SK308692A3

SK308692A3 - Cyclic vasoactive peptides

Info

Publication number: SK308692A3
Application number: SK3086-92A
Authority: SK
Inventors: David Robert Bolin; Margaret O'donnell
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1991-10-11
Filing date: 1992-10-09
Publication date: 1995-03-08
Also published as: IL103396A0; MX9205822A; FI924580A; US5677419A; FI20002041A; FI111646B; HU9203194D0; FI924580A0; ZA927724B; IL103396A; JPH05213996A; NO923929L; CN1198841C; SK279399B6; JP2515473B2; EP0536741A2; DK0536741T3; CZ281818B6; NO980377L; DE69207138D1

Description

Vynález se týká cyklických peptidu, které jsou analógy vasoaktivních peptidu (VIP) a farmaceutických prípravku obsahujících tyto cyklické peptidy. Tyto farmaceutické prípravky se hodí pro léčbu bronchotracheálních konstrikčních porúch.

Dosavadní stav techniky

Vasoaktivní stŕevní peptid (VIP) byl poprvé objeven, izolován a purifikován ze stŕev vepŕe (U.S. patent č.

879 371). Tento peptid obsahuje dvacetosm (28) aminokyselín a vykazuje v rozsáhlé míŕe homologii vúči sekretinu a glukagonu [Carlquist a dalši, Horm. Metab. Res., 14, 28 29 (1982)]. VIP má následující sekvenci aminokyselín

His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-LeuArg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-IleLeu-Asn-NH2 [(SEQ ID NO:1)-NH₂]

Je známo, že VIP vykazuje široké spektrum biologických účinností v gastrointestinálním traktu a obéhovém systému. Díky tomu, že je VIP podobný gastrointestinálním hormonúm, jak bylo zjišténo, stimuluje sekreci slinivky bŕišní a žlučníku, glykogenolýzu v játrech, sekreci glukagonu a insulinu a aktivuje uvolňování hydrogenuhličitanu ve slivnivce bŕišní [Kerrins. C. a Said, S.I., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 142, 1014-1017 (1972); Domschke, S. a dalši, Gastroenterology, 73, 478-480 (1977)].

Neuróny obsahujicí VIP byly lokalizovány imunostanovením v bunkách endokrinního a exokrinního systému, stŕev a hladkého svalstva. [Polak J. M. a další, Gut, 15, 720-724 (1974)]. Zjistilo se, že VIP je neurofaktorem, který zpúsobuje uvolňování nékolika hormonú, včetné prolaktínu [Frawley L.S. a další, Neuroendocrinology, 33, 79-83 (1981)], thyroxinu [Ahren B. a další, Náture, 287, 343-345 (1980) a insulinu a glukagonu [Schebalin M. a další, Am. J. Physiology E., 232, 197-200 (1977)]. Také se zjistilo, že VIP stimuluje uvolňování reninu z ledvin in vivo a in vitro [Porter J.P. a další, Neuroendocrinology, 36, 404-408 (1983)]. Bylo zjišténo, že VIP je pŕítomen v nervech a nervových zakončeních dýchacích cest rúzných druhú zvíŕat a človeka [Dey R.D. a Said S.I.,

Fed. Proc., 39, 1062 (1980); Said S.I. a další, Ann. N.Y.

Acad. Sci., 221, 103-114 (1974)].

Kardiovaskulárni a bronchopulmonární účinky VIP jsou pŕedmétem zájmu, ponévadž se zjistilo, že VIP je silný vasodilatant a účiný relaxant hladkého svalu, který púsobí na periférni pulmonární a koronárni vaškulární lóže [Said S.I. a další, Clin, Res., 20, 29 (1972)]. Zjistilo se, že VIP má vasodilatační účinek na mozkové cévy [Lee T.J. a Berszin I., Science, 224, 898-900 (1984)]. Štúdie in vitro ukázaly, že vasoaktivní stŕevní peptid aplikovaný exogenním zpúsobem na mozkové tepny indukuje vasodilataci, což ukazuje, že VIP je možným mediátorem (transmiterem) cerebrální vasodilatace [Lee T. a Saito A., Science, 224, 898-901 (1984)]. Také v oku se VIP ukázal být silným vasodilatantem. [Nilson S.F.E. a Bili A., Acta Physiol. Scand., 121, 385-392 (1984)].

i

VIP snad má také regulační účinky na imunitní systém. O'Dorisio a další ukázali, že VIP múže modulovat proliferaci a migraci lymfocytú [J. Immunol., 135 792s-796s (1985)].

Jelikož VIP zpúsobuje relaxaci hladkého svalu a je normálne pŕítomen ve tkáních dýchacích cest, jak již bylo uvedeno výše, byla postavená hypotéza, že je endogenním mediátorem relaxace bronchiálního hladkého svalu [Dey R.D. a Said S.I. Fed. Proc., 39, 1962 (1980)]. Potvrdilo se, že tkané astmatických pacientú neobsahuj! žádný imunoreaktivní VIP, ve srovnání s tkaní normálních pacientú. To múže ukazovat na ztrátu VIP nebo VlP-ergických nervových vláken, spojenou s onemocnením astma [Ollerensahw S. a další New England J. Med., 320, 1244-1248 (1989)]. Pri zkoušení in vitro a in vivo se ukázalo, že VIP relaxuje tracheální hladký sval a poskytuje ochranu pred bronchokonstrikčními činidly, jako je histamín a prostaglandin ^F2a t Wasserman M.A. a další v Vasoactive Intestinal Peptide, S.I. Said, red., Raven Press, N.Y., 1982, str. 177-184; Said S.I. a další Ann. N.Y. Acad. Sci., 221, 103-114 (1974)]. Pri intravenózním podávání poskytuje VIP ochranu proti bronchokonstrikčním činidlúm, jako je histamín, prostaglandin F_2a, leukotrieny, faktor aktivující krevní destičky a proti bronchokonstrikcím, které jsou vyvolány antigenem [Said S.I. a další viz výše (1982)]. Bylo také prokázáno, že VIP inhibuje in vitro sekreci slizu v tkáních dýchacích cest človéka [Coles S.J. a další, Am. Rev. Respir. Dis., 124, 531-536 (1981)].

Pri podání ve formé intravenózni infuze humánním astmatickým pacientúm zpúsobuje VIP zvýšení maximálního prútoku pri výdechu a zajištuje ochranu pred bronchokostrikcí vyvolanou histaminem [Morice A.H. a Sever P.S., Peptides, 7, 279-280 (1986); Morice A. a další, The Lancet, II 1225-1227 (1983)]. Pulmonární účinky pozorované pri této intavenózní infuzi VIP jsou však doprovázeny kardiovasklárními vedlejšími účinky, zejména hypotenzí a tachykardií a také zčervenáním obličeje. Pri podávání ve formé intravenózních dávek, které nezpúsobovaly kardiovaskulárni účinky, nebyl VIP schopen ménit špecifickou prúchodnost dýchacích cest [Palmer J.B.D. a další, Thorax, 41, 663-666 (1986)]. Chybéjící účinnost byla vysvétlována nízkou úrovní podané dávky a pravdepodobné rýchlou degradací sloučeniny.

Pri podaní ve formé aerosólu človeku je natívni VIP jen málo účinný pri ochrane proti bronchokostrikci vyvloané histaminem (Altieri a další, Pharmacologist, 25, 123 (1983)]. Bylo zjišténo, že VIP nemá podstatný účinek na základní parametry dýchacích cest, ale naproti tomu vykazuje ochranný účinek proti bronchokonstrikci vyvolané histaminem, pri inhalačním podání lidem [Baŕnes P.J. a Dixon C.M.S., Am. Rev. Respir. Dis., 130, 162-166 (1984)]. Pri podávání ve formé aerosólu VIP údajné nezpusobuje tachykardii ani hypotenzi ve spojení s bronchodilatací [Said S.I. a další v Vasoactive Intestinal Peptide, S.I. Said. red., Raven Press, N.Y., 1928, str. 185-191].

Vzhledem k zajímavým a potenciálne klinicky využitelným biologickým účinnostem VIP, stala se tato látka cílem nékolika publikovaných syntetických programú, jejichž cílem bylo posílit jednu nebo více vlastností této molekuly. Takeyama a další publikovali analóg VIP, v némž je v poloze 8 kyselina aspartová nahrazena kyselinou glutamovou. Bylo zjišténo, že tato látka je méné účinná než nativní VIP [Chem. Pharm.

Bull., 28, 2265-2269 (1980)]. Wendlberger a další popsali prípravu analogu VIP, v némž je v poloze 17 methionin nahrazen norleucinem [Peptide, Proc. 16th Eur. Pept. Symp., 290-295 (1980)]. Bylo zjišténo, že tento peptid je stejné účinný jako nativní VIP, ponévadž je schopen vytésňovat VIP značený radioisotopem jódu z preparátu jaterní membrány.

Watts a Wooton publikovali sérii liňeárních a cyklických fragmentú VIP, které obsahují 6 až 12 zbytkú nativní sekvence (EP 184 309, EP 325 044, US 4 73 7487 a US 4 866 039). Turner a další oznámili, že fragment VIP (10-28) je antagonistou VIP [Peptides, 7, 849-854 (1986)]. Také u sbustituovaného analogu [4-Cl-D-Phe⁶,Leu¹⁷]-VIP bylo zjišténo, že se váže k receptorum VIP a antagonizuje účinnost VIP [Pandol S. a další, Gastrointest. Liver Physiol, 13, G553-G557 (1986)]. Gozes a další oznámili, že analóg [Lys¹, Pro², Arg³, Arg⁴,

Pro⁵, Tyr⁶]-VIP je kompetitivním inhibitorem VIP, který se váže k jeho receptorúm na gliových bunkách. [Endocrinology, 125, 2945-2949 (1989)]. Robberecht a další publikovali nékolik analogú VIP s D-zbytky substituovanými v N-konci nativního VIP [Peptides, 9, 339-345 (1988)]. Všechny tyto analógy se vážou méné pevné k receptorúm VIP a vykazují nižší účinnost než nativní VIP pri c-AMP aktivaci. Tachibana a Ito publikovali nékolik analogú VIP prekursorové molekuly v Peptide Chem., T. Shiba a S. Sakakibara, red., Prot. Res. Foundation, 1988, str. 481-486, JP 1 083 012, US 4 822 774]. Bylo zjišténo, že tyto sloučeniny jsou jedno- až trojnásobné silnejší bronchodilatanty než VIP a vykazují jedno- až dvojnásobné vyšší úroveň hypotensní účinnosti. Musso a další také publikovali nékolik nalogú VIP se substitucemi v polohách 6-7, 9-13, 15-17 a 19-28 [Biochemistry, 27,

8174-8181 (1988); EP 8 271 141, US 4 835 252]. U téchto sloučenin byla zjišténa stejná nebo nižší účinnost než u VIP pri väzbe na receptory VIP a pri biologické odpovédi. Bartfai a další publikovali sérii nékolkanásobné substituovaných analogú [Ľeu¹⁷]-VIP [W089/05 857].

Podstata vynálezu

Pŕedmétem vynálezu jsou cyklické vasoaktivní peptidové analógy. Po označením cyklický peptid se rozumí peptid, v némž je karboxylový konec v postranním ŕetézci jedné aminokyseliny v peptidovém ŕetézci kovalentné vázán k aminovému konci postranního ŕetézce jiné aminokyseliny v peptidovém ŕetézci, za vzniku amidové väzby. Kovalentním spojením dvou zbytkú aminokyselín v peptidovém ŕetézci vzniká kruhová štruktúra.

Biologická účinnost cyklických peptidú se múže podstatné lišit od účinnosti rodičovských lineárních analogú. Cyklické

peptidy jsou z hlediska konformace rigidnéjší a obsahuj í více dobre definovaných struktur. Tyto. zmeny se odrážejí v biologickém profilu cyklických peptidú. Cyklizace peptidového analogu múže prodloužit dobu účinnosti peptidu díky zvýšené rigidité, která jej činí méné citlivým vúči chemické a enzymatické degradaci. Také biologická dostupnosť cyklických peptidú se múže zvýšit díky zmenám fyzikálních vlastností peptidu, které jsou dúsledkem zpevnéní štruktúry. Dobre definovaný tvar cyklického peptidu múže také zvýšit špecifičnosť pro cílový receptor, ve srovnání se špecifičností lineárního peptidu a tím se múže snížit sklon k nežádoucím biologickým účinnostem, které doprovázejí žádoucí účinnosť.

Pŕedmétem vynálezu jsou nové cyklické peptidy obecného vzorce I

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-R₈-Asn-Tyr-Thr-R₁₂(I)

Leu-Arg-Lys-Gln-R₁₇-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- rx-fcEO τπ Βη-71-vi

Leu-Asp-Ser-R₂₆-Leu-R₂a-Y kde Rg predstavuje Asp, Glu, nebo Lys; Ŕ·^ predstavuje Arg, Lys, Orn nebo Asp; R₁₇ predstavuje Met nebo Nie; R₂₆predstavuje íle nebo Val; R₂g predstavuje Asn nebo Thr; X predstavuje vodík nebo hydrolýzovatelnou chrániči skupinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chrániči skupinu karboxyskupiny; a jejich farmaceutický vhodné soli.

Prednosť se pri tom dává peptidum obecného vzorce

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-R₈-Asn-Tyr-Thr-R₁₂Leu-Arg-Lys-GIn-NIe-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- _rv ,_OT,„ ^{1 1} [X-(SEQ ID N0:3)-Y]

Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y kde X, Y, R_q a R₁₂ ^mají stejný význam, jako v obecném vzorci I.

Pŕedmetem vynálezu jsou také nové cyklické peptidy obecného vzorce II

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-R_a-Asp-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-GIn- R, _r Ala-Val-Lys-Lys-Tyr(II) [X-(SEQ ID NO:4)-Y]

Leu-Asp-Ser-R₂6-Leu-R₂8-Y kde Rg predstavuje Asp nebo Asn; R₁₇ predstavuje Met nebo Nie; R₂₆ predstavuje íle nebo Val; R₂₈ predstavuje Asn nebo Thr; X predstavuje vodík nebo hydrolýzovatelnou chránící sku pinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu karboxyskupiny; a jejich farmaceutický vhodné soli.

Pŕednost se pritom dává peptidu obecného vzorce

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asn-Asp-Tyr-Ttir-LysLeu-Arg-Lys-GIn-NIe-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr[X-(SEQ ID NO:5)-Y]

Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y δ

kde X a Y mají stejný význam, jako v obecném vzorci II.

Pŕedmétem vynálezu jsou také nové cyklické peptidy obecného vzorce III

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Lys| (III)

Leu-Arg-Lys-Glu-Ri7-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- [X-(SEQ ID NO: 6)-Y]

Leu-Asp-Ser-R26-Leu-R2B-Y kde R₁₇ predstavuje Met nebo Nie; R₂₆ predstavuje íle nebo Val; R₂₈ paŕedstavuje Asn nebo Thr; X predstavuje vodík nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu aminoskupiny;

Y predstavuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu karboxyskupiny; a jejich farmaceutický vhodné soli.

Pŕednost se pritom dává peptidúm obecného vzorce

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Glu-NIe-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr[X-(SEQ ID N0:7)-Y]

Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y kde X a Y mají stejný význam, jako v obecném vzorci III.

Pŕedmétem vynálezu jsou také nové cyklické peptidy obecného vzorce IV

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-R₁₂Leu-Arg-Lys-GIn-R, 7-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr(IV?

[X-(SEQ ID NO:8)-Y]

Leu-Asp-Ser-R₂₆-Leu-R28-Y

- 9 kde R₁₂ predstavuje Arg nebo Lys; R₁₇ predstavuje Met nebo Nie; R₂₆ predstavuje íle nebo Val; R₂₈ predstavuje Asn nebo Thr; X predstavuje vodík nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu karboxyskupiny; a jejich farmaceutický vhodné soli.

Pŕednostními peptidy tohoto typu jsou peptidy vzorce

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Gln-NIe-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr[X-(SEQ ID

NO:9)-Y]

Leu-Asp-Ser-Val-I_eu-Thr-Y kde X a Y maj í stejný význam, jako v obecném vzorce IV.

Pŕedmétem vynálezu jsou také nové cyklické peptidy obecného vzorce V

X-RrR2-Asp-Ala-Val-R₆-Thr-R₈-Asn-R₁₀-Thr-R₁₂__ (v)

Leu-Arg-Ly s-R, ₆-R, _r Ala-R, g-Lys-Lys-R^[X-(SEQ ID NO:10)-Y]

L6U-R24Asp-R2g-R27~R28Y kde R₁ predstavuje His, N-CHg-Ala; R₂ predstavuje Ser nebo Ala; R₆ predstavuje

Q.

π ^{11 H} O kde Q predstavuje cyklohexyl-nižší alkyl nebo aryl-nižší alkyl; Rg predstavuje Asp, Glu nebo Ala; R_1Q predstavuje Tyr nebo R₆; R₁₂ predstavuje Arg nebo Lys; R₁₆ predstavuje Gin nebo Ala; R₁₇ predstavuje Met, Nie nebo Ala; R_ig predstavuje Val nebo Ala; R₂₂ predstavuje Tyr nebo R_g; R₂₄ predstavuje Asn nebo Ala; R_2g predstavuje íle, Val nebo Leu; R₂₇predstavuje Leu nebo Lys; R₂₈ predstavuje Asn, Thr, nebo Lys;

X predstavuje vodík nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu karboxyskupiny; nebo skupinu vzorce ^R29^-R30^-R31^-z' ^{kde r}29 Predstavuje Gly nebo Ala; R₃₀ predstavuje Gly nebo Ala;, R₃₁ predstavuje Ala, Met, Cys(Acm), nebo Thr; Z predstavuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chrániči skupinu karboxyskupiny; a jejich farmaceutický vhodné soli.

Symbol Q predstavuje prednostné skupinu vzorce

kde n predstavuje číslo 1 nebo 2 a každý ze symbolu X₃ a X₂nezávisle predstavuje vodík nebo skupinu vzorce OH, OCH₃, F, Cl, I, CH₃, CF₃, N0₂, CH₂, N(CH₃)₂, NHC0CH₃, NHC0C_gH₅ nebo c(ch₃)₃.

Výhodné predstavuje Q benzyl, p-fluorbenzyl, p-aminobenzyl, p-hydroxybenzyl, o-methyl, 1-methylnaftyl nebo 2-methylnaftyl. Nejvýhodnéji predstavuje Q benzyl.

Prednostními peptidy jsou peptidy obecných vzorcu’

X-RľR^Asp-Ala-Val-Re-Thr-Rg-Asn-RwThr-Ri^

I

Leu-Arg-Lys-R 1 θ-R 1 r Ala-R ig-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID NO:11)-Y]

Leu - R24-Asp-V at- R27~Th r-Y

X-R₁-R₂-Asp-Ala-Val-R6-Thr-R₈-Asn-Rio-Ttir-R₁2Leu-Arg-Lys-Ri6-Nle-Ala-Rig-Lys-Lys-R22· [X-(SEQ ID NO:12)-Y]

Leu-R24-Asp-Val-R27-Thr-Y

X-R! - R₂-Asp-Ala-Val-Re-Thr-R₈-Asn-R 1 o-Thr-LeuLeu- Arg-Lys-R 1₆-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID NO:13)-Y]

Leu-R₂4-Asp-Val-R₂7-Thr-Y

X-Ri-R2-Asp-Ala-Val-R6-Thr-Re-Asn-R₁o-'nir-LysLeu-Arg-Lys-R₁₆-Nle-Ala-R₁₉-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID NO:14)-Y]

Leu-R₂4-Asp-Val-R₂7-Thr-Y

X- R r R 2-Asp-Ala-Val-Re-Thr-Rg-Asn- R1 o-Thr-LysLeu-Arg-Lys-R ₁₆-Nle-Ala-Ala-lys-Lys-R22[X-(SEQ ID NO:15)-Y]

Leu-R₂4-Asp-Val-R₂7-Thr-Y

X-RvRg-Asp-Ala-Val-Rs-Thr-Ra-Asn-R^-Thr-R^

Leu-Arg-Lys-Ri6-Ri7-Ala-Ri9-Lys-I_ys-R22[X-(SEQ ID NO:

16) -Y]

Π

Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

X-RpR^Asp-Ala-Val-Rg-Thr-Ra-Asn-R^-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Ri6-Ala-Ala-Ala-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID NO :17)-Y]

Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

X-R₁-R2-Asp-Ala-Val-R₆-Thr-Ra-Asn-R₁o-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Ri6-Nle-Ala-R₁g-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID NO :18)-Y]

Leu-R24-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

X-R₁-R₂-Asp-Ala-Val-R6-Thr-R8-Asn-R₁₀-Thr-Lys·

Leu-Arg-Lys-Ri6-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22[X-(SEQ ID NO

19)-Y]

Leu-R₂4-Asp-Leu-Lys-Lys-Y

X-Ri-R2*Asp-Ala-Val-R6-Thr-Re-Asn-Rio-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-R22Leu-R₂4-Asp-Ľeu-Lys-Lys-Y [X-SEQ ID NO:70-Y]

X-R_rSer-Asp-Ala-Val-R₆-Thr-R8-Asn-R₁₀-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Gln-NIe-Ala-Ala-Lys-Lys-R^Leu-R₂4-Asp-Ľeu-Lys-Lys-Y [X-SEQ ID No:71-Y]

X-R_rAla-Asp-Ala-Val-R6-Thr-R₈-Asn-R₁₀-Thr-LysLeu-Arg-Lys-GIn-NIe-Ala-Ala-Lys-Lys-Rar

Leu-R₂4-Asp-Leu-Lys-Lys-Y [X-SEQ ID NO:72-Y]

X-R_rR₂-Asp-Ala-VakR6-Thr-R₈-Asn-R₁₀-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Ala-NIe-Ala-Ala-Lys-Lys-R^Leu-R₂4-Asp-Leu-Lys-Lys-Y [X-SEQ

ID NO:73-Y] kde X, Y, R]_ / ^2^z ^6' ^8' ^10' ^12' ^16' ^17' ^19^z^22^z ^24 ® R₂₇ mají stejný význam, jako v obecném vzorci V.

Vúbec nejvýhodnejší cyklický peptid podie vynálezu má strukturu Ac-[Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶, Lyxs²⁷'²⁸, Gly²⁹'³⁰, Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH₂].

Peptidy podie vynálezu poskytuj! prodlouženou relaxaci tracheobronchiálního hladkého svalu bez kardiovaskulárních vediejších účinkú, a proto jsou účinné pri léčbé bronchokonstrikčních porúch, jako je asthma.

Pŕedmétem vynálezu jsou nové analógy vasoaktivního intestinálního peptidu (VIP), které vykazují zýšenou a prodlouženou bronchodilatační aktivitu, aniž by mély pozorovatelné vedlejší účinky.

Pod označením nižší alkyl se v tomto poisu rozumej í alifatické uhlovodíkové skupiny s pŕímým nebo rozvétveným ŕetezcem, které obsahují 1 až 6 atomú uhlíku. Prednostní nižší alkylskupinou je methyl.

