SK179798A3

SK179798A3 - Non-aqueous polar aprotic peptide formulations

Info

Publication number: SK179798A3
Application number: SK1797-98A
Authority: SK
Inventors: Cynthia L Stevenson; Steven J Prestrelski
Original assignee: Alza Corp
Priority date: 1996-07-03
Filing date: 1997-07-01
Publication date: 1999-05-07
Also published as: SK283926B6; PL330927A1; DE69715639T2; CZ299464B6; HUP9904270A2; ATE224199T1; EP1208846B1; DE69715639D1; US6124261A; AU739169B2; ID28822A; NO20063870L; NO986207L; RO119863B1; MY128850A; DE69728582D1; US6235712B1; DK0921808T3; CA2259557A1; NZ333294A

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa vzťahuje ku stabilným nevodným aprotickým formuláciám peptidových zlúčenín a zvlášť k formuláciám peptidových zlúčenín pri vyšších koncentráciách.

Odkazy:

Nasledujúce odkazy sú uvádzané číslami v zátvorkách ([]) v príslušnej časti opisu.

1. Zoladex (goserelinacetátový implantát), Physician's Desk Reference, 50. vydanie, s. 28582861, r. 1996.

2. Patent USA č. 3,914.412, vydaný 21.10.1975.

3. Patent USA č. 4,547.370, vydaný 15.10.1985.

4. Patent USA č. 4,661.472, vydaný 28.4.1987.

5. Patent USA č. 4,689.396, vydaný 25.8.1987.

6. Patent USA č. 4,851.385, vydaný 25.7.1989.

7. Patent USA č. 5,198.533, vydaný 30.3.1993.

8. Patent USA č. 5,480.868, vydaný 2.1.1996.

9. WO 92/20711, zverejnený 26.11.1992.

10. WO 95/00168, zverejnený 5.1.1995.

l.WO 95/04540, zverejnený 6.2.1995

12. Stabilita gonadorelínu a triptorelínu vo vodnom roztoku, V.J.Helm, B.W.Muller, Pharmaceutical Research, 7/12, s. 1253 - 1256, r. 1990.

13. Nový degradačný produkt Des-Gly¹⁰-NH₂-LH-RH-etylamidu (fertirelínu) vo vodnom roztoku, J.Okada, T.Seo, F.Kasahara, K.Takeda, S.Kondo, J. of Pharmaceutical Sciences, 80/2, s. 167-170, r. 1991.

14. Charakterizácia produktu rozpúšťadlovej degradácie histrelinu, agonistu spúšťacieho hormónu luteinizačného hormónu (LHRH), A.R.Oyler, R.E.Naldi, J.R.LLoyd, D.A.Graden, C.J.Shaw, M.L.Cotter, J. ofPharmaceutical Sciences, 80/3, s. 271-275, r. 1991.

• 15. Parenterálne peptidové formulácie: chemické a fyzikálne vlastnosti natívneho spúšťacieho hormónu luteinizačného hormónu (LHRH) a hydrofóbnych analógov vo vodnom roztoku, M.F.PowelI, L.M.Sanders, A.Rogerson, V.Si, Pharmaceutical Research, 8/10, s. 1258 - 1263, r. 1991.

16. Degradácia LHRH analógu nafarelínacetátu vo vodnom roztoku, D.M.Johnson, R.A. Pritchard, W.F.Taylor, D.Conley, G.Zuniga, K.G.McGreevy, Intl. J. of Pharmaceutics, 31, s. 125-129, r. 1986.

17. Podpora perkutánnej absorpcie leuprolidu, M.Y.Fu Lu, D.Lee, G.S.Rao, Pharmaceutical Research, 9/12, s. 1575-1576, r. 1992.

18. Lutrepulse (IV [intravenózna] injekcia gonadorelínacetátu). Physician's Desk Reference, 50. edice, s. 980-982, r. 1996.

19. Faktrel (gonadorelínhydrochlorid pre subkutánnu alebo IV injekciu), Physician’s Desk Refe- • rence, 50. edition, s. 2877-2878, r. 1996.

20. Lupron (leuprolidacetát pre subkutánnu injekciu), Physician's Desk Reference, 50. edition, s. 2555-2556, r. 1996.

21. Depotný lupron (leuprolid acetát pre depotnú suspenziu), Physician's Desk Reference, 50. edition, s. 2556-2562, r. 1996.

22. Farmaceutický zásah na zlepšenie klinickej účinnosti leuprorelinacetátu, H.Toguchi, J. of Intl. Medical Research, 18, s. 35-41, r. 1990.

23. Dlhodobá stabilita vodného roztoku spúšťacieho hormónu luteinizačného hormónu hodnotená biotestom in vitro a kvapalnou chromatografiou, Y.F.Shi, R.J.Sherins, D.Brightwell, J.F.Gallelli, D.C.Chatteiji, J.ofPharmaceutical Sciences, 73/6, s. 819-821, r. 1984.

24. Peptidové kvapalné kryštály: inverzná korelácia kinetiky tvorby a termodynamickej stability vo vodnom roztoku, M.F.PowelI, J.Fleitman, L.M.Sanders, V.C.Si, Pharmaceutical Research, 11/9, s. 1352-1354, r. 1994.

25. Priebeh rozpúšťania leuprolidacetátu, antagonistu LHRH, stanovený spektroskopiou cirkulámeho dichroizmu , M.E.Powers, A.Adejei, M.Y.Fu Lu, M.C.Manning, Int. J. Pharmaceutics, 108, s. 49-55, r. 1994.

26. Príprava depotných injikovateľných mikroguličiek leuprorelinacetátu na trojmesačnú depozíciu s použitím biodegradovateľných polymérov, Pharmaceutical Research, 11/8, s. 11431147, r. 1994.

Opis obsiahnutý v každej z týchto publikácií, patentov alebo patentových prihlášok je tu týmito odkazmi celý zahrnutý v rovnakom rozsahu, ako keby znenie každej jednotlivej publikácie, patentu alebo patentovej prihlášky bolo v odkaze špecificky a individuálne obsiahnuté.

Spúšťací hormón luteinizačného hormónu (LHRH), známy tiež ako spúšťací hormón gonadotropínu (GnRH) je dekapeptid so štruktúrou:

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2.

Je vylučovaný hypotalamom a viaže sa na receptory hypofýzy, pričom uvoľňuje luteinizačný hormón (LH) a hormón stimulujúci folikul (FSH). LH a FSH stimulujú gonády k syntéze steroidných hormónov. Sú známe početné analógy LHRH vrátane peptidov príbuzných LHRH, ktoré fungujú ako agonisty a také, ktoré fungujú ako antagonisty (1-15). LHRH analógy sú známe tým, že sú použiteľné pri liečbe chorôb na hormónoch závislých, ako je rakovina prostaty, benígne zdurenie prostaty, endometrióza, hysteromyóm, metrofibróm, predčasná puberta, rakovina prsníka a ako antikoncepčný prostriedok. (8). Podávanie lieku s dlhodobým uvoľňovaním je výhodné ako pre zlúčeniny príbuzné agonistom LHRH, ktoré pri opakovanom podávam znižujú počet dosiahnuteľných receptorov, takže produkcia steroidných hormónov je potlačená, tak aj pre zlúčeniny príbuzné antagonistom LHRH, ktoré je treba kontinuálne podávať na trvalú inhibíciu vzniku endogénneho LHRH. (8).

