 70 °-C. · Získá se 10,9 g L-alanin-2-(l,2-dipalmitoyl-sn-gly cero-3-hydr oxyf osforyloxy) ethylamidu ve formě bezbarvých krystalů o teplotě tání 138 až 147 °C.

[aln²⁰ = + 30° + 1° (_C = · 1 směs chloroformu, methanolu a vody v poměru 70· : :30:5).

Rf

Rf = · 0,14 (směs· chloroformu · a methanolu v poměru 7 : 3) a = 0,40 · (směs · chloroformu, methanolu a vody v poměru · 70 : 30 : 5).

Takto získaný produkt se převede na sodnou sůl následujícím způsobem:

3,82 g (5 mmol) L-alanin-2-(l,2-dipalmitoyl-sn-glycero.-3-hydroxyf osf oryloxy) ethylamidu se rozpustí ve 100 ml směsi chloroformu a methanolu (7:3) krátkým zahřátím na 35 °C. Roztok se ochladí a opatrně se k němu přidá 5 ml IN roztoku hydroxidu sodného. Čirý roztok se zahustí asi na 1/3 původního objemu a po přidání 200 ml dioxanu se lyofilizuje. Získá se sodná sůl L-alanin-2- (l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy) ethylamidu ve formě kyprého prášku.

Příklad 2

Analogickým postupem · jako je popsán v příkladu 1 se získají sloučeniny uváděné · v příkladech 3 až 10, jakož i následující sloučeniny:

sodná sůl N-acetylmuramyl-N-methyl-L-alanyl-D-glutamyl-(C_α))ethylester-(Cγ )-L-alanin-2- (l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydr oxyf osforyloxy) ethylamidu, sodná · sůl N-acetyldesmethylmuramyb-L-alanyl-D-glutamyll(Ce)-methylester-(CY)’ -L-alamn-2- (l,2-dipalmitoyl-sn-glycerO'-3-hydroxyf osf oryloxy) ethylamidu, sodná · sůl · N-acetylmuramyl-L-se.ryLD-glutamyl- ( Ck ) · -n-butyles.ter- ( Cy ) -L-alanin-2- [l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydro.xy·’ f osforyloxy) ethylamidu, sodná sůl N-acetylmuramyi-L-cysteinyl-D-glutamyl- (Ca) -n-butylester- ( Cy ) -L-alanin-2- (l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosf oryloxy) ethylamidu, sodná sůl N-acetylmuramyl-L-methionyl-D-glutamyl- (Ca) -n-butylester- ( Cy ) -L-alanin-2- [ l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy) ethylamidu, sodná sůl N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (Ca) -n-butylester- ( Cy ) -L-alanin-2-dimyristoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy) ethylamidu,

sodná sůl N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (Ca ) -n-butylester- (C_Y ] -L-alanm^-

- (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-hydroxyf os- . foryloxy) ethylamidu, sodná sůl N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (C„) -n-butylester- (C_Y) -L-alanin-2-

- (l,2-dioleoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosfo- ryloxy) ethylamidu, .....

sodná sůl N-benzoylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (C_a) -n-butylester- (CJ -L-alanin-2- (l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy) ethylamidu, sodná sůl N-glykolmuramyl-L-alanyl-D-glu- tamyl- (C_a) -n-butylester- (C_Y) -L-alanin-2-

- (l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosf-oryloxy)ethylamidu a sodná sůl N-acetyl-l,4,6O-triacetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (C_a) -n-butyletster-

- (C_Y) -L-alanin-2- (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyf osf oryloxy) ethylamidu.

Příklad 3

Oční kapky

Složení:

sodná sůl N-acetylmuranyl-L-a-aminobutyryl-D-glutamyl- (Ca) ln-butyles-terl { Cy)-L-alanimž- (1,2-dipalmitoyllsn-glycer0l3-hydroxyf osforyloxy) ethylamidu -.....

sloučenina (II) 0,10mg kyselina boritá 30,00mg tetraboritan sodný......

(10 H2O) 0,10mg benzalkoniumohlorid 0,20mg voda pro·, injekce do 1,0ml

Výroba

V jedné části shora -uvedeného množství vody . pro injekční -účely se za aseptických podmínek a za míchání rozpustí kyselina boritá, tetraboritan sodný -a benzalkoniumchlorid při teplotě místnosti. Potom se . v takto získaném roztoku rozpustí sloučenina II a roztok se doplní vodou pro injekční účely na konečný -objem 1,0 ml.

Tento roztok nebo jeho část nebo několikanásobné množství se filtruje přes membránový filtr a plní . se do čistých nádobek. Vhodnými nádobkami jsou například:

nádobka z pružné plastické hmoty (o objemu 5 ml nebo 10 ml) s kapátkem, nádobka ze skla (o objemu 5 ml nebo 10 mililitrů) s kapací pipetou ze skla nebo z plastické hmoty a elastickým nástavcem na pipetu nebo jednorázová dózovací pipeta z . , . plastické hmoty (o obsahu 1 až 2 kapek).

Příkladě

Nevodná jednotlivá dávka pro nasální aplikaci

Složení:

sodná sůl N-propionyl- desmethylmurainyl-L-alanyl· lD-glutamyl-(Cc)-nlbutyll ester-(Cγ)lL-alaninl2-(1,2l ·

-dipalmitoyl-snlglycero-3-hydroxyfosforyloxy)ethylamidu (sloučenina (III) 0,03 mg miglyol 812 do . 30,00 mg

Výroba

0,3 mg sloučeniny III se za aseptických podmínek rozpustí v 29,97 mg miglyolu 812.

Tento roztok se plní pomocí aplikačního přístroje pro jednorázovou nasální aplikaci, který je běžný na trhu, například podle amerického patentu č. 3 737'951, a který se před použitím nasadí na nádobku s'^; propelantem.

Nosní kapky

Složení: I II sodná sůl N-acetylmuramyl-L-valy l-D-glurttamyl- (Ca ) -n-butylester- (C_Y)-L^alanin-2- (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxytost or y loxy J ethylamidu

(sloučenina IV)	0,15	mg	0,10	mg
thiomersal	0,02	mg	—
natriummonohydrogen-
to-sfát. H2O	0,30	mg	0,30	mg
natriumdihydrogen-
tostát . 12 H2O	10,10	mg	10,10	mg
benzalkoniumchlorid	—		0,10	mg
dvojsodná sůl ethylendiamín-
tetraoctové kyseliny	0,50	mg	0,50	mg
chlorid sodný	3,70	mg	4.50	mg
demineralizovaná voda	988,30	mg	987,00	mg
hodnota pH	5,0- + 0,3	5,0 -1“	0,3
snížení teploty mrazu At	—0,51	°C	—0,56	°C

Výroba

V jedné části shora uvedeného množství demineralizované- vody se za míchání rozpustí natriumdihydrogentostát, dinatriumhydrogentostát, chlorid sodný, thiomersal a dvojsodná sůl ethylendia.mintetraoctové kyseliny při teplotě místnosti.

V tomto roztoku se potom rozpustí sloučenina IV a zbylou demineralizovanou vodou se roztok doplní na konečný objem.

Tento roztok nebo jeho část nebo jeho několikanásobek se filtruje přes membránový tiltr a plní se do čistých nádobek. Vhodnými nádobkami jsou například

a) nádobka ze skla nebo z plastické - hmoty (o objemu 5 ml nebo 10 ml), která je opatřena pipetou ze skla nebo z plastické hmoty s elastickým nástavcem pipety upraveným k nasávání

b) mačkací lahvičky z plastické hmoty s trubicí a rozstřikovací hlavou z plastické hmoty

c) nádobky z plastické hmoty pro jednotlivou dávku (obsah 2 až 3 kapky) nebo

d) lahvičky ze skla nebo z plastické hmoty opatřené normovaným mechanickým rozprašovačem z plastické hmoty (bez hnacího plynu).

Příklad 6

Gel

Složení:

sodná sůl N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (Ca) -n-butylester- (C_Y) -L-alanin-2- (1,2-dilaur oyl-sn-gly cer o-3-hydroxytostoryloxy) ethylamidu (sloučenina V) 0,01 g glycerin 85 %- ΙΟ,ΌΟ-g methylparaben 0,12g propylparaben 0,03-g natriumkarboxymethylcelulosa (vysoká viskosita) 2,50. g demineralizovaná voda 88,34 - g

Výroba

Methyl- a propylparaben se rozpustí - v 1 dílu horké demineralizované vody. Potom se do získaného .roztoku za intenzivního míchání přidá natriumkarboxymethylcelulosa. Získaný slizovitý produkt se nechá za míchání nabotnat. Po ochlazení se přidá glycerin - ' ' a roztok účinné látky (sloučenina V) ve - zbytku vody.

