BG62612B1

BG62612B1 - Съединения, фармацевтични състави и методи за инхибиране наhiv обратна транскриптаза и за лечение на hiv инфекции, спин илиarc и методи за получаване на съединенията

Info

Publication number: BG62612B1
Application number: BG99383A
Authority: BG
Inventors: Steven D. Young; Susan F. Britcher; Linda S. Payne; Lekhanh O. Tran; William C. Lumma Jun.
Original assignee: Merck & Co.
Priority date: 1992-08-07
Filing date: 1995-01-30
Publication date: 2000-03-31
Also published as: YU53093A; ES2151897T3; HRP931102B1; LV12719A; DE69329608D1; JPH06184124A; NZ255216A; AU4449693A; NO2008008I1; CN1318031C; CA2101572A1; CN1250652A; NO950424D0; EP0582455B1; WO1994003440A1; LV12719B; DE10199013I1; JPH0780860B2; DZ1707A1; IL106507A0

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до съединения, фармацевтични състави и методи за инхибиране на HIV обратна транскриптаза и за лечение на HIV инфекции, СПИН или ARC и методи за получаване на съединенията. То е свързано със заявки на MERCK + 18429, 18429IA и 18727. Изобретението е частично продължение на заявката на MERCK + 18793, регистрирана на 7 август 1992 г„ U.S.S.N. 07/926,607.

Предшестващо състояние на техниката

Ретровирусът, означен човешки имунодефицитен вирус (HIV), е етиологично средство на комплексно заболяване, което включва прогресивно разграждане на имунната система (придобит имунно недостатъчен синдром; СПИН) и деградиране на централната и периферната нервна система. По-рано този вирус е бил известен като LAV, HTLV-III или ARV. Обща особеност на ретровирусната репликация е обратната транскрипция на РНК генома чрез вирусно енкодирана обратна транскриптаза, за да се получат ДНК копия на HIV последователностите, задължителен етап във вирусното реплициране. Известно е, че някои съединения са обратни транскриптазни инхибитори и са ефективни средства при лечение на СПИН и подобни заболявания, например азидотимидин или AZT.

При проследяване последователността на HIV се установява присъствието на pol ген в една отворена четяща рамка /Ratner, L.et.al., Nature, 313, 277 (1985)/.

Хомологията на аминокиселинната последователност доказва, че pol последователността ендокира обратна транскриптаза, една ендонуклеаза и една HIV протеаза /Toh, Н. et al., EMBO J. 4, 1267 (1985); Power, M.D.etal., Science, 231, 1567 (1986), Pearl, L.H. et al., Nature 329, 351 (1987)/.

Заявителите показват, че съединенията от изобретението са инхибатори на HIV обратна транкриптаза. Особено предимство на тези съе диненията е показаното от тях инхибиране на резистентна HIV обратна транкриптаза.

Техническа същност на изобретението

Съединения с формула I и посочените подолу значения на заместителите са обект на изобретението. Тези съединения намират приложение при инхибиране на HIV обратна транскриптаза (и нейните резистентни варианти), при предпазване от зараза с HIV, при лечение на зарази от HIV и за лечение на СПИН и/или ARC, било като съединения или ако е подходящо като техни фармацевтично приемливи соли, под формата на фармацевтични състави, със или без комбинация с други противовирусни, антиинфекциозни, имуномодулиращи средства, антибиотици или ваксини. Изобретението включва също така методи за лечение на СПИН, методи за предпазване от инфекция с HIV и методи за лечение на зарази от HIV.

Съединенията с формула I са следните:

в която X означава халоген, X¹ означава трихалогенметил или пентахалогенетил; Z означава кислород; К означава:

(a) С₁₈алкил, незаместен или заместен с А и А представлява халоген, С_{3 6}циклоалкил, CN, хидрокси, С[ ₄алкокси, С_{2 4}алкинил-С₁₄алкокси, арилокси, C_{t 4}алкилкарбонил, нитро, ди(С, ₂алкил) амино, С₁₄алкиламино.С_|2алкил, хетероциклена или арилтиогрупа;

(b) С_{2 4}алкенил, незаместен или заместен с (I) А или (II) арил, незаместен или заместен с А;

(c) С_{2 5}алкинил, незаместен или заместен с (I) А или (II) арил, незаместен или заместен с А или (d) С_{3 4}циклоалкил, незаместен или заместен с (I) А или (II) арил, незаместен или заместен с А, или техни фармацевтично приемливи соли.