Trvalé parenterálne uvoľňovanie liečiv, zvlášť liečiv na báze peptidov, má mnohé výhody. Odborníkom je dobre známe použitie implantovateľných zariadení na dlhodobé uvoľňovanie veľkého množstva liečiv alebo iných priaznivo pôsobiacich činidiel. Typické prístroje sú opísané napríklad v patentoch USA č. 5,034.229, 5,057.318 a 5,110.596. Opis každého z týchto patentov je tu nahradený odkazom.

Všeobecne platí že biologická dostupnosť peptidov orálnou cestou, vrátane zlúčenín príbuzných LHRH, je nízka (16-17).

Doterajší stav techniky

V súčasnej dobe komerčne ponúkané formulácie LHRH, ich analógy a príbuzné zlúčeniny používané pre parenterálne injekcie sú vodné roztoky, ktoré obsahujú relatívne nízke koncentrácie zlúčenín príbuzných LHRH (0,05 až 5 mg/ml) a tiež môžu obsahovať prísady, ako mannit alebo laktózu (18-20). Také formulácie zlúčenín príbuzných LHRH je treba skladovať buď zmrazené alebo pri izbovej teplote, ale iba krátku dobu.

Komerčne dosiahnuteľné depotné formulácie zlúčenín príbuzných LHRH podávané za účelom dlhodobého uvoľňovania počas doby 1-3 mesiacov pozostávajú z 15 % zlúčeniny príbuznej LHRH dispergovanej v matrici z kopolyméru D,L-mliečnej kyseliny a glykolovej kyseliny v podobe valčeka na subkutánne injektovanie (1) a z formulácie pozostávajúcej z mikročastíc obsahujúcich jadro (stred) zo zlúčeniny príbuznej LHRH a želatíny, ktoré je obklopené plášťom z kopolyméru D,L-mIiečnej kyseliny a glykolovej kyseliny. Tieto mikročastice sú suspendované v rozpúšťadle na subkutánne alebo intramuskuláme injektovanie (21,26). Tieto výrobky sa musia skladovať pri izbovej alebo nižšej teplote. O vodných formuláciách zlúčenín príbuzných LHRH je známe, že vykazujú chemickú aj fyzikálnu nestabilitu a degradáciu po ožiarení (12-16, 22-25).

Stabilitu (tso asi 5 rokov) preukázali formulácie typu vodných roztokov s veľmi nízkou koncentráciou (25 pg/ml) obsahujúce pufer (10 mM, iónová sila 0,15) a skladované pri teplotách do 25 °C (teplota miestnosti) (15).

Stále trvá potreba stabilných peptidových formulácií.

Podstata vynálezu

Tento vynález ponúka stabilné nevodné formulácie v podobe roztokov peptidových zlúčenín v polárnych aprotických rozpúšťadlách. Tieto formulácie peptidových zlúčenín majú koncentrácie najmenej cca 10 %. Tieto stabilné formulácie je možné dlhodobo skladovať pri zvýše ných teplotách (napríklad 37 °C) a sú zvlášť vhodné pre implantované systémy na dlhodobé uvoľňovanie lieku (napríklad 1-12 mesiacov a viac).

V jednom ohľade vynález opisuje stabilné nevodné formulácie peptidových zlúčenín, ktoré obsahujú aspoň jednu peptidovú zlúčeninu v aspoň jednom polárnom aprotickom rozpúšťadle.

V jednom výhodnom uskutočnení formulácia obsahuje najmenej 10 % hmotnostných peptidovej zlúčeniny.

V inom ohľade vynález ponúka spôsoby prípravy stabilných nevodných formulácií peptidových zlúčenín, ktoré zahrnujú rozpustenie najmenej jednej peptidovej zlúčeniny v najmenej jednom polárnom aprotickom rozpúšťadle. Výhodné formulácie obsahujú aspoň asi 10 % hmotnostných peptidových zlúčenín.

V ďalšom ohľade vynález poskytuje spôsoby liečby pacienta trpiaceho zhoršeným zdravotným stavom, ktorý môže byť zlepšený podaním peptidovej zlúčeniny, pričom uvedené spôsoby zahrnujú podávanie účinného množstva stabilnej nevodnej formulácie obsahujúcej aspoň jednu peptidovú zlúčeninu v najmenej jednom polárnom aprotickom rozpúšťadle tomuto pacientovi. Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 ukazuje stabilitu 40% (hmotn.) roztoku leuprolidacetátu v dimetylsulfoxide (metylsulfoxid alebo DMSO) po dvoch mesiacoch pri 80 °C zisťovanú vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou s prevrátenými fázami (RP-HPLC).

Obrázok 2 ukazuje tú istú vzorku ako v obrázku 1 injektovanú pri vylučovacej chromatografii (SEC). Z obrázku vyplýva, že k agregácii dochádza iba v malej miere a toto neveľké zhlukovanie pozostáva z dimémych a trimérnych produktov a žiadna agregácia vyššieho rádu neexistuje.

Obrázok 3 ukazuje Arrheniov graf úbytku leuprolidu zo 40% roztoku leuprolidacetátu v dimetylsulfoxide (DMSO).

Obrázok 4 ilustruje chemickú a fyzikálnu stabilitu 40% roztoku leuprolidu v DMSO po 6 mesiacoch pri 80 °C.

Obrázok 5 ilustruje stratu leuprolidu zo 40% roztoku leuprolidacetátu v DMSO po 6 mesiacoch pri 37 °C, 50 °C, 65 °C alebo 80 °C.

Obrázok 6 ilustruje chemickú stabilitu 40% roztoku leuprolidacetátu v DMSO po 9 mesiacoch pri 37 °C.

Obrázok 7 dokazuje, že zvýšenie koncentrácie roztoku peptidu leuprolidu v DMSO zvýšilo jeho stabilitu pri 80 °C.

Obrázok 8 dokazuje, že zvýšenie obsahu vlhkosti v 40% formuláciách leuprolidu v DMSO malo za následok zníženú stabilitu pri 80 °C.

Obrázok 9 ukazuje, že vo formuláciách z obrázku 8 vzrastalo množstvo degradačných produktov s rastúcou vlhkosťou.