Příklad 7

Krém

Složení:

sodná sůl N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (Ca) -n-butylester- (C_Y) -L-alanin-2- (l-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-hydroxytost oryloxy) ethylamidu (sloučenina VI) 0,10g sorbitanmonostearát 0,60-g cetylalkohol 3,00g isopropylpalmitát 2,00g methylparaben 0,12g vlskosní parafinový olej 10,00g

PEG (20) -sorbitanmonostearát 4,40g propylparaben 0,03g

70% roztok krystalického sorbitu v demineralizované vodě 6,00g stearová kyselina 9,00g demineralizovaná voda 64,67g

Výroba

Mastná fáze sestávající z sorbitanmonostearátu, cetylalkoholu, stearové kyseliny, PEG . (20)-so'rbltanmonostearátu, isopropylpalmitátu a parafinového oleje se roztaví. Potom se v jednom dílu horké demineralizované vody rozpustí methyl- a propylparaben. K vodné fázi se přidá roztok sorbitu. Asi při 75 °C se potom za míchání přidá vodná fáze k mastné fázi. Krémový základ se potom nechá za míchání vychladnout. Asi při 40 '°C se ve zbytku vody přidá ke krémovému základu roztok účinné látky (sloučenina VI).

Příklad 8

Nosní mast

Složení: sodná sůl N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (Ca) -methylester- (C,)-L-alanin-2- (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxý-

ethylamidu (sloučenina Vll)	0,03
viskosní parafinový olej	20,00'
bílá . vaselina	30,00
tuk z ovčí vlny, bezvodý	40,00
demineralizovaná voda	19,97
Výroba

M-astná · fáze, sestávající z parafinového oleje, vasellny - a tuku z ovčí vlny, se roztaví.. Do mastné fáze se při teplotě asi 50 °C zapracuje vodný roztok účinné látky.

Příklad 9

Mast na pokožku Složení:
sodná sůl N-propionyldesmethylmur^m^yl-L-alanyl-D-glutamyl- (C„) -n-butylester- (CY) -glycin-2- (1,2-dipalmitoyl-sn-clycero-3-hydroxyf osforyloxy ) ethylamldu (sloučenina Vili)	0,25	g
sorbitanseskvioleát	10,00	g
bílý včelí vosk	5,00	g
cetylalkohol	2,50	g
methylparaben	0,15	g
viskosní parafinový olej	20,00	g
propylparaben	0,02	g
stearylalkohol	2,50	g
bílá vaselina	40,00	g
demineralizovaná voda	19,58	g
Výroba

Mastná fáze, která sestává z sorbitanseskvioleátu, bílého včelího. vosku, cetylalko holu, parafinového oleje, stearylalkoholu a bílé vaseliny, se roztaví. Potom se v hlavním množství vody rozpustí za horka methyl- a propylparaben. Při teplotě asi 80 °C se vodná fáze zapracuje do mastné fáze. Při teplotě asi 40 °C se do takto získaného masťového základu přidá roztok . účinné látky (sloučenina Vlll) ve zbývajícím množství vody.

Příklad 10

Rtěnka

Složení:

sodná sůl N-acetylmuramyl-N-methyl-L-alanyl-D-glutamyl- (C_K) -n-butylester- (C_Y ) -L-alanin-2- (l,2-dlpalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfo.sforyloxy) ethylamidu (sloučenina IX) 1,00 g polyethylenglykol se ' střední molekulovou hmotností 400 15,00 g polyethylenglykol se střední molekulovou hmotností 1 000 83,00 g polyethylenglykol se střední molekulovou hmotností 4 000 1,00 g

Výroba

Účinná . látka se jemně rozptýlí v tavenině polyethylenglykolů. Viskosní tavenina se potom lije do vhodných forem pro rtěnky a nechá se ztuhnout.

Příklad 11

3,50 g (6,9 mmol] (CJ-methylesteru N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny a . 1,20 g N-hydroxysukcinimidu se rozpustí v 50 ml směsi dimethylformamidu, isopropylalkoholu a chloroformu (1:3:6, objem/objem), přidá se 2,10 g (10,35 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu a za vyloučení vlhkosti se reakční směs míchá 1 hodinu při teplotě místnosti. K suspenzi se přidá 50 ml ethylacetátu, směs se míchá 30 minut na ledové lázni a nerozpustná dicyklohexylmočovina se odfiltruje.

Filtrát se zahustí na rotační -odparce na objem asi 40 ml, aktivovaný ester se - vyloučí přidáním 150 ml absolutního, -diethyletheru (dvakrát), odfiltruje se a vysuší se, načež se získá ester s N-hydroxysukcinlmidem s hodnotou Rf = 0,43 (chloroform : methanol : voda = 70 : 30 : 5).

3,43 g (4,4 mmol) L-alanin-2-(l,2-dipalmltoyl-sn-glycero.-3-hydroxyfosforyloxy) ethylamidu se suspenduje ve 45 ml chloroformu a při teplotě 40 °C se během 5 minut přikape roztok 0,86 (6,1 mmol) triethylaminu v 5 ml chloroformu, přičemž vznikne čirý roztok. . K tomuto roztoku se přikape za dobrého míchání a za vyloučení vlhkosti během 5 minut roztok shora popsaného aktivovaného esteru ve 100 ml směsi sestávající z dimethylformamidu, chloroformu a dioxanu (1:14 : 6; ' obj./obj.). Po 2 % hodině míchání při teplotě místnosti se slabě zakalený roztok odpaří na rotační . odparce (30 °C) k suchu.

Surový produkt se čistí na silikagelu (silikagel 60, čistý, velikost částic · 0,210 . až 0,062 mm) v rozpouštědlovém systému tvořeném směsí chloroformu, methanolu a vody v poměru 70:30:5 (frakce po 5 ml). Frakce obsahující požadovaný produkt (podle chromatografie na tenké vrstvě) se shromažďují. Zbytek, který se získá po odpaření rozpouštědla se rozpustí . ve 250 ml dvojnásobně destilované vody a · čistí se analoglckým způsobem jako v příkladu 1 dialysační filtrací (dialyzátor, ultrafiltr PM ..30/76 mm 0). ·

Roztok zbylý v komůrce se .. filtruje ' . přes miliporesní . filtr (0,2- ^m) a potom se lyofilizuje. Získá se sodná sůl . N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (Ca) -me thy lester- (C y) -L-alamn-2- (l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxyjethylamidu . 2,96 mol H2O ve formě bezbarvého prášku.

[a]D20 = 4-11 + r (c = 0,285, 10% octová kyselina).

Rf = 0,25 (směs chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5) a

Rf = 0,39 (směs .ethylacetátu, n-butanolu, pyridinu, octové kyseliny . a vody v poměru 42 : 21 : 21 : 6 : 10).

Výchozí látka se získá následujícím způsobem:

7,7 g hydrochloridu (CJ -methyl ester- (CJ-benzylesteru L-alanyl-D-glutamové kyseliny (21,2 mmol) a 8,96 g (23,3 mmol) sodné soli N-acetyl-4,6-O-isopropyl.idenmuramové kyseliny se kopuluje analogicky jako je popsáno v příkladu 1 za použití kombinované dicyklohexylkarbodiimidové a N-hydroxysukcinimidové metody. Surový . produkt . se . bez dalšího čištění štěpí ve ' 100 ml 60% octové kyseliny. Po 5 V2 hodinovém míchání při teplotě místnosti se roztok silně zahustí, přidá se k němu voda, znovu se zahustí a po přidání 100 ml dioxanu se lyofilizuje.

Zbytek se čistí na 600 g silikagelu (silikagel 60) za použití směsi chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5 jako elučního činidla (frakce po 7 ml) (dvakrát).

Frakce obsahující žádaný produkt se spojí a rozpouštědlo se odpaří. Zbude (CJ-methylester- (C_Y)-benzylester N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové ·kyseliny ' ve formě bezbarvé pěny.

Rf = 0,63 (směs chloroformu, methanolu . a vody v poměru 70 : 30 : 5).

tlaku. Katalyzátor se odfiltruje a odpaří při teplotě místnosti za tlaku. Zbytek se shora popsaným čistí . na 400 g silikagelu (sillkasystému tvořeném směsí chloro6,0 g (10 mmol) (CaPmethylester^Cy)-benzylesteru N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny, který je rozpuštěn ve směsi 1,2-dimethoxyethanu a vody v poměru 95:5 (obj./obj.) se hydrogenuje v přítomnosti 0,6 g paládia na uhlí (10%) jako katalyzátoru po dobu 1 V2 hodiny při atmosférickém filtrát se sníženého způsobem gel 60) v formu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : : 5 (frakce po 10 ml).