Pod označením aryl se v tomto popisu rozumej í jednojaderné aromatické uhlovodíkové skupiny, jako je fenyl, které mohou být nesubstituované nebo substituované v jedné nebo více polohách nižší alkylskupinou, nižší alkoxyskupinou, aminoskupinou, nitroskupinou, mono- nebo di-nižší alkylaminoskupinou, nižší alkylamidoskupinou nebo fenylamidoskupinou. Pod označením aryl se také rozuméjí vícejaderné arylové skupiny, jako je naftyl, které jsou poprípade substituovány jedním nebo více výše uvedených zbytkú. Prednostní arylskupinou je fenyl, který je poprípade substituován jedním atomem fluóru, nebo nesubstituovaný naftyl..

Symbolem X je v tomto popisu označováň substituent na aminickém dusíku amino-terminální aminokyseliny a symbolem Y substituent na karbonylové skupiné karboxy-terminální aminokyseliny. X múže pŕedstavovat atóm vodíku nnebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu aminoskupiny. Y múže pŕedstavovat hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou Chrániči skupinu karboxyskupiny.

Jako hydrolýzovatelné chránící skupiny aminoskupiny a hydrolýzovatelné chránící skupiny karboxyskupiny se múže používat jakýchkoliv konvenčních chránících skupín, které lze odštépovat hydrolýzou. Jako príklady takových skupín, kterých lze podie vynálezu použit, je možno uvést následující skupiny.

Pŕednostními chránícími skupinami aminoskupiny jsou skupiny vzorce

O

kde X₃ predstavuje nižší alkylskupinu nebo halogenovanou nižší alkylskupinu. Z téchto chránícíčh skupín se dává pŕednost zejména skupinám, v nichž X₃ predstavuje alkylskupinu s 1 až 3 atómy uhlíku nebo halogenalkylskupinu s 1 až 3 atómy uhlíku.

Pŕednostními chránícími skupinami karboxyskupiny jsou skupiny nižších alkylesterú, skupina NH₂ a skupiny nižších alkylamidú. Pŕednost se dává zejména alkylesterovým skupinám s 1 až 3 atómy uhlíku, skupiné NH₂ a alkylamidovým skupinám s 1 až 3 atómy uhlíku.

Pŕedmétem vynálezu je dále zpúsob výroby výše definovaných peptidú, farmaceutické prípravky na bázi téchto peptidu a použití téchto peptidú v kombinaci s netoxickým inertním terapetuticky vhodným nosičem pro léčbu bronchotracheálních konstrikčních porúch.

Zpúsob výroby cyklických polypeptidu podie vynálezu se vyznačuje tím, že se

a) chránéný peptid s odpovídající sekvencí aminokyselín, který je vázán k pryskyŕici, selektívne zbaví chránících skupín, za vzniku volné aminoskupiny v postranním ŕetézci a volné karboxyskupiny v postranním ŕetézci;

b) volná aminoskupina v postraním ŕetézci a volná karboxyskupina v postranním ŕetézci se spojí kovalentní väzbou za použití vhodného amidotvorného činidla; a

c) cyklizovaný peptid se zbaví chránících skupín a odštépí od pryskyŕice za použití vhodného deprotekčního a štépícího činidla, popŕípadé za prítomnosti dalších vhodných prísad, jako jsou látky zachycující kationty a získaný cyklický peptid se popŕípadé pŕevede na farmaceutický vhodnou súl.

Pŕedmétem vynálezu je také použití téchto cyklických peptidú pŕí výrobé farmaceutického prípravku, který se hodí pro léčbu bronchotracheálních konstrikčních porúch.

V tomto popisu se používá béžného názvosloví z oboru peptidú, pri némž se aminoskupina na N-konci znázorňuje nalevo a karboxyskupina na C-konci, napravo. Pod pojmem prírodní aminokyseliny se rozuméjí aminokyseliny, které se vysktytují v pŕírodních proteinech, t.j. Gly, Ala, Val, Leu, íle, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp a His. Pokud se múže aminokyselina vyskytovať v isomerních formách, rozumí se, že znázornená aminokyselina je v L-formé, pokud není výslovné uvedeno j inak.

Kromé výše uvedených zkratek se v tomto popisu pro označení aminokyselín, chránících skupín, rozpouštédel, reakčních činidel apod. používá následujících zkratek.

symbol význam

Ac	acetyl
Orn	ornithin
Nie	norleucin
Fmoc	9-fluorenylmethyloxykarbonyl
Fm	9-fluorenylmethy1
Boe	t-butyloxykarbonyl
Bom	benzyloxymethyl
^CH2^C12	methylenchlorid

wsisissittä

- 17 symbol ch₃cn

DMF

DIPEA

TFA

HOBT

DCC

DIC

BOP význam acetonitril d imethy1formamid

N,N-di isopropylethylamin trifluoroctová kyselina N-hydroxybenzotriazol N,N'-dicyklohexylkarbodiimid N,N'-diisopropykarbodiimid benzotriazol-l-yloxy-tri(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfát

N-Me-Ala

2-Nal p-F-Phe

FAB-MS hmotnostní spektrometrie Fast Atóm

Bombardment

Analógy nativní peptidové sekvence VIP se označuj! tak, že se pred označením VIP uvede v závorkách nahrazená aminokyselina. Derivatizace N-terminálni aminoskupiny, t.j.

derivatizace, která se projevuje ve významu symbolu X, je označována nalevo od substitucí vyznačených v závorkách. Sekvenční čísla, která jsou uvedená v závorkách napravo od označení VIP označuj í delece a adice aminokyselín a uvádéjí se vzhledem k číslování nnativní sekvence. Tak napríklad, Ac-[Lys¹², Nle¹⁷,Gly²⁹]-VIP(l-29)-NH₂ označuje polypeptid, jehož sekvence aminokyselín odpovídá sekvenci nativního humánního VIP, v níž však byla acetylskupinou nahrazen atóm vodíku na N-konci, lysinem byl nahrazen arginin v poloze 12 a norleucinem byl nahrazen methionin v poloze 17. Kromé toho, karboxyskupina asparaginu v poloze 28 byla kondenzována s glycinem, za vniku polohy 29. Označení -0H a -NH₂, které následuje po výrazu VIP nebo po výrazu v závorkách, se vzťahuje k volné kyselinové nebo amidové formé polypeptidu. V prípade, že tato označení chybéjí, rozumí se, že výraz zahrnuje obé tyto formy.

Jak již bylo uvedeno výše, cyklickým peptidem podie vynálezu je peptid, v némž je karboxy-konec jedné aminokyseliny v postranním ŕetézci peptidu kovalentné vázán k amino-konci jiné aminokyseliny v postranním ŕetézci peptidu, za vzniku amidové väzby. Pro znázornéní cyklického peptidu se používá nékolik názvoslovných variant a nékolika symbolu. Jejich príklady jsou uvedený dále.

Ac-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Ttir-Asp-Asn-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-GIn-NIe-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- ^a

Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-NH₂ [Ac-(SEQ ID NO;20)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nie¹⁷, Val²Thr²⁸]-VIP cyklo(8->l2) b. [Ac-(SEQ ID NO:20)-NH₂]

Ac- [Lys¹², Nie¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸ ] -VIP cyklo (Asp⁸->Lys¹²) c. [Ac-(SEQ ID NO:20)-NH2]

Tri štruktúry uvedené výše (a - c) a doprovodná reprezentace používající identifikačního čísla sekvence (SEQ ID NO:) a odvolávající se na dále uvedený seznam sekvencí, všechny predstavuj! a definují stejný polypeptid, jehož sekvence aminokyselín odpovídá sekvenci nativního humáního VIP, v níž však byl atóm vodíku na N-konci substituován acetylskupinou, v poloze 12 byl arginin nahranzen lysinem, v poloze 17 byl methionin nahrazen norleucinem, v poloze 26 byl isoleucin nahrazen valinem a v poloze 28 byl asparagin nahrazen threoninem. Kromé toho byla mezi postranní karboxyskupinou aspartové kyseliriy v poloze 8 a postranní aminoskupinou lysinu v poloze 12 vytvorená amidová vazba, za vzniku cyklického peptidového analogu. Výše uvedené reprezentace štruktúry peptidu se považuj í za ekvivalentní a vzájemné zaménitelné.

Označení R_n pro aminokyselinu v poloze n v jedné z uvedených struktur a označení Xaa pro aminokyselinu v poloze n v odpovídájící sekvenci v seznamu sekvencí, uvedeném dále, jsou ekvivalentní a vzájemné zaménitelné v téch pŕipadech, kdy Xaa predstavuje výber ze dvou nebo více aminokyselín.

V cyklických peptidech podie vynálezu platí následujici konfigurace, pokud není uvedeno jinak:

- 20 Aminokyselina v ŕetézci

Vázaný konec aminokyseliny pro vytvorení cyklického peptidu

Lys	e-amino (e =	epsilon)
Orn	S-amino (S =	delta)
Asp	β-karboxy (β	= beta)
Glu	ýl-karboxy	= gamma)

Reprezentatívni sloučeniny podie vynálezu zahrnuj í peptidy s následujícími sekvencemi aminokyselín:

- 21 Ac- [Lys¹², Nie¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸] -ypp cyklo (Asp⁸—»Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:20)-NH₂]

Ac- [Glu⁸, Lys¹²,Nie¹⁷, Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Glu⁸->Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:21)-NH₂]

Ac- [Asn⁸, Asp⁹,Lys¹², Nie¹⁷, Val^{2 6},Thr²⁸] -VIP cyklo. ,Asp⁹->Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:22)-NH₂]

Ac- [Orn¹², Nie¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸] -VIP cyklo (Asp⁸-»Orn¹²) [Ac-(SEQ ID NO:23)-NH₂]

Ac-[Lys⁸, Asp¹², Nie¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyKlo (Lys⁸-»Asp¹²) [Ac-(SEQ ID NO:24)-NH₂]

Ac- [Glu⁸, Orn¹², Nie¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Glu⁸-*Orn¹²) [Ac-(SEQ ID NO:25)-NH₂]

Ac- [Lys¹², Glu¹⁶, Nie¹⁷, Val²⁶, Thr²⁸ ] -VIP cyklo (Lys¹²—Kjlu¹⁶) [Ac-(SEQ ID NO:26)-NH₂]

Ac-[Lys¹², Nie¹⁷, Asp²⁴, Val^{2 6}, Thr²⁸ ] -VIP cyklo (Lys²⁰->Asp^{2 4}) [Ac-(SEQ ID NO:27)-NH₂]

Ac-[Lys¹², Nie¹⁷, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²-L-*Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:28)-NH₂]

Ac- [Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶,Thr²⁸] -VIP cyklo (Lys²¹—KAsp²^) [Ac-(SEQ ID NO:29)-NH₂]

Ac-(p-F-Phe⁶,2-Nal¹⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸, Gly²⁹' ²⁰, Met²¹] -VIP cyklo (Lys^2l->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:30)-NH₂]

Ac-[Glu⁸, Orn¹²,Nie¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:31)-NH₂]

Ac- [p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²²,Val²⁶,Thr²⁸, Gly²⁹'²⁸, Cys (Acm) ²¹]-VIP cyklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:32)-NH₂]

Ac- [Ala², Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²²,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:33)-NH₂J

Ac- [N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP _Cyklo (Lys²¹—?Asp²²) [Ac-(SEQ ID NO:34)-NH₂]

Ac- [2-Nal¹⁸,Leu¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²²,Val²⁶,Thr²⁸]-VI? cyklo (Lys²¹—>Asp²²) [Ac-(SEQ ID NO:35)-NH₂]

Ac- [O-CH3-Tyr¹⁰,Leu¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²²,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—JAsp²²) [Ac—(SEQ ID NO:36)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe⁶,p-NH₂-Phe¹⁰,Leu¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²², Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac—(SEQ ID NQ:37)-NH₂]

- 23 Ac-[Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹, Asp²²,Leu²®, Lys²⁷'28]-vip cyklo (Lys²¹—»Asp²®) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH₂]

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²®, Leu²®,Lys²⁷' 28 ]-vip cyklo (Lys²¹—» Asp²®) [Ac-(SEQ ID NO:3 9)-NH₂]

Ac-[Glu®,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²®,Leu²®,Lys²⁷1 28]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²®) [Ac-(SEQ ID NO:40)-NH₂]

Ac-[O-Me-Tyr¹®,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹, Asp²®,Val²®,Thr²®]-VIP cyklo (Lys 21—»Asp²®) [Ac-(SEQ ID NO:41)-NH₂]

Ac-[Glu®,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²®,Leu² ®,Lys²⁷'²®,Ala^{2 9-21}]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²®) [Ac-(SEQ ID NO:42)-NH₂]

Ac-[Ala²,Glu®,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²®,Leu²®,Lys^27,2®, Ala^29-21]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²®) [Ac-(SEQ ID NO:43)-NH₂]

Ac- [N-Me-Ala¹,Glu®,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²®,Leu²®, Lys²⁷> ²®]-VIP cyklo (Lys²¹—»Asp²®) [Ac-(SEQ ID NO:44)-NH₂]

Ac-[p-F-Phe®,Glu®,Lys¹²,Nie¹²,Ala¹⁹,Asp²®,Leu² ®, Lys²⁷'²® ]-VI? cyklo (Lys²¹—>Asp²®) [Ac-(SEQ ID NO:45)-NH₂]

Ac-[1-Nal®,Glu®,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²®,Leu²®,Lys²⁷> ²®]-VIP cyklo (Lys²¹—> Asp²®)

- ²⁴ [Ac-(SEQ ID NO:46)-NH₂]

Ac- [Glu⁸,p-NH₂-Phe¹Q, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁸, Leu² θ, Lys²⁷' 28 VIP cyklo (Lys²¹—»Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:47)-NH₂]

Ac- [Glu⁸,p-CH3-Tyr¹⁸, Lys¹², Nie¹⁷,Ala¹⁹, Asp²⁸, Leu²Lys²⁷' ²8 VIP cyklo (Lys²¹->Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:48)-NH₂]

Ac- [p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁸,Val²⁶,Thr²8]-VIP cykle (Lys²¹—>Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:49)-NH₂]

Ac-[1-Nal⁶,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁸,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:50)-NH₂]

Ac- [Ala², Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁸, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸ , Gly² 8/30, Thr⁸¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:51)-NH₂]

Ac- [Glu⁸, Lys¹²,Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁸, Leu^{2 6}, Lys^{2 7} < ^{2 8},

Gly²⁹'⁸θ,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac—(SEQ ID NO:52)-NH₂]

Ac- [Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁵, Lys²⁷> ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—»Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:53)-NH₂]

Ac-[p-NH₂-Phe¹⁰,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁸,Val²⁶, Thr²⁸ j-VI? cyk (Lys²¹—>Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:54)-NH₂]

Ac- [ Lys ¹² f Nie b7, Ala¹⁹, m-OCH3-Tyr²²1 Asp²⁵ _f Val^{2 6}, Thr 2 8 ]' - VIP cyklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:55)-NH₂]

Ac-[Lys¹²,Nie¹⁷, Ala¹⁹, m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸]-VI? cvkl (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac—(SEQ ID NO:56)-NH2]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,m-OCH3-Tyr²²,Asp²⁵,Leu^{2 6},

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:57)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸] VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac—(SEQ ID NO:58)-NH₂]

Ac-[Ala⁸, Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VI? cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:59)-NH₂]

Ac-[Glu⁸, Lys¹²,Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys^27,28]-VI? cykLo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NH₂]

Ac-[Ala⁸, Lys¹²,Ala¹⁶,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Ala² 4, Asp²⁵, Leu^{2 6},Lys²⁷'²⁸] VIP cyklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:61)-NH₂]

Ac-[Ala⁸, Lys¹²,Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵ ,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VI? cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:62)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²5,Leu^{2 6}, Lys²⁷' - ⁸ ] -VI? cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:63)-NH2l

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²®, Lys²⁷'²⁸ ]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:64)-NH2l

Ac-[Glu⁸, Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸' Gly²⁹'³0,Thr³¹]VIP cyj<lo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH2l

Ac- [p-F-Phe⁶, Glu⁸, Lys¹²,Nle¹⁷, Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸, Gly²⁹'³θ,Thr³¹]-VIP cyfclo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH2]

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²³,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸, Gly²⁹'³⁰, Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac—(SEQ ID NO:67)-NH₂]

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷, Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸, Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:68)-NH2]

Ac-[Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,Ala^29-31]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:69)-NH2]

Sloučeniny podie vynálezu je možno snadno syntetizovať jakýmkoliv konvenčním postupem, který se hodí pro tvorbu peptidové väzby mezi aminokyselinami. Takové konvenční postupy zahrnuj í napríklad všechny postupy provádéné v roztoku, které umožňují kondenzaci volné a-aminoskupiny aminokyseliny nebo jejího zbytku, v níž nebo v némž je karboxyskupina nebo jiná reaktívni skupina chránéna, s volnou primárni karboxyskupinou jiné aminokyseliny nebo jejího zbytku, v níž nebo v némž je aminoskupina nebo jiná reaktívni skupina chránéna.

Zpúsob syntetizace sloučenin podie tohoto vynálezu se múže provádét postupem, pri némž se každá aminokyselina v požadovaném sledu pridává po jedné postupné k jiné aminokyseliné nebo jejímu zbytku nebo postupem, pri némž se nejprve konvenčním zpúsobem syntetizuj! peptidové fragmenty s požadovanou sekvencí aminokyselín a potom se tyto fragmenty kondenzují, za vzniku požadovaného peptidú.

Takové konvenční postupy syntetizace nových sloučenin podie vynálezu zahrnuj í také napríklad všechny postupy syntézy peptidú provádéné v pevné fázi. Pri takových postupech se nové sloučeniny podie vynálezu mohou syntetizovať tak, že se k rostoucímu peptidovému ŕetézci postupné, po jednom, vážou požadované zbytky aminokyselín, v souladu s obecnými princípy metód syntézy v pevné fázi [Merrifield R. B., J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149-2154 (1963); Barany a další, The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology, sv. 2, Gross E. a Meinhofer J. vyd. Academic Press 1-284 (1980)].

Pro rúzné chemické zpúsoby syntézy peptidú je společná ochrana postranních reaktivních skupín rúzných zbytkú aminokyselín vhodnými chránícími skupinami, které zabraňuj í aby na téchto místech probéhla chemická reakce, dokud nejsou tyto chrániči skupiny nakonec odstranény. Obvyklá je také ochrana α-aminoskupiny na aminokyseline nebo jejím fragmentu, v prúbéhu reakce této kyseliny nebo fragmentu, která probihá na karboxylové skupine. Po ní následuje selektívni odstranéní chránící skupiny α-aminoskupiny, čímž se umožní, aby následu jici reakce probíhala na tomto místé. Pri postupech provádéných syntézou v pevné fázi byly sice publikovány špecifické chránící skupiny, je však treba zduraznit, že každá aminokyselina múže být chránená chránící skupinou bežné používanou pro tuto aminokyselinu pri syntetických postupech provádéných v roztokové fázi.

α-aminoskupiny se mohou chránit vhodnými chránícími skupinami, které jsou zvolený ze souboru zahrnujícího chrániči skupiny, které vytváŕejí s aminoskupinou seskupení typu aromatického urethanu, jako je benzyloxykarbonyl (Z) a subtituovaný benzyloxykarbonyl, jako je p-chlorbenzyloxykarbonyl, p-nitrobenzyloxykarbonyl, p-brombenzyloxykarbonyl, p-bifenylisopropyloxykarbonyl, 9-fluorenylmethyloxykarbonyl (Fmoc) a p-methoxybenzyloxykarbonyl (Moz); ghránící skupiny typu alifatického urethanu, jako je terc. butyloxykarbonyl (Boe), diisopropylmethyloxykarbonyl, isopropyloxykarbonyl a allyloxykarbonyl. Z chránících skupin α-aminoskupiny se nejvetší pŕednost dává Boe.

Karboxylové skupiny mohou být chránény vhodnou chrániči skupinou, která je zvolená ze souboru aromatických esterových skupin, jako je benzylesterová (OBzl) nebo benzylesterová skupina, substituovaná nižší alkylskupinou, halogenem, nitroskupinou, thioskupinou nebo substituovanou thioskupinou, napríklad alkylthioskupinou obsahující 1 až 7 atomú uhlíku v alkylovém ŕetézci; alifatických esterových skupin, jako je nižší alkylesterová, terc.butylesterová (Ot-Bu), cyklopentylesterová, cyklohexylesterová (OcHx), cyklopentylesterová a 9-fluorenylmethylesterová skupina (OFm). Pro glutamovou kyselinu (Glu) se nejvetší pŕednost dává skupine OBzl a OFm a pro aspartovou kyselinu (Asp) se dává nejvétší pŕednost skupine OChx, OBzl a OFm.

Hydroxylové skupiny mohou být chránény vhodnou chránící skupinou, která je zvolená ze souboru skupin, které s hydroxyskupinou vytváŕejí etherové seskupení, jako je napríklad benzyl (Bzl) nebo benzyl substituovaný nižší alkylskupinou, halogenem [jako je 2,6-dichlorbenzyl (DCB)], nitroskupinou nebo methoxyskupinou; terc.butyl (t-Bu), tetrahydropyranyl a trifenylmethyl (trityl). U serinu (Ser) a threoninu (Thr) se dává nejvétší pŕednost skupine Bzl a u tyrosinu (Tyr) se dává nejvétší pŕednost skupinám Bzl a DCB.

Postranní aminoskupiny je možno chránit vhodnými chránícími skupinami, které jsou zvolenny ze souboru zahrnuj ícího chránící skupiny, které s aminoskupinou vytváŕejí seskupení typu aromatického urethanu, jako je benzyloxykarbonyl (Z) a subtituovaný benzyloxykarbonyl, jako je p-chlorbenzyloxykarbonyl, 2-chlorbenzyloxykarbonyl (2-C1-Z), p-nitrobenzyloxykarbonyl, p-brombenzyloxykarbonyl, p-bifenylisopropyloxykarbonyl, 9-fluorenylmethyloxykarbonyl (Fmoc) a p-methoxybenzyloxykarbonyl (Moz); nebo seskupení typu alifatického urethanu, jako je terc.butyloxykarbonyl (Boe), diisopropylmethyloxykarbonyl, isopropyloxykarbonyl a allyloxykarbonyl. U ornithinu (Orn) se dává nejvétší pŕednost skupiné Z a u lysinu (Lys) se dává nejvétší pŕednost skupiné 2-C1-Z a Fmoc.

Guanidinoskupiny mohou být chránény vhodnou chránící skupinou, která je zvolená ze souboru zahrnuj ícího nitro, p-toluensulfonyl (Tos), Z,'adamantyloxykarbonyl a Boe. U argininu (Arg) se dává nejvétší pŕednnost dává skupiné Tos.

Postranní amidoskupiny mohhou být chránény xantylovou skupinou (Xan). U asparaginu (Asn) a glutaminu (Gin) se prednostné nepoužívá žádné ochrany.

