CZ289176B6 - Farmaceutický prostředek pro inhibici reverzní transkripce HIV - Google Patents

Abstract

Farmaceutick² prost°edek pro inhibici reverzn transkripce HIV obsahuje benzoxazinonov deriv ty obecn ho vzorce I, v n m jednotliv symboly maj specifick² v²znam. Prost°edek je mo no pou t k prevenci infekce HIV, k l en ji vznikl infekce virem HIV a k l en rozvinut ho syndromu AIDS a/nebo ARC.\

Description

Farmaceutický prostředek pro inhibici reverzní transkripce HIV

Oblast techniky

Vynález se týká farmaceutického prostředku pro inhibici reverzní transkripce HIV.

Dosavadní stav techniky

Podstata vynálezu je částečným pokračováním předmětu US patentové přihlášky č. 07/926 607 (Měrek), podané 7. srpna 1992.

Retrovirus, označovaný jako virus lidské imunodeficience, HTV je etiologickým původcem komplexního onemocnění při němž dochází k progresivní destrukci obranného systému, toto onemocnění je označováno jako získaný syndrom imunodeficience, AIDS a dochází při něm rovněž k degeneraci centrálního a periferního nervového systému. Uvedený virus byl dříve označován jako LAV, HTLV-III nebo ARV. Společnou vlastností replikace retrovirů je reverzní transkripce RNA genomu enzymem reverzní transkriptázou, jejíž kód se nachází ve viru, vznikají kopie DNA pro řetězec HIV a běží o nezbytný stupeň při replikaci viru. Je známo, že určité sloučeniny mohou způsobit inhibici reverzní transkriptázy a jsou proto účinné při léčení AIDS a příbuzných onemocnění, takovou sloučeninou je například azidothymidin, AZT.

Při analýze nukleotidového řetězce pro HIV je možno prokázat přítomnost genu pol v jednom z otevřených čtecích rámců, jak bylo popsáno v publikaci Ratner L. a další, Nátuře, 313, 277, 1985. Homologie řetězců aminokyselin prokazuje, že řetězec genu pol je kódovým řetězcem pro reverzní transkriptázu, endonukleázu a proteázu HIV podle publikací Toh H. a další, EMBO J., 4, 1267, 1985, Power M. D. a další, Science, 231, 1567, 1986, Pearl L. H. a další, Nátuře 329, 351, 1987.

Vynález si klade za úkol navrhnout farmaceutický prostředek pro inhibici reverzní transkriptázy HIV, zejména těch typů uvedeného enzymu, které jsou odolné proti působení jiných látek.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří farmaceutický prostředek pro inhibici reverzní transkripce HIV, který obsahuje benzoxazinonové deriváty obecného vzorce I v dále uvedeném významu. Tyto látky způsobují inhibici reverzní transkriptázy včetně jejích odolných typů, a je tedy možno je použít k prevenci infekce HIV, k léčení již vzniklé infekce virem HIV a k léčení rozvinutého syndromu AIDS a/nebo ARC. Uvedené deriváty je možno použít jako takové nebo ve formě farmaceuticky přijatelných solí, v případě, že je takové soli možno vytvořit.

Podstatu vynálezu tvoří farmaceutický prostředek pro inhibici reverzní transkripce HTV, který obsahuje účinné množství sloučeniny obecného vzorce I

(I),

-1 CZ 289176 B6 kde

X znamená atom halogenu,

X^I znamená trihalogenmethyl, pentahalogenethyl, alkyl nebo alkinyl vždy o 2 až 5 atomech uhlíku, cykloalkyl o 3 až 5 atomech uhlíku nebo aryl ze skupiny fenyl, naftyl, tetrahydronaftyl, bifenyl, fenanthryl, anthryl nebo acenaftyl,

Z znamená atom kyslíku nebo síry,

R znamená

a) alkyl o 1 až 8 atomech uhlíku, nesubstituovaný nebo substituovaný skupinou A, přičemž A znamená atom halogenu, cykloalkyl o 3 až 6 atomech uhlíku, kyanoskupinu, hydroxyskupinu, alkoxyskupinu o 1 až 4 atomech uhlíku, alkinylalkoxyskupinu o 2 až 4 atomech uhlíku v alkinylové části a 1 až 4 atomech uhlíku v alkoxyskupině, aryloxyskupinu, alkylkarbonyl o 1 až 4 atomech uhlíku v alkylové části, dialkylaminoskupinu o 1 až 2 atomech uhlíku v každé alkylové části, alkylaminoalkyl o 1 až 4 atomech uhlíku v alkylaminoskupině a 1 až 2 atomech uhlíku v alkylové části, heterocyklickou skupinu nebo aiylthioskupinu, přičemž aryiové zbytky znamenají fenyl, naftyl, tetrahydronaftyl, bifenyl, fenanthryl, anthryl nebo acenaftyl a heterocyklická skupina je stálý monocyklický zbytek o 5 až 7 členech nebo stálý bicyklický zbytek o 8 až 11 členech, a to nasycený, částečně nenasycený nebo nenasycený a tvořený atomy uhlíku a 1 až 4 heteroatomy ze skupiny N, O a S, přičemž heteroatomy dusíku a síiy jsou popřípadě oxidovány, včetně bicyklických skupin, v nichž je jakýkoliv svrchu definovaný heterocyklický kruh kondenzován s benzenovým kruhem,

b) alkenyl o 2 až 4 atomech uhlíku, nesubstituovaný nebo substituovaný

i) skupinou A nebo ii) arylovou skupinou ve svrchu uvedeném významu, nesubstituovanou nebo substituovanou skupinou A,

c) alkinyl o 2 až 5 atomech uhlíku, nesubstituovaný nebo substituovaný

i) skupinou A nebo ii) arylovou skupinou ve svrchu uvedeném významu, nesubstituovanou nebo substituovanou skupinou A nebo

d) cykloalkyl o 3 až 4 atomech uhlíku, nesubstituovaný nebo substituovaný

i) skupinou A nebo ii) arylovou skupinou ve svrchu uvedeném významu, nesubstituovanou nebo substituovanou skupinou A, jakož i soli těchto sloučenin, přijatelné z farmaceutického hlediska, spolu s farmaceutickým nosičem, za předpokladu, že

i) v případě, že Z znamená atom kyslíku, má X¹ význam, odlišný od trihalogenmethylové nebo pentahalogenethylové skupiny a

-2CZ 289176 B6 ii) v případě, že Z znamená atom kyslíku a R znamená nesubstituovaný alkyl o 1 až 8 atomech uhlíku, má X¹ význam, odlišný od alkylové skupiny o 2 až 5 atomech uhlíku.

Výhodnými sloučeninami jsou zejména dále uvedené sloučeniny 37.2, 4, 2, 5 a 24, v sestupném pořadí výhodnosti uvedených látek. Souhrnně budou vlastnosti těchto látek uvedeny v následující tabulce I. Jde o sloučeniny, jejichž struktura je dále uvedena.

Sloučenina 37,2:

(-)

Cl (-)-6-chlor-4-cyklopropylethinyl-4-trifluormethyl-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-on, běží o nejvýhodnější sloučeninu podle vynálezu.

Sloučenina 4:

Cl (-)

Ν' H (-)-6-chlor-4—fenylethinyl-4-trifluormethyl-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-on.

-3CZ 289176 B6

Sloučenina 2:

(+/-)-6-chlor-4-(2-kyanofenyl)ethinyl-4-( 1,1, l-trifluormethyl)-l ,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-on.

Sloučenina 5:

(+/_y_4_(l-chlor-l,l-difluormethyl)-4--(2-fenyl-2-ethinyl)-6-chlor-l,4-dihydro-2H-3,lbenzoxazin-2-on.

Sloučenina 24:

_zCH₃

-4CZ 289176 B6 (+/-)-4-(2-/dimethylaminomethyl/ethinyl)-4-trifluormethyl-6-chlor-l,4-dihydro-2H-3,lbenzoxazin-2-on.

Výhodné jsou také soli těchto sloučenin, přijatelné z farmaceutického hlediska.

Sloučeniny podle vynálezu jsou specificky uvedeny v následujících tabulkách I a II:

Tabulka I

-5CZ 289176 B6

Měřeno v nM nebo v nanoino I ech/ 1 i tr. P = teplota tání sIoučenI na

-6CZ 289176 B6

Tabulka I - pokrač

Tabulka I - pokrač

(+/-)

-8CZ 289176 B6

-9CZ 289176 B6

Tabulka I - pokrač

-10CZ 289176 B6

S C O o o ó co

u>

O

Tabulka I - pokrač.

o	i co	uí in * ·. co r-	CM Ό·	to	CO -Μ-
Ξ7	co co	^ř	CM CM	CM CM	O O
2		—- T—		CM CM	CM CM

-11CZ 289176 B6

Tabulka I - pokraě

CD CD	o-«-
CD CD	o o
	’Τ“ V*

ID ID	C\J CD
ΤΓ «	r- r*»

-12CZ 289176 B6

Tabulka I - pokrač in a « O O

c
o	o	O
o	o	o
o	o	o
o'	o	o	w
	o	o	O
CO	co	co
Λ	Λ	Λ	Λ

id co

CN ID

CO

U5

r- co	id co	•4 ID	1 CM	CD b-
b- r-	CM CM	CD CO	m ic	CD CD
CN CN	Ύ—	t-		»— T—

c Ή c o >□ □ o m

co co

U) co

CD bCO co

-13CZ 289176 B6

Tabulka 1 - pokrač

Další údaje, týkající se sloučeniny 38 Jsou uvedeny příkladové Části.

- 14CZ 289176 B6

Tabulka

II

-15CZ 289176 B6

Tabulka II - pokrač

-17CZ 289176 B6

Sloučeniny podle vynálezu mohou mít středy asymetrie a mohou se, pokud není uvedeno jinak, vyskytovat jako racemáty, směsi racemátů nebo jednotlivé diastereomery nebo enantiomery, všechny tyto izomemí formy jsou zahrnuty do rozsahu vynálezu. Pod pojmem (+/-) se rozumí optické izomery (+) nebo optické izomery (-) nebo jejich směsi.

V případě, že se skupina v určitém významu, například R vyskytuje v jakékoliv složce nebo v obecném vzorci I více než jednou, je význam jedné z těchto skupin nezávislý na významu při dalším výskytu. Jsou také možné kombinace substituentů a/nebo různých skupin v případě, že jejich výsledkem je stabilní sloučenina.

Pojem „alkyl“ zahrnuje nasycené alifatické uhlovodíkové skupiny s přímým nebo rozvětveným řetězcem s uvedeným počtem uhlíkových atomů. Pojem „alkenyl“ zahrnuje alkylové skupiny s přímým nebo rozvětveným řetězcem, obsahující alespoň jednu meziuhlíkovou dvojnou vazbu. Pojem „alkinyl“ zahrnuje alkylové skupiny s přímým nebo rozvětveným řetězcem, které obsahují alespoň jednu trojnou meziuhlíkovou vazbu. Atomem halogenu se rozumí atomy fluoru, chloru, bromu a jodu.

