PL176679B1

PL176679B1 - Kombinacja związków farmakologicznie czynnych do zapobiegania infekcji HIV lub leczenia infekcji HIV lub leczenia AIDS albo ARC

Info

Publication number: PL176679B1
Application number: PL93325950A
Authority: PL
Inventors: Steven D. Young; Linda S. Payne; Susan F. Britcher; Lekhanh O. Tran; William C. Lumma Jr.
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1992-08-07
Filing date: 1993-08-06
Publication date: 1999-07-30
Also published as: DZ1707A1; GR3034754T3; JPH06184124A; YU49439B; PL175615B1; PL307348A1; UA42699C2; NL300032I1; ES2151897T3; NO950424D0; FI950508A0; FI950508A; EP0582455B1; TW382014B; DE122008000034I1; AU670300B2; LU91446I2; YU53093A; CN1107505C; NO304886B1

Abstract

1. Kombinacja zwiazków farmakologicznie czynnych do zapobiegania infekcji HIV lub leczenia infekcji HIV, lub leczenia AIDS albo ARC, znamienna tym, ze stanowi kombinacje nowego zwiazku o wzorze I : w którym: X oznacza atom chlorowca, X oznacza grupe trichlorowcometylowa lub pentachlo- rowcoetylowa; Z oznacza atom tlenu; R oznacza: (a) grupe C1-8 alkilowa, niepodstawiona lub podsta- wiona przez A, a A oznacza atom chlorowca, grupe C 3-6 cykloalkilowa, CN, hydroksylowa, C1 -4 alkoksylowa, C 2-4 alkinylo-C1 - 4 alkoksylowa, aryloksylowa, C1 -4 alkilokarbonylowa, nitrowa, di-(C1 -2 alkilo) aminowa, C1 -4 alkiloamino-C1 -2 alkilowa, heterocykliczna lub arylotio; (b) grupe C 2-4 alkenylowa, niepodsta- wiona lub podstawiona przez: (i) A, albo (ii) grupa arylowa, niepodstawiona lub podstawiona przez A; (C) grupe C 2-5 alkinylowa, niepodstawiona lub podstawiona przez: (i) A, albo (ii) grupa arylowa, niepodstawiona lub podstawiona przez A; albo (d) grupe C 3-4 cykloalkilowa, niepodstawiona lub podsta- wiona przez: (i) A, albo (ii) grupa arylowa, niepodstawiona lub podstawiona A; lub jego dopuszczalnej farmaceutycznie soli, lub o wzorze II: w którym: X oznacza atom chlorowca, X1 oznacza grupe trichlorowcometylowa, pentachlorowcoetylowa, C 2-5 alkilowa, C 2-5 alkinylowa, C 3-5 cykloalkilowa lub arylowa; Z oznacza atom tlenu lub siarki; R oznacza: (a) grupe C1-8 alkilowa, niepodstawiona lub podstawiona przez A, a A oznacza atom chlorowca, grupe C3-6 cykloalkilowa, CN, hydroksylowa, C1-4 alkoksylowa, C 2-4 alkinylo-C1 - 4 alkoksylowa, aryloksylowa, C1 -4 alkilokarbonylowa, nitrowa, di(C1 -2 alkilo)aminowa, C1 -4 alkiloamino-C1 -2 alkilowa, heterocykliczna lub arylotio; (b) grupe C 2-4 alkenylowa, niepodstawio- na lub podstawiona przez: (i) A, albo (ii) grupa arylowa, niepodstawiona lub podstawiona A; (c) grupe C 2-5 alkinylowa niepodstawiona lub podstawiona przez: (i) A, albo (ii) grupa arylowa, niepodstawiona lub podstawiona A; albo (d) grupe C 3-4 cykloalkilowa, niepodstawiona lub podstawiona przez: (i) A, albo (ii) grupa arylowa, niepodstawiona lub podstawiona A; lub farmaceutycznie dopuszczalnej soli zwiazku o wzorze I lub II, z analogiem nukleozydowym bedacym inhibitorem odwrotnej transkryptazy HIV . PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kombinacja związków farmakologicznie czynnych do zapobiegania infekcji HIV lub leczenia infekcji HIV, lub leczenia AIDS albo ARC, stanowiąca kombinację nowego związku, pochodnej benzoksazynonu o działaniu hamującym wirusa HIV, oraz nukleozydowego inhibitora odwrotnej transkryptazy HTV. Kombinacja znajduje zastosowanie w inhibitowaniu odwrotnej transkryptazy HIV (i jej odpornych odmian), w zapobieganiu infekcji HIV, w leczeniu infekqi HIV i w leczeniu AidS i/lub ARC.

Retrowirus określany jako ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) jest czynnikiem etiologicznym złożonej choroby obejmującej stopniowy rozkład układu odpornościowego (zespołu nabytego niedoboru odporności, AIDS) oraz zwyrodnieniem ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. Wirus ten był poprzednio określany jako LAV, HTLV-III lub ARV. Wspólną cechą replikacji retrowirusówjest odwrotna transkrypcja genomu RNA przez wirusowo kodowaną odwrotną transkryptazę, prowadząca do powstania kopii DNA sekwencji HTV; jest to niezbędny etap replikami wirusa. Wiadomo, że pewne związki, np. azydotymidyna (czyli AZT), są inhibitorami odwrotnej transkryptazy i stanowią skuteczne środki w leczeniu AIDS i podobnych chorób.

Sekwencjonowanie nukleotydów HIV wykazało obecność genu pol w jednej z otwartych ramek odczytu [Ratner L. i inni, Nature, 313, 2ΊΊ (1985)]. Homologia sekwencji aminokwasów dostarcza potwierdzenia, że sekwenga pol koduje odwrotną transkryptazę, endonukleazę i proteazę HTV [Toh H. i inni, EMBO J. 4,126Ί (1985); Power M.D. i inni, Science, 231,156Ί (1986); Pearl.L.H. i inni, Nature 32S^, 351 (198Ί)].

Przedmiotem wynalazku jest kombinaq'a związków farmakologicznie czynnych do zapobiegania infekcji HIV lub leczenia infekqi HTV, lub leczenia AIDS albo ARC, stanowiąca kombinagę nowego związku o wzorze I:

X

I

176 679 w którym:

X oznacza atom chlorowca,

X^I oznacza grupę trichlorowcometylową lub pentachlorowcoetylową;

Z oznacza atom tlenu;

R oznacza:

(a) grupę Ci-8 alkilową, niepodstawioną lub podstawioną przez A, a A oznacza atom chlorowca, grupę C3-6 cykloalkilową, CN, hydroksylową, Ci^ alkoksylową, C24 alkinylo-C_w alkoksylową, aryloksylową, C1-4 alkilokarbonylową, nitrową, di(Ci-2 alkilo)aminową, C1-4 alkiloamino-C1-2 alkilową, heterocykliczną lub arylotio;

(b) grupę C24 alkenylową,niepodstawioną lub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną przez A;

(c) grupę C2-5 alkinylową, niepodstawioną lub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną przez A; albo (d) grupę C3-4 cykloalkilową, niepodstawioną lub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną A; lub jego dopuszczalnej farmaceutycznie soli, lub związku o wzorze II:

w którym:

X oznacza atom chlorowca, χΐ oznacza grupę trichlorowcometylową, pentachlorowcoetylową, C2-5 alkilową, C2-5 alkinylową, C3-5 cykloalkilową lub arylową;

Z oznacza atom tlenu lub siarki;

R oznacza:

(a) grupę Ci- alkilową, niepodstawioną lub podstawioną przez A, a A oznacza atom chlorowca, grupę C3-6 cykloalkilową, CN, hydroksylową, C1-4 alkoksylową, C2-4 alkinylo-Ci-4 alkoksylową, aryloksylową, C1-4 alkilokarbonylową, nitrową, di(Ci-2 alkilo)aminową, C1-4 alkiloamino-Ci-2 alkilową, heterocykliczną lub arylotio;

(b) grupę C2-4 alkenylową, niepodstawioną lub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną A;

(c) grupę C2-5 alkinylową, niepodstawioną lub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną A; albo (d) grupę C3-4 cykloalkilową, niepodstawioną lub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną A; lub farmaceutycznie dopuszczalnej soli związku o wzorze I lub II, z analogiem nukleozydowym będącym inhibitorem odwrotnej transkryptazy HTV.

Korzystnie kombinacja zawiera jako związek o wzorze I lub II (-)-6-chloro-4-cyklopropyloetynylo-4-trifluorometylo-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazyn-2-on.

Korzystnie kombinacja zawiera analog nukleozydowy, wybrany z grupy składającej się z azydotymidyny (AZT), dideoksycytydyny (ddC), dideoksyinozyny (ddl), didehydrodeoΠ6679 ksytymidyny (d4T), alfa-bicyklo[2.2.1]hept-5-en-2-yl<r-clfc-fenylo-1-piperydynopropanolu (HEPT) i 3'-fluoro-2',3'-dideoksytymidyny oraz ich dopuszczalnych farmaceutycznie soli.

Kombinacja według wynalazku zapewnia znaczne zmniejszenie poziomu RNA HTV we krwi w porównaniu z pacjentami, którym podaje się wyłącznie nuŁdeozydowy inhibitor odwrotnej transkryptazy HTV. Efekt tenjest długotrwały. Stosowanie kombinacji zabezpiecza przed rozwojem oporności na pojedynczo stosowane leki i zwiększa długotrwałość pozytywnych skutków leczenia. Związki o wzorze I lub II hamują powstawanie mutantów substytucyjnych RNA wirusa. Ilość związku o wzorze I lub wzorze II w kombinacji wynosi 0,1 - 2θ mg na 50 - 5000 mg nukleozydowego inhibitora odwrotnej transkryptazy HTV.

Związki o wzorze I zdefiniowanym powyżej są związkami nowymi, dotychczas nieopisanymi w literaturze. Związki te wykazują czynność hamowania odwrotnej transkryptazy HIV.

Do korzystnych związków należą związki 37.2, 4, 2, 5 i 24, podane poniżej w tabeli I, przy czym kolejne związki są coraz mniej korzystne. Struktura związków jest następująca.