Imidazolové skupiny mohou být chránény vhodnou chránící skupinou, zvolenou ze souboru zahrnujícího p-toluensulfonyl (Tos), 9-fluorenylmethyloxykarbonyl (Fmoc), trifenyImethy1 (trityl), 2,4-dinitrofenyl (Dnp), Boe a benzyloxymethyl (Bom). U histidinu se dává nejvétší pŕednost skupinám Tos a Bom.

Pokud není uvedeno jinak, jsou procentické údaje u pevných látek v pevných smésích uvádény v procentech hmotnostních, u kapalných látek v kapalných smésích v procentech objemových a u pevných látek v kapalných smésích v procentech hmotnost/objem, která po vynásobení faktorem 10 odpovídají koncentračním údajúm gram/litr. Pokud není uvedeno jinak, rozumí se také, že dodavatelé reakčních činidel a prístroju, kteŕí jsou uvedení dále, nejsou obligatórni a odborníci v tomto oboru si mohou zvolit obdobná reakční činidla nebo prístroje od j iných dodavatelú.

Všechna rozpouštédla, t.j. isopropylalkohol (iPrOH), methylenchlorid (CH₂Cl₂) a dimethylformamid (DMF) byly zakoupeny od firmy Fisher nebo Burdick & Jackson a bylo j ich používáno bez prídavné destilace. Kyselina trifluoroctová byla akoupena· od firmy Halocarbon a bylo j i používáno bez dalšího čišténí. Diisopropylethylamin (DIPEA) byl zakoupen od firmy Pfaltz a Bauer a pred použitím byl pŕedestilován za prítomnosti oxidu vápenatého a ninhydrinu. Dicyklohexylkarbodiimid (DCC) a diisopropylkarbodiimid (DIC) byly zakoupeny od firmy Fluka a bylo j ich používáno bez dalšího čišténí. Hydroxybenzotriazol (HOBT) a 1,2-ethandithiol (EDT) byly zakoupeny od firmy Sigma Chemical Co. a bylo j ich používáno bez dalšího čišténí. Chránéné aminokyseliny byly obecné v konfiguraci L a byly zakoupeny od firmy Chemical Dynamics Corp. nebo Bachem. Čistota téchto látek byla pred použitím potvrzena chromatografií na tenké vrstve, NMR a teplotou tání. Sloučeniny Boc-O-Me-Tyr,

Boc-2-Nal a Boc-p-F-Phe byly pripravený podie citace Bolin D.

R., US patentová prihláška č. 374 503. Sloučeniny Boc-Asp(OFm) a Boc-Glu(OFm) byly pripravený podie citace Bolin D.R. a další, Org. Prep. Proc. Int., 21, 67-74 (1989). Benzhydrylaminová pryskyŕice (BHA) je kopolymerem styrénu s 1 % divinylbenzenu (o zrnéní 100 až 200 nebo 200 až 400 mesh, t.j. 75 až 150 nebo 38 až 75 pm) a byla zakoupenna od firmy Biomega, Bachem, Omni nebo Advanced Chemtech. Celkový obsah dusíku v téchto pryskyŕicích byl obvykle v rozmezi od 0,3 do 1,2 mekv./g.

Chromatografie na tenké vrstve (TLC) byla provádéna na sklenených deskách s nánosem silikagélu (desky 60 F254 od firmy Merck), za použití vhodných rozpouštédlových systémú. Detekce slučenin byla provádéna pomoci UV-fluorescence (absorpce pri 254 nm), barvení jodem nebo postŕikem ninhydrinem (v prípade primárních a sekundárních aminú).

Pri analýze složení aminokyselín se peptidy hydroýzují v 6N kyseline chlorovodíkové obsahující 1 až 4 mg fenolu, pri teloté 115 °C, po dobu 22 až 24 hodin, v uzavŕené evakuované hydrolytické trubce. Analýzy se provádéjí buď za použití analyzátoru aminokyselín Beckman 121M nebo analytického systému pro aminokyseliny na bázi HPLC (Waters), pŕičemž se používá buď pryskyŕice Waters Cat Ex nebo sloupce Pierce AA511 a ninhydrinové detekce.

Vysoce výkonná kapalinová chromatografie (HPLC) se provádí za použití zaŕízení LDC, které obsahuje čerpadla Constametric I a III, programovací zaŕízení pro ŕízení složení rozpouštédla Gradient Master a mixéru a detektoru s ménitelnou vlnovou délkou UV záŕení Spectromonitor III. Analytická HPLC se provádí na reversní fázi, za použití sloupcu Waters pBondapak C_1Q (0,4 x 30 cm). Preparativní separace pomoci HPLC se provádéjí na kolonách Whatman Magnum 20 partisil 10 ODS-3 (2 x 25 cm nebo 2 x 50 cm), které jsou vybavený pŕedkolonou Waters Guard-Pak C₁₈. Gelová chrómatografie se provádi na koloné o rozmérech 2 x 85 cm, za použití peristaltického čerpadla LKB varioperpex a detektoru s ménitelnou vlnovou délkou UV záŕení (IBM).

Peptidy se prednostné pripravuj í syntetickým postupem v pevné fázi, za použití metódy, kterou obecné popsal Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149 (1963), i když je možno použít, jak bylo uvedeno výše, j iných ekvivalentních syntetických metód, které jsou známé v tomto oboru. Syntéza v pevné fázi se zahajuje na C-konci peptidu kondenzací chránené α-aminokyseliny s vhodnou pryskyŕicí. Takovou výchozí látku je možno pŕipravit pripojením a-amino-chránéné aminokyseliny esterpvou väzbou k chlormethylované pryskyŕicí nebo hydroxymethylované pryskyŕicí nebo amidovou väzbou k benzhydrylaminové pryskyŕicí (BHA) nebo p-methylbenzhydrylaminové pryskyŕicí (MBHA). Príprava hydroxymethylované pryskyŕice je dobre známá v tomto oboru. Chlormethylované pryskyŕice jsou obchodné dostupné a jejich výroba je v tomto oboru také dobre známa. Nosičové pryskyŕice BHA a MBHA jsou obchodné dostupné a obvykle se j ich používá, když má požadovaný syntetizovaný peptid na C-konci skupinu nesubstituovaného amidu.

První.aminokyselina, která se mmá kondenzovať s pryskyŕicí BHA, se obvykle pŕidává ve formé symetrického anhydridu Boc-aminokyseliny, za použití dvou až deseti ekvivalentú aktivované aminokyseliny na ekvivalent dusíku pryskyŕice. Po kondenzací se pryskyŕice promyje a za vakua vysuší. Zakotvení aminokyseliny na pryskyŕicí se múže stanovit analýzou alikvotního vzorku Boc-aminokyselina-pryskyŕice na aminokyselinu. Stupeň navázání aminokyseliny na pryskyŕicí činí obvykle 0,2 až 0,4 mmol/g. Všechny nezreagované aminoskupiny je možno blokovať reakcí pryskyŕice s acetanhydridem a diisopropylethylaminem v methylenchloridu.

Po adici Boc-aminokyseliny se pryskyŕice podrobí nekolika opakovaným cyklúm, pri nichž se postupné adují aminokyseliny. Chrániči skupina Boe α-aminoskupiny se odstráni za kyselých podmínek. K tomuto účelu se múže použi kyseliny trifluoroctové (TFA) v methylenchloridu, kyseliny chlorovodíkové v dioxánu nebo smési kyseliny mravenčí s kyselinou octovou. Prednostné se používá roztoku kyseliny trifluoroctové v methylenchloridu o koncentrací 50 % objemových. Tento roztok múže také obsahovat 1 až 5 % objemových EDT nebo dimethylsulfidu, jako látky zachycující terc. butylkarboniové ionty. Múže se také použiť jiných standardních štépících činidel, která jsou známa v tomto oboru.

Po odstranéní chrániči skupiny α-aminoskupiny se postupné kondenzací pripojuj í další chránené aminokyseliny v požadovaném poradí, aby se získal meziprodukt, kterým je kondenzační produkt chránéného peptidu a pryskyŕice.

Aktivační činidla, kterých se použícá pri kondenzaci aminokyselín syntetickým postupem pro výrobu peptidu v pevné fázi, jsou dobre známá v tomto oboru. Jako vhodných reakčních činidel pro takové syntézy je napríklad možno použiť benzotriazol-l-yloxytri(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfátu (BOP), dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) a diisopropylkarbodiimidu (DIC). Pŕenostné se používá DCC a DIC. Jiná aktivační činidla, kterých lze použiť, jsou popsána v citaci Barany a Merrifield, The Peptides, sv. 2, J. Meienhofer, vyd. Academic Press, 1979, str. 1 - 284. Pro optimalizaci syntetických cyklú se mohou ke kondenzačním smésím pŕidávat ruzná činidla, jako je 1-hydroxybenzotriazol (HOBT), Nhydroxysukcinimid (HOSu) a 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-l,2, 3-benzotriazin (HOOBT). Prednosť se dává HOBT.

Predpis pro typický syntetický cyklus lze popsat následujícím zpusobem:

Predpis 1

stupeň	reakční činidlo	doba
1	^CH2^C12	2 x 30 s
2	50% TFA/CH₂C1₂	1 min
3	50% TFA/CH₂C1₂	15 min
4	CH₂ ^c12	2 x 30 s
5	iPrOH	2 x 30 s
6	CH₂ ^c12	4 x 30 s
7	6% DIPEA/CH₂C1₂	3x2 min
8	ch₂ci₂	3 x 30 s
9	kondenzace	10 min -
10	^CH2^C12	2 x 30 s
11	iPrOH	1 x 30 s
12	^CH2^C12	1 x 30 s
13	DMF	2 x 30 s
14	Ch₂Cl₂	3 x 30 s

Rozpouštédel pro všechny promývací a kondenzační t (kopulační) stupné se používá v množství 10 až 40 ml/g pryskyŕice. Kondenzace se provádéjí bud za použití pŕedem » vytvorených symetrických anhydridú Boc-aminokyselin nebo derivátú O-acylisomočoviny. Obvykle se pŕidává 2 až 10 ekvivalentú aktivované Boc-aminokyseliny na ekvivalent aminopryskyŕice, za použití methylenchloridu, jako rozpouštédla. Boc-Arg(Tos), Boc-Gln, Boc-Asn, Boc-His(Tos) a Boc-His(Bom) se kondenzuj í ve 20 až 25% dimethylformamidu v dichlormethanu. Boc-Asn, Boc-Gln a Boc-His(Bom) se kondenzuj ve formé HOBT-aktivovaných esterú, za účelem minimalizace známých vediejších reakci.

- 35 Peptidy se obvykle cyklizují za použití známých metód v tomto oboru, nasledujícím zpúsobem. Na místech aminokyseliny v peptidu, kde mají být pripojený postranní ŕetézce, se použivá rúzných chránících skupin. Pro aminokyseliny s amínovým místem, Lys a Orn, se do peptidového ŕetézce zabuduj í N^- a N^-Fmoc-deriváty. Pro aminokyseliny s karboxylovým místem, Asp a Glu, se zabuduj í 0^- a O^-Fm-deriváty. Na peptid, který je stále ješté vázán k pryskyŕici, se púsobí 20 až 40% piperidinem v dimethylformamidu, aby se selektivné odstranily chránící skupiny Fmoc a Fm. Volná postranní aminoskupina a karboxyskupina se potom intramolekulárné kovalentné spojí púsobením vhodného amidotvorného činidla, jako je difenylfosforylazid (DPPA), DCC,

DIC nebo BOP. Pŕednost se dává použití DCC a BOP.

Predpis pro typický cyklizační postup zahrnuje následující stupné:

Predpis 2

stupeň	reakční činidlo	doba
1	DMF	1 x 30 s
2	20-40% piperidin/DMF	1 min
3	DMF	1 x 30 s
4	20-40% piperidin/DMF	20 min
5	iPrOH	1 x 30 s
6	DMF	1 X 30 s
7	iPrOH	2 x 30 s
8	DMF	2 x 30 s
9	6% DIPEA/CH₂C1₂	2x2 min
10	ch₂ci₂	1 x 30 Ξ
11	DMF	1 X 30 S
12	kondenzace	1 - 24 h

Predpis 2 - pokračování

stupeň	reakční činidlo	doba
13	iPrOH	1 x 30 s
14	ch₂ci₂	1 x 30 s
15	DMF	2 x 30 s
16	ch₂ci₂	3 x 30 s

Kondenzační reakce se v prúbéhu syntézy monitoruj í Kaiserovým ninhydrinovým testem, aby se , zj istil stupeň konverze [Kaiser a další, Anál. Biochem., 34, 595 - 598 (1970)]. U Boc-Arg(Tos), Boc-Asn a Boc-Gln byla pozorována pomalá reakční kinetika. Pokud je kondenzace neúplná, provede se bud’ nová kondenzace s čerstvé pripravenou aktivovanou kyselinou nebo se reakční produkt blokuje púsobením acetanhydridu na kondenzační produkt peptidu s pryskyŕicí, jak to bylo popsáno výše. Úplné sestavené produkty peptid-pryskyŕice se nékolik hodin suší za vakua.

V prípadé každé sloučeniny se odstraňování blokovacich skupin a odštépování petidu od pryskyŕice provádi následujícím zpúsobem. Obvykle se na 1 g produktu peptidpryskyŕice púsobí 25 až 100 μΐ ethandithiolu, 1 ml anisolu a 9 ml kapalného fluorovodíku, pri 0 °C po dobu 45 až 60 minút v zaŕízení pro práci s fluorovodíkem, které je zhotoveno z teflonu (Peninsula). Alternativné se používá modifikovaného dvoustupňového štépícího postupu [Tam a další, Tetrahedron Letters, 23, 2939-2940 (1982)], pri némž se na produkt peptid-pryskyŕice púsobí 3 ml dimethylsulfidu a 1 ml fluorovodíku, po dobu 2 hodin pri 0 °C, potom se tékavé látky odparí a na produkt se púsobí 90% fluorovodíkem. Tékavé látky se za vakua odparí pri teploté ledové lázné. Zbytek se promyje 2 nebo 3 20ml dávkami jednak diethyleetheru a jednak ethylacetátu a potom se odfiltruje. Peptidy se oddelí od pryskyŕice promytím produktu 3 nebo 4 20ml dávkami 10% kyseliny octové, po némž se promývací louhy pŕefiltrují.

Spojené vodné filtráty se lyofilizují, čímž se získá surový produkt.

Surové peptidy se nejprve prečistí gelovou.chromatografií na náplni Sephadex G-25 fine, aby se oddélily monomerní látky od oligomerních látek. Peptidy se rozpustí v minimálním objemu 10% kyseliny octové a nanesou na sloupec gélu. Sloupec se eluuje 10% kyselinou octovou pri prutoku 0,5 až 1,5 mml/min. Eluát se monitoruje pri 254 nm a frakce obsahujicí požadovaný pás se spojí a lyofilizují. Tak se získají zpola pŕečišténé produkty.

Čistení zpola prečistených peptidu se obvykle provádi preparativní HPLC. Peptid se nanáší na sloupec v minimálním objemu buď 1% kyseliny octové nebo 0,1% kyseliny trifluoroctové. Gradientová eluce se zaháji s 10% pufrem B v pufru A, gradient od 10% do 25% pufru B trvá 10 minút a gradient od 25% do 35% pufru B trvá 3 hodiny (pufr A: 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové ve vodé, pufr B: 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetonitrilu). Prútoková rychlost pri eluci je 8,0 ml/min. Detekce UV záŕením se provádi pri 220 nm.

Frakce se odebírají v intervalech 1,5 až 2,5 minutý a jejich složeni se kontroluje analytickou HPLC. Frakce o vysoké čistote se spojí a lyofilizují.

Čistota výsledných produktú se kontroluje analytickou HPLC na sloupci s reversní fází (viz výše). Obvykle se používá gradientové eluce s gradientem od 20% do 40% pufru B v pufru A (pufr A: 0,022% kyselina trifluoroctová ve vodé, pufr B: 0,022% kyselina trifluoroctová v acetonitrilu) v trvání 15 minút, pri prútoku 2,0 ml /min. Detekce UV záŕením se provádi pri 210 nm. Čistota všech produktú je približné 97 až 99 %. Provedou se analýzy aminokyselín v jednotlivých peptidech a

- 38 naméŕené hodnoty leží v pŕijatelném rozmezi. Všechny konečné produkty se také obvykle podrobí hmotnostní spektrometrii FAB-MS. Všechny produkty vykazují očekávaný rodičovský M+H ion v pŕijatelných mezích.

Nové sloučeniny podie vynálezu vykazují cenné farmakologické vlastnosti. Mají tracheální relaxační účinek a jsou silnými bronchodilátory. Tyto sloučeniny také nemaj í žádný vediejší kardiovaskulárni účinek. Účinnosť techto nových peptidú pri bronchodilataci múže být delší než 2 hodiny. Díky témto účinným vlastnostem pŕedstavují sloučeniny podie vynálezu farmaceutický cennné látky pro léčbu bronchokonstrikčních porúch, napríklad asthma.

Nové sloučeniny obecného vzorce I až 5 je možno mísit s rúznými typickými farmaceutickými nosiči, prednostné netoxickými inertními terapeuticky vhodnými nosičovými látkami, za vzniku pŕípravkú, které se hodí pro léčbu bronchokonstrikčních porúch, jako je asthma. Dávkování techto sloučenin v galenických aplikačních formách je závislé na rúzných faktorech, jako je druh konkrétné použité sloučeniny a druh použitého prípravku. Účinnou dávku mohou odborníci v tomto oboru určit na základe uvedených hodnoť účinné koncentrace (EC_5Q). Typické dávkování u humánních pacientú leží v rozmezi od 0,01 do 100 μg/kg. U sloučenin s nízkou hodnotou ED₅₀, jako napríklad 0,1 μς, leží typické dávkování u humánních pacientú v rozmezi od asi 0,02 do asi 20 μg/kg.

Nové sloučeniny obecného vzorce I až 5 tvorí farmaceutický vhodné adiční soli s kyselinami s rúznými anorganickými a organickými kyselinami, jako je kyselina sírová, fosforečná, chlorovodíková, bromovodíková, jodovodíková, dusičná, amidosulfonová, citrónová, mléčná, pyrohroznová, šŕavelová, maleínová jantárová, vinná, škoricová, octová, trifluoroctová, benzoová, salicylová, glukonová, askorbová apod.

Sloučeniny podie vynálezu je možno pacientúm podávat parenterálné, buď intravenosné, subkutánné, intramuskulárné, orálné nebo intranasálné. Prednostní zpúsob parenterálního podávání spočivá v podávání aerosólu orálni nebo intranasální cestou.

Vynález je blíže objasnén v následujících pŕíkladech provedeni. Tyto príklady mají výhradné ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Príklady provedeni vynálezu

Príklad 1

Príprava produktu Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyŕice

Zesítovaná benzhydrylaminová pryskyŕice na bázi kopolyméru styrenu s 1 % divinylbenzenu (9,5 g, 3,6 mekv. o zrnení 200 - 400 mesh, t.j. 38 až 75 μιη, výrobek firmy Vega Biochem) se nabotná ve 100 ml methylenchloridu, odfiltruje a promyje za použití stupňú 7 až 8 predpisu 1. V 50 ml dichlormethanu se nechá reagovat Boc-Thr(Bzl) (3,35 g, 10,8 mmol) s dicyklohexylkarbodiimidem (1,12 g, 5,42 mmol), po dobu 1 hodiny, smés se pŕefiltruje a v 50 ml dichlormethanu pridá k zbotnalé pryskyŕici. Vzniklá smés se 18 hodin trepe pri teploté místnosti. Potom se pridá DIPEA (630 ml, 3,6 mmol) a smés se další 1 hodinu trepe, potom se pŕefiltruje a provedou se stupné 10 až 14 podie predpisu 1. Kaiserova ninhydrinová analýza je negatívni. Prípadné nezreagované aminoskupiny se blokuj í 30minutovým púsobením 1 ml acetanhydridu a 1 ml DIPEA v 50 ml dichlormethanu na pryskyŕici. Pryskyŕice se odfiltruje a provedou se promývací stupné 13 a 14 podie predpisu 1. Pryskyŕice se za vakua suší pŕes noc. Získá se 9,8 g produktu Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyŕice. Vzorek této pryskyŕice se podrobí analýze na aminokyselinu. Zj istí se, že se navázalo 0,17 mmol Thr na 1 9 pryskyŕice.

Príklad 2

Príprava Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸J-VIP cyklo (Asp⁸—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID No: 20)-NH₂]

Produkt Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyŕice (9,8 g, 1,7 mmol) z príkladu 1 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití predpisu 1, uvedeného výše. Všechny kondenzace se provádéjí za použití symetrických anhydridu, které byly pripravený z Boc-aminokyseliny a dicyklohexylkarbodiimidu. Boc-asparagin, Boc-glutamin a Boc-histidin(benzyloxymethyl) se kondenzuj! ve formé príslušných HOBT-aktivovaných esterú. Reakční doba pro dokončení kondenzačního stupné je obvykle l až 18 hodin. Provede se celkem 5 kondenzačních cyklu, postupné s 5 aminokyselinami, Boc-Leu (1,5 g, 6,0 mmol), Boc-Val (1,3 g, 6,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (1,8 g, 6,0 mmol), Boc-Asn (773 mg, 3,3 mmol) a Boc-Leu (1,5 g, 6,0 mmol). Potom se pryskyŕice za vakua vysuší. Tak se získá 12,2 g produktu Boc-hexapeptid-pryskyŕice.

8,2 g (1,13 mmol) této pryskyŕice se postupné v 6 cyklech kondenzuje se 6 aminokyselinami, Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,77 g,

4,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,67 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-C1Z) (1,67 g, 4,0 mmol), Boc-Val (876 mg, 4,0 mmol), Boc-Ala (762 mg, 4,0 mmol) a·Boc-Nle (932 mg, 4,0 mmol). Získá se 10,2 g produktu Boc-dodekapeptid-pryskyŕice.

1,26 g (0,139 mmol) této pryskyŕice se podrobí dvéma kondenzačním cyklum a to za použtií jednak Boc-Gln (205 mg,

0,93 mmol) a jednak Boc-Lys(2-Cl-Z) (627 mg, 15 mmol). Jedna polovina této pryskyŕice (0,069 mmol) se postupné podrobí 14 kondenzačním cyklúm za použití 14 áminokyselin: Boc-Arg(Tos) (324 mg, 0,76 mmol), Boc-Leu (188 mg, 0,76 mmol),

Boc-Lys(Fmoc) (354 mg, 0,76 mmol), Boc-Thr(Bzl) (234 mg, 0,76 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (333 mg, 0,76 mmol), Boc-Asn (97 mg, 0,76 mmol), Boc-Asp(OFm) (311 mg, 0,76 mmol), Boc-Thr(Bzl) (234 mg, 0,76 mmol), Boc-Phe (201 mg, 0,76 mmol), Boc-Val (164 mg, 0,76 mmol), Boc-Ala (143 mg, 0,76 mmol),

Boc-Asp(OcHx) (238 mg, 0,76 mmol) a Boc-Ser(Bzl) (223 mg,

0,76 mmol) a Boc-His(Bom) (156 mg, 0,41 mmol). Získaný produkt peptid-pryskyŕice se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a potom se na né j púsobí 1,0 ml acetanhydridu a 66 ml DIPEA (0,38 mmol) ve 20 ml dichlormethanu po dobu 30 minút. Potom se pryskyŕice promyje (stupne 10 až 14).

