CZ234997A3

CZ234997A3 - Způsob výroby cyklopropylacetylenu

Info

Publication number: CZ234997A3
Application number: CZ972349A
Authority: CZ
Inventors: Andrew S. Thompson; Edward G. Corley; Martha Huntington
Original assignee: Merck And Co., Inc.
Priority date: 1995-01-23
Filing date: 1996-01-19
Publication date: 1998-02-18
Also published as: HRP960029A2; EA199700139A1; DE69605282T2; NZ301206A; GR3032200T3; DE69605282D1; FI973086L; HRP960029B1; CA2210577A1; EP0805790B1; EA000074B1; YU3696A; WO1996022955A1; CN1169137A; JPH10512880A; ATE186903T1; MX9705562A; CN1056824C; FI973086A0; EP0805790A1

Description

(57) Anotace:

Způsob výroby cyklopropylacetylenu spočívá v tom, že se smísí 5-halogen-l-pentin se silnou bází v aprotickém rozpouštědle, teplota se nechá stoupnout na O až 150°C a na této hodnotě se udržuje alespoň 15 minut, načež se k reakční směsi zdroj protonů. Získaný cyklopropylacetylen Je možno použít jako meziprodukt pro syntézu inhibitoru reverzní transkriptázy HIV.

CZ 2349-97 A3 *· ····

- 1 Způsob výroby cyklopropylacetylenu

4· ·· • · * 4 4 · · 4 · · ·« · * * a « • a a · · a i a a · · • * a · · a * ··«· «« «·« ··· ·« *

Oblast techniky 'Ϊ

Vynález se týká způsobu výroby cyklopropylacetylenu, | který je meziproduktem pro syntézu inhibitoru reverzní transkríptázy HIV..

Dosavadní stav techniky

Retrovirus, způsobující syndrom získané imunodeficience u Člověka, HIV, je příčinou komplexního onemocnění, při němž dochází k postupné destrukci imunitního systému a degeneraci centrálního a periferního nervového systému, celý syndrom je označován AIDS. Uvedený virus byl dříve označován také LAV, HTLV-ÍII nebo ARV. Společnou vlastností replikace všech retrovirů je reverzní transkripce RNA genomu reverzní transkriptážou, pro niž je virus kódem za vzniku kopií DNA sekvence HIV, tento stupeň je nezbytný pro replikaci viru.

Je známo, že některé látky jsou inhibitory této reverzní' transkriptázy a je tedy možno je použít jako účinné látky při léčení AIDS a podobných onemocnění, jde například o azidothymidin, AZT.

V nukleotidové sekvenci HIV se nachází v jednom z otevřených Čtecích rámců gen pol, jak bylo popsáno v publií kaci Ratner L. a další, Nátuře, 313, 277, 1985. Homologie i> sekvence aminokyselin prokazuje, že gen pol je kódovou sekvencí pro reverzní transkriptázu, endonukleázú a proteázu HIV podle publikací Toh H. a další, EMBO J., 4, 1267, 1985, Power M. D. a další, Science, 231, 1567, 1986, a Pearl L. H. a další, Nátuře, 329, 351, 1987.

·} j

- 2 Přihlašovatel inhibitoru reverzní navrhl podstatně zlepšený transkri.ptázy HIV vzorce

6;

způsob výroby 'ΐ jde o (-r)-6-chlor-4^cyklopropylethinyl-4-trif luorme thy 1-1,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-on, který je obvykle označován jako sloučenina A. Tato látka je vysoce účinná i proti reverzní transkriptáze HIV, odolné proti ostatním protivirovým látkám, užívaným k léčení AIDS.

Meziproduktem pro výrobu sloučeniny A je cyklopropylacetylen. Dřívější postupy byly prováděny ve dvou stupních při použití korozivních reakčních Činidel a současně byl celkový výtěžek těchto postupů nízký. Jde například o postupy, popsané v publikacích Militzer H. C. a další, Synthesis, 998, 1993, Schoberth W. a další, Synthesis, 703, 1972 (PCI,, a baze), Sherrod a další, J. Am, Chem. Soc., 93:8, 1925-1940, duben 1971 (1^ a hydrazon), Mikhailov a Bronovitskaya, Zh. Obshch. Khim., sv. XXII, 195 - 201, 1952 (dibromid). Bylo by tedy zapotřebí navrhnout postup, který by byl méně časově náročný, nevyžadoval by použití korozivních reakčních činidel a jehož výtěžek by byl stejný nebo vyšší než výtěžky známých postupů. Byl proto navržen postup, který je založen na cyklizaci 5-halogen-l-pentinu v prostředí silné baze.

··* · · *»· • · · · · • · · · · « i ·♦·» ·· ··» ··· ·» «

- 3 \

Bylo prokázáno, že pro úspěšný průběh reakce musí vzniknout přechodný dianion, který je cyklizován na cyklopropylacetylen. Pro tvorbu dianiontu nebyly dosud popsány žádné postupy. Naopak se uvádí, Že by pravděpodobně docházelo k řadě vedlejších reakcí včetně náhrady chloru baží nebo deprotonovaným acetylenem nebo výměny chloru v chloridu za kov.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří nový, zlepšený způsob výroby cyklopropylacetylenu, který je meziproduktem pro výrobu sloučeniny A., jak již bylo svrchu uvedeno.

Podstatu vynálezu tedy tvoří způsob výroby cyklopropylacetylenu, který spočívá v tom, že se

a) smísí alespoň 1,0 ekvivalentu silné baze v aprotickém rozpouštědle s jedním ekvivalentem 5-halogen-l-pentinu v aprotickém rozpouštědle při teplotě v rozmezí -20 až 150 °C,

b) teplota reakční směsi se nechá stoupnout na hodnotu v rozmezí 0 až 150.°C a na této hodnotě se udržuje alespoň 15 minut nebo do ukončení cyklizace a pak se

c) k reakční směsi přidá jakýkoliv zdroj protonů.

V jednom z možných provedení způsobu podle vynálezu se postupuje tak, že se

a) smísí alespoň 1,0 ekvivalentu silné baze v aprotickém rozpouštědle s jedním ekvivalentem 5-halogen-l-pentihu v aprotickém rozpouštědle při teplotě v rozmezí -20 až 150 °C,

b) teplota reakční směsi se nechá stoupnout na hodnotu v rozmezí 0 až 150 °C a na této hodnotě se udržuje alespoň 15 minut nebo do ukončení cyklizace, fcfc · fcfc fc

Á( ·♦· · Au • · • fcfc

- 4 •fc. ·· fcfc • * · · « · • fcfc fc · fc · · · · fc ··· «· ·· «· fcfcfc fc··

c) reakční směs se zchladí na teplotu v rozmezí -30 až 50 °C,

d) k reakční směsi se přidá jakýkoliv zdroj protonů.

Podle dalšího možného provedení způsobu podle vynálezu je možno zařadit ještě konečný stupeň, v němž se požadovaný cyklopropylacetylen čistí.