Związek 37.2

(-)-6-chloro-4-cyklzpropyloetynyyo-4-trifluorometyyo-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazyn-2-on, związek najkorzystniejszy;

Związek 4:

(-)-6-zUzrz-4-fenylzetynylz-4-trifluorometylz-1,4-dihydr(r-2H-3,1-benzokscayn-2-zn; Związek 2:

(+/-)

(+/-)-6-chloro-4-(2-cyjanofenylo)etynylo-4-(1,1,1-trifluorometyyo)-1,4-dihydro-2H3,1-benzzksczyn-2-zn;

176 679

Związek 5:

(+/-)

(+/-)-4-(1-chloro-1,1-difluorometylo)-4-(2-fenyloetynylo)-6-chloro-1,4-dihydro

2H-3,1-benzoksazyn-2-on;

Związek 24 (+/-)

(+/-)-4-(2-[dmaietyloaminiomietylo]eyniylo)-4-trifluorometylo-6-chloro-1,4-dihydro

2H-3,1-benzoksazyn-2-on;

oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Konkretne związki o wzorze I zilustrowano poniżej w tabelach I i II.

176 679

lO 09 -X O 1—1 O		6M	> 200	12
o m I O M	§ ϊ—1	O CO St*	37 000	69	357 nM	17 000	3 460
I5 5 O io * υ M	co to	25	2900	8, 6 !	CM rH	1 700	91
temp. topn. (⁰C)	186-187,5 1 i_	245-246	178-179	ε	154-155	225-226	160-161
x1	C tó o 1	CF O 1	C tó O 1	C tó O 1	-—1 u CM tó O 1	C tó u 1	-C tó o 1
tó	tn X O o -K	CN	T -K	T	T -X	-K
Związek	ϊ—1	CM	3 ( + )	1	5	W	7

* podano w nM czyli nanomolach/litr

17(6679

Tabela I-ciąg dalszy

C* 9 * O 1—1 O				O VO	LD Cs]
o C -* o W	o f co	O rH <N	O 9 OT	o te- CM	o OT OJ	S G OT o i—M	o o o OT OT	OT O r~1 Λ
C O OT * O H	n	ot OT	CO x—}	co r*4	OJ r—1	3950 —M	O OT r—1	9 04
O o ♦ β ft o 4-1 i <u 4-1	<3* co łH i cn co T—\|	τ—1 n<-1 1 co <x> r—ł	o OT x—i 1 9 OT i—i	OT OT i—1 1 OT OT τ—1	r- <3· r*4 1 Γ OT t~1	θ' OT <—1	r** r-ł 1 r- t-H	OT OT r--1 1 OT OT <—1
t“4 X	co C U	rn fci O l	OT Cm O 1	OT Cm O 1	OT Cm O 1	OT Cm O 1	OT Cm O 1	OT Cm O 1
(4	Φ II -K	Θ -K	II -łc	*	T -K	(Ώ ac o CJ o X o X \₊o ^ł cn OT O	l—1 υ *	*
Związek	8	9	O rH	t—1 rH	1 + CM t—ł	cn τ—1	r“ł	OT

Tabela I-ciąg dalszy

to σ -χ O 1—1 U	78 000		O lO
o to -X O u	o o σ> i-l	>3 o 1—t 15	£ c o lO Ό CM	o o o to CM	LO O χ—1	O o o lO CM i—1	o LO to co	s fi o o o o co
-U o tO -X o M	o o σι χ-4	O o CO CM	LO i—l	CM	Lf) rH	o to (X)	LO to	A o o co rH
1 I temp. topn. (°C)	230-240	132-133	148-149	t co 1-1 1 to co i—1	162-164	145-146	150-151	131-132
i—I \ X	co Cu D 1	co li O 1	co Cm O 1	co Cu o 1	co Cm O 1	co Cm O 1		co Cm U 1
Cd	°=< ZJ o < -K	<	i	*	ę	w * 1	(0] z	J
Związek	kO i—l	r- ιΉ	00 i—1	σι t—1	o CM	i—1 CM	CM CM	m CM

1766Ί9

Tabela I - ciąg dalszy

176 679

Tabela II

tC σι * O M U							100 nM
C Irt * O —m	>300 000nM	>300 OOOnM	29 000	>300 000nM			>300 OOOnM	>305 000nM	Γ 1 >300 OOOnM
4-> 3 o Lf) -* O wt	LO n t-1	510	00	1400 nM	1450	610	15 nM	560	41
temp., topn. (°C)	177-179	135-136	125-126		218-220	187-188	206-207	147-148	186-187
—1 X	Y	ś		q		Y¹	9	-fc	Y^J
R	Y	Y	Y	Y	*/		Y	>	y
Związek	38	39	40	i—1	42	1 ⁴³	tT tr	45	kO tr

Związki o wzorze I mogą zawierać centra asymetrii i mogą występować, z wyjątkiem konkretnie zaznaczonych, być w postaci racematów, mieszanin racemicznych lub poszczególnych diastereoizomerów albo enaq'omerów, przy czym wszystkie formy izomeryczne objęte są zakresem wynalazku. Oznaczenie (+/-) obejmuje izomery optyczne (+), izomery optyczne (-) lub ich mieszaniny.

Jeśli dowolna zmienna (np. R) występuje więcej niż raz w dowolnym podstawniku lub we wzorze I, to jej określenie w każdym przypadku jest niezależne od jej określenia w innych przypadkach. Ponadto kombinacje podstawników i/lub zmiennych są dopuszczalne tylko wtedy, gdy związki zawierające takie kombinagę są trwałe.

W użytym znaczeniu, z wyjątkiem zaznaczonych przypadków, alkil oznacza nasyconą alifatyczną grupę węglowodorową o rozgałęzionym lub prostym łańcuchu; alkenyl oznacza grupę alkilową o rozgałęzionym lub prostym łańcuchu, zawierającą co najmniej jedno wiązanie podwójne węgiel-węgiel; alkinyl oznacza grupę alkilową o rozgałęzionym lub prostym łańcuchu, zawierającą co najmniej jedno wiązanie potrójne węgiel-węgiel. W użytym znaczeniu atom chlorowca lub chlorowiec oznacza atom fluoru, chloru, bromu lub jodu.

W użytym znaczeniu, z wyjątkiem zaznaczonych przypadków, aryl oznacza grupę fenylową, naftylową, tetrahydronaftylową, bifenylową, fenantrylową, antrylową lub acenaftylową.

W użytym znaczeniu, z wyjątkiem zaznaczonych przypadków, określenie heterocykl lub heterocykliczny oznacza trwały 5-7 członowy monocyldiczny lub trwały 8-11 członowy bicykliczny układ heterocykliczny, nasycony, częściowo nienasycony lub nienasycony, który zawiera atomy węgla i 1-4 heteroatomy wybrane z grupy obejmującej atomy azotu, tlenu i siarki i w którym heteroatomy azotu i siarki mogą być ewentualnie utlenione, obejmujący dowolną grupę bicykliczną, w której dowolny z wyżej określonych pierścieni heterocyklicznych jest skondensowany z pierścieniem benzenowym. Pierścień heterocykliczny może być połączony poprzez dowolny heteroatom lub atom węgla w sposób zapewniający powstanie trwałej struktury. Do przykładowych grup heterocyklicznych należy piperydynyl, piperazynyl, 2-oksopiperazynyl, 2-oksopiperydynyl, 2oksopirolidynyl, 2-oksoazepinyl, azepinyl, pirolil, 4-piperydonyl, pirolidynyl, pirazolil, pirazolidynyl, imidazolil, imidazolinyl, pirydyl, pirazynyl, pirymidynyl, pirydazynyl, oksazolil, oksazolidynyl, izoksazolil, izoksazolidynyl, morfolinyl, tiazolil, tiazolidynyl, izotiazolil, chinuklidynyl, izotiazolidynyl, indolil, chinolinyl, izochinoliny!, benzimidazolil, tiadiazolil, benzopiranyl, benzotiazolil, benzoksazolil, furyl, tetrahydrofuryl, benzofuranyl, tetrahydropiranyl, tienyl, benzotienyl, tiamorfolinyl, sulfotlenek tiamorfolinylu, sulfon tiamorfolinylu i oksadiazolil.

Związki o wzorze I wytwarzać można następującymi sposobami.

Schemat I chlorek metylenu wodny roztwór Na^CO^

NH ,0 'F'

1. 2 eq. n-BuLi/THF/O

2. CF₃COOEt/0°C

3. 3N HCl/wrzenie

R-MgBr

-->

THF/O° do temperatury pokojowej

1,1’-karbonylodiimidazol .................>

THF/50°C

Przy wytwarzaniu benzoksazynonów o wzorze I ogólny sposób obejmuje zazwyczaj cyklizację przy pierścieniu benzenowym jako końcowy etap. Patrz schemat I. Grupę aminową w p-chloroanilinie najpierw blokuje się, np. chlorkiem piwaloilu, uzyskując 2. Do mniej korzystnych grup blokujących grupę aminową należy grupa tetr-butoksykarbonylowa, octanowa lub izowaleroilowa. Następnie 2 poddaje się reakcji z około 2 równoważnikami alkilolitu, korzystnie n-butylolitu. W tym etapie metalowania inne związki metaloorganiczne nie są przydatne. W wyniku przeprowadzonej następnie reakcji z CFaCOOEt, po jej przerwaniu otrzymuje się 3.

Trzeciorzędowy karbinol 4 uzyskuje się w wyniku addycji Grignarda do ketonu 3. Odczynnik Grignarda musi być solą dwuwartościowego kationu, np. Mg⁺⁺ lub Zn⁺⁺.

Do odpowiednich rozpuszczalników należy, ale nie wyłącznie, THF (tetrahydrofuran) lub eter. Reakcję można przeprowadzić w szerokim zakresie temperatur, od około 0°C do temperatury zbliżonej do temperatury pokojowej.