Potom se pryskyŕice selektivné zbaví chránících skupin (stupne 1 až 11 podie predpisu 2) a nechá 7 x reagovat s DCC (49 mg, 0,24 mmol) a HOBT (32 mg, 0,24 mmol) ve 20 ml destilovaného dimethylformamidu, v prúbéhu 24 hodin.

Kaiserova ninhydrinová analýza je negatívni. Pryskyŕice se promyje (stupné 13 až 16 podie predpisu 2) a za vakua vysuší. Získá se 0,72 g produktu.

Na pryskyŕici se púsobí 6 ml dimethylsulfidu a 2 ml kapalného fluorovodíku po dobu 2 hodin pri o °c. Reakční smés se odparí a ke zbytku se pridá 0,7 ml anisolu a 6 ml kapalného fluorovodíku, načež se reakční smés 45 minút udržuje pri 0 °C. Potom se reakční smés odparí a zbytek se promyje jednou 15 ml diethyletheru a trikrát 15 ml ethylacetátu. Pryskyŕice se extrahuje 3x 20 ml 10% kyseliny octové a spojené vodné filtráty se lyofilizují. Získá se 227 mg bílé pevné látky.

Tato surová látka se prečistí preparativní HPLC na sloupci Whatman Magnum-20 ODS-3 (2 x 25 cm), pŕičemž eluce se provádí lineárním gradientem 10% až 40% pufru B v pufru A (pufr A: 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové ve vodé, pufr B: 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetonitrilu) po dobu 4 hodin. Látka hlavního piku se oddelí analytickou HPLC a po spojení vhodných frakcí a lyofilizaci se získá 26,7 mg poločistého produktu. Tato látka se znovu nanese na sloupec Magnum-20 ODS-3 (2 x 50 cm) a eluuje stejným koncentračním gradientem. Látka hlavního piku se oddelí a lyofilizuje.

Získá se 9,5 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogénni podie HPLC a podie analýzy vykazuje správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3 277,8; nalezeno 3 276,1.

Príklad 3

Príprava Ac-Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Glu⁸—>Lys¹²) [Ac—(SEQ ID NO:21)-NH₂]

Zesítovaná benzhydrylaminová pryskyŕice na bázi kopolymeru styrénu s 1 % divinylbenzenu (17,7 g, 2,6 mekv. o zrnéní 200 - 400 mesh, t.j. 38 až 75 μιη, výrobek firmy Vega Biochem) se nabotná ve 160 ml methylenchloridu, odfiltruje a promyje za t

použití stupňu 7 až 8 predpisu 1. Pryskyŕice se resuspenduje ve 160 ml dichlormethanu a nechá reagovat s Boc-Thr(Bzl) (6,25 g, 20,2 mmol) a dicyklohexylkarbodiimidem (2,10 g,

10,1 mmol). Vzniklá smés se 8 hodin trepe pri teploté místnosti, potom se prefiltruje a provedou se stupne 10 až 14 podie predpisu 1. Kaiserova ninhydrinová analýza je negatívni. Prípadné nezreagované aminoskupiny se blokuj í 60minutovým púsobením 5 ml acetanhydridu a 5 ml DIPEA ve 150 ml dichlormethanu na pryskyŕici. Pryskyŕice se odfiltruje a provedou se promývací stupne 13 a 14 podie predpisu 1. Pryskyŕice se za vakua suší pŕes noc. Získá se 18,0 g produktu Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyŕice. Vzorek této pryskyŕice se podrobí analýze na aminokyselinu. Zjisti se, že se navázalo 0,17 mmol Thr na 1 g pryskyŕice.

Produkt Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyŕice (18,0 g, 3,06 mmol) z odstavce 1 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití predpisu 1, uvedeného výše. Všechny kondenzace se provádéjí za použití symetrických anhydridu, které byly pripravený z Boc-aminokyseliny a dicyklohexylkarbodiimidu. Boc-asparagin, Boc-glutamin a Boc-histidin(benzyloxymethyl) se kondenzuj! ve formé príslušných HOBT-aktivovaných esterú. Provede se celkem 5 kondenzačních cyklú, postupné s 5 aminokyselinami, Boc-Leu (6,1 g, 24,5 mmol), Boc-Val (5,32 g,

24,5 mmol), Boc-Ser(Bzl) (7,23 g, 24,5 mmol), Boc-Asn (3,13 g, 13,5 mmol) a Boc-Leu (6,1 g, 24,5 mmol). Potom se pryskyŕice za vakua vysuší. Tak se získá 22,9 g produktu Boc-hexapeptid-pryskyŕice.

7,48 g (1,0 mmol) této pryskyŕice se postupné v 10 cyklech kondenzuje se 10 aminokyselinami, Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,76 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-C1Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Val (869 mg, 4,0 mmol), Boc-Ala (1,5 g, 8,0 mmol), Boc-Nle (925 mg, 4,0 mmol), Boc-Gln (1,08 g, 4,4 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,66 g, 40 mmol), Boc-Arg(Tos) (1,71 g, 4,0 mmol) a Boc-Leu (998 mg, 4,0 mmol). Získá se 9,6 g produktu Boc-hexadekapeptid-pryskyŕice.

7,68 g (0,8 mmol) této pryskyŕice se podrobí jednomu kondenzačními cyklu za použití Boc-Lys(Fmoc) (1,5 g, 3,2 mmol). Získá se 8,32 g produktu Boc-heptadekapeptid-pryskyŕice.

6,24 g (0,6 mmol) této pryskyŕice se podrobí dvéma kondenzačním cyklúm za použití jednak Boc-Thr(Bzl) (742 mg,

2,4 mmol) a jednak Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,06 g, 2,4 mmol). Získá se 6,28 g produktu Boc-nonadekapeptid-pryskyŕice.

2,09 g (0,2 mmol) této pryskyŕice se podrobí 9 kondenzačním cyklúm, pri nichž se postupné jednotlivé použije Boc-Asn (204 mg, 0,88 mmol), Boc-Asp(OFm) (340 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol),

Boc-Asp(OcHx) (258 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol) a Boc-His(Bom) (330 mg, 0,88 mmol).Získaný produkt peptid-pryskyŕice se podrôbí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a potom se na néj púsobi 0,25 ml acetanhydridu a 70 ml DIPEA ve 20 ml dichlormethanu po dobu 20 minút. Potom se pryskyŕice promyje (stupne 10 až 14).

Potom se pryskyŕice selektivné zbaví chránících skupin (stupne 1 až 11 podie predpisu 2). Tri čtvrtiny této pryskyŕice (0,15 mmol) se nechaj í reagovat s DCC (77 mg,

0,37 mmol) a HOBT (51 mg, 0,37 mmol) ve 20 ml destilovaného dimethylformamidu, v prúbéhu 72 hodin a potom ve 20 ml toluénu, v prúbéhu 24 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je negatívni. Pryskyŕice se promyje (stupné 13 až 16 podie predpisu 2) a za vakua vysuší. Získá se 1,72 g produktu.

1,14 g (0,099 mmol) část této pryskyŕice se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 2, s tím rozdílem, že se ve druhém stupni použije 1 ml anisolu a 9 ml fluorovodíku. Potom se reakční smés odparí a zbytek se promyje jednou 15 ml diethyletheru a trikrát 15 ml ethylacetátu. Pryskyŕice se extrahuje 3x 20 ml 10% kyseliny octové a spojené vodné filtráty se lyofilizují. Získá se 535 mg bílé pevné látky.

Tato surová látka se prečistí gelovou filtrací na náplni Sephadex G-25 fine (kolona o rozmérech 2 x 100 cm) za použití eluce 10% kyselinou octovou. Monomér hlavního piku se oddelí analytickou HPLC spojených frakcí a po spojení vhodných frakcí a lyofilizaci se získá 83,5 mg poločistého produktu. Tato látka se prečistí preparativní HPLC, zpúsobem popsaným v príkladu 2, s tím rozdílem, že se použije 20 až 40% gradientu v prúbéhu 3 hodin. Látka hlavního piku se oddelí analytickou HPLC spojených frakcí a získané frakce se spojí a lyofilizují. Získá se 18,9 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogénni podie HPLC a podie analýzy vykazuje správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3 292,0; nalezeno 3 291,8.

Príklad 4

Príprava Ac-[Asn⁸,Asp⁹,Lys¹²,Nie¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Asp⁹—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID No:22)-NH₂]

Část produktu Boc-nonadekapeptid-pryskyŕice (1,55 g, 0,15 mmol) z príkladu 3 se podrobí devíti kondenzačním cyklúm, pri nichž se jednotlivé používá Boc-Asp(OFm) (247 mg, 0,6 mmol), Boc-Asn (153 mg, 0,66 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (159 mg, 0,6 mmol), Boc-Val (130-mg, 0,6 mmol), Boc-Ala (113 mg, 0,6 mmol), Boc-Asp(OcHx) (189 mg, 0,6 mmol), Boc-Ser(Bzl) (177 mg, 0,6 mmol) a Boc-His(Bom) (248 mg, 0,66 mmol).Získaný produkt peptid-pryskyŕice se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a potom se na néj púsobí 0,25 ml acetanhydridu a 70 ml DIPEA ve 20 ml dichlormethanu po dobu 30 minút. Potom se pryskyŕice promyje (stupné 10 až 14).

Potom se pryskyŕice selektívne zbaví chránících skupin (stupné 1 až 11 podie predpisu 2) a nechá reagovat dvakrát s DCC (77 mg, 0,37 mmol) a HOBT (51 mg, 0,37 mmol) ve 20 ml destilovaného dimethylformamidu, po dobu 24 hodin a 72 hodin a potom dvakrát ve 20 ml toluénu po dobu 24 hodin a 48 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je negatívni. Pryskyŕice se promyje (stupné 13 až 15 podie predpisu 2) a za vakua vysuší. Získá se 1,54 g produktu.

1,26 g (0,122 mmol) část této pryskyŕice se zbaví chránících skupin pomoci fluorovodíku zpúsobem popsaným v príkladu 3. Potom se reakční smés odparí a zbytek se promyje jednou 15 ml diethyletheru a trikrát 15 ml ethylacetátu. Pryskyŕice se extrahuje 3x 20 ml 10% kyseliny octové a spojené vodné filtráty se lyofilizují. Získá se 485 mg bílé pevné látky.

Tato surová látka se prečistí gelovou filtrací na náplni Sephadex G-25 fine zpúsobem popsaným v príkladu 3. Získá se

83,5 mg poločistého produktu. Tato látka se prečistí preparativní HPLC, zpúsobem popsaným v príkladu 3, s tím rozdílem, že se použije 20 až 45% gradientu v prúbehu 3 hodin. Látka hlavního piku se oddélí analytickou HPLC spojených frakcí a získané frakce se spojí a lyofilizují. Získá se 11,5 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogénni podie HPLC a podie analýzy vykazuje správne složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3 277,8; nalezeno 3 277,6.

Príklad 5

Príprava Ac-[Orn¹²,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Asp⁸—>0rn¹²) [Ac-(SEQ ID No:23)-NH₂]

1,92 g (0,2 mmol) část produktu Boc-hexadekapeptid-pryskyŕice z príkladu 3 se podrobí 12 kondenzačním cyklúm, pri nichž se jednotlivé použije

Boc-Orn(Fmoc) (364 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (495 mg, 1,6 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Asp(OFm) (329 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (495 mg, 1,6 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol) a Boc-His(Bom) (330 mg, 0,88 mmol). Získaný produkt peptid-pryskyŕice se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a potom se na nej púsobí 0,25 ml acetanhydridu a 70 ml DIPEA ve 20 ml dichlormethanu po dobu 30 minút. Potom se pryskyŕice promyje (stupne 10 až 14) a suší pŕes noc. Získá se 2,38 g produktu.

1,38 g (0,11 mmol) této pryskyŕice se selektivné zbaví chránících skupín (stupne 1 až 11 podie predpisu 2) a nechá reagovat s DCC (55 mg, 0,27 mmol) a HOBT (37 mg, 0,27 mmol) ve 20 ml destilovaného dimethylformamidu, po dobu 24 hodin a potom ve 20 ml toluénu po dobu 24 hodin a 5 x ve 20 ml destilovaného dimethylformamidu po dobu 24 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je mirné pozitívni. Pryskyŕice se promyje (stupne 13 až 16 podie predpisu 2) a za vakua vysuší.

0,8 g (0,05 mmol) část této pryskyŕice se zbaví chránících skupín pomoci fluorovodíku zpúsobem popsaným v príkladu 3. Potom se reakční smés odparí a zbytek se promyje jednou 15 ml diethyletheru a trikrát 15 ml ethylacetátu. Pryskyŕice se extrahuje 3x 20 ml 10% kyseliny octové á spojené vodné filtráty se lyofilizují. Získá se 429 mg pryskyŕičné pevné látky.

Tato surová látka se prečistí gelovou filtrací na náplni Sephadex G-25 fine zpúsobem popsaným v príkladu 3. Získá se 107 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC, zpúsobem popsaným v príkladu 3, s tím rozdílem, že se použije 10 až 40% lineárního gradientu v prúbéhu 3 hodin. Látka hlavního piku se oddelí analytickou HPLC spojených frakcí a získané frakce se spojí a lyofilizují. Získá se 17,5 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogénni podie HPLC a podie analýzy vykazuje správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3 263,7; nalezeno 3 264,1.

Príklad 6

Príprava Ac-[Lys⁸,Asp¹²,Νΐβ^⁷,Val²⁸,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys⁸—>Asp¹²) [Ac-(SEQ ID No: 24)-NH₂]

1/θ 9 (0/1 mmol) část produktu Boc-hexadekapeptidpryskyŕice z príkladu 3 se podrobí 12 kondenzačním cyklum, pri nichž se jednotlivé použije Boc-Asp(OFm) (165 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (176 mg, 0,4 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (187 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Phe (106 mg, 0,4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol) a Boc-His(Bom) (150 mg, 0,4 mmol). Získaný produkt peptid-pryskyŕice se podrobí stupňúm 1 až 8 a potom se na néj pusobí 0,5 ml acetanhydridu a 35 ml DIPEA ve 20 ml dichlormethanu po dobu 30 minút. Potom se pryskyŕice promyje (stupné 10 až 14) a suší pŕes noc. Získá se 1,2 i

g produktu.

0,8 g (0,066 mmol) této pryskyŕice se selektivné zbaví chránících skupín (stupné 1 až 11 podie predpisu 2) a nechá reagovat s BOP (58 mg, 0,13 mmol) ve 20 ml destilovaného dimethylformamidu, po dobu 24 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je negatívni. Pryskyŕice se promyje (stupné 13 až 16 podie predpisu 2) a za vakua vysuší.

Tato pryskyŕice se zbaví chránících skupin pomoci fluorovodíku zpúsobem popsaným v príkladu 3. Potom se reakční smés odparí a zbytek se promyje jednou 15 ml diethyletheru a trikrát 15 ml ethylacetátu. Pryskyŕice se extrahuje 3x 20 ml 10% kyseliny octové a spojené vodné filtráty se lyofilizují. Získá se pryskyŕičná pevná látka.

Tato surová látka se prečistí gelovou filtrací na náplni Sephadex G-25 fine zpúsobem popsaným v príkladu 3. Získá se 43,8 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC, zpúsobem popsaným v príkladu 3, s tím rozdílem, že se použije 10 až 40% lineárního gradientu v prúbéhu 3 hodin. Látka hlavního piku se oddélí analytickou HPLC spojených frakcí a získané frakce se spojí a lyofilizují. Získá se 7,5 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogénni podie HPLC a podie analýzy vykazuje správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3 277,8; nalezeno 3 276,4.

Príklad 7

Príprava Ac-[Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Glu⁸—>0rn¹²) [Ac-(SEQ ID No: 25)-NH₂]

Zesítovaná benzhydrylaminová pryskyŕice na bázi kopolymeru styrénu s 1 % divinylbenzenu (25,0 g, 17,5 mekv. o zrnéní 200 - 400 mesh, t.j. 38 až 75 μπι, výrobek firmy Bachem) se nabotná ve 160 ml methylenchloridu, odfiltruje a promyje za použití stupňú 7 až 8 predpisu 1. Pryskyŕice se resuspenduje ve 160 ml dichlormethanu a nechá reagovat s Boc-Thr(Bzl) (16,2 g, 52,5 mmol) a dicyklohexylkarbodiimidem (5,4 g, 26,2 mmol). Vzniklá smés se 6 hodin trepe pri teploté místnosti, potom se prefiltruje a provedou se stupné 10 až 14 podie predpisu 1. Kaiserova ninhydrinová analýza je negatívni. Prípadné nezreagované aminoskupiny se blokuj í 60minutovým púsobením 5 ml acetanhydridu a 5 ml DIPEA ve 150 ml dichlormethanu na pryskyŕici. Pryskyŕice se odfiltruje a provedou se promývací stupné 13 a 14.

Pryskyŕice se za vakua suší pŕes noc. Získá se 29,6 g produktu Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyŕice. Vzorek této pryskyŕice se podrobí analýze na aminokyselinu. Zj istí se, že se navázalo 0,21 mmol Thr na 1 g pryskyŕice.

Produkt Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyŕice (14,0 g, 2,94 mmol) z odstavce 1 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití stejného predpisu, jako v príkladu 2. Provede se celkem 11 kondenzačních cyklú, pri nichž se jednotlivé používá Boc-Leu (5,9 g, 23,5 mmol), Boc-Val (5,1 g, 23,5 mmol), Boc-Ser(Bzl) (6,9 g, 23,5 mmol), Boc-Asn (3,0 g, 13,0 mmol), Boc-Leu (5,9 g, 23,5 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (10,3 g,

23,5 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (9,8 g, 23,5 mmol),

Boc-Lys(2-C1-Z) (9,8 g, 23,5 mmol), Boc-Val (5,1 g, 23,5 mmol), Boc-Ala (4,4 g, 23,'5 mmol) a Boc-Nle (5,4 g, 23,5 mmol). Získá se 26 g produktu Boc-dekapeptid-pryskyŕice.

5,5 g (0,61 mmol) této pryskyŕice se postupné v 4 cyklech jednotlivé kondenzuje s Boc-Gln (655 mg, 2,7 mmol),

Boc-Lys(2—Cl—Z) (2,0 g, 4,8 mmol), Boc-Arg(Tos) (2,1 g, 4,8 mmol) a Boc-Leu (1,2 g, 4,8 mmol). Po vakuovém vysušení se získá 6,12 g produktu Boc-hexadekapeptid-pryskyŕice.

2,0 g (0,2 mmol) této pryskyŕice se podrobí dvanácti kondenzačním cyklum, pri nichž se jednotlivé použije Boc-Orn(Fmoc) (91 mg, 0,2 mmol), Boc-Thr(Bzl) (250 mg, 0,8 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Glu(OFm) (340 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (152 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx)

- 51 (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol) a Boc-His(Bom) (150 mg, 0,4 mmol). Získaný produkt peptid-pryskyŕice se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a potom se na nej pusobí 0,5 ml acetanhydridu a 38 ml DIPEA ve 30 ml dichlormethanu po dobu 180 minút. Potom se pryskyŕice promyje (stupne 10 až 14) a za vakua vysuší. Získá s e 2,4 g produktu.

Potom se část (1,15 g, 0,1 mmol) této pryskyŕice selektívne zbaví chránících skupín (stupne 1 až 11 podie predpisu 2) a nechá reagovať dvakrát s BOP (58 mg, 0,13 mmol) a 400 ml DIPEA ve 20 ml destilovaného dimethylformamidu, v prúbéhu 24 hodin a 6 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je negatívni. Pryskyŕice se promyje (stupne 13 až 16 podie predpisu 2) a za vakua vysuší. Získá se 1,05 g produktu.

Tato pryskyŕice se zbaví chránících skupín púsobením 9 ml fluorovodíku, 1 ml anisolu a 100 ml ethandithiolu po dobu 1 hodiny pri 0 °C. Potom se reakční smés odparí a zbytek se promyje dvakrát 15 ml diethyletheru a dvakrát 15 ml ethylacetátu. Pryskyŕice se extrahuje 4 x 20 ml 10% kyseliny octové a spojené vodné filtráty se lyofilizují. Získá se 385 mg svétle žluté pevné látky.

Tato surová látka se prečistí gelovou filtrací na náplni Sephadex G-25 fine zpúsobem popsaným v príkladu 3. Získá se 134 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC, zpúsobem popsaným v príkladu 3, s tím rozdílem, že se použije 26 až 36% lineárního gradientu v prúbéhu 3 hodin. Látka hlavního piku se oddélí analytickou HPLC spojených frakcí a získané frakce se spojí a lyofilizují. Získá se 23,2 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogénni podie HPLC a podie analýzy vykazuje správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3 277,8; nalezeno 3 276,3.

Príklade

Príprava Ac-[Lys¹²,Glu¹⁶,Nle¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys¹²—>Glu¹⁶) [Ac-(SEQ ID No:26)-NH₂J

Zesíŕovaná benzhydrylaminová pryskyŕice na bázi kopolyméru styrénu s 1 % divinylbenzenu (30 g, 21,4 mekv. o zrnéní 200 - 400 mesh, t.j. 38 až 75 μπι, výrobek firmy Bachem) se zpracovává zpúsobem popsaným v príkladu 22, s tím rozdílem, že se použije 19,9 g Boc-Thr(Bzl) (64,3 mmol) a 6,6 g dicyklohexylkarbodiimidu (32,1 mmol). Vzniklá smés se 18 hodin trepe pri teploté místnosti, potom se prefiltruje a provedou se stupné 10 až 14 podie predpisu 1. Kaiserova ninhydrinová analýza je negatívni. Prípadné nezreagované aminoskupiny se blokuj í 60minutovým púsobením 8 ml acetanhydridu a 8 ml DIPEA ve 200 ml dichlormethanu na pryskyŕici. Pryskyŕice se odfiltruje a provedou se promývací stupné 13 a 14 podie predpisu 1. Pryskyŕice se za vakua suší pŕes noc. Získá se 34,2 g produktu Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyŕice. Vzorek této pryskyŕice se podrobí analýze na aminokyselinu. Zj istí se, že se navázalo 0,47 mmol Thr na ¹ 9 pryskyŕice.

Produkt Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyŕice (0,85 g, 0,4 mmol) z odstavce l se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidú Applied Biosystems Model 430A. Všechny kondenzace se provádéjí za použití pŕedem pripravených symetrických anhydridú, které byly pripravený z Boc-aminokyseliny a dicyklohexylkarbodiimidu.