V jednom z výhodných provedení způsobu podle vynálezu se postupuje tak, že se

a) smísí 2,0 až 2,5 ekvivalentu n-butyllithia v cyklohexanu s jedním ekvivalentem 5-chlor-l-pentinu v cyklohexanu při teplotě přibližně 0 °C,

b) reakční směs se zahřeje na teplotu přibližně 75 °C a na této teplotě se udržuje přibližně 5 hodin nebo do ukončení cyklizace,

c) reakční směs se zchladí na teplotu přibližně 0 °C a

d) k reakční směsi se přidá nasycený roztok chloridu amonného a popřípadě se

e) výsledný cyklopropylacetylen čistí.

Způsob podle vynálezu je možno provádět v jediné reakční nádobě tak, že se na začátku smísí jeden ekvivalent 5-halogen-l-pentinu v aprotickém rozpouštědle s alespoň 1,0 ekvivalentem silné baze v aprotickém rozpouštědle při teplotě v rozmezí -20 až 150 °C. Výhodné rozmezí ekvivalentů silné baze se pohybuje mezi 2,0 až 2,5 ekvivalentu. Výhodnou výchozí látkou je 5-chlor-l-pentin. Výhodnou teplotou pro toto míšení je teplota v rozmezí -20 až 25 °C, nejvýhodnější teplota je přibližně 0 °C. Před smísením může být aprotické rozpouštědlo pro 5-halogen-l-pentin stejné nebo odlišné jako aprotické rozpouštědlo pro silnou bázi.

* · ·· * · ··»··· Λ • · · · · 9 · · «· _β * · · · · « * «

9 9 9 9 *··*·« • 9 9 9 9 « ft ?

··· ·· φ·« ··· «φ »

Silnou bázi je možno volit například ze skupiny n-butyllithium, amid sodíku, diethylamid sodíku, hydrid sodíku, hydrid draslíku, bis(trimethylsilyl)amid sodíku, bisi? (trimethylsilyl)amid draslíku, LDA, sek.butyllithium, terc.butyllithium a lithiumtetramethylpiperidid. Výhodnou silnou . baží je n-butyllithium.

Aprotické rozpouštědlo se volí ze skupiny THF, 2,5-dimethyl-THF,' 1,4-dioxan, MTBE, diethoxymethan, dimethoxyethan, cyklohexan, hexan a směs hexanu s te tramě thyl di aminem.. Výhodným rozpouštědlem je cyklohexan.

Míšení silné baze s 5-halogen-l-pentinem je exothermní reakce, v jejímž důsledku dochází k cyklizaci, která probíhá samovolně. Výhodné je reakční směs zahřívat k.urychlení této cyklizace. Výhodná teplota pro cyklizaci je v rozmezí 50 až 80 °C, výhodná, teplota je přibližně 75 °C. Čím vyšší je teplota, tím kratší doby inkubace je zapotřebí k ukončení cyklizace . Pro teplotu 75 °C je typická inkubační doba 5 hodin k dovršení cyklizace. Je zřejmé, že změny teploty a doby inkubace v cyklizačním stupni snadno určí každý odborník.

Jakmile je cyklizace v podstatě ukončena nebo alespoň dostatečně ukončena, je popřípadě možno reakční směs zchladit na teplotu v rozmezí -30 až 50, s výhodou na teplotu přibližně 0 °C.

>

Pak se k reakční směsi přidá zdroj protonů k ukončení reakce. Při provádění způsobu podle vynálezu se zdroj protonů volí z nasyceného roztoku chloridu amonného, kyseliny chlorovodíkové a kyseliny sírové. Výhodným zdrojem protonů je chlorid amonný.

Nakonec je možno zařadit ještě čištění výsledného cyklopropylácetylénu.

•4 · · • · ·

00

V

0 0000 00 • 0 · * i

Reakce, užívané pro navázání cyklopropylacetylenových skupin na jádra jiných molekul jsou obecně známé a snadno je uskuteční každý odborník. Pokud jde o vazbu cyklopropylacetylenové skupiny na aromatické látky, obvykle se užívá vazby, katalyzované přítomností paladia. Při vazbě cyklopropylacetylenové skupiny na látky s alkylovým řetězcem se obvykle užívá výměnné reakce.

Vzniklé látky mohou obsahovat středy asymetrie a mohou existovat jako racemáty, racemické směsi nebo jako jednotlivé diastereomery nebo enanciomery, přičemž vynález zahrnuje všechny isomerní formy. Pod označením (+/-) se zahrnují optické isomery (+), (-) i jejich směsi.

V případě, že se některý z prvků postupu, například symbol R nebo aprotické rozpouštědlo vyskytuje v určitém stupni více než jednou, je každý jeho další výskyt nezávislý na prvním výskytu. Je možno použít také kombinace substituentu, rozpouštědel a podobně, pokud je při takové kombinaci možno získat stálé sloučeniny.

Pod pojmem alkyl se rozumí nasycený alifatický uhlovodíkový řetězec, přímý nebo rozvětvený, obsahující uvedený počet uhlíkových atomů. Atomem halogenů může být atom fluoru, chloru, bromu a jodu..

Podle vynálezu je možno cyklopropylacetylen připravit podle následujícího schématu.

- 7 SCHÉMA I

» · •		« · ··	•	• •	·· ··· · • · ·
•	«	« ·	•	• ·	··· 9
• • · ·	•	··	• ««·	• • · *	• 9 9 9 9

n-3uL.í'/cycionexan ao°c/3h·

nasycený NH_dCI

rl

Celkový výtěžek reakce je nad 65 %. Známé postupy, prováděné s použitím- korozivních reakčních činidel měly’ výtěžek přibližně 42 % a probíhaly následujícím způsobem:

S CH Ε Μ A II

9’ r. r-SuOK/DMSO >-<' ΟΓ’ i ie (12%) ·

Reakce je popsána například v L. E. Hudson a další,

J. Am. Chem. Soc., 54, 1153, 1972 a W. Schoberth a další, Synthesis, 703, 1972.

Sloučeninu A je možno syntetizovat způsobem podle následujícího schématu:

·· «··« • ·· « · * · 0 ♦ « * * • · * · · ··· · *9 9·» ··ft

-8S C Η E.M A III

Cl pivaloylchlorid methylenchlorid T vodný Na„CO_q nh₂ ^{d d}

Cl

HN q

EíOH/HCI pak

NaOH

p^methoxybensyt chloridi molekulové síto 4A/toluen

• ·· ♦ · • · ···· ·*

-9Schema III - pokrač.

dusičnan rprnaťnqmnnriý

sloučenina A ·· *· • · « · « • «· • « · · • « · • · · · · ·· ····

- 10 ·· · • · i

Sloučenina A je použitelná při výrobě a k provádění, sériových zkoušek při vyhledávání protivirových látek. S jejím použitím je možno izolovat mutanty enzymů, které jsou opět velmi dobrým materiálem pro zkoušky při vyhledávání účinných protivirových látek. Mimoto je sloučeninu A možno využít k vytvoření nebo určení vazných míst pro jiné protivirové látky při jejich vazbě na reverzní transkriptázu HIV například při kompetitivní inhibici. Jde tedy o komerční produkt pro uvedené účely.

