RO113641B1

RO113641B1 - Derivati de benzoxazinona, procedeu de preparare a acestora, compozitii si combinatii farmaceutice si metoda de inhibare a hiv reverstranscriptazei

Info

Publication number: RO113641B1
Application number: RO95-00190A
Authority: RO
Inventors: Steven D Young; Susan F Britcher; Linda S Payne; Lekhanh O Tran; William C Lumma
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1992-08-07
Filing date: 1993-08-06
Publication date: 1998-09-30
Also published as: YU53093A; ES2151897T3; HRP931102B1; LV12719A; DE69329608D1; BG62612B1; JPH06184124A; NZ255216A; AU4449693A; NO2008008I1; CN1318031C; CA2101572A1; CN1250652A; NO950424D0; EP0582455B1; WO1994003440A1; LV12719B; DE10199013I1; JPH0780860B2; DZ1707A1

Description

Invenția se referă la derivați de benzoxazinonă, la un procedeu pentru prepararea acestora, la compoziții farmaceutice și combinații sinergetice, precum și la o metodă de inhibare a HIV reverstranscriptazei sau pentru prevenirea și tratarea infectării cu HIV.

Un retrovirus, denumit virusul imunodeficienței umane [HIV] este un agent etiologic al unei maladii complexe, care include distrugerea progresivă a sistemului imunitar (sindromul imunodeficienței dobândite; SIDA). Acest virus este cunoscut ca LAV, HTLV-III sau ARC. Q realizare obișnuită a replicației retrovirusului este reverstranscripția genomului RNA printr-o reverstranscriptază codificată viral, pentru a genera copii DNA ale secvențelor HIV, etapă necesară în replicația virală. Se cunoaște că anumiți compuși sunt inhibitori ai reverstranscriptazei și sunt agenți eficienți în tratamentul SIDA și a maladiilor similare, de exemplu, azidotimidina sau AZT.

Secvențializarea nucleotidică a HIV indică prezența unei gene pol, într-un cadru de citire deschis (Ratner L. ș.a., Nature, 313, 277 (1985)). Omologia secvenței de aminoacizi pune în evidență faptul că secvența pol codifică reverstranscriptaza, o endonuclează și o HIV protează (Toh H. ș.a., EMBO J., 4, (1985); PowerM.D. ș.a., Science, 231, 1567 (1986); Pearl L.H. ș.a., Nature 329,351(1987)).

Sunt cunoscuți derivați de 2,3dihidro-1,3-benzoxazin-2,4-dionă cu utilizare în prepararea de medicamente și antidăunători (RO 62687).

Se cunosc, de asemenea, 3,1benzoxazin-2-one substituite cu formula generală :

atom de hidrogen sau un radical alchil cu 1...4 atomi de carbon, dar R₂ și R₃nu sunt ambii atomi de hidrogen; și R₄poate fi hidrogen sau un radical alchil cu 1...5 atomi de carbon, compuși cu activitate anticonvulsivantă, tranchilizantă sau anti-Parkinson (US 3526621).

Sunt cunoscuți, de asemenea, derivați de benzoxazinone cu formula generală :

în care A este sulf, SO-, S0₂-, R-N=S- sau R-N=SO-, D este o grupare alchilen cu

2...6 atomi de carbon, R., este o grupă alchil, fenilalchil, cicloalchil sau fenil, R_a și R₃ , aceiași sau diferiți, reprezintă hidrogen, fenil, alchil sau cicloalchil, R₄ este hidrogen sau o grupă alchil, R₅ este hidrogen sau halogen, nitro sau o grupă alchil și R₆ este hidrogen sau halogen, nitro sau o grupă alchil, compuși care prezintă activitate antitrombotică (EP 0093922).

Invenția lărgește gama derivaților de benzoxazinonă cu compuși care prezintă structura chimică corespunzătoare formulei generale I :

(I) în care X reprezintă un atom de halogen, X¹ reprezintă trihalometil sau pentahaloetil; Z reprezintă O; R reprezintă (a) alchil C^Cg, nesubstituit sau substituit cu A, în care A este halogen, cicloalchil C₃C₆, ciano, hidroxi, alcoxi C^Czj, alchinil (C₂-C₄)alcoxi (C^CJ, ariloxi, alchilfC^CJ carbonil, nitro, dialchiKC^CjJamino, alchil (C^CJaminoalchiKC^Cg), un heterociclu sau ariltio; (b) alchenil C₂-C₄, nesubstituit sau substituit cu (i) A sau (ii) arii, nesubstituit sau substituit cu A; (c) alchinil C₂C₅ nesubstituit sau substituit cu (i) A sau (ii) arii, nesubstituit sau substituit cu A; sau (d) cicloalchil C₃-C₄, nesubstituit sau substituit cu (i) A sau (ii) arii, nesubstituit în care R și R₁ aceiași sau diferiți, reprezintă un atom de hidrogen, un atom de halogen, o grupă nitro și un radical alchil sau alcoxi cu 1 ...4 atomi de carbon; R₂ și R₃ aceiași sau diferiți, reprezintă un

RO 113641 Bl sau substituit cu A; sau sărurile acestora acceptabile farmaceutic.

Invenția se referă și la un procedeu de preparare a compușilor cu formula generală I, cum ar fi (-)-6-cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro2H-3,1-benzoxazin-2-onă, prin condensarea [±)-6-cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2onei cu un agent de rezoluție cum ar fi (-)-clorura de camfanil, într-un solvent inert, urmată de separarea diastereomerilor rezultați și îndepărtarea agentului de rezoluție.

Invenția constă și din compoziții farmaceutice pentru inhibarea HIV reverstranscriptazei, pentru prevenirea sau tratarea infecțiilor cu HIV sau pentru tratarea SIDA sau ARC, constituite din compușii cu formula I și un purtător acceptabil farmaceutic.

Invenția constă și din combinații constituite din compușii cu formula I și un analog de nucleozidă cu activitate biologică față de HIV reverstranscriptază, și anume conține compusul cu formula:

și eventual unul sau mai mulți inhibitori HIV aleși din grupa formată din: zidovudin (AZT); dideoxicitidin [ddCJ; dideoxinozin (ddl); didehidrodeoxitimidină (d4T) și lamivudin (3TC) sau constituite din compusul cu formula:

și unul sau mai mulți inhibitori HIV aleși din grupa formată din: zidovudin (AZT);

dideoxicitidin (ddCJ; dideoxinozin (ddl); didehidrodeoxitimidină (d4T) si lamivudin (3TC).

Invenția constă și dintr-o metodă de inhibare a HIV reverstranscriptazei sau pentru prevenirea și tratarea infectării cu HIV și a situațiilor patologice care urmează infectării, precum SIDA, prin administrarea la un mamifer a unei cantități eficiente dintr-un compus cu formula I sau o compoziție farmaceutică care cuprinde un purtător farmaceutic și o cantitate eficientă terapeutic dintr-un compus cu formula I, pe cale orală, parenterală, prin inhalare sau rectal, în formulări unitare de dozare, care conțin compușii cu formula I, în limitele de la 1 la 100 mg/kg greutate corporală, de preferință, de la 0,1 la 10 mg/kg greutate corporală.

Invenția prezintă avantaje prin aceea că se obțin compuși noi cu activitate farmacologică superioară.

Compușii preferați includ compușii 37.2, 4, 2, 5 și 24 din tabelul 1 de mai jos, în ordinea scăderii gradului de preferință:

Compusul 37.2:

[-]6-Cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-onă este compusul preferat în mod deosebit.

(-) 6-cloro-4-feniletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1 -benzoxazin-2onă.

Compusul 2:

RO 113641 Bl (±)-4-(1 -cloro-1,1 -difluorometil]-4(2-feniletinil)-6-cloro-1,4-dihidro-2H-3,1benzoxazin-2-onă.

Compusul 24 :

(±j 6-cloro-4-(2-cianofenil]etinil-4(1,1,1-trifluorometil)-1,4)-dihidro-2H-3,1- io benzoxazin-2-onă.

Compusul 5 :

(±) 4-(2-[dimetilaminometil]etinil)-

4-trifluorometil-6-cloro-1,4-dihidro-2H3,1-benzoxazin-2-onă; sau o sare acceptabilă farmaceutic.

Compușii, conform prezentei invenții, sunt în mod specific ilustrați în tabelele 1 și 2 de mai jos :

Tabelul 1

UI

Compus	Fț	X¹	PT(°C)	Ιθ*50 masă	IC* 50 dm	CIC*₉₅
1	= —©~^och₃	-cf₃	186- 187.5	58nM	4100nM
2	—-p	-cf₃	245- 246	25	480	6nM
3(+)	CN	-cf₃	178- 179	2900	37,000	>200

4_H

8.6 69 * măsurat în nM sau nanomoli/litru

RO 113641 Bl

7	8
	Tabelul 1 [continuare]

Compus	F[	2Î
5	*_ O	-CF«C!
	- \U/
6	—	-cf₃
7	no₂ ·- O	-cf₃
8		-cf₃

PT(°C)	IC‘_5O masă	Ιθ50 dm CIC95
154- 155	12nM	350nM
225- 226	1,700	19,000
160- 161	91	3,460
183- 184	163	8,470

-cf₃

168- 171	83nM	210nM
159- 160	18	390
185- 186	16	270	6.0nM
137- 147	12	2B0	25

(+/-)

RO 113641 Bl

Tabelul 1 [continuare]

R

-cf₃

-CF₃

-cf₃

	IC*50	10*50
PT(°C)	masă	dm CIC*gg
157	390nM	10⁵nM

174176

165166

230240

132133

148149

136137

162164

145146

150151

130	65,000
29	>10⁵
1900	1900	78,000

2300 >10⁵

15nM	2,650ηΜ 5θηΜ
24	25,000
145	10⁵
860	125,000
55	3,650

RO 113641 Bl

Tabelul 1 (continuare)

Compus

w1		IC*50	IC‘_5O
X	PT(°C)	masă	dm	CIC*95

-cf₃

*\A —o *\A

\A

131- 133	1300nM>	30,000nM
146.5- 147.5	43	1950 100
122- 124	220	>10⁵

224- 225	0.24	>10⁵
203- 204	550	>10⁵

118- 120	307nM	114,250nM	1500nM
1 ΘδΙ 68	1,900	>10⁵
100- 101.5	410	3000
140.5- 141.5	410	4250

172173

5400

RO 113641 Bl

Tabelul 1 [continuare]

Compus R

PT(°C)

Ιθ*50 masă

IC*50 dm CIC*₉₅ *

V *

V

277278

125126

184185

186187

300nM

16,500

650

5,300

37.2 (-)

CF₃

2nM >300,000nM >300,000 >300,000 >10⁵

85⁺nM alte date despre Compusul 38 sunt prevăzute la Exemple

RO 113641 Bl

Tabelul 2

u

Ιθ*50

Compus	R.	2Î	PT(°C)	masă
38		* -<	177179	136nM
39	-ÎJ	*	135- 136	510
40		Xz	125126	48
41	‘\A			1400nM

IC* 50 dm CIC*95 >300,000nM >300,000nM

29,000 >300,000nM

218220

1450

187- 610

188

44	* \/		206- 207	15nM
45		*	147- 148	560
46	^<1		186- 187	41

>300,000nM 100nM >300,000nM >300,O00nM

RO 113641 Bl

Compușii, conform invenției, pot prezenta centre asimetrice și pot exista (cu excepția cazurilor special notate] ca racemați, amestecuri racemice sau ca diastereoizomeri individuali sau ca enan- 5 tiomeri, toate formele izomere fiind incluse în prezenta invenție.