Frakce obsahující ' žádaný produkt se spojí a rozpouštědlo se odpaří. Odparek, částečně ve formě sodné soli, se zbaví soli analogickým postupem jako je popsán v příkladu 1 na 50 ml iontoměniče (DOWEX 50 W X 8, 0,297/0,149 mm, v H + -cyklu, silně kyselý katex). Filtrát se potom filtruje přes miliporesní filtr : (0,45 ,um) a potom se lyofilizuje. Získá se (CJ-methylester N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutanové kyseliny (1,27 mol H2O) . ve formě bezbarvého· prášku.

[ajo²⁰ = -)-47 + 1° (c = 1,249, methanol).

Rf

Rf

Rf = 0,08 (směs chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5), = 0,30 (směs acetonitrilu a vody v poměru 3 :1) a = 0,43 (směs ethylacetátu, octové kyseliny, vody a methanolu v poměru 67 : 10 : : 23 : 12).

Příklad 12

9,4 g (11,1 mmo) . C^_a)-t(rrcb^itylh^íth3ru N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny se analogickým postupem jako je popsán v příkladu 11 převede na aktivní ester a .. potom se analogicky jako je popsáno v příkladu 11, nechá reagovat s 6,48 g (8,2 mmol ] L-alanin-2- (1,2-dipalmitoyl-sn-glyceroi3-hydroxyfosf oryloxyJethylamidu v přítomnosti triethylaminu.

Surový produkt se suspenduje ve 250 ml dvakrát destilované vody a suspenze se krátce zahřeje na 37 °C. Potom se míchá reakční směs 15 minut na ledové lázni, nerozpustná dicyklohexylmočovina. se odfiltruje a filtrát se podrobí dialysační filtraci způsobem popsaným v příkladu 1 (ultrafiltr PM 30/76 mm 0). Roztok zbylý v komůrce (120 ml) se lyofilizuje a produkt se chromatografuje obvyklým způsobem na 550 g silikagelu (silikagel 60). Žádaný materiál se spojí, potom se vyjme 200 ml dvakrát destilované vody [pH — 7), sterilizuje se (filtrací na miliporesním filtru 0,45 «m) a potom se lyofilizuje. Získá se sodná sůl N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (Ca) -terc.butylester-(C_Y)-L-alanm-2-(1,2-dip3alini'Loyl245787

36

-sn-glycero-3-hydroxyfosf oryloxy) ethylamidu ve formě bezbarvého prášku, který obsahuje 3,4 mol vody.

[a]n²⁰ = -|-14 + 1° (c = 0,817; 10% octová kyselina).

Rf - 0,29 (směs chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5) a

Rf - 0,53 (směs· ethylacetátu, n-butanolu, pyridinu, •octové kyseliny a vody v poměru 42 : 21 : 21 : 6 : 10).

Derivát muramyldipeptidu, který je potřebný jako · výchozí látka, se získá analogickým postupem jako je popsán v příkladu 1 reakcí sodné soli N-acetyl-4,6-O-isopropylidenmuramové kyseliny a (C₍J-terc.butylester- (C_Y) -benzylesteru L-alanyl-D-glutamové kyseliny za použití kombinované dicyklohexylkarbodiimidové a N-hydroxysukcinimidové metody.

Po odštěpení isopropylidenového zbytku 60% octovou kyselinou a po •odstranění benzylového zbytku katalytickou hydrogenací analogicky jako v příkladu 1 se získá [Caj-terc.butylester N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny ve formě bezbarvého prášku.

[ajn²0 = +-44 + 1° (c = 1,004, methanol).

Rf = 0,20 (směs chloroformu, methanolu a vody v poměru 70· : 30 : 5) a

Rf = 0,41 (směs acetonitrilu a vody v poměru 3:1).

Derivát dipeptidu, který je potřebný jako výchozí látka, se získá následujícím způsobem:

38,3 g (63,5 mmol) (CJ-terc.butylester- ( Cy ) -benzylesteru N- [ 2- (4-bif eny lyl) propyloxykarbony 1 ] -L-alanyl-D-glutamové kyseliny se rozpustí v 700 ml směsi trifluorethanolu a vody v poměru 9 : 1 (obj./obj.) a ve stejné směsi rozpouštědel se přikape 1,23 N chlorovodíková kyselina 1 objemový díl koncentrované chlorovodíkové kyseliny a 9 objemových dílů trifluorethanolu), čímž se hodnota pH sníží na 1,5 (2,5 hodiny, spotřeba 51,66 ml, tj. 81 % teorie).

Slabě nažloutlý roztok se zahustí na rotační odparce ve vakuu vodní vývěvy při teplo-tě 30 °C na objem 100 ml, · přidá se 200 mililitrů dioxanu a směs se vysuší vymrazením. Polopevný zbytek se vyjme 30 ml absolutního· diethyletheru a při teplotě 0 až 5 °C se produkt vysráží přidáním 150 ml petroletheru. Směs se nechá stát v chladu (—20 °C), · produkt se · oddekantuje a tento postup se opakuje ještě dvakrát. Olejovitý zbytek se konečně vyjme 100 ml terc.butanolu, roztok se lyofilizuje a zbytek se vysuší ve vysokém vakuu použitím natronového asbestu.

Získá se · ·hydrochlorid · ·(C_a)-terc.butylester-(CY.)-benzylesteru L-alanyl-D-glutamové kyseliny ve formě silně hydroskopického· prášku.

[a]D·²⁰ = +7 + 1° (c = 1,630, chloroform).

Rf · - 0,60· (směs chloroformu, methanolu · a vody v poměru 70 : 30 : 5) a

Rf = 0,45 · (směs n-butanolu, octové kyseliny a vody v poměru 10· : 1 · : 2,8).

Chráněná sloučenina se získá následujícím způsobem:

K roztoku 65,96 g (0,2 mol) hydrochloridu (C„) -terc.butylester- ( Cy ) -benzylesteru D-glutamové· kyseliny a 65,47 g · (0,2 mol) N-[2- (4-bif eny ly 1) propyloxykarbony 1 ] -L-alaninu v 650 ml absolutního dimethylformamidu, ochlazeného na 0 °C, se · za míchání přidá 22 ml (0,24 mol) N-methylmorfolinu · a konečně 59,11 g · (0,24 mol) 2-ethoxy-N-ethoxykarbonyl-l,2-dihydrochinolinu. Po lOhodinovém· míchání při teplotě místnosti se žlutý roztok odpaří při · teplotě 30· (C na rotační odparce. Zbytek · se vyjme 1 litrem ethylacetátu, pětkrát se extrahuje· vždy 5 · ml vody, vodná fáze se · pak znovu extrahuje 0,5 litru ethylacetátu a spojené organické fáze se vysuší.

Surový produkt (150 g) vzniklý po· odpaření rozpouštědla se čistí několikanásobnou chromatografií na · silikagelu (silikagel 60) (1 : 20) za použití ethylacetátu jako· elučního činidla. Získá se (C_a)-terč.butylester-(CYj-benzylester N- [ 2- (4-bif enylyl) propyloxykarbonyl].-L-alanyl-D-glutamové kyseliny ve formě bezbarvého oleje.

[a]i?° = —14 + 1° (c = 1,625, ethylacetát).

Rf = 0,73 (směs chloroformu, isopropylalkoholu a octové kyseliny v poměru 79 : :8:2)a

Rf = 0,51 (směs toluenu a ethylacetátu v poměru 1:1).

Hydrochlorid ( C„ ] -terc.buyyleste-· (C_Y) -benzylesteru D-glutamové kyseliny, · který slouží jako· výchozí látka, se získá analogickým způsobem jako je popsán v literatuře (srov. Roeske, J. Org. Chem. 28, 1 251 /1963/) pro L-derivát reakcí (CY)-benzylesteru-D-glutamové kyseliny s · isobutenem ve směsi 1,4-dioxanu a sírové kyseliny ve formě bezbarvých jehlic o teplotě tání 108 až 109 °C.

[a]_Dzo = —16 + 1° · (c = 1,235, ethanol).

Rť = 0,84 (směs chloroformu, methanolu · a vody v poměru 70 : 30 : 5) a

Rf = 0,64 (směs ethylacetátu, n-butanolu, pyridinu, octové kyseliny a vody v poměru 42 : 21 : 21 : 6 : 10).

Příklad 13

K roztoku 4,62 g (6,05 mmol) L-alanin-2-

- (l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyf osf oryloxyj-ethylamidu ve . 100 ml směsi chloroformu, isopropylalkoholU · a vody v poměru 70 : 30 : 2 se za míchání při teplotě 15 °C přikape během 10 minut 14,52 ml (7,26 mmol) 0,5 M roztoku triethylaminu ve směsi chloroformu, isopropylalkoholu a vody v poměru 70 : 30 : 2.

Potom se během 20 minut přidá 6,0 g (7,26 mmol) (Ca)-methylester-(Cy)-N-hydroxysukcinimidesteru N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny, který obsahuje ještě malé množství dicyklohexylmočoviny, ve 4 částech po· 1,5 g v pevné formě, přičemž roztok obsahuje zřetelný zákal.