Sloučeninu A je možno použít k inhibici reverzní transkriptázy HIV, k prevenci nebo léčení infekce virem HIV i k léčení následných pathologických stavů, jako AIDS, včetně široké škály různých stádií této infekce, jako jsou AIDS,

ARC (komplex, spojený s AIDS), s příznaky i dosud bez příznaků a také při skutečném nebo potenciálním styku s virem HIV. Uvedenou látku je například možno použít při podezření na styk s virem HIV v minulosti například při. krevní transfuzi, výměně tělních tekutin, po kousnutí, náhodném bodnutím jehlou nebo při styku, s krví nemocného v průběhu chirurgického zákroku.

Zvláštní výhodou sloučeniny A je její účinná inhibice reverzní transkriptázy, odolné proti jiným vírovým látkám, například proti L-697 661, to znamená 3-(/(4,7-dichlor-l,3-benzoxazol-2-yl)methyl/amino)-5-ethy1-6-methylpyridin-2(1H)-onu nebo proti L-696 229, to znamená 3-/2-(1,3-benzoxazol-2-γ1)6ΐ1τγ1/-5-βίΗγ1'-6-πϊβίΗγ1ργΓΪάΐη-2-(1Η)-οηυ nebo proti AZT.

K uvedeným účelům je možno sloučeninu A podávat perorálně, parenterálně, včetně podkožní injekce, nitrožilní, nitrosvalové nebo intrasternální injekce nebo také infuzí, inhalací nebo rektálně v lékových formách, obsahujících běžné netoxické farmaceutické nosiče a pomocné látky.

·· .«··*

’.ν'ί ···· «·,

- 11 Farmaceutické prostředky s obsahem sloučeniny A mohou mít formu, vhodnou pro perorální podání, jako suspenze nebo tablety, může jít o spreje pro podání do nosu, sterilní injekční prostředky, například suspenze ve vodě nebo v oleji nebo o čípky.

V případě perorálního podání ve formě suspenze je možno farmaceutické’ prostředky připravit běžnými známými postupy. Prostředky mohou obsahovat mikrokrystalickou celulosu pro zvětšení objemu, kyselinu alginovou nebo alginát sodnýjako suspenzní činidlo, methylcelulosu pro zvýšení viskosity a známá sladidla nebo látky pro úpravu chuti. Tablety pro okamžité uvolnění účinné látky mohou obsahovat známé pomocné složky, jako jsou mikrokrystalická celulosa, hydrogenfosforeČnan vápenatý, škrob, stearan hořečnatý, laktosa, pojivá, desintegrační látky, ředidla a kluzné látky. Prostředky pro tvorbu aerosolu nebo inhalaci nosem je rovněž možno připravit známými postupy. Může jít o roztoky ve fyziologickém roztoku chloridu sodného s obsahem benzylalkoholu nebo- jiného vhodného konzervačního Činidla, látek, zvyšujících' vstřebávání pro lepší biologickou dostupnost a mimoto mohou prostředky obsahovat fluorované uhlovodíky . a/nebo další solubilizační nebo dispergační činidla.

Injekční roztoky nebo suspenze se připravují známým způsobem při použití netoxických ředidel nebo rozpouštědel, jako jsou mannitol, 1,3-butandiol, voda, Ringerův roztok, isotonický roztok chloridu sodného, mimoto mohou tyto prostředky obsahovat dispergační činidla, smáčedlá a suspenzní činidla, například fixované oleje, včetně syntetických mononebo diglyceridů a mastné kyseliny, včetně kyseliny olejové.

Při rektálním podání ve formě čípků je možno tyto prostředky připravit tak, že se účinná látka smísí s nedrážϊ φφ φφφφ φ φ φ φ φφφ φ φ φ φφ φ • ·'

- 12 »·»» φφ • φφφ divým základem, jako je například kakaové máslo, syntetické glyceridy nebo polyethylenglykoly, které mají při teplotě místnosti pevnou formu, avšak po zavedení do dutiny rekta se stávají kapalnými a/nebo se rozpouštějí za současného uvolnění účinné látky.

Sloučeninu A je možno podávatperorálně dospělým lidem v dávkovém rozmezí 1 až 100 mg/kg hmotností, rozděleně na dílčí dávky. Výhodné rozmezí dávek je 0,1 až 10 mg/kg hmotnosti perorálně, rozděleně v dílčích dávkách. Další výhodné rozmezí při perorálním podání je 0,1 až 20 mg/kg hmotnosti. Při kombinačním léčení spolu s nukleosidovými analogy se s výhodou podává 0,1 až 20 mg/kg hmotnosti sloučeniny A perorálně rozděleně na dílčí dávky a 50 mg až 5 g/kg hmotnosti nukleosidového analogu, který se podává perorálně v dílčích dávkách. Je však zřejmé, že skutečná velikost dávky a frekvence podávání u jednotlivých nemocných se může měnit v závislosti na řadě faktorů, jako jsou účinnost použité sloučeniny, její metabolická stálost a tím i délka působení, věk, hmotnost, Celkový zdravotní stav, pohlaví, strava, způsob a frekvence podání, rychlost vylučování, použitá kombinace použitých látek, závažnost léčeného onemocnění a podobně.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

··· • · ·' · « 0 • 90 0

0 9 9 9

9 9 9

9 9 9 9 009 9 ·· *

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava cyklopropylacetylenu

C₅H₇CI MW = 1Q2.Č7 n-SuLi/cvcíonexaiT,

3Q°C / 3h nasycený NH^Cl

CcHg MW = S3

MW = molekulová hmotnost.

Materiál ,možství mmo1 MW

5-chlor-l-pentin n-BuLi/cyklohexaň (2,0 M) cyklohexan nasycený NH₄C1

10 g 122 ml	98 244	102,57
80	ml
50	ml

K roztoku 5-chlor-l-pentinu v 80 ml cyklohexanu se při teplotě O °C pod dusíkem přidá 122 ml 2,0 M roztoku n-butyllithia v cyklohexanu a směs se 5 hodin zahřívá na teplotu 75 °C.

·· ttlt

Přidávání n-butyllithia k alkinu je exothermní reakce a teplota se v průběhu přidávání udržuje pod +5 °C při použití směsi ledu a vody.

Postup cyklizace se sleduje pomocí HPLC. Reakce' se považuje za ukončenou, jakmile teoretický výtěžek reakce je vyšší než 90 %.

HPLC: fenylový sloupec, CH^CN, voda, kyselina fosforečná 50 : 50 : 0,1, isokratická eluce 20 minut při průtoku 1,0 ml/min, detekce·, v UV světle při 195 nm, doba retence t_R = 7,5 minut pro výchozí látku a 6,0 minut pro cyklopropylacetylen.

Po ukončení cyklizačního stupně se reakční směs zchladí- na 0 °C a přidá se nasycený roztok chloridu amonného.