Notația (±J cuprinde izomeri optici (+] sau izomerii optici (-) sau amestecuri ale acestora. io

Când orice variabilă (de exemplu R) apare mai mult de o dată în orice constituent sau în formula I, definirea sa în fiecare caz este independentă de definirea sa în oricare altă apariție. Astfel, 15 combinațiile substituenților și/sau variabilelor sunt permise numai dacă asemenea combinații rezultă în compuși stabili.

Așa cum este utilizat, cu excepția situațiilor special notate, termenul “alchil” 20 include grupări hidrocarbonate alifatice, saturate, cu catenă lineară sau ramificată, având un număr precizat de atomi de carbon; termenul “alchenil” se referă la grupări alchenil cu cel puțin o dublă legă- 25 tură carbon - carbon, atât cu catenă ramificată, cât și cu catenă lineară; termenul “alchinil” se referă la grupări alchinil cu cel puțin o triplă legătură carbon carbon, atât cu catenă ramificată, cât și 30 cu catenă lineară. Termenul “halogen” sau “halo” este utilizat aici pentru a desemna fluor, clor, brom sau iod.

Așa cum este utilizat, cu excepția situațiilor special notate, termenul “arii” 35 reprezintă fenil, naftil, tetrahidronaftil, bifenil, fenantril, antril sau acenaftil.

Termenul “heterociclu” sau “heterociclic”, așa cum este utilizat aici, cu excepția situațiilor menționate special, 40 reprezintă inele monociclice stabile cu 5 până la 7 atomi sau inele heterociclice, biciclice cu 8 la 11 atomi, care sunt fie saturate, fie parțial saturate, fie nesaturate și care constau din atomi de 45 carbon și de la 1 la 4 heteroatomi selectați din grupa care constă din N, 0 și S și în care heteroatomii de N și S pot fi opțional oxidați și care includ orice grupare biciclică în care oricare din inelele so heterociclice definite mai sus poate fi condensat la un inel benzenic.

Exemple de astfel de elemente heterociclice includ piperidinil, piperazinil, 2-oxopiperazinil, 2-oxopiperidinil, 2-oxopirolidinil, 2-oxoazepinil, azepinil, pirolil, 4piperidonil, pirolidinil, pirazolil, pirazolidinil, imidazolil, imidazolinil, imidazolidinil, piridil, pirazinil, pirimidinil, piridazinil, oxazolil, oxazolodinil, izoxazolil, izoxazolidinil, morfolinil, tiazolil, tiazolidinil, izotiazolil, chinuclidinil, izotiazolidinil, indolil, chinolinil, izochinolinil, benzimidazolil, tiadiazolil, benzopiranil, benzotiazolil, benzoxazolil, furii, tetrahidrofuril, benzofuranil, tetrahidropiranil, tienil, benzotienil, tiamorfolinil, tiamorfolinil sulfoxid, tiamorfolinil sulfonă și oxadiazolil.

Compușii, conform prezentei invenții, pot fi sintetizați prin următoarele metode :

Schema I

Clorură de pivaloil

Clorură de metilen

Na₂CO₃ apos

1,1'- carbonildiimidazol

THF/50°C în sinteza benzoxazinelor, conform prezentei invenții, metodele generale implică, în mod caracteristic, ciclizarea nucleului benzenic ca etapă finală (vezi

RO 113641 Bl

Schema 1). Gruparea aminică a p-cloranilinei este întâi protejată cu, de exemplu, clorură de pivaloil, pentru a da compusul 2. Alte grupe care protejează gruparea aminică, mai puțin preferate, includ grupele t-butoxicarbonil, acetat sau izovaleroil. Apoi în jur de 2 echivalenți dintr-un alchillitiu sunt reacționați cu compusul 2, de preferință, n-butillitiu. Nici un alt compus organic metalic nu este adecvat pentru această etapă de metalare.

în mod consecutiv, prin· reacția cu CF₃C00Et urmată de răcire, se obține compusul 3.

Urmează sinteza carbinolului 4, prin adiția Grignard la cetona 3. Reactivul Grignard poate fi o sare a unui cation bivalent, de exemplu, Mg⁺⁺ sau Zn⁺⁺. Cationii monovalenți, ca Li⁺ sau Na⁺s-au găsit a fi neadecvați. Solvenții potriviți includ, dar nu se limitează, la tetrahidrofuran (THF) sau eter. Este permis un domeniu larg de temepraturi, cuprins între O°C și temperatura camerei.

închiderea inelului pentru a se obține produși 5, conform invenției, se realizează cu agenți de condensare, precum 1 ,T-carbonildiimidazol, fosgen, dimetilcarbonat, difenilcarbonat sau dh[pnitrofeniljcarbonat. Ciclizarea poate fi realizată cu oricare dintre acești compuși și tot așa de bine cu o mare varietate de alți compuși.

Un caz specific al Schemei 1 este prevăzut în Schema 1 A. Este prezentată astfel sinteza compusului L-741.211 care este un racemat al compusului

37.2 prezentat în continuare în exemplul 6.

Schema IA

In Schema II se prezintă o metodă pentru derivatizarea substituțiilor acetilenei din poziția 4 a nucleului benzoxazinic. Pe această cale, compusul 6 este metalizat, apoi se adaugă o sare de zinc. în reacția Heck este folosit catalizatorul tetrakis(trifenilfosfină)paladiu (O) complexat cu Cui, pentru a da compusul 7.

RO 113641 Bl

Schema III

Schema III ilustrează substituția io unei grupări 4-acetilenă cu un heterociclu care conține azot. Reacția Mannich implică o reacție de condensare a for maldehidei cu heterociclu, de exemplu pirolidină. Urmează substituția la atomul de carbon terminal în prezență de Cui drept catalizator.

Schema IV

(+/-)

Schema IV ilustrează rezoluția izo- 45 merilor optici a compușilor cu formula I sau II. în acest exemplu, (-)acidul camfanic este agentul de rezoluție. O mare varietate de alți agenți de rezoluție sunt adecvați, care includ clorură de acid 0- 50 metilmandelic sau reactiv Mosher. Este evident pentru specialiștii în domeniu modul de separare al unor astfel de izomeri. Schema IVA este adaptată în mod specific pentru rezoluția compusului L-742.211 în izolarea lui L-743.726. Vezi Schema IVA și Exemplul 6.

RO 113641 Bl (-)- clorură de camfanil

Schema IVA

4-DMAP/Et₃N/CHCI₃

Cristalizare din hexan

Recuperare 90% n-BuOH/1 N HCI/60°C

L-743,726

Compus 37.2

Ciclopropilacetilena este preparată conform Schemei V , conform procedeelor cunoscute (C.E.Hudson ș.a.,

J.Am. Chem.Soc. 94, 1158 [1972] și

W. Schoberth ș.a., Synthesis, 703 (1972)}.

RO 113641 Bl

Schema V

K^{0 PCI}·	L.CI t-BuOK/DMSO _
	(42%)

Se dau în continuare mai multe exemple de preparare a compușilor, conform invenției.

Exemplu I 1. [+/-)4/7,7,7-trifluo- 1 o rometil]-4-( 7 -buten-4-il)-6-cloro- 7,4dihidro-2H-3, 7 -benzoxazin-2-onă (compus 15]

Etapa A: N/4-clorofenil)-2,2-dimetilpropanamidă 15 într-un balon cu fund rotund, cu 3 gâturi, de 5 I, prevăzut la partea superioară cu agitator, se adaugă 127,56 g (1 mol) de 4-cloroanilină, 1200mlCHCI₃și 1200 ml soluție apoasă saturată de 20 Na₂C0₃. Se atașează la balon o pâlnie de alimentare și se încarcă cu 129 ml (1,05 moli) clorură de 2,2-dimetilpropanoil. Clorură acidă se adaugă, prin picurare, la amestecul agitat viguros, timp 25 de 1 h. Amestecul rezultat se agită la temperatură ambiantă încă 23 h. Din amestec se separă un produs sub formă de cristale albe. Aceste cristale se colectează prin filtrare. Filtratul se transvazea- 30 ză într-o pâlnie separatoare și se separă straturile. Stratul cloroformic se spală cu apă și cu saramură. După uscare peste sulfat de magneziu, filtrare și îndepărtarea solventului în vid se obține un 35 produs suplimentar. Cele două porțiuni de produs se reunesc și se recristalizează din amestec EtOAc-hexan fierbinte, obținându-se 185,6g de N-(4-clorofenil)-

2.2- dimetilpropanamidă, sub formă de 40 solid cristalin alb.