Изобретението се отнася също така и до фармацевтични състави, намиращи приложение за инхибиране на HIV обратна транскрипция, съдържащи ефективно количество от съединение с фор2 мула II

и фармацевтично приемлив носител, в която X означава халоген; X’ означава трихалогенметил; пентахалогенетил; С_{2 5}алкил; С_{2 5}алкинил; С_{3 5}циклоалкил или арил; Z означава кислород или сяра; R означава:

(а) С₁₈алкил, незаместен или заместен с А, и А представлява халоген, С_{3 6}циклоалкил, циано, хидрокси, С, ^алкокси, С₂ ^алкинил-С, ₄алкокси, арилокси, С_{| 4}алкилкарбонил, нитро, ди (С! ₂алкил) амино, Сj ₄ал киламино-С, ₂алкил, хетероциклена или арилтиогрупа; (Ь) С_{2 4}алкенил, незаместен или заместен с (I) А или (II) арил, незаместен или заместен с А;

Предпочитани са съединенията 37,2, 4, 2, 5 и 24 от таблица I по-долу, като предпочитанията намаляват по низходящ ред.

Тези съединения имат следната структура:

Съединение 37,2

(-) 6-хлоро-4-фенилетинил-4-трифлуорометил-1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2-он;

Съединение 2

(+/-) 6-хлоро-4-(2-цианофенил)етинил-4(1,1,1 -трифлуорометил) -1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2-он;

Съединение 5

фенил-етинил) -6-хлоро-1,3-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2-он;

Съединение 24 _хсн₃ (-) 6-хлоро-4-циклопропилетинил-4-трифлуорометил-1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2он, което е най-предпочитано;

Съединение 4

(+/-) 4-(2-/диметиламинометил/етинил)-4трифлуорометил-6-хлоро-1,4-дихидро-2Н-3,1-бен зоксазин-2-он или тяхна фармацевтично приемлива сол.

ТАБЛИЦА I

не ние

•V 1	2	3	4	с	6 7
i		=—	-СР₃	186- 187.5	58 пМ	4100 пМ
2	*	-	-ог₃	245-	25	480	бпй
	' &	246

3(+)	*		-СР₃	178- 179	2900	37,000	>200
*(-)	*		-®з	ί»	S.6	69	12
5	*		-cf₂ci	154-	12iw	350 пЬ
	= ο	155	I
	*		-CF₃	225	1,700	19,000
6		-	226

X 2

1«—0

3	4	5	6
-CF₃	Ϊ60- 161	91	3,460
-C?J	183- 184	163	8470 r
-CF₃	168- 171	83nM	2I0nM
-CP₃	159-	18	390
	Ϊ60
-C?J	185- 186	16	270
-Cf₃	13?	12.	280
	147
-CF₃	157	390nN	10⁵nM
-cr₃	174 176	130	65,000
-c?₃	165- 166	29	>I0⁵

I 2

4 5 δ

-CP₃	230- 240	1900	1900
-cp₃	132- 133	2300	>I0⁵
-CPj	148- 149	15 nM	2,650nM

78000 f

5011Й

136-CP, 24 25000 ^b 137 '

-CP₃	162-	IO⁵
164	145
-cp₃	145- 146	860	125,000
T1	ISO- 151	55	3,650

I 2

7

23	*	-СР₃
24	ж		-CP_Z
	\	3
25	»		-сг₃

26	ж		-С?₃
27	ж	он	II

1311300пк> ЗООООпМ

133

146.5

1950100

147.5

122-ς

220> I?

124

224-q

0.24>10’

225

203-q

550 > Ιθ’

204

118307ηϋ П4250ПЙ Ι500πΜ

120

166- q

J300 >10’

168

100410 3000

ΙΟΙ.5

410 4250

5400

277278

ЗООпМ

126

16,500 >5ОО,00ОпМ

184185

650 >300,000

151152 >300,000

166-

187 , 300 > Ю⁵

37.2(-) _

С?₃

2πίύ 85⁺nW ⁺кзиерениетс пИ означава наномода в литър ⁺друси данни за съединението 38 са посочени при примерите.