Boc-asparagin, Boc-glutamin a Boc-arginin(tosyl) se obvyklým zpúsobem kondenzuj! ve formé príslušných HOBT-aktivovaných esterú. Provede se celkem 11 kondenzačních cyklú, pri nichž se jednotlivé používá aminokyselín, Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) a Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Získá se produkt

Boc-dodekapeptid-pryskyŕice.

Tato pryskyŕice se postupné v 5 cyklech kondenzuje zpúsobem popsaným v príkladu 2, pŕičemž se jednotlivé používá Boc-Glu(OFM) (340 mg, 0,8 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (664 mg,

1,6 mmol), Boc-Arg(Tos) (685 mg, 1,6 mmol), Boc-Leu (398 mg,

1,6 mmol) a Boc-Lys(Fmoc) (375 mg, 0,8 mmol). Produkt se vysuší za vakua. Získá se 2,12 g produktu

Boc-heptadekapeptid-pryskyŕice.

Potom se část (1,06 g, 0,2 mmol) této pryskyŕice selektivné zbaví chránících skupín (stupne 1 až 11 podie predpisu 2) a pryskyŕice se nechá reagovat dvakrát s BOP (177 mg, 0,4 mmol) a DIPEA ve 20 ml destilovaného dimethylformamidu, v prúbéhu 2 hodin a 8 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je mírné pozitívni. Nezreagované aminoskupiny se blokuj í lOminutovým púsobením 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v dichlormethanu na pryskyŕici. Pryskyŕice se odfiltruje a provedou se promývací stupné 13 až 16 podie predpisu 2. Tato pryskyŕice se podrobí jednomu kondenzačnímu cyklu za použití Boc-Thr(Bzl) (495 mg,

1,6 mmol) a potom znovu pŕevede do syntetizátoru peptidú Applied Biosystems 430A. Provede se 10 kondenzačních cyklú, v nichž se jednotlivé používá Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg,

2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol). Získaný peptid navázaný na pryskyŕici se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu a 100 ml

DIPEA ve 20 ml methylenchloridu po dobu 30 minút. Pryskyŕice se promyje (stupne 10 až 14) a za vakua vysuší.

Peptid navázaný.na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 340 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 3 5 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 15,6 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3276,67; nalezeno 3278,0.

Príklad 9

Príprava Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁴ Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²⁰—>Asp²⁴) [Ac-(SEQ ID No:27)-NH₂]

0,42 g (0,2 mmol) produktu Boc-Thr(Bzl)-pryskyŕice z príkladu 8 se podrobí 9 kondenzačním cyklúm, pri nichž se jednotlivé používá Boc-Leu (200 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OFm) t

(329 mg, 0,8 mmol), Boc-Leu (200 mg, 0,8 mmol), Boc-Tyr(2,6DCB (352 mg, 0,8 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (332 mg, 0,8 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (375 mg, 0,8 mmol) a Boc-Val (174 mg, 0,8 mmo1) .

Získaná pryskyŕice se selektívne zbaví chránících skupin tím, že se provedeou stupné 1 až 11 podie predpisu 2 a potom se nechá reagovat s BOP (177 mg, 0,4 mmol) a 200 ml DIPEA ve 20 ml destilovaného dimethylformamidu po dobu 6 hodin.'

- 55 Kaiserova ninhydrinová analýza je negatívni.

Tato pryskyŕice se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidú Applied Biosystems Model 430A, tak jako v príkladu 8. Provede se celkem 17 kondenzačních cyklú, pri nichž se jednotlivé použije téchto aminokyselín: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg,

2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg,

2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) a Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol). Tato pryskyŕice se podrobí jednomu kondenzačnímu cyklu s Boc-His(Tos) (164 mg, 0,4 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyŕici se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovat s 1 ml acetanhydridu a 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu. po dobu 30 minút. Pryskyŕice se promyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 1,94 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici (0,97 g, 0,1 mmmol) se zbaví chránících skupín zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 265 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtraci zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 149 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 28,1 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zjistí, že má správné složeni aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3 278,6; nalezeno 3 278,8.

Príklad 10

Príprava aAc-[Lys¹²,ΝΙβ¹^,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸J-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:28)-NH₂]

Zesítovaná benzhydrylaminová pryskyŕice na bázi kopolymeru styrénu s 1 % divinylbenzenu (5,0 g, 2,6 mekv.o zrnení 200 - 400 mesh, t.j. 38 až 75 μιη,' výrobek firmy Vega Biochem) se nabotná ve 50 ml methylenchloridu, odfiltruje a promyje za použití stupňu 7 až 8 predpisu 1. Pryskyŕice se resuspenduje ve 60 ml dichlormethanu a nechá reagovat s Boc-Thr(Bzl) (2,32 g, 7,5 mmol) a dicyklohexylkarbodiimidem (774 mg, 3,75 mmol). Vzniklá smés se 4 hodin trepe pri teploté místnosti, potom se prefiltruje a provedou se stupné 10 až 14 podie predpisu 1. Kaiserova ninhydrinová analýza je negatívni. Prípadné nezreagované aminoskupiny se blokuj í 60minutovým púsobením 5 ml acetanhydridu a 5 ml DIPEA v 50 ml dichlormethanu na pryskyŕicí. Pryskyŕice se odfiltruje a provedou se promývací stupné 13 a 14 podie predpisu 1. Pryskyŕice se za vakua suší pŕes noc. Získá se 5,8 g produktu Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyŕice. Vzorek této pryskyŕice se podrobí analýze na aminokyselinu. Zjisti se, že se navázalo 0,276 mmol Thr na 1 g pryskyŕice.

Produkt Boc-Thr(Bzl)-BHA pryskyŕice (1,44 g, 0,4 mmol) z odstavce 1 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití predpisu 1, tak jako v príkladu 2. Provedou se celkem 3 kondenzační cykly,pri nichž se jednotlivé použije aminokyselín Boc-Leu (399 mg, 1,6 mmol), Boc-Val (348 mg,

1,6 mmol) a Boc-Asp(OFm) (329 mg, 0,8 mmol). Jedna polovina této pryskyŕice (0,2 mmol) se podrobí 4 kondenzačním cyklúm, pri nichž se jednotlivé použije Boc-Asn (204 mg, 0,88 mmol), Boc-Leu (199 mg, 0,8 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol) a Boc-Lys(Fmoc) (375 mg, 0,8 mmol).

Tato pryskyŕice se selektivné zbaví chránících skupin za použití stupňu 1 až 11 podie predpisu 2 a nechá reagovat s BOP (177 mg, 0,4 mmol) ve 20 ml 1% roztoku DIPEA v dimethylformamidu po dobu 2 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je negatívni.

Tato pryskyŕice se podrobí jednomu kondenzačními cyklu s Boc-Lys(2-Cl-Z) (332 mg, 0,8 mmol) a potom syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidu Applied Biosystems Model 430A, tak jako v príkladu 8. Provede se 19 kondenzačních cyklu, pri nichž se jednotlivé použije téchto aminokyselín: Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg,

2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol),

Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHxj (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boq-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol). Získaný peptid navázaný na pryskyŕici se podrobí stupňúm 1 až 8 z pŕepdpisu 1 a nechá reagovat s 1 ml acetanhydridu a 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 30 minút. Pryskyŕice se promyje (stupné 10 až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 210 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 93 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 27 až 37% lineárního gradientu. Získá se 26,2 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složeni aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3305,8; nalezeno 3305,8.

Príklad 11

Príprava Ac-[Lys¹² ,Nle¹⁷ ,Ala¹⁸ ,Asp²^ ,Val²⁸ ,Thr²⁸ ]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:29)-NH₂]

0,4 g (0,1 mmól) benzyhdrylaminové pryskyŕice (o zrnení 100 až 200 rnesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 μιη, výrobek firmy Bachem), se podrobí syntéze v pevné fázi za použití výše uvedeného predpisu. Všechny kondenzace se provádéjí za použití stejných molárné ekvivalentních množství Boc-aminokyseliny a diisopropylkarbodiimidu. Boc-asparagin a Bocglutamin se zavádéjí ve formé reaktivních esterú tím, že se ke kondenzační smési pridá l,5molární nadbytek HOBT. Reakční doba, v prúbéhu níž probéhne kondenzační stupeň do konce, činí približné 2 až 18 hodin. Provede se celkem 9 kondenzačních cyklú, pri nichž se jednotlivé použije Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (206 mg, 0,5 mmol), Boc-Asn (232 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB), (440 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (234 mg, 0,5 mmol) a Boc-Lys(2-cl-z) (415 mg, 10 mmol).

Tato pryskyŕice se selektivné zbaví chránících skupin za použití stupňu 1 až 11 podie predpisu 2 a nechá reagovat s BOP (88 mg, 0,2 mmol) ve 20 ml 1% roztoku DIPEA v dimethylformamidu po dobu 2 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je negatívni.

Provede se 19 kondenzačních cyklú, pri nichž se postupné jednotlivé použije téchto aminokyselín: Boc-Ala (189 mg, 1,0

J.: .V.'f.J ;. .· .· iz- n .* Si·.,..·. .·

- 59 mmol), Boc-Ala ( 189 mg, 1,0 mmol), Boc-Nle (231 mg, 1,0 mmol) a Boc-Gln (246 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (428 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol), Boc-Asn (232 mg, 1,0 mmol), Boc-Ásp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (309 mg, 1,0 mmol), Boc-Phe (265 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol) a Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol) a Boc-His(Tos) (409 mg, 1,0 mmol). Získaný peptid navázaný na pryskyŕici se podrobí stupňúm 1 až 8 z pŕepdpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu v 10 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 30 minút. Pryskyŕice se promyje (stupné 10 až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 304 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 215 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 26 až 36% lineárního gradientu. Získá se 20,1 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3277,6; nalezeno 3277,7.

Príklad 12

Príprava Ac-[p-F-Phe⁶,2-Nal¹⁰,Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸,Gly²⁹' ³⁰,Met³¹]-VIP (1-31)-NH2 cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:30)-NH2]

0,4 g (0,1 mmol) benzhydrylaminové pryskyŕice ( o zrnéní

100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 μπι, výrobek firmy Bachem) se podrobí syntéze v pevné fázi, podobné jako v príkladu 11. Provedou se celkem 3 kondenzační cykly, pri nichž se jednotlivé použije následujících aminokyselín:

Boc-Met (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) a Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). Dále se provede 9 kondenzačních cyklu a cyklizace, zpúsobem podie príkladu 11. Následuje 19 kondenzačních cyklu, jako v príkladu 11, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Ala v 10. cyklu nahradí Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol, Boc-Tyr(2,6-DCB) v 19. cyklu se nahradí Boc-2-Nal (158 mg, 0,5 mmol) a Boc-Phe ve 23.cyklu se nahradí Boc-p-F-Phe (142 mg, 0,5 mmol).

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 345 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 215 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 30 až 40% lineárního gradientu. Získá se 16,4 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3 574,7; nalezeno 3 575,1.

/

Príklad 13,

Príprava Ac-[Glu⁸,Orn¹²,Nie¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:3l)-NH₂]

0,4 g (0,1 mmol) benzhydŕylaminové pryskyŕice (o zrnéní 100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 μπι, výrobek firmy Bachem) se podrobí syntéze v pevné fázi, podobné jako v príkladu 11. Provede se se celkem 9 kondenzačních cyklú a cyklizace, jako v príkladu 11 a dále následuje 19 kondenzačních cyklu, jako v príkladu 11, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Ala v 10. cyklu nahradí Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol, Boc-Lys(2-C1-Z) v 17. cyklu se nahradí Boc-Orn(Z) (366 mg, 1,0 mmol) a Boc-Asp(OcHx) ve 21.cyklu se nahradí Boc-Glu(Bzl) (337 mg, 1,0 mmol).

Peptid navázaný na pryskyŕicí se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 255 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 200 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 28 až 38% lineárního gradientu. Získá se 30,7 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3305,8; nalezeno 3305,5.

Príklad 14

Príprava Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸ ,Gly²⁹'³⁰,Cys(Acm)³¹]-VIP (1-31)-NH2 cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:32)-NH2)

0,4 g (0,1 mmol) benzhydrylaminové pryskyŕice (o zrnení 100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 μιη, výrobek firmy Bachem) se podrobí syntéze v pevné fázi, podobné jako v príkladu 11. Provedou se celkem 3 kondenzační cykly, pri nichž se jednotlivé použije následujicich aminokyselín: Boc-Cys(Acm) (292 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) a Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). Dále se provede 9 kondenzačních cyklú a cyklizace, zpúsobem podie príkladu 11. Následuje 19 kondenzačních cyklú, jako v príkladu 11, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Phe ve 23. cyklu nahradí Boc-p-F-Phe (142 mg, 0,5 mmol).

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 268 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 165 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že. se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 28,1 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správne složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3584,1; nalezeno 3584,0.

Príklad 15

Príprava Ac-[Ala²,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No; 33)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyŕice (1,5 g, 0,4 mmol o zrnéní 100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 μιη, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidú Applied Biosystems Model 430A, podobné jako v príkladu 11. Provede se celkem 8 kondenzačních cyklú, pri nichž se jednotlivé použije následujících aminokyselín: Boc-Thr(Bzl) (619 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp (OFm) (822 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol) a Boc-Lys(Fmoc) (938 mg,

2,0 mmol).

Tato pryskyŕice se selektívne zbaví chránících skupin za použití stupňú 1 až 11 podie predpisu 2 a nechá reagovat s BOP (356 mg, 0,8 mmol) ve 20 ml 1% roztoku DIPEA v dimethylformamidu po dobu 2 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je negatívni. Pryskyŕice se promyje za použití stupňú 13 až 16 podie predpisu 2 a vysuší za vakua. Získá se 1,9 g produktu Boc-oktapeptid-pryskyŕice.

část této pryskyŕice (0,95g, 0,2 mmol) se znovu podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidú Applied Biosystems Model 430A, tak jako v príkladu 11. Provede se 18 kondenzačních cyklú, pri nichž se jednotlivé použije téchto aminokyselín: Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol) a Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol),

Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) a Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol). Získá se 1,54 g produktu Boc-hexakosapeptidpryskyŕice.

Část této pryskyŕice (0,77 g, 0,1 mmol) se podrobí syntéze v pevné fázi za použití predpisu uvedeného v príkladu 2. Provedou se 2 kondenzační cykly, pri nnichž se jednotlivé použije Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol) a Boc-His(Tos) (328 mg,

0,8 mmol). Získaný peptid navázaný na pryskyŕici se podrobí stupňúm 1 až 8 z pŕepdpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minút. Pryskyŕice se promyje (stupné 10 až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,74 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupín zpúsobem popsaným v príkladu 7, pričemž se získá 172 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pričemž se získá 110 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 22 až 37% lineárního gradientu. Získá se 40,0 mg bílého amorfnxho prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3261,7; nalezeno 3261,8.

Príklad 16

Príprava Ac-fN-Me-Ala¹, Lys¹² , Nle^·⁷ , Ala^·⁹ , Asp²⁵ , Val²⁶ ,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:34)-NH₂]

0,77 g (0,1 mmol) produktu Boc-hexakosapeptid-pryskyŕice z príkladu 15 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití predpisu uvedeného v príkladu 2. Provodou se 2 kondenzační cykly, pri nichž se jednotlivé použije

Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol) a Boc-N-Me-Ala (81 mg, 0, mmol). Potom se peptid navázaný na pryskyŕici zpracuje stupni 1 až 8 podie predpisu 1 a dále se na néj pusobí BOP (442 mg, 1,0 mmol), kyselinou octovou (57 ml, 1,0 mmol) a DIPEA (523 ml, 3,0 mmol) ve 20 ml dimethylformamidú po dobu 6 hodin a potom 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minút. Pryskyŕice se promyje (stupné 10 až 14) a za vakua vysuší. Získá se 0,73 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupín zpúsobem popsaným v príkladu 7, pričemž se získá 191 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 138 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 22 až 37% lineárního gradientu. Získá se 28,0 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3225,4; nalezeno 3225,8.

Príklad 17

Príprava Ac-[2-Nal¹⁰,Leu¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:35)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyŕice (4,0 g, 1,08 mmol o zrnení 100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 μιη, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím predpisu 1, podobné jako v príkladu 2. Provede se celkem 8 kondenzačních cyklú, pri nichž se jednotlivé použije následujících aminokyselín Boc-Thr(Bzl) (1,34 g, 4,3 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4,3 mmol), Boc-Val (938 mg, 4,3 mmol), Boc-Asp(OFm) (889 mg, 2,1 mmol), Boc-Asn (557 mg, 2,4 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4,3 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,9 g, 4,3 mmol) a Boc-Lys(Fmoc) (1,1 g, 4,3 mmol).

Tato pryskyŕice se selektivné zbaví chránících skupín za použití stupňú 1 až 11 podie predpisu 2 a nechá reagovat s BOP (885 mg, 2,0 mmol) ve 20 ml 1% roztoku DIPEA v dimethylformamidu po dobu 2 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je negatívni. Pryskyŕice se promyje za použití stupňú 13 až 16 podie predpisu 2.

Tato pryskyŕice se podrobí jednomu kondenzačnímu cyklu za použití Boc-Lys(2-Cl-Z) (1,79 g, 4,3 mmol) a za vakua vysuší. Získá se 6,3 g produktu Boc-nonapeptid-pryskyŕice.

Část této pryskyŕice (1,89 g, 0,3 mmol) se podrobí 9 kondenzačním cyklúm, pri nichž se jednotlivé použije téchto aminokyselín: Boc-Ala (227 mg, 1,2 mmol), Búc-Ala (227 mg,

1,2 mmol), Boc-Nle (278 mg, 1,2 mmol) a Boc-Gln (325 mg,

1,32 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (498 mg, 1,2 mmol), Boc-Arg(Tos) (514 mg, 1,2 mmol), Boc-Leu (299 mg, 1,2 mmol) a Boc-Leu (498 mg, 2,0 mmol) a Boc-Thr(Bzl) (371 mg, 1,2 mmol). Získá se 2,06 g produktu Boc-oktadekapeptid-pryskyŕice.

0,68 g (0,1 mmol) této pryskyŕice se podrobí 10 kondenzačním cyklúm, pri nichž se jednotlivé použije téchto aminokyselín: Boc-2-Nal (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Phe (106 mg, 0,4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118, 0,4 mmol) a Boc-His(Tos) (164, 0,4 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyŕici se podrobí stupňúm 1 až 8 z pŕepdpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 /

minút. Pryskyŕice se promyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,82 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupín zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 261 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 186 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 30 až 40% lineárního gradientu. Získá se 60,1 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3296,8; nalezeno 3295,6.

Príklad 18

Príprava Ac-[O-Me-Tyr¹⁰,Leu¹²,ΝΙβ¹?,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁸, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:36)-NH₂]

0,68 g (0,1 mmol) produktu Boc-oktadekapeptid-pryskyŕice z príkladu 17 se podrobí 10 kondenzačním cyklúm, podobné jako v príkladu 17, pouze s tím rozdílem, že se Boc-2-Nal v 19. cyklu nahradí Boc-Tyr(O-Me) (59 mg, 0,2 mmol). Získá se 0,61 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 175 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 136 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 28 až 38% lineárního gradientu. Získá se 42,4 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3276,7; nalezeno 3276,0.

Príklad 19

Príprava Ac-[p-F-Phe⁶,p-NH₂-Phe¹⁰,Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,

Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:37)-NH₂]

0,625 g (0,09 mmol) produktu Boc-oktadekapeptid-pryskyŕice z príkladu 17 se podrobí 10 kondenzačním cyklúm, podobné jako v príkladu 17, pouze s tím rozdílem, že se Boc-2-Nal v 19. cyklu nahradí Boc-p-NH(Z)-Phe (166 mg, 0,4 mmol) a Boc-Phe ve 23. cyklu se nahradí Boc-p-F-Phe (113 mg, 0,4 mmol). Získá se 0,84 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupín zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 182 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 160 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 47,2 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složeni aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3279,7; nalezeno 3279,8.

Pŕíklad20

Príprava Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:38)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyŕice (1,25 g, 1,0 mmol o zrnéní 100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 μιη, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím predpisu 1, podobné jako v príkladu 2. Provede se celkem 8 kondenzačních cyklú, pri nichž se jednotlivé použije následujících aminokyselín: Boc-Lys(2-Cl-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (823 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (511 mg,. 2,2 mmol), Boc-Leu (925 mg, 4,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,76 g, 4,0 mmol) a Boc-Lys(Fmoc) (937 mg, 2,0 mmol).

Tato pryskyŕice se selektivné zbaví chránících skupín za použití stupňu 1 až 11 podie predpisu 2 a nechá reagovat s BOP (885 mg, 2,0 mmol) ve 20 ml 1% roztoku DIPEA v dimethylformamidu po dobu 2 hodin. Kaiserova ninhydrinová analýza je negatívni. Pryskyŕice se promyje za použití stupňu 13 až 16 podie predpisu 2.

Tato pryskyŕice se podrobí jednomu kondenzačnímu cyklu za použití Boc-Lys(2-Cl-Z) (1,66 g, 4,0 mmol) a za vakua vysuší. Získá se 2,7 g produktu Boc-nonapeptid-pryskyŕice.

Část této pryskyŕice (0,54 g, 0,2 mmol) se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidú Applied Biosystems Model 430A, tak jako v príkladu

8. Provede se celkem 18 kondenzačních cyklú, pri nichž se jednotlivé použije téchto aminokyselín: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol) a Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) a Boc-Ser(Bzl) (590, 2,0 mmol). Získá se 1,16 g produktu Boc-heptakosapeptidpryskyŕice.

0,54 g (0,1 mmol) této pryskyŕice se podrobí 1 kondenzačnímu cyklu, pri némž se použije Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyŕici se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minút. Pryskyŕice se promyje (stupné 10 až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,5 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pouze s tím rozdílem, že se použije 5 ml fluorovodíku a 0,5 ml anisolu. Získá se 127 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pričemž se získá 74,6 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 24 až 34% lineárního gradientu. Získá se 17,1 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3333,8; nalezeno 3333,4.

Príklad 21

Príprava Ac-fN-Me-Ala¹,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, _Lys27,28-j__{VIp cyklo} (Lys²¹—>Asp²⁵ [Ac-(SEQ ID No:39)-NH₂]

0,58 g (0,1 mmol) produktu Boc-heptakosapeptid-pryskyŕice z príkladu 20 se podrobí 1 kondenzačnímu cyklu s Boc-N-Me-Ala (81 mg, 0,4 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyŕici se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovat s BOP (443 mg, 1,0 mmol), kyselinou octovou (57 ml, 1,0 mmol) a DIPEA (523 ml,

3,0 mmol) ve 20 mlO dimethylformamidu, po dobu 6 hodin a potom s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minút. Pryskyŕice se promyje (stupné 10 až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,4 g produktu.

_;ď,ľ|h-7.* '

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupín zpúsobem popsaným v príkladu 20, pŕičemž se získa 165 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtraci zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získa 101 mg poločistého produktu. Tato látka se dáie prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdilem, že se k eluci použije 24 až 34% lineárního gradientu. Získá se 19,8 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správne složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3281,8; nalezeno 3281,9.