Podrobný opis vynálezu

Tento vynález sa vzťahuje k nečakanému objavu, že pri rozpustení peptidových zlúčenín v nevodných polárnych aprotických rozpúšťadlách vznikajú stabilné formulácie. Už známe formulácie peptidových zlúčenín, čo sú zriedené pufrované vodné roztoky obsahujúce prísady ako je EDTA alebo askorbová kyselina, ktoré sa musia skladovať pri nízkych teplotách (4-25 °C), tvoria degradačné produkty po degradačných líniách ako je kyslo alebo bázický katalyzovaná hydrolýza, deamidácia, racemizácia a oxidácia. Naproti tomu formulácie uvedené v patentových nárokoch predloženého vynálezu stabilizujú peptidové zlúčeniny pri zvýšených teplotách (napríklad 37 až 80 °C) a pri vysokých koncentráciách (t.j. najmenej asi 10 %).

Štandardné peptidové a proteínové formulácie sú zriedené vodné roztoky. Stabilita liekov sa obvykle dosahuje zmenou jedného alebo viac z nasledujúcich parametrov: pH, druhu pufra, iónovej sily, excipientov (EDTA, askorbové kyseliny ap.) V týchto formuláciách nemožno plne stabilizovať degradačné procesy spôsobené vodným prostredím (ako je hydrolýza, deamidácia, racemizácia). Naopak sa v tomto vynáleze dokazuje, že peptidy formulované v nevodnom prostredí ako je dimetylsulfoxid (DMSO) a dimetylformamid (DMF) sú chemicky a fyzikálne stabilnejšie než peptidy formulované vo vode. DMSO a DMF sú považované za poláme aprotické rozpúšťadlá. Od aprotických rozpúšťadiel by sa očakávalo, že spomalia degradáciu, pretože nemôžu dodávať protóny do degradačných pochodov. Naopak by sa očakávalo od rozpúšťadiel, ktoré sú polárnejšie než voda (dipólový moment vody je 1,85, DMF 3,82 a DMSO 3,96), že urýchlia degradáciu, pretože môžu pomôcť stabilizovať stupeň určujúci túto rýchlosť a tým zvýšiť rýchlosť degradácie. Zistili sme však, že celkový účinok polárnych aprotických rozpúšťadiel všeobecne spočíval v stabilizácii roztokov peptidov.

Vynález sa týka použitia nevodných aprotických rozpúšťadiel ako je DMSO alebo DMF na stabilizáciu peptidových formulácií voči ako chemickej, tak aj fyzikálnej degradácii. Tento objav sa zakladá na zistení, že použitie DMSO alebo DMF zlepšuje celkovú stabilitu peptidov v širokom rozsahu podmienok formulácie, vrátane vysokých koncentrácií a zvýšených teplôt, čo umožňuje uvoľňovanie peptidov z dlhodobo implantovaných systémov, ktoré by inak nebolo uskutočniteľné.

A. Definície

Tu použité termíny majú tento význam:

Termín chemická stabilita znamená, že po línii chemických zmien ako je oxidácia alebo hydrolýza vzniká iba prijateľné množstvo degradačných produktov. Konkrétne je formulácia považovaná za stabilnú, keď po dvoch mesiacoch pri 37 °C nevznikne viac než asi 20 % degradačných produktov.

Termín fyzikálna stabilita znamená, že vzniká iba prijateľné množstvo agregátov (napríklad dimérov, trimérov a väčších zhlukov). Špecificky je formulácia považovaná za fyzikálne stabilnú, keď po dvoch mesiacoch pri 37 °C nevznikne viac než 15 % agregátov.

Termín stabilná formulácia znamená, že po dvoch mesiacoch pri 37 °C (alebo ekvivalentných podmienkach pri zvýšenej teplote) zostane najmenej asi 65 % chemicky a fyzikálne stabilných peptidových zlúčenín. Zvlášť výhodnými formuláciami sú také, ktoré udržia v týchto podmienkach aspoň 80 % chemicky a fyzikálne stabilných peptidov. Špeciálne preferovanými stabilnými formuláciami sú také, u ktorých nedochádza k degradácii ani po sterilizácii ožiarením (napríklad lúče gama, beta alebo zväzkom elektrónových lúčov.)

Termín peptid a/alebo peptidová zlúčenina znamená polyméme zlúčeniny zložené z až 50 zvyškov aminokyselín spojených amidovými (CONH) väzbami. V týchto termínoch sú zahrnuté aj analógy, deriváty, agonisty, antagonisty a ich farmaceutický prijateľné soli. Tieto termíny tiež zahrnujú peptidy a/alebo peptidové zlúčeniny, ktoré obsahujú ako štruktúrnu zložku Daminokyseliny, modifikované, derivatizované alebo v prírode sa nevyskytujúce aminokyseliny v D- alebo L-konfigurácii a/alebo peptomimetické jednotky.

Termín zlúčeniny príbuzné LHRH znamená spúšťací hormón luteinizačného hormónu (LHRH), jeho analógy a farmaceutický prijateľné soli. Agonisty a antagonisty LHRH typu okta-, nona- a dekapeptidov sú obsiahnuté v termíne zlúčeniny príbuzné LHRH rovnako ako natívny LHRH. Zvlášť preferované zlúčeniny príbuzné LHRH zahrnujú LHRH, leuprolid, goserelín, nafarelín a ostatné známe aktívne agonisty a antagonisty (1-21).

Termín vysoká koncentrácia znamená aspoň 10 % hmotnostných a koncentráciu limitovanú maximálnou rozpustnosťou toho ktorého konkrétneho peptidu.

Termín excipient znamená viac alebo menej inertnú zlúčeninu vo formulácii, ktorá je pridaná ako riedidlo alebo vehikulum alebo na vytvorenie formy alebo konzistencie. Excipienty sa odlišujú od rozpúšťadiel ako je etylalkohol, používaný na rozpúšťanie liekov vo formuláciách a od neionogénnych povrchovo aktívnych prostriedkov ako je Tween 20, používaný na solubilizáciu liekov vo formuláciách a od konzervačných prostriedkov ako sú benzylalkoholy alebo metyl- alebo propylparabény, používané na prevenciu alebo inhibíciu rastu mikróbov.

Termín poláme aprotické rozpúšťadlo znamená poláme rozpúšťadlo, ktoré neobsahuje kyslý vodík a nie je donorom vodíkovej väzby. Príklady polárneho aprotického rozpúšťadla sú dimetylsulfoxid (DMSO), dimetylformamid (DMF), hexametylfosfortriamid (HMPT) a nmetylpyrolidón.

Termín nevodné protické rozpúšťadlo znamená nepoláme rozpúšťadlo obsahujúce vodík viazaný na kyslík alebo dusík, takže je schopný vytvárať vodíkové väzby alebo byť donorom protónu. Príklady nepolámych protických rozpúšťadiel predstavujú polyetylénglykoly (PEG), propylénglykol (PG), polyvinylpyrolidón (PVP), metoxypropylénglykol (MPEG), glycerín a glykofurol.