ТАБЛИЦА II

Съединение

Е X¹

°C

тег.

^1С50 d rv

4 5 6 7

177136пм >330 ,ΟΟΟπΜ

179

135510 >300,000πΜ

136

¥	/ 125-
	^ζ 48	29,000
	126

4 5 6 7

1400пМ >300,000πΜ

*	147-
	560 >3ΰΟ,ΟΟΟπΜ
	148

186187 41 >300,000пМ

Съединенията от изобретението могат да притежават асиметрични центрове и могат да бъдат, освен ако не е специално отбелязано, като рацемати, рацемични смеси или като отделни диастереомери или енантиомери, като всички изомерни форми се включват в настоящото изобретение. 45 Означението (+/-) включва (+) оптични изомери или (-) оптични изомери или смеси от тях.

Като някой изменящ се заместител (например R) се появи повече от веднъж в дадена съставна част или във формула I, то неговото 50 значение всеки път е независимо едно от друго и е в съответствие с посочените. Допустими са също така и комбинации от заместителите с техните вариращи значения, само ако тези комбинации водят до стабилни съединения.

Използваният тук термин “алкил”, освен ако е посочено друго, означава както правоверижни, така и с разклонена верига алифатни въглеводородни групи, притежаващи определен брой въглеродни атоми; “алкенил” означава правоверижни или с разклонена верига алкилови групи, съдържащи поне една въглерод-въглерод двойна връзка; “алкинил” означава правоверижни или с разклонена верига алкилови групи, притежаващи поне една въглерод-въглерод трой на връзка. Под “халоген”, използван тук, се включва флуор, хлор, бром и йод.

Под термина “арил”, освен ако е отбелязано друго, използван тук, се включва фенил, нафтил, тетрахидронафтил, бифенил, фенантрил, : антрил или аценафтил.

Използваният тук термин хетероцикъл или хетероциклен, освен ако е посочено друго, означава стабилен 5- до 7-членен моноциклен или стабилен 8- до 11 -членен бицикличен хете- 1 роциклен пръстен, който може да е наситен, частично ненаситен или ненаситен и който се състои от въглеродни атоми и от един до четири хетероатома, подбрани между азот, кислород и сяра. При това азотните и серните хетероатоми могат 1 евен-туално да се окислени. В горният термин се включват и бициклени групи, при които всеки от по-горе дефинираните хетероциклени пръстени е кондензиран към бензоено ядро. Хетероцикленият пръстен може да бъде свързан чрез всеки 2

СХЕМА I от хетероатомите или въглеродните атоми, така че да се получи стабилна структура. Примери на такива хетероциклични елементи са пиперидинил, пиперазинил, 2-оксопиперазинил, 2-оксопиперидинил,2-оксопирилидинил, 2-оксоазеиинил, азепинил, пиролил, 4-пиперидонил, пиролидинил, пиразолил, пиразолидинил, имидазолил, имидазолинил, имидазолидинил, пиридил, пиразинил, пиримидинил, пиридазинил, оксазолил, оксазолидинил, изоксазолил, изоксазолидинил, морфолинил, тиазолил, тиазолидинил, изотиазолил, хинуклидинил, изотиазолидинил, индолил, хинолинил, изохинолинил, бензимидазолил, тиадиазолил, бензопиранил, бензотиазолил, бензоксазолил, фурил, тетрахидрофурил, бензофуранил, тетрахидропиранил, тиенил, бензотиенил, тиаморфолинил, тиаморфалинил сулфоксид, тиаморфолинил сулфон и оксадиазолил.

Съединенията от изобретението могат да се синтезират по следните методи:

CI

ш₂ пивалоил хлорид метиленхлорид воден Ка₂С0₅

1.

2.

3.