Pod pojmem „aryl“ se v průběhu popisu, pokud není výslovně uvedeno jinak, rozumí fenyl, naftyl, tetrahydronaftyl, bifenyl, fenanthryl, anthryl nebo acenaftyl.

Heterocyklickou skupinou se v průběhu popisu, není-li výslovně uvedeno jinak, rozumí stálý monocyklický heterocyklický kruh o 5 až 7 členech nebo stálá heterocyklická bicyklická skupina o 8 až 11 členech, a to nasycená, částečně nenasycená nebo nenasycená a obsahující uhlíkové atomy a mimoto 1 až 4 heteroatomy ze skupiny dusík, kyslík a síra, přičemž heteroatomy dusíku a síry jsou popřípadě oxidovány, může také jít o jakoukoliv bicyklickou skupinu, v níž kterýkoliv ze svrchu definovaných heterocyklických kruhů je kondenzován s benzenovým kruhem. Heterocyklický kruh může být vázán na jakýkoliv heteroatom nebo atom uhlíku, pokud vzniká stálá struktura. Příkladem takových heterocyklických skupin mohou být piperidyl, piperazinyl, 2-oxo-piperazinyi, 2-oxopiperidyl, 2-oxopyrrolidinyl, 2-oxoazepinyl, azepinyl, pyrrolyl,

4-piperidonyl, pyrrolidinyl, pyrazolyl, pyrazolidinyl, imidazolyl, imidazolinyl, imidazolidinyl, pyridyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, pyridazinyl, oxazolyl, oxazolidinyl, izoxazolyl, izoxazolidinyl, morfolinyl, thiazolyl, thiazolidinyí, izothiazolyl, chinuklidinyl, izothiazodinyl, indolyl, chinolyl, izochinolyl, benzimidazolyl, thiadiazolyl, benzopyranyl, benzothiazolyl, benzoxazolyl, furyl, tetrahydrofuryl, benzoranyl, tetrahydropyranyl, thienyl, benzothienyl, thiamorfolinyl, thiamorfolinylsulfoxid, thiamorfolinylsulfon a oxadiazolyl.

Sloučeniny podle vynálezu je možno syntetizovat některým z následujících postupů:

-18CZ 289176 B6

Schéma I

pivaloyl chlorid

---------------> methylenchlorid vodný N82CO3

1. 2 eq. n-BuLi/THF/O°C

Z CF₃COOEt/0⁹C

3. 3N HCl/reflux

R-MgBr

THF/0°C krefluxu

1,1 ‘-karbonytóiimidazal

THF/50r

- 19CZ 289176 B6

Při syntéze benzoxazinonových derivátů podle vynálezu zahrnuje obecný postup obvykle jako konečný stupeň cyklizaci na benzenovém jádře, jak je zřejmé ze schématu I. Aminoskupina parachloranilinu je nejprve chráněna například pomocí pivaloylchloridu, čímž se získá sloučenina 5 vzorce 2. Dalšími méně vhodnými ochrannými skupinami na aminoskupině jsou například terc.butoxykarbonyl, acetát nebo izovaleroylová skupina. Pak se přibližně dva ekvivalenty alkyllithia uvedou do reakce se sloučeninou vzorce 2, s výhodou se užije n-butyllithium. Pro tuto reakci není vhodná žádná jiná organokovová sloučenina. Pak se provádí reakce s CF₃COOEt, čímž se získá sloučenina vzorce 3.

io

Syntézu terciárního karbinolu vzorce 4 je možno uskutečnit Grignardovou adicí na keton vzorce 3. Grignardovým reakčním činidlem musí být sůl dvoj vazného kationtu, například kationtu hořečnatého nebo zinečnatého. Jednovazné kationty, například kation lithný nebo sodný jsou nevhodné. Vhodným rozpouštědlem je například tetrahydrofuran nebo ether. Reakci je 15 možno provádět při teplotě 0 °C až teplotě místnosti.

Uzavření kruhu za vzniku sloučenin podle vynálezu vzorce 5 se uskuteční kondenzačními činidly, jako jsou Ι,Γ-karbonyldiimidazol, fosgen, dimethylkarbonát, difenylkarbonát nebo di(paranitrofenyl)karbonát. Cyklizaci je možno uskutečnit kteroukoliv z těchto látek a řadou 20 dalších látek.

Specifické provedení reakce podle schématu I je znázorněno ve schématu IA. Jde o syntézu sloučeniny L-741 211, která je racemátem sloučeniny 37,2, jak bude dále podrobněji popsáno v příkladu 6.

-20CZ 289176 B6

Schéma IA

1. 2 n-BuL/THF

-78 Ό->0 Ό/1 h

2. EtOOCCFa/O °C

3.3N HCI reflux (60%)

(L-741,211)

-21 CZ 289176 B6

Schéma II

Schéma II popisuje jednu z metod pro derivatizaci acetylenového substituentu v poloze 4 benzoxazinového jádra. Sloučeninu vzorce 6 je pak možno metalizovat a pak přidat zinečnatou sůl. Při Heckově reakci se pak užije jako katalyzátor tetrakis(trifenylfosfin)palladium (0) ve formě komplexu s Cul, čímž se získá sloučenina vzorce 7.

Schéma III

Pyrrolidin, paraformaldehyd Cul

--------------------->

Schéma III ilustruje substituci acetylenové skupiny v poloze 4 heterocyklickou skupinou s obsahem dusíku. Mannichova reakce zahrnuje kondenzační reakci formaldehydu s heterocyklickou skupinou, například s pyrrolidinem. Substituce terminálního uhlíkového atomu probíhá v přítomnosti Cul jako katalyzátoru.

-22CZ 289176 B6

Schéma IV

(+/-)

----------------------------->

Et₃N/4-DMAP/CH₂Ci₂

1. chromatografie na silikagelu

--------------------------->

2. K₂CO₃/H₂O/2-propanol

Na schématu IV je znázorněno dělení optických izomerů sloučenin obecného vzorce I nebo II. V tomto příkladu se jako činidlo pro rozdělení užívá kyselina (-) kamfanová. Je možno užít celou řadu dalších činidel včetně chloridu kyseliny O-methyimandlové nebo Mosherova reakčního činidla. Odborníkům bude zřejmé, jak je od sebe možno takové izomery oddělit.

Schéma IVA je specificky upraveno pro dělení L-741211 při izolaci L-743726. Postup je popsán v příkladu 6.

-23CZ 289176 B6

krystalizace z hexanu (90% výtěžek)

-24CZ 289176 B6 n-BuCH/1N HCl/SOO

L-743,726 sloučenina 37,2

PCI₅

t-BuOK/DMSO

(42%)

Cyklopropylacetyien se ve schématu V připravuje podle známých postupů, například popsaných 5 v C. E. Hudson a další, J. Am. Chem. Soc., 94, 1158, 1972 a W. Schoberth a další, Synthesis, 703,1972.

Sloučeniny podle vynálezu je možno využít při pokusech, při nichž se sleduje účinnost protivirových sloučenin. Sloučeniny podle vynálezu je například možno použít při izolaci mutant io enzymů, které jsou pak velmi vhodné pro hledání nových protivirových sloučenin. Mimoto je možno sloučeninu podle vynálezu využít k vyhledání a určení vazných míst jiných protivirových látek, účinných proti reverzní transkriptáze HTV, například pomocí kompetitivní inhibice.

-25CZ 289176 B6

Uvedené látky budou proto velmi vhodné jako běžně dodávané komerční produkty pro tyto účely.

Sloučeniny podle vynálezu jsou schopné způsobit inhibici reverzní transkriptázy HIV a je tedy možno je použít také k prevenci nebo k léčení infekce virem lidské imunodeficience, HIV a k léčení patologických stavů, vzniklých v důsledku této infekce, jako je například syndrom AIDS. Léčení AIDS nebo prevence nebo léčení infekce HTV je obvykle definováno jako léčení široké škály stavů, jimiž prochází postupně organismus po infekci HIV. Jde o syndromy AIDS, ARC (komplex, příbuzný AIDS), a to bez příznaků nebo s již vyvinutými příznaky, může také jít o vystavení infekci HIV nebo o hrozbu této možnosti. Sloučeniny podle vynálezu je tedy možno použít například u lidí, u nichž je důvodné podezření, že byli vystaveni působení viru HTV například při krevní transfuzi, při výměně tělních tekutin, při pokousání, náhodném poranění injekční jehlou nebo v případě lékařů může jít o náhodný styk s krví nemocného v průběhu chirurgického zákroku.

Zvláštní výhodou sloučenin podle vynálezu je skutečnost, že tyto látky jsou schopné způsobit inhibici reverzní transkriptázy HIV i v případě těch typů, které jsou odolné proti jiným protivirovým látkám, jako je sloučenina L-697 661, 3-(/(4,7-dichlor-l,3-benzoxazol-2-yl)methyl/amino)-5-ethyl-6-methylpyridin-2-(lH)-on nebo L-696 229,3-/2-( l,3-benzoxazol-2yl)ethyl/-5-ethyl-6-methylpyridin-2-(lH)-on, čili AZT.

K. uvedenému účelu je možno sloučeniny podle vynálezu podávat perorálně, parenterálně (včetně injekcí podkožních, nitrožilních, nitrosvalových, intrastemálních nebo včetně různých infuzi), inhalací ve formě spreje nebo rektálně. Farmaceutické prostředky s obsahem těchto látek mohou obsahovat běžné netoxické, z farmaceutického hlediska přijatelné nosiče, pomocné látky nebo nosná prostředí.

Takto získané farmaceutické prostředky je tedy možno použít k léčení infekcí virem HIV a syndromu AIDS. Toto léčení spočívá vtom, že se nemocným podávají farmaceutické prostředky, které obsahují farmaceutický nosič a účinné množství sloučeniny podle vynálezu.

Tyto farmaceutické prostředky mohou mít formu suspenzí nebo tablet pro perorální podání, sprejů pro podání do nosu, sterilních injekčních prostředků, například sterilních suspenzí ve vodě nebo v oleji pro injekční podání, nebo může také jít o čípky.

Při perorálním podání ve formě suspenze je možno farmaceutické prostředky podle vynálezu připravit postupy, které jsou v boru známé, suspenze může obsahovat mikrokrystalickou celulózu pro zvětšení objemnosti, kyselinu alginovou nebo alginát sodný jako činidla pro vznik suspenze, methylcelulózu pro zvýšení viskozity a známá sladidla nebo jiné látky pro úpravu chuti. V případě tablet s okamžitým uvolněním účinné látky mohou tyto tablety obsahovat mikrokrystalickou celulózu, hydrogenfosforečnan vápenatý, škrob, stearan hořečnatý a laktózu a/nebo další pomocné látky, pojivá, látky pro zahuštění, dezintegrační činidla, ředidla a kluzné látky, tak jak se běžně užívají.