Etapa B: 1-[2-amino-5-clorofenil)-

2.2.2- trifluoroetanonă într-un balon, uscat la cuptor, de 3 I, cu 3 gâturi, cu fund rotund, cu un 45 agitator la partea superioară, cu admisie pentru argon și o pâlnie de alimentare de 500 ml, uscată la cuptor, se adaugă 100 g (472 moli) de N-(4-clorofenil)-2,2dimetilpropanamidă și 1 I THF. Această 50 soluție se răcește pe baie de gheată la 0°C și pâlnia de alimentare se încarcă cu

387 ml (968 mmoli] n-butillitiu, soluție

2,5 M în hexan. Soluția de n-butillitiu se adaugă lent, în picături, la soluția de amidă timp de 1 h, menținând temperatura sub +5°C. Soluția clară, rezultată, se lasă la perfectare, la 0°C, timp de 1 h, când se formează un precipitat portocaliu. La acest amestec se adaugă 115 ml (968 mmoli) de 1,1,1-trifluoroacetat de etil, în picături, timp de 1 h. Soluția clară, rezultată, se mai păstrează timp de 30 min pentru perfectare. Reacția se întrerupe cu soluție apoasă 5% de HCI. Amestecul se diluează cu 1 I de EtOAc și se separă straturile. Faza organică se spală cu saramură, se usucă peste MgS0₄, se filtrează și se concentrează în vid, obținându-se 1 60 g de ulei galben. Acest produs se suspendă în 1 I de soluție 3N de HCI și soluția se încălzește la reflux, timp de 24 h. Soluția răcită se diluează cu 1 I de EtOAc și amestecul devine bazic prin tratare cu soluție concentrată de NH₄0H. Straturile se separă și faza organică se spală cu saramură, se usucă peste MgS0₄ , se filtrează și se concentrează în vid și se cromatografiază pe 1,5 kg de silicagel, utilizând ca eluent soluție 15% EtOAc în hexan. Materialul cromatografiat se recristalizează din hexan fierbinte, obținându-se 57 g (54%) 1-(2-amino-5-clorofenil)-2,2,2-trifluoroetanonă pură, sub formă de cristale galben strălucitoare, cu punct de topire: 91-92°C. ¹H RMN (CDCI₃): δ 6,46 (br s, 2H), 6,69 (d, 1H, J= 9,2Hz), 7,32 (dd, 1H, J=2,4, 9,2Hz), 7,70 (d,1H, J=2,4Hz).

Etapa C. [+/-) 2-[2-Amino-5-clorofenil)-1, 7, 7-trifluoro-5-hexen-2-ol într-un balon, uscat la cuptor, de

300 ml, cu 3 gâturi, prevăzut cu agitator, admisie pentru argon, pâlnie de alimentare și un condensator de reflux, se adaugă 3,03 g (125 mmoli] șpan de magneziu și 75 ml THF. La acest amesRO 113641 Bl tec, bine agitat, se adaugă 12,0 ml (118,21 mmoli) de 4-bromo-1-butenă, cu un astfel de debit încât să se mențină un reflux ușor. Când adiția este completă, amestecul se lasă să reacționeze încă 30 min, apoi se răcește la O°Cîntro baie de gheață. La această soluție, bine agitată, se adaugă o soluție de 5,00 g (22,36 mmoli) de 1-(2- amino-5clorofenil)-2,2,2-trifluoroetanonă în 35 ml THF, în picături, timp de 30 min. Baia de răcire se lasă să se epuizeze și amestecul se agită timp de 20 h la temperatura camerei. Amestecul de reacție se diluează în EtOAc și acid citric 10%. Acest amestec se agită timp de 4 h. Straturile se separă și faza organică se spală cu soluție apoasă de NaHCO₃ și cu saramură. După uscare peste MgS0₄, filtrare, îndepărtarea solventului în vid și cromatografiere pe 300 g silicagel, utilizând soluție 15% de EtOAc în hexan ca eluent, se obțin 4,80 g de (+/-) 2-(2amino-5-clorofenil)-1,1,1 -trifluoro-5hexen-2-ol, sub formă de solid galben.

Etapa D: (+/-) 4-(1,1,1-trifluorometil)-4-( 1 -buten-4-il]-6-cloro-1,4-dihidro2H-3,1 -benzoxazin-2-onă într-un balon de 200 ml, cu fund rotund, prevăzut cu un agitator tijă, admisie pentru argon și un condensator de reflux, se adaugă 4,80 g (17,16 mmoli) de (+/-) 2-(2-amino-5-clorofenil)-1,1,1trifluoro-5-hexen-2-ol, 13,91 g (85,81 mmoli) 1 ,Τ-carbonildiimidazol și 75 ml THF. Acest amestec se încălzește 18 h la 60°C. Amestecul de reacție răcit se diluează cu EtOAc și se spală cu (3 x 200 ml) apă și cu 250 ml saramură. După uscare peste MgS0₄, filtrare și îndepărtarea solventului în vid, urmată de recristalizare din EtOAc-hexan, se obțin 3,22 g de (+/-) 4-(1,1,1-trifluorometil)-4-(1 -buten-4-il)-6-cloro-1,4-dihidro2H-3,1-benzoxazin-2-onă, sub formă de solid cristalin alb; punct topire 165166°C. ¹H RMN (CDCI₃) : δ 1,99 (m, 1H), 2,09-2,40 (m, 3H), 5,00 (d, 1H, J=1,4Hz), 5,03 (dd, 1H, J=1,4, 7,9), 5,78 (m, 1H), 6,85 (d, 1H, J=8,6Hz),

7,21 (br s, 1H], 7,35 (dd, 1H, J=2,2, 8,6Hz], 9,63 (br s, 1H).

Exemplul 2 (+/-) 6-Cloro-4-et/nil4-(1,1,1 -trifluorometil)-1,4-dihidro-2H3,1-benzoxazin-2-onă (Compus 26)

Etapa A: 2-(2-amino-5-clorofenil]1,1,1 -trifluoro-3-butin-2-ol

Un balon de 500 ml cu 3 gâturi, prevăzut cu pâlnie de alimentare, admisie pentru argon, agitator tijă și un termometru digital, se încarcă cu 268 ml (134 mmoli) bromură de etinilmagneziu 0,5 M în hexan, apoi se răcește la 78°C. Adăugarea în picături a unei soluții de 6,0 g (26,8 moli) de 1-(2-amino-5clorofenil]-2,2,2-trifluoroetanonă în 50 ml THF este completă în 15 min, menținând temperatura < -55°C. Amestecul de reacție se agită timp de 16 h după încălzire ușoară la temperatura camerei. Soluția roșu închis se aduce la temperatura de -5°C prin adăugarea, în picături, a 60 ml de soluție apoasă saturată de clorură de amoniu. După extracția cu acetat de etil, urmată de spălarea cu acid citric 10%, soluție apoasă saturată de bicarbonat de sodiu, apă și saramură se obțin 8,5 g produs brut, care se usucă peste sulfat de sodiu, se filtrează și se evaporă solventul. Purificarea prin cromatografie rapidă utilizând 15-20% acetat de etil-hexan conduce la obținerea a 5 g de 2-(2-amino-5-clorofenil)-1,1,1trifluoro-3-butin-2-ol sub formă de ulei brun deschis (η=75%).

Etapa B: (+/-) 6-Cloro-4-etinil-4(1,1,1-trifluorometil)-1,4-dihidro-2H-3,1benzoxazin-2-onă

O soluție de 5,0 g (20,0 mmoli) de 2-(2-amino-5-clorofenil)-1,1,1 -trifluoro-

3-butin-2-ol în 225 ml THF se tratează cu 13,0 g (80,0 mmoli) de 1,1 '-carbonildiimidazol și se încălzește într-o baie de ulei la 60°C, timp de 17 h. THF se îndepărtează sub vid, reziduul se dizolvă în acetat de etil, apoi se spală cu acid citric 10%, bicarbonat de sodiu, apă și saramură, înainte de uscare peste sulfat de sodiu. După filtrarea și evaporarea în vid, se izolează 3,6 g de produs brut, care se recristalizează din acetat de etil-hexan. Se izolează 3,22 g (η=58,4%) de (+/-) 6-cloro-4-etinil-4-(1,1,1-trifluorometil)-1 ,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-onă,

RO 113641 Bl sub formă de solid cristalin alb; punct topire 226-227°C.

¹H RMN (CDCI₃ + urme de DMSO]: δ 3,16 (s, 1H), 6,98 (d, J=3,3Hz, 1H), 7,35 (m, 1H), 7,51 (s,1H), 10,66 (s,1H).

Exemplul 3. (+/-] 6-Cloro-4-(1, 1,1 -trifluorometil)-4-[(3-[ 1 -pirolidinil])-1 propinil]-1,4-dihidro-2H-3,1 -benzoxazin-2onă (Compus 7]

O soluție în dioxan de 150 mg (0,544 mmoli) de (+/-) 6-cloro-4-etinil-4(1,1,1-trifluorometil)-1,4-dihidro-2H-3,1benzoxazin-2-onă, 52,2 pl (0,626 mmoli] de pirolidină, 20,5 mg (0,681 mmoli) paraformaldehidă, 31,1 pl (D,544mmoli) de acid acetic și 20,5 mg (0,207 mmoli) de clorură de Cu (I) în 3,5 ml dioxan se încălzesc la 5D°C, într-o baie de ulei, pentru aproximativ 2 h. Amestecul de reacție este turnat în soluție 2N HCI și se extrage cu acetat de etil. Stratul apos se neutralizează cu carbonat de potasiu solid și este extras de 3 ori cu acetat de etil. Extractele reunite se spală cu apă și saramură, înainte de uscare peste sulfat de sodiu pentru a se obține 140 mg produs brut. După purificare prin cromatografie pe silicagel și recristalizare din acetat de etil-hexan, se obține un produs cristalin (+/-]6-cloro-4-(1,1,1-trifluorometil)-4-[(3-(1 -pirolidinil)]-1 -propinil]-

1.4- dihidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-onă (89 mg, η=46%]; punct topire 160161°C (cu descompunere).

¹H RMN (CDCI₃) : δ 1,85-1,89 (m, 4H], 2,68-2,71 (m, 4H), 3,67 (s, 1H), 6,88 (d, J=8,55Hz, 1H], 7,40 (dd, J=2,19, 8,54 Hz, 1H), 9,45 (s, 1H).

[+/-] 6-Cloro-4-(2-cianofeniiJetinil-

4-( 1,1,1 -trifluorometil)-1,4-dihidro-2H-

3,1-benzoxazin-2-onă (Compus 2]

O soluție de 138 mg (0,5 mmoli) de 6-cloro-4-etinil-4-(1,1,1-trifluorometil]-

1.4- dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-onă în 3 ml THF uscat se agită la -78°C. La această soluție se adaugă 0,4 ml [1,0 mmoli) de n-butillitiu 2,5 M în hexan. Anionul se lasă 10 min la -78°C, apoi se adaugă 1 ml de ZnCI₂ [1M în eter). Amestecul de reacție se lasă sub agitare la -78°C, timp de 15 min, se înde părtează baia de gheață și amestecul se încălzește ușor la 0°C, timp de 30 min. La amestecul de reacție se adaugă o soluție de 149 mg (0,65 mmoli) de 2iodobenzonitril în 2 ml THF, apoi 56 mg (0,05 mmoli) de tetrakis(trifenilfosfină) de paladiu (□). Amestecul de reacție se lasă să se încălzească la temperatura camerei, cu agitare timp de 15 h. Amestecul de reacție se răcește cu 10 ml soluție Hcl 2 N, se extrage cu 2 x 200 ml EtOAc și extractele reunite se spală cu apă, cu saramură și se usucă peste MgS0₄.

