PT582455E - Benzoxazinonas como inibidoras de transcriptase reserva de hiv - Google Patents

Description

-1 - DESCRIÇÃO "BENZOXAZINONAS COMO INIBIDORAS DE TRANSCRIPTASE REVERSA DE HIV”

Um retrovírus designado por vírus da imunodeficiência humana (HIV) é o agente etiológico da complexa doença que inclui a progressiva destruição do imuno sistema (síndrome da imunodeficiência adquirida; SIDA) e degeneração do sistema nervoso central e periférico. Este vírus era anteriormente conhecido como LAV, HTLV-III, ou ARV. Uma característica comum de replicação de retrovírus é a transcrição inversa da genoma de ARN por uma transcriptase reversa de vírus codificada para gerar cópias do ADN de sequências de HIV, um passo necessário na replicação virai. É sabido que alguns compostos são inibidores de transcriptase reversa e são agentes eficazes no tratamento da SIDA e doenças semelhantes, por exemplo, azidotimidina ou AZT. A sequência nucleótida do HIV mostra a presença de um gene pol numa configuração aberta [Ratner, L. et al.. Nature, 313, 277 (1985)]. A homologia da sequência do amino ácido fornece prova de que a sequência pol codifica transcriptase reversa, uma endonuclease e uma protease do HIV [Toh, H. et al.. EMBO J. 4, 1267 (1985); Power, M. D. et al.. Science, 231, 1567 (1986); Pearl, L. H. etal., Nature 329, 351 (1987)].

Os requerentes do Pedido de Patente demonstram que os compostos desta invenção são inibidores de transcriptase reversa de HIV. As principais vantagens dos presentes compostos são sua demonstrada inibição da transcriptase reversa do HIV resistente. -2- A Patente U.S. A-3526621 revela 3,l-benzoxazin-2-onas substituídas tendo actividade relaxante em fibra muscular estriada e actividade anti-convulsiva, tranquilizante e anti-Parkinsoniana. A Patente EP-A-93922 revela benzoxazin-2-onas tendo actividade anti-trombótica. São revelados compostos de fórmula I como definidos aqui. Estes compostos são úteis na inibição da transcriptase reversa de HIV (e as suas variedades resistentes), na prevenção de infecção por HIV, no tratamento de infecção por HIV e no tratamento da SIDA e/ ou CRS, como compostos, sais farmaceuticamente aceitáveis (quando apropriado), ingredientes de composição farmacêutica, em combinação ou não com outros antivirais, anti-infecciosos, imunomoduladores, antibióticos ou vacinas. São também revelados métodos para o tratamento da SIDA, métodos de prevenção de infecção por HIV, e métodos para tratamento de infecção por HIV usando os compostos de fórmula II. A presente invenção fornece o uso de um composto de fórmula II:

X é halo; XI é tri-halometilo; penta-haloetilo; C2.5 alquilo; C2-5 alquinilo; C3.5 cicloalquilo; ou fenilo, nafitilo, tetra-hidronaftilo, bifenilo, -3- fenetilo, antrilo ou acenaftilo; Z é O ou S; Ré (a) Ci_8 alquilo, não substituído ou substituído com A, e A é halo, C3.6 cicloalquilo, CN, hidroxi, C1.4 alcoxi, C2-4 alquinil-Ci.4 alcoxi, fenoxi, naftoxi, tetra-hidronaftoxi, bifenoxi, fenetoxi, antroxi, acenaftoxi, Cm alquilcarbonilo, nitro, di(C 1 _2 alquil)amino, Cm alquilamino-Ci.2 alquilo, heterociclo, ou feniltio, naftiltio, tetra-hidronaftiltio, bifeniltio, fenetiltio, antriltio ou acenaftiltio; em que heterociclo significa um anel monocíclico estável de 5 a 7 membros ou um anel heterocíclico bicíclico estável de 8 a 11 membros que é ou insaturado, parcialmente insaturado ou insaturado e que consiste em átomos de carbono e em um a quatro heteroátomos seleccionados de N, O e S, e em que os heteroátomos de azoto e enxofre podem opcionalmente ser oxidados, e incluindo qualquer grupo bicíclico no qual qualquer dos anéis heterocíclicos acima definidos é condensado com um anel de benzeno; b) C2-4 alcenilo, não substituído ou substituído com (i) A, ou (ii) fenilo, naftilo, tetra-hidronaftilo, bifenilo, fenetilo, antrilo ou acenaftilo, não substituídos ou substituídos com A;

Esta invenção também abrange uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula II com a condição de que X1 e R não sejam ambos Cm alquilo não substituído. A presente invenção também fornece um composto de fórmula I: -Α

Χ é halo, X1 é trialometilo, ou penta-haloetilo; X é O; Ré (a) Ci_g alquilo, não substituído ou substituído com A, e A é halo, C3.6 cicloalquilo, CN, hidroxi, Cm alcoxi, C2-4 alquinil- Cm alcoxi, fenoxi, naftoxi, tetra-hidronaftoxi, bifenoxi, fenetoxi, antroxi, acenaftoxi, Cm alquilcarbonilo, nitro, di(Ci_2 alquilo) amino, Cm alquilamino-Ci_2 alquilo, heterociclo, ou feniltio, naftiltio, tetra-hidronaftiltio, bifeniltio, fenetiltio, antriltio ou acenaftiltio; em que heterociclo significa um anel monocíclico estável de 5 a 7 membros ou um anel heterocíclico bicíclico estável de 8 a 11 membros que é ou insaturado, parcialmente insaturado ou insaturado e que consiste em átomos de carbono e em um a quatro heteroátomos selec-cionados de N, O e S, e em que os heteroátomos de azoto e enxofre podem opcionalmente ser oxidados, e incluindo qualquer grupo bicíclico no qual qualquer dos anéis heteroclíclicos acima definidos é condensado com um anel de benzeno; (b) C2-4 alcenilo, não substituído ou substituído com (i) A, ou (ii) fenilo, naftilo, tetra-hidronaftilo, bifenilo, fenetilo, antrilo ou acenaftilo, não substituídos ou substituídos com A; -5-

I (c) C2-5 alquinilo, não substituído ou substituído com (i) A, ou

Compostos preferidos incluem Compostos 37.2, 4, 2, 5 e 24 da Tabela I abaixo, em ordem descendente do grau de preferência. Estes compostos têm a seguinte estrutura:

Composto 37.2:

Cl (-) (-) 6-Cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-l,4-di-hidro-2H-3,l-benzoxazin-2-ona, o mais preferido;

Composto 4:

(-) (-) 6-cloro-4-feniletinil-4-trifluorometil-l ,4-di-hidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-ona;

Composto 2: -6-

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(+/-) 6-cloro-4-(2-cianofenil)etinil-4-( 1,1,1 -trifluorometil)-1,4-di-hidro-2H-3,1 benzoxazin-2-ona;

Composto 5: (+/-) 4-( 1 -cloro-1,1 -difluorometil)-4-(2-fenil-etinil)-6-cloro-1,4-di-hidro-2H-3,1 -enzoxazin-2-ona;

Composto 24: (+/.) 4-(2-[dimetilaminometil]etinil)-4-trifluorometil-6-cloro-1,4-di-hidro-2H-3,1 -benzoxazin-2 -ona; -7- ou um sal destes farmaceuticamente aceitável.

Os compostos da presente invenção estão especificamente ilustrados nas Tabelas I e II abaixo:

TABELA I

TABELA I (Continuação)

TABELA I (Continuação)

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U -20-

Os compostos da presente invenção podem ter centros assimétricos e podem ocorrer, excepto quando especificamente mencionado, como racematos, misturas racémicas ou como diastereómeros individuais, ou enantiómeros, com todas as formas isoméricas incluídas na presente invenção. O termo (+/-) é destinado a abranger isómeros ópticos (+) ou isómeros ópticos (-) ou misturas destes.

Quando qualquer variável (por exemplo, R) ocorre mais do que uma vez em qualquer componente ou na fórmula I, a sua definição em cada ocorrência é independente da sua definição em cada outra ocorrência. Também, combinações de substituintes e/ ou variáveis só são permissíveis se tais combinações resultarem em compostos estáveis.

Como usado neste contexto, excepto quando assinalado, "alquilo" pretende incluir grupos de hidrocarbonos alifáticos saturados tanto de cadeia ramificada como linear tendo o número especificado de átomos de carbono; o termo "alcenilo" pretende cobrir grupos alquilo de cadeia tanto ramificada como linear com pelo menos uma ligação dupla de carbono-carbono; o termo "alquinilo" pretende cobrir grupos alquilo de cadeia tanto ramificada como linear com pelo menos uma ligação tripla de carbono-carbono. "Halogéneo" ou "halo" como usado aqui, significa flúoro, cloro, bromo e iodo.

Como usado neste contexto, excepto quando assinalado, "arilo" significa fenilo, naftilo, tetra-hidronaftilo, bifenilo, fenantrilo, antrilo ou acenaftilo. O termo heterociclo ou heterocíclico, como usado neste contexto -21 -

c \ 4.1 excepto onde houver uma chamada de atenção, representa um anel monocíclico estável de 5 a 7 membros ou um anel heterocíclico bicíclico estável de 8 a 11 membros que é ou saturado, parcialmente insaturado ou insaturado e que consiste em átomos de carbono e em um a quatro heteroátomos seleccionados do grupo consistindo em N, O e S, e em que os heteroátomos de azoto e enxofre podem opcionalmente ser oxidados, e incluindo qualquer grupo bicíclico no qual qualquer dos anéis heterocíclicos acima definidos é condensado com um anel de benzeno. O anel heterocíclico pode ser ligado a qualquer heteroátomo ou átomo de carbono que resulte na criação de uma estrutura estável. Exemplos de tais elementos heterocíclicos incluem piperidinilo, piperazinilo, 2-oxopiperazinilo, 2-oxopiperidinilo, 2-oxopirrolidinilo, 2-oxoazepinilo, azepinilo, pirrolilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, pirazolilo, pirazolidinilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, oxazolilo, oxazolidinilo, isoxazolilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, tiazolilo, tiazolidinilo, isotiazolilo, quinuclidinilo, isotiazolidinilo, indolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzimidazolilo, tiadiazoílo, benzopiranilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, furilo, tetra-hidrofurilo, benzofuranilo, tetra-hidropiranilo, tienilo, benzotienilo, tiamorfolinilo, sulfóxido de tiamorfolinilo, sulfona de tiamorfolinilo, e oxadiazolilo.