Při analýze organické fáze pomocí HPLC bylo prokázáno 5,5 g cyklopropylacetylenu, což znamená výtěžek 85 %.

Produkt byl čištěn frakční destilací při použití sloupce s rozměrem 15 x 1,2 cm se skleněnými kuličkami s průměrem . 4 mm. Byla odebrána frakce s teplotou varu v rozmezí 45 až 75 °C.

Tímto způsobem bylo ve výtěžku 65 % získáno 4,2 g cyklopropylacetylenu ve formě bezbarvého oleje.

· • · · • · · • ··« · • ·

- 15 ·· «· • » * · ♦ ·· • · · ·»·* ···

Příklad 2

Příprava 4-chlorfenylpivalamidu

CgHgCJN MW - 127.99

ΓΙ pivaloylchlorid^' Toluen. i Na₂CO₃

O

c.,k₁₄c;no

MW = 211.55

Materiál	množství	mmol	.MW
4-chloranilin	76 g	596	127,57
pivaloylchlorid (d=	:0,979) 74 ml	600	120,58
toluen	600 ml .
nasycený Na₂CO₃	95 ml
deionizovaná voda	225 ml

K roztoku 76 g 4-chloranilinu v 600 ml toluenu se přidá 95 ml nasyceného roztoku uhličitanu sodného. Směs se zchladí na 10 °C a v průběhu 45 minut se po kapkách přidá 74 ml pivaloylchloridu. Pak se směs míchá 60 minut při teplotě 5 až 10 °C a průběh reakce se sleduje HPLC.

Přidání pivaloylchloridu k anilinu je exothermní reakce. Podmínky HPLC: sloupec C-Q, směs CH^CN, vody a kyseliny fosforečné pří gradientově eluci v rozmezí 40 : 60 : 0,1 až 30 : 20 : 0,1 v průběhu 20 minut, průtok 1,0 ml/min, detekce v UV světle při 245 nm, t_R = 7,2 min pro výchozí materiál a 12,6 min pro pivalamid.

- 16 Produkt se odfiltruje, promyje se 3 x 75 ml neionizované vody a suší na vzduchu 10 minut za odsávání. Pak se produkt suší ve vakuové peci pod dusíkem 16 hodin při teplotě 40 °C, Čímž se ve výtěžku 86 % získá 108,5 g produktu ve formě jemných bílých jehliček.

Příklad 3

Příprava 4-chlorketoanilinu

C_:1H_uCiNO WW — 211 ,55 fvSuíJ/THF

EtQCOCri

eOH / HCI pak NaOH

CgHcFCNO MW = 222.33

Materiál	množství	mmol	MW
4-chlorfenylpivalamid	10	g	47,2	211,69
n-BuLi/hexan (2,5 M)	38	ml	95
ethyltrifluoracetát (d=l,194)	6,7	' ml	56,6	142,08
THF	75	ml
ethanol	90	ml
6N HCI	50	ml	240
hexan	90	ml
2N NaOH	1.5	ml
deionizovaná voda	350	ml

999 ·

»· * · * · · • 99 • «

9

999 99

- 17 V baňce se třemi hrdly s objemem 500 ml se rozpustí g pivalamidu v 75 ml bezvodého THF a směs se zchladí na 0 °C. K roztoku se po kapkách přidá 38 ml 2,5 M roztoku n-BuLi v hexanu a vnitřní teplota směsi se nechá stoupnout na +15 °C. Pak se nechá směs stát 2 hodiny při 0 °C.

Přidání prvního ekvivalentu n-BuLi k pivalamidu bylo vysoce exothermní, reakce byla řízena rychlostí přidávání.

K výsledné světležluté suspenzi bylo přidáno 6,7 ml ethyltrifluoracetátu, přičemž vnitřní teplota směsi stoupla na +10 °C. Průběh reakce byl sledován HPLC.

Podmínky' HPLC; sloupec C-8, CHgCN, voda a kyselina fosforečná při gradientově eluci 40 : 60 : 0,1 až 80 : 20 : 0,1 v průběhu 20 minut, rychlost průtoku 1,0 ml/min, detekce v UV světle při 245 nm, t_ = 12,6 min pro výchozí pivalamid a 11,6 min pro ketopivalamid. Produkt zaujímal 85 %. plochy pod křivkou, nezreagovaný pivalamid 10 až 15 % plochy pod křivkou.

K reakční směsi bylo přidáno 10 ml 6 M kyseliny chlorovodíkové a 20 ml deionizované vody.

V tomto okamžiku byl výtěžek produktu podle HPLC 13,1 g,· to znamená 90 %.

Roztok byl zahuštěn ve vakuu na přibližně 50 ml a promyt 50 ml ethanolu k odstranění hexanu a THF. Pak bylo přidáno 40 ml 6N HC1 a směs byla zahřívána 1 hodinu na teplotu 80 °C pod zpětným chladičem.

Pomocí.HPLC bylo prokázáno 85 až 90 A% ketoanilinu a 10 A% nezreagovaného pivalamidu. Acylovaný materiál byl tedy hydrolyzován, kdežto nezreagovaný pivalamid zůstal nezměněn. Výtěžek v tomto okamžiku byl 7,78 g, 74 %, • · · · * · · · ·« • ·· · • ♦ · · · • · · · *«·» ·· ···

Směs byla zahuštěna ve vakuu na objem přibližně 50 ml, při zahuštění se vytvořila sraženina, pravděpodobně šlo o hydrochlorid produktu. Destilace byla přerušena a. reakční směs byla zchlazena na teplotu 0 °G. Po další hodině stání byla reakční směs zfiltrována a pak promyta 3 x 30 ml hexanu.

Promytím hexanu byl z produktu odstraněn-nezreagovaný pivalamid. Získaná pevná látka byla podrobena HPLC, aby bylo možno ověřit úplné odstranění. Filtrát a promývací kapalina typicky Obsahovaly 1,2 až 1,5 g, to znamená 8 až 12 % produktu. -K největší ztrátě produktu došlo ve vodném filtrátu.

Sůl byla sušena 16 hodin při teplotě 40 °C ve vakuu, čímž bylo získáno 10,4 g pevné látky s Čistotou 71,4 %, výtěžek 70 %. Tato sůl byla uvedena do suspenze ve 260 ml deionizované vody a neutralizována přidáním 15 ml 2N NaOH na pH přibližně 6 až 7.

Nesmí dojít ke zvýšení pH nad 9,0 vzhledem k tomu, že při této hodnotě se produkt rozkládá.

Výsledná jasně žlutá pevná látka byla oddělena filtrací a promyta 2 x 25 ml deionizované vody. Produkt byl sušen 16 hodin při teplotě 40 °C ve vakuu, Čímž bylo ve výtěžku 54 % získáno 6 g ketoanilinu s čistotou 96,6 %.

Takto získaný produkt byl ještě dále Čištěn překrystalováním z hexanu.