V případě, že jsou účinné látky určeny k podávání do nosu ve formě aerosolu nebo inhalací, mohou tyto prostředky rovněž být připraveny známým způsobem, například ve formě roztoků ve fyziologickém roztoku chloridu sodného, při použití benzylalkoholu nebo jiných vhodných konzervačních činidel, látek, napomáhajících vstřebávání ke zvýšení biologické dostupnosti, fluorovaných uhlovodíků a/nebo dalších běžných solubilizačních nebo dispergačních činidel.

Injekční roztoky nebo suspenze mohou být rovněž připravovány známým způsobem při použití vhodných netoxických pro parenterální podání přijatelných ředidel nebo rozpouštědel, jako je mannitol, 1,3-butandiol, voda, Ringerův roztok nebo izotonický roztok chloridu sodného, je také možno použít vhodná dispergační činidla, smáčedla a činidla pro vznik suspenze, například

-26CZ 289176 B6 sterilní čištěné oleje včetně syntetických mono- nebo diglyceridů, s výhodou stabilizovaných nebo nasycených alifatických kyselin včetně kyseliny olejové.

V případě rektálního podání ve formě čípků je tyto prostředky možno připravovat tak, že se účinná látka smísí s vhodnými nedráždivými pomocnými látkami, jako jsou kakaové máslo, syntetické glyceridy nebo polyethylenglykoly, které se při běžných teplotách nacházejí v pevném stavu, avšak při teplotě v konečníku jsou zkapalněny a/nebo se rozpouštějí a uvolní účinnou látku.

V případě podání člověku je možno sloučeniny podle vynálezu podávat perorálně v rozmezí dávek 1 až 100 mg/kg hmotnosti rozděleně na jednotlivé dávky. Výhodné rozmezí je například 0,1 až 10 mg/kg perorálně v rozdělených dávkách. Další výhodné rozmezí je 0,1 až 20 mg/kg při perorálním podání rozděleně na jednotlivé dávky. Při kombinačním léčení s použitím nukleosidových analogů je výhodné rozmezí dávek 0,1 až 20 mg/kg v případě sloučenin podle vynálezu při perorálním podání rozděleně na jednotlivé dávky a 50 mg až 5 g/kg hmotnosti pro nukleosidové analogy při perorálním podání rozděleně na jednotlivé dávky. Je však zřejmé, že specifické dávky a častost jejich podání se může u jednotlivých nemocných měnit, tyto faktoiy mohou záviset na účinnosti zvolené sloučeniny, na její metabolické stálosti a délce jejího působení, na věku, hmotnosti, celkovém zdravotním stavu a pohlaví nemocného, na způsobu jeho stravování, na způsobu a době podání, rychlosti vylučování, na použité kombinaci účinných látek a na závažnosti léčeného stavu.

Podstatu vynálezu tvoří rovněž kombinace inhibitorů reverzní transkriptázy HIV s jednou nebo větším počtem látek, které se rovněž užívají pro léčení syndromu AIDS. Je například možno sloučeniny podle vynálezu podat před infekcí a/nebo po infekci v kombinaci s účinným množstvím protivirových látek proti AIDS, spolu s imunomodulátory, protiinfekčními látkami nebo různými vakcínami, tak jak jsou souhrnně uvedeny v následující tabulce.

Tabulka

Protivirové látky název látky	výrobce	indikace
AL-721	Ethigen (Los Angeles, CA)	ARC, PGL, HIV pozitivita, AIDS
rekombinantní lidský interferon beta	Triton Biosciences (Almeda, CA)	AIDS, Kaposiho sarkom, ARC
Acemannan	Carrington Labs (Irving, TX)	ARC (viz také imunomodulátory)
Cytovene	Syntex (Palo Alto, CA)	CMV, ohrožující Zrak
Ganciclovir	Syntex	periferní retinitis CMV
d4T, didehydrodeoxythymidin	Bristol-Myers (New York. NY)	AIDS, ARC
ddl, dideoxyinosin	Bristol-Myers (New York, NY)	AIDS, ARC

-27CZ 289176 B6

EL10	Elán Corp., PLC (Gainesville, GA)	infekce HTV, (viz také imunomodulátoiy)
fosfonomravenčan sodný	Astra Pharm. Products, lne. (Westborough, MA)	CMV retinitis, infekce HIV, jiné infekce CMV
dideoxycytidin, ddC	Hoffman-La Roche (Nutley,NJ)	AIDS, ARC
Novapren	Novaferon Labs, lne. (Akron, OH) Diapren, lne. (Roseville, MN, dodavatel)	inhibitor HTV
peptid T, oktapeptidový řetězec	Peninsula Labs (Belmont, CA)	AIDS
Zidovudin, AZT	Buroughs Wellcome (Rsch. Triangle Park, NC)	pokročilý AIDS, ARC, AIDS dětí, Kaposiho sarkom.

HTV bez příznaků, mírnější HTV, neurologické příznaky, kombinační léčba

Ansamycin LM-427	Adria Laboratories (Dublin, OH) Erbamont (Stamford, CT)	ARC
dextransulfát	Ueno Fine Chem. Ind. Ltd. (Osaka, Japonsko)	AIDS, ARC, HIV pozitivní, bez příznaků
Virazol Ribavirin	Viratek/ICN (Costa Mesa, CA)	pozitivní HTV bez příznaků, LAS, ARC
Alfa-interferon	Burroughs Wellcome (Rsch. Triangle Par, NC)	Kaposiho sarkom, HIV při kombinaci w/retrovir
Acyclovir	Burroughs Wellcime	AIDS, ARC, HIV

pozitivní bez příznaků, v kombinaci s AZT protilátky, neutralizující pH-labilní, alfa-aberantní interferon v imunoadsorpčním sloupci

Advanced Biotherapy

Concepts (Rockville, MD)

AIDS, ARC

-28CZ 289176 B6

L-697 661

Měrek (Rahway, NJ)

L-696 229

Měrek (Rahway, NJ)

L-735 524

Měrek (Rahway, NJ)

AIDS, ARC, HIV pozitivní bez příznaků, též v kombinaci s AZT

AIDS, ARC, HIV pozitivní bez příznaků, též v kombinaci s AZT

AIDS, ARC, HIV pozitivní bez příznaků, též v kombinaci s AZT

Imunomodulátory

AS-101	Wyeth-Ayerst Labs. (Philadelphia, PA)	AIDS
Bropirimin	Upjohn (Kalamazoo, MI)	pokročilý AIDS
Acemannan	Carrington Labs, lne. (Irving, TX)	AIDS, ARC (viz také protivirové látky)
CL 246 738	Američan Cyanamid (Pearl Tiver,NY) Lederle Labs (Wayne, NJ)	AIDS, Kaposiho sarkom
EL 10	Elán Corp, PLC (Gainesville, GA)	infekce HTV (viz také protivirové látky)
Gamma interferon	Genentech (S. San Francisco, CA)	ARC v kombinaci w/TNF (faktor nekrózy nádorů)
faktor stimulující kolonie granulocytů makrofágů	Genetics Institute (Cambridge, MA) Sandoz (East Hannover, NJ)	AIDS
faktor stimulující kolonie granulocytů makrofágů	Hoechst-Roussel (Somerville, NJ) Immunex (Seattle, WA)	AIDS
faktor stimulující kolonie granulocytů makrofágů	Schering-Plough (Madison, NJ)	AIDS

-29CZ 289176 B6

imunostimulační částice jádra HTV	Rorer (Ft. Washington, PA)	AIDS, v kombinaci w/AZT, seropozitivní HTV
IL-2 Interleukin-2	Hoffman-La Roche (Nutley, NJ) Immunex	AIDS, ARC, HIV v kombinaci s w/AZT
nitrožilní imunoglobulin (lidský)	Cutter Biological (Berkeley, CA)	AIDS u dětí, v kombinaci w/AZT
IMREG-1	Imreg (New Orleans, LA)	AIDS, Kaposiho sarkom, ARC, PGL
IMREG-2	Imreg (New Orleans, LA)	AIDS, Kaposiho sarkom, ARC, PGL
Imuthiol, diethyldithiokarbamát	Merieux Institute (Miami, FL)	AIDS, ARC
Alfa-2-interferon	Schering Plough (Madison, NJ)	Kaposiho sarkom w/AZT:AIDS
methionin-enkefalin	(TNI Pharmaceutical (Chicago, IL)	AIDS, ARC
MTP-PE Muramyltripeptid	Ciba-Geigy, Corp. (Summunt, NJ)	Kaposiho sarkom
faktor, stimulující kolonie granulocytů	Amgen (Thousand Oaks, CA)	AIDS, v kombinaci w/AZT
rCD4, rekombinantní rozpustný lidský CD4	Genentech (S. San Francisco, CA)	AIDS, ARC
rekombinantní rozpustný lidský CD4	Biogen (Cambridge, MA)	AIDS, ARC
interferon alfa 2a	Hoffman-La Roche (Nutley, NJ)	Kaposiho sarkom, AIDS, ARC v kombinaci w/AZT
SKaF106528 rozpustný T4	Smith, Kline a French Laboratories (Philadelphia, PA)	Infekce HIV
Thymopentin	Immunobiology Research Institute (Annandale, NJ)	infekce HTV
faktor nekrózy nádorů, TNF	Genentech (S. San Francisco, CA)	ARC, v kombinaci w/gamma interferon

-30CZ 289176 B6

Antiinfekční látky
Clindamycin s Primaquinem	Upjohn (Kalamazoo, MI)	PCP
Fluconazole	Pfizer (New York, NY)	kryptokoková meningitis, kandidiáza
nystatikové pastilky	Squibb Corp. (Princeton, NJ)	prevence orální kandidiázy
Omidyl, Eflomithin	Merrell Dow (Cincinnati, OH)	PCP
Pentamidin Isethionate (IM a IV)	LyphoMed (Rosemont, IL)	léčení PCP
Piritrexim	Burroughs Wellcome (Rsch. Triangle Park,NC)	léčení PCP
Pentamidinisethionát pro inhalaci	Fisons Corporation (Bedford, MA)	profylaxe PCP
Spiramycin	Rhone-Poulenc Pharmaceuticals (Princeton, NJ)	kryptosporidiální průjem
Intraconazol R51211	Jansen Pharm. (Piscataway, NJ)	histoplasmóza, kryptokoková meningitis
Trimetrexat	Wamer-Lambert	PCP
Jiné látky
rekombinantní lidský erythropoetin	Ortho Pharm. Corp. (Raritan, NJ)	těžká anemie při léčbě AZT
Megestrolacetát	Bristol-Myers (New York, NY)	léčení anorexie spojené s AIDS
celková enterální výživa	Norwich Eaton Pharmaceuticals (Norwich, NY)	průjem a malabsorpce při AIDS

Je zřejmé, že kombinace sloučenin podle vynálezu s protivirovými prostředky, užívanými při AIDS, s imunomodulátoiy, protiinfekčními látkami nebo vakcínami nemohou být omezeny na sloučeniny ze svrchu uvedené tabulky. V principu je možno užít jakoukoliv kombinaci 5 s jakýmkoliv prostředkem, který může příznivě ovlivnit příznaky AIDS. Například je možno sloučeniny obecného vzorce I nebo II podávat v kombinaci s analogem nukleosidu se známou biologickou účinností proti reverzní transkriptáze HTV. Příslušné nukleosidové analogy obvykle způsobují ukončení řetězce, jde například o AZT, ddC, ddl, D4T, HEPT a 3'-fluor-2',3'-dideoxythymidin.