Solventul se îndepărtează, obținându-se 195 mg de ulei care se cromatografiază rapid pe silicagel (20% EtOAc în hexan) pentru a da 60 mg de materie primă nereacționată și 35 mg de produs cuplat. Ultimul se triturează cu eter pentru a se obține 25 mg de (+/-) 6-cloro-4(2-cianofenil)etinil-4-(1,1,1-trif Iu oro metil )-

1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-onă cu punct topire 245-246°C. FAB.MS M+1 = 377 m/e. ¹H RMN (CDCI₃); δ 6,82-

6,85 (d, J=8,5Hz, 1H), 7,40-7,44 (dd, J=2,1,8,5 Hz, 1H], 7,56-7,79 (m, 5H], 8,00 (s, 1H).

Exemplul 4 (+/-) 4-[1-Cloro-1,1difluorometil)-4-(2-feniletinil)-6-cloro-1,4dihidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-onă (Compus 5)

Etapa A: 1-(2-amino-5-clorofenil}2-cloro-2,2-difluoroetanonă) într-un balon cu 3 gâturi, de 300 ml, uscat la cuptor, prevăzut cu agitare magnetică, admisie de argon și pâlnie de alimentare de 100 ml, uscată la cuptor, se adaugă 10 g (47,2 mmoli] de N-(4-clorofenil)-2,2-dimetilpropanamidă și 100 ml THF. Această soluție se răcește pe baie de gheață la 0°C și pâlnia de alimentare se încarcă cu 38,7 ml (96,8 mmoli) de n-butillitiu, soluție 2,5 M în hexan. Soluția de n-butillitiu se adaugă, prin picurare, la soluția de amidă timp de 1 h, menținând temperatura sub +5°C. Soluția rezultată se lasă în repaos la 0°C, timp de 1 h, timp în care se formează un precipitat portocaliu. La acest amestec se adaugă 10,2 ml (96,8 mmoli) de 1-cloro-1,1-difluoroaceRO 113641 Bl tat, în picături, timp de 15 min. Soluția clară care rezultă se lasă la perfectare încă 30 min. Reacția se întrerupe cu soluție apoasă de HCI 5%. Amestecul se diluează cu 1 I de EtOAc și se separă 5 straturile. Faza organică se spală cu saramură trează și

usucă peste MgSCL, se filconcentrează in via. obtinându-se 160 g de ulei galben. Acest material se suspendă în 200 ml soluție io apoasă 3 N de HCI și soluția se încălzește la reflux timp de 24 h. Soluția răcită se diluează cu 500 ml de EtOAc și amestecul devine bazic prin tratare cu soluție concentrată de NH₄0H. Straturile 15 se separă și faza organică se spală cu saramură, se usucă peste MgS0₄, se filtrează, se concentrează în vid și se cromatografiază pe 350 g de silicagel, utilizând EtOAc 15% în hexan, ca eluent. 20 Materialul cromatografiat se recristalizează din hexan fierbinte, obținându-se

5,5 g de 1-(2-amino-5-clorofenil)-2-cloro-

2,2-difluoroetanonă pură, sub formă de cristale qalben deschis, cu punct topire 25 55-56°C.

¹H RMN (CDCI₃) : δ 6,43 (br s, 2H),

6,69 (d, 1H, J=9,0Hz), 7,31 (dd, 1H, J=2,4, 9,0 Hz], 7,80 (d, 1H, J=2,4 Hz).

Etapa B: (+/-) 2-(2-Amino-5-clo- 30 rofenil)-4-fenil- 1-cloro-1,1-difluoro-3-butin2-ol

Intr-un balon de 100 ml, cu 3 gâturi, uscat la cuptor, prevăzut cu agitator tijă, admisie pentru argon, conden- 35 sator de reflux și o șicană, se adaugă 2,13 g (20,83 mmoli) de etinilbenzen, 50 ml THF și 6,94 ml bromură de etilmagneziu (soluție 3,0 M în eter).Acest amestec se lasă la perfectare timp de 40 2 h la temperatura camerei, apoi se adaugă cu seringa o soluție de 1 ,□□ g (4,17 mmoli) de 1 -(2-amino-5-clorofenil)2-cloro-2,2-difluoroetanonă în 6 ml THF. Soluția de culoare roșu portocaliu rezul- 45 tată se agită la temepratura camerei timp de 21,5 h. Reacția se întrerupe prin adăugare de 50 ml soluție 1N Hcl, apoi are loc diluarea cu EtOAc. Soluția devine apoi bazică cu soluție concentrată 50 de NH₄0H și straturile se separă. Faza organică se spală cu apă și cu saramu ră. După uscare peste MgS0₄, filtrare, îndepărtarea solventului în vid și cromatografie pe silicagel, utilizând soluție 20% EtOAc în hexan ca eluent, se obțin 1,02 g de (+/-) 2-(2-amino-5-clorofenil]-4-fenil1-cloro-1,1-difluoro-3-butin-2-ol sub formă de solid alburiu.

¹H RMN (CDCIg) : δ 4,42 (br s, 2H], 5,10 (br s, 1H), 6,65 (d, 1H, J=8,5Hz),

7,15 (dd, 1H, J=2,4, 8,5 Hz), 7,38 (m, 3H), 7,55 (m, 2H), 7,70 (d, J=2,4Hz).

Etapa C: (+/-] 4-(1-Cloro-1,1-difluorometil)-4-(2-feniletinil)-6-cloro-1,4dihidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-onă într-un balon de 100 ml cu fund rotund, prevăzut cu un agitator tijă, un condensator de reflux și admisie pentru argon se adaugă 0,81 g (2,37 mmoli) de (+/-) 2-(2-amino-5-clorofenil]-4-fenil-1cloro-1,1-difluoro-3-butin-2-ol, 25 ml THF uscat și 1,919 g (11,84 moli) de 1 ,Tcarbonildiimidazol. Această soluție se încălzește la 60°C timp de 20 h. Amestecul de reacție răcit se diluează cu EtOAc și se spală cu soluție 0,5 N de HCI, apă și saramură. După uscare peste MgS0₄, filtrare și îndepărtarea solventului în vid dă 890 mg dintr-un ulei. Acest material este cromatografiat pe 80 g silicagel, utilizând soluție 20% EtOAc în hexan, ca eluent. Materialul cromatografiat se recristalizează din amestec EtOAc-hexan fierbinte, obținându-se 507 mg (η=58%) de (+/-)4-(1cloro-1,1 -difluorometil]-4-(2-feniletinil)-6cloro-1,4-dihidro-2H-3,1 -benzoxazin-2onă, sub formă de ace albe, cu punct topire 154-155°C. ¹H RMN (CDCI₃) : δ 6,89 (d, 1H, J=8,4 Hz], 7,35-7,48 (m, 4H], 7,56 (m, 2H), 7,64 (br s, 1H), 9,19 (br s, 1H).

Exemplul 5 (-) 6-Cloro-4-feniletinil-

4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3₁ 1 benzoxazin-2-onă (Compus 4)

Etapa A: 2-(2-amino-5-clorofenilJ4-fenil-1,7,1-trifluoro-3-butin-2-ol

O soluție de fenilacetilidă de litiu, preparată din 4,83 ml (0,044 moli) de fenilacetilenă și 17,2 ml (0,043 moli] dintr-o soluție 2,5 N de /7-b util litiu în hexan, în 50 ml THF, la -78°C, se tratează cu 11,4 g (0,0044 moli] de eterat

RO 113641 Bl bromură de magneziu, timp de 5 min. Amestecul se lasă să se încălzească la 2O°C și agitarea sub atmosferă de argon se continuă timp de 30 min. Amestecul de reacție este apoi răcit la -60°C și se adaugă o soluție care conține 2,5 g (0,011 moli) de 1-(2-amino-5-cloro-

2,2,2-trifluorometiletanonă, complexată în prealabil cu un echivalent (2,8 g, 0,011 moli) de eterat de bromură de magneziu în 25 ml de THF. Amestecul de reacție se lasă sub agitare la 15°C timp de 1 h, înainte de a fi răcit la 0°C și se tratează cu un amestec de 30 ml din fiecare dintre o soluție apoasă saturată de NH₄CI și apă. Amestecul se extrage cu 2 x 100 ml eter etilic, fazele organice se spală cu saramură și se usucă peste MgSQ₄. îndepărtarea agentului de uscare și a solvenților lasă 6 g dintr-un ulei care se cromatografiază rapid pe silicagel, eluând cu 20% EtOAc în hexan, pentru a se obține 2,5 g de 2-(2-amino-

5-clorofenil]-4-fenil-1,1,1-trifluoro-3-butin2-ol.

¹H RMN (CDCIg) : δ 4,63 (br s, 3H),

6,69 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,15 (d, J=2Hz, 1H], 7,17 (d, J=2Hz, 1H), 7,357,44 (m, 3H), 7,53-7,56 (m, 2H), 7,66 (d, J=2 Hz, 1H], FAB MS Μ + H = 326 m/e.

Etapa B: [+) 6-Cloro-4-feniletinil-4trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazinon-2-onă (Compus 12)

O soluție de 2,0 g (6,1 mmoli] de 2-(2-amino-5-clorofenil)-4-fenil-1,1,1-trifluoro-3-butin-2-ol și 11 ,□ g (12,0 mmoli) de 1, T-carbonildiimidazol în 300 ml de THF uscat, se agită sub argon la 55°C, timp de 24 h. Solventul se îndepărtează într-un evaporator rotativ și reziduul se împarte în părți între 200 ml eter și 400 ml apă. Straturile se separă și extractul apos se mai extrage o dată cu eter. Extractele eterice reunite se spală cu 2 x 200 ml acid citric 10% și apoi cu saramură, înainte de uscate peste MgS0₄. După îndepărtarea agentului de uscare și a solventului se obțin 1,5 g (η=70%) compus din titlu brut, sub forma unui ulei. Triturarea cu eter -hexan conduce la obținerea a 875 mg de (±) 6-cloro-4feniletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-

3,1-benzoxazinon-2-onă, sub formă de solid alb, cu topire parțială la 137°C și totală la 147°C. ¹H RMN (CDCI₃) : δ 6,92 (d, J=8 Hz, 1H), 7,30-7,49 (m, 4H), 7,58-7,65 (m, 3H), 8,99 (s, 1H).