Os compostos da presente invenção podem ser sintetizados pelos métodos a seguir. -22-

ESOUEMA I

Cl I Cl S Cloreto de pivaloílo íS r Cloreto de metileno V T nh2 Na2C03 aquoso HV 1

1. 2 eq. n-BuLÍ/THF/0°G 05

2. CF3COOEt/0°C 3. 3N hci/ refluxo 3

R-MgBr

THF/0°C até à TA

1,1 '-carbonildi-imidazole THF/50°C 5 -23-

Na síntese das benzoxazinas da presente invenção, o método geral envolve, tipicamente a ciclização num núcleo de benzeno como passo final. A este respeito, ver o Esquema I. O grupo amino de paracloroanilina é primeiramente protegido com, por exemplo, cloreto de pivaloílo, para dar 2. Outros grupos protectores de amino menos preferíveis incluem grupos t-butoxi-carbonilo, acetato ou isovaleroílo. Cerca de 2 equivalentes de um alquil-lítio são então feitos reagir com 2, preferencialmente n-butil-lítio. Nenhum outro composto organo-metálico é adequado para este passo de metalização. Subsequentemente, a reacção de CF3COOEt seguida por finalização produz 3.

Segue-se a síntese do carbinol terciário 4, pela adição de Grignard na cetona de 3. O reagente de Grignard deve ser um sal de catiões bivalentes, por exemplo, Mg++ ou Zn++. Catiões monovalentes são considerados inadequados, tais como Li+ ou Na+. Solventes adequados incluem mas não se limitam a THF ou éter. Uma larga gama de condições de temperatura é permitida entre cerca de 0o C e cerca da temperatura ambiente. O fecho do anel para produzir os compostos da presente invenção 5 é alcançado com agentes de condensação tais como l,l'-carbonildi-imidazole, fosgénio, dimetilcarbonato, difenilcarbonato ou di(paranitrofenil)carbonato. A ciclização pode ser alcançada com qualquer destes compostos, bem como uma larga variedade de outros.

Um exemplo específico do Esquema I é fornecido no Esquema IA. Este diagrama a síntese de L-741.211, que é um racemato do Composto 37,2, como fornecido mais adiante no Exemplo 6. -24-

ESOUEMAIA -24-

Cl

1.2 n-BuLi/THF -78°C->0°C/1h 2. EtOOCCF3/0°c 3. 3N HCI refluxo (60%)

1. EtMgBr/THF

[>—= 50°C/1 h 2. A/1.5h/RT (73-74%)

1,1’-CDI/THF

O

A

(L-741,211) (99%) -25

ESQUEMA II

7 O Esquema II fornece um método para derivatizar substituições de acetileno na posição 4 do núcleo de benzoxazina. Por meio de ilustração, o Composto 6 é metalizado, depois é adicionado um sal de zinco. Na reacção de Heck o catalisador tetrakis (trifenilfosfma)paládio(O) composto com Cul é empregue para dar 7.

ESQUEMA III

8 -26- bA.yh CL— O Esquema III ilustra a substituição de um grupo 4-acetileno com um heterociclo contendo N. A reacção de Mannich envolve uma reacção de condensação de formaldeído com o heterociclo, por exemplo, pirrolidina. A substituição no carbono terminal segue na presença de Cul como catalisador.

ESQUEMA IV

COCI

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Et3N/4-DMAP/CH2CI2 1. Cromatografía sobre

Gel de Silica_ 2. K2C03/H20/2-propanol O Esquema IV ilustra a resolução de isómeros ópticos dos compostos de Fórmula I ou Fórmula II. Neste Exemplo, o ácido canfanico (-) é o agente de resolução. Uma larga variedade de outros agentes de resolução adequados, incluindo o cloreto de ácido O-metil-mandélico ou reagente de Mosher. E claro para os especialistas na matéria como separar tais isómeros. O Esquema VI A é especificamente adaptado à resolução de L741.211 no isolamento de L-743.726. A este respeito ver o Esquema IV A, e o Exemplo 6.

ESQUEMA IV A

cloreto de (-)-canfanilo 4-DMAP/Et3N/CHCI3

(90% de recuperação) -28-

L-743,726 Composto 37.2

ESQUEMA V

t-BuOK/DMSO O— (42%)

Ciclopropilacetileno é preparado pelo Esquema V de acordo com procedimentos publicados, por exemplo, C. E. Hudson et al., J. Am. Chem. Soc. 94, 1158 (1972) e W. Schoberth et al., Synthesis, 703 (1972). -29- f» C—J 4-1

Os compostos desta invenção são úteis para a preparação e execução de ensaios médicos para compostos antivirais. Por exemplo, os compostos desta invenção são úteis para isolar enzimas mutantes, que são excelentes ferramentas para ensaios para compostos aintivirais mais potentes. Além disto, os compostos desta invenção são úteis para estabelecer ou determinar o local de ligação de outros antivirais à transcriptase reversa de HIV, por exemplo, por inibição competitiva. Deste modo, os compostos desta invenção são produtos comerciais a ser vendidos para estes fins.

Os compostos da presente invenção são úteis na inibição de transcriptase reversa de HIV, na prevenção ou tratamento de infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e o tratamento de consequentes condições patológicas tais como a SIDA. O tratamento da SIDA ou a prevenção ou tratamento de infecção por HIV é definido como incluindo, mas não se limitando ao tratamento de uma larga variedade de estados de infecção pelo HIV: SIDA, CRS (complexo relacionado com a SIDA), tanto sintomáticos como assinto-máticos, e exposição real ou potencial ao HIV. Por exemplo, os compostos desta invenção são úteis no tratamento de infecção por HIV depois de suspeita pós-exposição ao HIV por, por exemplo, transfusão de sangue, troca de fluidos corporais, mordidas, picada de agulha acidental, ou exposição do sangue do paciente durante cirurgia. A principal vantagem dos compostos desta invenção é a sua potente inibição contra transcriptase reversa de HIV tomado resistente a outros antivirais, tais como L-697.661, que é 3-([(4,7-dicloro-l,3-benzoxazol-2-il)metil]-amino)-5-etil-6-metil-piridina-2(lH)-ona; ou L-696.229, que é 3-[2-(l,3-benzoxazol-2-il)etil]-5-etil-6-metil-piridina-2(lH)-ona; ou AZT. -30-

At h*. yh —4. (

Para estes fins, os compostos da presente invenção podem ser administrados por via oral, por via parentérica (incluindo injecções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, injecção inter-extemal ou técnicas de infusão), por inalação por aspersão, ou via rectal, em formulações de unidade de dosagem contendo transportadores, adjuvantes e veículos convencionais não-tóxicos farmaceuticamente aceitáveis.

Deste modo, de acordo com a presente invenção é também fornecido um método de tratamento e uma composição farmacêutica para o tratamento de infecções pelo HIV e da SIDA. O tratamento implica a administração a um paciente em necessidade de tal tratamento de uma composição farmacêutica compreendendo um transportador farmacêutico e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção.

Estas composições farmacêuticas podem ser na forma de suspensões ou comprimidos administrados por via oral; aspersões nasais; preparações estéreis injectáveis, por exemplo, como suspensões aquosas ou oleaginosas estéreis injectáveis ou supositórios.

Quando administrado como uma suspensão por via oral, estas composições são preparadas de acordo com técnicas bem conhecidas da técnica de formulação farmacêutica e podem conter celulose microcristalina para conferir volume, ácido algínico ou alginato de sódio como agente de suspensão, metil-celulose como intensificador de viscosidade, e agentes edulcorantes/ aromatizan-tes conhecidos da técnica. Como comprimidos de libertação imediata, estas composições podem conter celulose microcristalina, fosfato dicálcico, amido, -31 - estearato de magnésio e lactose e/ ou outros excipientes, aglutinantes, diluentes, desintegrantes, agentes de volume e lubrificantes conhecidos da técnica.

Quando administradas por aerossol nasal ou inalação, estas composições são preparadas de acordo com técnicas bem conhecidas da técnica de formulação farmacêutica e podem ser preparadas como soluções em solução salina, utilizando álcool benzílico ou outros conservantes adequados, estimuladores de absorção para aumentar a biodisponibilidade, fluorocarbonetos, e/ ou outros agentes solubilizantes ou dispersantes conhecidos da técnica.

As soluções injectáveis ou suspensões podem ser formuladas de acordo com técnica conhecida, usando diluentes ou solventes apropriados, não tóxicos aceitáveis por via parentérica, tais como manitol, 1,3-butanodiol, água, solução de Ringer ou solução isotónica de cloreto de sódio, ou agentes dispersantes ou humedecedores e de suspensão adequados, tais como óleos fixos estéreis, brandos, incluindo mono ou diglicéridos sintéticos, e ácidos gordos, incluindo ácido oleico.

Quando administradas por via rectal, na forma de supositórios, estas composições podem ser preparadas misturando o fármaco com um excipiente adequado não irritante, tal como manteiga de cacau, ésteres glicéridos sintéticos ou polietilenoglicóis, os quais são sólidos a temperaturas comuns, mas liquidificam-se e/ ou dissolvem-se na cavidade rectal para libertar o fármaco.

Os compostos desta invenção podem ser administrados por via oral a humanos numa gama de dosagem de 1 a 100 mg/ kg de peso corporal em doses divididas. Uma gama de dosagem preferida é de 0,1 a 10 mg/ kg de peso corporal -32- por via oral em doses divididas. Uma outra gama de dosagem preferida é de 0,1 a 20 mg/ kg de peso corporal por via oral em doses divididas. Para terapia de combinação com análogos de nucleósidos, uma gama de dosagem preferida é de 0,1 a 20 mg/ kg de peso corporal para os compostos desta invenção administrados por via oral em doses divididas, e de 50 mg a 5 g/ kg de peso corporal por nucleósidos análogos administrados por via oral em doses divididas. Será entendido, no entanto, que o nível de dose específico e a frequência da dosagem para qualquer paciente específico pode ser variada e dependerá de uma variedade de factores incluindo a actividade do composto específico empregue, a estabilidade metabólica e duração da acção daquele composto, a idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, modo e tempo de administração, taxa de excreção, combinação de fármacos, severidade da condição específica, e a terapia a que o paciente se submete. A presente invenção é também dirigida a combinações de compostos de inibidores de transcriptase reversa de HIV com um ou mais agentes no tratamento da SIDA. Por exemplo, os compostos desta invenção podem ser eficazmente administrados, quer seja em períodos de pré-exposição quer seja em períodos de pós-exposição, em combinação com quantidades eficazes dos antivirais da SIDA, imunomoduladores, anti-infecciosos, ou vacinas, tais como os que são apresentados na Tabela seguinte.