	0
2 eq. n-BuLi/THF/O°C
c?₃coost/ 0°C	V<_N„₂
3N НС1/ теиператз^гра на кипене	5

		Е
R-MgBr		*^0Н
тир/ 0^c C до температура p.a кипене		-лн₂
	4

1,1 ’-карсояилдиадидазол — ----------—-►

ТНР/5О⁰ С

При синтезата на бензоксазините от изо- ¹⁰бретението общият метод обикновено предвижда като краен етап циклизиране на бензеновото ядро. Виж схема I. Първоначално аминогрупата на парахлоранилина се защитава например с пивало20 илхлорид, за да се получи съединение 2. Други, по-малко предпочитани защитни за амино-групата средства са терц.-бутоксикарбонилна, ацетатна или изовалероилни групи. Около 2 еквивалента алкиллитий след това взаимодействат със съединение 2, като се предпочита норм.-бутиллитий. Други органометални съединения не са подходящи при този етап на металиране. След това се взаимодейства с CF₃COOC₂H_S и се изсолва, за да се получи съединение 3.

Синтезата на третичния карбинол 4 се осъществява, като се прибавя Гринярдов реактив към кетона 3. Гринярдовият реактив трябва да бъде сол на двувален катион, например Mg** или Zm^. Установено е, че моновалентни катиони като Li⁺ или Na⁺ не са подходящи. Подходящи разтворители са тетрахидрофуран или етер, без да се ограничават до тях. Могат да се използват различни температурни условия между около 0°С и стайна температура.

Свързването на пръстена, за да се получат съединенията 5, се осъществява с помощта на кондензиращи средства като 1,1'-карбонилдиимидазол, фосген, диметилкарбонат, дифенилкарбонат или ди- (паранитрофенил) карбонат. Циклизирането може да се извърши с всяко от тези съединения, както и с много други.

Специфичен етап от схема I е даден на схема IA. На схемата е илюстрирано получаването на L-741,211, което е рацемат на съединението 37,2 и е описано в пример 6.

CXEftiA ΙΑ

трет-BaDOCI

На0НД1₂0 сни₃ (100

(L-741,211)

СХЕМА II

Схема II показва метод за получаване на ацетиленови заместители в 4-та позиция на бензоксазиновото ядро. Илюстрирано е метализирането на съединението 6, след което се прибавя цинкова сол. В реакцията на Хек се използва катализатора тетракис (трифенилфосфин) паладий (0), комплексиран с Cui, при което се получава съединение 7.

Схема III илюстрира заместването на 4ацетиленовата група с N-съдържащ хетероцикъл. Маниховата реакция включва кондензиране на формалдехид с хетероцикъл, например пиролидин. Заместването на крайния въглерод става в присъствието на Cui като катализатор.

St₃N/4-EMAP/CH₂Cl₂

I. Хромзюграфиране върху сипикагел

----------------—*

2. К_?С0₅/Н₂0/2-лропансл

Схема IV илюстрира разделянето на оптични изомери на съединенията с формула I или с формула II. В този пример (-) камфановата киселина е разделящото средство. Подходящи са и много други разделящи средства, включително 5 киселинен хлорид на 0-метил бадемената киселина или реактива на Мошер. За специалистите в областта е ясно как да разделят такива изомери.

Схема IVA илюстрира отделянето на L741,211 при изолирането на L-743,726. Виж схема IVA и пример 6.

(-)-Камфаиил хлорид

-------------------------->

4-MAP/Et₃N/CHCl₃

изкристализираме от хексан ----------------------------------+ (90 %-ен добив)

Ъ-743,726 създинение 37.2

СХЕМА V

CI >-<⁰

РС1₅

------►

t-BuOK

EMSO

Циклопропил ацетилен се получава по схема V съгласно публикувани методи като например C.E.Hudson et al., J.Am.Chem.Soc., 94, 1158 (1972), W.Schoberth et al., Synthesis, 703 (1972).

Съединенията от изобретението намират приложение при изготвянето и провеждането на опити за скриниране на противовирусни съединения. Например съединенията от изобретението се използват за изолиране на ензимни мутанти, които са отлични средства за селекциониране на по-мощни антивирусни съединения. Съединенията от изобретението се прилагат за установяване или определяне на местоположението на свързване на други противовирусни вещества към HIV обратната транскриптаза, например чрез конкуриращо инхибиране. Съединенията от изобретението са търговски продукти, които могат да се продават за тези цели.