Etapa C: 6-Cloro-1-Î1S]-camfanoil-4-feniletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro2H-3,1 -benzoxazin-2-onă

La o soluție care conține 2,24 g (6,37 mmoli) (±) 6-cloro-4-feniletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazinon-2-onă, 0,10 g (0,8 mmoli] 4-dimetilaminopiridină și 2,07 g (9,55 mmoli) de clorură a (-] acidului camfanic în 60 ml de diclormetan uscat, agitată sub argon, într-o baie de gheață, se adaugă

2,22 ml (15,9 mmoli] de trietilamină. Baia de răcire se îndepărtează și se lasă ca reacția să se producă la temperatura camerei. Când reacția este completă, moment determinat prin cromatografie în strat subțire (Si0₂, 4% EtOAc în CHCI₃), soluția se diluează cu 200 ml de CHCI₃ și se spală de două ori cu acid citric 10%, apoi cu saramură. După uscare peste MgS0₄, solventul se îndepărtează într-un evaporator rotativ și reziduul spumos se supune cromatografierii rapide, eluând cu CHCI₃. Se obțin 575 mg de diastereoizomer I al 6-cloro-(1S]-camfanoil-4-feniletinil-4-trifluorometil-1,4dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-onei sub formă de ulei. ¹H RMN (CDCI₃) : δ 0,85 (s, 3H), 1,08 (s, 3H], 1,22 (s, 3H), 1,73-

1.85 (m, 1H], 1,92-2,08 (m, 1H),

2.50- 2,67 (m, 2H), 7,30-7,79 (m, 8H). Acesta este urmat de 1,52 g de amestec de fracțiuni (diastereoizomeri I și II).

Eluarea în continuare conduce la obținerea a 680 g din diastereoizomerul II, al compusului din titlu, care se deplasează mai încet, care după triturare cu amestec de eter/hexan dă aglomerări de ace albe, punct topire 177178,5°C. ¹H RMN (CDCI₃) : δ 0,83 (s, 3H), 1,12 (s, 3H], 1,23 (s, 3H), 1,73-

1.86 (m, 1H), 1,93-2,06 (m, 1H],

2.50- 2,63 (m, 2H), 7,38-7,51 (m, 4H], 7,49-7,62 (m, 2H], 7,72 (d, J=9Hz, 1H), 7,76 (d, J=2 Hz, 1H).

RO 113641 Bl

Se dizolvă 1,52 g de amestec de izomeri rezultați de la cromatografia rapidă în 75 ml eter, soluția se diluează cu 50 ml hexan și apoi se însămânțează cu un cristal de izomer II.

Cristalizarea lentă conduce la 385 mg de izomer II suplimentar, care se recristalizează din eter/hexan, obținându-se >96% material pur din punct de vedere diasteromeric, prin HPLC.

Etapa D: (-] 6-Cloro-4-feniletinil-4trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3_t 1 -benzoxazin-2-onă

Se dizolvă 53 mg (0,1 □ mmoli] de diastereoizomer II, cristalin, de 6-cloro-1(1 S)-camfanoil-4-feniletinil-4-trifluorometil-

1,2-dihidro-4(H)-3,1-benzoxazin-2-onă în 8 ml de 2-propanol la 45°C, sub atmosferă de argon. La soluție se adaugă 0,27 ml dintr-o soluție apoasă 10% de K₂C0₃. Agitarea se continuă 10 min, în care timp tot materialul inițial este consumat (așa cum indică TLC, SiO_a, 4% EtCAc în CHCI₃). Soluția se concentrează în vid și reziduul se reia în eter. După spălare cu solție 0,1 N HCI și saramură, soluția eterică se usucă peste MgSO₄, se filtrează și se evaporă în vid la un solid uleios, care se purifică prin cromatografie pe SiO₂, cu eluent 5% 2-propanol în hexan. Se obține (-) 6-cloro-4-feniletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1benzoxazin-2-onă sub formă de ace albe, din eter/hexan, punct topire 178179°C; [α]²% = -92,5°C (CHCI₃, C = 0,0012 g ml·¹).

¹H RMN (CDCI₃) : δ 6,87 [d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,37-7,50 (m, 4H], 7,56-7,63 (m, 3H), 8,60 (s, 1H).

Etapa E: (+] 6-Cloro-4-feniletinil-4trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-onă (Compus 3) (+) 6-Cloro-4-feniletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2onă se prepară pornind de la produsul necristalin de la Etapa C, diastereoizomerul I, într-un mod asemănătr cu Etapa D; punct topire 178-179°C; [a]²⁰ _D = +87,6°C (CHCI₃, C = 0,0050 g ml¹].

Ή RMN (CDCI₃] : δ 6,87 (d, J = 8,5 Hz,

1H], 7,37-7,50 (m, 4H], 7,56-7,63 (m,

3H], 8,60 (s, 1H).

Exemplul 6 (-] 6-Cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-

3,1-benzoxazin-2-onă [L-743.726, Compus 37.2] și [+] 6-cloro-4-ciclopropiletinil4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1 - benzoxazin-2-onă (L-743.725]

Etapa A : 2-(2-Amino-5-clorofenil]-4-ciclopropil-1,1,1-trifluoro-3-butin-2ol

Se prepară o soluție de ciclopropilacetilidă de bromomagneziu din 23 g (0,340 moli] ciclopropilacetilenă în 250 ml de THF, prin adăugarea, prin picurare a 116 ml dintr-o soluție 3,0 M de bromură de etilmagneziu (0,348 moli) în eter, timp de 1 h. Această soluție se menține la 0°C timp de 1 h, apoi la 40°C timp de 3 h. La această soluție răcită din nou la 0°C, se adaugă 15,56 g (0,0696 mmoli) de 1-(2-amino-5-clorofenil)-2,2,2-trifluorometiletanonă, sub formă de solid, în porțiuni, timp de 5 min. Amestecul de reacție se agită la 0°C, timp de 1,5 h. Reacția se întrerupe la 0°C prin adăugarea în porțiuni, a 700 ml de soluție apoasă saturată de clorură de amoniu. Amestecul se extrage cu 2 x 400 ml acetat de etil, fazele organice reunite se spală cu apă și cu saramură și se usucă peste MgS0₄. După îndepărtarea agentului de uscare și a solvenților se depune un solid galben. Acest material se recristalizează din hexan fierbinte (la volum final de 100 ml), obținându-se 14,67 g de 2-(2-amino-5-clorofenil]-4ciclopropil-1,1,1 -trifluoro-3-butin-2-ol. Prin concentrarea apelor mumă se obține o a doua cantitate, de 2,1 g din același produs, care are punct topire 153-154°C.

¹H RMN (CDCIg) : δ 0,84 (m, 2H), 0,90 (m, 2H), 1,38 (m, 1H), 4,50 (br s, 3H],

6,69 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,13 (dd, J=2,5, 8,5 Hz, 1H], 7,55 (d, J=2,5 Hz, 1H).

Etapa B : [±] 6-Cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3, 7 benzoxazin-2-onă (L-741.211) □ soluție de 15,00 g (0,0518 moli) de (2-amino-5-clorofenil)-4-ciclopropil-1,1,1-trifluoro-3-butin-2-ol și 41,98 g

RO 113641 Bl (0,259 moli] de 1, T-carbonildiimidazol în 250 ml de THF uscat, se agită sub argon la 55°C timp de 24 h. Solventul se îndepărtează într-un evaporator rotativ și reziduul se împarte între 500 ml acetat de etil și 400 ml de apă. Straturile se separă și faza apoasă se extrage încă o dată cu acetat de etil. Extractele de acetat de etil reunite se spală cu 2 x 200 ml soluție apoasă 2% de HCI, cu soluție apoasă saturată de NaHC0₃ și cu saramură. După uscare peste MgS0₄, filtrare și îndepărtarea solventului în vid, se obțin 16,42 g de produs din titlu, sub formă de solid. Prin recristalizare din acetat de etil : hexan se obțin 12,97 g produs de puritate analitică (±) 6-cloro-4ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-onă, cristalin, alb, cu punct topire 178-180°C. ¹H RMN (CDCIg): δ 0,85 (m, 2H], 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, 1H], 6,81 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,37 (dd, J=2,5, 8,5 Hz, 1H],

7,49 (d, J=2,5 Hz, 1H), 8,87 (br s, 1H).

Etapa C : 6-Cloro-1-(1S]-camfanoil-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4dihidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-onă

La o soluție care conține 12,97 g (0,041 moli] de (±) 6-cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1benzoxazin-2-onă, 1,02 g (0,0083 moli] 4-aminopiridină și 14,22 g (0,06556 moli] de clorură de (-] acid camfonic în 350 ml de diclorometan uscat, agitată sub argon, într-o baie de gheață, se adaugă 22,84 ml (0,164 moli] trietilamină. Baia de răcire se îndepărtează și reacția este lăsată să se desfășoare la temperatura camerei. După 75 min, reacția se consideră a fi completă, indicație dată de cromatografia în strat subțire (Si0₂, 4% EtOAc în CHCI₃)și soluția se diluează cu 500 ml de CHCI₃, apoi se spală de două ori cu acid citric 10%, o dată cu apă și o dată cu saramură. După uscare peste MgS0₄, filtrare și îndepărtarea solventului în vid, se depune o spumă fără culoare. Acest material se triturează cu 200 ml de hexan fierbinte. Prin răcire la temperatura camerei, precipită camfonatimida, diastereoizomerul dorit. Produsul, solid se colectează pe o frită, se spală cu puțin hexan rece și se usucă în vid, obținându-se 7,79 g de 6cloro-1 -(1 S)-camfanoil-4-ciclopropiletinil-4trifluorometil-1 ,4-dihidro-2H-3,1 benzoxazin-2-onă, sub formă de solid alb, cu punct topire 164-165°C, puritate HPLC: 99,2%, a) 254 nm.

¹H RMN (CDCIg] : δ 0,77 (s, 3H], 0,860,96 (m, 4H], 1,08 (s, 3H], 1,19 (s, 3H], 1,44 (m, 1H), 1,76 (m, 1H], 1,95 (m, 1H), 2,51 (m, 2H], 7,42 (dd, J=2,4, 9,0 Hz, 1H], 7,63 (m, 2H).

Etapa D : [-) 6-Cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1benzoxazin-2-onă (L-743.726, Compus 37.2]

Se dizolvă 7,50 g (0,01 51 2 moli] de 6-cloro-1 -(1 S]-camfanoil-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1benzoxazin-2-onă în 150 ml de n-butanol, la 60°C, sub atmosferă de argon. La această soluție se adaugă 10 ml de soluție HCI 1 N. Această soluție se menține la 60°C, timp de 72 h. Amestecul se neutralizează cu soluție apoasă de NaHC0₃ și π-butanolul se îndepărtează în vid. Reziduul se dizolvă în 150 ml THF și se tratează cu 50 ml soluție 2N de LiOH, timp de 3 h, la temperatura camerei. Acest amestec se diluează cu acetat de etil și se spală cu două porții de apă și una de saramură. După uscare peste MgS0₄, filtrare și îndepărtarea solventului în vid, se obține un solid alb. Acest material se recristalizează din hexan fierbinte, obținându-se 3,43 g (-] 6-Cloro-4ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-onă, sub formă de cristale albe, cu punct de topire 131-132°C; [a]²% = -84,7° (CHCI₃, c = 0,005 g ml'¹];

Ή RMN (CDCI₃) : δ 0,85 (m, 2H], 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, 1H], 6,81 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,37 (dd, J=2,5, 8,5 Hz, 1H],

7,49 (d, J=2,5 Hz, 1H], 8,87 (br s, 1H).