Príprava formulácii

Tento vynález sa vzťahuje k nevodným formuláciám peptidových zlúčenín v polárnom aprotickom rozpúšťadle, ktoré sú stabilné počas dlhej doby pri zvýšených teplotách. Štandardné zriedené vodné peptidové a proteínové formulácie vyžadujú na dosiahnutie stability zvláštne podmienky týkajúce sa pufru, iónovej sily, pH a excipientov (napríklad EDTA a askorbovej kyseliny). Oproti tomu predloženým vynálezom nárokované formulácie dosahujú stabilitu peptidových zlúčenín použitím nevodných polárnych aprotických rozpúšťadiel. Predovšetkým bola formuláciami podľa tohto vynálezu dosiahnutá stabilita v prípade vysokých koncentrácií (najmenej asi 10 % hmotnostných).

Príklady peptidov a peptidových zlúčenín, ktoré je možné formulovať na základe tohto vynálezu, zahrnujú tiež peptidy, ktoré majú biologickú aktivitu, alebo ktoré je možné použiť na liečbu chorôb alebo iných patologických stavov. Zahrnujú, bez toho, aby sa na ne obmedzovali, adrenokortikotropný hormón, angiotenzín I a II, atriálny natriuretický peptid, bombezín, bradykinín, kalcitonín, cerebellin, dynorfín A, alfa a beta endorfín, endotelín, enkefalín, epidermálny rastový faktor, fertirelín, spúšťací peptid folikulámeho gonadotropínu, galanín, glukagón, gonadorelín, gonadotropín, goserelín, spúšťací peptid rastového hormónu, histrelín, inzulín, leuprolid, LHRH, motilín, nafarelín, neurotenzín, oxytocín, somatostatín, substanciu P, faktor nekrotického tumoru, triptorelín a vazopresín. Ich analógy, deriváty, antagonisty, agonisty a farmaceutický prijateľné soli je možné použiť taktiež.

Peptidové zlúčeniny použiteľné v týchto formuláciách a spôsoby podľa tohto vynálezu je možné použiť vo forme soli, najradšej farmaceutický prijateľnej soli. Použiteľné soli sú známe odborníkom a zahrnujú soli anorganických kyselín, organických kyselín, anorganických báz alebo organických báz. Výhodnými soľami sú acetáty.

Peptidy a peptidové zlúčeniny dobre rozpustné v nevodných polárnych aprotických rozpúšťadlách sú pre použitie v tomto vynáleze preferované. Odborník ľahko určí, ktoré zlúčeniny sú použiteľné na základe ich rozpustnosti, čo znamená, že zlúčenina musí byť v danom nevodnom polárnom aprotickom rozpúšťadle rozpustná v aspoň prijateľnom množstve. Prednosť sa dáva rozpustnostiam aspoň asi 10 % hmotnostných. Zvlášť výhodné peptidové zlúčeniny sú zlúčeniny príbuzné LHRH vrátane leuprolidu a leuprolid acetátu.

Podiel peptidu môže kolísať v závislosti od zlúčeniny a zdravotného stavu liečeného, rozpustnosti zlúčeniny, predpokladanej dávky a doby podávania. (Viď napríklad Gilman a ďalší, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7. edition, 1985) a Remington, Pharmaceutical Sciences, 18. edition, 1990, ktorých závery sú tu zahrnuté odkazmi). Koncentrácia peptidu vo formuláciách s vysokou koncentráciou sa môže pohybovať od asi 10 % hmotnostných do maximálnej rozpustnosti zlúčeniny. Výhodné rozpätie je od asi 20 do asi 60 % hmotnostných. V súčasnej dobe je viac preferovaný koncentračný rozsah od asi 30 do asi 50 % hmotnostných a najvhodnejší je rozsah od asi 35 do asi 45 % hmotnostných.

Mimo očakávania bolo zistené, že pri zvyšovaní koncentrácie peptidu rozpusteného v nevodnom polárnom aprotickom rozpúšťadle sa stabilita peptidovej formulácie môže zvyšovať. Napríklad, ako ukazuje obrázok 7, keď roztoky 5, 10, 20 a 40 % leuprolidu v DMSO boli 8 mesiacov skladované pri 80 °C a periodicky boli odoberané vzorky a analyzované na zistenie zostávajúcej koncentrácie leuprolidu, formulácie s vyššími koncentráciami leuprolidu boli stabilnejšie než formulácie s nižšími koncentráciami leuprolidu.

Všeobecne platí, že stabilné formulácie podľa tohto vynálezu sa môžu pripraviť jednoduchým rozpustením potrebného množstva (čo môže byť terapeuticky účinné množstvo) príslušnej peptidovej formulácie vo zvolenom nevodnom polárnom aprotickom rozpúšťadle. Výhodné polárne aprotické rozpúšťadlá predstavujú DMSO a DMF.

Zvýšenie podielu vody obsiahnutej v peptidových formuláciách podľa tohto vynálezu zvyšuje stupeň degradácie peptidu, ako ukazuje obrázok 8. Tento vzrast je zrejme spôsobený hlavne rastom produktov chemickej degradácie, pričom zhlukovanie (agregácia) zostáva pomerne konštantná (obrázok 9).

Bolo tiež zistené, že nevodné protické rozpúšťadlá ako PEG, PG a PVP je možné podľa želania pridávať k týmto formuláciám podľa nárokov vynálezu.

C. Metodológia

Zistili sme, že sa stabilné nevodné formulácie peptidových zlúčenín môžu pripraviť rozpustením zvolenej peptidovej zlúčeniny v nevodnom polárnom aprotickom rozpúšťadle.

Tieto formulácie peptidových zlúčenín, špecificky formulácie zlúčeniny príbuznej LHRH leuprolidu, sme skúšali z hľadiska stability ich urýchleným starnutím pri zvýšenej teplote a meraním ich chemickej a fyzikálnej stability. Výsledky týchto skúšok (uvedené napríklad v tabuľke II a obrázkoch 1,2,4 a 6) ukazujú, že tieto formulácie boli stabilné za podmienok, ktoré sa blížia alebo prekračujú skladovanie počas doby jedného roku pri teplote 37 °C.

Tiež sme testovali stabilitu formulácií peptidových zlúčenín pripravených ako je tu opísané po gama ožiarení (2,5 Megarad). Výsledky uvedené v tabuľke ΙΠ ukazujú, že tieto formulácie zostali chemicky a fyzikálne stabilné aj po takomto ožiarení.