Asi po 15minutovém míchání při teplotě 15 °C se chlazení odstraní a dále se míchá 2 x/2 hodiny při teplotě místnosti.

Potom se takto získaný kalný reakční roztok odpaří ve vakuu při 30 · °C. Surový produkt (10,75 g) se potom suspenduje ve 170 mililitrech dvojnásobně destilované vody (pH 5,5), suspenze se přidáním 0,3 ml triethylaminu upraví na pH 6,0, odfiltruje se nerozpuštěná dicyklohexylmočovina a filtrát se lyofilizuje ve vysokém vakuu.

Takto získaný lyofilizát se rozpustí ve 300 mililitrech dvojnásobně destilované vody a · roztok se v dialyzátoru (ultrafiltr PM 10/76 milimetrů 0) při 0,3 MPa (přetlak) zahustí až na objem 75 ml a potom se · filtruje· proti 250' ml směsi fosfátového pufru a chloridu sodného (vždy 0,1 M roztok, v poměru 1 · : 1, pH 7) a 1750 . ml dvojnásobně . destilované vody až do Odstranění chloridových .iontů. Roztok zbylý v komůrce ·· (asi 75 ml) se potom postupně filtruje dvěma miliporesními filtry (0,45 ^m a 0,2 .um) a takto získaný čirý, bezbarvý roztok se lyofilizuje ve vysokém vakuu. .

Získá se 7,36 g ještě znečištěné sodné soli N-proplonyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (Ca) -methylester- (Cy) -L-alanin-2-

- · (l,2-Sipalmitoyl-sn-glycerO’3lhySroxyfosf· 0ryloxy)ethylamidu ve formě · bezbarvého prášku, který se dále čistí protiproudým protřepáváním se směsí tetrachlormethanu, chloroformu, methanolu a 0,5% roztoku chloridu sodného v poměru 7 : 17 : 18 : 6. Po 547 stupních je požadovaný produkt ve frakcích 160 až 220, K = 0,58.

Frakce obsahující produkt se spojí a odpaří se k suchu ve vysokém vakuu bez zahřívání (chlazení). Získá se bezbarvý prášek, který obsahuje ještě chlorid sodný. K odstranění chloridu sodného se produkt rozpustí v 600 ml dvojnásobně destilované vody a filtruje se přes dialyzační filtr (ultrafiltr Ph 30/76 mm 0) při přetlaku 0,3 MPa, nejdříve se zahustí na vnitřní objem asi 50 mililitrů a potom za použití celkem 1 750 ml dvojnásobně destilované vody až do odstranění chloridových iontů.

Zbylý roztok (asi 50 ml) se potom filtruje pres miliporesní filtr (0,45 ^m, popřípadě 0,2 .un) za sterilních podmínek a lyofilizuje se ve vysokém vakuu.

Získá se sodná sůl N^^№^^^6^1muramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (©) -methylester- (C_y) -L-alanin-2- (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydro-xyfosforyloxy) ethylamidu ve formě . bezbarvého prášku, který · obsahuje 1,90 mol vody.

[«] _d20 = 4-3,7 + 0,1° (c form).

0,672, chloro[α)η²° = ·1,7 + 0,Γ (c - 1,044, voda).

Rf

Rf = 0,42 (směs chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5) a

- 0,62 (směs ethylacetátu, n-butanolu, pyridinu, octové kyseliny a vody v poměru 42 : 21 : 21 : 6 : 10).

Výchozí látka se získá následujícím způsobem:

5,12 g (10,1mmof ) c--methylesteru N-propirny1desmethy1muramy1-L-a1any1lD-g1utamové kyseliny se rozpustí ve 100 ml směsi chloroformu a itopropy1a1krhr1u v poměru 7:3a rozpuštění se dokončí přidáním 10 ml dimethylformamidu.

K · tomuto roztoku se přidá 2,68 g (13 mmol) Sicyk1ohexylkarbrSiimiSu a 1,50 g (14 · · mmol) N-hydroxysukcinimidu a takto získaný čirý, · bezbarvý roztok se míchá 1 Vz hodiny při teplotě místnosti a potom se nechá stát. 17 hodin při teplotě 4 °C.

K takto · získané suspenzi se .přidá 400 ml diethyletheru · á potom se míchá 1 hodinu při . teplotě místnosti.

Potom · se krystalizát odfiltruje, promyje se díéthyletherem a vysuší se ve vakuu nad oxidem· fosforečným.

Získá se · surový (Cα)-methyletter-(Cy)lNl -hydroxysukcinimidester N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny ve · formě . bezbarvých . krystalů, které obsahují hlavně ještě malé množství dicyklohexylm-očoviny a používají se bez dalšího čištění.

R_ř = 0,46

5: 1) a

R_f = 0,72 : 3).

(směs chloroformu a methanolu (směs chloroformu a methanolu látka se získá následujícím způVýchozí sobem:

Roztok 13,0 g (21,75 mmol) [CJ-methylester- (Cy) -benzylesteru N-propionyldesmethylmura^^yl-L-alanyl-D-^lutamové kyseliny ve 250 ml směsi dimethoxyethanu a vody v poměru 20 : 1 se hydrogenuje v přítomnosti

2,5 g 10% paládia na uhlí jako katalyzátoru 1 hodinu při teplotě místnosti a za atmosférického tlaku.

Potom se katalyzátor odfiltruje, filtrát se odpaří ve vakuu к suchu a takto získaný zbytek se třikrát vyjme vždy 50 ml vody a roztok se vždy znovu odpaří.

Zbytek se znovu rozpustí v asi 100 ml dvojnásobně destilované vody, získaný roztok se filtruje přes miliporesní filtr (0,2 ^m) a filtrát se potom lyofilizuje ve vysokém vakuu.

Získá se ^-methylester N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny (s obsahem 0,68 mol vody) ve formě bezbarvého lyofilizátu.

[_e]_D2« = -|-14,9 + 0,l^o (c = 1,067, methanol ).

Rf = 0,78 (směs chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5) a

R₍ = 0,57 (směs ethylacetátu, n-butanolu, pyridinu, octové kyseliny a vody v poměru 42 : 21 : 21 : 6 : 10).

Výchozí látka se získá následujícím způsobem:

Roztok 20,7 g (32,46 mmol) (CJ-methylester- (C_Y) -benzylesteru 4,6-O-isopropyliden-N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny ve 400 ml 60% octové kyseliny se míchá 21 hodin při teplotě místnosti, potom se odpaří ve vakuu při teplotě 30 °C a takto získaný zbytek se postupně smísí třikrát vždy s přídavkem 100 ml vody a roztok se vždy znovu odpaří.

Surový produkt se potom čistí sloupcovou chromatografií na 1000 g silikagelu (silikagel 60, čistý, 0,063 až 0,200 mm) za použití směsi methylenchloridu a methanolu v poměru 85 :15 jako elučního činidla, přičemž se odebírají frakce po 15 ml. Frakce 207 až 290 se spojí a odpaří se ve vakuu při teplotě 30 °C.

Takto se získá (C„)-methylester-(C_Y)-benzylester N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny, který obsahuje 0,24 mol vody.

[a]o²⁰ = +16,1 + 0,1 (c = 1,463, methanol).

R_f = 0,24 (směs chloroformu a methanolu v poměru 9:1),

R_f = 0,55 (směs chloroformu a methanolu v poměru 5 :1) a

R_f = 0,94 (směs chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5).

Výchozí látka se získá následujícím způsobem:

Do suspenze 13,2 g (35,77 mmol) sodné soli 4,6-O-isopropyliden-N-propionyldesme thylmuramové kyseliny ve 200 ml dimethylformamidu se přidá při teplotě místnosti za míchání 9,6 g (46,5 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu, 5,35 g (46,5 mmol) N-hydroxysukcinimidu a 12,8 g (35,77 mmol] hydrochloridu (C.,) -methylester- (C _Y) -benzylesteru L-alanyl-D-glutamové kyseliny a směs se míchá 21 hodin při teplotě místnosti.

К takto získané bílé suspenzi se přidá 200 mililitrů ethylacetátu, směs se míchá 1 hodinu při teplotě 0 °C, krystalický podíl (dlcyklohexylmočovina) se odfiltruje, promyje se ledem ochlazeným ethylacetátem a filtrát se odpaří ve vakuu při teplotě 30 °C.

Takto získaný zbytek se vyjme 300 ml ethylacetátu a získaný roztok se promývá dvakrát postupně vždy 50 ml 2 N roztoku citrónové kyseliny, vody, 10% roztoku hydrogenuhličitanu sodného a vody.

Ethylacetátové fáze se spojí, vysuší se síranem sodným, zfiltrují se a odpaří se ve vakuu.