-33- TABELA ANTIVIRAIS

Nome do Fármaco AL-721 Fabricante Ethigen (Los Angeles, CA) Interferão Beta Recombinante Humano Triton Bioscience (Almeda, CA) Acemanano Carrington Labs (Irving, TX) Cytovene Syntex Ganciclovir (Paio Alto, CA) d4T Didesidrodesoxitimidina Bristol-Meyers (Nova Iorque, NY) ddl Didesoxi-inosina Bristol-Meyers (Nova Iorque, NY) EL10 Elan Corp, PLC (Gainsneville, GA)

Indicação

CRS, PGL

HIV positivo, SIDA

SIDA, sarcoma de Kaposi, CRS CRS (Ver também imunomoduladores) CMV ameaçador da visão retinite por CMV periférica

SIDA, CRS

SIDA, CRS

Infecção por HIV (Ver também imunomoduladores) -34-

Nome do Fármaco Fosfonoformato trissódico Fabricante Astra Pharm. Products, Inc (Westborough, MA) Indicação retinite por CMV, infecção por HIV, outras infecções por CMV Didesoxicitidina; ddC Hoffman-La Roche (Nutley, NJ) SIDA, CRS Novapren Novaferon Labs, Inc. (Akron, OH) Diapren, Inc. (Roseville, MN, vendedor) inibidor de HIV Péptido T Sequência Octapéptica Península Labs, (Belmont, CA) SIDA Zidovudina; AZT Burroughs Wellcome (Rsch. Triangle Park, NC) SIDA, avançada, CRS SIDA pediátrico, sarcoma de Kaposi, infecção por HIV assin-tomática, doenças de HIV menos severas, envolvimento neurológico, em combinação com terapias. -35-

Nome do Fármaco Fabricante Indicacão Ansamycin LM 427 Adria Laboratories (Dublin, OH) Erbamont (Stamford, CT) CRS Sulfato de Dextrano Ueno Fine Chem. Ind. Ltd. (Osaka, Japan) SIDA, CRS, HIV positivo assintomático Virazole Viratek/ ICN HIV positivo Ribavirina (Costa Mesa, CA) assintomático, LAS, CRS Interferão Alfa Burroughs Wellcome (Rsch. Triangle Park, NC) Sarcoma de Kaposi, HIV em combinação com Retrovir Aciclovir Burroughs Wellcome SIDA, CRS, HIV positivo assintomático, em combinação com AZT. Anticorpo que neutraliza Advanced Biotherapy SIDA, CRS o Interferão alfa aberran- Concepts te de pH lábil numa colu- Rockville, MD) na de imuno-adsorção -36-

Nome do Fármaco L-697.661 Fabricante Merck (Rahway, NJ) Indicacão SIDA, CRS, HIV positivo assintomático, também em combinação com AZT. L-696.229 Merck (Rahway, NJ) SIDA, CRS, HIV positivo assintomático, também em combinação com AZT. L-735.524 Merck (Rahway, NJ) SIDA, CRS, HIV positivo assintomático, também em combinação com AZT. IMUNO-MODULADORES Nome do Fármaco AS-101 Fabricante Wyeth-Ayerst Labs. (Filadélfia, PA) Indicacão SIDA Bropirimina Upjohn (Kalamazoo, MI) SIDA avançada Acemanano Carrington Labs, Inc. (Irving, TX) SIDA, CRS (Ver também anti virais)

Nome do Fármaco Fabricante Indicacão CL246.738 American Cyanamid (Pearl River, NY) Lederle Labs (Wayne, NJ) SIDA, sarcoma de Kaposi EL10 Elan Corp, PLC (Gainesville, GA) Infecção por HIV (Ver também aintivirais) Interferão Gama Genentech (S. San Francisco, CA) CRS, em combinação com TFN (factor de necrose de tumor) Granulócito Factor Estimulante de Colónia de Macrófagos Genetics Institute (Cambridge, MA) Sandoz (East Hanover, NJ) SIDA Granulócito Hoeschst-Roussel (Sommerville, NJ) Immunex (Seattle, WA) SIDA Granulócito Schering-Plough SIDA Factor Estimulante de Colónia de Macrófagos (Madison, NJ) SIDA em combinação com AZT Imunoestimulante da Partícula do Núcleo do Rorer (Ft. Washington, PA) HIV seropositivo -38-

Atk^rfr

Nome do Fármaco IL-2 Interleucina-2 Fabricante Hoffman-LaRoche (Nutley, NJ) Immunex Indicacão SIDA, CRS, HIV, em combinação com AZT Imuno Globulina Intravenosa (humana) Cutter Biological (Berkeley, CA) SIDA pediátrica, em combinação com AZT IMREG-1 Imreg (Nova Orleães, LA) SIDA, sarcoma de Kaposi, CRS, PGL IMREG-2 Imreg (Nova Orleães, LA) SIDA, sarcoma de Kaposi, CRS, PGL Imutiol Dietil Ditio Carbamato Merieux Institute (Miami, FL) SIDA, CRS Interferão Alfa-2 Schering Plough (Madison, NJ) Sarcoma de Kaposi com AZT: SIDA Metionina-Encefalina TNI Pharmaceutical (Chicago, IL) SIDA, CRS MT-PE Muramil-Tripéptido Ciba-Geigy Corp. (Summit, NJ) Sarcoma de Kaposi Granulócito Factor Estimulante de Colónia Amgen (Thousand Oaks, CA) SIDA, em combinação com AZT

Nome do Fármaco rCD4

Recombinante Solúvel Humano CD4 Recombinante Solúvel Humano CD4

Interferão Alfa 2a SK&F 106528 Solúvel T4

Timopentina

Factor de Necrose de Tumor; TFN

Fabricante

Genentech (S. San Francisco, CA) Biogen (Cambridge, MA)

Hoffman-La Roche (Nutley, NJ)

Smith, Kline & French Laboratories (Filadélfia, PA)

Immunobiology Research Institute (Annandale, NJ)

Genentech (S. San Francisco, CA)

Indicação SIDA, CRS

SIDA, CRS

Sarcoma de Kaposi, SIDA, CRS, em combinação com AZT

Infecção por HIV

Infecção por HIV CRS, em combinação com Interferão gamma

ANTI-INFECCIOSOS

Nome do Fármaco Clindamicina com Primaquina Fluconazolec

Fabricante

Upjohn (Kalamazoo, MI) Pfizer (Nova Iorque, NY)

Indicação

PCP

Meningite criptococal, candidíase h*~rfr

Nome do Fármaco Fabricante Indicacão Pastille Squibb Corp Prevenção de candidíase Nistatina Pastille (Princeton, NJ) oral Omidil Eflomitina Merrel Dow (Cincinnati, OH) PCP Isetionato de Pentamidina (IM & IV) LyphoMed (Rosemont,, IL) Tratamento de PCP Piritrexim Burroughs Wellcome (Rsch. Triangle Park, NC) Tratamento de PCP Isetionato de Pentamidina para inalação Fisons Corporation (Bedford, MA) Profilaxia de PCP Espiramicina Rhone-Poulenc Pharmaceuticals (Princeton, NJ) diarreia criptosopirial Intraconazole-R51211 Janssen Pharm. (Piscataway, NJ) histoplamose; heningite criptococal Trimetrexato Warner-Lambert PCP

OUTROS

Nome do Fármaco Fabricante Indicacão Eritropoietina Ortho Pharm. Corp. anemia severa associada Recombinante Humana (Raritan, NJ) à terapia de AZT Acetato de Megestrol Bristol-Myers (Nova Iorque, NY) tratamento da anorexia associada à SIDA Nutrição Entérica Total Norwich Eaton Pharmaceuticals (Norwich, NY) diarreia e malabsorção relacionada com a SIDA

Será compreendido que o âmbito de combinações dos compostos desta invenção com antivirais da SIDA, imunomoduladores, anti-infecciosos ou vacinas não está limitado à lista na Tabela acima, mas inclui em princípio qualquer combinação com qualquer composição farmacêutica útil para o tratamento da SIDA. Por exemplo, um composto de Fórmula I ou Fórmula II pode ser adequadamente administrado em combinação com um análogo de nucleósido tendo actividade biológica conhecida contra transcriptase reversa de HIV. Análogos de nucleósidos apropriados são geralmente codões de paragem e incluem AZT, ddC, ddl, D4T, HEPT e 3'-flúoro-2',3'-didesoxitimidina. O AZT é sintetizado pelos métodos de J. P. Horwitz et al., J. Org. Chem. 29, 2076 (1964); R. P. Glinski at al., J. Org. Chem. 38, 4299 (1973); C. K. Chu et al., Tetrahedron Letters 29, 5349 (1988). A aplicação de AZT como um fármaco terapêutico no tratamento da SIDA é revelado na Patente U. S. 4,724,232. -42- h*.rh Cl—-«.(ui O composto ddC é sintetizado pelos métodos de J. P. Horwitz et al., J. Org. Chem. 32, 817 (1967); R. Marumoto, Chem. Pharm. Buli. 22, 128 (1974); e T.-S. Lin et al., J. Med. Chem. 30, 440 (1987). O D4T é sintetizado pelo métodos de Herdewijn, P. et al., J. Med. Chem. 30, 1270(1987). O HEPT é sintetizado pelo métodos de Miyasaka, T. et al., J. Med. Chem.32, 2507 (1989); e A. Rosowisky, J. Med. Chem. 24, 1177 (1981). As sínteses de ddC, ddl e AZT são também descritas na Patente Europeia EPO 484071. O composto 3'-flúoro-2',3'-didesoxitimidina é sintetizado pelos procedimentos de Herdewijn, P. et al., J. Med. Chem. 30, 1270 (1987). O composto L-735.524 é N-(2(R)-hidroxi-l(S)-indanil)-(2(R)-fenilmetil-4-(S)-hidroxi-5-(l-(4-(3-piridilmetil)-2(S)-N'-(t-butilcaboxamido)-piperazinil))-penta-namida, ou sal deste farmaceuticamente aceitável. L-697.661 ou '661' é 3-([4,7-dicloro-1,3-benzoxazol-2-il)metil]-amino)-5-etil-etil-6-metil-piridina-2( lH)-ona; L-696.229 é 3-[2-(l ,3-benzoxazol-2-il)-etil]-5-etil-6-metil-piridina-2(lH)-ona. As sínteses de L-697.661 e L-696.229 estão descritas nas Patentes Europeias EPO 484071, e EPO 462800, ambas aqui incorporadas a título de referência.