Ako je ukázané v tabuľke I, skúšali sme stabilitu širokého spektra peptidových formulácií, zvlášť leuprolidu, goserelínu, LHRH, angiotenzínu I, bradykinínu, kalcitonínu, enkefalínu, inzulínu, neurotenzínu, substancie P, trypsinogénu a vazopresínu ich rozpúšťaním (lebo snahou je rozpustiť ich) v nevodnom polárnom aprotickom rozpúšťadle DMSO a potom ich urýchleným starnutím pri zvýšených teplotách. Stabilita formulácií sa merala. Výsledky sú uvedené v tabuľke I ako polčas pri 37 °C za predpokladu, že E, = 22,2 kcal/mol. Značné množstvo testovaných peptidov bolo v DMSO rozpustných a v podmienkach skúšky zostali stále. Rozpustnosť určitého peptidu v určitom nevodnom polárnom aprotickom rozpúšťadle a stabilita výsledného roztoku sa ľahko stanoví použitím rutinných postupov známych odborníkom.

Tabuľka I: Stabilita peptidov formulovaných v DMSO

Formulácia	Polčas* (Teplota)
40% leuprolid	29,8 rokov (37 °C)
40% goserelín	5,0 rokov (80 °C)
20% LHRH	8,2 roka (65 °C)
20% angiotenzín I	4,2 roka (65 °C)
5% angiotenzín I	4,1 mesiaca (50 °C)
20% bradykinín	2,9 mesiaca (65 °C)
40% kalcitonín	nerozpustný (80 °C)
20% kalcitonín	2,4 mesiaca (80 °C)
5% kalcitonín	100% stabilita 2 mesiace (50 °C)
10% enkefalín	1,9 mesiaca (80 °C)
5% enkefalín	2,6 mesiaca (50 °C)
20% inzulín	nerozpustný gél (65 °C)
5% neurotenzín	5,0 mesiacov (50 °C)
5% substancia P	3,0 mesiace (50 °C)
40% trypsinogén	nerozpustný kryštál/gél (65 °C/80 °C)
20% trypsinogén	nerozpustný gél (65 °C)
5% trypsinogén	5,9 mesiaca (50 °C)
40% vazopresín	degradácia (80 °C)
20 % vazopresín	11,8 dní (65 °C)
*Polčas pri 37 °C; predpoklad: E, = 22,2 kcal/mol

Formulácie 40% peptidu v DMSO skladované šesť mesiacov pri teplote 37 °C, 50 °C, 65 °C a 80 °C vykázali nelineárny priebeh Arrheniovej kinetickej rovnice pri meraní celkovej straty peptidu z roztoku, ilustrujúci stabilitu tejto formulácie pri zvýšených teplotách. Rozbor údajov zistených pri 37 °C ukázal tso 14,4 mesiacov, čo dokazuje, že stabilita pri 37 °C je veľmi dobrá.

Zdá sa, že teplota ovplyvňuje ako rýchlosť degradácie, tak podiel degradačných produktov formulácií podľa tohto vynálezu. Štúdium formulácií leuprolid-DMSO ukázalo, že pri 65 °C a 80 °C je zrejme oxidácia hlavnou formou chemickej degradácie. Naopak sa zdá, že pri 37 °C a 50 °C je dominantnou cestou degradácie týchto formulácii hydrolýza a izomerizácia.

Neočakávane sme tiež zistili, že určité peptidové formulácie podľa tohto vynálezu sú bakteriostatické (t.j. inhibujú rast baktérií), baktericídne (t.j. usmrcujú baktérie) a sporicídne (t.j. usmrcujú spóry). Obzvlášť formulácie leuprolidu v koncentrácii 50-400 mg/ml vykazovali bakteriostatické, baktericídne a sporicídne účinky. Stabilitu vzoriek neovplyvnilo injektovanie baktérií, čo naznačuje, že enzýmy uvoľňované z usmrtených a lýzovaných baktérií neovplyvňovali záporne stabilitu produktu. Toto ukazuje, že tieto formulácie nepodporovali aktivitu enzýmov.

Je známe, že niektoré peptidy, napríklad kalcitonín a leuprolid, sú fyzikálne nestabilné, pretože u nich dochádza k agregácii, gélovaniu, fibrilácii, keď sa formulujú vo vodných roztokoch. Zlepšenie fyzikálnej stability môže zvýšiť biologickú dostupnosť, uľahčiť senzibilizáciu a imunitnú odozvu a umožniť ľahšie parenterálne podávanie vrátane podávania s použitím implantovateľných systémov na dlhodobé uvoľňovanie liekov.

Mimo očakávania sa zistilo, že určité peptidy ako leuprolid, goserelín a kalcitonín formulované v nevodných polárnych aprotických rozpúšťadlách podľa tohto vynálezu, negélujú. Ani po 12 mesiacoch pri 37 °C nebolo zistené žiadne gélovanie. Je to zrejme preto, že nevodné aprotické poláme rozpúšťadlá nútia peptidy vytvárať priestorové usporiadania (konformácie) typu nepravidelná špirála/a-helix, ktoré spätne nevytvárajú ploché β-štruktúry skladaného listu a preto nedochádza ku gélovaniu. Preto majú tieto rozpúšťadlá antigelačný účinok.

Závažnejší aspekt tohto vynálezu je ten, že nevodné roztoky obsahujúce peptidové zlúčeniny v polárnych aprotických rozpúšťadlách sú chemicky a fyzikálne stabilné pri vysokých teplotách počas dlhej doby. Také formulácie sú stabilné i pri vysokých koncentráciách. Preto sú tieto formulácie výhodné tým, že môžu byť dopravované alebo skladované pri teplotách miestnosti a vyšších počas dlhej doby. Sú tiež vhodné na použitie v implantovateľných systémoch na dlhodobé uvoľňovanie lieku.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Pri realizácii výskumu nasledujúcimi príkladmi boli použité tieto spôsoby:

1. Príprava roztokov leuprolidacetátu

Leuprolidacetát získaný napríklad od firmy Mallinckrodt, St. Louis, Missouri, sa navážil a vo vhodnej koncentrácii sa za miešania alebo centrifugácie rozpustil vo vehikule ako napríklad DMSO, DMF, DMSO/PEG, DMSO/PG alebo DMSOZPVP. Termín bezvodý DMSO sa týka formulácií s DMSO pripravených v bezvodom prostredí, to znamená v suchej dusíkovej atmosfére.

Pokiaľ nie je uvedené inak, obsah voľnej bázy leuprolidu sa vypočítal z proklamovaného chemického zloženia (čistoty) komerčného výrobku ako 37 % voľnej bázy. Jednalo sa teda o 40% leuprolidacetát, pokiaľ nie je uvedené inak.

2. Príprava kontejnerov

Kontejnery depotných systémov na dlhodobé uvoľňovanie liekov (opísané v patentovej prihláške USA č. 08/595.761 a v tejto prihláške zahrnuté odkazom) sa naplnili vhodnými roztokmi leuprolidacetátu. Formulácie sa plnili do titánových alebo polymémych kontejnerov uzavretých na každom konci polymémou zátkou. Naplnené kontejnery sa potom zapečatili do vreciek z viacvrstvovej fólie a umiestnili vo vyhrievanom priestore (skúšobnej piecke) na testovanie stability.