Zamknięcie pierścienia prowadzące do związków 5 według wynalazku przeprowadza się stosując środek kondensujący taki jak 1,1'-karbonylodiimidazol, fosgen, węglan dimetylu, węglan difenylu lub węglan di(p-nitrofenylu). Cyklizację można przeprowadzić stosując dowolny z tych związków, a także wiele innych związków.

Konkretny przykład rozwiązania według schematu I podano na schemacie IA. Przedstawiono na nim syntezę L-741,211, będącego racematem związku 37.2, opisaną dokładniej w przykładzie 6.

Schemat IA

(60%)

Ν'

H (L-742,211)

Schemat Π

Na schemacie Π przedstawiono sposób wytwarzania podstawionych pochodnych zawierających grupę acetylenową w pozycji 4 układu benzoksazynowego. Przykładowo związek 6 metalizowano, po czym dodano sól cynku. W reakcji Heck’a zastosowano jako katalizator tetrakis(trifenylofosfino)-pallad(0) skompleksowany z Cul, otrzymując 7.

Schemat ΠΙ

Na schemacie ΙΠ przedstawiono podstawienie grupy 4-acetyłenowej związkiem heterocyklicznym zawierającym atom azotu. Reakcja Mannicha obejmuje reakcję kondensacji formaldehydu ze związkiem heterocyklicznym, np. z pirolidyną. Podstawienie końcowego atomu węgla przebiega w obecności Cul jako katalizatora.

Π66Ί9

1Ί

Schemat IV

(+/-)

Et₃N/4-DMAP/CH₂Cl₂

ο

1. Chromatografia na żelu krzemionkowym

2. K₂C0₃/H₂0/2-propanol

Na schemacie IV przedstawiono rozdzielanie izomerów optycznych związków o wzorze I i o wzorze II. W tym przykładzie jako związek rozdzielający zastosowano kwas (-)-kamfanowy. Zastosować można wiele innych związków rozdzielających takich jak chlorek kwasu O-metylomigdałowego lub odczynnik Moshera. Rozdzielanie takich izomerów jest znane specjalistom.

Na schemacie IVA przedstawiono w szczególności rozdzielanie ΕΊ41,211 przy wydzielaniu L-743,Ί26. Patrz schemat IVA i przykład 6.

176 679

Schemat IVA

O

Chlorek (-)-kamfanylu 4-DMAP/Et₃H/CHCl₃

Krystalizacja z heksanu (odzysk fi

n-BuOH/lH HC1/6O°C li

L-743,726

Związek 37.2

Schemat V

(42%)

Cylklo;p:rt^j^;^ll^:^(^^tylen wytworzono w sposób przedstawiony na schemacie V, zgodnie z opublikowanymi procedurami, np. C.E. Hudson i inni, J. Am. Chem. Soc. 94,1158 (1972) oraz W. Schoberth i inni, Synthesis, 703 (1972).

Analogi nukleozydowe azydotymidyna (AZT), dideoksycytydyna (ddC), dideoksyinozyna (ddI) didehydrodeoksytymidyna (d4T), af-bicyklo[2.2.1.]hept-5-en-2-yl<>af-fenylo-1-piperydynopropanol (HEPT) i 3'-fluoro-2',3'-dideoksytymidyna są znanymi związkami o znanej czynności biologicznej przeciwko odwrotnej' transktyptazie HIV. Sposoby ich wytwarzania są znane i opisane w literaturze.

AZT wytwarza się sposobami opisanymi przez J.P. Horwitza i innych, J. Org. Chem. 29,2076 (1964); R.P. Glińskiego i innych, J. Org. Chem. 38,4299 (1973); C.K. Chu i innych, Tetrahedron Letters 29, 5349 (1988). Zastosowanie AZT jako środka terapeutycznego w leczeniu HIV ujawniono w opisie patentowym USA nr 4 724 232.

176 679

Związek ddC wytwarza się sposobami opisanymi przez J.P. Horwitza i innych, J. Org. Chem. 32, 817 (1967); R. Muramoto, Chem. Pharm. Buli. 22,128 (1974); oraz T.-S. 1 .ina i innych, J. Med. Chem. 30,440 (1987).

D4T wytwarza się sposobami opisanymi przez P. Herdewijna i innych, J. Med. Chem 30,1270 (1987).

HEPT wytwarza się sposobami opisanymi przez T. Miyasaka'ę i innych J. Med. Chem. 32,2507 (1989); i A. Rosowsky'ego, J. Med. Chem. 24,1177 (1981). Syntezy ddC, ddl i AZT opisano również w EPO 484071.

3'-fluoro-2'-3'-didezoksytymidynę wytwarza się sposobami opisanymi przez P. Herdewijna i innych, J. Med. Chem. 30,1270 (1987).

Kombinacje według wynalazku są przydatne w inhibitowaniu odwrotnej transkryptazy HIV, w zapobieganiu lub leczeniu infekcji ludzkim wirusem niedoboru odporności (HTV) oraz w leczeniu wynikłych z tego stanów patologicznych takich jak AIDS. Określenia leczenie AIDS albo zapobieganie łub leczenie infekcji HTV obejmują, ale nie wyłącznie, leczenie wielu różnych stanów infekcji HIV.· AIDS, ARC (zespół spokrewniony z AIDS), obydwa w postaci objawowej i bezobjawowej, a także rzeczywiste i potencjalne narażenie na HIV. Tak np. kombinacje według wynalazku są przydatne w leczeniu infekcji HIV po podejrzeniu o wcześniejsze narażenie na HIV np. w wyniku transfuzji krwi, wymiany płynów ustrojowych, ukąszeń, przypadkowego ukłucia igłą lub narażenia krwi pacjenta podczas operacji.

Szczególną zaletę związków o wzorze I stanowi ich silne inhibitowanie odwrotnej transkryptazy HIV opornej na inne środki przeciwwirusowe. Stosowanie kombinacji związku o wzorze I lub II pozwala zapobiec rozwijaniu się oporności pacjenta na pojedynczy lek a także zwiększa skuteczność działania przeciwwirusowego. Kombinacje wykazują działanie synergistyczne na rozprzestrzenianie się wirusa.

Kombinacje według wynalazku podawać można doustnie, pozajelitowo (w tym na drodze iniekcji podskórnej, iniekcji dożylnej, domięśniowej lub domostkowej albo infuzji, przez wdychanie rozpylonego środka albo doodbytowo, w postaci dawek jednostkowych zawierających zwykłe nietoksyczne, farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, dodatki i podłoża.

Takie środki farmaceutyczne mogąbyć. w postaci doustnych zawiesin lub tabletek; środków do rozpylania do nosa; sterylnych preparatów do iniekcji takich jak sterylne wodne lub olejowe zawiesiny do iniekcji, albo czopków.

Środki doustne w postaci zawiesin wytwarzać można sposobami powszechnie znanymi w farmacji, przy czym mogą one zawierać celulozę mikrokrystalicznąjako wypełniacz, kwas alginowy lub alginian jako środek zawieszający, metylocelulozę jako środek zwiększający lepkość oraz znane środki słodzące/smakowo-zapachowe. Jako tabletki natychmiast uwalniające lek środki takie mogą zawierać celulozę mikrokrystaliczną, fosforan diwapniowy, skrobię, stearynian magnezowy, laktozę i/lub inne znane dodatki, spoiwa, wypełniacze, środki ułatwiające rozpad, rozcieńczalniki i środki smarujące.

Środki aerozolowe do nosa lub środki do inhalacji wytwarzać można sposobami powszechnie znanymi w farmacji, przy czym mogą one być w postaci roztworów w soli fizjologicznej, z wykorzystaniem alkoholu benzylowego lub innych środków konserwujących, środków ułatwiających wchłanianie i zapewniających biodostępność, związków fluorowęglowych i/lub innych znanych środków rozpuszczających lub dyspergujących.

Roztwory lub zawiesiny do iniekcji wytwarzać można znanymi sposobami stosując odpowiednie nietoksyczne, dopuszczalne do podawania pozajelitowego rozcieńczalniki lub rozpuszczalniki takie jak mannitol, 1,3-butanodiol, woda, roztwór Ringera lub izotoniczny roztwór chlorku sodowego, albo odpowiednie środki dyspergujące lub zwilżające i zawieszające takie, jak sterylne, łagodne oleje roślinne, w tym syntetyczne mono- i diglicerydy, oraz kwasy tłuszczowe, w tym kwas oleinowy.

Środki do podawania doodbytowego w postaci czopków wytwarzać można w wyniku zmieszania leku z odpowiednim nośnikiem nie powodującym podrażnień, takimjak masło kakaowe, syntetyczne estry glicerydowe lub glikole polietylenowe, stałe w temperaturach otoczenia, ale upłynniające lub rozpuszczające się w jamie odbytowej z uwolnieniem leku.

176 679

Dość związku o wzorze I lub wzorze II podawanego doustnie wynosi 0,1-20 mg/kg wagi ciała w podzielonych dawkach, a ilość analogu nukleozydowego podawanego doustnie wynosi od 50 mg do 5 g/kg wagi ciała w podzielonych dawkach. Ndeżyjednak zdawać sobie sprawę, że konkretny poziom dawki i częstotliwość podawania określonemu pacjentowi może zmieniać się i zależy odwielu czynników takichjak aktywność konkretnego zastosowanego związku, stabilność metaboliczna i długotrwałość działania tego związku, wiek, waga ciała, ogólny stan zdrowia, płeć, rodzaj odżywiania, sposób i czas podawania, szybkość wydalania, kombinacje leków, ostrość konkretnego stanu chorobowego i leczony stan.

Poniżej przedstawiono przykłady ilustrujące wytwarzanie związków o wzorze I.