Съединенията съгласно изобретението са приложими при инхибиране на HIV обратна транскриптаза за предпазване или лечение на инфекции от човешки имунодефицитен вирус (HIV) и за лечение на получаващи се в резултат на него патологични състояния като СПИН. Ле чението на СПИН или предпазване от или лечение на инфекции, предизвикани от HIV се включват в изобретението, без да го ограничават, тъй като съединенията могат да намерят приложение при много други състояния, предизвикани от HIV инфекции: СПИН, ARC (сроден на СПИН комплекс), както симптоматично, така и асимптоматично, и актуално или потенциално излагане на HIV. Съединенията от изобретението могат да се използват при лечение на инфекции от HIV при съмнения от такава зараза, например при преливане на кръв, при обмяна на телесни течности, при ухапвания, при инцидентни убождания с игла или при хирургическа намеса.

Особено предимство на съединенията от изобретението е тяхното силно инхибиране срещу HIV обратна транскриптаза, станала резистентна към други противовирусни средства като L697,661, което представлява 3-(/ (4,7-дихлоро-1,3бензоксазол-2-ил) метил) -амино) -5-етил-6-метилпиридин-2(1Н)-он или L-696,229, което е 3-/2-(1,3бензоксазол-2-ил) етил/-5-етил-6-метил-пиридин2(1Н)-он илиАгТ.

За тези цели съединенията от изобретението могат да се прилагат през устата, парентерално (включително като инжекции подкожно, интравенозно, в мускулите и пр. или чрез инфузионна техника), като спрейове за инхалиране или ректално, като отделни дозировъчни единици във формулировки, съдържащи освен това и нетоксични, фармацевтично приемливи носители, добавъчни и свързващи вещества.

Съгласно изобретението е разработен метод и фармацевтични състави за лечение на HIV инфекции и СПИН. Лечението предвижда прилагането на пациент, нуждаещ се от такова лечение, на фармацевтичен препарат, съдържащ фармацевтичен носител и терапевтично ефективно количество от съединение съгласно изобретението.

Фармацевтичният състав може да бъде под формата на суспензии или таблетки за прилагане през устатата, спрейове за пръскане през носа, стерилни инжекционни препарати, например стерилни водни или маслени суспензии или под формата на супозитории.

Когато се прилагат през устата като суспензия съставите се приготвят чрез техника, добре позната на специалистите, работещи в областта на фармацевтичните формулировки, и могат да съдържат микрокристална целулоза за прибавяне на маса, алгинова киселина или натриев алгинат като суспендиращо средство, метилцелулоза за увеличаване на вискозитета и подсладители и/ или оцветители, добре познати в областта. В таблетки, при които активното вещество се освобождава веднага, могат да се съдържат също микрокристална целулоза, двукалциев фосфат, нишесте, магнезиев стеарат и лактоза и/или други пълнители, свързващи вещества, дезинтегратори, разредители и смазващи вещества, известни за тези цели.

Когато се прилагат като аерозол през носа или чрез инхалиране, съставите се приготвят по познат начин и могат да бъдат като разтвори в солен разтвор, при което се използва бензилов алкохол или друг подходящ консервант, също вещества, ускоряващи биоабсорбцията, флуоровъглеводороди и/или други средства, подпомагащи разтварянето или диспергирането.

Инжекционните разтвори или суспензии се формулират по познати начини, като се използват нетоксични приемливи парентерално разредители или разтворители като например манитол, 1,3-бутандиол, вода, разтвор на Рингер или изотоничен разтвор на натриев хлорид или подходящи диспергиращи и суспендиращи средства като стерилни недразнещи масла, включително синтетични моно- или диглицериди и мастни киселини, включително олеинова киселина.

Когато се прилагат ректално под формата на супозитории, съставите се приготвят чрез смесване на лекарственото съединение с подходящ недразнещ пълнител като какаово масло, синтетични глицеридни естери или полиетилен гликоли, които са твърди при обикновена температура, но се втечняват и/или разтварят в ректалната кухина и освобождават съединението.