Je treba poznamenať, že formulácie sú v kontejneroch týchto systémov dokonale izolované od vonkajšieho prostredia.

3. Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia s prevrátenými fázami (RP-HPLC)

Všetky vzorky na testovanie stability sa analyzovali na koncentráciu leuprolidu a plochy píkov v percentách s použitím gradientovej elučnej vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie s prevrátenými fázami za pomoci chladeného automatického dávkovača (4 °C) pre zníženie degradácie vzoriek. Podmienky chromatografovania sú uvedené nižšie.

Podmienky chromatografie s RP-HPLC

Opis	Parameter
Kolóna	HaiSil C 18,4,6 x 250 mm, S/N 5103051
Prietok	0,8 ml x min¹
Vstrekovaný objem	20 μΐ
Detekcia	210 nm
Retenčný čas leuprolidu	25 až 30 minút
Mobilná fáza	A = 100 mM fosforečnanu sodného, pH 3,0 B = 90% acetonitril/voda
Gradient	Minúty: 0 5 25 40 41 46 46,1 50 %B: 15 26,5 26,5 65 85 85 15 15

Štandardy leuprolidu vo vode prechádzali kolónou pri 4 až 6 rôznych koncentráciách, typicky v rozmedzí 0,1 - 1,2 mg/ml, spoločne so vzorkami testovanými na stabilitu. Testované vzorky boli obklopené (ohraničené) súbormi štandardov, pričom medzi súbormi štandardov nebolo viac testovaných vzoriek než 40. Všetky piky medzi vonkajším objemom a 45 minútami priechodu boli integrované. Integrované plochy píkov štandardov leuprolidu boli graficky vynášané ako funkcie koncentrácie. Pomocou lineárnej regresie boli potom vypočítané koncentrácie leuprolidu vo vzorkách testovaných na stabilitu. Tiež boli zaznamenané % plochy píkov leuprolidového piku, sumy všetkých píkov eluovaných pred íeuprolidom (označené iné) a sumy všetkých píkov eluovaných za leuprolidom (označené agregáty) a vynesené do diagramu ako funkcie časového priebehu elúcie vzorky.

4. Vylučovacia chromatografia SEC

Pre vybrané vzorky určené na skúšky stability sa zisťovali plochy píkov v percentách a molekulové hmotnosti izokratickou vylučovacou chromatografiou SEC s použitím chladeného automatického dávkovača (4 °C). Použité chromatografické podmienky sú uvedené nižšie.

Podmienky chromatografie SEC

Opis	Parameter
Kolóna	Pharmacia Peptide, HR 10/30, 10 x 300 mm
Prietok	0,5 ml x min’¹
Vstrekovaný objem	20 μΐ
Detekcia	210 nm
Retenčný čas leuprolidu	asi 25 minút
Mobilná fáza	100 mM fosforečnanu sodného, pH 2,0, 200 mM chloridu sodného, 30% acetonitril

Znalosť vonkajšieho objemu a celkového objemu kolóny SEC boli pre výpočet molekulových hmotností nevyhnutné. Na stanovenie vonkajšieho objemu a celkového objemu sa použil vysokomolekulárny štandard BioRad a 0,1% acetónu. Zaznamenávali sa retenčné časy pre prvý pík štandardu BioRad a acetónový pík a konvertovali sa na objemové jednotky nižšie uvedenými rovnicami. Pretože tieto hodnoty sú pre určitú kolónu SEC a určitý systém HPLC konštantné, bolo treba vonkajší a celkový objem novo určiť kedykoľvek došlo ku zmene na kolóne SEC alebo systéme HPLC. Potom boli chromatografované štandardy a po nich nasledovali vzorky testované na stabilitu. Zmes štandardov obsahovala približne 0,2 mg/ml nasledujúcich peptidov: bursin (molekulová hmotnosť 449), WLFR peptid (molekulová hmotnosť 619), angiotenzín (molekulová hmotnosť 1181), GRF (molekulová hmotnosť 5108) a cytochróm C (molekulová hmotnosť 12394). Tieto štandardy boli zvolené, pretože ich molekulové hmotnosti ohraničovali (boli blízke - vyššie i nižšie) molekulové hmotnosti leuprolidu a všetky mali bázické pi 9,8 až 11,0 podobne ako leuprolid.

Plochy píkov v percentách boli zaznamenané pre všetky piky. Molekulové hmotnosti izolovaných zlúčenín boli vypočítané s pomocou nižšie uvedených rovníc.

V_s = prietok (ml/min) x retenčný čas piku vzorky (min)

V_o = prietok (ml/min) x retenčný čas piku vonkajšieho objemu (min)

V_t = prietok (ml/min) x retenčný čas piku celkového objemu (min)

V_s-V_o

Kd =------v_t-v<

kde:

V, = objem štandardu alebo vzorky

V_o = vonkajší objem

V_t = celkový objem

Pre každý pík peptidového štandardu bol vypočítaný V_s. S použitím hodnôt pre V_t a V_ovypočítaných skôr bol potom pre každý peptidový štandard vypočítaný Kd. Na stanovenie molekulových hmotností každého piku vzoriek testovaných na stabilitu sa použila krivka lineárnej regresie v diagrame log molekulová hmotnosť proti Kd’¹. Tiež boli zaznamenané %plochy píkov vzoriek testovaných na stabilitu.

5. Prístroje a materiály

Na chromatografické analýzy s RP-HPLC a SEC sa použili nasledujúce prístroje a materiály:

HPLC systém spol. Waters Millennium pozostávajúci z automatického dávkovača 717, čerpadla 626, regulátora 6000S, detektora 900 typu fotodióda array (napojeného na počítač), refraktometrického detektora 414 od spol. Waters Chromatography, Milford, Ma), skúmavky pre HPLC pre 48 pozícií a pre 96 pozícií od spol. Waters Chromatography, Milford, Ma),

HaiSil C 18, 120 A, 5 gm, kolóna 4,6 x 250 mm HPLC od spol. Higgins Analytical, Mountain View, Ca)

Pharmacia Peptide, HR 10/30 SEC kolóna od spol. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)

Nasledujúce príklady podávame na ilustráciu tohto vynálezu, ale v žiadnom prípade nemajú limitovať rozsah jeho platnosti.

Príklad 1

Podľa vyššie uvedeného opisu boli pripravené formulácie obsahujúce 40 % hmotnostných leuprolidacetátu (čo je ekvivalent asi 37 % voľnej bázy) vo vehikule, a potom nimi boli naplnené kontejnery implantovateľných systémov na dlhodobé uvoľňovanie liečiv, tiež vyššie opísaných. Všetky kontejnery boli z titánu.