Przykład 1 (+/-)-4~(1,1,1-trifluorome1ylo)-4-(1-buten-4-ylo)-6-chloro-1,4-dihydro2H-3,1-benzzksazyn-2-zn (związek 15)

Etap A: N-(4-zhlorofenylo)-2,2-dimetylopropanoamid

Do 5-litrowej, trójszyjnej kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło z napędem górnym załadowano 4-chloroanilinę (127,57 g, 1 mol), 1200 ml CHCb i 1200 ml nasyconego wodnego roztworu Na2CO3. Do kolby przyłączono wkraplacz i wlano do niego chlorek

2,2-dimetylzpropanoilu (129 ml, 1,05 mola). Chlorek kwasowy wkraplano do intensywnie mieszanej zawartości kolby w ciągu 1 godziny. Uzyskaną mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze otoczenia przez 23 godziny. Część produktu wydzieliła się z mieszaniny w postaci białych kryształów. Kryształy te odsączono. Przesącz przeniesiono do rozdzielacza i warstwy rozdzielono. Warstwę chloroformową przemyto wodą i solanką. Po wysuszeniu nad MgSO4, przesączeniu i usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano dodatkowy produkt. Obydwie porcje produktu połączono i rekrysta^owano z wrzącej mieszaniny octan etylu/heksany, uzyskując 185,6 g -^-chlorofenylo)-2,2-dimetyloprzpanoamidu w postaci białej, krystalicznej substancji stałej.

Etap B: 1-(2-amino-5-chlofofenylo)-2,2,2-trifluoroetanon

Do wysuszonej w suszarce, 3-litrowej trójszyjnej kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło z napędem górnym, wlot argonu i wysuszony w suszarce wkraplacz o pojemności 500 ml załadowano N-(4-chlorzfenylo)-2,2-dimetyloprzpanoamid (100 g, 472 mmole) w suchym THF (1 litr). Roztwór ten schłodzono w łaźni z lodem do 0°C i do w^placza załadowano n-butylolit (387 ml 2,5M roztworu w heksanach, 968 mmoli). Roztwór n-butylolitu powoli wkroplono do roztworu amidu w ciągu 1 godziny utrzymując temperaturę poniżej +5°C. Uzyskany roztwór utrzymywano w 0°C przez 1 godzinę. W tym czasie wytrącił się pomarańczowy osad. Do uzyskanej mieszaniny wkroplono w ciągu 1 godziny

1,1,1-trifluorooztan etylu (115 ml, 968 mmoli). Uzyskany klarowny roztwór pozostawiono na 30 minut, po czym reakcję przerwano dodając 5% kwas solny. Mieszaninę rozcieńczono 1 litrem octanu etylu i warstwy rozdzielono. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono nad siarczanem magnezowym, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując 160 g żółtego oleju. Materiał ten zawieszono w 1 litrze 3N kwasu solnego i roztwór ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez 24 godziny. Schłodzony roztwór rozcieńczono 1 litrem octanu etylu i mieszaninę zanalizowano stężonym NH4OH. Warstwy rozdzielono i fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono nad siarczanem magnezowym, przesączono, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i chromatografowano na 1,5 kg żelu krzemionkowego stosując jako eluent 15% octan etylu w heksanie. Chromatzgrafowany materiał rekrystalizowano z wrzącego heksanu otrzymując 57 g (54%) czystego 1-(2-ammo-5-chlorofenylo)-2,2,2-trifluoroetanonu w postacijasno żółtych kryształów; temperatura topnienia 91-92°Ć;

Ή NMR (CDCls): δ 6,46 (br s, 2H), 6,69 (d, 1H, J = 9,2 Hz) 7,32, (dd, 1H, J = 2,4,

9.2 Hz), 7,70 (d, 1H, J = 2,4 Hz).

Etap C: (+/-)-2-22-ammo-5-clilorofenylo)-2,2,2-trifluoro-5-heksen-2-ol

Do wysuszonej w suszarce, 300 ml trójszyjnej kolby okrągłodennej wyposażonej w pręcik mieszający, wlot argonu, wkraplccz i chłodnicę zwrotną załadowano magnez (wiórki, 3.03 g, 125 mmoli) w suchym THF (75 ml). Do intensywnie mieszanej zawartości kolby dodano 4-bromo-1)buten (12,0 ml, 118,21 mmola) z taką szybkością, aby utrzymać łagodne wrzenie. Po zakończeniu wkraplania mieszaninę reakcyjną mieszano przez 30 minut, po czym schłodzono do 0°C w łaźni z lodem. Do tego intensywnie mieszanego roztworu wkroplono roztwór l-(2-amino-5-chlorofenylo)-2,2,2-trifluoroetanonu (5,00 g, 22,36 mmnla) w THF 935 ml) w ciągu 30 minut. Łaźnię pozostawiono do ogrzania się i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 20 godzin w temperaturze otoczenia. Mieszaninę rozcieńczono octanem etylu i 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego. Meszaninę reakcyjną mieszano przez 4 godziny. Warstwy rozdzielono, po czym fazę organiczną przemyto wodnym roztworem NaHCO3 i solanką. Po wysuszeniu nad MgSC>4, przesączeniu, usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym-ciśnieniem i chromatografowaniu na 300 g żelu krzemionkowego z zastosowaniem 15% octanu etylu w heksanie jako eluentu otrzymano 4,80 g (+/-)-2-(2-amino-5-chłorofenylo)-2,2,2-trifluoro-5-heksen-2-olu w postaci żółtej substancji stałej.

Etap D: (+/-)-4-(1,l,l-trifluorometylo)-4-(l-buten-4-ylo)-6-chloro-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazyn-2-on

Do 300-ml trójszyjnej kolby okrągłodennej wyposażonej w pręcik mieszający, wlot argonu i chłodnicę zwrotną załadowano (+/-)-2-(2-amino-5-chlorofenylo)-2,2,2-trifluoro5-heksen-2-ol (4,80 g, 17,16 mmola), 1,1'-karbonylodiimidazol (13,91 g, 85,81 mmola) i suchy THF (75 ml). Uzyskaną mieszaninę ogrzewano w 60°C przez 18 godzin. Schłodzoną mieszaninę reakcyjną rozcieńczono octanem etylu i przemyto wodą (3 x 200 ml) i solanką (250 ml). Po wysuszeniu nad MgSOł, przesączeniu i usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie rekrystalizacji z wrzącej mieszaniny octan etylu/heksan otrzymano 3,22 g (+/-)-4-(1,l,l-trifluorometylo)-4-(l-buten-4-ylo)-6-chloro-l,4-dihydro-2H3,l-benzoksazyn-2-onu w postaci białej, krystalicznej substancji stałej; temperatura topnienia 165-166°C;

Ή NMR (CDC1₃): <5 1,99 (m, 1H), 2,09-2,40 (m, 3H), 5,00 (d, 1H, J = 1,4 Hz), 5,03 (dd, 1H, J = 1,4,7,9), 5,78 (m, 1H), 6,85 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 7,21 (br s, 1H), 7,35 (dd, 1H, J = 2,2,8,6 Hz), 9,63 (br s, 1H).

Przykład 2 (+/-)-6-chloro-4-etynylo-4-(l,l,l-trifluorometylo)-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazyn -2-on (związek 26)

Etap A: (2-amino-5-chlorofenylo)-l,l,l-trifluoro-3-butyn-2-ol

Do 500-ml trójszyjnej kolby okrągłodennej wyposażonej we wkraplacz, wlot argonu, pręcik mieszający i termometr cyfrowy załadowano bromek etynylomagnezowy (0,5M w heksanie, 268 ml, 134 mmole), po czym kolbę schłodzono do -78^ÓC. Wkraplanie roztworu l-(2-amino-5-chlorofenylo)-2,2,2-trifluoroetanonu (6,0 g, 26,8 mmola) w 50 ml THF zakończono po 15 minutach, utrzymując temperaturę < -55°Ć. Mieszanmę reakcyjną mieszano przez 16 godzin po powolnym ogrzaniu do temperatury pokojowej. Reakcję przerwano wkrapląjąc do ciemno czerwonego roztworu w -5°C nasycony wodny roztwór chlorku amonowego (60 ml). Po ekstrakcji octanem etylu, a następnie przemyciu 10% roztworem kwasu cytrynowego, nasyconym roztworem wodorowęglanu sodowego, wodą i solanką, a następnie wysuszeniu nad siarczanem sodowym, przesączeniu i odparowaniu rozpuszczalnika otrzymano 8,5 g surowego produktu. Po oczyszczaniu metodą chromatografii rzutowej z zastosowaniem 15-20% octanu etylu w heksanie uzyskano czysty 2-(2-amino-5-chłorofenylo)-l,l,l-trifluoro-3-butyn-2-ol (5 g jasno brunatnego oleju, 75% wydajności).

Etap B: (+/-)-6-chloro-4-etynylo-4-(l,l,l-trifluorometylo)-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoksazyn-2-on

Do roztworu (2-amino-5-chlorofenylo)-l,l,l-trifluoro-3-butyn-2-olu w THF (5,0 g, 20,0 mmoli w 225 ml THF) dodano 1,1'-karbonylodiimidazol (13,0 g, 80,0 ml) i mieszaninę ogrzewano w łaźni olejowej w 60°C przez 17 godzin. THF usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszczono w octanie etylu, po czym przemyto 10% roztworem kwasu cytrynowego, roztworem wodorowęglanu sodowego, wodą i solanką, a następnie wysuszono nad siarczanem sodowym. Po przesączeniu i odparowaniu pod zmniejszonym ciśnieniem wydzielono surowy produkt (3,6 g), który rekrystalizowano z mieszaniny octan etylu/heksan. Produkt, (+/-)-6-chloro-4-etynylo-4-(l,l,l-trifluorometylo)-l,4-dihy22

1766Ί9 dro-2H-3,1-benzoksazyn-2-on wydzielono w postaci białej', krystalicznej substancji stałej (3,22 g, (58,4% wydajności); temperatura topnienia 226-22λΟ

1H NMR (CDCls + śladowe ilości DMSO): 6 3,16 (s, 1H), 6,98 (d, J = 3.3 Hz, 1H),

Ί,35 (m, 1H), Ί,51 (s, 1H), 10,66 (s, 1H).