Съединенията от изобретението могат да се прилагат през устата при хора в доза от порядъка на 1 до 100 mg/kg телесно тегло в разделни дози. Предпочитана доза е от 0,1 до 10 mg/kg телесно тегло през устата, разделени на няколко пъти. Друга предпочитана доза е от порядъка на от 0,1 до 20 mg/kg телесно тегло през устата, разделена на няколко пъти. За комбинирано лечение с нуклеозидни аналози предпочитаната доза е от порядъка на 0,1 до 20 mg/kg телесно тегло от съединението на изобретението, приложена през устата, разделена на няколко пъти и 50 mg до 5 g/kg телесно тегло за нуклеозидните аналози, приложени през устата на няколко пъти. Трябва да се подразбира обаче, че специфичната доза и честотата на приема може да варира при отделните пациенти и ще зависи от различни фактори, например активността на използваното специфично съединение, неговата метаболитна стабилност и продължителността му на действие, от възрастта на пациента, телесното му тегло, общото здравословно състояние, пола, 5 режима на хранене и начина и времето на приложение, скоростта на изхвърляне, комбинацията от лекарствени средства, сериозността на конкретния случай и лечението, на което се подлага болния.

Изобретението се отнася също така и до комбинации от HIV обратна транскриптаза инхибиращи съединения с едно или повече средства, прилагани при лечението на СПИН. Например съединенията от изобретението могат ефективно да се прилагат, било в периоди преди излагане и/или след излагане, в комбинация с ефективни количества от СПИН антивирусни средства, имуномодулатори, противоинфекциозни средства или ваксини като тези, посочени в таблицата по-долу:

ТАБЛИЦА

ПРОТИВОВИРУСНИ СРЕДСТВА

Име на лекарството	Производител	Индикация
AL· - 721	Ethigen	ARC, PGL
	(Los Angeles, CA)	HIV позитивни,СПИН
Recombinant Human	Triton Biosciences	СПИН, Kaposi’s
Interferon Beta	(Almeda, CA)	sarcoma, ARC
Acemannan	Carrington Labs	ARC
	(Irving, TX).	(вж.също имуномодулатори)
Cytovene	Syntex	лечение на зрението CMV
Ganciclovir	(Palo Alto, CA)	периферен CUB ретинит
d4T	Bristol-Myers	СПИН, ARC
Di dehydro de oxythymid ine	(New York, NY)
ddl	Bristol-Myers	СПИН, ARC
Dideoxyinaeine	(New York, NY)
EL 10	Elan Corp. PLC	HIV инфекция (вж.съ-
	(Gainesville, GA)	що имуномодулатори)
Trisodium	Astra Pharm.	CMV ретинит, HIV ин-
Phosphonoformate	Products, Tnc.	фекция, други CMV
	(Westborough, MA)	инфекции
Dideoxycytidine;	Hoffman-La Roche	СПИН, ARC
ddC	(Nutley, NJ)

ТАБЛИЦА

ПРОТИВОВИРУСНИ СРЕДСТВА

Име на лекарството Производител Индикация _Navapren Novaferon Labs,Inc. HIV ИНХИбиТОр (Akron, OH)

Diapren, Tnc.

(Roseville, MN, marketer)

Peptide Т	Peninsula	Labs	СПИН
Octapeptide	(Belmont,	CA)
Sequence
Zidovudine; AZT	Burroughs	Wellcome	СПИН,adv, ARC

(Rech. Triangle Park, ДвТСКИ СПИН,

Νθ) Kaposi*s sarcoma асимптоматична HIV инфекция, по-малко тежко HIV заболяване, неврологични прояви, в комбинация с лечение

Ansamyoin LM 427	Adria Laboratories (Dublin, OH) Erbamont (Stamford, CT)	ARC
Dextran Sulfate	Ueno Fine Chem.	СПИН, ARC, HIV
	Ind. Ltd.	пазитивен асимптома-
	(Osaka, Japan)	тичен
Virazole	Viratek/ICN	асимптоматичен HIV
Ribavirin	(Coeta Mesa, CA)	ПОЗИТИВеН, LAS, ARC
Alpha Interferon	Burroughs Wellcome	Kaposi’s sarcoma, HIV
	(Rsch. Triangle	в комбинация c
	Park, NC)	... Retrovir
Acyclovir	Burroughs Wellcome	СПИН, arc, асимпто-