Combinações preferidas são tratamentos simultâneos, intermitentes ou alternados de L-743.726 com ou sem um inibidor de protease de HIV. Um terceiro componente opcional na combinação é um nucleósido inibidor de transcriptase reversa de HIV, tais como AZT, ddC ou ddl. Um inibidor de protease de HIV preferido é L-735.524. Outros inibidores de transcriptase reversa de HIV preferidos incluem L-697.661. Estas combinações podem ter efeitos sinergísticos na limitação da disseminação do HIV. Combinações preferidas -43 - incluem as seguintes: (1) L-743.726 com L-735.524, e opcionalmente qualquer de L-697.611, AZT, ddl ou ddC; (2) L-743.726 e qualquer de L-697.611, AZT, ddl ou ddC. São também incluídos sais destas combinações farmaceuticamente aceitáveis. EXEMPLO 1 (+/-) 4-(1,1,1 ,-trifluorometil)-4-( 1 -buten-4-il)-6-cloro-1,4-di-hidro-2H-3,1 benzoxazin-2-ona: (Composto 15)_

Passo A: N-(4-clorofenilV2.2-dimetilpropanamida A um balão de fundo redondo de 3 tubuladuras de 5 L com um agitador suspenso foram adicionados 4-cloroanilina (127,57 g, 1 mole), 1200 mL de CHCI3, e 1200 mL de solução aquosa saturada de Na2C03. Um funil de adição foi ligado ao balão e carregado com cloreto de 2,2-dimetilpropanoílo (129 mL, 1,05 mole). O cloreto de ácido foi adicionado gota a gota à mistura agitada vigorosamente durante 1 hora. A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por mais 23 horas. Uma parte do produto separou-se da mistura como cristais brancos. Estes cristais foram recolhidos por filtração. O filtrado foi transferido a um funil separador e as camadas foram separadas. A camada de clorofórmio foi lavada com água e salmoura. A secagem (MgSO^, filtração, e remoção do solvente in vacuo produziram produto adicional. As duas porções de produto foram combinadas e re-cristalizadas a partir de EtOAc-hexanos em ebulição para dar 185,6 g de N-(4-clorofenil)-2,2-dimetil propanamida como um sólido cristalino branco.

Passo B: l-(2-amino-5-clorofenil)-2.2.2-trifluoroetanona A um balão de fundo redondo de 3 tubuladuras seco em forno de 3 -44- L com um agitador suspenso, entrada para árgon e um funil de adição seco em forno de 500 mL foram adicionados N-(4-clorofenil)-2,2-dimetilpropanamida (100 g, 472 mmol) e THF seco (1 L). Esta solução foi arrefecida num banho de gelo até 0o C e o funil de adição foi carregado com n-butil-lítio (387 mL de uma solução de 2,5 M em hexanos, 968 mmol). A solução de n-butil-lítio foi adicionada gota a gota à solução de amida lentamente durante lh, mantendo a temperatura abaixo de +5° C. A solução resultante foi envelhecida a 0o C por 1 h e durante este tempo formou-se um precipitado cor de laranja. A esta mistura foram adicionados 1,1,1-trifluoroacetato de etilo (115 mL, 968 mmol), gota a gota durante lh. A solução límpida resultante foi envelhecida durante mais 30 min. A reacção foi temperada com HC1 aquoso a 5 %. A mistura foi diluída com 1 L de EtOAc e as camadas foram separadas. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca (MgS04), filtrada e concentrada in vacuo. para dar 160 g de um óleo amarelo. Este material foi suspenso em 1 L de HC1 3N aquoso e a solução foi aquecida à temperatura de refluxo durante 24 h. A solução arrefecida foi diluída com 1 L de EtOAc e a mistura foi tomada básica com NH4OH concentrado. As camadas foram separadas e a fase orgânica foi lavada com salmoura, seca (MgS04), filtrada, concentrada in vacuo. e cromatografada sobre 1,5 kg de gel de sílica usando EtOAc a 15 % em hexano como eluente. O material cromatografado foi re-cristalizado a partir de hexano em ebulição para dar 57 g (54 %) de l-(2-amino-5-clorofenil)-2,2,2-trifluoroetanona pura como cristais amarelos vivos, pf: 91 - 92° C. lU NMR (CDC13):Ô 6,46 (br s, 2H), 6,69 (d, 1H, J - 9,2 Hz), 7,32 (dd, 1H, J = 2,4, 9,2 Hz), 7,70 (d,lH, J = 2,4 Hz).

Passo C: (+/ -) 2-('2-Amino-5-clorofenilVl.l.l-trifluoro-5-hexen-2-ol A um balão de fundo redondo de 3 tubuladuras seco em forno de 300 mL com uma barra de agitar, entrada para árgon, um funil de adição e um condensador de refluxo foram adicionados magnésio (aparas, 3,03 g, 125 mmol) -45- e THF seco (75 mL). A esta bem agitada mistura foi adicionado 4-bromo-l-buteno (12,0 mL, 118,21 mmol) numa velocidade tal que permitisse manter um suave refluxo. Quando a adição estava completa, a mistura foi envelhecida 30 min depois arrefecida até 0o C num banho de gelo. A esta bem agitada mistura foi adicionada uma solução de l-(2-amino-5-clorofenil)-2,2,2-trifluoroetanona (5,00 g, 22,36 mmol) em THF (35 mL), gota a gota durante 30 min. O banho de arrefecimento foi deixado expirar e a mistura foi agitada por 20 h à temperatura ambiente. A reacção foi diluída com EtOAc e ácido cítrico aquoso a 10 %. Esta mistura foi agitada durante 4 h. As camadas foram separadas e a fase orgânica foi lavada com NaHCC>3 aquoso e salmoura. Secagem (MgSO^, filtração, remoção do solvente in vacuo. e cromatografia sobre 300 g de gel de sílica usando EtOAc a 15 % em hexano como eluente deu 4,80 g de (+/-) 2-(2-amino-5-clorofenil)-l,l,l-trifluoro-5-hexen-2-ol como um sólido amarelo.

Passo D: (+/-) 4-(1,1,1 ,-trifluorometil)-4-(l-buten-4-il)-6-cloro-1,4-di-hidro- 2H-3.1-benzoxazi-2-ona_ A um balão de fundo redondo de 200 mL com uma barra de agitar, entrada para árgon e um condensador de refluxo foram adicionados (+/-) 2-(2-Amino-5-clorofenil)-l,l,l-trifluoro-5-hexen-2-ol (4,80 g, 17,16 mmol), 1,1'-carbonildi-imidazole (13,91 g, 85,81 mmol) e THF seco (75 mL). Esta mistura foi aquecida a 60° C durante 18 h. A mistura de reacção arrefecida foi diluída com EtOAc e lavada com H20 (3X 200 mL) e salmoura (250 mL). Secagem (MgS04), filtração, remoção do solvente in vacuo. seguidos por re-cristalização a partir de EtOAc-hexano em ebulição deu 3,22 g de (+/-) 4-(l,l,l,-trifluorometil)-4-(l-buten-4-il)-6-cloro-l,4-di-hidro-2H-3,l-benzoxazi-2-ona como um sólido branco cristalino, pf: 165 - 166° C. 'H NMR (CDCL3): δ 1,99 (m, 1H), 2,09 - 2,40 (m, 3H), 5,00 (d, 1H, J = 1,4 Hz), 5,03 (dd, 1H, J = 1,4, 7,9), 5,78 (m, 1H), 6,85 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 7,21 (br s, 1H), 7,35 (dd, 1H, J = 2,2, 8,6 Hz), 9,63 (br s, 1H). -46- h^rfr C- -46-

EXEMPLO 2 (+/-) 6-Cloro-4-etinil-4-( 1,1,1 -trifluorometil)-1,4-di-hidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-ona (Composto 26)_

Passo A: 2-(2-amino-5-clorofenil)-l.l.l-trifluoro-3-butin-2-ol

Um balão de 3 tubuladuras de fundo redondo de 500 ml equipado com um funil de adição, entrada para árgon, barra de agitar e termómetro digital foi carregado com brometo de etinil magnésio (0,5 M em hexano; 268 mL, 134 mmol) depois arrefecido até -78° C. A adição gota a gota de l-(2-amino-5-clorofenil)-2,2,2-trifluoroetanona (6,0 g, 26,8 mmol) em 50 mL de THF foi completada depois de 15 minutes mantendo a temperatura =-55° C. A mistura de reacção foi agitada durante 16 h depois de aquecida lentamente à temperatura ambiente. A solução de cor vermelho escuro foi temperada a -5o C pela adição gota a gota de solução de cloreto de amónio aquoso saturado (60 mL). Extracção de acetato de etilo seguida por lavagens de ácido cítrico a 10 %, bicarbonato de sódio saturado, água e salmoura, forneceram 8,5 g de produto bruto depois de secagem sobre sulfato de sódio, filtração, e evaporação de solvente. Purificação por meio de cromatografia "flash" usando 15 - 20 % de acetato de etilo: hexano forneceu 2-(2-amino-5-clorofenil)-l,l,-trifluoro-3-butin-2-ol puro (5 g de óleo de cor castanho claro, rendimento de 75 %).