Przykład 3 (+/-)-6-chloro-4-(1,1,1-trifluorometylol-4--[(--(-pirolidynylo))-1-propynylo]-1,4-di hydro-2H-3,l-benzoksazyn-2-on (związek Ί)

Dioksanowy roztwór (+/-)-6-chloro-4-etynyIo-4-(1,1,1-trifluorometylo)-1,4-dihydro2H-3,1-benzoksazyn-2-onu (150 mg, 0,544 mmola), pirolidyny (52,2 fil, 0,626 mmola), paraformaldehydu (20,5 mg, 0,681 mmola), kwasu octowego (31,1 fil, 0,544 mmola) i chlorku miedzi (I) (20,5 mg, 0,20Ί mmola, w 3,5 ml dioksanu) ogrzewano w 50°C w łaźni olejowej przez około 2 godziny. Reakcję przerwano 2N HCl i mieszaninę wyekstrahowano octanem etylu. Warstwę wodną zobojętniono stałym węglanem potasowym i wyekstrahowano octanem etylu (3 razy). Połączone ekstrakty przemyto wodą i solanką, po czym wysuszono nad siarczanem sodowym uzyskując 140 mg surowego produktu. W wyniku chromatograficznego oczyszczania na żelu krzemionkowym i rekrystalizacji z mieszaniny octan etylu/heksan otrzymano krystaliczny (+/-)-6-chloro-4-(1,1,1-trifluorometylo)-4-[(3(1-pir^hdy^^lo))-1-propynyi^(o]-1,4-dihyd^(^-^:^iH-3,1-benzoksazyn-2-on (89 mg, 46% wydaja ności)- temperatura topnienia 160-161°C (rozkład).

Ή NMR (CDC1₃): δ 1,85-1,89 (m, 4H), 2,68-2,Ί1 (m, 4H), 3,6Ί (s, 1H), 6,88 (d, J = 8,55 Hz, 1H), Ί,40 (dd, J = 2,19,8,54 Hz, 1H), Ί,55 (s, 1H), 9,45 (s, 1H).

(+/-)-6chloro-4-(2-cyjanofenylo)etynyio-4-(1,1,1-trifluorometylo)-1,4-dihydro-2H3,1-benzoksazyn-2-on (związek 2)

Roztwór 6-chloro-4-etynyIo-4-(1,1,1-trifluorometylo)-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazyn-2-onu (138 mg, 0,5 mmola) w 3 ml suchego THF mieszano w -Ί8°Ο Do roztworu tego dodano 0,4 ml (1,0 mmola) n-butylolitu, 2,5M roztwór w heksanie. Anion mieszano przez 10 minut w -?8°C, po czym dodano 1 ml 1M roztworu ZnCl2 w eterze. Mieszaninę reakcyjną mieszano w -Ί8°Ο przez 15 minut, po czym łaźnię z lodem usunięto i mieszaninę powoli ogrzano do 0°C w ciągu 30 minut. Do mieszaniny reakcynej dodano roztwór 2-jodobenzonitrylu (149 mg, 0,65 mmola) w 2 ml THF, a następnie tetra^s(t^^^^]^i^fos:fi^o)pallad(0) (56 mg, 0,05 mmola). Mieszaninę reakcyną pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej i mieszanie kontynuowano przez 15 godzin. Reakcję przerwano dodając do mieszaniny reakcyjnej 10 ml 2N HCl, po czym mieszaninę wyekstrahowano 2 x 200 ml octanu etylu i połączone ekstrakty przemyto wodą i solanką, a następnie wysuszono nad siarczanem magnezowym. Rozpuszczalnik usunięto uzyskując 195 mg oleju, który poddano chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym (20% octan etylu w heksanie) otrzymując 60 mg nieprzereagowanej substancji wyjściowej i 35 mg sprzężonego produktu. Produkt ten ucierano z eterem uzyskując 25 mg (+--)-6-chloro-4-(2-cyjanofenylo)etynylo-4-(1,1,1-trifluorometylo)-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazyn-2-onu; temperatura topnienia 245-246°C; FAB.MS M+1 = 3ΊΊ m/e.

1H NMR (CDCls): δ 6,82-6,85 (d, J = 8,5 Hz, 1H), Ί,40-Ί,44 (dd, J = 2,1,8,5 Hz, 1H); Ί,56-Ί,Ί9 (m, 5H), 8,00 (s, 1H).

Przykład 4 (+/-)-4-(1-chloro-1,1-difluorometylo)-4-(2-fenyloetynylo)-6-chloro-1,4-dihydro2H-3,1-benzoksazyn-2-on (związek 5)

Etap A: 1-(2-amino-5-chlorofenylo)-2-chloro-2,2-difluoroetanon

Do wysuszonej w suszarce, 300-ml trójszyjnej kolby okrągłodennej wyposażonej w pręcik mieszający, wlot argonu i 100-ml wkraplacz wysuszony w suszarce załadowano N-(4-chlorofenylo)-2,2-dimetylopropanoamid (10 g, 4Ί,2 mmola) i suchy THF (100 ml). Roztwór ten schłodzono w łaźni z lodem do 0°C, a do wkraplacza dodano n-butylolit (38,Ί ml 2,5M roztworu w heksanach, 96,8 mmola). Roztwór n-butylolitu powoli wkroplono do roztworu amidu w ciągu 1 godziny, utrzymując temperaturę poniżej +5°C. Uzyskany roztwór mieszano w 0°C przez 1 godzinę; w tym czasie wytrącił się pomarańczowy osad. Do mieszaniny tej wkroplono w ciągu 15 minut 1-chloro-1,1-difluorooctan etylu (10,2 ml,

96,8 mmola). Uzyskany klarowny roztwór mieszano przez 30 minut. Reakcję przerwano dodając 5% kwas solny. Mieszaninę rozcieńczono 1 litrem octanu etylu, po czym warstwy rozdzielono. Fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono nad siarczanem magnezowym, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując 160 g żółtego oleju. Materiał ten zawieszono w 200 ml 3N kwasu solnego i roztwór ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez 24 godziny. Schłodzony roztwór rozcieńczono 500 ml octanem etylu i mieszaninę zalkalizowano stężonym NH4OH. Warstwy rozdzielono i fazę organiczną przemyto solanką, wysuszono nad siarczanem magnezowym, przesączono, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i chromatografowano na 350 g żelu krzemionkowego stosując jako eluent 15% octan etylu w heksanie. Chromatografowany materiał rekrystalizowano z wrzącego heksanu otrzymując 5,5 g czystego 1-(2-amino-5-chlorofenylo)-2-chloro-2,2-difluoroetanonu w postaci jasno żółtych kryształów; temperatura topnienia 55-56°C.

‘H NMR (CDCl₃): δ 6,43 (br s, 2H), 6,69 (d, 1H, J = 9,0 Hz), 7,31 (dd, 1H, J = 2,4, 9,0 Hz), 7,80 (d, 1H, J = 2,4 Hz).

Etap B: (+/-)-2-(2-amino-5-chlorofenylo)-4-fenylo-1-chloro-1,1-difluorc3-butyn-2-ol

Do wysuszonej w suszarce, 100-ml trójszyjnej kolby okrągłodennej wyposażonej w pręcik mieszający, wlot argonu, chłodnicę zwrotną i przegrodę załadowano etynylobenzen (2,13 g, 20,83 mmola), suchy THF (50 ml) i bromek etylomagnezowy (6,94 ml 3,0M roztworu w eterze). Uzyskaną mieszaninę reakcyjną mieszano 2 godziny w temperaturze pokojowej, po czym dodano ze strzykawki roztwór 1-(2-amino-5-chlorofenylo)-2-chloro2,2-difluoroetanonu (1,00 g, 4,17 mmola) w THF (6 ml). Uzyskany pomarańczowo-czerwony roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 21,5 godziny. Reakcję przerwano dodając 1N HCl (50 ml), po czym mieszaninę rozcieńczono octanem etylu. Roztwór zalkalizowano stężonym NH4OH i warstwy rozdzielono. Fazę organiczną przemyto wodą i solanką. Po wysuszeniu nad siarczanem magnezowym, przesączeniu, usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem i chromatografii na żelu krzemionkowym z zastosowaniem 20% octanu etylu w heksanie jako eluentu otrzymano 1,02 g (+/-)-2-(2-amino-5-chlorofenylo)-4-fenylo-1-chlora-1,1-difluoro-3-butyn-2-olu jako białawej substancji stałej.

^:H NMR (CDCl₃): δ 4,42 (br s, 2H), 5,10 (br s, 1H), 6,65 (d, 1H, j = 8,5 Hz), 7,15 (dd, 1H, J = 2,4,8,5 Hz), 7,38 (m, 3H), 7,55 (m, 2H), 7,70 (d, J = 2,4 Hz).

Etap C: (+/-)-4-(1-chloro-1,1-difluorometylo)-4-(2-fenyloetynylo)-6-chloro-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazyn-2-on

Do 100-ml trójszyjnej kolby okrągłodennej wyposażonej w pręcik mieszający, chłodnicę zwrotną i wlot argonu załadowano (+--)-2-(2-amino-5-ch]orofenylo)-4-fenylo-lchloro-1,1-difluoro-3-butyn-2-ol (0,81 g, 2,37 mmola), suchy THF (25 ml) i 1,1'-karbonylodiimidazol (1,919 g, 11,84 mmola). Roztwór ten ogrzewano w 60°C przez 20 godzin. Schłodzoną mieszaninę reakcyjną rozcieńczono octanem etylu i przemyto 0,5N HCl, wodą i solanką. Po wysuszeniu nad siarczanem magnezowym, przesączeniu i usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano 890 mg oleju. Materiał ten chromatografowano na 80 g żelu krzemionkowego stosującjako eluent 20% octan etylu w heksanie. Chromatografowany materiał rekrystalizowano z wrzącej mieszaniny octan etylu/heksany otrzymując 507 mg (58%) (+/-)-4-(1-chloro-1,1-difłuorometylo)-4-(2-fenyloetynylo)-6-chloro-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazyn-2-onu w postaci białych igieł, o temperaturze topnienia 154-155°C.

H NMR (CDCla): δ 6,89 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 7,35-7,48 (m, 4H), 7,56 (m, 2H), 7,64 (br s, 1H), 9,19 (brs,lH).