Príklad 22

Príprava Ac-[Glu®,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷,28 j_VIp cykio (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:40)-NH2]

0,54 g (0,2 mmol) produktu Boc-nonapeptid-pryskyŕice z príkladu 20 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidú Applied Biosystems Model 430A, tak jako v príkladu 8. Provede se celkem 18 kondenzačních cyklú, pri nichž se jednotlivé použije téchto aminokyselín: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol) a Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg,

2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol),

Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Glu(0-Bzl) (675 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) a Boc-Ser(Bzl) (590, 2,0 mmol). Získá se 0,58 g produktu Boc-heptakosapeptid-pryskyŕice.

Tato pryskyŕice se podrobí 1 kondenzačnímu cyklu, pri némž se použije Boc-His(Tos) (164 mg, 0,4 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyŕici se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minút. Pryskyŕice se promyje (stupné 10 až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,53 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pouze s tím rozdílem, že se použije 5 ml fluorovodíku a 0,5 ml anisolu. Získá se 151 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 110 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 23,5 až 33,5% lineárního gradientu. Získá se 22,8 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3347,9; nalezeno 3347,0.

Príklad 23

Príprava Ac-[O-Me-Tyr¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SÉQ ID No:41)-NH₂]

1,84 g (0,3 mmol) produktu Boc-nonapeptid-pryskyŕice z príkladu 17 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidú Applied Biosystems Model 430A, tak jako v príkladu 8. Provede se celkem 9 kondenzačních cyklú, pri nichž se jednotlivé použije téchto aminokyselín: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol) a Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol),

Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg,

2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol) a Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). Získá se 2,2 g produktu Boc-oktadekapeptid-pryskyŕice.

0,73 g (0,1 mmol) této pryskyŕice se podrobí 10 kondenzačním cyklúm, pri nichž se jednotlivé použije téchto aminokyselín Boc-Tyr(O-Me) (59 mg, 0,2 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol),

Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Bôc-Phe (106 mg, 0,4 mmol), Boc-Val (87 mg, 0,4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol),

Boc-Asp(OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol) a Boc-His(Tos) (164 mg, 0,4 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyŕici se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minút. Pryskyŕice se promyje (stupné 10 až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,77 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 187 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 131 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 26 až 36% lineárního gradientu. Získá se 5,3 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složeni aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3291,8; nalezeno 3291,7.

·- 74

Pŕíklad24

Príprava Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸, Ala^29-31]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:42)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyŕice (1,1 g, 0,5 mmol o zrnéní 200 až 400 rnesh podie ASTM, t.j. 38 až 75 μπι, výrobek firmy BIOMEGA) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím predpisu 1, podobné jako v príkladu 2. Provede se celkem 13 kondenzačních cyklú, pri nichž se jednotlivé použije následujících aminokyselín: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (823 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (511 mg, 2,2 mmolj, Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (881 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (936 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol) a Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol).

Tato pryskyŕice se selektivné zbaví chránících skupin za použití stupňu 1 až 11 podie predpisu 2 a nechá reagovat s BOP (443 mg, 1,0 mmol) ve 20 ml 1% roztoku DIPEA v dimethylformamidu po dobu 1 hodiny. Kaiserova ninhydrinová analýza je negatívni. Pryskyŕice se promyje za použití stupňú 13 až 16 podie predpisu 2 a za vakua vysuší. Získá se 2,02 g produktu Boc-tridekapeptid-pryskyŕice.

Část této pryskyŕice (0,8 g, 0,2 mmol) se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidú Applied Biosystems Model 430A, tak jako v príkladu

8. Provede se celkem 16 kondenzačních cyklu, pri nichž se jednotlivé použije téchto aminokyselín: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol),

Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) a Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol). Získá se 1,2 g produktu

Boc-nonakosapeptid-pryskyŕice.

0,6 g (0,1 mmol) této pryskyŕice se podrobí 2 kondenzačním * cyklúm, pri nichž se použije Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol). Získá se 0,72 • g pryskyŕice.

Získaný peptid navázaný na pryskyŕicí se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minút. Pryskyŕice se promyje (stupné 10 až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,645 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕicí se zbaví chránících skupín zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 280 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 160 mg ' poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím i . / rozdilem, ze se k eluci použije 22 až 32% lineárniho gradientu. Získá se 23,1 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zjisti, že má správné složeni aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3561,1; nalezeno 3560,8.

- 76 Príklad 25

Príprava Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵, Leu²⁶, Lys27,28> Aia29-31]_VIp cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:43)-NH2]

0,6 g (0,1 mmol) produktu Boc-nonakosapeptid-pryskyŕice z príkladu 24 se podrobí dvéma kondenzačním stupňum, zpúsobem popsaným výše, pri nichž se jednotlivé použije Boc-Ser(Bzl) (590 mg), 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol). Získá ♦ se 0,68 g produktu.

• Získaný peptid navázaný na pryskyŕici se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minút. Pryskyŕice se promyje (stupné 10 až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,56 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 160 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 70 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím * rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 21,8 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj isti, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS; MH vypočteno 3545,1; nalezeno 3545,3.

Príklad 26

Príprava Ac-[N-Me-Ala¹,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,

Leu²⁶, Lys²⁷' ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:44)-NH₂]

1,1 g (0,4 mmol) produktu Boc-nonapeptid-pryskyŕice z príkladu 20 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidú Applied Biosystems Model 430A, tak jako v príkladu 8. Provede se celkem 17 kondenzačních cyklú, pri nichž se jednotlivé použije téchto aminokyselín: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg,

2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), • Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 • mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) a Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol). Získá se 2,24 g produktu

Boc-hexakosapeptid-pryskyŕice.

Tato pryskyŕice (1,1 g, 0,2 mmol) se podrobí 2 kondenzačním cyklúm, pri nichž se použije Boc-Ser(Bzl) (238 mg, 0,8 mmol) a Boc-N-Me-Ala (163 mg, 0,8 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyŕici se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovat s BOP-Cl (100 mg, 0,2 mmol), kyselinou octovou (23 ml, 0,2 mmol) a DIPEA (140 ml, • 0,4 mmol) ve 20 ml dimethylformamidu po dobu 1 hodiny. Pryskyŕice se promyje (stupne 10 až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,95 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7. Získá se 245 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 165 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se

33,7 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MSMH vypočteno 3295,8; nalezeno 3294,5.

Príklad 27

Príprava Ac-[p-F-Phe⁶, Glu⁸, Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:45)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyŕice (2,49 g, 2,0 mmol o zrnéní 100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 μπι, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím predpisu 1, podobné jako v príkladu 2. Provede se celkem 6 kondenzačních cyklú, pri nichž se jednotlivé použije následujících aminokyselín: Boc-Lys(2-C1-Z) (3,32 g, 8,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (3,32 g, 8,0 mmol), Boc-Leu (1,85 g, 8,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (823 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (1,02 g, 4,4 mmol) a Boc-Leu (1,05 g, 8,0 mmol). Získaná pryskyŕice se vysuší a oddélí se z ní 0,4 mmol. Nasleduj í 3 kondenzační cykly, pri nichž se jednotlivé použije Boc-Tyr(2,6-DCB) (2,52 g, 6,4 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (1,87 g, 6,4 mmol) a Boc-Lys(2-C1-Z) (2,65 g, 6,4 mmol).

Tato pryskyŕice se selektivné zbaví chránících skupín za použití stupňú l až 11 podie predpisu.2 a nechá reagovat s BOP (1,42 g, 3,2 mmol) ve 20 ml 1% roztoku DIPEA v dimethyl formamidu po dobu 4,5 hodiny. Kaiserova ninhydrinová analýza je negatívni. Pryskyŕice se promyje za použití stupňú 13 až 16 podie predpisu 2 a vysuší. Získá se 6,56 g produktu Boc-nonapeptid-pryskyŕice.

Část této pryskyŕice (1,64 g, 0,4 mmol) se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidú Applied Biosystems Model 430A, tak jako v príkladu

8. Provede se celkem 13 kondenzačních cyklú, pri nichž se jednotlivé použije téchto aminokyselín: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) a Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). Získá se 2,56 g produktu Boc-dokosapeptid-pryskyŕice.

Část této pryskyŕice (0,64 g, 0,1 mmol) se podrobí 6 kondenzačním cyklúm, pri nichž se jednotlivé použije následujících aminokyselín: Boc-p-F-Phe (283 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (218 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol) a Boc-His(Tos) (818 mg, 2,0 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyŕici se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minút. Pryskyŕice sé promyje (stupné 10 až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,69 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupín zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 224 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtraci zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 213 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 27 až 37% lineárního gradientu. Získá se 70,5 mg bíléhó amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zjistí, že má správné složeni aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3365,9; nalezeno 3365,6.

Príklad 28

Príprava Ac-[1-Nal⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:46)nh₂]

1,28 g (0,2 mmol) produktu Boc-dokosapeptid-pryskyŕice z príkladu 27 se podrobí 6 kondenzačním cyklúm, tak jako v príkladu 27, pouze s tím rozdílem, že se Boc-p-F-Phe v prvním cyklu nahradí Boc-l-Nal (315 mg, 1,0 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyŕicí se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minút. Pryskyŕice se promyje (stupné 10 až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 1,41 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕicí se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 420 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 305 mg poločistého produktu. Tato látka sé dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 66,9 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3398,0; nalezeno 3398,8.

Príklad 29

Príprava Ac-[Glu⁸,p-NH₂~Phe¹⁰,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No: 47) nh₂]

- 81 1,64 g (0,4 mmol) produktu Boc-nonapeptid-pryskyŕice z príkladu 27 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidú Applied Biosystems Model 430A, tak jako v príkladu 8. Provede se celkem 9 kondenzačních cyklú, pri nichž se jednotlivé použije téchto aminokyselín: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol) a Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg,

2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol) a Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). Získá se

2,2 g produktu Boc-oktadekapeptid-pryskyŕice.

^w Část této pryskyŕice (1 g, 0,2 mmol) se podrobí 10 kondenzačním cyklúm, pri nichž se jednotlivé použije téchto aminokyselín: Boc-p-NH(CBZ)-Phe (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Asn (512 mg, 2,2 mmol), Boc-Glu(Bzl) (675 mg, 2,0 mmol),

Boc-Thr(Bzl) (620 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (532 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (436 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (510 mg, 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (1,64 g, 4,0 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyŕici se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 * minút. Pryskyŕice se promyje (stupné 10 až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 1,45 g produktu.

·< Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7. Získá se 580 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 400 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 22 až 32% lineárního gradientu. Získá se

60,9 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie

HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3346,9; nalezeno 3346,8.

Príklad 30

Príprava Ac-[Glu⁸,O-Me-Tyr¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No: 48)-NH₂]

1,1 g (0,2 mmol) produktu Boc-oktadekapeptid-pryskyŕice z príkladu 29 se podrobí 10 kondenzačním cyklúm, tak jako v príkladu 29, pouze s tím rozdílem, že se Boc-p-NH(CBZ)-Phe v prvním cyklu nahradí Boc-O-Me-Tyr (14 mg), 0,5 mmol.

Získaný peptid navázaný na pryskyŕici se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovať s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minút. Pryskyŕice se promyje (stupné 10 až 14 predpisu l) a za vakua vysuší. Získá se 1,45 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupín zpúsobem popsaným v príkladu 7. Získá se 555 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 460 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se

152,9 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj isti, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3361,9; nalezeno 3361,7.

Príklad 31

Príprava Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO: 49)-NH₂]

1,2 g (0,2 mmol) produktu Boc-nonapeptid-pryskyŕice z príkladu 17 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidú Applied Biosystems Model 430A, jako v príkladu 8. Provede se celkem 13 kondenzačních cyklu, pri nichž se jednotlivé použije téchto aminokyselín: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg,

2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol),

Bo-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol) a Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol). Získá se 1,3 g produktu Boc-dokosapeptidpryskyŕice.

Část této pryskyŕice (0,65 g, 0,1 mmol) se podrobí 6 kondenzačním cyklúm, tak jako v príkladu 27.

Získaný peptid navázaný na pryskyŕici se podrobí stupňum 1 až 8 z predpisu l a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minút. Pryskyŕice se promyje (stupné 10 až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,856 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupín zpúsobem popsaným v príkladu 7. Získá se 550 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pričemž se získá 225 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 27 až 37% lineárního gradientu. Získá se

80,9 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správne složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3295,7; nalezeno 3296,2.

Príklad 32

Príprava Ac-[1-Nal⁶,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No: 50)-NH₂]

0,65 g (0,1 mmol) produktu Boc-dokosapeptid-pryskyŕice z príkladu 31 se podrobí 6 kondenzačním cyklum, tak jako v pri kladu 27, s tím rozdílem, že se Boc-p-F-Phe v 1. cyklu nahradí Boc-l-Nal (315 mg, 1,0 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyŕici se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minút. Pryskyŕice se promyje (stupné 10 až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,801 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupín zpúsobem popsaným v príkladu 7. Získá se 250 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 188 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 27 až 37% lineárního gradientu. Získá se 28,0 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3327,8; nalezeno 3328,5.

Príklad 33

Príprava Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸,Gly²⁹'³⁰Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹·—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:51)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyŕice (1,1 g, 0,5 mmol o zrnení 200 až 400 mesh podie ASTM, t.j. 38 až 75 μπι, výrobek firmy BIOMEGA) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím predpisu 1, podobné jako v príkladu 2. Provede se celkem 13 kondenzačních cyklú, tak jako v príkladu 24, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Ala v 1. cyklu nahradí Boc-Thr(Bzl) (619 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala ve 2. cyklu se nahradí Boc-Gly (350 mg, 2,0 mmol) a Boc-Ala ve 3. cyklu se nahradí Boc-Gly (350 mg, 2,0 mmol). Získá se 2,03 g produktu Boc-tridekapeptidpryskyŕice.

Část této pryskyŕice (1,22 g, 0,3 mmol) se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidú Applied Biosystems Model 430A, jako v príkladu 8. Provede se celkem 16 kondenzačních cyklú, tak jako v príkladu 24, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Asp(OcHx) v 11. cyklu nahradí Boc-Glu(Bzl) (675 mg, 2,0 mmol). Získá se 1,95 g produktu Boc-nonakosapeptid-pryskyŕice.

0,975 g (0,15 mmol) této pryskyŕice se podrobí 2 kondenzačním cyklúm, pri nichž se použije Boč-Ala (378 mg, 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol). Získá se 1,05 g pryskyŕice.

Získaný peptid navázaný na pryskyŕicí se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minút. Pryskyŕice se promyje (stupné 10 až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,897 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 270 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 150 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 24 až 34% lineárního gradientu. Získá se 28,7 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složeni aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3547,1; nalezeno 3546,9.

Príklad 34

Príprava Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸, Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Äsp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)nh₂]

0,975 g (0,15 mmol) produktu Boc-nonakosapeptid-pryskyŕice z príkladu 33 se podrobí 2 kondenzačním cyklúm, tak jako v príkladu 33, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Ala v 1. cyklu nahradí Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2,0 mmol). Získá se 0,915 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 303 mg /

surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 180 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 42,8 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složeni aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3563,1; nalezeno 3562,6.

Príklad 35

Príprava Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, _Lys27,28j__{VIp cyklo} (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:53)-NH₂J

0,27 g (0,1 mmol) produktu Boc-nonapeptid-pryskyŕice z príkladu 20 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidú Applied Biosystems Model 430A, jako v príkladu 8. Provede se celkem 19 kondenzačních cyklú, pri nichž se jednotlivé použije téchto aminokyselín: Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol), Boc-Gln (493 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (856 mg,

Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Glu(0-Bzl) (675 mg, 2,0 mhol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590, 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (818 mg, 2,0 mmol). Získá se 0,57 g produktu Boc-oktakosapeptidpryskyŕice.

Získaný peptid navázaný na pryskyŕici se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minút. Pryskyŕice se promyje (stupné 10 až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,506 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pričemž se získá 160 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pričemž se získá 100 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 17,1 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složeni aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3331,9; nalezeno 3332,0.

Príklad 36

Príprava Ac-[p-NH₂-Phe¹⁰,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:54)-NH₂]

0,6 g (0,1 mmol) produktu Boc-nonapeptid-pryskyŕice z príkladu 17 se podrobí syntetickému postupu v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidu Applied Biosystems Model 430A, jako v príkladu 8. Provede se celkem 9 kondenzačních cyklu, tak jako v príkladu 23, pŕičemž se získá 0,72 g produktu Boc-oktadekapeptid-pryskyŕice. Tato pryskyŕice se podrobí jednomu kondenzačnímu cyklu s Boc-p-NH(CBZ)-Phe (166 mg, 0,4 mmol). Získá se 0,79 g produktu Boc-nonadekapeptidpryskyŕice.

Tato pryskyŕice se podrobí syntéze v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidu Applied Biosystems Model 430A, jako v príkladu 8. Provede se celkem 9 kondenzačních cyklú, jako v príkladu 23, pŕičemž se získá 0,72 g produktu Boc-oktadekapeptid-pryskyŕice. Tato pryskyŕice se podrobí syntéze v pevné fázi za použití syntetizátoru peptidú Applied Biosystems Model 430A, jako v príkladu 8. Provede se celkem 9 kondenzačních cyklú, pri nichž se jednotlivé použije následujících aminokyselín: Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg,

2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590, 2,0 mmol) a Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol). Získá se 0,91 g produktu.

Získaný peptid navázaný na pryskyŕici se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu ve 20 ml 6% roztoku DIPEA v methylenchloridu po dobu 60 minút. Pryskyŕice se promyje (stupné 10 až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,85 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 350 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 138 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 25,2 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3276,8; nalezeno 3276,2.

Príklad 37

Príprava Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-OCH3-Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:55)-NH2]

Benzhydrylaminová pryskyŕice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnéní 100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 μιη, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím predpisu 1, podobné jako v príkladu 2. Provede se celkem 9 kondenzačních cyklú, pri nichž se jednotlivé použije následujících aminokyselín: Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (267 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OFm) (212 mg, 0,5 mmol), Boc-Asn (255 mg, 1,1 mmol), Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-m-OCH₃-Tyr(Bzl) (80 mg, 0,2 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (234 mg, 0,5 mmol) a Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol).

Tato pryskyŕice se selektívne zbaví chránících skupin za použití stupňu 1 až 11 podie predpisu 2 a nechá reagovat s BOP (132 mg, 0,3 mmol) v 10 ml 1% roztoku DIPEA v dimethylformamidu po dobu 3,5 hodiny. Kaiserova ninhydrinová analýza je negatívni. Pryskyŕice se promyje za použití stupňu 13 až 16 podie predpisu 2.

Provede se celkem 19 kondenzačních cyklu, pri nichž se jednotlivé použije téchto aminokyselín: Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Nle (231 mg, 1,0 mmol), Boc-Gln (270 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Arg(Tos) (428 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu (267 mg, 1,0 mmol), Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (220 mg, 0,5 mmol), Boc-Asn (256 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0 mmol), Boc-Phe (265 mg, 1,0 mmol), Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol) a Boc-His(Tos) (409 mg, 1,0 mmol).

Získaný peptid navázaný na pryskyŕici se podrobí stupňúm 1 až 8 z predpisu 1 a nechá reagovat s 0,5 ml acetanhydridu v 10 ml 6% roztoku DIPEA v -methylenchloridu po dobu 60 minút. Pryskyŕice se promyje (stupne 10'až 14 predpisu 1) a za vakua vysuší. Získá se 0,814 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 265 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 150 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 23 až 33% lineárního gradientu. Získá se 8,1 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složeni aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3307,8; nalezeno 3306,8.

Príklad 38

Príprava Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:56)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyŕice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnéní 100 až 200 rnesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 μπι, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím predpisu 1, podobné jako v príkladu 2. Provede se celkem 28 kondenzačních cyklú, tak jako v príkladu 37, pouze s tím rozdílem, že se Boc-m-OCH^-Tyr(Bzl) v 7. cyklu nahradí Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl) (78 mg, 0,2 mmol). Získá se 0,754 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 254 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 114 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 27 až 37% lineárního gradientu. Získá se 15,1 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složeni aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3295,7; nalezeno 3295,5.

Príklad 39

Príprava Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-OCH₃-Tyr²²,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:57)nh_2]

Benzhydrylaminová pryskyŕice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnení 100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 μιη, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím predpisu 1, podobné jako v príkladu 2. Provede se celkem 28 kondenzačních cyklú, tak jako v príkladu 37, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Thr(Bzl) v 1. cyklu nahradí Boc-Lys(2-C1-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu ve 2. cyklu se nahradí Boc-Lys(2-Cl-Z) (415 mg, 1,0 mmol), Boc-Val ve 3. cyklu se nahradí Boc-Leu (268 mg, 1,0 mmol) a Boc-Asp(OcHx) ve 21. cyklu se nahradí Boc-Glu(O-Bzl) (337 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,90 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 270 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 155 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 29,6 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3377,9; nalezeno 3377,9.

Príklad 40

Príprava Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,Leu²⁶, Ľys27,28j_VIp cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:58)-NH2]

Benzhydrylaminová pryskyŕice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnéní 100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 μιη, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím predpisu 1, podobné jako v príkladu 2. Provede se celkem 28 kondenzačních cyklú, tak jako v príkladu 39, pouze s tím rozdílem, že se Boc-m-OCH-j-Tyr(Bzl) v 7. cyklu nahradí Boc-m-F-DL-Tyr(Bzl) (78 mg, 0,2 mmol). Získá se 0,83 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupín zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 240 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtraci zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 100 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 37,2 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zjistí, že má správné složeni aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3365,9; nalezeno 3365,8.

Príklad 41

Príprava Ac-[Ala⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-SEQ ID No:59)-NH₂)

Benzhydrylaminová pryskyŕice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnéní 100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 μιη, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím predpisu 1, podobné jako v príkladu 2. Provede se celkem 28 kondenzačních cyklú, tak jako v príkladu 39, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Asn v 5.cyklu nahradí Boc-Ala (189 mg,

1,0 mmol), Boc-m-OCH₃-Tyr(Bzl) v 7.cyklu se nahradí Boc-Tyr(2,6 DCB) (440 mg, 1,0 mmol) a Boc-Glu (OBzl) v 21. cyklu se .nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,85 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupín zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 255 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 112 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 12,0 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3246,8; nalezeno 3246,7.

Príklad 42

Príprava Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶·¹⁷·¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷·²⁸]VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:60)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyŕice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnéní 100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 μιη, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím predpisu 1, podobné jako v príkladu 2. Provede se celkem 28 kondenzačních cyklú, tak jako v príkladu 41, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Ala v 5. cyklu nahradí Boc-Asn (256 mg, 1,1 mmol), Boc-Nle ve 12. cyklu se nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Gln ve 13. cyklu se nnahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol) a Boc-Ala ve 21. cyklu se nahradí Boc-Glu(OBzl) (337 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,80 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupín zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 254 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 115 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 20 až 30% lineárního gradientu. Získá se 32,1 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a'analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3248,7; nalezeno 3248,3.