Etapa E : (+) 6-Cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1 benzoxazin-2-onă (L-743.725]

Apele mume de la etapa C de mai sus se purifică prin cromatografie pe

RO 113641 Bl coloană de silicagel, utilizând acetat de etil 10% în hexani, ca eluent. Diastereoizomerul nedorit, pur (o spumă fără culoare) se hidrolizează conform Etapei

D. Benzoxazinona enantiomeră, (+) 6- 5 cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-

1,4-dihidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-onă, se obține sub formă de cristale albe, cu punct topire 131-132°C [a]^a% = +84,4° (CHCI₃, c = 0,005 g ml'¹); io ¹H RMN (CDCI₃) ; δ 0,85 (m, 2H), 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, 1H), 6,81 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,37 (dd, J=2,5, 8,5 Hz, ΪΗ),

7,49 (d, J=2,5 Hz, 1H), 8,87 (br s, 1H). 15

Compușii, conform invenției, sunt utilizați pentru prepararea și executarea testelor de selecție pentru compușii antivirali. De exemplu, compușii, conform invenției, sunt utilizați pentru izolarea mu- 20 tanților de enzime, care sunt mijloace excelente de selecție pentru compuși antivirali mai puternici. în plus, compușii acestei invenții sunt utilizați în stabilirea și determinarea situsurilor de legare a 25 altor antivirali la HIV reverstranscriptazei, de exemplu, prin inhibare competitivă. Astfel, compușii, conform invenției, sunt produși cu destinație comercială.

Compușii, conform invenției, sunt 30 utilizați pentru inhibarea HIV reverstranscriptazei, pentru prevenirea tratamentului de infectare prin virusul imunodeficienței umane (HIV) și tratamentul situațiilor patologice care urmează infectării pre- 35 cum SIDA.

Tratamentul SIDA sau prevenirea sau tratarea infectării cu HIV așa cum este definit, include, dar nu se limitează la, tratarea unei mari varietăți de situații 40 ale infectării cu HIV: SIDA; ARC (SIDA asociat complex], atât simptomatic cât și asimptomatic și expunere actuală sau potențială la HIV. De exemplu, compușii, conform invenției, sunt utilizați în trata- 45 mentul infectării prin HIV după expunerea suspectată la HIV, de exemplu, prin transfuzii, schimbarea fluidelor în organism, mușcături, înțepături accidentale cu acul sau expunerea pacientului la sân- 50 gerare în timpul intervenției chirurgicale.

Avantajele particulare ale compu șilor, conform invenției, constau în potențiala lor inhibare împotriva HIV reverstranscriptazei, rezistent la alți antivirali, precum L-697.661 care este 3-(((4,7dicloro-1,3-benzoxazol-2-il)metil]-aminoJ-

5-etil-6-metilpiridin-2(1 H]-onă sau L696.229, care este 3-(2-(1,3-benzoxazol-2-il)etil]-5-etil-6-metilpiridin-2(1 H]-onă sau AZT.

Pentru aceste scopuri, compușii, conform invenției, pot fi administrați oral, parenteral (incluzând injecții subcutanate, intravenoase, intramusculare, injecții intrasternale sau infuzii tehnice], prin inhalare din pulverizatoare sau rectal, în formulări unitare de dozare, care conțin purtători convenționali, netoxici, acceptabili farmaceutic, aditivi și materiale de suport.

Astfel, conform prezentei invenții, în mod suplimentar, este prevăzută o metodă de tratare și o compoziție farmaceutică pentru tratarea infecției cu HIV și SIDA. Tratamentul implică administrarea la un pacient, care are nevoie de un astfel de tratament, a unei compoziții farmaceutice care cuprinde un purtător farmaceutic și o cantitate eficientă terapeutic dintr-un produs, conform prezentei invenții.

Aceste compoziții farmaceutice pot fi sub formă de suspensii administrate oral sau tablete; pulverizatoare nazale, preparate injectabile sterile, de exemplu suspensii sterile injectabile, apoase sau uleioase sau supozitoare.

Atunci când se administrează oral sub formă de suspensii, aceste compoziții sunt preparate conform metodelor cunoscute în condiționările farmaceutice și pot conține celuloză microcristalină pentru dispersarea în masă, acid alginic sau alginat de sodiu ca agent de suspendare, metilceluloză pentru ameliorarea viscozității și agenți îndulcitori/aromatizanți cunoscuți în domeniu.

Sub formă de tablete cu eliberare spontană, aceste compoziții pot să conțină celuloză microcristalină dicalciu fosfat, amidon, stearat de magneziu și lactoză și/sau alți excipienți, lianți, materiale de umplutură, dezintegranți, diluanți și

RO 113641 Bl lubrifianți, cunoscuți în domeniu. Atunci când se administrează aerosoli nazali sau inhalații, aceste compoziții se prepară conform metodelor cunoscute în domeniu pentru formulările farmaceutice 5 și pot fi preparate ca soluții de sare metalică, utilizând alcool benzilic sau alți protectori adecvați, promotori de absorbție pentru îmbunătățirea compatibilității biologice, fluorocarbonați și/sau alți io agenți de solubilizare sau dispersare, cunoscuți în domeniu.

Soluțiile injectabile sau suspensiile pot fi formulate conform metodelor cunoscute în domeniu, utilizând diluanți sau 15 solvenți netoxici, acceptabili din punct de vedere parenteral, cum sunt 1,3-butandiol, apă, soluție Ringer sau soluție izotonică de clorură de sodiu sau utilizând agenți corespunzători de dispersare sau 20 umectare și agenți de suspendare, cum sunt calmante sterile, uleiuri nevolatile care includ mono- sau digliceride sintetice și acizi grași, care includ acid oleic.

Atunci când se administrează sub 25 formă de supozitoare, aceste compoziții pot fi preparate prin amestecarea medicamentului cu un excipient adecvat, neiritant, cum sunt butircacao, gliceridesteri sintetici sau polietilenglicoli, care sunt 30 solizi la temperatură ordinară, dar care devin lichizi și/sau se dizolvă în cavitatea rectală, pentru a elibera medicamentul.

Compușii, conform invenției, pot fi administrați oral, la oameni, într-o doză în limitele de la 1 la 1OO mg/kg greutate corporală, în doze divizate. Un dozaj oral preferat este în limitele de la □, 1 la 10 mg/kg greutate corporală, în doze divizate.

O altă dozare orală, preferată, este în limitele de la 0,1 la 20 mg/kg greutate corporală, în doze divizate. Pentru terapie combinată cu analogi nucleozidici, o dozare preferată, este în limitele de la 0,1 la 20 mg/kg greutate corporală, pentru compușii acestei invenții administrați oral, în doze divizate și 50 mg la 5 g/kg greutate corporală, pentru analogii nucleozidici, administrați oral, în doze divizate. Se înțelege, totuși, că nivelul specific al dozei și frecvența dozării pentru orice pacient va varia și va depinde de diferiți factori care includ activitatea compusului specific utilizat, stabilitatea metabolică și durata de acțiune a compusului, precum și vârsta, greutatea, starea generală a sănătății, sexul, dieta, modul și timpul administrării, viteza de excreție, combinația medicamentului, severitatea stării particulare și terapia suferită de gazdă.

Se dă în continuare un exemplu de compoziție farmaceutică cu compusul L-743.726 (cu denumirea generică de efavirenz):

Material în capsule*	50 mg	75 mg	100 mg	150 mg	200 mg
efavirenz	50,0 mg	75,0 mg	100,0 mg	150,0 mg	200,0 mg
laurilsulfat de sodiu	2,50 mg	3,75 mg	5,0 mg	7,5 mg	10,0 mg
glicolat de amidon sodiu intragranular	40,0 mg	60,0 mg	80,0 mg	120,0 mg	160,0 mg
glicolat de amidon sodiu extragranular	5,00 mg	7,50 mg	10,0 mg	1 5,0 mg	20,0 mg
lactoză monohidrat	28,5 mg	42,75 mg	57,0 mg	85,5 mg	114,0 mg
stearat de magneziu	2,0 mg	4,0 mg	4,0 mg	6,0 mg	8,0 mg
greutate totală	128,0 mg	192,0 mg	256,0 mg	384,0 mg	512,0 mg

* în timpul procesului s-a folosit apă purificată.

RO 113641 Bl

Prezenta invenție se referă și la combinații de compuși inhibitori ai HIV reverstranscriptazei cu unul sau mai mulți agenți utilizați în tratamentul SIDA. De exemplu, compușii prezentei invenții, pot fi administrați în mod eficient, în perioadele de pre-expunere și/sau postexpunere, în combinații cu cantități eficiente de antivirali SIDA, imunomodulatori, agenți antiinfecțioși sau vaccinuri și anume:

antivirali :AL-721 (Ethigen, Los Angeles, CA, pentru ERC, PGL, HIV pozitiv, SIDA], Beta Interferon uman recombinant (Triton Biosciences, Almeda, CA, pentru SIDA, sarcomul lui Kaposi, ARC), Acemannan (Carrinton Labs, Irving TX, pentru ARC, vezi de asemenea, imunomodulatori), Cytovene (Syntex, pericol pentru vedere); Ganciclovir (Palo Alto, CA, retinite CMV periferice), d4T Didehydrodeoxythymidine (Bristol-Myers, New York, SIDA, ARC], ddl Dideoxyinosine (Bristol-Myers, New York, SIDA, ARC), EL 10 (Elan Corp, PLC, Gainesville, GA, infecție HIV, vezi de asemenea, imunomodulatori), Trisodium Phosphonoformate (Astra Pharm. Products, Inc., Westborough, MA, retinite CMV, infevție HIV, alte infecții, CMV), Dideoxycytidine, ddC (Hoffman-La Roche, Nutley, SIDA, ARC), Novapren (Novaferon Labs, Inc., Akron, OH, Diapren, Inc., Roseville, MN, marketer,inhibitor HIV), Secvență de ocatapeptidă - Peptide T - (Peninsula Labs, Belmont, CA; SIDA), Zidovudine; AZT (Burroughs Wellcome, Rsch. Triangle Park, NC; SIDA, ARC avansat, SIDA pediatric, sarcomul lui Kaposi, infecție asimptomatică HIV, maladii HIV mai puțin grave, implicație neurologică, în combinație cu terapii), Ansamycin LM 427 (Adria Laboratories, Dublin, Erbamont (Stamford, CT; ARC), Dextran Sulfate (Ueno Fine Chem. Ind. Ltd., Osaka, JP; SIDA, ARC, HIV pozitiv asimptomatic], Virazole Ribavirin (Viratek/ICN, Costa Mesa, CA; HIV asimptomatic pozitiv, LAS, ARC), Alpha Interferon (Burroughs Wellcome, Rsch. Triangle Park, NC; sarcomul lui Kaposi, HIV în combinație cu Retrovir), Acyclovir (Burroughs Wellcome; SIDA, ARC, HIV pozitiv asimptomatic, în combinație cu AZT), Anticorp care neutralizează pH-ul labil, anormal al Interferonului într-o coloană de imunoadsorbție (Advanced Biotherapy Concenpts, Rockville, MD; SIDA, ARC), L-697.661 (Merck, Rahway, NJ; SIDA, ARC, HIV pozitiv asimptomatic, în combinație cu AZT), L696.229 (Merck, Rahway, NJ; SIDA, ARC, HIV pozitiv asimptomatic, în combinație cu AZT), L-735.524 (Merck, Rahway, NJ; SIDA, ARC, HIV pozitiv asimptomatic, în combinație cu AZT);

imunomodulatori AS-101 (Wyeth-Ayerst Labs. Philadelphia, PA; SIDA), Bropirimine (Upjohn, Kalamazoo, Ml; SIDA avansat], Acemannan (Carrington Labs, Inc., Irving. TX; SIDA, ARC, vezi de asemenea antivirali], CL 246.738 (American Cyanamid, Pearl River, NY; Lederle Labs, Wayne, NJ; SIDA, sarcomul lui Kaposi), EL 10 (Elan Corp, PLC, Gainesville, GA; infecție HIV, vezi de asemenea, antivirali), Gamma Interferon (Genentech, S. San Francisco, CA; ARC, în combinație cu w/TNF (factor de necrozare al tumorii]), Factor de stimulare al coloniei macrofage de granulocite (Genetics Institute, Cambridge, MA, Sandoz (East Hanover, NJ; SIDA) Factor de stimulare al coloniei macrofage de granulocite (HoeschstRoussel, Sommerville, NJ, Immunex, Seattle, WA; SIDA), Factor de stimulare al coloniei macrofage de granulocite (Schering-Plough, Madison, NJ; SIDA, SIDA în combinație cu w/AZT], Imunostimulant de particulă de HIV (Rorer, Ft. Washington, PA; HIV seropozitiv], IL-2, lnterleukin-2 (Hoffman-La Roche, Nutley, NJ, Immunex; SIDA, ARC, HIV, în combinație cu w/AZT), Imunoglobulină, intravenos uman (Cutter Biological, Berkeley, CA; SIDA pediatric, în combinație cu w/AZT), IMREG-1 (Imreg, New Orleans, LA; SIDA, sarcomul lui Kaposi, ARC, PGL], IMREG-2 (Imreg, New Orleans, LA; SIDA, sarcomul lui Kaposi, ARC, PGL), Imuthiol, Ditiocarbamat de dietil (Merieux Institute, Miami, FL; SIDA, ARC], Alpha-2 Interferon (Schering Plough, Madison,

RO 113641 Bl

NJ; sarcomul lui Kaposi w/AZT, SIDA], Methionine-Enkephalin (TNI Pharmaceutical, Chicage, IL; SIDA, ARC), MTP-PE Muramyl-Tripeptide (Ciba-Geigy Corp., Summit, NJ; sarcomul lui Kaposi), Factor de stimulare al coloniei de granulocite (Amgen, Thousand Oaks, CA; SIDA, în combinație cu w/AZT), rCD4 Recombinant uman solubil CD4 (Genentech S. San Francisco, CA; SIDA, ARC), Recombinant uman solubil CD4 (Biogen, Cambridge, MA; SIDA, ARC), Interferon Alfa 2a Hoffman-La Roche, Nutley, NJ; sarcomul lui Kaposi, SIDA, ARC, în combinație cu w/AZT), SK&F106528 solubil T4 (Smith, Kline & french Laboratories, Philadelphia, PA; infecție HIV), Thymopentin (Immunobiology Research Institute, Annandale, NJ; infecție HIV), Factor de necroză a tumorii; TNF (Genentech, S. San Francisco, CA; ARC, în combinație cu gamma Interferon);

antiinfecțioase: Clindamycin cu primaquine Fluconazolec (Upjohn, Kalamazoo, Ml, Pfizer, New York, NY; PCP; meningite criptococice candidoze], Pastille Nystatin Pastille (Squibb Corp, Princeton, NJ; prevenirea candidozelor orale], Ornidyl Eflornithine (Merrell Dow, Cincinnati, OH; PCP), Pentamidine Isethionate (IM & IV] (LyphoMed, Rosemont, IL; tratament PCP], Piritrexim (Burroughs Wellcome, Rsch. Triangle Park, NC; tratament PCP), Pentamidine isethionate pentru inhalație (Fisons Corporation, Bedford, MA; profilaxie PCP), Spiramycin (RhonePoulenc Pharmaceuticals, Princeton, NJ; diaree criptosporidică), Intraconazole R51211 (Janssen Pharm., Piscataway, NJ; histoplasmoze; meningite criptococice], Trimetrexate (Warner-Lambert; PCP), alte medicamente; Erythropoietin recombiantă umană (Ortho Pharm. Corp., Raritan, NJ; anemie gravă asociată cu terapie AZT), Megestrol Acetate (Bristol-Myers; tratamentul anorexiei asociat cu SIDA], Total Enteral Nutrition (Norwich Eaton Pharmaceuticals, Norwich, NY; diaree și malabsorbție legată de SIDA).

Se înțelege că gama de combinații ale compușilor, conform invenției, cu antivirali SIDA, imunomodulatori, antiinfecțioase și vaccinuri nu se limitează la cele de mai sus, dar include, în principal, orice combinație cu orice compoziție farmaceutică, utilizată în tratamentul SIDA. De exemplu, un compus cu formula I sau II poate fi administrat în mod adecvat în combinație cu o nucleozidă analoagă, având activitate biologică cunoscută împotriva HIV reverstranscriptazei. Nucleozide analoage corespunzătoare sunt în general lanțuri terminale si includ AZT, ddC, ddl, D4T, HEPT și 3'-fluoro-2',3'-dideoxitimidină.

AZT este sintetizat prin procedeul lui J.P.Horwitz ș.a.., J.Org.Chem. 29, 2076 (1964); R.P.GIinski ș.a., J.Org. Chem.38, 4299 (1973); C.K.Chem. ș.a., Tetrahedron letters 29, 5349 (1988). Aplicațiile AZT ca medicament terapeutic în tratamentul SIDA sunt descrise în US 4724232.

Compusul ddC este sintetizat prin procedeul lui J.P.Horwitz ș.a.., J.Org. Chem. 32, 817 (1967); R. Marumoto, Chem.Bull. 22, 128 (1974); și T.S.Lin ș.a., J.Med.Chem. 30, 440 (1987).

D4T este sintetizat prin procedeul lui P.Herdewijn s.a., J.Med.Chem. 30, 1270(1987).

HEPT este sintetizat prin procedeul lui T. Miyasaka ș.a., J.Med.Chem. 32, 2507 (1989) și A. Rosowsky, J. Med.Chem. 24, 1177 (1981). Sintezele pentru ddC, ddl și AZT sunt, de asemenea, descrise în EP 0484071.

Compusul 3'-fluoro-2', 3’-dideoxitimidină este sintetizat prin procedeul lui

P. Herdewijn, J.Med.Chem. 30, 1270 (1987). Compusul L-735.524 este N((2R)-hidroxi-1 (S)-indanil]-2(R)-fenilmetil-4(S)-hidroxi-5-( 1 -(4-(3-p ir id i I meti I ]-2-[S)-N '(t-butilcarboxamido)-piperazinil)-pentanamida sau săruri acceptabile farmaceutic ale acestora.

L-697.661 sau 661' este 3-((4,7dicloro-1,3-benzoxazol-2-il]metil]amino]-5etil-6-metilpiridin-2(1 H)-onă; L-696.229 este 3-(2-(1,3-benzoxazol-2-il)-etil]-5-etilRO 113641 Bl

6-metilpiridin-2(1 H]-onă. Sintezele pentru

L-697.661 și L-696.229 sunt, de asemenea, descrise în EP 0484071 și EP

0462800.

Combinațiile preferate sunt trata- 5 mente simultane, intermitente sau alternante ale lui L-743.726, cu sau fără un inhibitor al HIV, proteazei. Un al treilea component facultativ în combinații este un inhibitor nucleozidă al HIV revers- io transcriptazei, precum AZT, ddC sau ddl.

Un inhibitor preferat al HIV proteazei este L-735.524. Alți imhibitori preferați ai HIV reverstranscriptazei 15 includ L-697.661. Aceste combinații pot avea efecte sinergetice asupra limitării răspândirii HIV. Combinațiile preferate includ următoarele : (1) L743.726 cu L-735.524 și facultativ 20 oricare dintre L-697.661, AZT, ddl sau ddC; (2) L-743.726 și oricare dintre L697.661, AZT, ddl sau ddC.

Sărurile acceptabile farmaceutic ale acestor combinații sunt de asemenea 25 incluse.

Testul reverstranscriptazei

Prin acest test se determină încorporarea monofosfatului de deoxiguanozină tritiat prin HIV reverstranscrip- 30 tază recombinantă (HIV RT_H) (sau alt RT] în cDNA precipitabil în acid, la valori Km ale dGTP și poli r(C]-oligo d(G)₁₂._1B. Inhibitorii prezentei invenții inhibă această încorporare. 35

Testările au fost conduse în 55 mM Tris (pH 8,2)-30 mM Kcl-30 mM MgCI₂-1mM ditiotreitol-2Opg de rC:dG₁₂._1B [Pharmacia) per ml - 8 mM [³H]dGTP (New England Nuclear) - 40 0,01% Triton X-10O- 50 mM etilenglicolbis(B-aminoetileter)-acid Ν,Ν,Ν’,Ν’-tetraacetic (EGTA)- 1 mg albumină din ser de bovină per ml. După 60 min de incubare la 37°C, materialul precipitabil în acid se 45 colectează într-un filtru de fibră de sticlă, utilizând un colector semiautomat de celule. Extractul de celule bacteriene conținând RT se diluează, până în domeniul linear al testului și se determină activitatea în prezența și în absența inhibitorului. Heterodimerul HIV-1 RT purificat, produs în E. coli servește, de asemenea, drept control. Rezultatele sunt exprimate sub formă de concentrație de inhibitor care produce o inhibare de 50% (IC₅₀ în greutate), în nanomoli per litru.