Passo B: (+/-) 6-Cloro-4-etinil-4-( 1,1,1 -trifluorometil)-1,4-di-hidro-2H-3,1 - benzoxazin-2-ona

Uma solução em THF de 2-(2-amino-5-clorofenil)-1,1,1-trifluoro-3-butin-2-ol (5,0 g, 20,0 mmol em 225 mL de THF) foi tratada com 1,T- -47- Âçtb*-yb CL·— carbonildi-imidazole (13,0 g, 80,0 mmol) e aquecida num banho de óleo a 60° C durante 17 h. O THF foi removido in vacuo. o resíduo dissolvido em acetato de etilo depois lavado com ácido cítrico a 10 %, bicarbonato de sódio, água e salmoura antes de secar sobre sulfato de sódio. A seguir à filtração e evaporação in vacuo o produto bruto foi isolado (3,6 g) e re-cristalizado a partir de acetato de etilo:hexano. O produto (+/-) 6-Cloro-4-etinil-4-( 1,1,1 -trifluorometil)- 1,4-di-hidro-2H-3,l-benzoxazin-2-ona foi isolado como um sólido cristalino branco (3,22 g, rendimento de 58,4 %: pf 226 - 227° C. 'H-NMR (CDC13 + vestígio de DMSO): δ 3,16 (s, 1H), 6,98 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,35 (m, 1H), 7,51 (s, 1H), 10,66 (s,lH). EXEMPLO 3 (+/-) 6-Cloro-4-( 1,1,1 -trifluorometil)-4-[(3-( 1 -pirrolidinil))-1 -propinil] -1,4-di- hidro-2H-3.1-benzoxazin-2-ona (Composto 7)_

Uma solução de dioxano de (+/-) 6-Cloro-4-etinil-4-( 1,1,1-trifluorometil)-l,4-di-hidro-2H-3,l-benzoxazin-2-ona (150 mg, 0,544 mmol), pirrolidina (52,2 pL, 0,626 mmol), paraformaldeído (20,5 mg, 0,681 mmol), ácido acético (31,1, pL, 0,544 mmol) e cloreto de cobre (I) (20,5 mg, 0,207 mmol em 3,5 ml de dioxano) foi aquecida até 50° C num banho de óleo durante aproximadamente 2 h. A mistura de reacção foi temperada em HC1 2N e extraída com acetato de etilo. A camada aquosa foi neutralizada com carbonato de potássio sólido e extraída com acetato de etilo (3x). Os extractos combinados foram lavados com água e salmoura antes de secar em sulfato de sódio para fornecer 140 mg de produto bruto. Purificação cromatográfica em gel de sílica e re-cristalização a partir de acetato de etilo: hexano forneceu (+/-) 6-cloro-4- -48- (1,1,1 -trifluorometil)-4-[(3-( 1 -pirrolidinil))-1 -propinil]-1,4-di-hidro-2H-3,1 -ben-zoxazin-2-ona cristalina (89 mg, rendimento de 46 %): PF 160 - 161° C (dec). 'H-NMR (CDC13): δ 1,85 - 1,89 (m, 4H), 2,68 2,71 (m, 4H), 3,67 (s, 1H), 6,88 (d, J = 8,55 Hz, 1H), 7,40 (dd, J = 2,19, 8,54 Hz, 1H), 7,55 (s, 1H), 9,45 (s, 1H). (+/-) 6-Cloro-4-(2-cianofenil)etinil-4-( 1,1,1 -trifluorometil)-1,4-di-hidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-ona (Composto 21_

Uma solução de 6-Cloro-4-etinil-4-( 1,1,1-trifluorometil)-1,4-di-hidro-2H-3,l-benzoxazin-2-ona (138 mg, 0,5 mmol) em 3 mL de THF seco foi agitada a -78° C. A esta solução foram acrescentados 0,4 mL (1,0 mmol) de n-butil-lítio, 2,5 M em hexano. O anião foi envelhecido durante 10 minutos a -78° C e depois foi adicionada uma solução de 1 mL de ZnCl2 (1 M em éter). A mistura de reacção foi deixada a agitar a -78° C durante 15 minutos, o banho de gelo foi removido e a mistura foi lentamente aquecida até 0o C durante 30 min. A mistura de reacção foi adicionada uma solução de 2-iodobenzonitrilo (149 mg, 0,65 mmol) em 2 mL de THF, seguindo-se tetrakis(trifenilfosfina)paládio(0) (56 mg, 0,05 mmol). A mistura de reacção foi deixada a aquecer até a temperatura ambiente e foi continuada a agitação durante 15 horas. A mistura de reacção foi temperada com 10 mL de HC1 2N, extraída com 2x 200 mL de EtOAc e os extractos combinados foram lavados com H20, salmoura e secos em MgSO^ O solvente foi removido para dar 195 mg de um óleo que foi sujeito a cromatografia "flash" em gel de sílica (EtOAc a 20 % em hexano) para fornecer 60 mg do material de partida não reagido e 35 mg do produto acoplado. Este foi triturado com éter para render 25 mg de (+/-) 6-Cloro-4-(2-cianofenil)etinil-4-( 1,1,1-trifluorometil)-l,4-di-hidro-2H-3,l-benzoxazin-2-ona. pf: 245 - 246° C FAB. MS M+l = 377 m/e. ’Η-NMR (CDC13): δ 6,82 - 6,85 (d, J = 8,5 Hz, 1H); 7,40 - 7,44 (dd, J = 2,1, 8,5 Hz, 1H); 7,56 - 7,79 (m, 5H); 8,00 (s, 1H). -49- EXEMPLO 4 (+/-) 4-( 1 -Cloro-1,1 -difluorometil)-4-(2-feniletinil)-6-cloro-1,4-di-hidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-ona (Composto 5)_

Passo A: l-(2-amino-5-clorofenil)-2-cloro-2.2-difluoroetanona A um balão, seco em forno, de 3 tubuladuras de fundo redondo e 300 mL, com uma barra de agitar magnética, entrada para árgon, e um funil de adição de 100 mL seco em forno foram adicionados N-(4-clorofenil)-2,2-dimetil-propanamida (10 g, 47,2 mmol) e THF seco (100 mL). Esta solução foi arrefecida num banho de gelo até 0o C e o funil de adição foi carregado com n-butil-lítio (38,7 mL de uma solução de 2,5 M em hexanos, 96,8 mmol). A solução de n-butil-lítio foi adicionada gota a gota à solução de amida lentamente durante 1 h, mantendo a temperatura abaixo de +5° C. A solução resultante foi envelhecida a 0o C durante lhe durante este tempo formou-se um precipitado cor de laranja. A esta mistura foram adicionados 1-cloro-1,1-difluoroacetato de etilo (10,2 mL, 96,8 mmol), gota a gota durante 15 min. A solução límpida resultante foi envelhecida por mais 30 min. A reacção foi temperada com HC1 aquoso a 5 %. A mistura foi diluída com 1 L de EtOAc e as camadas foram separadas. A fase orgânica foi lavada com salmoura, seca (MgS04), filtrada e concentrada in vacuo. para dar 160 g de um óleo amarelo. Este material foi suspenso em 200 mL de HC1 3N aquoso e a solução foi aquecida à temperatura de refluxo durante 24 h. A solução arrefecida foi diluída com 500 mL de EtOAc e a mistura foi tomada básica com NH4OH concentrado. As camadas foram separadas e a fase orgânica foi lavada com salmoura, seca (MgS04), filtrada, concentrada in vacuo. e cromatografada sobre 350 g de gel de sílica usando EtOAc a 15 % em hexano como eluente. O material cromatografado foi re-cristalizado a partir de hexano em ebulição para dar 5,5 g de l-(2-amino-5-clorofenil)-2-cloro-2,2-difluoroetanona pura como cristais amarelos vivos, pf: 55 - 56° C. ’H NMR (CDC13): δ 6,43 (br s, 2H), 6,69 -50- (d, 1H, J = 9,0 Hz), 7,31 (dd, 1H, J = 2,4, 9,0 Hz), 7,80 (d, 1H, J = 2,4 Hz).

Passo B: (+/-) 2-(2-amino-5-clorofenil)-4-fenil-l-cloro -1.1 -difluoro-3-butin-2-ol_ A um balão de 100 mL de 3 tubuladuras, de fundo redondo, seco em forno, com uma barra de agitar, entrada para árgon, condensador de refluxo e um septo foram adicionados etinil benzeno (2,13 g, 20,83 mmol), THF seco (50 mL) e brometo de etil magnésio (6,94 mL de uma solução de 3,0 M em éter). Esta mistura foi envelhecida 2 h à temperatura ambiente e depois uma solução de l-(2-amino-5-clorofenil)-2-cloro-2,2-defluoroetanona (1,00 g, 4,17 mmol) em THF (6 mL) foi adicionada com uma seringa. A solução de cor vermelho-alaranjada resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 21,5 h. A reacção foi temperada pela adição de HC1 (50 mL) depois diluída com EtOAc. A solução foi então tomada básica com NH4OH concentrado e as camadas foram separadas. A fase orgânica foi lavada com água e salmoura. Secagem (MgS04), filtração, remoção do solvente in vacuo. e cromatografia sobre gel de sílica usando EtOAc a 20% em hexano como eluente deu 1,02 g de (+/-) 2-(2-amino-5-clorofenil)-4-fenil-1-cloro-l,l-difluoro-3-butin-2-ol como um sólido quase branco. ’H NMR (CDCI3): δ 4,42 (br s, 2H), 5,10 (br s, 1H), 6,65 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 7,15 (dd, 1H, J = 2,4, 8,5 Hz), 7,38 (m, 3H), 7,55 (m, 2H), 7,70 (d, J = 2,4 Hz).

Passo C: (+/-) 4-( 1 -Cloro-1,1 -difluorometil)-4-(2-fenil-etil)-6-cloro-1.4-di- hidro-2H-3. l-benzoxazin-2-ona_ A um balão de fundo redondo de 100 mL com uma barra de agitar, condensador de refluxo, e uma entrada para árgon foram adicionados (+/-) 2-(2-amino-5-clorofenil)-4-fenil-l-cloro-l,l-difluoro-3-butin-2-ol (0,81 g, 2,37 mmol), THF seco (25 mL), e l,l'-carbonildi-imidazole (1,919 g, 11,84 mmol). A solução foi aquecida até 60° C durante 20 h. A solução de reacção arrefecida foi -51 -

diluída com EtOAc e lavada com HC1 0,5N, H20 e salmoura. A secagem (MgS04), filtração, e remoção do solvente in vacuo deu 890 mg de um óleo. Este material foi cromatografado sobre 80 g de gel de sílica usando EtOAc a 20 % em hexano como eluente. O material cromatografado foi re-cristalizado a partir de EtOAc-hexanos em ebulição para dar 507 mg, (58 %) de (+/-) 4-(l-Cloro-1,1-difluorometil)-4-(2-feniletinil)-6-cloro-l,4-di-hidro-2H-3,l-benzoxazin-2-ona como agulhas brancas, pf: 154 - 155° C. 'H NMR (CDCI3): 6 6,89 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 7,35 - 7,48 (m, 4H), 7,56 (m, 2H), 7,64 (br s, 1H), 9,19 (br s, 1H). EXEMPLO 5 (-) 6-Cloro-4-fenietinil-4-trifluorometil-1,4-di-hidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-ona (Composto 4)_