Získá se (C_a)-methylester-(C_Y)-benzylester 4,6-O-lsopropyliden-N-propionyldesme thylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny.

R_f = 0,65 (směs chloroformu a methanolu v poměru 9 :1) a

R_f = 0,86 (směs chloroformu a methanolu v poměru 5:1).

Obě výchozí látky se získají následujícím způsobem:

К roztoku 20,3 g (48,0 mmol) (C_a)-methylester-(C_Y)-benzylesteru N-terc.butyloxykarbonyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny [P. Lefrancier, M. Derrien, I. Lederman, F. Nief, J. Choay a E. Lederer, Int. J. Peptide Protein Res. 11, 289 až 296 (1978) ] ve 100 ml absolutního ethylacetátu se přidá při teplotě 0 °C 100 ml asi 5 N roztoku chlorovodíkové kyseliny v absolutním ethylacetátu a reakční směs se míchá 2 hodiny při teplotě 0 °C.

Nažloutlý roztok se potom odpaří ve vakuu, takto získaný zbytek se vyjme dvakrát vždy 100 ml absolutního ethylacetátu a získaný roztok se vždy znovu odpaří. Po digerování dvakrát se 100 ml absolutního diethyletheru se zbytek vysuší ve vysokém vakuu a získá se hydrochlorid (C_a)-methylester- (C_Y ] -benzylesteru L-alanyl-D-glutamové kyseliny, který obsahuje 0,31 mol vody.

[ a] o²⁰ =+18,6 + 0,1° (c = 0,043, methanol).

R₍ = 0,72 (směs chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5),

Rf = 0,44 (směs chloroformu a methanolu v poměru 5 : 1) a

R_f = 0,31 (směs chloroformu a methanolu v poměru 9:1].

Roztok 34,4 g (73,8 mmol), 2,14 mmol/g, obsahující ještě chlorid sodný) sodné soli ltf-0-benzyl-4,6-0-isopropyliden-N-propionyldesmethylmuramové kyseliny ve 340 ml vody se hydrogenuje při konstantní hodnotě pH 7,1 v přítomnosti 6,0 g 10% paladia na uhlí jako katalyzátoru 23 hodin při teplotě místnosti a při atmosférickém tlaku.

Potom se katalyzátor odfiltruje, filtrát se odpaří při pH 7,1 ve vakuu při teplotě 30 °C a takto získaný zbytek se vysuší ve vysokém vakuu pomocí oxidu fosforečného.

Získá se sodná sůl 4,6-O-propiyliden-N-propionyldesmethylmuramové kyseliny ve formě bezbarvého prášku.

Rí = 0,50 (směs chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5) a

R_ř = 0,66 (směs acetonitrilu a vody v poměru 3 : 1).

Výchozí látka se získá následujícím způsobem:

К roztoku 14,3 g (32,7 mmol) methylesteru lrrO-benzyl-4,6-O-isopropyliden-N-propionyldesmethylmuramové kyseliny ve 130 ml methanolu se přidá 24,4 ml (48,7 mmol) 2 N roztoku hydroxidu sodného a směs se míchá 1 У2 hodiny při teplotě místnosti.

Potom se takto získaný čirý, slabě žlutý roztok upraví přidáním 1 N roztoku chlorovodíkové kyseliny na pH 7,0 a odpaří se ve vakuu při teplotě 30 °C.

Po vysušení nad oxidem fosforečným se získá sodná sůl lar-O-benzyl-4,6-O-isopropyliden-N-propionyldesmethylmuramové kyseliny ve formě bezbarvých krystalů.

Rf = 0,67 (směs chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5) a

R_ř = 0,74 (směs acetonitrilu a vody v poměru 3 : 1).

Výchozí látka se získá následujícím způsobem:

К suspenzi 6,75 g (224,7 mmol) hydridu sodného ve 120 ml absolutního tetrahydrofuranu se přikape při teplotě 5 °C pod atmosférou dusíku a za míchání během 5 minut roztok 31,3 g (85,65 mmol) l^-O-benzyl-2-desoxy-4,6-O-isopropyliden-2-propionamido-a-D-glukopyranosidu ve 200 ml absolutního tetrahydrofuranu, přičemž teplota vystoupí na 20 °C.

Takto získaná suspenze se míchá ještě 2 hodiny při teplotě 40 °C, potom se ochladí na 0 T a za míchání a pod atmosférou dusíku se během 30 minut přikape к roztoku

20,7 g (135,77 mmol) methylesteru bromoctové kyseliny v 95 ml absolutního tetrahydrofuranu, který je -ochlazen na —15 °C.

Takto získaná suspenze se míchá ještě 3 hodiny při teplotě 0 až 5 °C a potom se přidá 20 ml methanolu a 20 ml tetrahydrofuranu. Pomocí 4,5 ml ledové kyseliny octové se upraví hodnota pH na 6 a potom se směs odpaří ve vakuu při teplotě 30 °C.

Zbytek se rozpustí ve 200 ml methylenchloridu a takto získaný roztok se třikrát promyje vždy 125 ml vody. Methylenchloridová fáze se spojí, vysuší se síranem sodným, zfiltrují se a potom se odpaří ve vakuu při teplotě 30 °C.

Získá se surový produkt ve formě slabě žlutých krystalů, které se čistí sloupcovou chromatografií na 500 g neutrálního kysličníku hlinitého (Super 1) za použití ethylacetátu jako elučního činidla (odebírají se frakce po 10 ml). Frakce 14 až 36 se spojí a odpaří se ve vakuu.

Získá se methylester la-O-benzyl-4,6-O-is-opropyliden-N-propionyldesmethylmuramové kyseliny ve formě bezbarvých krystalů o teplotě tání 121 až 123 °C (ze směsi diethyletheru a petroletheru v poměru 1:2).

= +146,9 + 0,.V (c - 0,849, chloroform ).

Rí = 0,67 (směs chloroformu a methanolu v poměru 9:1).

Příklad 14

Analogickým postupem jako je popsán v příkladu 13 se z 5,525 g (6,43 mmol) surového (obsahuje ještě malé množství dicyklohexylmočoviny) (C«) -terc.butylester- (C_Y) -N-hydroxysukcinimidesteru N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny a 3,78 g (4,95 mmol) L-alanin-2-(l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydrOxyf osf oryloxy) ethylamidu získá sodná sůl N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (C_a) -terc.butylester- (C_y)-L-alanin-2-( 1,2-dipalmitoyl-s,n-glycero-3-hydroxyf osf oryloxy) ethylamidu ve formě bezbarvého prášku, který obsahuje ještě 2,64 mol vody.

[a]o²⁰ = +2,5+ 0,1° (c = 0,649, voda).

[orjf+θ := +5,8 + 0,1° (c - 0,694, chloroform).

Rí = 0,60 (směs chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5).

Výchozí látka se získá následujícím způsobem:

Analogickým postupem jako je popsán v příkladu 13 se z 3,44 g [6,15 mmol) a-terč.butylesteru N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny, 1,68 g (8,14 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu a 0,94 g (8,14 mmol) N-hydroxysukcinimidu získá (C_a) -terc.butylester- (C_Y) -N-hydroxysukcin-imidester N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny v surovém stavu ve formě bezbarvých krystalů, které obsahují hlavně ještě malé množství dicyklohexylmočoviny a používají se pro další reakci bez dalšího čištění.

R_ř = 0,61 (směs chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5).

Výchozí látka se získá následujícím způsobem:

Roztok 5,1 g (7 mmol] (CJ-te-rc.butylester- (C_Y) -benzylester u la-Ó-benzyl-N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny ve 100 ml směsi dimethoxyethanu a vody v poměru 9 : 1 se hydrogenuje v přítomnosti 1,5 g 5% paládia na uhlí jako katalyzátoru 20 hodin při teplotě místnosti a při atmosférickém tlaku.

Po 20 hodinách se katalyzátor odfiltruje a potom se opět jak popsáno shora dále hydrogenuje v přítomnosti 1,5 g čerstvého katalyzátoru po dobu 26 hodin. Potom se katalyzátor znovu odfiltruje a filtrát se odpaří ve vakuu při teplotě 30 °C k suchu.

Takto získaný odparek se rozpustí ve směsi 100 ml methylenchloridu a 5 ml isopropylalkoholu k roztoku se přidá 500 ml směsi diethyletheru a petroletheru v poměru 3:2a směs se míchá ještě · 1 hodinu při teplotě místnosti.

Potom se vyloučený produkt odfiltruje a ještě se promyje diethyletherem. Získá se a-terc.butylester N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny ve formě bezbarvého prášku, který obsahuje 0,52 mol vody.

[<] d²⁰ = ψ 20,2 + 0,1° [c = 0,902, voda].