*· ·· · · • · · · ·»« · · • · « * • ♦ * · · • ti · » ··· · · «* · · · *

I* ···· ·«

-19 Příklad 4

Příprava N-4-methoxybenzylketoanilinu

CgHcF-CÍNO MW * 222.:3

II p-meThoxyaenzyl chloriti molekulové síto 4A/toluen

GF,

As 'A,

GMe

CigHini“ tGINCo MW = 343.72:

Materiál	množství	mmol	MW
ketoanilin	15,5 g	69,5	223,58
p-methoxybenzylchlorid	10,9 g	69,8
molekulové síto 4A	90 g
toluen	70 ml
aceton	500 ml
hexan	120 ml
Do banky s objemem	250 ml se	vloží 15,5	g ketoanilinu

g aktivovaného molekulového síta 4A a 75 ml toluenu. Směs se míchá pod dusíkem při teplotě 23 °C celkem 24 hodin. Po této době prokáže analýza HPLC, že směs obsahuje produkt a výchozí látku v poměru 1:1.

Podmínky HPLC: Sloupec C-8, směs CH^CN, vody a kyseliny fosforečné pri isokratické eluci 65 : 35 : 0,1, eluce trvá 20 minut, průtok je 1,0 ml/min, detekce v UV světle při ·· 4» * 4 4 4 4 « 4 « ··» 4 4 • 4 4 4 4 b * • · 4 4 · '

4444 44 44« 444

4444 » · i * 4 · • 44 4 • · ·

260 nm, hodnota t_R pro toluen je 5,7 min, pro výchozí ketoanilin 6,5 min a pro výsledný produkt 15,0 min. Plocha pod křivkou je typicky 25 A% pro toluen. Reakce se provádí při použití 40 g Čerstvého molekulového síta, směs se míchá další 3 dny při teplotě 23 °C. Reakce se považuje za ukončenou, jakmile klesne množství výchozího materiálu pod 2 A%.

Směs se zfiltruje přes vrstvu celitu a tato vrstva se pak promyje 7 x 75 ml acetonu, po tomto promytí se z celitu vymyje převážná část žluté barvy. Filtrát se odpaří, čímž se získá 27 g žlutooranžového oleje, který se stáním mění na pevnou látku. Tato pevná látka se čistí tak, že se rozpustí v horké směsi 100 ml hexanů. Roztok se zchladí na teplotu místnosti a pak až na 0 °C v lázni vody a ledu. Po 1,5 hodině stání se směs zfiltruje a pevný podíl se promyje 2 x 100 ml chladné, směsi hexanů. Produkt se pak suší. na vzduchu za odsávání celkem 10 minut a pak se suší ještě 2 hodiny ve vakuové peci při teplotě 40 °C. Tímto způsobem se ve výtěžku 86 % získá 20,5 g výsledného produktu ve formě jasně žlutého prášku.

·· Μ»|

I · ».

* · · • · ·

Příklad 5

Příprava aminoalkoholu

O

c₁₆h₁₃f₃cino,

MW = 343

THF/O°C az -40 °C ',

Cji H^gí-jCINOj MW = 409

- 22 ·· fcfc • · · 4 * ·♦ fc fc « fcfcfcfc fcfc « · fc • fcfc • · fc' * fc •

··« • · · fc fc ► * fc » fc <i

Materiál množství mmol

MW

keton	175	mg	0,51	343
lR,2S-N-pyrrolidinyl- norefedrín	264	mg	1,3	205
cyklopropylacetylát (d = 0,8)	0,1	ml	1,21	66
sek-BuLi (1,3 M v cyklohexanu).	2	ml .	2,6
THF (KF = 20/Ug/ml)	4	ml
1M kyselina citrónová	10	ml
ethylacetát	6	ml

264 mg pyrrolidinylefedrinu se rozpustí ve 2 ml THF a směs se zchladí' na -5 °C. Ke směsi se pak při teplotě-5 °C pod dusíkem přidá 0,11 ml cyklopropylacetylenu a 2,0 ml sek.butyllithia po kapkách. Směs se nechá stát 30, minut při teplotě -5 °C a pak se zchladí na -45 °C.

Přidání sek.butyllithia vyvolá exothermní reakci, reakční směs se udržuje na teplotě -5 až 0 °C, teplota se. řídí rychlostí přidávání.

175 mg ketonu se rozpustí pod dusíkem v 1,0 ml THF a roztok se v průběhu 2 až 3 minuty přidá k aniontové směsi, vnitřní teplota směsi se v průběhu přidávání nechá stoupnout na -40 °C. Výsledný svetleoranžový roztok se nechá stát 60 minut při teplotě -40 °C a pak se přidají 3 ml 1M kyseliny citrónové a 3 ml ethylacetátu. Reakční směs se nechá zteplat na teplotu místnosti a vrstvy se oddělí.

Spodní vodná vrstva se extrahuje 3 ml ethylacetátu. Organické vrstvy se spojí a promyjí se 2 x 3 ml ÍM kyseliny « · · · · *

- 23 ♦ · OB • « « » ·· • · · < · · « · ·« « • » · • » ♦ ··· · • 9 ·* * > lei li

citrónové, Reakční směs se nalyzuje pomocí HPLC, Čímž se zjistí stupeň přeměny a enanciomerní čistota EE produktu.

Podmínky HPLC: Sloupec C-S, směs CH^CN, vody a kyseliny fosforečné 65 : 35 : 0,1 při isokratické eluci 20 minut, rychlost průtoku je 1,0 ml/min, detekce v UV světle při 252 nm, hodnota t_R pro výchozí materiál je 12,8 minut a pro produkt 10,3 minut.

Podmínky pro chirální HPLC: sloupec stacionární fáze s amylosou, směs hexanu a isopropanolu 85 : 15 při isokratícké eluci, rychlost průtoku 1,0 ml/min, detekce v UV světle při 252 nm, hodnota t_ pro výchozí materiál je 4,9 minut,

Λ pro. převažující enanciomer 5,5 minut a pro vedlejší enanciomer 25,0 minut.

Přebytek enanciomeru byl 98 %, stupeň přeměny v průběhu reakce byl 93 %·(6Α% výchozího materiálu). Výtěžek reakce byl 92 %,

Příklad 6

Příprava benzoxazinonu φ * φφ * * φ φ • φφ φ φ φ φφφ* φφφ φ

• Φφ

Materiál	množství	mmol	MW
aminoalkohol	3,2 g	. 7,8	409
1,93 Μ fosgen v toluenu	4,6 ml	8,89

*1	triethylamin (d=G,726)	5,4	ml	39	101
	THF (KFÉ lOOyUg/ml)	15	ml
	deionizovaná voda	15	ml
	ethylacetát	45 .	ml
	hexany	30	ml
	IM kyselina citrónová	40	ml
	nasycený roztok NaCl	25	ml

* ·	• ·	*	•	fr « · · fr fr
•	• fr	•	•	fr fr fr
β	• · I	*	fr	• ··· fr
•	fr ·	i	fr_r	Ϊ ·
• fr · ·	• ·	• · 4	fr fr ·	frfr ·

Aminoalkohol se rozpustí v 15 ml THF a zchladí se pod dusíkem na -10 °C.. Ke směsi se přidá 5,4 ml triethylaminu a fosgen ve 4,6 ml toluenu. Přidáním fosgenu dojde k exothermní reakci, teplota směsi se udržuje pod 20 °C, teplota se řídí rychlostí přidávání. Průběh reakce se sle- duje pomocí HPLC, reakce je obvykle ukončena do doby 15 min.