Passo A: 2-í2-Amino-5-c1orofeni1)-4-fenil-l.l.l-trifluoro-3-butin-2-ol

Uma solução de fenilacetileto de lítio, preparada a partir de 4,83 mL de fenilacetileno (0,044 mol) e 17,2 mL de uma solução de n-butil-lítio 2,5N em hexano (0,043 mol) em 50 mL de THF a -78° C, foi tratada com 11,4 g de eterato de brometo de magnésio (0,044 mol) durante 5 minutos. A mistura foi deixada a aquecer até -20° C e a agitação sob árgon foi continuada for 30 minutos. A mistura foi então arrefecida até -60° C e foi adicionada uma solução contendo 2,5 g (0,011 mol) de l-(2-amino-5-cloro)-2,2,2-trifluorometiletanona, previamente composta com um equivalente (2,8 g, 0,011 mol) de eterato de brometo de magnésio em 25 mL de THF. A mistura de reacção foi deixada a agitar a 15° durante uma hora antes de ser arrefecida até 0o C e tratada gota a gota com uma mistura de 30 mL de solução de cloreto de amónio aquoso saturado e 30 mL água. A mistura foi extraída com porções de 2 x 100 mL de éter etílico, as fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura e secas sobre MgS04. A remoção do e solventes deixou 6 g de um óleo que foi submetido a -52- cromatografia "flash" sobre gel de sílica, eluindo com EtOAc a 20 % em hexano, para fornecer 2,5 g de 2-(2-Amino-5-clorofenil)-4-fenil-1,1,1 -trifluoro-3-butin-2-ol. ’Η-NMR (CDC13): δ 4,63 (br s, 3H), 6,69 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,17 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,35 - 7,44 (m, 3H), 7,53 - 7,56 (m, 2H), 7,66 (d, J = 2 Hz, 1H). FAB MS M+H = 326 m/e.

Passo B: (±) 6-Cloro-4-feniletinil-4-trifluorometil-l,4-di-hidro- 2H-3.1-benzoxazin-2-ona (Composto 2)_

Uma solução de 2-(2-amino-5-clorofenil)-4-fenil-1,1,1 -trifluoro-3-butin-2-ol (2,9 g, 6,1 mmol) e 11,0 g (12,0 mmol) de Ι,Γ-carbonildi-imidazole em 300 mL de THF seco foi agitada sob árgon a 55° C durante 24 horas. O solvente foi removido num evaporador rotativo e o resíduo foi dividido entre 200 mL de éter e 400 mL de água. As camadas foram separadas, e o extracto aquoso extraído mais uma vez com éter. Os extractos de éter combinados foram lavados com 2 x 200 mL de ácido cítrico a 10 % e depois com salmoura antes de secar sobre MgS04. A remoção do agente de secagem e do solvente forneceu 1,5 g (70 %) do composto bruto do título como um óleo. Trituração com éter-hexano forneceu 875 mg de (±) 6-cloro-4-feniletinil-4-trifluorometil-l,4-di-hidro-2H-3,l-benzoxazin-2-ona como um sólido branco, fusão parcial a 137°, límpida a 147° C. 'H-NMR (CDC13): δ 6,92 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,30 - 7,49 (m, 4H), 7,58 - 7,65 (m, 3H), 8,99 (s, 1H).

Passo C: 6-Cloro-1 -(1 S)-canfanoil-4-feniletinil-4-trifluoro-metil-1.4-di- hidro-2H-3.1 -benzoxazin-2-ona_ A uma solução contendo (±)6-cloro-4-feniletinil-4-trifluorometil-l,4-di-hidro-2H-3,l-benzoxazin-2-ona (2,24 g, 6,37 mmol), 4-dimetilamino-piridina (0,10 g, 0,8 mmol), e (-) de cloreto de ácido canfanico (2,07 g, 9,55 mmol) em 60 mL de diclorometano seco, agitada sob árgon num banho de gelo, -53 - foi adicionada trietilamina (2,22 mL, 15, 9 mmol). O banho de arrefecimento foi removido e a reacção foi deixada prosseguir à temperatura ambiente. Quando a reacção estava completa por cromatografia de camada fina (S1O2, EtOAc a 4 % em CHCI3), a solução foi diluída com 200 mL de CHC13 e lavada duas vezes com ácido cítrico a 10 %, e depois com salmoura. Após secagem (MgSCL), o solvente foi removido num evaporador rotativo e o resíduo espumoso foi submetido a cromatografia "flash", eluindo com CHCI3. Foram obtidos 575 mg de diastereómero I de 6-cloro-(lS)-canfanoil-4-feniletinil-4-trifluorometil-l,4-di-hidro-2H-3,l-benzoxazin-2-ona como um óleo. 'H-NMR (CDCI3): δ 0,85 (s, 3H), 1,08 (s, 3H), 1,22 (s, 3H), 1,73 - 1,85 (m, 1H), 1,92 - 2,08 (m, 1H), 2,50 - 2,67 (m, 2H), 7,30 - 7,79 (m, 8H). Isto foi seguido por 1,52 g de ffacções mistas (diastereómeros I e II). A eluição continuada forneceu 680 mg do diastereómero de movimento lento (II) do composto do título que, depois de triturado com uma mistura de éter/ hexano, deu um aglomerado de agulhas brancas, pf 177 - 178,5° C; ’Η-NMR (CDCI3): δ 0,83 (s, 3H),1,12 (s, 3H), 1,23 (s, 3H), 1,73 - 1,86 (m, 1H), 1,93 - 2,06 (m, 1H), 2,50 - 2,63 (m, 2H), 7,38 - 7,51 (m, 4H), 7,49 - 7,62 (m, 2H), 7,72 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,76 (d, J = 2 Hz, 1H).

Os 1,52 g da mistura de isómero da cromatografia "flash" foram dissolvidos em 75 mL de éter, a solução diluída com 50 mL de hexano, e depois feitos semente com um cristal de isómero II. A cristalização lenta forneceu 385 mg adicionais de isómero II que foram re-cristalizados a partir de éter/ hexano para dar >96 % de material diastereomericamente puro por HPLC.

Passo D: (-) 6-Cloro-4-feniletinil-4-trifluorometil 1,4-di-hidro- 2H-3.1 benzoxazin-2-ona_ O diastereómero cristalino (II) de 6-cloro-l-(lS)-canfanoil-4-feniletinil-4-trifluorometil-l,2-di-hidro-4H-3,l-benzoxazin-2-ona (53 mg, 0,10 mmol) foi dissolvido em 8 mL de 2-propanol a 45° C sob uma atmosfera de -54- (Qa. γ árgon. À solução, foram adicionados 0,27 mL de uma solução aquosa de K2C03 a 10 %. A agitação foi continuada durante 10 min., no fim de cujo tempo todo o material de partida tinha sido consumido (TLC, Si02, EtOAc em CHCI3 a 4 %). A solução foi concentrada in vacuo e o resíduo tomado em éter. Depois de lavagem com HC1 0,1N e salmoura, a solução de éter foi seca (MgSO^, filtrada e evaporada in vacuo até obter-se um sólido oleoso que foi purificado por cromatografia de Si02, eluente 2-propanol a 5% em hexano. (-) 6-cloro-4-fenietinil-4-trifluorometil-l,4-di-hidro-2H-3,l-benzoxazin-2-ona foi obtido como agulhas brancas a partir de éter/ hexano, pf 178 - 179° C; [cx]D20 = -92,5° (CHCI3, c = 0,0012 g mL-Ι); 'H-NMR (CDC13): δ 6, 87 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,37 - 7,50 (m, 4H), 7,56 - 7,63 (m, 3H), 8,60 (s, 1H).

Passo E: (+) 6-Cloro-4-feniletinil-4-trifluorometil 1,4-di-hidro- 2H-3.1 benzoxazin-2-ona (Composto 31_ (+) 6-C1 oro-4-fenietinil-4-trifluorometil-1,4-di-hidro-2H-3,1 -benzo-xazin-2-ona foi preparado a partir do produto não cristalino do Passo C, diasterómero I, de uma maneira de acordo com 0 Passo D: p.f. 178 - 179° C; [a]D20 = + 87,6° (CHCI3, c = 0,0050 g mL-Ι; 'H-NMR (CDC13): δ 6,87 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,37 - 7,50 (m, 4H), 7,56 - 7,63 (m, 3H), 8,60 (s, 1H). EXEMPLO 6 (-) 6-Cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-di-hidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-ona (L-743.726, Composto 37,2) e (+) 6-Cloro-4-ciclopropiIetinil-4-trifluoromer til-1.4-di-hidro-2H-3.1-benzoxazin-2-ona (L- 743.7251_

Passo A: 2-(2-Amino-5-clorofenil)-4-ciclopropil-1.1.1 -trifluoro-3-butin-2-ol

Uma solução de ciclopropilacetileto de bromomagnésio, foi («'i -55- preparada a partir de 23 g de ciclopropilacetileno (0,348 mol) em 250 mL de THF pela adição gota a gota de 116 mL de uma solução de 3,0M de brometo de etilmagnésio em éter (0,348 mol) durante 1 h. Esta solução foi mantida a 0o C durante 1 h, depois a 40° C durante 3 h. A esta solução, re-arrefecida até 0o C, foram adicionados, porção a porção, 15,56 g de l-(2-amino-5-clorofenil)-2,2,2-trifluorometiletanona (0,0696 mol) como um sólido durante 5 min. A mistura de reacção foi deixada a agitar a 0o durante 1,5 horas. A reacção foi temperada a 0o C pela adição gota a gota de 700 mL de solução de cloreto de amónio aquoso saturado. A mistura foi extraída com porções de 2 x 400 mL de acetato de etilo, as fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura e secas sobre MgSCL. A remoção do agente de secagem e solventes deixou um sólido amarelo. Este material foi re-cristalizado a partir de hexanos em ebulição (100 mL de volume final) para fornecer 14,67 g de 2-(2-Amino-5-clorofenil)-4-ciclopropil-l,l,l-trifluoro-3-butin-2-ol. Uma segunda colheita (2,1 g) foi obtida a partir da concentração de águas mães. pf: 153 - 154° C. 'H-NMR (CDCI3): δ 0,84 (m, 2H), 0,90 (m, 2H) 1,38 (m, 1H), 4,50 (br s, 3H), 6,69 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,13 (dd, J = 2,5, 8,5 Hz, 1H), 7,55 (d, J = 2,5 Hz, 1H).