Tieto systémy s naplnenými kontejnermi boli podrobené urýchlenému starnutiu inkubáciou v piecke (spol. Precision Scientific alebo Thelco) pri zvýšenej teplote 80 °C počas doby siedmich dní. To zodpovedá skladovaniu pri 37 °C počas asi 1,5 roka alebo pri izbovej teplote (25 °C) asi štyri roky.

Tieto vzorky boli analyzované vyššie opísanými chromatografickými metódami RPHPLC a SEC na stanovenie chemickej a fyzikálnej stability formulácií pri urýchlenom starnutí.

Výsledky uvedené v tabuľke II ukazujú, že tieto formulácie boli schopné zachovať stabilitu LHRH príbuznej zlúčeniny leuprolidu. Vždy sa zachovalo najmenej 65 % leuprolidu.

Tabuľka II

Stabilita formulácií leuprolidacetátu v polárnom aprotickom rozpúšťadle po 7 dňoch pri 80 °C v titánovom kontejneri

Formulácia	% leuprolidu na 7. deň
40% v DMSO	92
40 % v DMSO/PEG (50/50)	90
40 % v DMSO/PG (50/50)	86
40 % v DMSO/PVP (50/50)	93
40 % v DMF	91
40 % v bezvodom DMSO	89

Príklad 2

Skúška stability ožiarených formulácii leuprolidacetátu

Formulácie 40% (hmotn.) leuprolidacetátu v DMSO boli pripravené ako je opísané vyššie a plnené do kontejnerov systémov na dlhodobé uvoľňovanie liekov, tiež rovnako ako je opísané vyššie. Všetky kontejnery boli vyrobené z titánu.

Naplnené systémy boli zaslané spol. Sterigenics (Tustin, Kalifornie), kde boli ožiarené lúčmi gama (2,5 Megarad) s použitím kobaltu 60 v centrálnej komore fy Sterigenics (Tustin) k ožiareniu typu tote box na 3. stupni. Vzorky označené v tabuľke III studené boli dopravené a ožiarené na suchom ľade. Potom boli vzorky podrobené urýchlenému starnutiu ako v príklade 1. Vzorky boli odoberané nultý a siedmy deň, analyzované chromatografickými spôsobmi RPHPLC a SEC ako je opísané vyššie na zistenie chemickej a fyzikálnej stability ožiarených formulácií.

Výsledky uvedené v tabuľke III ukazujú, že tieto formulácie leuprolidacetátu boli po ožiarení stále. Vo všetkých prípadoch sa zachovalo aspoň 65 % leuprolidu pri nízkej tvorbe agregátov.

o CM

Tabuľka III

SEC	7. deň	% diméru/triméru	Ch	-	'r	CM	o	CM cm	r-t	00	r—<
% monoméru	97,7	98,5	98,3	95,3	I‘9OI	99,4	104	97,7	91,7
0. deň	% diméru/triméru	m r o	o	______OJ______	00 n O	o	Ό o	o	<n A O	un Λ O
% monoméru	oô o	001	99,1	99,1	o o	99,4	100	99,5	99,5
% leuprolidu 7. deň (RP-HPLC)			o o	06	66	95	N.D.	06	o o	00 00	cn 00
Ožiarenie			áno	nie	studená	áno	nie	áno	nie	áno	áno
Formulácia			40% v DMSO	40% v DMSO	40% v DMSO	40% v DMSO	O CO s Q > x? θ'* O M^-	40% v DMSO	O CO s Q > cr* O	40% v DMSO	40% v DMSO

Príklad 3

Boli pripravené roztoky 40% (hmotn.) leuprolidacetátu v DMSO, naplnené do kontejnerov, skladované 2 mesiace pri 80 °C a analyzované ako je opísané vyššie. Výsledky prezentované v obrázkoch 1 (RP-HPLC) a 2 (SEC) ukazujú, že sa zachovalo 81,1 % leuprolidu, iba 14,6 % sa zmenilo chemickou degradáciou a 5,1 % fyzikálnou agregáciou.

Roztoky leuprolidacetátu sa pripravili, plnili do kontejnerov, skladovali pri 80 °C 6 mesiacov a analyzovali ako je opísané vyššie. Obrázok 4 ukazuje graf leuprolidu a produktov jeho chemickej a fyzikálnej degradácie evidovaných po šiestich mesiacoch, z ktorého vyplýva, že sa vyhľadal všetok peptidický materiál s ktorým sa pokus začal a že tieto formulácie vykázali dobrú stabilitu pri 80 °C. Suma všetkých troch týchto zložiek sa tu prezentuje ako celkom. Obrázok 5 je diagram prirodzeného logaritmu týchto údajov a ukazuje, že tieto formulácie vykazovali v celom testovanom teplotnom rozsahu lineárnu kinetiku.

V obrázku 6 sa ukazuje chemická stabilita roztokov 40% leuprolidacetátu pripravených a analyzovaných ako je opísané vyššie. Po deviatich mesiacoch pri 37 °C sa zachovalo viac než 90 % (93,5 %) leuprolidu a vzniklo menej než 5 % (2,9 %) produktov chemickej degradácie (v obrázku označených skoré (early)) a menej než 5 % (2,3 %) produktov fyzikálnej degradácie (označených ako neskoré (late)) zistených spôsobom RP-HPLC ale v dobrej zhode s výsledkami chromatografie SEC.

Boli pripravené roztoky 40% (hmotn.) leuprolidacetátu v DMSO, umiestnené v kontejneroch, skladované pri 37 °C, 50 °C, 65 °C a 80 °C a analyzované s použitím vyššie opísaného spôsobu RP-HPLC. Výsledky boli vypočítané a opísané vo: Physical Pharmacy: Physical Chemical Priciples in the Pharmaceutical Sciences, 3. edition, Martin a ďalší, kapitola 14 (1983) a dokázali, že úbytok leuprolidu z formulácií v DMSO bol nelineárny. Údaje sú uvedené nižšie a na obrázku 3 sa prezentujú ako Arrheniov graf.

Pretože Arrheniove grafy formulácií v DMSO skladovaných pri 80 °C ukázali, že úbytok leuprolidu bol nelineárny, použili sa pre výpočet tso týchto formulácií pre 14,4 mesiacov pri 37 °C údaje o stabilite získané pri 37 °C.

DMSO
°C	Kobs (mesiace¹)	ti/2(mesiace)
37	7,29 x 10'³	95,1
50	9,74 x 10'³	71,2
65	2,48 x 10’²	27,9
80	0,108	6,4

E_a = nelineárny

Príklad 4

Skúška stability formulácií leuprolidacetátu v DMSO/voda

Formulácie 40% (hmotn.) leuprolidacetátu v DMSO, DMSO/voda (95:5, 90:10, 70:30, 50:50 a 30:70) a vo vode boli pripravené ako je opísané vyššie a sedem dní inkubované pri 80 °C. V nultom a siedmom dni bola urobená analýza IČ spektrometrom vybaveným Fourierovou transformáciou signálu ako detektorom (FTIR).