Przykład 5 (-)-6-chloro-4-fenyloetynylo-4-triffuorometylo-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazyn-2on (związek 4)

Etap A: 2-(2-amino-5-cłdorofenylo)-4-fenylo-1,1,1-trifluoro-3-butyn-2-ol

Do roztworu fenyloacetylidku litu wytworzonego z 4,83 ml fenyloacetylenu (0,044 mola) i 17,2 ml 2,5N roztworu n-butylolitu w heksanie (0,043 mola) w 50 ml THF w -78°C dodano 11,4 g eteratu bromku magnezowego (0,044 mola) w ciągu 5 minut. Mieszaninę

17(6679 pozostawiono —o ogrzania się —o -20°C i mieszanie w atmosferze argonu kontynuowano przez 30 minut. Mieszaninę schło—zono następnie —o -60°C i —o—ano roztwór zawierający

2,5 g (0,011 mola) 1-(2-amino-5-chloro)-2,2,2-trifluorom.etyloetanonu skompleksowanego uprze—nio z równoważną ilością (2,8 g, 0,011 mola) eteratu bromku magnezowego w 25 ml THF. Mieszaninę reakcyjną mieszano w 15°C przez 1 go—zinę, po czym schło—zono —o 0°C i wkroplono —o niej mieszaninę zawierającą po 30 ml nasyconego wo—nego roztworu chlorku amonowego i wo—y. Mieszaninę wyekstrahowano —woma porcjami po 100 ml eteru etylowego, po czym połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono na— siarczanem magnezowym. Po usunięciu śro—ka suszącego i rozpuszczalników uzyskano 6 g oleju, który po——ano chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym, stosując —o eluowania 20% octan etylu w heksanie; otrzymano 2,5 g

2-(2-amino-5-chlorofenylo)-4-fenylo-1,1,1-trifluoro-3-butyn-2-olu.

^lH NMR (CDCb): δ 4,63 (br s, 3H), 6,69 (—, J = 8,5 Hz, 1H), 7,15 (ά, J = 2 Hz, 1H), 7,17 (—, J = 2 Hz, 1H), 7,35-7,44 (m, 3H), 7,53-7,56 (m, 2H), 7,66 (—, J = 2 Hz, 1H). FAB MS M+H = 326 m/e.

Etap B: (±)-6cchloro4|ffenyloeyniylo-4-trifluorometylo-1,4-—ihdro-2H-3,-1-benzoksazyn-2-on (związek 12)

Roztwór 2-(2-aminr)5)cClorofenylo))4-fenylo-1,1,1)tΓiflu<rro-3-butyn-2-olu (2,0 g, 6,1 mmola) i 11,0 g (12,0 mmola) 1,r-karbonylodiimidazolu w 300 ml suchego THF mieszano w atmosferze argonu w 55°C przez 24 go—ziny. Rozpuszczalnik usunięto w wyparce rotacyjnej, a pozostałość wymieszano z 200 ml eteru i 400 ml wo—y. Warstwy roz—zielono i warstwę wo—ną wyekstrahowano jeszcze raz eterem. Połączone ekstrakty eterowe przemyto —woma porcjami po 200 ml 10% roztworu kwasu cytrynowego, a następnie solanką, po czym wysuszono na— siarczanem magnezowym. Po usunięciu śro—ka suszącego i rozpuszczalników uzyskano 1,5 g (70%) surowego tytułowego związku w postaci oleju. Wwyniku ucierania z mieszaninąeter/heksan otrzymano 875 mg (±)-6-chloro-4-fenylo-etynylo-4-trifIuorometylo-l,4-—ihy—ro-2N-3,l)benzoksazyn)2-rnu w postaci białej substancji stałej, która częściowo topi się w 137°C, a staje się klarowna w 147°C.

*11 NMR (CDCla): δ 6,92 (—, J = 8 Hz, 1H), 7,30-7,49 (m, 4H), 7,58-7,65 (m, 3H), 8,99 (s, 1H).

Etap C: 6-cCloro-1)(1S)-kamfanoilr-4)fenylretynylO)4)trifluorometylo-1,4)—ihy—ro2H-3,1)benzoksazyn)2)rn

Do roztworu zawierającego (±)-6-chloro-4)fenyloetynylO)4)trifluorometylo-1,4-—ihy—ro-2H)3,1)benzoksazyn-2-on (2,24 g, 6,37 mmola), 4-—imetyloamino-piry—ynę (0,10 g, 0,8 mmola) i chlorek kwasu (J-kamfanowego (2,07 g, 9,55 mmola) w 60 ml suchego —ichlorometanu, mieszanego w atmosferze argonu w łaźni z lo—em, —o—ano trietyloaminę (2,22 ml, 15,9 mmola). Łaźnię chło—zącą usunięto i reakcję kontynuowano w temperaturze pokojowej. Po stwier—zeniu, że reakcja została zakończona, na po—stawie chromatografii cienkowarstwowej (SiO2, 4% octan etylu w CHCI3) roztwór rozcieńczono 200 ml CHCI3 i przemyto —wukrotnie 10% roztworem kwasu cytrynowego, a następnie solanką. Po wysuszeniu na— siarczanem magnezowym rozpuszczalnik usunięto w wyparce rotacyjnej i piankowatą pozostałość po——ano chromatografii rzutowej stosując —o eluowania CHCI3. Uzyskano 575 mg —iastereoizomeru I 6)CMoro-1-{1S))kamfanrilo)4)fenyloetynylo-4)tri) flurromftylo-1,4-dihy—ΓO-2H-3,1-benzoksazyn-2)Onu w postaci oleju;

Ή NMR (CDCb): δ 0,85 (s, 3H), 1,08 (s, 3H), 1,22 (s3 2H), 1,73-1,85 (m, 1H),

1.92- 2,08 (m, 1H), 2,50-2,67 (m, 2H), 7,30-7,79 (m, 8H). Następnie uzyskano 1,52 g mieszanych frakcji (—iastereoizomery I i II). Kontynuując eluowanie otrzymano 680 mg wolniej przemieszczającego się —iastereoizomeru (II) tytułowego związku, z którego w wyniku ucierania z mieszaniną eter/heksan otrzymano gru—ki białych igieł o temperaturze topnienia 177-178,5oC.

NMR (CDCb): δ 0,83 (s, 3H), 1,12 (s, 3H), 1,23 (s, 3H), 1,73-1,86 (m, 1H),

1.93- 2,06 (m, 1H), 2,50-2,63 (m, 2H), 7,38-7,51 (m, 4H), 7,49-7,62 (m, 2H), 7,72 (—, J=9 Hz, 1H), 7,76 (—, J=2Hz, 1H).

1,52 g mieszaniny izomerów z chromatografii rzutowej rozpuszczono w 75 ml eteru, roztwór rozcieńczono 50 ml heksanu i zaszczepiono kryształem izomeru II. W wyniku powolnej krystdizaq'i otrzymano dodatkowo 385 mg izomeru II, który rekrystalizowano z mieszaniny eter/heksan otrzymując materiał o czystości diastereoizomerycznej (oznaczcnej metodą HPLC) ponad 96%.

Etap D: ())-6-chloro-4)fenyloetylO)4-trifluorometylo-1,4-dihydro-2H-3,1-benzO) ksczyn-2)on

Krystaliczny dia^^ijrisoizomer II 6-zhlorO)1)(1S))kcnrfanzilz-4)fenyloetynylz-4)trifIuorometylO)1,2-dihydΓO-4(H))3,1-benzoksazyn-2)Onu (53 mg, 0,10 mmola) rozpuszczono w 8 ml 2-propanolu w 45 e w atmosferze argonu. Do roztworu dodano 0,27 ml 10% wodnego roztworu K2CO3. Mieszanie kontynuowano przez 10 minut, gdy stwierdzono, że cały materiał wyjściowy przereagował (TLC, S1O2, 4% octan etylu w CHCb). Roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszczono w eterze. Po przemyciu 0,1N HCl i solanką roztwór eterowy wysuszono nad siarczanemcmcgnezowym, przesączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując oleistą substancję stałą, którą zczyszczcno metodą chromatografii na S1O2 stosując do eluowcnia 5% 2-propanol w heksanie. Uzyskano ())-6)Chlorr>-4)fenylzetylz·-4)0rifluorometylo-1,4-dihy<±cz2H-3,1-benzoksczyn-2)on w postaci białych igieł po krysotlizczji z mieszaniny eter/heksan; temperatura topnienia 178-179°C. α Da = -92,5’ (CHCls, c = 0,0012 g/ml);

¹H NMR (CDCls): δ 6,87 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,37-7,50 (m, 4H), 7,56-7,63 (m, 3H),

8.60 (s, 1H).

Etap E: (+))6-chloro-4)fenyloetylZ)4)trifluorometylO)1,4-dihycdΌ-2H-3,1-benzoksa) zyn^-on (+))6-chlorO)4)fenyloetylO)4)trifluorzmetylo-1,4)dihydro-2H)3,1-benaoksazyn-2)On ztrzymcnz z niekrystalicznego produktu z etapu C, diastereoizzmeru I, w sposób podany w etapie D; temperatura topnienia 178-179°C; [ajo^ = +87,6° (CHCb, c = 0,0050 g/ml);

Ή NMR (CDCl·,): δ 6,77 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,37-7,00(1^411), 7,66-7,63 (m,3H),

8.60 (s, 1H).