Podmínky HPLC: sloupec C-8, směs CH^CN, vody a kyseliny fosforečné při gradientově elucí 50 : 50 : 0,1 až 90 : 10 : 0,1 v průběhu 20 minut, rychlost průtoku 1,5 ml/min, detekce v UV světle při 252 nm,hodnota t_n pro výchozí látku je 14,6 minut a pro produkt 16,0'minut.

Reakční směs se zchladí na teplotu 0 °C a přidá se15 ml směsi ledu a vody a 20 ml ethylacetátu. K rozrušení jakékoliv vznikající emulze se užije, nasycený roztok chloridu sodného.· Organická'vrstva se oddělí a vodná vrstva se extrahuje.15 ml ethylacetátu. Organické extrakty se spojí a promyjí se 40 ml IM kyseliny citrónové.a 25 ml nasyceného roztoku chloridu sodného. Organická vrstva se vysuší síranem sodným a odpaří ve vakuu, čímž se získá 3,8 g hnědého oleje.

Produkt se nechá krystalizovatz 25 ml směsi hexanu a ethylacetátu 5:1. Roztok se zchladí-na 0 °C, nechá se stát 1 hodinu a pak se zfiltruje. Materiál se promyje 2 x 5 ml chladné směsi hexanu a ethylacetátu 5:1a pak se suší na vzduchu za odsávání, čímž se ve výtěžku 85 % získá 2,9 g produktu jako světle oranžové pevné látky.

	•	0	0 0 0 0*0
» · · • · 0 • 0 • · 0	• 00 0	0 b 000	0 0 0 0 00 0 * 0 0 00 0

Příklad 7

Příprava sloučeniny A

sloučenina A

Materiál	množství	mmol	MW
PMB sloučenina A, 7	0,8 g	1,83	435
dusičnan cernatoamonný	4,4 g	8,0	548,23
ch₃cn	15 ml
ethylacetát	30 ml
deionizovaná voda	30' ml

nasycený roztok NaCl ml ·· *··· •λ*:

·%.

*· • · * i «» «

Sloučenina A, chráněna p-methoxybenzylovou skupinou se rozpustí v 15 ml methylkyanidu. K roztoku se přidá roztok 4,4 g dusičnanu cernatoamonného v 5 ml vody. Reakce je β o obvykle ukončena v průběhu 2 hodin při teplotě 23 C;-podle výsledků HPLC. '

Podmínky HPLC: sloupec C-8, směs CH^CN, vody a kyseliny fosforečné při gradientově eluci 50 : 50 : 0,1 až 90 : 10 :'0,1 v průběhu 20 minut, rychlost průtoku 1,5 ml/min, detekce v UV světle při 252 nm, t_R pro výchozí látku je 16,0 minut a pro produkt 9,0 minut.

Reakční směs se zředí 5.ml deionizované vody a odpaří na přibližně 1/2 svého objemu. 2 vodné vrstvy se produkt extrahuje 2 x 15 ml ethylacetátu. Organické extrakty se spojí a promyjí se 2 x 10 ml deionizované vody a 10 ml nasyceného roztoku chloridu sodného. Organický podíl se odpaří ve vakuu na* žlutou-gumu. Pak. se produkt čistí chromatografií na silikagelu.

Příklad 8

N-(4-chlorfenyl)-2,2-dimethylpropanamid

Do baňky s okrouhlým dnem se třemi hrdly s objemem 5 litrů, opatřené míchadlem se vloží 127,57 g, 1 mol 4-chloranilinu, 1200 ml chloroformu a 1200 ml nasyceného vodného roztoku uhličitanu sodného. Připojí se přidávací nálevka a přidá se 129 ml, 1,05 mol 2,2-dimethylpropanoylchloridu. Chlorid se přidává po kapkách v průběhu 1 hodiny za energického míchání směsi. Výsledná směs se míchá ještě dalších 23 hodin při teplotě místnosti. Určité množství produktu se ze směsi oddělí ve formě bílých krystalků, • · 9949 • * · · v · · 499

4 9 · · φ ···· ·.* **Φ ···' «»

- 28 tyto krystalky se odfiltrují. Filtrát se přenese do dělicí nálevky a vrstvy se oddělí. Chloroformová vrstva se promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného. Pak se vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu, čímž se získá další podíl produktu. Oba podíly produktu se spojí a nechají se překrystalovat z vroucí . směsi ethylacetátu a hexanů, čímž se získá 185,6 g N-(4-chlorfenyl)-2,2-dimethylpropanamidu ve formě bílé krystalické pevné látky.

Příklad 9 (-)-6-chlor-4-cyklopropylethinyl-4-trifluormethy1-1,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-on (sloučenina A) a (+)-6-chlor-4-cyklopropylethinyl-4-trifluormethyl-1,4- .

-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-on

Stupeň A: 2-( 2-amino-5-chlorfenyl)-4-cyklopropyl-l ,.l, 1-trifluor-3-butin-2-ol

Roztok brommagnesiumcyklopropylacetylidu se připraví z 23 g, 0,348 mol cyklopropylacetylenu ve 250 ml THF tak, že se v průběhu 1 hodiny po kapkách přidává 116 ml 3,0M roztoku ethylmagnesiumbromidu v etheru. Roztok se nechá stát 1 hodinu při teplotě 0 °C a pak 3 hodiny při teplotě 40 °C. Pak se roztok znovu zchladí na 0 °C a v průběhu 5 minut se po jednotlivých podílech přidá 15,56 g, 0,0696 mol l-(2-amino-5-chlorfenyl)-2,2,2-trifluormethylethanonu v pevné formě. Reakční směs se 1,5 hodiny míchá při teplotě 0 °C. Pak se k reakční směsi při teplotě 0 °C po kapkách přidá 700 ml nasyceného vodného roztoku chloridu amonného. Směs se extrahuje 2 x 400 ml ethylacetátu, organické fáze se spojí, promyjí se nasyceným vzorkem chloridu sodného a pak se suší síranem hořečnatým. Po odstranění síranu hořec• · ··* • · * · · » ;

··♦· ·· ··· ··· *t _#

- 29 natého a rozpouštědla se získá žlutá pevná látka, která se nechá prekrystalovat z vroucích hexanů (konečný objem 100 ml), čímž se získá 14,67 g 2-(2-amino-5-chlorfenyl)-4-cyklopropyl-1,1,l-trifluor-3-butin-2-olu. Druhý podíl 2,1 g se získá zahuštěním matečného louhu. Teplota tání výsledného produktu je 153 až 154 °C.