Príklad 43

Príprava Ac-[Ala⁸,Lys¹²,Ala¹⁶,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:61)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyŕice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnéní 100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 um, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím predpisu 1, podobné jako v príkladu 2. Provede se celkem 28 kondenzačních cyklú, tak jako v príkladu 41, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Gln ve 13. cyklu nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,93 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupín zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 250 mg surového peptidú. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 100 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 27 až 37% lineárního gradientu. Získá se 23,6 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zjistí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3189,8; nalezeno 3189,9.

Príklad 44

Príprava Ac-[Ala⁸,Lys¹²,Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶, LyS²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-SEQ ID No:62)-NH2]

Benzhydrylaminová pryskyŕice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnení 100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 μιη, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím predpisu 1, podobné jako v príkladu 2. Provede se celkem 28 kondenzačních cyklú, tak jako v príkladu 43, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Nle ve 12. cyklu nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,762 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 240 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 150 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 22 až 32% lineárního gradientu. Získá se 55,3 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí , že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3147,7; nalezeno 3148,0.

Príklad 45

Príprava Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:63)-NH2]

Benzhydrylaminová pryskyŕice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnéní 100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 μιη, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím predpisu 1, podobné jako v príkladu 2. Provede se celkem 28 kondenzačních cyklú, tak jako v príkladu 42, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Ala ve 12. cyklu nahradí Boc-Nle (231 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,775 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupín zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 203 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 100 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 27 až 37% lineárního gradientu. Získá se 40,0 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3290,8; nalezeno 3290,5_t

Príklad 46

Príprava Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys27,28]_VIp cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:64)-NH2J

Benzhydrylaminová pryskyŕfce (0,125 g, 0,1 mmol o zrnéní 100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 gm, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím predpisu

1, podobné jako v príkladu 2. Provede se celkem 28 /

kondenzačních cyklú, tak jáko v príkladu 43, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Ala ve 21. cyklu nahradí Boc-Glu(OBzl) (337 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,837 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupín zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 178 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 126 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpusobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 20 až 30% lineárního gradientu. Získá se 24,9 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správne složeni aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3205,7; nalezeno 3205,2.

Príklad 47

Príprava Ac- [Glu® ,Lys^·² ,Nle^-⁷, Ala·*·® ,Asp²^,Val²® ,Thr²® ,

Gly²⁹ < ³⁰ , Thr³! ] - VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:65)NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyŕice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnení 100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 μιη, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím predpisu 1, podobné jako v príkladu 2. Provedou se 3 kondenzační cykly, pri nichž se jednotlivé použije následujících aminokyselín: Boc-Thr(Bzl) (310 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol) a Boc-Gly (175 mg, 1,0 mmol). Dále se provede 28 kondenzačních cyklú, tak jako v príkladu 37, pouze s tím rozdílem, že se Boc-m-OCH^-Tyr(Bzl) v 7. cyklu nahradí Boc-Tyr(2,6-DCB) (440 mg, 1,0 mmol) a Boc-Asp(OcHx) ve 21. cyklu se nahradí Boc-Glu(0-Bzl) (337 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,895 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 440 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 120 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 27,7 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3506,9; nalezeno 3205,8.

Príklad 48

Príprava Ac-[p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸, Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²!—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:66)nh₂1

Benzhydrylaminová pryskyŕice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnéní 100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 gm, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím predpisu 1, podobné jako v príkladu 2. Provede se celkem 31 kondenzačních cyklú, tak jako v príkladu 47, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Ala ve 13.cyklu nahradí Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol) a Boc-Phe ve 26. cyklu se nahradí Boc-p-F-Phe (142 mg, 0,5 mmol). Získá se 0,754 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 280 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 152 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 27 až 38% lineárního gradientu. Získá se 53,4 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3553,0; nalezeno 3552,2.

100

Príklad 49

Príprava Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,

Gly²⁹·³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:67)nh₂]

Benzhydrylaminová pryskyŕice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnení 100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 μιη, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím predpisu 1, podobné jako v príkladu 2. Provede se celkem 31 kondenzačních cyklú, tak jako v príkladu 47, pouze s tím -* rozdílem, že se Boc-Thr(Bzl) ve 4. cyklu nahradí Boc-Lys(2Cl-Z) (414 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu v 5. cyklu se nahradí BocLys (2-Cl-Z) (414 mg, 1,0 mmol), Boc-Val v 6. cyklu se nahradí Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol), Boc-Ala ve 13. cyklu se nahradí Boc-Val (217 mg, 1,0 mmol) a Boc-Ser(Bzl) ve 13. cyklu se nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,838 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupin zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 370 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 196 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí , preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 23 až 33% lineárního « gradientu. Získá se 48,4 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složeni aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3575,1; nalezeno 3574,0.

Príklad 50

Príprava Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,Gly²⁹'³⁰, Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:68)-NH₂]

101

Benzhydrylaminová pryskyŕice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnéní 100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 pm, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím predpisu 1, podobné jako v príkladu 2. Provede se celkem 31 kondenzačnich cyklu, tak jako v príkladu 49, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Ala ve 13. cyklu nahradí Boc-Ser(Bzl) (295 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,913 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránicích skupín zpúsobem popsaným v príkladu 7, pričemž se získá 378 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pričemž se získá 240 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 25 až 35% lineárního gradientu. Získá se 28,8 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složení aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3591,1; nalezeno 3590,3.

Príklad 51

Príprava Ac-[Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,

Ala^29-31]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:69)-NH₂]

Benzhydrylaminová pryskyŕice (0,125 g, 0,1 mmol o zrnení 100 až 200 mesh podie ASTM, t.j. 75 až 150 μιη, výrobek firmy BACHEM) se podrobí syntéze v pevné fázi s využitím predpisu 1, podobné jako v príkladu 2. Provede se celkem 31 kondenzačnich cyklú, tak jako v príkladu 47, pouze s tím rozdílem, že se Boc-Thr(Bzl) v 1. cyklu nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly ve 2. cyklu se nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Gly ve 3. cyklu se nahradí Boc-Ala (189 mg, 1,0 mmol), Boc-Thr(Bzl) ve 4. cyklu se nahradí

102

Boc-Lys(2-Cl-Z) (414 mg, 1,0 mmol), Boc-Leu v 5. cyklu se nahradí Boc-Lys(2-Cl-Z) (414 mg, 1,0 mmol), Boc-Val v 6. cyklu se nahradí Boc-Leu (249 mg, 1,0 mmol) a Boc-Glu(OBzl) ve 24. cyklu se nahradí Boc-Asp(OcHx) (315 mg, 1,0 mmol). Získá se 0,844 g produktu.

Peptid navázaný na pryskyŕici se zbaví chránících skupín zpúsobem popsaným v príkladu 7, pŕičemž se získá 360 mg surového peptidu. Tento peptid se prečistí gelovou filtrací zpúsobem popsaným v príkladu 3, pŕičemž se získá 115 mg poločistého produktu. Tato látka se dále prečistí preparativní HPLC zpúsobem popsaným v príkladu 3, pouze s tím rozdílem, že se k eluci použije 24 až 34% lineárního gradientu. Získá se 34,7 mg bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je podie HPLC homogénni a analýzou se zj istí, že má správné složeni aminokyselín. FAB-MS: MH vypočteno 3547,1; nalezeno 3546,0.

Príklad 52

Účinnost analogú VIP na relaxaci prúdušnice

Relaxační účinnost analogú VIP se študuje na modelu, pri némž se používá prúdušnice morčete [Wasserman M.A. a dalši, v publikaci Vasoactive Intestinal Peptide, red. S.I. Said, Raven Press, N.Y. 1982, str. 177 až 184]. Všechny tkáné se odebírají ze samou albínských morčat o hmotnosti 400 až 600 g, anestetizovaných urethanem (2 g/kg i.p.). Po exanguinaci se vyjme prúdušnice a rozdelí na 4 kruhové segmenty, z nichž každý má délku 3 mm. Každý kroužek se zavésí za použití dráťu z nerezové oceli o tloušťce 76 μιη do 10 ml nádoby s duplikátorovým pláštém pro tkáňové lázné a pomoci hedvábné nité 4-0 pripojí k zaŕizeni pro méŕení napétí Grass Force Displacement Transducer, Model FTO3C, výróbek firmy Grass

103

Instruments Co. , Quincy, MA), za účelem izometrického méŕení a zaznamenávání napétí. Hladký sval se máčí v lázni obsahující modifikovaný Krebsúv roztok následujícího složeni: chlorid sodný, 120 mM; chlorid draselný, 4,7 mM; chlorid vápenatý, 2,5 mM; heptahydrát síranu horečnatého, 1,2 mM; hydrogénuhličitan sodný, 25 mM; hydrogenfosforečnan didraselný, monobazický, 1,2 mM; a dextróza, 10 mM. Tkáňová lázeň se udržuje pri teploté 37 °C a prúbéžné probublává smési 95 % kyslíku a 5 % oxidu uhličitého. Odpovéčf se zaznamenává na 8-kanálovém a 4-kanálovém zapisovači Hewlett-Packard (Model 7702B a 7754A), což jsou výrobky firmy Hewlett-Packard, Paramus, NJ). Prúdušnicové kroužky se umístí pod klidové napétí 1,5 g, o némž bylo zjišténo, že je optimálni nebo blízké optimálnímu v pŕedchozích pokusech. V prúbéhu šedesátiminutové stabilizační periódy, která následuje, je zapotŕebí napétí znovu upravovat. Tkáné se oplachuj í v 15 minútových intervalech.

Krivky závislosti odpovedi na kumulatívni koncentraci pro každou tkáň se získají postupným zvyšováním koncentrace VIP nebo analogú VIP pŕidáváním mikrolitrových množství téchto látek do lázné podie postupu posaného v VanRossum, Árch. Ind. Pharmacodyn., 143, 299 až 330 (1963). Pro jednu tkáň se získá pouze jedna krivka odpovedi na kumulatívni dávku. Pro minimalizaci rozdílú mezi tkánémi se relaxační odpovéd vyjádŕí jako procentický podíl získané maximálni odpovédi na VIP (10 θ M = 100 %), pridaný na záver každého experimentu, pri némž se méŕí závislost odpovédi na koncentraci. Sečtou se odpovédi ze tŕí tkání a lineárni regresí se stanoví hodnoty ^EC50 ’

Výsledky, které jsou souhrnné uvedený v tabulce 1 ukazuj í relaxační účinnost analogú VIP na prúdusnici, ve srovnání s účinností nativního VIP.

104

Tabulka I

Relaxační účinnost analogu VIP na tracheální hladký sval morčete sloučenina

EC (nM)

VIP[(Seq ID N0:l)-NH2) 10

Ac-[Lys¹²,Nie¹⁷,Val²®,Thr²®]-VIP cyklo (Asp®->Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:20)-NH₂] 14

Ac-[Glu®,Lys¹²,Nie¹⁷,Val²®,Thr²⁸]-VIP cyklo (Glu®—»Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:21)-NH₂] 34

Ac-[Asn®,Asp⁹,Lys¹²,Nie¹⁷,Val² ®,Thr²®]-VIP cyklo (Asp⁹->Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:22)-NH₂] 17

Ac-[Orn¹²,Nie¹⁷,Val²®,Thr²⁸]-VIP cyklo (Asp®—>0rn¹²) [Ac-(SEQ ID NO:23)-NH₂] 40

Ac-[Lys®,Asp¹²,Nie¹⁷,Val² ®,Thr²®]-VIP cyklo (Lys®—>Asp¹²) [Ac-(SEQ ID NO:24)-NH₂] ' 38

Ac-(Glu®,Orn¹²,Nie¹⁷,Val²®,Thr²®]-VIP cyklo (Glu⁸—J-Orn¹²) [Ac-(SEQ ID NO:25)-NH₂] 16

Ac-[Lys¹²,Glu¹®,Nie¹⁷,Val²®,Thr²®]-VIP cyklo (Lys¹²—>Glu¹⁶) [Ac-(SEQ ID NO:26)-NH₂] 37

Ac-[Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁴,Val²®,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²⁰—>Asp²⁴) [Ac-(SEQ ID NO:27)-NH₂] 5,3

- 105 3,1

Ac-[Lys¹²,Nie¹⁷, Asp²⁶,Val²⁶,Thr²⁸] -VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID ΝΟ:28)-ΝΗ₂]

Ac- [Lys¹², Nie¹⁷ , Ala¹⁹, Asp²⁶, Val²⁶, Thr²⁸ ] - VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:29)-NH₂] 0,70

Ac-[p-F-Phe⁶,2-Nal¹⁹,Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁶, Val²⁶,

Thr²⁸, Gly²⁹'Met⁶¹ ]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁶) [Ac-(SEQ ID NO:30)-NH₂] 1_;3

Ac- [Glu⁸, Orn¹², Nie¹⁷, Asp²⁶, Val²⁶, Thr²⁸] -VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:31)-NH₂] 2_f2

Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸,

Gly²⁹' ⁶θ, Cys (Aon) ⁵¹] -VIP cyklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac—(SEQ ID NO:32)-NH₂] 0,44

Ac-[Ala²,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:33)-NH₂] i_;2

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵, Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac—(SEQ ID NO:34)-NH₂] 0,71

Ac- [2-Nal¹⁰, Leu¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶·,Thr²⁸]VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:35)-NH₂] 4_;2

Ac-[O-CH₃-Tyr¹⁰,Leu¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val^{2 6},

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:36)-NH₂] 0,84

106

Ac- [p-F-Phe®,p-NH₂-Phe¹⁶,Leu¹²,Nie¹⁷,Ala¹$, Asp²⁶,

Val²⁶, Thr²⁸] -VIP cyklo (Lys²¹-*Asp²⁵) [Ac—(SEQ ID NO:37)-NH₂] 4,4

Ac- [Lys¹²,Nie¹⁷, Ala¹9, Asp²⁶, Leu²⁶, Lys²⁷'2®] -VIP cyklo (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH₂] 0,13

Ac- [N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹®,Asp²⁶,Leu²⁶,

Lys²⁷'²®]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁶) [Ac-(SEQ ID NO:39)-NH₂] 0,95

Ac- [Glu®, Lys¹², Nie i 7 _z Ala¹®, Asp²⁶, Leu²®, Lys²”?, 28 ] _

VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁶) [Ac-(SEQ ID NO:40)-NH₂] 0,45

Ac- [O-Me-Tyr¹*®, Lys¹²,Nie¹?, Ala¹®, Asp²⁶, Val²®,

Thr²®]-VIP cyklo (Lys^2l->Asp²⁶) [Ac-(SEQ ID NO:41)-NH₂] 2,6

Ac- [Glu®, Lys¹², Nie¹”?, Ala¹®, Asp²⁶, Leu²⁶, Lys²⁷> ²®,

Ala² θ“31 ]-VIP cyklo (Lys²¹—»Asp²⁶) [Ac-(SEQ ID NO:42)-NH₂] 0,61

Ac- [Ala², Glu®, Lys¹², Nie¹?, Ala¹®, Asp²⁶, Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸,Ala²®^-61]-VIP _cyklo (Lys²¹->Asp²⁶) [Ac-(SEQ ID NO:43)-NH₂] 0,55

Ac- [N-Me-Ala¹, Glu®, Lys¹², Nie¹?, Ala¹®, Asp²⁶, Leu²⁶,

Lys²⁷'²®]-VIP _cyklo (Lys²¹—>Asp²⁶) [Ac-(SEQ ID NO:44)-NH₂] 0,36

Ac- [p-F-Phe®> Glu®, Lys¹²,Nie¹?, Ala¹®, Asp²⁶, Leu²®, _Lys27,28]__VIp _{cyklo (Lys}21__>Asp25) [Ac-(SEQ ID NO:45)-NH₂] 0,47

107

Ac- [ 1-Nal⁶, Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁸, Asp²⁵, Leu^{2 6},

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:46)-NH₂] 0,26

Ac- [Glu⁸,p-NH₂-Phe¹⁰, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁸, Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:47)-NH₂] 0,32

Ac-[Glu⁸,0-CH3~Tyr¹⁰, Lys¹²,Nie¹⁷, Ala¹⁸, Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:48)-NH₂] 0,41

Ac- [p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nie¹⁷, Ala¹⁸, Asp²⁵, Val²⁶,Thr²⁸]VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:49)-NH₂] o,39

Ac- [1-Nal⁶,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁸,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸ ]VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:50)-NH₂] 2,9

Ac- [Ala², Glu⁸, Lys ¹², Nie ľ ⁷, Ala I·⁸, Asp²⁵, Leu^{2 6},

Lys²⁷'²⁸,Gly²⁸'²⁰,Thr²¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:51)-NH₂] 0,92

Ac- [Glu⁸, Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁸,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸,

Gly²⁸' ²θ, Thr⁸¹] -VIP cyklo Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH2l 0,35

Ac- [Ala², Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁸,Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:53)-NH2] 0,78

Ac- [p-NH2~Phe¹⁰, Lvs¹², Nie¹⁷, Ala¹⁸, Asp²⁵, Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:54)-NH2] 0,96

- 108 Ac-[Lys¹²,Nie¹⁷, Ala¹⁸,m-OCHg-Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹->Asp²⁸) (Ac-(SEQ ID ΝΟ:55)-ΝΗ₂] 0,31

Ac-[Lys¹²,Nie¹⁷, Ala¹⁸,m-F-L-Tyr²², Asp²⁸, Val²⁸,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:56)-NH2l 0,52

Ac- [Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁸,m-OCHg-Tyr²²,Asp²⁸,

Leu²⁸,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁸) (Ac-(SEQ ID NO:57)-NH₂] 0,29

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁸,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁸,

Leu²⁸,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:58)-NH₂] 0,31

Ac-[Ala⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁸,Ala²⁴,Asp²⁸,Leu²⁸,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—»Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:59)-NH₂] 1,1

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁸'¹⁷/¹⁸,Asp²⁸, Leu²⁸, Lys²⁷'²⁸] VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:60)-NH₂] 0,26

Ac- [Ala⁸,Lys¹²,Ala¹⁸,Nie¹⁷,Ala¹⁸,Ala²⁴,Asp²⁸,

Leu²⁸, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:61)-NH2] / 2,4

Ac-Ala⁸,Lys¹², Ala¹⁸'Í7,19,Ala²⁴,Asp²⁸, Leu^{2 8},

Lys²⁷'²⁸]-VIP _Cyklo (Lys²¹—>Asp²⁸) [Ac-(SEQ ID NO:62)-NH2] 0,1

109

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸ ]-VIP cyklo (Lys²¹—»Asp25) [Ac-SEQ ID NO:63)-NH2] 0,9

Ac-[Glu⁸,Lys¹², Ala¹⁶'¹⁷>¹⁹,Ala²⁴, Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:64)-NH2] 0,22

Ac- [Glu⁸, Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,

Gly²⁹'²⁰,Thr²¹]-VIP _cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH₂] · 0,88

Ac-[p-F-Phe ⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁵,Val^{2 6}, Thr²⁸,

Gly²⁹'²⁰,Thr²¹]-VIP _cyklo Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH₂] 0,57

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸,

Gly²⁹'²⁸,Thr²¹]-VIP cyklo Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH2] 0,19

Ac-[Glu⁸,Lys¹², Nie¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸,

Gly²⁹'²⁸,Thr²¹]-VIP cyklo Lys²¹—>Asp²⁵)

Ac-(SEQ ID NO:68)-NH2] 0,43

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷· ²⁸'Ala²⁹“ ²1]~VIP cyklo (Lys—>Asp²⁵)

Ac-(SEQ ID NO:69)-NH₂] 0,42

110

Príklad 53

Bronchodilatační účinnost analogú VIP

Bronchodilatační účinnost VIP a jeho analogú in vivo se stanovuje instilačním podáváním do prúdušnice. Pri této technice se používá samcú morčete (kmeň Hartley, Charles River) o hmotnosti 400 až 600 g. Zvíŕata se anestetizují urethanem (2 g/kg i.p.) a do jejich jugulární vény se vloží polyethylenová kanyla pro intravenózni podávání léčiva.

Zvíŕata se tracheotomizují a do místa prúdušnice, vzdáleného 3/4 délky od carina tracheae, se pipetou dávkuje roztok destilované vody nebo zkoušené sloučeniny v destilované vode. Koncentrace dávkovaného roztoku se nastaví tak, aby se dodával konštantní objem 100 ml. Zvíŕata se na 1 minutu umístí do vertikálni polohy, hlavou nahoru, aby se usnadnila dodávka léčiva do plic. Po jedné minuté se zastaví spontánni dýchání intravenózním podáním chloridu sukcinylcholinu (1,2 mg/kg) a pomoci malého respirátoru pro zvíŕata Harvard Model 680, nastaveného na dechovou frekvenci 40 min^-1 a zdvihový objem 4,0 cm³ se zavede umelá ventilace. Zvíŕatúm se podá maximálni konstrikční dávka histamínu (50 mg/kg i.v.) a za použití pŕevadéče tlaku Statham Pressure Transducer (P 32 AA) se zaznamenává tlak v prudušnici (v cm vodního sloupce).

t

Vypočítá se prumérný tlak v prúdušnici z údajú od nejméné 3 kontrolních zvíŕat a 3 zvíŕat ošetrených léčivem a inhibice v procentech. Relatívni sila sloučenin podávaných instilační cestou se stanovuje tak, že se zvíŕatúm podávaj í rúzné dávky zkoušených sloučenin a vypočítá se strední účinná dávka (hodnota ED₅₀). Hodnoty ED₅₀ se stanoví z logaritmických kŕivek závislosti odpovedi na dávce, které byly sestrojeny za použití alespoň tri dávek, jejichž inhibični účinnek leží v rozmezí od 10 do 90 %. Korelační koeficienty pro regresní

111 pŕímku všech sloučenin jsou vždy vyšší než 0,95.

Pro stanovení časového prúbéhu inhibice u rúzných sloučenin se méní doba mezi podaním sloučeniny a podaním provokační dávky histamínu. Časový prúbéh účinnosti se vyjádŕí vypočtenou hodnotou času, béhem néhož inhibice poklesne na 40 %.

Výsledky, které jsou souhrnné uvedený v tabulce II, ukazuj bronchodilatační účinnost in vivo analogú VIP, ve srovnání s účinností nativního VIP.

112

Tabulka II

Bronchodilatační účinnosť analógu VIP u morčete sloučenina ^ED50 (ng)

VIP[(Seq ID NO:1)-NH2] 7,3

Ac-[Lys¹²,Glu¹⁶,Nie¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys¹²—»Glu¹⁶) [Ac-(SEQ ID NO:26)-NH₂] 39

Ac-[Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁴,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²⁰—>Asp²⁴) [Ac-(SEQ ID NO:27)-NH₂] 2,3

Ac-[Lys¹²,Nie¹⁷, Asp²⁵, Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:28)-NH2l 1,2

Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁸,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:29)-NH2l 0,34

Ac- [p-F-Phe⁶,2-Nal¹⁰,Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸,Gly²⁹'³⁰,Met³¹]-VIP cyklo (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:30)-NH₂] / 0,90

Ac-[Glu⁸,Orn¹²,Nie¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP _cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:31)-NH₂] 0,19

Ac- [p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val^{2 6},Thr²⁸,

Gly²⁹'³⁰, Cys(Acm)³¹]-VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:32)-NH₂] 0,19 ¹ - l·. •'iGúAl.l.»- ((•LM’J'ŕir/^VJťÁ.HUrK-i-ť'UHIIAMÍľ’J VX.vVU iX.i.'>'*'l*'V>liFUlbl>nW4'· I¹ WÍA/.'íVf.ll,'->...fc iir.l.^j. ·...