Przykład 6 , (-))6)Zhloro-4)CyklopropyloetynylZ)4)trifluorometylo-1,4-dihydro-2H-3,1)benzoksa) zyn^-on (L)343,726, związek 37.2) i (+)-6-chloΓO-4-cyklopropyloetynylO)4)trifluorome0ylz-1,4-dihydro-2H)3,1)benaoksczyn-2-on(L-743,325)

Etap A: 2)(2-amino-5-c]hlorofenylo)-4-cyklopropylo-7,l,lttrifluorO)3-butyn)2)Ol

Roztwór cyklopropyloccetylidku bromomagnezowego otrzymano z 23 g cyklopnpyloacetylenu (0,348 mola) w 250 ml THF, do którego wkroplono 116 ml 3,0 M roztworu bromku eOylomcgnezzwego w eterze (0,348 mola) w ciągu 1 godziny. Roztwór ten utrzymywano w 0¾ przez 1 godzinę, a następnie w 40°C przez godziny. Do roztworu tego, schłodzonego ponownie do 0°C dodano porcjami w ciągu 5 minut stały l-(2)aminO)5)ChlZ) rofenylz))2,2,2-trifluorometyloetanzn (0,0696 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 1,5 godziny. Reakcję przerwano w 0cC wkraplając 700 ml nasyconego wodnego roztworu chlorki amonowego. Mieszaninę wyekstrahowano 2 porcjami po 400 ml octanu etylu, po czym połączone fazy organiczne przemyto solanką i wysuszono nad siarczanem magnezowym. Po usunięciu środka suszącego i rozpuszczalników uzyskano żółtą substancję stałą. Materiał ten rekrystalizowcno z wrzących heksanów (ostateczna objętość 100 ml) otrzymując 14,67 g 2)(2-aminO)5)Zhlorofenylo))4)CyklopropylO)1,1,1)trifluzrz-3-butyn-2-olu. Drugi rzut; (2,1 g) uzyskano z zatężonego ługu macierzystego. Temperatura topnienia

H NMR (CDCls) : δ 0,84 (m, 2H), 0,90 (m, 2H), 1,38 (m, 1H), 4,50 (br s, 3H), 6,69 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,13 (dd, J=2,5,8,5, Hz, 1H), 7,55 (d, J=2,5 Hz, 1H).

Etap B: (±)-6-chloro-4-cyklopentylzetynylo-4)trifluoΓometylo-1,4-dihydro-2H-3,1benzoksczyn-2)on (L-741,211)

Roztwór 2-(2-cminZ)5-zhloΓofenylo)-4-zyklopropylZ)1,1,1)triffuoro3-buOyn-2-olu (15,00 g, 0,0518 mola) i 41,98 g (0,259 mola) 1,r-karbonylodiimidazolu w 250 ml suchego THF mieszano w atmosferze argonu w 55°C przez 24 godziny. Rozpuszczalnik usunięto w wy26

176 679 parce- rotacyjnej, a pozostałość wymieszano z 500 ml octanu etylu i 400 ml wody. Warstwy rozdzielono i fazę wodną wyekstrahowano jeszcze raz octanem etylu. Połączone ekstrakty w octanie etylu przemyto 2 porcjami po 200 ml 2% kwasu solnego, nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 i solanką. Po wysuszeniu nad siarczanem magnezowym, przesączeniu i usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano 16,42 ą tytułowego związku w postaci substancji stałej. W wyniku rekrystalizacji z mieszaniny octan etylu/heksan uzyskano 12,97 ą analitycznie czystego (±:)-<^(^ll^oi^c^-^^t^klope^ntyloetynylO/4/trifluorometylo-1,4-dihydro-2H-3,1/benzoksazyn/2-onu w postaci białych kryształów. Temperatura topnienia 178-180°C.

*H NMR (CDCl₃): δ 0,85 (m, 2H), 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, 1H), 6,81 (d, J=8,5 Hz, 1H),

7.37 (dd, J=2,5, 8,5 Hz, 1H), 7,49 (d, J=2,5 Hz, 1H), 8,87 (br s, 1H).

. Etap C: 6/chloro-1/(1S)/4-cyklopropyloetynylo-4-trifluorometyło-1,4/dChydrO/2H-3,1benzoksazyn-2-on

Do roztworu zawierającego (±/-6-chloro-4-cyklopentyloetynylo-4/trifluorometylo/1,4/dihydΓ0-2H/3,1/benzoksazyn-2/on (12,97 ą, 0,041 mola), 4/dimetyloamCnopCrydynę (1,02 g, 0,0083 mola) i chlorek kwasu (^-kamfanowego (14,22 ą, 0,06556 mola) w 350 ml suchego dichlorometanu, mieszanego w atmosferze argonu w łaźni z lodem dodano trietyloaminę (22,84 ml, 0,164 mola). Łaźnię chłodzącą usunięto i reakqę kontynuowano w temperaturze pokojowej. Po 75 minutach stwierdzono, że reakcja została zakończona, na podstawie chromatografii cienkowarstwowej (SiO^ 4% octan etylu w CHCl₃) roztwór rozcieńczono 500 ml CHCh, a następnie przemyto 10% roztworem kwasu cytrynowego (2 razy), wodą (1 raz) i solanką (1 raz). Po wysuszeniu nad siarczanem magnezowym, przesączeniu i usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano bezbarwną piankę. Materiał ten ucierano z 200 ml wrzącego heksanu. Podczas schładzania do temperatury pokojowej wytrącił się pożądany diastereoizomeryczny imid kamfanianu. Osad oddzielono na filtrze spiekanym, przemyto niewielką ilością zimnych heksanów i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując 7,79 g ó-chloro-l^lSj-H-cyklopropyloetynylo-4-triifuorometylo-l,4/dChydro-2H-3,l-benzoksazyn-2/Onu w postaci białych kryształów. Temperatura topnienia 164-165°C. Czystość na podstawie HPLC: 99,2% przy około 254 nm.

‘ll NMR (CDCI3): δ 0,77 (s, 3H), 0,86-0,96 (m, 4H), 1,08 (s, 3H), 1,19 (s, 3H), 1,44 (m, 1H), 1,76 (m, 1H), 1,95 (m, 1H), 7,42 (dd, J=2,4,9,0 Hz, 1H), 7,63 (m, 2H).

Etap D: (/)-6/Chloro/4/Cyklopropyloetynylo-4-trifluoromety]o-1,4/dihydro-2H-3,1/ benzoksazyn-2/on (L-743,726, związek 37.2)

6/chloro-1/(lS)-4/CyklopropyloetyΉylo-4/trifluorometylo-1,4/dihydro-2H/3,1-benzo ksazyn-2-on (7,50 g, 0,01512 mola) rozpuszczono w 150 ml n-butanolu w 60°C w atmosferze argonu. Uzyskany roztwór mieszano w 60°C przez 72 godziny. Mieszaninę zobojętniono wodnym roztworem NaHCO3 i n-butanol usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w 150 ml THF, do uzyskanego roztworu dodano 50 ml 2N LiOH i uzyskaną mieszaninę reakcyjną mieszano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Mieszaninę rozcieńczono octanem etylu, po czym przemyto dwoma porcjami wody i jedną porcją solanki. Po wysuszeniu nąd siarczanem magnezowym, przesączeniu i odparowaniu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano białą substancję stałą. Materiał ten rekrystalizowano z gorącego heksanu uzyskując 3,43 g (/)-6-chloro/4-cykIopropyloety/ nylo/4/trCluorometylo-l,4-dChydro-2H-3,1-benzoksaz;yn-2-onu w postaci białych kryształów o temperaturze topnienia 131-132°C; [ajo²⁰ = -84,7° (CHCI3, c = 0,005 g/ml);

¹H NMR (CDCl₃): ó 0,85 (m, 2H), 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, 1H), 6,81 (d, J=8,5 Hz, 1H),

7.37 (dd, J=2,5, 8,5 Hz, 1H), 7,49 (d, J=2,5 Hz, 1H), 8,87 (br s, 1H).

Etap E: (+)-6-chloro-4~cyklopropyloetynylo-4-tri.fluorometylo-1,4-di.hydro-2H-3,1/ benzoksazyn-2-on (L-743,725)

Ług macierzysty z etapu C oczyszczano metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym stosując jako eluent 10% octan etylu w heksanach. Czysty, niepożądany diastereoizomer (w postaci białej pianki) hydrolizowano w sposób podany w etapie D. Uzyskano enancjomerycznybenzoksazynon, (+/-6-chloro-4-<ykdopropyloetynylo-4/tri176 679 fluorometylo-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoksazyn-2-on w postaci białych kryształów o temperaturze topnienia 131-132°C; [<z]d²⁰ = +84,4° (CHCb, c = 0,005 g/ml);

7,37 (dd, J=2,5, 8,5 Hz, 1H), 7,49 (d, J=2,5 Hz, 1H), 8,87 (br s, 1H).

Przykład 7

Receptura tabletek

Substancja	Ilość substancji w tabletce a'
	50,0 mg	75,0 mg	100,0 mg	150,0 mg	200,0 mg
Substanqa czynna	50,0 mg	75,0 mg	100,0 mg	150,0 mg	200,0 mg
laurylosiarczan soda	2,50 mg	3,75 mg	5,0 mg	7,5 mg	10,0 mg
wewnątrzgranulkowy glikolan sodu skrobi	40,0 mg	60,0 mg	80,0 mg	120,0 mg	160,0 mg
zewnątrzgranulkowy glikolan sodu skrobi	5,00 mg	7,50 mg	10,0 mg	15,0 mg	20,0 mg
monohydrat laktozy	28,5 mg	42,75 mg	57,0 mg	85,5 mg	114,0 mg
sterarynian magnezu	2,0 mg	3,0 mg	4,0 mg	6,0 mg	8,0 mg
waga łączna	128,0 mg	192,0 mg	256,0 mg	384,0 mg	512,0 mg

Badania farmakologiczne

Test z DdwrDtną transkryptazą

W teście oznacza się wbudowywanie trytowanego monofosforanu dezoksyguanozyny przez zrekombinowaną odwrotną transkryptazę HIV (HIV RTr) (lub inną RT) do strącanego kwasem cDNA przy wielkościach Km dGTP i poli r(C) · oligo d(G)12-18. Inhibitory według wynalazku inhibitują to wbudowywanie. Testy prowadzono w 55 mM Tris (pH 8,2) - 30 mM KCl - 30 mM MgCl2 -1 mM ditiotreitol - 20μ grC:dG12-18 (Pharmacia) na ml - 8 mM J^HjdGTP (New England Nuclear) - 0,01% Triton X - 50 mM kwas etylenoglikolo-bisO/-anmioetylo-etero))N,N,N',N'-tetraoctowy (EGTA) - 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej.· Po inkubowaniu przez 60 minut w 27°^ materiał strącony kwasem zebrano na filtrach z włókien szklanych za pomocą półautomatycznego aparatu do zbierania komórek. Ekstrakty komórek bakteryjnych zawierające RT rozcieńczono do wielkości przypadającej w obszarze zależności liniowych w teście i zmierzene aktywność w obecności i bez inhibitora. Jako środek kontrolny zastosowano oczyszczony heterodimer HIV-1 RT wytwarzany przez E. coli. Wyniki podawano jako stężenie inhibitora zapewniające inhibitowanie w 50% (IC50 wt), w nanomolach/lil^r.