-31 CZ 289176 B6

AZT je možno připravit podle publikací J. P. Horwitz a další, J. Org. Chem., 29, 2076, 1964,

R. P. Glinski a další, J. Org. Chem., 38, 4299, 1973, C. K. Chu a další, Tetrahedron Letters,

29, 5349, 1988. Podávání AZT jako účinné látky při léčení AIDS bylo popsáno v US 4 724 232.

Sloučenina ddC se připravuje podle publikací J. P. Horwitz a další, J. Org. Chem., 32, 817,1967, R. Marumoto, Chem. Pharm. Bull., 22, 128, 1974 a T. S. Lin a další, J. Med. Chem., 30, 440, 1987.

D4T je možno připravit podle publikace Herdewijn P. a další, J. Med. Chem., 30, 1270,1987.

HEPT se připravuje podle Miyasaka T. a další, J. Med. Chem., 32, 2507, 1989 a A. Rosowsky, J. Med. Chem., 24, 1177, 1981. Syntéza ddC, ddl a AZT je rovněž popsána v evropském patentovém spisu č. 484 071.

Svrchu uvedený 3'-fluor-2',3'-dideoxythymidin je možno syntetizovat podle publikace Herdewijn P. a další, J. Med. Chem., 30, 1270, 1987. Sloučenina L-735524 je chemicky N-(2(R)-hydroxy-l(S)-indanyl)-2(R)-fenylmethyl-4(S)-hydroxy-5-(l-(4—(3-pyridylmethyl)2(S)-N'-(terc.butylkarboxamido)piperazinyl))pentanamid, použít je možno také soli této látky, přijatelné z farmaceutického hlediska. L-697661, nebo také pouze „661“ je chemicky 3-(/(4,7dichlor-1,3-benzoxazol-2-yl)methyl/amino)-5-ethyl-6-methylpyridin-2( 1 H)-on, L-696229 je chemicky 3-/2-( 1,3-benzoxazol-2-yl)ethyl/-5-ethy l-6-methylpyridin-2-( 1 H)-on. Syntéza těchto látek je popsána v EP 487 071 a 462 800.

Výhodnými kombinacemi jsou současné, přerušované nebo střídavé podávání L-743726 a inhibitoru proteázy HIV. Případnou třetí složkou v této kombinaci může být nukleosidový inhibitor reverzní transkriptázy HIV, jako AZT, ddC nebo ddl. Výhodným inhibitorem proteázy HIV je L-735524, dalšími výhodnými inhibitory reverzní transkriptázy HTV mohou být sloučeniny typu L-697661. Uvedené kombinace mají synergní účinek při omezení postupu HTV. Výhodné kombinace jsou: 1) L-743726, L-735524 a popřípadě L-697661, AZT, ddl nebo ddC a 2) L-743726 a L-697661, AZT, ddl nebo ddC. Kombinace zahrnují rovněž farmaceuticky přijatelné soli.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 (+/-)-4-( 1,1,1-Trifluormethy 1)-4-( l-butan-4-yl)-6-chlor-l ,4-dihydro-2H-3,1-benzoxazin2-on (sloučenina 15)

Stupeň A: N-(4-Chlorfenyl)-2,2-dimethylpropanamid

Do baňky s okrouhlým dnem, s objemem 5 litrů, opatřené třemi hrdly a míchadlem se uloží 127,57 g, 1 mol 4-chloranilinu, 1200 ml chloroformu a 1200 ml nasyceného vodného roztoku uhličitanu sodného. K baňce se připojí nálevka, do níž se uloží 129 ml, 1,05 mol 2,2-dimethylpropanoylchloridu. Tento chlorid se pak za energického míchání v průběhu jedné hodiny po kapkách přidává do reakční směsi. Výsledná směs se míchá při teplotě místnosti ještě 23 hodin. Ze směsi se vyloučí určitý podíl produktu ve formě bílých krystalků. Tyto krystalky se odfiltrují. Filtrát se přenese do dělicí nálevky a vrstvy se oddělí. Chloroformová vrstva se promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného. Pak se vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu, čímž se získá další podíl produktu. Oba dva podíly produktu se spojí a produkt se nechá překiystalovat z vroucí směsi ethylacetátu a hexanů, čímž se získá 185,6 gN-(4-chlorfenyl)-2,2-dimethylpropanamidu ve formě bílé krystalické pevné látky.

-32CZ 289176 B6

Stupeň B: l-(2-Amino-5-chlorfenyl)-2,2,2-trifluorethanon

Do baňky s okrouhlým dnem s objemem 3 litry se třemi hrdly, míchadlem a vstupem pro argon se po vysušení v sušicí peci vsune kapací nálevka s objemem 500 ml, rovněž vysušená v sušicí peci a pomocí této nálevky se přidá 100 g 472 mmol N-(4-chlorfenyl)-2,2-dimethylpropanamidu a 1 litr bezvodého THF. Tento roztok se zchladí na ledové lázni na 0 °C a do nálevky se uloží 387 ml, 968 mmol 2,5 M roztoku n-butyllithia v hexanech. Roztok n-butyllithia se v průběhu 1 hodiny po kapkách pomalu přidává k roztoku amidu, přičemž teplota se udržuje pod +5 °C. Výsledný roztok se nechá 1 hodinu stát při teplotě 0 °C, v průběhu této doby se vytvoří oranžová sraženina. K výsledné směsi se přidá 115 ml, 968 mmol ethyl-l,l,l-trifluoracetátu po kapkách v průběhu 1 hodiny. Výsledný čirý roztok se nechá ještě 30 minut stát a pak se reakce zastaví přidáním 5% vodné kyseliny chlorovodíkové. Pak se směs zředí 1 litrem ethylacetátu a vrstvy se oddělí. Organická fáze se promyje nasyceným roztokem chloridu sodného, vysuší se síranem hořečnatým, zfiltruje a odpaří ve vakuu, čímž se získá 160 g žlutého oleje. Tento materiál se uvede do suspenze v 1 litru 3N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové a roztok se 24 hodin zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem. Po zchlazení se roztok zředí 1 litrem ethylacetátu a směs se alkalizuje koncentrovaným hydroxidem amonným. Vrstvy se oddělí, organická fáze se promyje nasyceným roztokem chloridu sodného, vysuší se síranem hořečnatým, zfiltruje, odpaří ve vakuu a chromatografuje na 1,5 kg silikagelu při použití 15% ethylacetátu v hexanu jako elučního činidla. Materiál po chromatografií se nechá překrystalovat z vroucího hexanu, čímž se ve výtěžku 54 % získá 57 g čistého l-(2-amino-5-chlorfenyl)-2,2,2trifluorethanonu ve formě jasně žlutých krystalků s teplotou tání 91 až 92 °C.

‘H-NMR (CDC1₃): 6,46 (br, s, 2H), 6,69 (d, 1H, J = 9,2Hz), 7,32 (dd, 1H, J = 9,2Hz), 7,70 (d, 1H, J = 2,4 Hz).

Stupeň C: (+/-)-2-(2-Amino-5-chlorfeny!)-l,l,l-trifluor-5-hexen-2-ol

Do baňky s okrouhlým dnem s objemem 300 ml se třemi hrdly, vysušené v sušicí peci a opatřené míchadlem, vstupem pro argon, kapací nálevkou a zpětným chladičem se přidá 3,03 g, 125 mmol hořčíkových hoblin a 75 ml bezvodého tetrahydrofuranu. K. této směsi se za energetického míchání přidá 12,0 ml, 118,21 mmol 4—brom-l-butenu takovou rychlostí, aby se směs mírně vařila pod zpětným chladičem. Po skončeném přidávání se směs nechá 30 minut stát a pak se zchladí v ledové lázni na 0 °C. Pak se ke směsi za energického míchání přidá roztok 5,00 g, 22,36 mmol l-(2-amino-5-chlorfenyl)-2,2,2-trifluorethanonu ve 35 ml THF po kapkách v průběhu 30 minut. Pak se chladicí lázeň odstraní a směs se míchá 20 hodin při teplotě místnosti. Reakční směs se pak zředí ethylacetátem a 10% vodným roztokem kyseliny citrónové a pak se míchá ještě 4 hodiny. Pak se vrstvy oddělí a organická fáze se promyje vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasyceným vodným roztokem chloridu sodného. Pak se směs vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a produkt se chromatografuje při použití 300 g silikagelu a 15% ethylacetátu v hexanu jako elučního činidla, čímž se získá 4,80 g (+/-)-2-(2-amino-5-chlorfenyl)-l,l,l-trifluor-5-hexen-2-olu ve formě žluté pevné látky.

Stupeň D: (+/-)-4-( 1,1, l-Trifluormethyl)-4-( l-buten-4-yl)-6-chlor-l ,4-dihydro-2H-3,1benzoxazin-2-on

Do baňky s okrouhlým dnem s objemem 200 ml, opatřené míchadlem, vstupem pro argon a zpětným chladičem se vloží 4,80 g, 17,16 mmol (+/-)-2-(2-amino-5-chlorfenyl)-l,l,l-trifluor-5-hexen-2-olu, 13,91 g, 85,81 mmol l,l'-karbonyldiimidazolu a 75 ml bezvodého tetrahydrofuranu. Tato směs se zahřívá 18 hodin na 60 °C. Zchlazená reakční směs se zředí ethylacetátem a roztok se promyje 3 x 200 ml vody a pak 250 ml nasyceného roztoku chloridu sodného. Pak se roztok vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje, rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a produkt se nechá překrystalovat z vroucí směsi ethylacetátu a hexanu, čímž se získá 3,22 g

-33CZ 289176 B6 (+/-)-4-(1,1, l-trifluormethyl)-4-( l-buten-4-yl)-6-chlor-l ,4-dihydro-2H-3, l-benzoxazin-2onu ve formě bílé krystalické pevné látky s teplotou tání 165 až 166 °C.

'H-NMR (CDCIj): 1,99 (m, 1H), 2,09-2,40 (m, 3H), 5,00 (d, 1H, J= 1,4 Hz), 5,03 (dd, 1H, J = 1,4, 7,9 Hz), 5,78 (m, 1H), 6,85 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 7,21 (široký s, 1H), 7,35 (dd, 1H, J = 2,2 a 8,6 Hz), 9,63 (široký s, 1H).