матичен HIV позитивен, ο ΛΖΤ В ggtir

- 28 -	Показания
Име на лекарството Производител	ζ Индикация)

Антитдею, което	Advanced Biotherapy СПИН,	ARC
неутрализира pH ла-	Concepts
биленЧотклоняващ се	Rockville, MD)
интерферон в имуно-
адсорбционна колона

L-697,661	Merck (Rahway, NJ)	СПИН, ARC,	асимптο-
		матичен HIV	πο зити-
		вен, също в	комбина-

L-696,229

L-735,524

AS-101

Bropirimine

Acemannan

CT.246,738

RL1O

Gamma Interferon

Merck (Rahway, NJ)

Merck (Railway, NJ)

ИМУНО--МОДУЛАТОРИ

Wyeth-Ayerst Labв.

(Philadelphia, PA)

Upjohn (Kalamazoo, MI)

Carrington Labs.Inc.

(Irving, TX)

American Cyanamid (Pearl River, NY) Lederle Labs. (Wayne, NJ) Elan Corp, PLC (Gainesville, GA)

Genentech

ЦИЯ 0 AZT.

СПИН, arc, а симптоматичен HIV позитивен, съшо в комбинация С AZT.

СПИН, ARC, асимптоматичен HIV позитивен, също в комбинация С AZT.

СПИН напреднал СПИН

СПИН, arc, (вж. също противовируони средства)

СПИН, Kaposi’s sarcoma

HIV инфекция (вж. също противовируони) ARC, в комбина20

Име на лекарството	Производител	Показания
	(S.San Francisco,	ЦИЯ C TNF (TyMOp
	CA)	некрозисен фактор)
Granulocyte	Genetics Institute	СПИН
Macrophage Colony	(Cambridge, MA)
Stimulating Factor	Sandoz (East Hanover, NJ)
Granulocyte	Hoechst-Roussel (Somerville, NJ) Immunex (Seattle, WA)	СПИН
Granulocyte	Schering-Plough	СПИН
Macrophage Colony	(Madison, NJ)
Stimulating Factor		СПИН, в комбинация С AZT
HIV Core Particle	Rorer	серопозитивен HIV
Immuno s t imulant	(Ft. Washington,PA)
IT,-2	Hoffman-Ta Roche	СПИН, ARC.HIV, в
lnterleukin-2	(Nutley, NJ) Immunex	комбинация с azt
Immune Globulin	Cutter Riological	детски СПИН, в ком-
Intravenous (human)	(Berkeley, CA)	бинация с azt
TMREG-1	Imreg	СПИН, Kaposi’s
	New Orleans, TA)	sarcoma, ARC, PGL
IMREG-2	Imreg	СПИН, Kaposi’s
	(New Orleans, LA)	sarcoma, ARC, PGL
Tmuthiol Diethyl	Merieux Institute	СПИН, ARC
Dithio Carbamate	(Miami, FL)
Alpha-2	Schering Plough	Kaposi’s sarcoma
Interferon	(Madison, NJ)	c AZTt СПИН
Methionine-	TNI Pharmaceutical	СПИН, ARC
Enkephalin	(Chicago, IL)
MTP-PE	Ciba-Geigy Corp._t	Kaposi’s sarcoma
Muramyl-Tripeptide	(Summit, NJ)
Granulocyte	Amgen	СПИН, в комбинация
Colony Stimulating Factor	(Thousand Oaks,CA)	c AZT

Име на лекарството	Производител	Показания
rCDi	Genentech	СПИН, ARC
Recombinant	(S. San Francisco, CA)
Soluble Human CD4
Recombinant	Biogen	СПИН, ARC
Soluble Human CD4	(Cambridge, MA)
Interferon	Hoffman-La Roche	Kaposi's sarcoma
Alfa 2a	(Nutley, NJ)	СПИН, ARC, B KOH-
		бинация c azt
SK&P1O6528	Smith,Kline & French	HIV инфекция
Soluble T4	Laboratories
	(Philadelphia, PA)
Thymopentin	Tmmunobiology	HIV инфекция
	Research Institute
	(Annandale, NJ)
Tumor Necrosis	Genentech	ARC, В комбина-
Factor; TNF	(S.San Francisco,CA)	ция c гама интер-