¹H-NMR (CDClg): 0,84 (m, 2H), 0,90 (m, 2H), 1,38 (m, IH), 4,50 (br s, 3H), 6,69 (d, J = 8,5 Hz, IH), 7,13 (dd,

J = 2,5, 8,5 Hz, IH) 7,55 (d, J = 2,5 Hz, IH) .

Stupeň B: (±)-6-chlor-4-cyklopropylethinyl-4-trifluormethyl-1,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-on

Roztok 15,00 g, 0,0518 mol 2-(2-amino-5-chlorfenyl)-4-cyklopropyl-l,1,1-trifluor-3-butin-2-olu a 41,98 g,

0,259 mol 1,1'-karbonyldiimidazolu ve 250 ml bezvodého THF se míchá pod argonem-24 hodin při teplotě 55 °C. Pak se rozpouštědlo odpaří na rotačním odpařovači a odparek se dělí mezi 500 ml ethylacetátu a 400 ml vody. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se ještě jednou extrahuje ethylacetátem. Ethylacetátové extrakty se spojí a promyjí 2 x 200 ml 2% roztoku kyseliny chlorovodíkové, nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasyceným roztokem chloridu sodného. Pak se směs vysuší síranem hořečnatým,' zfiltruje a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu, čímž se získá 16,42 g pevného produktu. Po překrystalování ze směsi ethylacetátu a hexanu se získá 12,97 g analyticky čistého (±)-6-chlor-4-cyklopropylethinyl-4-trifluormethyl-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoxazin-2-onu ve formě bílých krystalků s teplotou tání 178 až 180 °C.

·· ···* ·· ·· « « • · · · «· 9t • »· · · * · · · · t • *· · φ »♦·» ·» ··· »«·

- 30 ¹H-NMR (CDC1₃): 0,85 (m,. 2H), 0,94 (m, 2H) , 1,40 (m, ÍH),

6,81 (d, J = 8,5 Η, ÍH), 7,37 (dd, J = 2,5, 8,5 Hz, ÍH),

7,49 (d, J = 2,5 Hz, ÍH), 8,87 (br s, ÍH).

Stupeň C: 6-chlor-l-(lS)-camphanoyl-4-cyklopropylethinyl-4-trifluormethyl-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoxazin-2-on

K roztoku 12,97 g, 0,041 mol (±)-5-chlor-4-cyklopropylethinyl-4-trif l.uormethyl-1,4-dihydro-2H-3, l-benzoxazin-2-onu, 1,02 g, 0,0083 mol 4-dimethylaminopyridinu a 14,22 g, 0,06556 mol chloridu kyseliny (-)-kamphanové ve 350 ml bezvodého dichlormethanu , míchanému pod argonem na ledové lázni se přidá 22,84 ml, 0,164 mol. triethylaminu. Chladicí lázeň se odstraní a reakce se hechá probíhat při teplotě místnosti. Po- 75 minutách je reakce ukončena podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě (Si0₂, 4% ethylacetát v chloroformu) a roztok se zředí 500 ml chloroformu, pak se 2x promyje 10% kyselinou citrónovou, lx vodou a lx nasyceným roztokem chloridu sodného. Po vysušení síranem horečnatým, filtraci a odpaření roztoku ve vakuu se získá bezbarvá pěna. Tato pěna se rozetře s 200 ml vroucího hexanu. Po zchlazení na teplo-r tu místnosti se vysráží požadovaný diastereomerní cmphanátimid. Pevný podíl se oddělí na frite,. promyje se malým množstvím chladných hexanů a suší ve vakuu, čímž se získá 7,79g

6-chlor-l-(lS)-kamphanoyl-4-cyklopropylethinyl-4-trifluormethyl-1,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-on ve formě bílých krystalků s teplotou tání 164 až 165 C. Čistota produktu podle HPLC při detekci v UV světle při 254 nm je 99,2 %.

¹H-NMR (CDC1₃): 0,77 (s, 3H), 0,86 - 0,96 (m, 4H), 1,08 (s, 3H), 1,19 (s, 3H), 1,44 (m, ÍH), 1,76 (m, ÍH), 1,95 (m, ÍH), 2,51 (m, 2H), 7,42 (dd, J = 2,4, 9,0 Hz, ÍH), 7,63 (m, 2H).

·· 0000

00 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 •00» 00

- 31 L<

i

Stupeň D: (-)-6-chlor-4-cyklopropylethinyl-4-trifluormethyl- 1

-1,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-on (sloučenina A) 1 v

7,50 g, 0,001512 mol 6-chlor-l-(IS)-camphanoyl-4-cyklopropylethinyl-4-trifluormethyl-l,2-dihydro-4(H)-3,1-benzoxazin-2-onu se rozpustí ve 150 ml n-butanolu při 60 °C pod argonem. K roztoku se přidá 10 ml IN kyseliny chlorovodíkové. Pak se roztok udržuje 72 hodin na teplotě 60 °C.

Směs se neutralizuje vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a pak se n-butanol odpaří ve vakuu. Odparek se rozpustí ve 150 ml THF a v průběhu 3 hodin se při teplotě místnosti přidá 50 ml 2N LiOH. Směs se zředí ethylacetátem, promyje se dvěma podíly vody a jedním podílem nasyceného roztoku chloridu sodného. Po vysušení síranem hořečnatým, filtraci a odpaření rozpouštědla ve vakuu se získá bílá pevná látka.

Tento materiál se.nechá .překrystalovat z horkého hexanu, čímž se získá 3.,43' g (-)-.6-chlor-4-cyklopropylethinyl-4-trifluormethyl-14-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-onu ve formě bílých krystalků s teplotou tání 131 až 132 °C.

/alfa/p⁰ = -84,7° (chloroform, c = 0,005 g/ml).

¹H-NMR (CDC1₃).: 0,85 (m, 2H) , 0,94 (m, 2H) , 1,40 (m, 1H) ,

6,81 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,37 (dd, J = 2,5, 8,5 Hz, 1H),

7,49 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 8,87 (br s, 1H).

Stupeň E: ( + )-6-chlor-4-cykl'opropylethinyl-4-trifluormethyl-1,4-dihydro-2H-3,l-benzoxazin-2-on

Matečný louh ze stupně C se čistí chromatografií na silikagelu při použití 10% ethylacetátu v hexanech jako elučního činidla. Čistý nežádoucí diastereomer, který má formu bezbarvé pěny se hydrolyzuje způsobem podle stupně D.

Tímto způsobem se získá enanciomerní benzoxazinon, (+)-6-chlor-4-cyklopropylethinyl-4-trifluormethyl-1,4-dihydro·· ·· • · » « • *· • · f • · β »·»ι ·· *· ····

- 32 -2H-3,l-benzoxazin-2-on jako bílá krystalická látka s teplotou tání 131 až 132 °C, /alfa/^O ₌ +84,4° (chloroform, c = 0,005 g/ml).

¹H-NMR (CDC1₃): 0,85 (m, 2H), 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, ÍH),

6,81 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,37 (dd, J = 2,5, 8,5 Hz, ÍH), 7,49 (d, J = 2,5 Hz, ÍH), 8,87 (br s, ÍH).