Passo B: (±) 6-Cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-l,4-di-hidro- 2H-3 J-benzoxazin-2-ona (L- 741.211)_

Uma solução de 2-(2-amino-5-clorofenil)-4-ciclopropil-1,1,1-trifluoro-3-butin-2-ol (15,00 g, 0,0518 mol) e 41,98 g (0,259 mol) del,l'-carbonildi-imidazole em 250 mL de THF seco foi agitada sob árgon a 55° C durante 24 horas. O solvente foi removido num evaporador rotativo e o resíduo foi dividido entre 500 mL de acetato de etilo e 400 mL de água. As camadas foram separadas e a fase aquosa foi extraída mais uma vez com acetato de etilo. Os extractos combinados de acetato de etilo foram lavados com 2 x 200 mL de HC1 aquoso a 2 %, NaHCOa aquoso saturado, e salmoura. A secagem sobre -56- -56- •2? A^h*.rb ^

MgS04, filtração, e remoção do solvente in vacuo forneceu 16,42 g do composto do título como um sólido. A re-cristalização a partir de acetato de etilo hexano forneceu 12,97 g de (±) 6-cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-l,4-di-hidro-2H-3,l-benzoxazin-2-ona analiticamente puro, como cristais brancos, pf 178 — 180° C. ‘H-NMR (CDC13): 0,85 (m, 2H), 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, 1H), 6,81 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,37 (dd, J = 2,5, 8,5 Hz, 1H), 7,49 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 8,87 (br s, 1H).

Passo C: 6-Cloro-1 -(1 S)-canfanoil-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-di- hidro-2H-3.1 -benzoxazin-2-ona_ A uma solução contendo (±) 6-cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-l,4-di-hidro-2H-3,l-benzoxazin-2-ona (12,97 g, 0,041 mol), 4-dimetilaminopiridina (1,02 g, 0,0083 mol), e cloreto de ácido (-)-canfanico (14,22 g, 0,06556 mol) em 350 mL de diclorometano seco, agitados sob árgon num banho de gelo, foi adicionada trietilamina (22,84 mL, 0,164 mol). O banho de arrefecimento foi removido e a reacção foi deixada prosseguir à temperatura ambiente. Depois de 75 min. a reacção foi julgada completa por cromatografia de camada fina (Si02, EtOAc a 4 % em CHCI3), e a solução foi diluída com 500 mL de CHCI3 depois lavada com ácido cítrico a 10% (2 x), água (1 x), e salmoura (1 x). A secagem(MgSC>4), filtração, e remoção do solvente in vacuo deixou uma espuma incolor. Este material foi triturado com 200 mL de hexano em ebulição. Ao arrefecer até a temperatura ambiente precipitou-se a desejada imida de canfanato diastereomérico. O sólido foi recolhido numa frita, lavado com um pouco de hexanos frios e seco in vacuo para dar 7,79 g de 6-cloro-l-(lS)-canfanoil-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-l,4-di-hidro-2H-3,l-benzoxazin-2-ona como cristais brancos, pf: 164 - 165° C. Pureza de HPLC: 99,2 % @ 254 nm. 'H-NMR (CDCI3): δ 0,77 (s, 3H), 0,86 - 0,96 (m, 4H), 1,08 (s, 3H), 1,19 (s, 3H), 1,44 (m, 1H), 1,76 (m, 1H), 1,95 (m, 1H), 2,51 (m, 2H), 7,42 (dd, J = 2,4, 9,0 Hz, 1H), 7,63 (m, 2H). -57- (qa. ffa d----- (

Passo D: (-) 6-Cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-di-hidro-2H-3,1 - benzoxazin-2-ona (L-743.726. Composto 37.2)_ 6-cloro-1 -(1 S)-canfanoil-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-di-hidro-4(H)-3,l-benzoxazin-2-ona (7,50 g, 0,01512 mol) foi dissolvida em 150 mL de n-butanol a 60° C sob uma atmosfera de árgon. A esta solução foram adicionados 10 mL de HC1 IN. Esta solução foi mantida a 60° C durante 72 h. A mistura foi neutralizada com NaHC03 aquoso e o n-butanol foi removido in vacuo. O resíduo foi dissolvido em 150 mL de THF e tratado com 50 mL de LiOH 2N durante 3 h à temperatura ambiente. Esta mistura foi diluída com acetado de etilo e lavada com duas porções de água e uma de salmoura. A secagem (MgS04), filtração e remoção do solvente in vacuo deu um sólido branco. Este material foi re-cristalizado a partir de hexano quente para dar 3,43 g de (-) 6-cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-di-hidro-2H-3,1 -benzoxa-zin-2-ona como cristais brancos, pf. 131 - 132 ° C; [cc]D20 = - 84,7° (CHCI3, c = 0,005 g mL'1); 'H-NMR (CDC13): δ 0,85 (m, 2H), 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, 1H), 6,81 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,37 (dd, J = 2,5, 8,5 Hz, 1H), 7,49 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 8,87 (brs, 1H).

Passo E: (+)6-Cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-l,4-di-hidro-2H-3,l- benzoxazin-2-ona (Έ-743.7251_

As águas mãe do Passo C acima foram purificadas por cromato-grafia de coluna em gel de sílica usando acetado de etilo a 10 % em hexanos como eluente. O diastereómero puro, indesejado (uma espuma incolor) foi hidrolizado de acordo com o Passo D. A benzoxazinona enantiomérica, (+) 6-Cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-di-hidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-ona, foi obtida como cristais brancos, pf. 131 - 132° C; [a]D20 = + 84,4° (CHC13, c = 0,005 g mL·1); ‘H-NMR (CDC13): δ 0,85 (m, 2H), 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, 1H), 6,81 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,37 (dd, J = 2,5, 8,5 Hz, 1H), 7,49 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 8,87 (br s, 1H).

ENSAIO DE TRANSCRIPTASE REVERSA O ensaio mede a incorporação de monofosfato de desoxiguanosina tritiatada pela recombinação de transcriptase reversa do HIV (HIV RTr) (ou outro RT) em ácido passível de ser precipitado cADN nos valores Km de dGTP e poli r(C)*oligo d(G)i2-i8- Os inibidores da presente invenção inibem esta incorporação.

Os ensaios foram levados a cabo em 55 mM Tris (pH 8,2)-30 mM KC1-30 mM MgCl2-l mM de ditiotreitol-20 ou rC:dGi2-i8 (Pharmacia) por ml-8 mM [3H]dGTP (New England Nuclear)-0,01 % Triton X-100-50 mM ácido etileno glicol-bis(B-amino-etil éter)-N,N,N',N'-tetracético (EGTA)-1 mg de soro de albumina de bovino por ml. Depois de 60 min de incubação a 37° C, material ácido-precipitável foi recolhido em filtros de fibra de vidro usando um colector de células semi-automático. Extractos de células bacterianas contendo RT foram diluídos até estarem dentro da gama linear do ensaio, e a actividade foi determinada na presença e na ausência de um inibidor. Heterodímero de HIV-1 RT purificado produzido em E. coli também serviu como controlo. Os resultados são determinados como concentração de inibidores para dar 50 % de inibição (IC50 p), em nanomoles/ litro.

Para o ensaio de duplo mutante (dm), foi empregue AI7 Rt no ensaio. A17 Rt é resistente a várias aminopiridonas, como descrito em Nunberg, J. H. et al, J. Virol. 65, 4887 (1991). Os resultados são medidos como IC50 dm em nanomoles/ litro.

ENSAIO DE DISSEMINAÇÃO DE CÉLULAS A inibição da disseminação de HIV em cultura de células foi medido de acordo com Nunberg, J. H. et al., Virol. 65,4887 (1991). Neste ensaio, células linfóides MT-4 T foram infectadas com HIV-1 (tipo selvagem, a menos que indicado de outra maneira), pelo uso de um inoculado pré-determinado, e as culturas foram incubadas por 24 h. Neste momento, <1 % das células eram positivas por imunofluorescência indirecta. As células foram, então, extensivamente lavadas e distribuídas em placas de cultura de 96 cavidades. Diluições duplas de inibidor em série foram adicionadas às cavidades, e as culturas foram continuadas durante mais 3 dias. A uma pós-infecção de 4 dias, 100 % das células em cultura de controlo estavam infectadas. A acumulação de HIV-1 p24 estava directamente correlacionada com a disseminação do vírus. A concentração inibidora de cultura de células foi definida como a concentração de inibidor em nanomoles/ litro que reduziu a disseminação de infecção por pelo menos 95 %, OU CIC95. RESUMO DOS RESULTADOS PARA O COMPOSTO 37,2 A. Ensaio de Transcriptase Reversa e Ensaio de Disseminação de Células: P K103N* Y181C DM RT-2 ICso^M) 0,002 0,030 0,008 0,085 80,8 CIC95(pM) <0,006 (N=2) 0,100 <0,025 0,400 N. D. -60- ij*. YÍ"^ ^ B. Dados Farmacológicos:

Rhesus: r\

O.B. = 0,55 (A.U.C.) 1 mg kg'1 i.v.:ti/2=210 min. 10 mg kg '' p.o. (metocel): Cmax= 4,4 μΜ @ 2h C24h = 1,1 μΜ

Ligação a proteínas: 98,0 % Plasma Humano Normal (Método HPLC)

Os mutantes K103N e Y181C são transcriptases reversas de HIV-1 resistentes aos fármacos. DM é o duplo mutante, como discutido no ensaio de transcriptase reversa. RT-2 é a transcriptase reversa de HIV-2.