Výsledky ukázali, že toto urýchlené starnutie spôsobilo u všetkých skúšaných formulácií iba veľmi malé zmeny štrukturálnej konformácie leuprolidu. Všeobecne platí, že vo formuláciách s DMSO mali peptidové štruktúry prevažne charakter nepravidelnej špirály alebo α-helix, zatiaľ čo vo vodných formuláciách mali prevážne ploché β-štruktúry skladaného listu.

Modifikácie vyššie uvedených spôsobov realizácie rôznych uskutočnení tohto vynálezu budú odborníkom na základe v tomto vynáleze uvedených poučení zrejmé. Vyššie uvedené príklady nemajú obmedzujúci charakter, ale iba predstavujú príklady vynálezu, ktorého rozsah je definovaný nasledujúcimi nárokmi.

Claims

1. Stabilná nevodná formulácia peptidovej zlúčeniny, vyznačujúca sa tým, že obsahuje:

a) najmenej jednu peptidovú zlúčeninu; a

b) najmenej jedno poláme aprotické rozpúšťadlo, pričom uvedená formulácia je stabilná pri 37 °C najmenej 3 mesiace.

2. Formulácia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje najmenej asi 10 % hmotnostných peptidovej zlúčeniny.

3. Formulácia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje najmenej asi 30 % hmotnostných peptidovej zlúčeniny.

4. Formulácia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že uvedená peptidová zlúčenina je zlúčenina príbuzná LHRH.

5. Formulácia podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že uvedená peptidová zlúčenina sa vyberie zo skupiny pozostávajúcej z leuprolidu, LHRH, nafarelínu a goserelínu.

6. Formulácia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že je pri 80 °C stabilná najmenej 2 mesiace.

7. Formulácia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že je pri 37 °C stabilná najmenej jeden rok.

8. Formulácia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že sa aplikuje v implantovateľných systémoch na dlhodobé uvoľňovanie lieku.

9. Formulácia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že ďalej obsahuje nevodné protické rozpúšťadlo.

10. Formulácia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že uvedené poláme aprotické rozpúšťadlo sa vyberie zo skupiny pozostávajúcej z DMSO a DMF.

11. Formulácia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že uvedené poláme aprotické rozpúšťadlo vykazuje antigelačný efekt.

12. Formulácia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že pozostáva hlavne z asi 30 až asi 50 % hmotnostných z leuprolidacetátu, zlúčeniny príbuznej LHRH, v DMSO.

13. Formulácia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že pozostáva hlavne z leuprolidu a DMSO v pomere 370 mg leuprolidu v 1 ml DMSO.

14. Formulácia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že je po ožiarení stabilná,

15. Spôsob prípravy stabilnej nevodnej formulácie podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje rozpustenie najmenej jednej peptidovej zlúčeniny v najmenej jednom polárnom aprotickom rozpúšťadle.

16. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že pri ňom najmenej asi 10 % hmotnostných peptidovej zlúčeniny prejde do roztoku.

17. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že pri ňom najmenej asi 30 % hmotnostných peptidovej zlúčeniny prejde do roztoku.

18. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že uvedená peptidová zlúčenina je zlúčenina príbuzná LHRH.

19. Spôsob podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že uvedená peptidová zlúčenina sa vyberie zo skupiny pozostávajúcej z leuprolidu, LHRH, nafarelínu a goserelínu.

20. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrnuje stupeň, v ktorom sa pridá nevodné protické rozpúšťadlo.

21. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že asi 30 % až asi 50 % hmotnostných leuprolidacetátu, zlúčeniny príbuznej LHRH, je rozpustené v DMSO.

22. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že sa pri ňom 370 mg leuprolidu rozpustí v 1 ml DMSO.

23. Spôsob liečby subjektu trpiaceho stavom, ktorý sa môže zmierniť aplikáciou peptidovej zlúčeniny, vyznačujúci sa tým, že sa uvedenému subjektu podá účinné množstvo formulácie podľa nároku 1.

24. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že toto podávanie lieku je parenterálne podávanie.

25. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že uvedené podávanie lieku je kontinuálne a dlhodobé.

26. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedené podávanie sa vykonáva s použitím implantovateľného systému na dlhodobé uvoľňovanie lieku.

27. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že uvedeným stavom je rakovina prostaty a uvedená peptidová zlúčenina je leuprolid.

28. Spôsob podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že sa denne podáva najmenej asi 80 mikrogramov leuprolidu.

29. Spôsob podľa nároku 28, vyznačujúci sa tým, že uvedené denné podávanie trvá počas doby vybranej zo skupiny zloženej z 3 mesiacov, 6 mesiacov a 12 mesiacov.

30. Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že uvedené denné podávanie počas uvedenej doby je kontinuálne podávanie uskutočnené s použitím implantovateľného systému na dlhodobé uvoľňovanie lieku.

31. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že uvedeným stavom je rakovina prostaty a uvedená peptidová zlúčenina je antagonista LHRH.

32. Stabilná nevodná formulácia peptidovej zlúčeniny vyznačujúca sa tým, že obsahuje:

a) najmenej jednu peptidovú zlúčeninu; a

b) najmenej jedno polárne aprotické rozpúšťadlo, pričom táto formulácia je stabilná pri 37 °C najmenej 3 mesiace za predpokladu, že uvedená formulácia neobsahuje zložky obsahujúce pridanú vodu.

33. Spôsob prípravy stabilnej nevodnej formulácie podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje rozpustenie najmenej jednej peptidovej zlúčeniny v najmenej jednom polárnom aprotickom rozpúšťadle za predpokladu, že uvedená formulácia neobsahuje zložky obsahujúce pridanú vodu.

34. Spôsob podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že sa uskutočňuje v atmosfére inertného plynu.

35. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že túto atmosféru predstavuje suchý dusík.

36. Stabilná nevodná formulácia peptidovej zlúčeniny vyznačujúca sa tým, že obsahuje:

a) najmenej jednu peptidovú zlúčeninu; a

b) najmenej jedno polárne aprotické rozpúšťadlo, pričom uvedená formulácia vykazuje bakteriostatické, baktericídne alebo sporicidne aktivity bez toho, aby boli použité bežné bakteriostatické, baktericídne alebo sporicidne činidlá.

37. Spôsob prípravy stabilných nevodných formulácií podľa nároku 36, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje rozpustenie najmenej jednej peptidovej zlúčeniny v najmenej jednom polárnom aprotickom rozpúšťadle za predpokladu, že uvedená formulácia neobsahuje žiadne pridané konvenčné bakteriostatické, baktericídne alebo sporicidne činidlá.

38. Spôsob liečby subjektu trpiaceho stavom, ktorý sa môže zmierniť aplikáciou peptidovej zlúčeniny, vyznačujúci sa tým, že sa uvedenému subjektu podá účinné množstvo formulácie podľa nároku 36.