Příklad 2 (+/-)-6-Chlor-4-ethinyl-4-( 1,1, l-trifluormethyl)-l ,4-dihydro-2H-3, l-benzoxazin-2-on (sloučenina 26)

Stupeň A: 2-(2-Amino-5-chlorfenyl)-l,l,l-trifluor-3-butin-2-ol

Do baňky s okrouhlým dnem s objemem 500 ml, se třemi hrdly, opatřené kapací nálevkou, přívodem pro argon, míchadlem a digitálním teploměrem se vloží 268 ml, 0,5 M roztoku ethinylmagneziumbromidu, to znamená 134 mmol této látky a baňka se zchladí na -78 °C. Pak se po kapkách přidá roztok 6,0 g, 26,8 mmol l-(2-amino-5-chlorfenyl)-2,2,2-trifluorethanonu v 50 ml THF v průběhu 15 minut, v průběhu přidávání se teplota udržuje na teplotě -55 °C nebo nižší. Pak se reakční směs míchá 16 hodin po pomalém zteplání na teplotu místnosti. K tmavě červeně zbarvenému roztoku se při teplotě -5 °C po kapkách přidá 60 ml nasyceného vodného roztoku chloridu amonného k zastavení reakce. Pak se směs extrahuje ethylacetátem, roztok se promyje 10% kyselinou citrónovou, nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného, po vysušení roztoku síranem sodným, filtraci a odpaření se získá 8,5 g surového produktu. Produkt se čistí rychlou chromatografií při použití 15 až 20% ethylacetátu v hexanu, čímž se ve výtěžku 75 % získá 5 g čistého 2-(2-amino-5chlorfenyl)-l, 1, l-trifluor-3-butin-2-olu ve formě světle hnědého oleje.

Stupeň B: (+/-)-6-Chlor-4-ethinyl-4-( 1,1, l-trifluormethyl)-l,4—dihydro-2H-3,1-benzoxazin2-on

Roztok 5,0 g, 20,0 mmol 2-(2-amino-5-chlorfenyl)-l,l,l-trifluor-3-butin-2-olu ve 225 ml THF se smísí se 13,0 g, 80,0 mmol l,l'-karbonyldiimidazolu a směs se zahřívá v olejové lázni 17 hodin na teplotu 60 °C. Pak se THF odpaří ve vakuu, odparek se rozpustí v ethylacetátu, roztok se promyje 10% kyselinou citrónovou, roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného, vysuší se síranem sodným, zfíltruje a odpaří ve vakuu. Tímto způsobem se získá 3,6 g surového produktu, kteiý se nechá překiystalovat ze směsi ethylacetátu a hexanu. Tímto způsobem se ve výtěžku 3,22 g získá (+/-)-6-chlor-4-ethinyl-4(l,l,l-trifluormethyl)-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazim-2-onu ve formě bílé pevné krystalické látky s teplotou tání 226 až 227 °C.

‘H-NMR (CDC1₃ + stopy DMSO): 3,16 (s, 1H), 6,98 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,35 (m, 1H), 7,51 (s, 1H), 10,66 (s, 1H).

Příklad 3 (+/-)-6-Chlor-4-( 1,1, l-trifluormethyl)-4-/(3-( I-pyrrolidinyl))-l-propinyl/-l ,4-dihydro-2H3,l-benzoxazin-2-on (sloučenina 27)

Roztok 150 mg, 0,544 mmol (+/-)-6-chlor-4-ethinyl-4-(l,l,l-trifluormethyl)-l,4-dihydro2H-3,l-benzoxazin-2-onu, 52,2 mikrolitrů, 0,626 mmol pyrrolidinu, 20,5 mg, 0,681 mmol paraformaldehydu, 31,1 mikrolitrů, 0,544 mmol kyseliny octové a 20,5 mg, 0,207 mmol chloridu měďného ve 3,5 ml dioxanu se zahřívá přibližně 2 hodiny na olejové lázni s teplotou 50 °C. Pak

-34CZ 289176 B6 se reakční směs vlije do 2N kyseliny chlorovodíkové k zastavení reakce a směs se extrahuje ethylacetátem. Vodná vrstva se neutralizuje pevným uhličitanem draselným a třikrát se extrahuje ethylacetátem. Extrakty se spojí, promyjí se vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného, načež se vysuší síranem sodným, po odpaření se získá 140 mg surového produktu. Po chromatografickém čištění na silikagelu a po překrystalování ze směsi ethylacetátu a hexanu se ve výtěžku 46% získá 89 mg krystalického (+/-)-6-chlor-4-( 1,1,1 -trifluormethyl)-4-/(3-( 1-pyrrolidinyl))-l-propinyl/-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-onu s teplotou tání 160 až 161 °C za rozkladu.

'H-NMR (CDC1₃): 1,85 - 1,89 (m, 4H), 2,68-2,71 (m, 4H), 3,67 (s, 1H), 6,88 (d, J = 8,55 Hz, 1H), 7.40 (dd, J = 2,19, 8,54 Hz, 1H), 7,55 (s, 1H), 9,45 (s, 1H).

(+/-)-6-Chlor-4-(2-kyanofenyl)ethinyl-4-( 1,1, l-trifluormethyl)-l ,4-dihydro-2H-2,1-benzoxazin-2-on (sloučenina 2)

Roztok 138 mg, 0,5 mmol 6-chlor-4-ethinyl-4-(l,l,l-trifluormethyl)-l,4-dihydro-2H-3,lbenzoxazin-2-onu ve 3 ml bezvodého THF se míchá při teplotě -78 °C a současně se přidává 0,4 ml, 2,5 N roztoku n-butyllithia v hexanu, to znamená 1,0 mmol této látky. Anion se nechá vytvářet 10 minut při teplotě -78 °C a pak se přidá 1 ml 1 M roztoku chloridu zinečnatého v etheru. Reakční směs se míchá ještě 15 minut při teplotě -78 °C, pak se chladicí lázeň odstraní a směs se nechá v průběhu 30 minut pomalu zteplat na teplotu 0 °C. Pak se k reakční směsi přidá roztok 149 mg, 0,65 mmol 2-jodbenzonitrilu ve 2 ml THF a pak ještě 56 mg, 0,05 mmol tetrakis(trifenylfosfm)palladia(0). Reakční směs se nechá zteplat na teplotu místnosti a při ní se míchá ještě 15 hodin. Pak se reakce zastaví přidáním 10 ml 2 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, extrahuje se 2 x 200 ml ethylacetátu, extrakty se spojí, promyjí se vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného a vysuší se síranem hořečnatým. Pak se rozpouštědlo odpaří, čímž se získá 195 mg oleje, který se podrobí rychlé chromatografii na silikagelu při použití 20% ethylacetátu v hexanu, čímž se získá 60 mg nezreagovaného výchozího materiálu a 35 mg navázaného produktu. Navázaný produkt se rozetře s etherem, čímž se získá 25 mg (+/-)-6-chlor-4-(2kyanofenyl)ethinyl-4-( 1,1,l-trifluormethyl)-l,4-dihydro-3H-3,l-benzoxazin-2-onu s teplotou tání 245 až 246 °C.

Hmotové spektrum FAB: Μ + 1 = 377 m/e.

'H-NMR (CDClj): 6,82-6,85 (d, J= 8,5 Hz, 1H), 7,40-7,44 (dd, J= 2,1 a 8,5 Hz, 1H), 7,56 - 7,79 (m, 5H, 8,00 (s, 1H).

Příklad 4 (+/—)—4—(1—Chlor—1, l-difluormethyl)-4-(2-fenylethinyl)-6-chlor-l ,4-dihydro-2H-3,1-benzoxazin-2-on (sloučenina 5)

Stupeň A: l-(2-Amino-5-chlorfenyl)-2-chlor-2,2-difluorethanon

Do baňky s okrouhlým dnem s objemem 300 ml se třemi hrdly, vysušené v sušicí peci a opatřené magnetickým míchadlem, přívodem pro argon a kapací nálevkou s obsahem 100 ml, rovněž vysušenou v sušicí peci, se přidá roztok lOg, 47,2 mmol N-(4-chlorfenyl)-2,2-dimethylpropanamidu ve 100 ml bezvodého THF. Roztok se zchladí v ledové lázni na 0 °C a do přidávací nálevky se uloží 38,7 ml, 2,5 M roztoku n-butyllithia v hexanech, to znamená 96,8 mmol této látky. Tento roztok se pak pomalu v průběhu 1 hodiny po kapkách přidá k roztoku amidu, přičemž teplota se udržuje na hodnotě nižší než +5 °C. Vzniklý roztok se nechá jednu hodinu stát při teplotě 0 °C, v průběhu této doby se vytvoří oranžová sraženina. Ke směsi se přidá ethyl—1— chlor-l,l-difluoracetát. Užije se 10,2 ml, 96,8 mmol tohoto roztoku a roztok se přidává po kapkách v průběhu 15 minut. Výsledný čirý roztok se nechá stát dalších 30 minut. Pak se reakce

-35CZ 289176 B6 zastaví přidáním 5% vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové. Směs se zředí 1 litrem ethylacetátu a vrstvy se oddělí. Organická fáze se promyje nasyceným roztokem chloridu sodného, vysuší se síranem hořečnatým, zfiltruje a odpaří ve vakuu, čímž se získá 160 g žlutého oleje. Tento materiál se uvede do suspenze ve 200 ml 3N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové a roztok se 24 hodin vaří pod zpětným chladičem. Pak se roztok zchladí, zředí se 500 ml ethylacetátu a směs se alkalizuje koncentrovaným hydroxidem amonným. Vrstvy se oddělí, organická fáze se promyje nasyceným roztokem chloridu sodného, vysuší se síranem hořečnatým, zfiltruje, odpaří ve vakuu a chromatografúje na 350 g silikagelu při použití 15% ethylacetátu v hexanu jako elučního činidla. Po chromatografii se produkt nechá překrystalovat z vroucího hexanu, čímž se získá 5,5 g čistého l-(2-amino-5-chlorfenyl)-2-chlor-2,2difluorethanonu ve formě jasně žlutých krystalků s teplotou tání 55 až 56 °C.

'H-NMR (CDC1₃): 6,43 (široký s, 2H), 6,69 (d, IH, J = 9,0 Hz), 7,31 (dd, IH, J = 2,4 a 9,0 Hz), 7,80 (d, IH, J = 2,4 Hz).

Stupeň B: (+/-)-2-(2-Amino-5-chlorfenyl)-4-fenyl-l-chlor-1,l-difluor-3-butin-2-ol

Do baňky s okrouhlým dnem s objemem 100 ml se třemi hrdly, vysušené v sušicí peci a opatřené míchadlem, přívodem pro argon, zpětným chladičem a přepážkou se přidá 2,13 g, 20,83 mmol ethinylbenzenu, 50 ml bezvodého THF a 6,94 ml, 3,0 M roztoku ethylmagneziumbromidu v etheru. Tato směs se nechá stát 2 hodiny při teplotě místnosti a pak se pomocí injekční stříkačky přidá roztok 1,00 g, 4,17 mmol l-(2-amino-5-chlorfenyl)-2-chlor-2,2-difluorethanonu v 6 ml THF. Výsledný oranžověčervený roztok se míchá 21,5 hodin při teplotě místnosti. Pak se reakce zastaví přidáním 50 ml 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, reakční směs se zředí ethylacetátem, roztok se alkalizuje koncentrovaným hydroxidem amonným a vrstvy se oddělí. Organická fáze se promyje vodou a nasyceným vodným roztokem chloridu sodného. Pak se organická fáze vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje se a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Odparek se chromatografúje na silikagelu při použití 20% ethylacetátu v hexanu jako elučního činidla, čímž se získá 1,02 g (+/-)-2-(2-amino-5-chlorfenyl)-4-fenyl-l-chlor-l,l-difluor-3butin-2-olu ve formě špinavě bílé pevné látky.