Rí = 0,32 (směs chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5] a

Rí = 0,54 (směs acetonitrilu a vody v poměru 3 : 1.

Výchozí látka se získá následujícím způsobem:

Analogickým způsobem jako je popsán v příkladu 13 se z 7,3 g (9,5 mmol] (CJ-terc.butylester-(CY)-benzylester u la-Ó-benzyl-d^-Odsopropyllden-N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny a 150 ml 60% octové kyseliny získá (CJ-terc.butylester-fCJ-benzylester lcz-Ó-benzyl-N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny ve formě bezbarvých krystalů o teplotě tání 152 až 153 'C . (ze směsi methanolu a vody v poměru 1:5].

[a_;]_n20 = _G8,9 + 0,1' (c =- 0,991, methanol].

Rf = . 0,40 (směs chloroformu a methanolu v poměru 9 : 1] a

Rf = 0,70 (směs acetonitrilu a vody v poměru 3:1].

Výchozí látka se získá následujícím způsobem:

Analogickým postupem jako je popsán v příkladu 13 se z 4,65 g (9,62 mmol] 2,066 mmol/g, obsahuje ještě chlorid sodný] sodné soli laa.'O-benzyl-4,6-0-isopropyliden-N-propionylesmethylmuramové ' kyseliny, 2,38 gramu · (11,54 mmol] dicyklohexylkarbodiimidu, 1,33 g (11,54 mmol] N-^ydroxysukc'inimidu a 3,86 g (9,62 mmol] hydrochloridu (C_a ] -terc.butylester- ( Cy ] -benzy lesteru L-ala.n.yl--D-gl'UCsmlové zůsllká (Ca]-terc.butylester- ( Cy ] -benzylester lo-Ó-benzyl-4,6-Odsopropyliden-N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny, který obsahuje ještě 0,31 . mol vody.

[a]_D2° = + 38,4 + 0,1° (c = 1,086, methylenchlorld].

Rí = 0,86 (směs acetonitrilu · a vody v ' poměru 3 : 1] a

Rí- = 0,8'3 (směs chloroformu a methanolu v poměru 9:1].

Příklad 15

Analogickým postupem jako je popsán v příkladu 13 se z 3,07 g (4 mmol] surového (obsahuje ještě malé množství dicyklohexylmočoviny ] (C«] -n-butylester- ( Cy ] -N-hydroxysukcinimidesteru N-propió-nyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny ' a

2,37 g (3,1 mmol) L-alanin-2-(l,2-dipalm-~ toyl-on-glycero-3-hydroxyfosforyloxy ]ethylamidu získá sodná sůl N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl-(C_a ]-n-butylester- (Cy ] -L-alanin-2- (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosf oryloxy ] ethylaml- . du ve formě bezbarvého' prášku, · která obsahuje ještě 2,93 mol vody.

[a]b²⁰ = + 6,9 + 0,1' (c = . 0,504, methylenchlorid].

Rf = 0,65 (směs chloroformu, methanolu a vody v poměru ' 70 : 30 : 5] a

Rí = 0,63 (směs chloroformu a methanolu v poměru 7:3]. ,

Výchozí látka se získá následujícím způsobem:

Analogickým· postupem jako se popisuje v příkladu 13 se z 2,2 g (3,9 mmol] a-n-butylesteru N-propiónyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny, 1,2 g. (5,8 mmol]] dicyklohexylkarbodiimidu a . 0,69 .g (5,8 mmol] ' N-hydroxysukcinimidu získá surový (Ca ] -n-butylester- ( Cy ] -N-hydroxysukcinimidester N--^roplonyldesmethylmura^myl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny ve formě bezbarvých krystalů, který obsahuje hlavně . ještě malé množství dicyklohexylmočoviny a používá se bez dalšího· čištění.

Rí = 0,6’6 · (směs chloroformu, · methanolu ' a vody v poměru 70 : .30 : 5].

Výchozí látka se získá následujícím způsobem:

Analogickým- · postupem jako je popsán v příkladu 14 (doba hydrogenace 20 minut] se získá z 7,3 g ' (11,3 mmol] . (Ca]-n-butyl ester- (C_Y) -benzylesteru N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny α-n-butylester N-propiOinyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny ve formě bezbarvého prášku, který obsahuje ještě 0,88 mol vody.

[a]d²⁰ - + 16,4 + 0,1° [c = 0,959, voda).

Rf = 0,61 (směs methylenchloridu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5) a

R_ř = 0,52 (směs acetonitrilu a vody v poměru 3:1).

Výchozí látka se získá následujícím způsobem:

Analogickým způsobem jako je popsán v příkladu 13 se z 9,5 g (13,97 mmol) (CJ-n-butylester- (C_Y) -benzylesteru 4,6-O-isopropyliden-N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny a 120 ml 60% octové kyseliny získá (C_a)-n-butylester-(C_Y)-benzylester N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny, který obsahuje ještě 0,41 mol vody.

[я]₀2о ₌ _|_ _15>7 4_ _Одо _{(c = 0},₀₁₉, methanol).

Rř = 0,23 (směs methylenchloridu a methanolu v poměru 9:1),

R_ř = 0,45 (směs methylenchloridu a methanolu v poměru 5 : 1) a

Rf = 0,82 (směs methylenchloridu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5).

Výchozí látka se získá následujícím způsobem:

Analogickým způsobem jako je popsán v příkladu 13 se z 3,81 g (10,76 mol), 2,72 mmol/g, obsahuje ještě chlorid sodný) sodné soli 4,6-O-propyliden-N-propionyldesmethylmuramové kyseliny 2,44 g (11,83 mmol) dičyklohexylkarbodiimidu, 1,36 g (11,83 mmol) N-hydroxysukcinimidu a 4,3 g (10,76 mmol) (C_a) -n-butylester- (C_Y)-benzy lester-hydrochloridu L-alanyl-D-glutamové kyseliliny získá (C_rč)-n-butylester-(C_Y)-benzylester

4,6-O-isopropyliden-N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny.

[a]o²⁰ = + 10,6 + 0,1° (c = 0,928, methanol ).

Rf = 0,81 (směs methylenchloridu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5) a

Rř = 0,57 (směs methylenchloridu a methanolu v poměru 5:1).

Příklad 16

К roztoku 2,85 g (2,09 mmol) sodné soli N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl-(C_a)-te.rc.butylester-(C_?)-L-alanin-2- (l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxyjethylamidu, který byl získán postupem podle příkladu 14, ve 112 ml absolutního methylenchloridu se přidá 28 mililitrů trifluoroctové kyseliny a směs se míchá 3 hodiny při teplotě místnosti.

Bezbarvý, čirý roztok se potom odpaří ve vakuu při teplotě 30 °C a takto získaný odparek se několikrát \?yjme methylenchloridem a získaný roztok se vždy znovu odpaří.

Získá se 3,0 g bezbarvého oleje, který se rozpustí ve 350 ml směsi fosfátového pufru a chloridu sodného (vždy 0,1 M, v poměru 1:1, pH 7) a získaný roztok se filtruje v dialyzačním filtru ultrafiltr PM 30/76 mm 0) při přetlaku 0,3 MPa. Potom se filtruje ještě proti celkem 2,1 litru dvojnásobně destilované vody až do odstranění chloridových iontů. Roztok zbylý v komůrce dialyzátoru (asi 50 ml) se potom lyofilizuje ve vysokém vakuu.

Takto se získá bezbarvý lyofilizát, který se čistí dále sloupcovou chromatografií na 260 g silikagelu (silikagel 60, čistý, velikost částic 0,063 až 0,200 mm) za použití směsi chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5 jako elučního činidla, přičemž se odebírají frakce o obsahu 10 ml. Frakce 90 až 260 se spojí a odpaří se, aniž by se zahřívaly ve vysokém vakuu (ochlazení) к suchu.

Zbytek se rozpustí ve 250 ml dvojnásobně destilované vody a v dialyzačním filtru (ultrafiltr PM 30/76 mm 0) se při přetlaku 0,3 MPa nejdříve zahustí na objem asi 50 ml a potom se postupně filtruje proti 250 ml směsi fosfátového pufru a chloridu sodného (vždy 0,1 Μ, 1 : 1, pH 7) a 1 750 ml dvojnásobně destilované vody až do odstranění chloridových iontů.

Roztok zbylý v komůrce dialyzačního filtru se potom sterilizuje filtrací dvěma miliporesními filtry (0,45 μπι, popřípadě 0,2 wm) a potom se lyofilizuje ve vysokém vakuu.

Získá se dvojsodná sůl (C_Y)-L-alanin-2- (l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hy droxyf osf o ryloxy)ethylamidu N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny ve formě hygroskopického prášku, který obsahuje ještě 4,80 mol vody.

[_a]₀2o ₌ 4_₀₁o _{(c = 0},_{489j m}ethylenchlorid ku ethanol v poměru 1:1).