Zkoušky na účinnost na reverzní transkriptázu

Při provádění zkoušky se měří zařazení triciovaného deoxyguanosinmonofosfátu rekombinantní reverzní transkriptázou HIV (HIV RT_n) (nebo jinou reverzní transkriptázou RT) rt do cDNA, kterou je možno vysráŽet působením kyseliny při hodnotách Km, dGTP a póly r(C).oligo d(G)₁₂__1θ· Inhibitory podle vynálezu to.to. zařazení blokují.

Zkoušky byly prováděny v 55 mM tris-pufru o pH 8,2 s 30 mM KC1, 30 mM MgCl₉, 1 mM dithiothreitolu, 20 mikrogramů rC:dG^2_]_g (Pharmacia) na ml, 8 mM / Η/dGTP (New England Nuclear), 0,01 % Triton X-100, 50 mM ethylenglykol-bis-(beta-aminoethylether)-Ν,Ν,Ν*,N*-tetraoctové kyseliny (EGTA), mg sérového albuminu skotu v 1 ml. Po 60 minutách inkubace při teplotě 37 °C se materiál, který je možno vysrážet kyselinou oddělí filtry ze skelných vláken při použití poloautomatického zařízení. Extrakty bakteriálních buněk, obsahující RT byly lineárně ředěny a byla stanovena účinnost v přítomnosti a v nepřítomnosti inhibitorů. Jako kontrola byl použit čištěný heterodimer HIV-1 RT, produkovaný v E. coli. Výsledky byly vyjádřeny jako ta koncentrace inhibitorů, pří níž je možno dosáhnout 50% inhibice, hodnota je uváděna v nanomolech /litr. Pro sloučeninu A je hodnota ΙΟ^,θ přibližně 2 nM.

• · · · · ♦ *·· ·· *·« ·(·;

- 33 Při zkoušce s dvojitou mutantou dm byla použita A 17 RT.

A 17 RT je odolná proti různým aminopyridonům, jak je popsáno v publikaci Nunberg J. H. a další, J. Virol., 65, 4887,

1991. Výsledky se vyjadřují jako dm v nanomolech/litr.

Tato hodnota je pro sloučeninu A 85 nM.

Zkouška na šíření v buněčné kultuře

Inhibice šíření HIV v buněčné kultuře byla sledována podle Nunberg J. H. a další, J. Virol., 65, 4887,. 1991. Zkouška se provádí tak, že se T-lymfoidní buňky MT-4 infikují divokým typem HIV-1, není-li výslovně uvedeno jinak, užívá se předem stanovené množství a kultury se pák inkubují 24 hodin. Po této době je množství 1 % buněk nebo nižší positivní při nepřímé imunófluorescenci. Po této době se buněčný materiál důkladně promyje. a ..rozdělí, do ploten s 96 vyhloubeními,. Do vyhloubení se přidá sériové ředění inhibitoru, každá nižší, koncentrace je vždy polovinou koncentrace vyšší, kultury se'pěstují další 3 dny. 4 dny po infekci je v kontrolních kulturách infikováno 100 % buněk. Nahromadění p24 viru HIV-1 je v přímé, korelaci s šířením viru. Inhibiční. koncentrace byla definována jako ta koncentrace inhibitoru v nanomolech/litr, která zmenší šíření infekce o alespoň 95 %, jde tedy o ClCg^.

Vynález byl osvětlen na příkladech některých výhodných provedení, je však zřejmé, že by bylo možno navrhnout ještě řadu běžných variací, úprav nebo modifikací, rovněž spadajících do rozsahu vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby cyklopropylacetylenu, v y z n a dující se tím, že se

a) smísí alespoň 1,0 ekvivalentu silné oáze v aprotickém rozpouštědle s jedním ekvivalentem 5-halogen-l-oentínu v aprotickém rozpouštědle při teplotě v rozmezí -20 až 150 °C,

b) teplota reakční směsi se nechá stoupnout na hodnotu v rozmezí 0 až 150 °C a na této hodnotě se udržuje alespoň 15 minut nebo do ukončení cyklizace a pak se

c) k reakční směsi přidá jakýkoliv zdroj protonů.
2. Způsob’výroby cyklopropylacetylenu, vyznačuj í c í s‘e t í m , že se

a) smísí alespoň 1,0 ekvivalentu silné baze v aprotickém rozpouštědle s jedním ekvivalentem 5-halogen-l-pentinu v aprotickém rozpouštědle při teplotě v rozmezí -20 až 150 °C,

b) teplota reakční směsi se nechá stoupnout na hodnotu v- rozmezí 0 až 150 °C a na teto hodnotě se udržuje alespoň 15 minut nebo do ukončení cyklizace,

c) reakční směs se zchladí na teplotu v rozmezí -30 až 50 °C,

d) k reakční směsi se přidá jakýkoliv zdroj protonů.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačuj í c í se í m , že se výsledný cyklopropylacetylen čistí.

• *· · • β «
4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyzná· « *· » • ·· · ·' (V·

Sující se tím, že se silná baze volí ze skupiny n -butyllithium, amid sodíku, díethylamid sodíku, hydrid sodíku, hydrid draslíku, bis(trimethylsilyl)amid sodíku, bis(trimethylšilyUamíd draslíku, LDA, sek.butyllithium, terc.butyllithium a lithiumtetramefhylpiperidid. Výhodnou silnou baží je· n-butyllithium.
5. Způsob podle nároku 4,vyznačující se t í m , že se jako silná baze užije'n-butyllithium.

S. Způsob podle nároku 1 až 3, vyznačuj íc í se t í m , že se jako rozpouštědlo užije THF, 2,5-dimechyl-THF, 1,4-dioxan, MT3F, diethoxymethan, dimethoxyethan, cyklohexan, hexan a směs hexanu s tetrámethyldíaminem.
7. Způsob podle nároku 5,vyznačující se tím, že se jako aprotické rozpouštědlo ušije cyklohexan.

3. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se jako zdroj protonů užije nasycený chlorid amonný, kyselina chlorovodíková nebo kyselina sírová.
9.. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se jako 5-halogen-l-pentin užije 5-chlor-l-pentin.
10. Způsob výroby cyklopropylacetylenu, vyznačující se tím, Že se r w • « . .. * ·: · ► · f · ; · • · ·♦·· ·«

a)

b)

c)

d)

- 36 smísí 2,0 až: 2.,5 ekvivalentu n-butyllithia/v cykJ xanu s jedním ekvivalentem 5-chlor-i-pentinu v hexanu při teplotě přibližně 0 °C, reakční směs se zahřeje na teplotu přibližně 75 ^UC a na této teplotě se udržuje přibližně 5 hodin nebo do ukončení cyklizace, reakční'směs se zchladí na teplotu přibližně O °C a k reakční směsi se přidá nasycený roztok chloridu amonného .
11. Způsob podle nároku 10, vyznačuj ící· t í ra , že se výsledný cyklopropylacetylen čistí.