‘H-NMR (CDC1₃): 4,42 (široký s, 2H), 5,10 (široký s, IH), 6,65 (d, IH, J= 8,5 Hz), 7,15 (dd, IH, J = 2,4 a 8,5 Hz), 7,38 (m, 3H), 7,55 (m, 2H), 7,70 (d, J = 2,4 Hz).

Stupeň C: (+/-)-4-( 1-Chlor-l,l-difluormethyl)-4-(2-fenylethinyl)-6-chlor-l ,4-dihydro-2H3, l-benzoxazin-2-on

Do baňky s okrouhlým dnem s objemem 100 ml, opatřené míchadlem, zpětným chladičem a přívodem pro argon se vloží 0,81 g, 2,37 mmol (+/-)-2-(2-amino-5-chlorfenyl)-4-fenyl-lchlor-l,l-difluor-3-butin-2-olu, 25 ml bezvodého THF a 1,919 g, 11,84 mmol 1,1-karbonyldiimidazolu. Výsledný roztok se 20 hodin zahřívá na 60 °C. Reakční směs se zchladí, zředí se ethylacetátem a promyje se 0,5 N roztokem kyseliny chlorovodíkové, vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného. Pak se směs vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu, čímž se získá 890 mg oleje. Tento materiál se chromatografúje na 80 g silikagelu při použití 20% ethylacetátu v hexanu jako elučního činidla. Chromatografovaný materiál se nechá překrystalovat ze vroucí směsi ethylacetátu a hexanů, čímž se ve výtěžku 58 % získá 507 mg (+/-)-4-( l-chlor-l,l-difluormethyl)-4-(2-fenylethinyl)-6-chlor-l,4-dihydro2H-3,l-benzoxazin-2-onu ve formě bílých jehličkovitých krystalků s teplotou tání 154 až 155 °C.

'H-NMR (CDCI3): 6,89 (d, IH, J = 8,4Hz), 7,35- 7,48 (m, 4H), 7,56 (m, 2H), 7,64 (široký s, IH), 9,19 (široký s, IH).

-36CZ 289176 B6

Příklad 5 (-)-6-Chlor-4-fenylethinyl-4-trifluonnethyl-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-on (sloučenina 4)

Stupeň A: 2-(2-Amino-5-chlorfenyl)-4-fenyl-l,l,l-trifluor-3-butin-2-ol)

K roztoku fenylacetilidu lithia, připravenému z 4,83 ml, 0,044 mol fenylacetylenu a 17,2 ml, 2,5 N roztoku n-butyllithia v hexanu, to znamená 0,043 mol této látky v 50 ml THF se při teplotě -78 °C v průběhu 5 minut přidá 11,4 g, 0,044 mol etherátu bromidu hořečnatého. Směs se nechá zteplat na -20 °C a pak se ještě 30 minut míchá pod argonem. Pak se směs zchladí na -60 °C a přidá se roztok, obsahující 2,5 g, 0,011 mol l-(2-amino-5-chlor)-2,2,2-trifluormethylethanonu, předem uvedeného do komplexu s ekvivalentním množstvím 2,8 g, 0,011 mol etherátu bromidu hořečnatého ve 25 ml THF. Reakční směs se jednu hodinu míchá při teplotě 15 °C, pak se zchladí na 0 °C a po kapkách se k ní přidá směs 30 ml nasyceného vodného roztoku chloridu amonného a 30 ml vody. Pak se směs extrahuje 2 x 100 ml ethyletheru, organické fáze se spojí, promyjí se nasyceným vodným roztokem chloridu sodného a pak se vysuší síranem hořečnatým. Rozpouštědlo se odpaří, čímž se získá 6 g oleje, který se čistí rychlou chromatografií na silikagelu při použití 20% ethylacetátu v hexanu jako elučního činidla, čímž se získá 2,5 g 2—(2— amino-5-chlorfenyl)-4-fenyl-l, 1,l-trifluor-3-butin-2-olu jako výsledného produktu.

'H-NMR (CDC1₃): 4,63 (široký s, 3H), 6,69 (d, J= 8,5 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,17 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,35 - 7,44 (m, 3H), 7,53 - 7,56 (m, 2H), 7,66 (d, J = 2 Hz, 1H).

Hmotové spektrum FAB: Μ + H = 326 m/e.

Stupeň B: (±)-6-Chlor-4-fenylethinyl-4-trifluormethyl-l ,4-dihydro-2H-3, l-benzoxazin-2-on (sloučenina 12)

Roztok 2,0 g, 6,1 mmol 2-(2-amino-5-chlorfenyl)-4-fenyl-l,l,l-trifluor-3-butin-2-olu a 11,0 g, 12,0 mmol Ι,Γ-karbonyldiimidazolu ve 300 ml bezvodého THF se míchá pod argonem 24 hodin při teplotě 55 °C. Pak se rozpouštědlo odpaří na rotačním odpařovači a odparek se dělí mezi 200 ml etheru a 400 ml vody. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se ještě jednou extrahuje etherem. Etherové extrakty se spojí, promyjí se 2 x 200 ml 10% kyseliny citrónové a pak nasyceným roztokem chloridu sodného, načež se vysuší síranem hořečnatým a rozpouštědlo se odpaří, čímž se získá ve výtěžku 70% celkem 1,5 g surového produktu ve formě oleje. Po rozetření se směsí etheru a hexanu se získá 875 mg (±)-6-chlor-4-fenylethinyl-4-trifluormethyl-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-onu ve formě bílé pevné látky, která měkne při teplotě 137 °C a taje při teplotě 147 °C.

'H-NMR (CDClj): 6,92 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,30 - 7,49 (m, 4H), 7,58 - 7,65 (m, 3H), 8,99 (s, 1H).

Stupeň C: 6-Chlor-l-( 1 S)-kamfanoyl-4-fenylethinyl-4-trifluormethyl-l ,4-dihydro-2H-3,1benzoxazin-2-on

K roztoku, obsahujícímu 2,24 g, 6,37 mmol (±)-6-chlor-4-fenylethinyl-4-trifluormethyl-l,4dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-onu, 0,10 g, 0,8 mmol 4-dimethylaminopyridinu a 2,07 g, 9,55 mmol chloridu kyseliny kamfanové v 60 ml bezvodého dichlormethanu se za míchání na ledové lázni pod argonem přidá 2,22 ml, 15,9 mmol triethylaminu. Chladicí lázeň se odstraní a reakce se nechá probíhat při teplotě místnosti. Jakmile je reakce ukončena, což se prokazuje chromatografií na tenké vrstvě oxidu křemičitého při použití 4% ethylacetátu v chloroformu jako rozpouštědla, zředí se roztok 200 ml chloroformu a dvakrát se promyje 10% kyselinou citrónovou a pak nasyceným roztokem chloridu sodného. Po vysušení síranem hořečnatým se rozpouštědlo odpaří na rotačním odpařovači a pěnovitý odparek se podrobí rychlé chromatografií při eluci chloroformu. Tímto způsobem se získá 575 mg diastereomeru I 6-chlor-(lS)

-37CZ 289176 B6 kamfanoyl-4-fenylethinyl-4-trifluormethyl-1,4-dihydro-2H-3,1 -benzoxazin-2-onu ve formě oleje.

’Η-NMR (CDC1₃): 0,85 (s, 3H), 1,08 (s, 3H), 1,22 (s, 3H), 1,73- 1,85 (m, 1H), 1,92 - 2,08 (m, 1H), 2,50 - 2,67 (m, 2H), 7,30 - 7,79 (m, 8H).

Po získání uvedeného diastereomerů se získá 1,52 g smíšené frakce, obsahující diastereomery I a Π. Další elucí se získá 680 mg pomaleji se pohybujícího diastereomerů II výsledného produktu, po rozetření tohoto materiálu se směsí etheru a hexanu se získají shluky bílých jehličkovitých krystalků s teplotou tání 177 až 178,5 °C.

’Η-NMR (CDCI3): 0,83 (s, 3H), 1,12 (s, 3H), 1,23 (s, 3H), 1,73 -1,86 (m, 1H), 1,93 -2,06 (m, 1H), 2,50 - 2,63 (m, 2H), 7,38 - 7,51 (m, 4H), 7,49 - 7,62 (m, 2H), 7,72 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,76 (d, J = 2Hz, 1H).

1,52 g směsi izomeru se rozpustí v 75 ml etheru, roztok se zředí 50 ml hexanu a naočkuje krystalky izomeru II. Pomalou krystalizaci se získá ještě 385 mg izomeru Π a po překrystalování z etheru a hexanu se získá pomocí HPLC materiál s diastereomemí čistotou vyšší než 96 %.

Stupeň D: (-)-6-Chlor-4-fenylethinyl-4-trifluormethyl-l ,4-dihydro-2H-3, l-benzoxazin-2-on mg, 0,10 mmol krystalického diastereomerů II 6-chlor-l-(lS)-kamfanoyl-4-fenylethinyl-4trifluormethyl-l,2-dihydro-4(H)-3,l-benzoxazin-2-onu se rozpustí v 8 ml 2-propanolu při teplotě 45 °C v atmosféře argonu. K roztoku se přidá 0,27 ml 10% vodného roztoku uhličitanu draselného. Směs se míchá ještě 10 minut, v průběhu této doby je veškerý výchozí materiál spotřebován, jak je možno prokázat chromatografií na tenké vrstvě oxidu křemičitého při použití 4% ethylacetátu v chloroformu. Roztok se odpaří ve vakuu a odparek se rozpustí v etheru. Roztok se promyje 0,1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové a nasyceným roztokem chloridu sodného, pak se etherový roztok vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje a odpaří ve vakuu na olejovitou pevnou látku, která se čistí chromatografií na oxidu křemičitém při použití 5% 2-propanolu v hexanu jako elučního činidla. Tímto způsobem se po překrystalování ze směsi etheru a hexanu získá (-)-6-chlor-4-fenylethinyl-4—trifluormethyl-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-on ve formě bílých jehličkovitých krystalků s teplotou tání 178 až 179 °C.

/alfa/²⁰ _D =-92,5° (chloroform, c = 0,0012 g/ml).

’Η-NMR (CDCI3): 6,87 (d, J= 8,5 Hz, 1H), 7,37-7,50 (m, 4H), 7,56-7,63 (m, 3H), 8,60 (s, 1H).