R_ř = 0,28 (směs ethylacetátu, n-butanolu, pyridinu, octové kyseliny a vody v poměru 42 : 21 : 21 : 6 : 10) a

Rf = 0,62 (směs acetonitrilu a vody v poměru 3 : 1).

Příklad 17

4,5 g [34 mmol) soudné soli N-acetylmuramy 1-L-ala.nyl-D -glutamyl- (C_a) -terc.butylester-

- (C_Y) -L-alanrn-2- (1,2-dii3almitoyl-sn-gly cero-3-hydroxyfosforyloxy) ethylamidu, ' která byla získána podle příkladu 12 a která byla vysušena ve vysokém vakuu nad oxidem fosforečným, se rozpustí v 75 ml absolutního dichlormethanu.

Roztok se ochladí na 0 °C a potom · se k němu přidá za míchání a za vyloučení vlhkosti 25 ml bezvodé trifluoroctové kyseliny a teplota roztoku se nechá vystoupit na teplotu místnosti. Po 2 ¥2 hodině se čirý, bezbarvý roztok silně zahustí · na rotační · odparce při teplotě místnosti (asi na objem 10 ml), několikrát se přidá vždy 100 ml dichlormethanu a dichlormethan se vždy znovu odpaří. Zbylý olej se vyjme 100 ml terc.butanolu a roztok se lyofilizuje.

Surový produkt se čistí dvojnásobnou chromatografií vždy na 400 g silikagelu (silikagel 60) za použití směsi chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5 jako elučního· činidla. Produkt obsažený ve · frakcích 92 až 172 se rozpustí ve 100 ml dvojnásobně destilované vody a tento· roztok se čistí dialyzační filtrací analogickým postupem jako je popsán v příkladu 1. Roztok zbylý v komůrce dialyzátoru se filtruje miliporesním filtrem (0,2 ^m) a filtrát se lyofilizuje. «

Získá se dvojsodná sůl (C_Y)-L-alamn-2-

- (l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyf osf 0ryloxy) ethylamidu N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny, která · obsahuje ještě · 4,89 mol vody, ve formě bezbarvého kyprého prášku.

mýváním · plic se nanesou na desku a in vitro se inkubují · 24 hodin buď liposomy, které obsahují účinnou · . látku, · nebo· účinnou látkou ve fyziologickém roztoku · chloridu sodného· (fyziologický · roztok chloridu sodného pufrovaný fosfátovým pufrem). Potom se přidají nádorové buňky značené jodem (1²⁵J) a v inkubaci se pokračuje dalších ·72 hodin.

Potom se usmrcené nádorové buňky odstraní vymytím a stanoví se počet ještě živých nádorových buněk na · základě jejich radioaktivity. Aktivace makrofágů se posuzuje na základě jejich cytotoxicity, tzn. podle · podílu usmrcených nádorových · buněk na konci pokusu. Specifická cytotoxicita . · (v procentech) se vypočte následujícím způsobem:

100 počet nádorových buněk inkud bovaných makrofágy a účinnou · látkou v 1 ml [cpm]

1--.-------;--------------------------počet nádorových buněk inkubovaných makrofágy a účinnou látkou ve fyziologickém roztoku, který · je pufrován fosfátovým pufrem, v 1 ml [cpm] [_ď>]_o20 = -|-10 + 1° (c — 0,675, methanol).

Rf = 0,08 (směs chloroformu, methanolu a vody v poměru 70 : 30 : 5),

Rf = 0,15 (směs ethylacetátu, n-butanolu, pyridinu, octové kyseliny a vody v poměru 42 : 21 : 21 : 6 : 10) a

Rf = 0,30 (směs chloroformu, methanolu, vody a octové · kyseliny v poměru 70 : 40 : :9:1). ,

Další podrobnosti shora uvedeného- · testu jsou popsány v publikaci I. J. Fidlera a dalších, J. Biol. · Response · Modifiers 1, 43 až · 55 (1982). V následující · tabulce · jsou uvedeny některé výsledky pokusu, které byly dosaženy při testování dále uvedených účinných látek: ... . ..

I sodná sůl N-acetylmuramyl-L-alany--D-glutamyl- (C_c,) -n-butylester- {C_Y) -L-alauíu-2- (l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-bydroxyf osf oryloxy) ethylamidu,

II · sodná · sůl · N-propionylmuramyl-L-alan- yl-D-glutamyl-(C_a)-n-butylester-(C_Y)-L-al.aniu-2-(l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosf oryloxy) ethylamidu, .

III · .sodná sůl · · N.-přopionylnormuramyl-L-

-alanyl-D-glutamyl- (C_a) -n-methylester- [ C_Y) -L-alamn-2- (1.,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy) ethylamidu a

IV sod-ná sůl N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (C_a) -terc.butylester- (Cy) -L-alanin-2- (l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyf osforyloxy) ethylamidu.

Alveolární krysí makrofágy získané pro245787

Účinná Specifická cytotoxicita (%) látka účinná látka v 0,2 ml PBS .ug/kultura

	0,02	0,2	2	20
I		39	59
II		21	48	74
III	3	81	47
IV	23	18	20

účinná látka v 100 ,ug liposomů na 0,2 ml

^g/kultura
0,02	0,2	2	20
	56	51	44
	10	23	11
64	76	79
64	68	52

PBS = fyziologický roztok chloridu sodného pufrovaný fosfátovým pufrem.

Příklad 19

Výroba 1 000 tablet s obsahem 0,5 % účinné látky

Složení na 1 000 tablet sodná sůl N-acetylmutamyl-L-alanyl-D-glutamyl-ÍCj-methylester-(C_Y) -L-alanin-2- (1,2-dipalmltoyl-sn-glycero-3hydroxyfosforyloxyjethylamidu 0,5 g rozemletá laktosa 43,0g kukuřičný škrob 52,0g hydroxypropylmethylcelulosa obsahující 28 až 30 % methoxyskupin (Pharmacoat 603^,R)) 3,0g koloidální kysličník křemičitý (Aerosil^<R>) 1,0g hořečnatá sůl kyseliny stearové 0,5g

Výroba

Nejdříve se smísí účinná látka a 15 g laktosy. Takto získaná předsměs se smísí dále s 28 g laktosy a 47 g kukuřičného škrobu. Z této směsi a vodného roztoku hydroxy propylmethylcelulosy se získá hmota vhodná ke granulování, která se granuluje, granulát se vysuší a rozemele se. Potom se přimísí 5 g kukuřičného škrobu, koloidní kysličník křemičitý a hořečnatá sůl stearové kyseliny a ze směsi se lisováním vyrobí 1 000 tablet o hmotnosti po 100 ml.

Takto vylisované tablety se mohou opatrovat o sobě známým způsobem vrstvou laku, která je rezistentní vůči účinku žaludečních šťáv.

Příklad 20

Účinná látka ve formě lyofilizované suché látky mg sodné soli N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (C_a) -methylester- (C_Y )-L-alanin-2- (l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxyjethylamidu a 500 mg mannitu (prostého pyrogenních látek) se rozpustí ve vodě pro injekční účely a roztok se sterilizuje filtrací přes membránový filtr. Za aseptických podmínek se sterilní roztok plní do sterilních skleněných ampulí nebo do skleněných fiol a vysuší se vymrazením. Po lyofilizaci se ampule uzavřou a fioly se uzavřou gumovým uzávěrem a překryjí se hliníkovou fólií.

Claims (18)

1. Způsob výroby mutiamylpeptldů obecného vzorce I

CH^OH мА*™

R^CH>! 9 λ \!DNJH-C-R (_D) v němž

0 oR⁶

R² znamená alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxymethylovon skupinu nebo fenylovou skupinu,

R3 znamená vodík nebo pinu,

R⁵ znamená vodík nebo nu s 1 až 3 atomy uhlíku,

R7 znamená substituovanou atomy Uhlíku, methylovou skualkylovou skupihydroxyskupinou popřípadě alkylovou skupinou s 1 až 3 (I⁾ R⁸ znamená vodík nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku,

X znamená kyslík nebo skupinu NH,

Y znamená alkylideriovoň - skupinu - s ' 1 ' až 4 atomy uhlíku a

R⁹ a R10 znamenají nezávisle na sobě alkylovou skupinu s 11 až 17 atomy uhlíku nebo alkenylovou -skupinu' 's 11 až 17 atomy uhlíku, ' a/nebo jejich - solí, vyznačující se tím, že ' se sloučenina obecného vzorce V

HQCH2 (h,qh) b

«3 ..