- 113 Ac-[Ala²,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:33)-NH2] 0,6

Ac- [N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵, Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:34)-NH2] 1,0

Ac-[Lys¹²,Nie¹⁷, Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷· ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:38)-NH₂] 0,09

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys²⁷> ²⁸] —VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:39)-NH2] 0,06

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:40)-NH₂] 0,022

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lvs²⁷'²⁸,

Ala^29-31 ]-VIP cyklo (Lys²¹—> Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:42)-NH2] 0,072

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸,Ala^29-31]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:43)-NH₂] 0,14

Ac- [N-Me-Ala¹, Glu⁸, Lys¹²,Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:44)-NH2] 0,097

Ac-[p-F-Phe⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP _cyklo (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:45)-NH₂] 0,026

- 114 Ac-[1-NalGlu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹Asp²⁵, Leu²⁵,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac—(SEQ ID NO:46)-NH₂] 0,036

Ac-[Glu⁸,p-NH₂-Phe¹⁰,Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:47)-NH₂] 0,075

Ac-[Glu⁸,O-CH3-Tyr¹⁰,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,

Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸] -VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:48)-NH₂] 0,094

Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵, Val²⁶, Thr²⁸] VIP cyklo (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ IĎ NO:49)-NH₂] o,26

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵, Leu²⁶, _Lys27,28_/gly29, 30_/Thr31]__VIp _cyklo (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:51)-NH₂] 0,1

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu^{2 6},Lys²⁷' ²⁸,

Gly^{2 9}'30, Thr⁵¹]-VIP cyklo Lys²¹-»Asp?⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)-NH₂] 0,1

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹, Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:53)-NH₂] 0,14

Ac- [p-NH₂-Phe¹⁽3, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹, Asp²⁵, Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:54)-NH₂] 0,35

- 115 Ac-[Lys¹², Nie¹⁷,Ala¹⁹,m-OCH₃-Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:55)-NH₂] 0,14

Ac-[Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵, Val²⁶,

Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:56)-NH₂] 7,2

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,m-OCH₃-Tyr²²,Asp²⁵,

Leu^{2 6}, Lys²⁷· ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-+Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:57)-NH₂] 0,019

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²², Asp²⁵,

Leu^{2 6}, Lys²⁷'²⁸ ] -VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:58)-NH₂] 0,03

Ac-[Ala⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵, Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP _Cyklo (Lys²¹->Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:59)-NH₂] 0,17

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸] VI? cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:oO)-NK₂] 0,17

Ac-[Ala⁸,Lys¹²,Ala¹⁶,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,

Leu^{2 6}, Lys²⁷'²⁸ ]-VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:61)-NH₂] 0,045

Ac-Ala⁸,Lys¹²,Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹-*Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:62)-NH2] 0,24

116

Ac- [Glu⁸,Lys¹², Ala¹⁸' 17,19, Ala²⁴, Asp²5, Leu²⁸, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—»Asp²²) [Ac-(SEQ ID NO:64)-NH2]

Ac- [Glu⁸, Lys¹², Nie¹⁷, Ala¹⁹Asp²⁵, Val²⁸, Thr²⁸, Gly²⁸'²θ,Thr²¹] -VIP cyklo (Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:65)-NH2]

0,13

0,84

Ac-[p-F-Phe⁸,Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁵,Val²⁸, Thr²⁸, Gly²⁸' ²⁰, Thr²¹] -VIP cyklo Lys²¹--»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:66)-NH2]

0,12

Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁸, Lys²⁷'²⁸, Gly²⁸, ²⁰,Thr²¹]-VIP cyklo Lys²¹-»Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:67)-NH2]

0,077

Ac-[Glu⁸, Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²²,Leu²⁸, Lys²⁷'²⁸,

Gly^{2 8}' ²⁰, Thr²¹] -VIP cyklo Lys²¹—» Asp²²)

Ac-(SEQ ID NO:68)-NH2]

Ac-[Lys¹²,Nie¹⁷, Ala¹⁸, Asp²²,Leu^{2 8},Lvs²⁷'²⁸' Ala²⁸~ 31] “vip cyklo (Lys-»Asp²²)

Ac—(SEQ ID NO:69)-NH2l

0,04

0,04 ?V

117

Claims

1. Cyklický peptid obecného vzorce I

X-His-Ser-Asp-Ala-VakPhe-Thr-R8-Asn-Tyr-Thr-R₁₂(I)

Leu-Arg-Lys-Gln-Ri7-AIa-Val-Lys-Lys-Tyr- [X-(SEQ ID NO: 2)-Y]

Leu-Asp-Ser-R26-Leu-R28-Y kde R₈ predstavuje Asp, Glu, nebo Lys; R₁₂ predstavuje Arg, Lys, Orn nebo Asp; R₁₇ predstavuje Met nebo Nie; R₂₆predstavuje íle nebo Val; R₂₈ predstavuje Asn nebo Thr; X predstavuje vodík nebo hydrolýzovatelnou chrániči skupinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu karboxyskupiny; a jeho farmaceutický vhodné soli.

2. Cyklický peptid podie nároku 1, kde R^₇ predstavuje Nie, R₂₆ predstavuje Val a R₂₈ predstavuje Thr.

3. Peptid podie nároku 2, kterým je Ac-[Lys¹²,Nie¹⁷,

Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Asp⁸—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID No: 20)-NH₂].

4. Peptid podie nároku 2, kterým je Ac-Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷, Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Glu⁸—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID NO:21)-NH₂].

5. Peptid podie nároku 2, kterým je Ac-[Orn¹²,Nle¹⁷,Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Asp⁸—>Orn¹²) [Ac-(SEQ ID No:23)-NH₂].

6. Peptid podie nároku 2, kterým je Ac-[Lys⁸,Asp¹²,Nle¹⁷, Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys⁸—>Asp¹²)

118 [Ac-(SEQ ID No: 24)-NH₂]

7. Peptid podie nároku 2, kterým je Ac-[Glu⁸,Orn¹²,Nle¹⁷Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Glu⁸—>Orn¹²) [Ac-(SEQ ID No: 25)-NH₂]

8. Cyklický peptid obecného vzorce II

I-n

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-R₈-Asp-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Gln-R_l7-Ala-VaJ-Lys-Lys-TyrLeu-Asp-Ser-R₂₆-Leu-R_2a-Y (II) [X- (SEQ ID NO: 4) -Y] kde Rg predstavuje Asp nebo Asn; R₁₇ predstavuje Met nebo Nie; R₂₆ predstavuje íle nebo Val; R_2Q predstavuje Asn nebo Thr; X predstavuje vodík nebo hydrolýzovatelnou chrániči sku pinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chrániči skupinu karboxyskupiny; a jeho farmaceutický vhodné soli.

9. Peptid podie nároku 8, kterým je Ac-[Asn⁸,Asp⁹,Lys¹², Nie¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Asp^{9 10 *}—>Lys¹²) [Ac-(SEQ ID No:22)-NH₂].

10. Cyklický peptid obecného vzorce III

X-His-Ser-Asp-A!a-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-LysLeu-Arg-Lys-Glu-Ri7-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr(III)

Leu-Asp-Ser-R₂6-Leu-R2B*Y [X-(SEQ ID NO:6)-Y] kde R₁₇ predstavuje Met nebo Nie; R₂₆ predstavuje íle nebo

119

Val; R₂₈ paŕedstavuje Asn nebo Thr; X predstavuje vodík nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu aminoskupiny;

Y predstavuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chrániči skupinu karboxyskupiny; a jeho farmaceutický vhodné soli.

ll.

Peptid podie nároku 10, kterým je Ac-(Lys¹² ,Glu^1€i, Nie¹⁷,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys¹²—>Glu¹⁶) [Ac—(SEQ ID No:26)-NH₂].

12 nebo 14, jako terapeutické činidlo.

B

12. Cyklický peptidy obecného vzorce IV

X-His-Ser-Asp-AIa-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Ri2ILeu-Arg-Lys-Gln-Ri7-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr(iv;

Leu-Asp-Ser-R26-Leu-R28-Y [X-(SEQ IĎ NO:8)-Y] kde R₁₂ predstavuje Arg nebo Lys; R₁₇ predstavuje Met nebo Nie; R₂₆ predstavuje íle nebo Val; R_2g predstavuje Asn nebo Thr; X predstavuje vodík nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu karboxyskupiny; a jeho farmaceutický vhodné soli. ^{13 14 * *}

13. Peptid podie nároku 12, kterým je Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,

Asp²⁴ Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²⁰—>Asp²⁴) [Ac-(SEQ ID No:27)-NH₂].

14. Cyklický peptid obecného vzorce V

X-RrRrAsp-Ala-Val-Re-Thr-Rg-Asn-R^-Ihr-R^

Leu-Arg-Lys-R ₁₆-R, τ-Ala-R ig-Lys-Lys-R22(V)

Leu- R24-ASP-R26- 827-829-Y [X-(SEQ ID NO:10)-Y]

120 kde R_ľ predstavuje His, N-CH₃-Ala; R₂ predstavuje Ser nebo Ala; Rg predstavuje

Q kde Q predstavuje nižší alkylcyklohexyl nebo nižší alkylaryl; Rg predstavuje Asp, Glu nebo Ala; R₁₀ predstavuje Tyr nebo R_g; R₁₂ predstavuje Arg nebo Lys; R₁₆ predstavuje Gin nebo Ala; R₁₇ predstavuje Met, Nie nebo Ala; R₁₉ predstavuje Val nebo Ala; R₂₂ predstavuje Tyr nebo Rg; R₂₄ predstavuje Asn nebo Ala; R₂₆ predstavuje íle, Val nebo Leu; R₂₇predstavuje Leu nebo Lys; R₂₈ predstavuje Asn, Thr, nebo Lys; X predstavuje vodík nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu aminoskupiny; Y predstavuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chránící skupinu karboxyskupiny; nebo skupinu vzorce ^R29^-R30^_R31^-Z' ^k<^^{e R}29 predstavuje Gly nebo Ala; R_3Q predstavuje Gly nebo Ala;, R₃₁ predstavuje Ala, Met, Cys(Acm), nebo Thr; Z predstavuje hydroxyskupinu nebo hydrolýzovatelnou chrá ničí skupinu karboxyskupiny; a jeho farmaceutický vhodné soli.

15. Cyklický peptid podie nároku 14, kde Q predstavuje methylcyklohexylskupinu.

16. Cyklický peptid podie nároku 14, kde Q predstavuje alkylarylskupinu s 1 až 2 atómy uhlíku v alkylovém zbytku.

17. Cyklický peptid podie nároku 16, kde Q predstavuje alkylfenylskupinu s 1 až 2 atómy uhlíku v alkylovém zbytku, v níž je fenylový kruh popŕípadé substituován jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru zahrnujiclho skupiny vzorcú oh, och₃, f, ci, i, ch₃, cf₃, no₂, nh₂, n(ch₃)₂, nhcoch₃, NHCOCgHg a C(CH₃)₃.

- 121

18. Cyklický peptid podie nároku 16, kde Q predstavuje alkylnaftylskupinu s 1 až 2 atómy uhlíku v alkylovém zbytku, v níž je naftylový kruh popŕípadé substituován jedním nebo více substituenty zvolenými ze souboru zahrnujioiho skupiny vzorcu oh, och₃, f, ci, i, ch₃, cf₃, no₂, nh₂, n(ch₃)₂, nhcoch₃, nhcoc₆h₅ a c(ch₃)₃.

19. Peptid podie nároku 14, kde R_2g predstavuje Val a R_2gpredstavuje Thr [X-(SEQ ID NO: 11)-Y].

20. Peptid podie nároku 14, kde R₁₇ predstavuje Nie, R_2gpredstavuje Val a R₂₈ predstavuje Thr [X-(SEQ ID NO: 12)-Y].

I

21. Peptid podie nároku 20, kterým je Ac-[Glu⁸,Orn¹²,

Nie¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:31)-NH₂],

22. Peptid podie nároku 20, kde R₁₂ predstavuje Leu, R₁₇predstavuje Nie, R^g predstavuje Ala, R₂g predstavuje Val a R₂₈ predstavuje Thr [X-(SEQ ID NO: 13)-Y].

23. Peptid podie nároku 22, kterým je Ac-[2-Nal¹⁰,Leu¹², Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:35)-NH₂].

24. Peptid podie nároku 22, kterým je Ac-[O-Me-Tyr¹⁰, Leu¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:36)-NH₂].

25. Peptid podie nároku 22, kterým jé Ac-[p-F-Phe⁶, p-NH2-Phe¹⁰,Leu¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹, Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:37)-NH2).

122

26. Peptid podie nároku 20, kde R₁₂ predstavuje Lys, R₁₇predstavuje Nie, R₂₆ predstavuje Val a R₂₈ predstavuje Thr [X-(SEQ ID NO: 14)-Y].

27. Peptid podie nároku 26, kterým je Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷, Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:28)-NH₂].

28. Peptid podie nároku 26, kterým je Ac-[p-F-Phe⁶,2-Nal¹⁰, Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,Gly²⁹·³⁰,Met³¹]-VIP (1-31)-NH2 cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:30)-NH2].

29. Peptid podie nároku 20, kterým j é Ác-[p-F-Phe⁶,Glu⁸, Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:66)-NH₂].

30. Peptid podie nároku 20, kde R₁₂ predstavuje Lys, R₁₇predstavuje Nie, R_ig predstavuje Ala, R₂₆ predstavuje Val a R₂₈ predstavuje Thr [X-(SEQ ID NO: 15)-Y].

31. Peptid podie nároku 30, kterým je Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,

Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklú (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:29)-NH₂].

32. Peptid podie nároku 30, kterým je Ac-[p-F-Phe⁶,Lys¹², Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸,Gly²⁹'³⁰,Cys(Acm)³¹]-VIP (1-31)-NH2 cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:32)-NH23.

33. Peptid podie nároku 30, kterým je Ac-[Ala²,Lys¹²,

Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No: 33)-NH₂J.

34. Peptid podie nároku 30, kterým je Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹², Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-ÍSEQ ID No:34)-NH₂].

123

35. Peptid podie nároku 30, kterým je Ac-[0-Me-Tyr¹⁰, Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁸,Val²⁸,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:41)-NH₂].

36. Peptid podie nároku 30, kterým je Ac-[p-F-Phe⁶,

Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No: 49)-NH₂].

37. Peptid podie nároku 30, kterým je Ac-(1-Nal⁶,Lys¹², Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵} [Ac-(SEQ ID No: 50)-NH₂].

38. Peptid podie nároku 30, kterým je Ac-[p-NH₂-Phe¹⁰, Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:54)-NH₂].

39. Peptid podie nároku 30, kterým je Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,m-OCH₃-Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:55)-NH₂].

40. Peptid podie nároku 30, kterým je Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷, Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁵,Val²⁶, Thr²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:56)-NH₂].

41. Peptid podie nároku 30, kterým je Ac-[Glu⁸,Lys¹², Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Val²⁶,Thr²⁸,Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No: 65 ) -NH₂ ] ...

42. Peptid podie nároku 14, kde R₂₆ predstavuje Leu a jak R₂₇, tak R₂₈ je Lys [X-(SEQ ID No: 16)-Y].

43. Peptid podie nároku 42, kde R₁₂ predstavuje Lys, R₁₇predstavuje Ala, R₁₉ predstavuje Ala, R₂₆ predstavuje Leu a ^R27 ^{a R}28 ^oba Predstavuj! Lys [X-(SEQ ID No:17)^-Y],

124

44. Peptid podie nároku 43, kterým je Ac-[Glu⁸,Lys¹², Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:60)-NH₂].

45. Peptid podie nároku 43, kterým je Ac-[Ala⁸,Lys¹², Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷ · ²⁸ ]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-SEQ ID No:62)-NH₂].

46. Peptid podie nároku 43, kterým je Ac-[Glu⁸,Lys¹², Ala¹⁶'¹⁷'¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:64)-NH₂].

47. Peptid podie nároku 42, kde R^₂ predstavuje Lys, R₁₇predstavuje Nie, R₂₆ predstavuje Leu a jak R₂₇, tak R₂₈predstavuje Lys [X-(SEQ ID No: 18)-Y].

48)-NH₂].

48. Peptid podie nároku 47, kterým je Ac-[Ala²,Glu⁸, Lys¹²,Nie¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸, Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:67)-NH₂].

49. Peptid podie nároku 47, kterým je Ac-[Glu⁸,Lys¹², Nie¹⁷,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,Gly²⁹'³⁰, Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:68)-NH₂]

50. Peptid podie nároku 47, kde R₁₂ predstavuje Lys, R₁₇predstavuje Nie, R_ig predstavuje Ala, R₂₆ predstavuje Leu a jak R₂7' ^{tak R}28 Predstavuje Lys [X-(SEQ ID No: 19)-Y].

51. Peptid podie nároku 50, kde R₁₂ predstavuje Lys, R₁₆predstavuje Gin, R₁₇ predstavuje Nie, R_ig predstavuje Ala, R₂₆ predstavuje Leu a jak R₂₇, tak R₂₈ predstavuje Lys [X-(SEQ ID No: 70)-Y].

52. Peptid podie nároku 51, kde R₂ predstavuje Ser, R₁₂predstavuje Lys, R₁₆ predstavuje Gin, R₁₇ predstavuje Nie,

125

R_ig predstavuje Ala, R₂₆ predstavuje Leu a jak R₂₇, tak R₂₈predstavuje Lys [X-(SEQ ID No: 71)-Y].

53. Peptid podie nároku 52, kterým je Ac-[Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]- VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:38)-NH₂].

54. Peptid podie nároku 52, kterým je

Ac-[N-Me-Ala¹,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷·²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵ [Ac-(SEQ ID No:39)-NH₂].

55. Peptid podie nároku 52, kterým je

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:40)-NH₂].

56. Peptid podie nároku 52, kterým je Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷· ²⁸,

Ala^29-31]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:42)-NH₂].

57. Peptid podie nároku 52, kterým je

Ac-[ N-Me-Ala¹,Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵, Leu²⁶,

Ly_S ²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:44)-NH₂J.

58. Peptid podie nároku 52, kterým je Ac-[p-F-Phe⁶, Glu⁸, Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵, Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:45)-NH₂].

59. Peptid podie nároku 52, kterým je

Ac- [ 1-Nal⁶,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷· ²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:46)- NH₂].

60. Peptid podie nároku 52, kterým je Ac-[Glu⁸,p-NH₂-Phe¹⁰,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,

Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No: 47) nh₂].

126

61. Peptid podie nároku 52, kterým je

Ac- [ Glu⁸,O-Me-Tyr¹⁰,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:

62. Peptid podie nároku 52, kterým je

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸,

Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)- NH₂].

_Λ

63. Peptid podie nároku 52, kterým je

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-OCH₃-Tyr²²,Asp²⁵, * Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:57)- NH₂].

64. Peptid podie nároku 52, kterým je

Ac-[ Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,m-F-L-Tyr²²,Asp²⁶,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:58)-NH2]

65. Peptid podie nároku 52, kterým je

Ac- [Ala⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶, Lys²⁷·²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-SEQ ID No:59)-NH₂].

66. Peptid podie nároku 52, kterým je * Ac-[ Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,Lys²⁷'²⁸, Ala^29-31]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:69)-NH₂). r

67. Peptid podie nároku 51, kde R₂ predstavuje Ala, R₁₂predstavuje Lys, R^_g predstavuje Gin, R^₇ predstavuje Nie, R_ig predstavuje Ala, R_2g predstavuje Leu a každý ze symbolú R₂₇ a R_2g predstavuje Lys [X-(SEQ ID No: 72)-Y].

68. Peptid podie nároku 67, kterým je Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵, Leu²⁶, Lys²⁷'²⁸, Ala^29-31]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:43)-NH₂]

127

69. Peptid podie nároku 67, kterým je Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁶,

Ly_S ²⁷'²⁸,Gly²⁹'³⁰Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—> Asp^{2 5}) [Ac-(SEQ ID No:51)-NH₂].

70. Peptid podie nároku 67, kterým je Ac-[Ala²,Glu⁸,Lys¹²,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁸, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:53)-NH₂].

71. Peptid podie nároku 50, kde R₁₂ predstavuje Lys, Rjg * predstavuje Ala, R₁₇ predstavuje Nie, R_ig predstavuje Ala,

- R₂₆ predstavuje Leu a každý ze symbolú R₂₇ a R₂₈ predstavuje ⁵ Lys [X-(SEQ ID No: 73)-Y].

72. Peptid podie nároku 71, kterým je

Ac-[Ala⁸,Lys¹²,Ala¹⁸,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Ala²⁴,Asp²⁵,Leu²⁶,

Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:61)-NH₂].

73. Peptid podie nároku 71, kterým je

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Ala¹⁸,Nle¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁸, Lys²⁷'²⁸]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID No:63)-NH₂].

74. Cyklický peptid podie kteréhokoliv z nárokú 1, 8, 10,

75. Cyklický peptid podie kteréhokoliv z nárokú 1, 8, 10, 12 nebo 14, jako bronchodilatační činidlo.

76. Cyklický peptid

Ac-[Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁸,Lys²⁷'²⁸,

Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)- NH₂], jako terapeutické činidlo.

77. Cyklický peptid

Ac-[ Glu⁸,Lys¹²,Nie¹⁷,Ala¹⁹,Asp²⁵,Leu²⁸,Lys²⁷'²⁸,

128

Gly²⁹'³⁰,Thr³¹]-VIP cyklo (Lys²¹—>Asp²⁵) [Ac-(SEQ ID NO:52)- NH₂], jako bronchodilatační činidlo.

78. Zpúsob výroby cyklického peptidu podlé kteréhokoliv z nárokú 1, 8, 10, 12 nebo 14, vyznačuj ící se tím, že se

a) chránený peptid s odpovídající sekvencí aminokyselín, který je vázán k pryskyŕici, selektívne zbaví chránících skupín, za vzniku volné aminoskupiny v postranním ŕetézci a volné karboxyskupiny v postranním ŕetézci;

b) volná aminoskupina v postranním ŕetézci a volná karboxyskupina v postranním ŕetézci se spojí kovalentní väzbou za použití vhodného amidotvorného činidla; a

79. Farmaceutický pŕípravek, vyznačující se tím, že obsahuje cyklický peptid podie kteréhokoliv z nárokú 1 až 73 a netoxickou inertní terapeuticky vhodnou· nosičovou látku.

80. Farmaceutický pŕípravek pro léčbu bronchotracheálních konstrikčních porúch vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství cyklického peptidu podie kteréhokoliv z nárokú 1 až 73 a netoxický farmaceutický vhodný kapalný nebo pevný nosič.

81. Cyklický peptid podie kteréhokoliv z nárokú 1 až 73 pro použití pri léčbé rúzných porúch.

129

82. Cyklický peptid podie kteréhokoliv z nárokú 1 až 73 pro použití pri léčbé bronchotracheálních konstrikčních porúch.