Pentru testul dublu mutant (dm), se utilizează A 17 RT în determinări. A 17 RT este rezistent la diferite aminopiridone, așa cum este descris în J.H. Nunberg ș.a., J. Virol. 65, 4887 (1991). Rezultatele sunt date ca IC_5Q dm în nanomoli/litru.

Testul propagării în celule

Inhibarea propagării HIV în cultură de celule se măsoară conform testului descris de J.H. Numberg ș.a., J.Virol. 65, 4887 (1991). în acest test, celule MT-4T-limfoide sunt infectate cu HIV-1 (tipul sălbatic, fără altă indicație] prin utilizarea unui inoculum prestabilit și culturile sunt incubate timp de 24 h. în acest moment 1% din celule au fost pozitive prin imunofluorescență indirectă. Celulele sunt apoi spălate și distribuite pe placă de cultură cu 96 de adâncituri.

Diluții duble, în serie, de inhibitori, se adaugă în adâncituri și culturile se continuă încă 9 zile. La a 4-a zi după infectare, 100% din celulele din culturile de control au fost infectate. Acumularea HIV-1 p24 a fost corelată direct cu propagarea virusului. Concentrația de inhibare a culturii de celule a fost definită drept concentrația de inhibitor în nanomoli/litru, care reduce propagarea infecției la cel puțin 95% sau CIC_g5.

Rezultatele pentru compusul 37.2 A. Testul reverstranscriptazei și Testul de propagare în celule

	WT	K103N*	Y181C	DM	RT-2
IC50 (μΜ)	0,002	0,030	0,008	0,085	80,2
CIC95	<0,006 (N=2)	0,100	<0,025	0,400	N.D.

RO 113641 Bl

B. Date farmacologice

Rhesus : 1 mgkg'¹ i.v., t₁₂ =210 min mgkg’¹ p. o. (Methocel) :

C_max = 4,4 pM (2 h OB = 0,55

C_24h= 1,1 pM (A. U. C.)

Legarea proteinei 98,0% Plasmă umanp normală (Metoda HPLC] * Mutanții K103N și Y181C sunt reverstranscriptaze ale HIV

-1 - rezistent la medicamente. DM este dublu mutant așa cum s-a menționat în testul reverstranscriptazei. RT-2 este reverstranscriptaza HIV-2.

Efecte sinergetice

A. Prepararea unei suspensii de celulă ΜΤ-4-infectată cu HIV

Celulele MT sunt infectate în ziua O la o concentrație de 250.000 pe ml cu o diluare 1:1000 a stocului III b de tulpină de HIV-1 (final 125 pg.p24/ml] suficient pentru a da 1 % celule infectate în ziua 1 și 25 - 100% în ziua 4. Celulele au fost infectate și s-au dezvoltat în următorul mediu : RPMI 1640 (Whittaker Bio Products], 10% de ser fetal inactivat de bovine, 4 mM glutamină (Gibco Labs) și 1:100 Penicilină - Streptomicină (Gibco Labs).

Amestecul a fost incubat peste noapte la 37°C, în atmosferă de C0₂5%.

B. Tratament cu inhibitori

S-au preparat concentrații în domeniul monomolar de combinații perechi (ca în Tabelul S). în ziua 1, s-au adăugat părți alicote de 125 pl de inhibitori la volume egale de celule MT-4 infectate cu HIV (50 000 per adâncitură) pe o placă de microtitrare cu 96 de adâncituri de cultură de celulă. Incubarea se continuă încă 3 zile la 37°C în atmosferă de C0₂5%.

C. Măsurători de propagare a virusului

Utilizând un dispozitiv de pipetare cu canale multiple, celulele depuse sunt resuspendate în 125 pl și colectate pe o placă de microtitrare separată. Supernatantul a fost tratat pentru antigenul

HIV p24.

Concentrația de antigen HIV p24 a fost măsurată printr-un imunotest de enzimă descris în în continuare. Părți alicote de antigen P24 destinate măsurătorilor, au fost adăugate în microadânciturile acoperite cu un anticorp monoclonat specific pentru miezul antigenului HIV.

Microadânciturile au fost spălate în acest moment în alte etape adecvate care urmează.

A fost adăugat apoi anticorp specific Biotinilat - HIV, urmată de peroxidaza de hrean strepavidin - conjugată. O reacție de culoare apare la adăugarea la substrat a apei oxigenate și a tetrametilbenzidinei. Intensitatea colorării este proporțională cu concentrația antiqenului HIV p24.

Calcularea gradului de sinergism

Combinații perechi de inhibitori prezintă o inhibare a virusului ridicată, în mod marcant, a propagării virusului, comparativ cu fiecare inhibitor luat individual sau comaprativ cu inhibarea cumulativă a fiecărui inhibitor. Astfel, de exemplu, combinația pereche a lui 726 cu SZT s-a găsit că prezintă o inhibare a propagării virusului, în mod maecant mai ridicată în comparație cu 726 singur sau AZT singur sau în comparație cu suma inhibării provocate de 726 și AZT.

Aceste date au fost prelucrate după cum urmează:

Raportul dintre concentrațiile inhibitorii (FIC) s-a calculat conform metodei lui Elion ș.a., J.Biol.Chem. 208, 477 (1954). Suma minimă a valorilor FIC, care reprezintă maximum de sinergism, a fost determinată pentru diferite combinații perechi. în mod alternativ, s-a calculat o medie FIC care reprezintă media sinergetică (vezi tabelul S). Aceste rezultate indică un sinergism substanțial în inhibarea propagării virusului. Cel mai mic număr, cel mai mare sinergism.

RO 113641 Bl

Tabelul S

Combinații perechi*	Sinergism mediu
726 + ddl	0,81
726 + AZT	0,62
726 + 524	□,65
726 + 524 + AZT

524 este L-735.524. Alți compuși sunt, de asemenea, definiți de mai sus.

Claims

Revendicări

1, caracterizați prin aceea că, sunt:

1. Derivați de benzoxazinonă, caracterizați prin aceea că, prezintă structura chimică corespunzătoare formulei generale I :

în care în care X reprezintă un atom de halogen, X¹ reprezintă trihalometil sau pentahaloetil; Z reprezintă 0; R reprezintă (a) alchil C.|-C_B, nesubstituit sau substituit cu A, în care A este halogen, cicloal- 3o chil C₃-C₆, ciano, hidroxi, alcoxi C-j-C^ alchinil (C₂-C₄)alcoxi (C.|-C₄), ariloxi, alchil (C^CJcarbonil, nitro, dialchilfC-j-CJamino, alchilfC-j-CJaminoalchiltt^-Cy, un heterociclu sau ariltio; (b) alchenil C₂-C₄, 35 nesubstituit sau substituit cu (i) A sau (ii] arii, nesubstituit sau substituit cu A; (c) alchinil C₂-C₅ nesubstituit sau substituit cu (i] A sau (ii) arii, nesubstituit sau substituit cu A; sau (d) cicloalchil C₃-C₄, 40 nesubstituit sau substituit cu (i) A sau (ii) arii, nesubstituit sau substituit cu A; sau sărurile acestora acceptabile farmaceutic.

2. Derivați, conform revendicării 45

3. Procedeu de preparare a compușilor cu formula generală I, cum ar fi (-]-6-cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2onă, caracterizat prin aceea că, se condensează (±)-6-cloro-4-ciclopropiletinil4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2-ona cu un agent de rezoluție cum ar fi (-)-clorura de camfanil, într-un solvent inert, urmată de separarea diastereomerilor rezultați și îndepărtarea agentului de rezoluție.

4. Compoziție farmaceutică pentru inhibarea HIV reverstranscriptazei, caracterizată prin aceea că, conține o cantitate eficientă dintr-un compus cu formula I și un purtător acceptabil farmaceutic.

5. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 4, pentru prevenirea sau tratarea infecțiilor cu HIV sau pentru tratarea SIDA sau ARC, caracterizată prin aceea că, conține o cantitate eficientă dintr-un compus cu formula I și un purtător acceptabil farmaceutic.

6. Combinație, caracterizată prin aceea că, conține un compus cu formula I și un analog de nucleozidă cu activitate biologică față de HIV reverstranscriptază.

(-)-6-cloro-4-ciclopropiletinil-4trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-onă, (-)-6-cloro-4-feniletinil-4-trifluoro- 50 metil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazin-2onă,

10 (+/-)-6-cloro-4-(2-cianofenil)etinil-4(1,1,1-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1benzoxazin-2-onă, (+/-)-4-(1-cloro-1,1-difluorometil)4-(2-feniletinil)-6-cloro-1,4-dihidro-2H-3,1benzoxazin-2-onă, (+/-]4-(2-[dimetilaminometil]etinil)4-trifluorometil-6-cloro-1,4-dihidro-2H3,1-benzoxazin-2-onă sau o sare a acestora acceptabilă farmaceutic.

7. Combinație, sinergetică a corn pușilor antivirali SIDA, caracterizată

RO 113641 Bl prin aceea că, conține un compus cu și, eventual, unul sau mai mulți inhibitori HIV, aleși din grupa formată din : zidovudin sau AZT; dideoxicitidin sau ddC, dideoxinozin sau ddl, didehidrodeoxitimi- 15 dină sau d4T și lamivudin sau 3TC.

8. Combinație sinergetică a compușilor antivirali SIDA, caracterizată prin aceea că, conține compusul cu for- și unul sau mai mulți inhibitori HIV, aleși din grupa formată din : zidovudin sau

AZT; dideoxicitidin sau ddC, dideoxinozin sau ddl, didehidrodeoxitimidină sau d4T și lamivudin sau 3TC.

9. Metodă de inhibare a HIV reverștranscriptazei sau pentru prevenirea și tratarea infectării cu HIV și a situațiilor patologice care urmează infectării, precum SIDA, caracterizată prin aceea că, se administrează la un mamifer o cantitate eficientă dintr-un compus cu formula I sau o compoziție farmaceutică care cuprinde un purtător farmaceutic și o cantitate eficientă terapeutic dintr-un compus cu formula I, pe cale orală, parenterală, prin inhalare sau rectal, în formulări unitare de dozare, care conțin compușii cu formula I în limitele de la 1 la 1OD mg/kg greutate corporală, de preferință, de la 0,1 la 10 mg/kg greutate corporală.