W przypadku testu podwójnego mutanta (dm) zastosowano A17 RT. A17 RT jest odporna na różne aminopiiydony,jak to opisali J.H. Nunberg i inni, J. Virol. 65,4887 (1991). Wyniki podano jako wielkości 1C50 dm w nanomolach/litr.

Test rDzprzestrzeniania w kDmórkach

Inhibitowanie rozprzestrzeniania się HIV w hodowli komórek oznaczano metodą

J.H. Nunberga i innych, J. Virol. 65, 4887 (1991). W teście komórki T-limfoidalne MT-4 zainfekowano HTV-1 (typu dzikiego, o ile nie zaznaczono tego inaczej) stosując ustalone inokulum, po czym hodowle inkubowano przez 24 godziny. Po tym czasie <1% komórek wykazywała odczyn dodatni w teście pośredniej immunofluorescencji. Następnie komórki dokładnie przemyto i rozprowadzono na płytkach do hodowli z 96 zagłębieniami. Do zagłębień dodano inhibitor kolejno dwukrotnie rozcieńczany i hodowle kontynuowano przez 3 kolejne dni. Po 4 dniach od zainfekowania 100% komórekw hodowlach kontrolnych zostało zainfekowanych. Nagromadzenie się HTV-1 p24 było bezpośrednio powiązane z rozprzestrzenianiem się wirusa. Stężenie inhibitujące hodowlę komórek określano jako stężenie inhibitora w nanomolach/litr (CIC95), zmniejszające rozprzestrzenianie się infekcji o co najmniej 95%.

176 679

Zestawienie wyników dla związków 37.2

A. Test z odwrotną transkryptazą i test rozprzestrzeniania się w komórkach

	WT	K103N*	Y181C	DM	RT-2
IC50 (uM)	0,002	0,030	0,008	0,085	80,8
CIC95 (uM)	<0,006 (N=2)	0,100	<0,025	0,400	NO

B. Dane farmakologiczne

Rezus:

mg. leg⁴ ddżyyie:ti/2 = 211nmint O.B.=0,55(AU.C) mg. kg-ι doustnie (methocel): (W = 4,4μΜ @ 2 h

C24h = 1,1

Wiązanie białka: 98.0% zwykłego ludzkiego osocza (metoda HPLC) * Mutanty K103N i Y181C stanowią oporne na leki odwrotne transkryptazy HTV-1. DM jest mutantem podwójnym, co wyjaśniono w teście z odwrotną transkryptazą. RT-2 oznacza odwrotną iranskryptazę HTV-2.

Działanie synergistyczne

A. Preparowanie zawiesiny komórek MT-4 zadekowanych przez HIV

Komórki MT zainfekowano w dniu 0 w stężeniu 250 000 na ml w rozcieńczeniu 1:1000 szczepem podstawowym IMb HTV-1 (ostateczne stężenie 125 pg p24/ml; wystarczające do osiągnięcia < 1% zainfekowanych komórek w dniu 1 i 25-100% w dniu 4). Komórki zainfekowano i hodowano w następującym ośrodku: RPMI1640 (Whittaker BioProducts), 10% zdezaktywowanej płodowej surowicy bydlęcej, 4 mM glutaminy (Gibco Labs) i 1:100 penicyliny-streptomycyny (Gibco Labs).

Mieszaninę inkubowano przez noc w 37°C w atmosferze z 5% CO2.

B. Obróbka inhibitorami

Przygotowano matrycę kombinacji par związków (patrz tabela S) o stężeniach w zakresie nanomolowym. W dniią 1 porcje po 125 fil inhibitorów dodano do takich samych objętości komórek MT-4 zainfekowanych przez HIV (50 000 komórek/zaglębienie) na płytce do hodowli komórek o 96 zagłębieniach. Inkubację kontynuowano przez 3 dni w 37°C w atmosferze z 5% CO2.

C. Pomiar rozprzestrzeniania się wirusa

Wykorzystując aparat do wielokanałowego pipetowania osadzone komórki ponownie zawieszono i po 125 μl hodowli zebrano na odrębną płytkę Antygen p24 HIV oznaczano w supematancie.

Stężenie antygenu p24 HVO oznaczano metodą enzymatycznego testu immunologicznego w sposób następujący. Próbki, w których oznaczano antygen p24 dodawano do mikrozagłębień powleczonych monoklonalnym przeciwciałem specyficznym względem antygenu rdzenia HIV. Mikrozagłębienia przemyto w tym stadium oraz w kolejnych innych odpowiednich etapach. Z kolei dodawano biotynylowane przeciwciało specyficzne względem HIV, a następnie strepawidynę skoniugowaną z peroksydazą chrzanową. Po dodaniu nadtlenku wodoru i tetrametylobenzydyny jako substratu występowała barwna reakcja. Intensywność zabarwienia jest proporcjonalna do stężenia antygenu p24 HIV.

Wyliczanie stopnia synergizmu

Stwierdzono, że kombinacje par inhibitorów (patrz tabela) powodują znacznie silniejsze inhibitowanie rozprzestrzeniania się wirusa w porównaniu z każdym z inhibitorów stosowanych pojedynczo oraz w porównaniu ze zsumowanym inhibitowaniem każdego z inhibitorów. Tak np. stwierdzono, że kombinacja 726 i AZT powoduje silniejsze inhibitowanie rozprzestrzeniania się wirusa w porównaniu z samym 726 lub z samym AZT, albo w porównaniu z sumą inhibitowania przez 726 i inhibitowania przez AZT.

Obróbkę danych wykonywano w sposób następujący: ułamkowe stosunki stężeń inhibitujących (FIC) wyliczano metodą Eliona i innych, J. Biol. Chem., 208,477 (1954). Dla różnych kombinacji par wyznaczano minimum sumy FICS będące maksimum synergizmu.

1Ί6 6Ί9

Alternatywnie wyliczano średnią sumę FICS stanowiącą średni synergizm. Wyniki obliczeń przedstawione w poniższej tabeli wskazują na znaczny synergizm w inhibitowaniu rozprzestrzeniania się wirusa. Im mniejsza jest liczba, tym synergizm jest większy.

Tabela

Wyniki obliczeń średniego synergizmu

Kombinacje par*	Średni synergizm
Ί26 + ddI	0,81
Ί26 + AZT	0,62

* Ί26 oznacza L-743726 (przykład 6).

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kombinacja związków farmakologicznie czynnych do zapobiegania infekcji HTV lub leczenia infekcji HIV, lub leczenia AIDS albo ARC, znamienna tym, że stanowi kombinację nowego związku o wzorze I:

w którym:

X oznacza atom cłhorowca,

Xioznacza grupę trichlorowzometylową lub pentachlorowcoetylową;

Z oznacza atom tlenu;

R oznacza:

(a) grupę C1-8 alkilową, niepodstawioną lub podstawioną przez A, a A oznacza atom chlorowca, grupę C3-6 cyklodlkilową, CN, hydroksylową, C1-4 alkoksylową, C2.4 alkinylz-Cl-^clkzksylową, aryloksylową, C1-4 alkilokcrbonylzwą, nitrową, di-(Ci-2 alkilo) aminową, C1-4 clkilzamino-C^2 alkilową, heterocykliczną lub arylotio;

(b) grupę C2-4 alkenylową, niepodstawioną lub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną przez A;

(C) grupę C2-5 alkinylową, niepodstcwizną lub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną przez A; albo (d) grupę C3-4 cykloalkilową, niepodstawioną lub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną A; lub jego dopuszczalnej farmaceutycznie soli, lub o wzorze II:

X w którym:

X oznacza atom chlorowca,

XI oznacza grupę trichlorowczmetylową, pentachlorowcoetylową, C2-5 alkilową, C2-5 alkinylową, C3-5 cykloalkilową lub arylową;

Z oznacza atom tlenu lub siarki;

R oznacza:

(a) grupę C1-8 alkilową, niepodstawioną lub podstawioną przez A, a A oznacza atom chlorowca, grupę C3-6 cykloalkilową, CN, hydroksylową, C1-4 alkoksylową, C2-4 alkiny1766Ί9 lo-Ci-t alkoksylową, aryloksylową, C1-4 alkilokarbonylową, nitrową, di(Ci-2 alkilo)aminową, C1-4 alkiloamino-Ci-2 alkilową, heterocykliczną lub arylotio;

(b) grupę C2-4 alkenylową, niepodstawioną lub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną A;

(c) grupę C2-5 alkinylową niepodstawioną lub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną A; albo (d) grupę C3-4 cykloalkilową, niepodstawioną lub podstawioną przez:

(i) A, albo (ii) grupą arylową, niepodstawioną lub podstawioną A; lub farmaceutycznie dopuszczalnej soli związku o wzorze I lub II, z analogiem nukleozydowym będącym inhibitorem odwrotnej transkryptazy HIV.
2. Kombinacja według zastrz. 1, znamienna tym, że jako związek o wzorze I lub wzorze II zawiera (-)-6-chloro-4-cyktopropyloetynylo-4-triifuorometylo-l,4-dihydro-2H3,1-benzoksazyn-2-on.
3. Kombinacja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera nukleozydowy inhibitor odwrotnej transkryptazy HIV, wybrany z grupy składającej się z azydotymidyny (AZT), dideoksycytydyny (ddC), dideoksyinozyny (ddI), didehydrodeoksytymidyny (d4T), acyklowinualfa-bicyldo[2.2.1]hept-5-en-2-ylo-alfa-fenylo-1-piperydynopropiaiolu(HEPT) i 3'-fluoro-2'-3'-dideoksytymidyny oraz ich dopuszczalnych farmaceutycznie soli.