R-CH (_D)NH-C-R (L)

N-CH-C

I , II

R R⁷ O

(L) JX-y-C- (5 u - у

QH (V)

24 5'7 8'7 v němž s, r a q znamenají nezávisle na sobě 0 nebo 1,

R⁸ znamená alkylovou skupinu s 1 až'· . 4 atomy uhlíku nebo chránící skupinu ' karboxyskupiny, a ostatní substituenty mají shora uvedené významy, ' přičemž volné funkční 'skupiny přítomné ve sloučenině vzorce V, s výjimkou skupiny podílející se na reakci, jsou popřípadě ' přítomny v chráněné formě, nebo reaktivní ' derivát karboxylové kyseliny nechá reagovat ;se ' sloučeninou obecného vzorce VI %

I o _v </4 . . i— „ .··.· I · :

0=0

.-.--¹ .'··> ³

3 5—o:

r

v němž t, u a v znamenají ' nezávisle na sobě ' ' O nebo 1 a

R8 'znamená alkylovou skupinu s ' 1 až 4 atomy uhlíku nebo chránící skupinu ' ' karboxylové skupiny, a ostatní substituenty mají shora uvedené významy, přičemž t, u a v znamenají číslo' 1, jestliže v reakční složce vzorce V znamená q nulu, nebo že t znamená nulu, u znamená 1 ' a v znamená 1, jestliže q znamená 1 a r znamená nulu, nebo že u znamená nulu a v znamená 1, jestliže q znamená 1, r znamená las znamená nulu, nebo že v znamená nulu, jestliže q, ras znamenají 1, nebo s jejím reaktivním derivátem, načež se popřípadě přítomné chránící skupiny odštěpí, a získaná sloučenina vzorce I se popřípadě převede na sůl nebo se získaná sůl převede na jinou sůl.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako výchozí látky použijí odpovídající sloučeniny obecných vzorců V а VI za vzniku sloučenin obecného vzorce I, v němž R² znamená alkylovou skupinu s 1 až 2 atomy uhlíku nebo hydroxymethylovou skupinu, R³ znamená vodík nebo methylovou skupinu, R⁵ znamená vodík nebo methylovou skupinu, R⁷ znamená alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku nebo hydroxymethylovou skupinu, R⁸ znamená vodík nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, X znamená kyslík nebo skupinu NH, Y znamená alkylidenovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku a R⁹ a R¹⁰ znamenají nezávisle na sobě přímou alkylovou skupinu s 11 až 17 atomy uhlíku nebo deskarbonyloleoylovou skupinu a sloučeniny vzorce I se potom popřípadě převádějí na své soli.

3. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se jako výchozí látky použijí odpovídající sloučeniny obecných vzorců V а VI, za vzniku sloučenin obecného vzorce I, v němž R² znamená methylovou skupinu nebo ethylovou skupinu, R³ znamená vodík nebo methylovou skupinu, R⁵ znamená vodík nebo methylovou skupinu, R⁷ znamená alkylovou skupinu s 1 až 3 atomy uhlíku, R⁸ znamená vodík nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, X znamená kyslík nebo skupinu NH, Y znamená alkylidenovou skupinu s 1 až 2 atomy uhlíku a R⁹ a R¹⁰ znamenají nezávisle na sobě přímou alkylovou skupinu s 11 až 17 atomy uhlíku s lichým počtem atomů uhlíku nebo deskarbonyloleoylovou skupinu, a sloučeniny vzorce I se potom popřípadě převádějí na své soli.

4. Způsob podle jednoho z bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že se jako výchozí látky použijí odpovídající sloučeniny obecných vzorců V а VI za vzniku sloučenin obecného vzorce I, v němž R⁸ znamená alkylovou skupinu uvedenou v bodech 1 až 3, a ostatní substituenty mají význam uvedený v jednom z bodů 1 až 3, a sloučeniny vzorce I se potom popřípadě převádějí na své soli.

5. Způsob podle bodu 3, vyznačující se tím, že se jako výchozí látky použijí odpovídající sloučeniny obecných vzorců V а VI, za vzniku sloučenin obecného vzorce I, v němž R² znamená methylovou skupinu nebo ethylovou skupinu, R³ znamená vodík, jestliže R^z znamená ethylovou skupinu, nebo znamená methylovou skupinu, jestliže R² znamená methylovou skupinu, R⁵ znamená vodík nebo methylovou skupinu, R⁷ znamená alkylovou skupinu s 1 až 2 atomy uhlíku, R⁸ znamená přímou alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, X znamená kyslík nebo skupinu NH, Y znamená ethylidenovou skupinu a R⁹ a R¹⁰ znamenají nezávisle na sobě přímou alkylovou skupinu s 15 až 17 atomy uhlíku s lichým počtem atomů uhlíku, a sloučeniny vzorce I se potom popřípadě převádějí na své soli.

6. Způsob podle jednoho z bodů 1 až 5, vyznačující se tím, že se jako výchozí látky použijí odpovídající sloučeniny obecných vzorců V а VI, za vzniku sloučenin obecného vzorce I, v němž R³ znamená methylovou skupinu, a ostatní substituenty mají význam uvedený v jednom z bodů 1 až 5, a sloučeniny vzorce I se potom popřípadě převádějí na své soli.

7. Způsob podle jednoho z bodů 1 až 6, vyznačující se tím, že se jako výchozí látky použijí odpovídající sloučeniny obecných vzorců V а VI, za vzniku sloučenin obecného vzorce I, v němž R⁵ znamená vodík, a ostatní substituenty mají význam uvedený v jednom z bodů 1 až 6, a sloučeniny vzorce I se potom popřípadě převádějí na své soli.

8. Způsob podle jednoho z bodů 1 až 7, vyznačující se tím, že se jako výchozí látky použijí odpovídající sloučeniny obecných vzorců V а VI, za vzniku sloučenin obecného vzorce I, v němž R⁸ znamená n-butylovou skupinu, a ostatní substituenty mají význam uvedený v jednom z bodů 1 až 7, a sloučeniny vzorce I se potom popřípadě převádějí na své soli.

9. Způsob podle jednoho z bodů 1 až 8, vyznačující se tím, že se jako výchozí látky použijí odpovídající sloučeniny obecných vzorců V а VI, za vzniku sloučenin obecného vzorce I, v němž X znamená skupinu NH, a ostatní substituenty mají význam uvedený v jednom z bodů 1 až 8 a sloučeniny vzorce I se potom popřípadě převádějí na své soli.

10. Způsob podle jednoho z bodů 1 až 9, vyznačující se tím, že se jako výchozí látky použijí odpovídající sloučeniny obecných vzorců V а VI, za vzniku sloučenin obecného vzorce I, v němž R⁹ stejně jako R¹⁰ znamenají n-pentadecylovou skupinu a ostatní substituenty mají význam uvedený v jednom z bodů 1 až 9 a sloučeniny vzorce I se potom popřípadě převádějí na své soli.

11. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako výchozí látky použijí odpovídající sloučeniny obecných vzorců V а VI za vzniku N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (C_a) -terc.butylester- (C_y) -L-alanlii-2-

- (1,2-dipalmitoyl-sn-glycer o-3-hy droxyf osfd ryloxyjethylamldu, který se potom popřípadě převádí na svou sůl.

12. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako výchozí látky použijí odpoivídající sloučeniny obecných vzorců V а VI, za vzniku (C_Y)-L-alanin-2-(l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)ethylamidu N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové kyseliny, který se potom popřípadě převádí na svou sůl.

13. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako výchozí látky použijí odpovídající sloučeniny obecných vzorců V а VI, za vzniku N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glu tamyl- (C_tt) -n-butylester- (C_Y) -L-alanin-2- (1,2-dípalmltoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy) ethylamidu, který se potom popřípadě převádí na svou sůl.

14. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako výchozí látky použijí odpovídající sloučeniny obecných vzorců V а VI, za vzniku N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (C_K) -n-butylester- (C_Y) -L-alanin-2- {l,2-<lípalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy) ethylamidu, který se potom popřípadě převádí na svou sůl.

15. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako výchozí látky použijí odpovídající sloučeniny obecných vzorců V а VI, za vzniku N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamy 1- (C_a) -methylester- (C_Y) -L-alanin-2-

- (l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy) ethylamidu, který se potom popřípadě převádí na svou sůl.

16. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako výchozí látky použijí odpovídající sloučeniny obecných vzorců V а VI, za vzniku N-propionyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (C_a) -methylester- (C_Y ] -L-alanin-2- (l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxyj ethylamidu, který se potom popřípadě převádí na svou sůl.

17. Způsob podle jednoho z bodů 1 až 16, vyznačující se tím, že se jako výchozí látky použijí odpovídající sloučeniny obecných vzorců V а VI, za vzniku sloučenin obecného vzorce I ve formě farmaceuticky použitelných solí.

18. Způsob podle bodu 17, vyznačující se tím, že se jako výchozí látky použijí odpovídající sloučeniny obecných vzorců V а VI, za vzniku sloučenin obecného vzorce 1, ve formě sodných solí.