Stupeň E: (+)-6-Chlor-4-fenylethinyl-4-trifluormethyl-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-on (sloučenina 3) (+)-6-Chlor-4-fenylethinyl-4-trifIuormethyl-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-on je možno připravit z nekrystalického diastereomerů I ze stupně C podle stupně D. Produkt má teplotu tání 178 až 179 °C.

/alfa/²⁰ _D = +87,6° (CHC1₃, c = 0,0050 g/ml).

’Η-NMR (CDCI3): 6,87 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,37 - 7,50 (m, 4H), 7,56 - 7,63 (m, 3H), 8,60 (s, 1H).

-38CZ 289176 B6

Příklad 6 (-)-6-Chlor-4-cyklopropylethinyl-4-trifluormethyl-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-on (L-743 726, sloučenina 37,2) a (+)-6-chlor-4-cyklopropylethinyl-4-trifluormethyl-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-on (L-743 725)

Stupeň A: 2-(2-Amino-5-chlorfenyl)-4-cyklopropyI-l, 1, l-trifluor-3-butin-2-ol

Roztok brommagneziumcyklopropylacetilidu se připraví tak, že se ke 23 g, 0,348 mol cyklopropylacetylenu ve 250 ml THF v průběhu 1 hodiny po kapkách přidává 116 ml, 3,ON roztoku ethylmagneziumbromidu v etheru, celkem 0,348 mol této látky. Roztok se udržuje I hodinu na teplotě 0 °C a pak 3 hodiny na teplotě 40 °C. Pak se roztok znovu zchladí na 0 °C a v průběhu 5 minut se po jednotlivých podílech přidá 15,56 g, 0,0696 mol l-(2-amino-5chlorfenyl)-2,2,2-trifluormethylethanolu v pevné formě. Pak se reakční směs míchá 1,5 hodiny při teplotě 0 °C. Pak se reakce zastaví tak, že se při teplotě 0 °C po kapkách přidá 700 ml nasyceného vodného roztoku chloridu amonného. Směs se pak extrahuje 2 x 400 ml ethylacetátu, organické fáze se spojí, promyjí se nasyceným roztokem chloridu sodného a pak vysuší síranem hořečnatým. Pak se rozpouštědlo odpaří, čímž se získá žlutá pevná látka. Tento materiál se nechá překrystalovat ze 100 ml vroucího hexanu, čímž se získá 14,67 g 2-(2-amino-5-chlorfenyl)-4cyklopropyl-l,l,l-trifluor-3-butin-2-olu. Druhý podíl 2,1 g tohoto materiálu se získá odpařením matečného louhu, produkt má teplotu tání 153 až 154 °C.

’Η-NMR (CDCl₃): 0,84 (m, 2H), 0,90 (m, 2H), 1,38 (m, IH), 4,50 (široký s, 3H), 6,69 (d, J = 8,5 Hz, IH), 7,13 (dd, J = 2,5 a 8,5 Hz, IH), 7,55 (d, J = 2,5 Hz, IH).

Stupeň B: (±)-6-Chlor-4-cyklopropylethinyl-4-trifluormethyl-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-on (L-741 211)

Roztok 15,00 g, 0,0518 mol 2-(2-amino-5-chlorfenyI)-4-cyklopropyl-l,l,l-trifhior-3-butin2-olu a 41,98 g, 0,259 mol l,l'-karbonyldiimidazolu ve 250 ml bezvodého THF se míchá 24 hodin pod argonem při teplotě 55 °C. Rozpouštědlo se odpaří na rotačním odpařovači a odparek se dělí mezi 500 ml ethylacetátu a 400 ml vody. Vrstvy se oddělí a vodná fáze se ještě jednou extrahuje ethylacetátem. Ethylacetátové extrakty se spojí, promyjí se 2 x 200 ml 2% vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasyceným vodným roztokem chloridu sodného. Po vysušení síranem hořečnatým se roztok zfiltruje a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu, čímž se získá 16,42 g výsledného pevného produktu. Po překrystalizaci ze směsi ethylacetátu a hexanu se získá 12,97 g analyticky čistého (±)-6-chlor-4-cyklopropylethinyl-4-trifluormethyl-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-onu ve formě bílých kiystalků s teplotou tání 178 až 180 °C.

’Η-NMR (CDCI3): 0,85 (m, 2H), 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, IH), 6,81 (d, J = 8,5 Hz, IH), 7,37 (dd, J = 2,5 a 8,5 Hz, IH), 7,49 (d, J = 2,5 Hz, IH), 8,87 (široký s, IH).

Stupeň C: 6-Chlor-l-( 1 S)-kamfanoyl-4-cyklopropylethinyl-4-trifluormethyl-l ,4-dihydro2 H-3,1 -benzoxazin-2-on

K roztoku s obsahem 12,97 g, 0,041 mol (±)-6-chlor-4-cyklopropylethinyM-trifluormethyll,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-onu, 1,02 g, 0,0083 mol 4-dimethylaminopyridinu a 14,22 g, 0,06556 mol chloridu kyseliny (-)-kamfanové ve 350 ml bezvodého dichlormethanu se za míchání pod argonem na ledové lázni přidá 22,84 ml, 0,164 mol triethylaminu. Chladicí lázeň se odstraní a reakce se nechá probíhat při teplotě místnosti. Po 75 minutách je reakce ukončena, jak je možno prokázat chromatografií na tenké vrstvě oxidu křemičitého při použití 4% ethylacetátu v chloroformu jako elučního činidla, roztok se zředí 500 ml chloroformu,

-39CZ 289176 B6 dvakrát se promyje 10% kyselinou citrónovou a pak ještě vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného. Po vysušení síranem hořečnatým, filtraci a odpaření rozpouštědla ve vakuu se získá bezbarvá pěna. Tento materiál se rozetře s 200 ml vroucího hexanu. Po zchlazení na teplotu místnosti se vysráží požadovaný diastereomemí kamfanát. Pevný podíl se oddělí na fritě, promyje se malým množstvím chladného hexanu a suší ve vakuu, čímž se získá 7,79 g 6-chlor1—(1 S)-kamfanoyM-cyk!opropylethinyI-4-trifluormethyl-l ,4-dihydro-2H-3, l-benzoxazin-2onu ve formě bílých krystalků s teplotou tání 164 až 165 °C. Čistota produktu při HPLC je 99,2 % (254 nm).

'H-NMR (CDC1₃): 0,77 (s, 3H), 0,86-0,96 (m, 4H), 1,08 (s, 3H), 1,19 (s, 3H), 1,44 (m, 1H), 1,76 (m, 1H), 1,95 (m, 1H), 2,51 (m, 2H), 7,42 (dd, J = 2,4 a 9,0 Hz, 1H), 7,63 (m, 2H).

Stupeň D: (-)-6-Chlor-4-cyklopropylethinyl-4-trifluormethyl-l,4-dihydro-2H-3,1-benzoxazin-2-on (L-743 726, sloučenina 37,2)

7,50 g, 0,01512 mol 6-chlor-l-(lS)-kamfanoyl-4-cyklopropylethinyl-4-trifluormethyl-l,2dihydro-4(H)-3,l-benzoxazin-2-onu se rozpustí ve 150 ml n-butanolu při teplotě 60 °C v atmosféře argonu. K roztoku se přidá 10 ml IN kyseliny chlorovodíkové. Roztok se udržuje 72 hodin na teplotě 60 °C. Směs se neutralizuje vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a n-butanol se odpaří ve vakuu. Odparek se rozpustí ve 150 ml THF a přidá se k němu 50 ml 2N roztoku hydroxidu lithného, který se nechá působit 3 hodiny při teplotě místnosti. Směs se zředí ethylacetátem a promyje se dvěma podíly vody a jedním podílem nasyceného roztoku chloridu sodného. Po vysušení síranem hořečnatým, filtraci a odpaření rozpouštědla ve vakuu se získá bílá pevná látka. Tento materiál se nechá překrystalovat z horkého hexanu, čímž se získá 3,43 g (-)-

6-chlor-4-cyklopropylethinyl-4-trifluormethyl-l ,4-dihydro-2H-3, l-benzoxazin-2-onu ve formě bílých krystalků s teplotou tání 131 až 132 °C.

/alfa/²°D =-84,7° (CHCI₃, c = 0,005 g/ml).

'H-NMR (CDC1₃): 0,85 (m, 2H), 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, 1H), 6,81 (d, J = 8,5Hz, 1H), 7,37 (dd, J = 2,5 a 8,5 Hz, 1H), 7,49 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 8,87 (široký s, 1H).

Stupeň E: (+)-6-Chlor-4-cyklopropylethinyl-4—trifluormethyl-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoxazin-2-on (L-743 725)

Matečné louhy ze stupně C se čistí chromatografií na silikagelu při použití 10% ethylacetátu v hexanech jako elučního činidla. Čistý nepožadovaný diastereomer ve formě bezbarvé pěny se hydrolyzuje podle stupně D. Enantiomemí benzoxazinon, (+)-6-chlor-4-cyklopropylethinyl-4trifluormethyl-l,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-on se získá jako bílé krystalky s teplotou tání 131 až 132 °C.

/alfa/²⁰ _D = +84,4° (CHC1₃, c = 0,005 g/ml) 'H-NMR (CDCl₃): 0,85 (m, 2H), 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, 1H), 6,81 (d, J= 8,5 Hz, 1H), 7,37 (dd, J = 2,5 a 8,5 Hz, 1H), 7,49 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 8,87 (široký s, 1H).

Zkouška s reverzní transkriptázou

Při této zkoušce se měří ukládání triciovaného deoxyguanosinmonofosfátu působením reverzní transkriptázy HIV v rekombinantní formě (HIV RT_r) nebo jiné reverzní transkriptázy do cDNA, kterou je možno vysrážet kyselinou při některých hodnotách Km pro dGTP a póly r(C).oligo d(G)i2-i8· Inhibitory podle vynálezu mohou způsobit inhibici tohoto ukládání.

Zkoušky byly prováděny v 55 mM tris o pH 8,2 v přítomnosti 30 mM KCl, 30 mM MgCL, 1 mM dithiothreitolu a 20 mikrogramů rC:dG|₂_i8 (Pharmacia) na 1 ml roztoku, mimoto obsahoval

-40CZ 289176 B6 roztok ještě 8 nM ³H dGTP (New England Nuclear), 0,01 % prostředku Triton X-100, 50 mM kyseliny ethylenglykol-bis(beta-aminoethylether)-N,N,N',N-tetraoctové (EGTA) a 1 mg sérového albuminu skotu v 1 mi. Po 60 minutách inkubace při teplotě 37 °C se materiál, který se sráží kyselinou, oddělí filtrem ze skelných vláken na poloautomatickém zařízení pro oddělování buněk. Extrakty bakteriálních buněk s obsahem reverzní transkriptázy RT byly zředěny lineárním způsobem a účinnost byla stanovena v přítomnosti a v nepřítomnosti inhibitoru. Jako kontrola byl užit čištěný heterodimer HIV-1 RT, produkovaný E. coli. Výsledky byly vyjádřeny jako ta koncentrace inhibitorů, kterou je možno dosáhnout 50% inhibice, IC₅₀, a jsou udávány v nanomol/litr, wt.