EFEITOS SINERGÍSTICOS

A. Preparação de Suspensão de células MT-4 infectadas por HIV Células MT foram infectadas no Dia 0 a uma concentração de 250.000 por ml com uma diluição de 1:1000 de lote Illb de concentrado de HIV-1 (final de 125 pg p24/ ml; suficiente para render < 1% de células infectadas no dia 1 e 25 -100 % no dia 4). As células foram infectadas e desenvolvidas no seguinte meio: RPMI 1640 (Whittaker BioProducts), 10 % de soro fetal bovino inactivado, 4 mM de glutamina (Gibco Labs) e 1:100 de Penilicina-estreptomicina (Gibco Labs). A mistura foi incubada de um dia para o outro a 37° C numa atmosfera de C02 a 5 %. B. Tratamento com Inibidores

Foi preparada uma matriz de concentrações de gama nanomolar das -61 - combinações em pares (ver Tabela S). No dia 1, foram adicionadas partes alíquotas de 125 μΐ de inibidores a volumes iguais de células MT-4 infectadas por HIV (50.000 por cavidade) num placa de cultura de células micro-titulador de 96 cavidades. A incubação foi continuada durante 3 dias a 37° C numa atmosfera de C02 a 5 %. C. Medições de Disseminação de Vírus

Usando uma pipeta de múltiplos canais, as células assentes foram re-suspensas e 125 μΐ foram colhidos numa placa de microtitulação separado. O sobrenadante foi testado para avaliação de antigénio de HIV p24. A concentração de antigénio de HIV p24 foi medida por um teste de imunização de enzima, descrito como a seguir. Alíquotas de antigénio p24 a serem medidas foram adicionadas às micro-cavidades revestidss com um anticorpo monoclónico específico para antigénio de núcleo de HIV. A esta altura, e em outros passos apropriados que se seguem, as micro-cavidades foram lavadas. Anticorpo biotinilatado específico de HIV foi então adicionado, seguido de peroxidase conjugada de rábano silvestre e estrepavidina. A reacção de cor ocorre a partir do peróxido de hidrogénio adicionado e substrato de tetrametilbenzidina. A intensidade da cor é proporcional à concentração de antigénio de HIV p24. Cálculo do Grau de Sinergia

Combinações aos pares de inibidores (ver Tabela 5) exibiram acentuadamente um aumento de inibição da disseminação do vírus, em comparação com cada inibidor por si só, ou em comparação com a mera inibição aditiva de cada inibidor. Assim, por exemplo, a combinação em par de 726 e AZT exibiu um acentuado aumento da inibição da disseminação do vírus, em -62- 4 comparação com 726 por si só ou com AZT por si só, ou em comparação com a soma da inibição de 726 e da inibição de AZT.

Estes dados foram processados como a seguir: as proporções de concentração inibidora fraccional (CIF) foram calculadas de acordo com Elion, et. al. J. Biol. Chem., 208 477 (1954). A soma mínima de CIFS, que é a sinergia máxima, foi determinada por várias combinação de pares. Altemativamente, é calculada uma soma média de CIFS, que é a média da sinergia. A este respeito ver Tabela S. Estes resultados indicam substancial sinergia na inibição da disseminação de vírus. Quanto menor o número, maior a sinergia.

TABELA S

Sinergia Média 0,81 0,62 0,65

Combinações aos Pares* 726 + ddl

726 + AZT 726 + 524 726 + 524 + AZT 524 é L-735.524. Outros compostos são também definidos na Tabela C anterior.

Embora a memória descritiva anterior ensine os princípios da presente invenção com exemplos fornecidos com o propósito de ilustração, será compreendido que a prática da invenção abrange todas as variações, adaptações ou modificações usuais, como vem no âmbito das seguintes reivindicações e seus equivalentes.

Lisboa, 12 de Dezembro de 2000 A<.ufW <-—

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VIÇTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. A utilização de um composto de fórmula (II)

   em que X é halo; XI é tri-halometilo; penta-haloetilo; C2_5 alquilo; C2-5 alquinilo; C3.5 cicloal quilo; ou fenilo, naftilo, tetra-hidronaftilo, bifenilo, fenetilo, antrilo ou acenaftilo; Z é O ou S; Ré (a) Ci.g alquilo, não substituído ou substituído com A, e A é halo, C3.6 cicloalquilo, CN, hidroxi, Cm alcoxi, C2.4 alquinil- Cm alcoxi, fenoxi, naftoxi, tetra-hidronaftoxi, bifenoxi, fenetoxi, antroxi, acenaftoxi, C]_4 alquilcarbonilo, nitro, di(C].2 alquilo) amino, Q.4 alquilamino-C].2 alquilo, heterociclo, ou feniltio, naftiltio, tetra-hidronaftiltio, bifeniltio, fenetiltio, antriltio ou acenaftiltio; em que heterociclo significa significa um anel monocíclico estável de 5 a 7 membros ou um anel heterocíclico bicíclico estável de 8 a 11 membros que é ou insaturado, parcialmente insaturado ou insaturado e que consiste em átomos de carbono e em um a quatro -2- heteroátomos seleccionados de N, O e S, e em que os heteroátomos de azoto e enxofre podem opcionalmente ser oxidados, e incluindo qualquer grupo bicíclico no qual qualquer dos anéis heteroclíclicos acima definidos é condensado com um anel de benzeno; (b) C2-4 alcenilo, não substituído ou substituído com (i) A, ou (ii) fenilo, naftilo, tetra-hidronaftilo, bifenilo, fenetilo, antrilo ou acenaftilo, não substituídos ou substituídos com A; (c) C2-5 alquinilo, não substituído ou substituído com (i) A, ou (ii) fenilo, naftilo, tetra-hidronaftilo, bifenilo, fenetilo, antrilo ou acenaftilo, não substituído ou substituído com A; ou (d) C3.4 cicloalquilo, não substituído ou substituído com (i) A, ou (ii) fenilo, naftilo, tetra-hidronaftilo, bifenilo, fenetilo, antrilo ou acenaftilo, não substituído ou substituído com A, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para a preparação de um medicamento para a inibição da transcriptase reversa de HIV, para a prevenção de infecção de HIV, para o tratamento da infecção por HIV ou para o tratamento da SIDA ou CRS.
2. 2. A utilização da reivindicação 1, em que o composto de fórmula II é: (-) 6-cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-di-hidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-ona, -3- C^( (-) 6-cloro-4-feniletinil-4-trifluorometil-1,4-di-hidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-ona, (+/-) 6-cloro-4-(2-cianofenil)etinil-4-( 1,1,1 -trifluorometil)-1,4-di-hidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-ona, (+/-) 4-( 1 -cloro-1,1 -difluorometil)-4-(2-feniletinil)-6-cloro-1,4-di-hidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-ona, ou (+/-) 4-(2-[dimetilaminometil]etinil)-4-trifluorometil-6-cloro-1,4-di-hidro-2H-3,1- benzoxazin-2-ona, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
3. 3. Um composto de fórmula II como definido na reivindicação 1 ou 2 com a condição de que X1 e R não sejam ambos Cm alquilo não substituído, para uso num método de tratamento do corpo humano.
4. 4. Uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula II como definido na reivindicação 1 ou 2, com a condição de que X1 e R não sejam ambos Cm alquilo não substituído.
5. 5. Um composto de fórmula I:

   em que -4-

   X é halo; XI é tri-halometilo ou penta-haloetilo; Zé O; Ré (a) C|.8 alquilo, não substituído ou substituído com A, e A é halo, C3.6 cicloalquilo, CN, hidroxi, Cm alcoxi, C2^ alquinil- Cm alcoxi, fenoxi, naftoxi, tetra-hidronaftoxi, bifenoxi, fenetoxi, antroxi, acenaftoxi, Cm alquilcarbonilo, nitro, di(Ci.2 alquilo) amino, Cm alquilamino-Ci.2 alquilo, heterociclo, ou feniltio, naftiltio, tetra-hidronaftiltio, bifeniltio, fenetiltio, antriltio ou acenaftiltio; em que heterociclo significa um anel monocíclico estável de 5 a 7 membros ou um anel heterocíclico bicíclico estável de 8 a 11 membros que é ou insaturado, parcialmente insaturado ou insaturado e que consiste em átomos de carbono e em um a quatro heteroátomos seleccionados de N, O e S, e em que os heteroátomos de azoto e enxofre podem opcionalmente ser oxidados, e incluindo qualquer grupo bicíclico no qual qualquer dos anéis heteroclíclicos acima definidos é condensado com um anel de benzeno; (b) C2-4 alcenilo, não substituído ou substituído com (i) A, ou (ii) fenilo, naftilo, tetra-hidronaftilo, bifenilo, fenetilo, antrilo ou acenaftilo, não substituídos ou substituídos com A; (c) C2-5 alquinilo, não substituído ou substituído com (i) A, ou (ii) fenilo, naftilo, tetra-hidronaftilo, bifenilo, fenetilo, antrilo ou acenaftilo, não substituído ou substituído com A; ou (d) C3.4 cicloalquilo, não substituído ou substituído com (i) A, ou -5- Λί b^rb (ii) fenilo, naftilo, tetra-hidronaftilo, bifenilo, fenetilo, antrilo ou acenaftilo, não substituído ou substituído com A, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
6. 6. Um composto que é (-) 6-cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-l,4-di-hidro-2H-3,l-benzoxazin-2-ona, (-) 6-cloro-4-feniletinil-4-trifluorometil-1,4-di-hidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-ona, (+/-) 6-cloro-4-(2-cianofenil)etinil-4-( 1,1,1 -trifluorometil)-1,4-di-hidro-2H-3,1 benzoxazin-2-ona, (+/-) 4-( 1 -cloro-1,1 -difluorometil)-4-(2-feniletinil)-6-cloro-1,4-di-hidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-ona, ou (+/-) 4-(2-[dimetilaminometil]etinil)-4-trifluorometil-6-cloro-1,4-di-hidro-2H-3,1- benzoxazin-2-ona, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
7. 7. Uma combinação de um composto de fórmula I como definido na reivindicação 5 ou de Fórmula II como definido na reivindicação 1 ou 2 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável com um análogo de nucleósido tendo actividade biológica contra a transcriptase reversa de HIV.
8. 8. Uma combinação sinergística de compostos antivirais da SIDA, que é -6- e

   (L-735.524) e, opcionalmente, um ou mais dos inibidores de HIV seleccionados do grupo consistindo em

   AZT, ddl ou ddC.
9. 9. Uma combinação sinergística de compostos antivirais da SIDA, que é

   H (-) (L-743.726) -7- e um ou mais dos inibidores de HIV seleccionados do grupo consistindo em

   (L-697.661) AZT, ddl ou ddC.
10. 10. Um processo para sintetizar (-)-6-cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-di-hidro-2H-3,1 -benzoxazin-2-ona (L-743.726) compreendendo os passos de: (a) fornecer uma quantidade de (+/-)-6-cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-l,4-di-hidro-2H-3,l-benzoxazin-2-ona (L-741.211); (b) condensar os compostos do passo (a) com um agente de resolução; (c) separar os diastereómeros resultantes; (d) remover a modificação do agente de resolução para dar o composto desejado.
11. 11. O processo da reivindicação 10, em que o agente de resolução é cloreto de (-)-canfanilo. Lisboa, 12 de Dezembro de 2000 ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDOSÍM4 1200 LISBOA