Při zkouškách s dvojitou mutanto (dm) byla použita reverzní transkriptáza A17. A17 RT je odolná proti působení různých aminopyridinů, jak bylo popsáno v publikaci Nunberg J. H. a další, J. Virol. 65, 4887, 1991. Výsledky byly stanoveny ve formě IC₅₀ dm a jsou rovněž uváděny v nmol/litr.

Zkoušky na inhibici buněčného růstu

Inhibice šíření HTV v buněčné kultuře byla měřena podle publikace Nunberg J. H. a další, J. Virol., 65, 4887, 1991. Při této zkoušce byly velké T-lymfoidní buňky MT-4 infikovány virem HIV-1 divokého typu, není-li výslovně uvedeno jinak při použití předem stanoveného množství. Kultury pak byly inkubovány 24 hodin. Po této době bylo nejvýše 1 % buněk pozitivní při nepřímé imunofluorescenční zkoušce. Pak byly buňky důkladně promyty a rozděleny do ploten s 96 vyhloubeními. Do vyhloubení byl přidán inhibitor v sériovém vždy dvojnásobném ředění a kultury byly pěstovány další tři dny. Čtyři dny po infekci bylo infikováno 100% buněk v kontrolních kulturách. Nahromadění p24 z HIV-1 bylo v přímé korelaci s rozšířením viru. Inhibiční koncentrace byla definována jako ta koncentrace inhibitoru v nanomol/litr, která snížila šíření infekce v buněčném materiálu na alespoň 95 %, CIC95.

V následujících tabulkách jsou shrnuty výsledky zkoušek, při nichž byla jako inhibitor použita sloučenina podle vynálezu 37,2.

A. Zkouška na inhibici reverzní transkriptázy a na šíření viru v buněčném materiálu _______________wt_______K103N*______Y18C________dm_______RT-2 IC₅₀ (μΜ) 0,002 0,030 0,008 0,085 80,8

CIC₉₅ (μΜ) 0,006 (N=2) 0,100<0,025 0,400 N.D.

B. Farmakologické údaje

Rhesus: 1 mg/kg i.v.: ti/₂ = 210 minut ] O.B. = 0,55 mg/kg p.o. (methocel): Cniax ⁼ 4,4 μΜ, 2h }·(Α.υ.€.) ε₂4ΐι⁼1,1μΜ J

Vazba bílkoviny: 98,0 % normální lidské plazmy (HPLC) * Mutanty K103N a Y181C jsou reverzní transkriptázy HTV-1, odolné proti různým účinným látkám. Mutanta dm je dvojitá mutanta, jak již bylo svrchu uvedeno. RT-2 je reverzní transkriptáza HIV-2.

N.D. = nebylo provedeno

-41 CZ 289176 B6

Synergní účinky

A. Příprava suspenze buněk MT-4, infikovaných HTV

Buňky MT byly infikovány ve dni 0 při koncentraci 250 000 buněk/ml ředěním 1 : 1000 kmene HIV-1, šarže Illb (konečné ředění 125 pg p24/ml, toto ředění je dostatečné k infekci nejvýše 1 % buněk ve dni 1 a 25 až 100 % ve dni ₄₎. Buněčný materiál byl infikován a pěstován v živném prostředí RPMI 1640 (Whittaker BioProducts) s obsahem 10% inaktivovaného fetálního séra skotu, 4 mM gíutaminu (Gibco Labs) a 1: 100 penicilin-streptomycin (Gibco Labs.).

Směs byla inkubována přes noc při teplotě 37 °C v atmosféře s obsahem 5 % oxidu uhličitého.

B. Působení inhibitorů

Byla připravena řada kombinací dvou látek v nanomolámích koncentracích, jak je zřejmé z tabulky S. Ve dni 1 byly přidány podíly 125 mikrolitrů inhibitorů ke stejnému objemu buněk MT-4 (50 000 na vyhloubení), infikovaných HIV v mikrotitračních plotnách s 96 vyhloubeními. Buněčný materiál byl inkubován 3 dny při teplotě 37 °C v atmosféře s obsahem 5 % oxidu uhličitého.

C. Měření šíření viru

Při použití vícečetné pipety byly usazeniny buněk uvedeny znovu do suspenze a 150 mikrolitrů materiálu bylo odebráno do oddělené mikrotitrační plotny. Supematant byl pak podroben zkouškám na antigen p24 HTV.

Koncentrace tohoto antigenu byla měřena enzymatickou imunologickou zkouškou. Podíly antigenu p24, který měl být měřen, byly přidány do vyhloubení mikroplotny s povlakem monoklonální protilátky, specifické pro antigen jádra HIV. Pak byla plotna omyta a byla přidána biotinylovaná specifická protilátka proti HIV a pak ještě konjugát streptavidinu a peroxidázy z křenu. Přidaný peroxid vodíku a tetramethylbenzidinový substrát vyvolá barevnou reakci, jejíž intenzita je úměrná koncentraci antigenu p24 HIV.

Vypočítání stupně synergie

Kombinace dvojic různých inhibitorů, tak jak jsou uvedeny v tabulce S, způsobovaly zvýšenou inhibici šíření viru ve srovnání s použitím těchto inhibitorů jednotlivě nebo i ve srovnání s aditivním účinkem každého z použitých inhibitorů. Například kombinace 726 a AZT způsobila podstatné zvýšení inhibice šíření viru ve srovnání s použitím 726 jednotlivě nebo AZT jednotlivě nebo ve srovnání s prostým součtem účinku 726 a AZT.

Získané výsledky byly zpracovány tak, že byly vypočítány poměry frakčních inhibičních koncentrací FIC podle publikace Elion a další, J. Biol. Chem., 208, 477, 1954. Minimální součet hodnot FIC, který znamená maximální synergii, byl stanoven pomocí různých párových kombinací. Je také možno postupovat tak, že se vypočítá průměr získaných hodnot FIC, který označuje průměrný stupeň synergie, tak jak je to uvedeno v následující tabulce S. Výsledky, které jsou v tabulce uvedeny, prokazují podstatnou synergii použitých látek při inhibici šíření viru. Čím nižší je výsledné číslo, tím vyšší je synergie.

-42CZ 289176 B6

Tabulka S

Párové kombinace	Průměrný stupeň synergie
726 + ddl 726 + AZT 726 + 524 726 + 524 + AZT	0,81 0,62 0,65

Sloučenina 524 je L-735 524. Další sloučeniny byly definovány svrchu v tabulce C.

V průběhu přihlášky byly uvedeny všechny základní principy vynálezu, příkladová část byla uvedena k osvětlení těchto principů. Je však zřejmé, že by bylo možno navrhnout řadu běžných praktických variací, úprav nebo modifikací, rovněž spadajících do oboru vynálezu a do rozsahu patentových nároků této přihlášky.

Claims (3)

1. Farmaceutický prostředek pro inhibici reverzní transkripce HTV, vyznačující se t í m , že obsahuje účinné množství benzoxazinonového derivátu obecného vzorce I (D, kde

X znamená atom halogenu,

X^I znamená trihalogenmethyl, pentahalogenethyl, alkyl nebo alkinyl vždy o 2 až 5 atomech uhlíku, cykloalkyl o 3 až 5 atomech uhlíku nebo aryl ze skupiny fenyl, naftyl, tetrahydronaftyl, bifenyl, fenanthryl, anthryl nebo acenaftyl,

Z znamená atom kyslíku nebo síry,

R znamená

a) alkyl o 1 až 8 atomech uhlíku, nesubstituovaný nebo substituovaný skupinou A, přičemž A znamená atom halogenu, cykloalkyl o 3 až 6 atomech uhlíku, kyanoskupinu, hydroxyskupinu, alkoxyskupinu o 1 až 4 atomech uhlíku, alkinylalkoxyskupinu o 2 až 4 atomech uhlíku v alkinylové části a 1 až 4 atomech uhlíku v alkoxyskupině, aryloxyskupinu, alkylkarbonyl o 1 až 4 atomech uhlíku v alkylové části, dialkylaminoskupinu o 1 až 2 atomech uhlíku v každé alkylové části, alkylaminoalkyl o 1 až 4 atomech uhlíku v alkylaminoskupině a 1 až 2 atomech

-43CZ 289176 B6 uhlíku v alkylové části, heterocyklickou skupinu nebo arylthioskupinu, přičemž arylové zbytky znamenají fenyl, naftyl, tetrahydronaftyl, bifenyl, fenanthryl, anthryl nebo acenaftyl a heterocyklická skupina je stálý monocyklický zbytek o 5 až 7 členech nebo stálý bicyklický zbytek o 8 až 11 členech, a to nasycený, částečně nenasycený nebo nenasycený a tvořený atomy uhlíku a 1 až 4 heteroatomy ze skupiny N, O a S, přičemž heteroatomy dusíku a síry jsou popřípadě oxidovány, včetně bicyklických skupin, v nichž je jakýkoliv svrchu definovaný heterocyklický kruh kondenzován s benzenovým kruhem,

b) alkenyl o 2 až 4 atomech uhlíku, nesubstituovaný nebo substituovaný

i) skupinou A nebo ii) arylovou skupinou ve svrchu uvedeném významu, nesubstituovanou nebo substituovanou skupinou A,

c) alkinyl o 2 až 5 atomech uhlíku, nesubstituovaný nebo substituovaný

i) skupinou A nebo ii) arylovou skupinou ve svrchu uvedeném významu, nesubstituovanou nebo substituovanou skupinou A nebo

d) cykloalkyl o 3 až 4 atomech uhlíku, nesubstituovaný nebo substituovaný

i) skupinou A nebo ii) arylovou skupinou ve svrchu uvedeném významu, nesubstituovanou nebo substituovanou skupinou A, jakož i soli těchto sloučenin, přijatelné z farmaceutického hlediska, spolu s farmaceutickým nosičem, za předpokladu, že

i) v případě, že Z znamená atom kyslíku, má X¹ význam, odlišný od trihalogenmethylové nebo pentahalogenethylové skupiny a ii) v případě, že Z znamená atom kyslíku a R znamená nesubstituovaný alkyl o 1 až 8 atomech uhlíku, má X¹ význam, odlišný od alkylové skupiny o 2 až 5 atomech uhlíku.

2. Farmaceutický prostředek pro inhibici reverzní transkriptázy HTV, vyznačující se t í m , že obsahuje účinné množství benzoxazinového derivátu obecného vzorce I podle nároku 1, spolu s farmaceutickým nosičem.

3. Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčení infekce HTV nebo pro léčení AIDS nebo ARC, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství benzoxazinového derivátu obecného vzorce I podle nároku 1, spolu s farmaceutickým nosičem.