ферон

ПР0ТИВ0ИНФЕКЦИ03НИ СРЕДСТВА

Clindamycin c	Upjohn	PCP
Primaquine	(Kalamazoo, MI)
Fluconazolec	Pfizer	cryptococcal
	(New York, NY)	meningitis,candidias
Pastille	Squibb Corp.	предпазване от
Nystatin Pastille	(Princeton, NJ)	орална candidiasis
Ornidyl	Merrell now	PCP
Rflornithine	(Cincinnati, OH)
Pentamidine	LyphoMed	PCP лечение
Isethionate (IM & IV)	(Rosemont, IL)
Piritrexim	Burroughs Wellcome	PCP лечение

Име на лекарството	Производител	Показания
Pentamidine	(Rsch. Triangle Park, NC) Fisons Corporation	POP профилактика
isethionate За	(Bedford, MA)
инхалиране Spiramycin	Rhone-Poulenc	cryptosporidia1
	Pharmaceuticals	diarrhea
Intraconazole-	(Jrinceton, NJ) Janssen Pharm.	histoplasmosis;
R51211	(Piscataway, NJ)	cryptococcal
Trimetrexate	Warner-Lambert	meningitis PCP
Recmmbinant Human	ДРУГИ Ortho Pharm. Corp.	тежка анемия₇свърз,
Erythropoietin	(Raritan, NJ)	c AZT лечение
Megestrol Acetate	Bristol-Myers	лечение на анорексия
	(Nww York, NY)	свъз. З^СПИН
Total Enteral	Norwich Eaton	diarrhea и
Nutrition	Pharmaceuticals	лоша* абсорбциЯт свър-
	(Norwich, NY)	зано със СПИН

Трябва да се подразбира, че възможните комбинации на съединенията от изобретението с противовирусни, имуномодулиращи, противоинфекциозни средства или ваксини срещу СПИН не се ограничава до изброените в горната таблица. Принципно се включват всякакви комбинации с фармацевтични състави, използвани при лечението на СПИН. Например съединение с формула I или с формула II може подходящо да се прилага в комбинация с нуклеозиден аналог, притежаващ известна биологическа активност срещу HIV обратна транскриптаза. Подходящи нуклеозидни аналози са обикновено верижни терминатори и включват AZT, ddc, ddl, D4T, HEPT и 3флуоро-2',3'-дидеокситимидин.

AZT се синтезира по методи на J.P.Horwitz et al., J. Org.Chem. 29, 2076 (1964); R.P.Glinski et al., J.Org.Chem. 38, 4299 (1973); C.K.Chu et al., Tetrahedron Letters 29, 5349 (1988). Прило жението на AZT като лекарствено средство при терапията на СПИН е описано в US 4 724 232.

Съединението ddC се синтезира по методите на J.P.Horwitz et al., J.Org.Chem. 32, 817 (1967); R.Marumoto, Chem. Pharm.Bull. 22, 128 (1974) и TJS.Lin et al., J.Med.Chem. 30,440 (1987).

D4T се синтезира по методите, описани от Herdewijn, P.etal., J.Med.Chem.30, 1270 (1987).

HEPT се синтезира по методите на Miyasaka, T.et al., J.Med.Chem., 32, 2507 (1987) и A. 4$ Rosowsky, J.Med.Chem., 24, 1177 (1981). Синтезата на ddC, ddl и AZT също е описана в ЕРО 484071.

Съединението 3'-флуоро-2',3'-дидеокситимидин се синтезира по методите на Herdewijn, 5q P.et al., J.Med.Chem. 30,1270 (1987). Съединението L-735,524 представлява N-(2(R)-xnapokcHI (S) -индапул) -2 (R) -фенилметил-4- (S) -хидрокси-

5-(1-(4- (З-пир идилметил) -2 (S) -Ν’- (трет-бутил карбоксамидо)-пиперазинил))-пентанамид или негова фармацевтично приемлива сол. L-697,661 или “661” представлява 3-(/4,7-дихлоро-1,3-бензоксазол-2-ил) метил/-амино) -5-етил-етил-6-метилпиридин-2(1Н)-он; L-696,229 е 3-/2-(1,3-бензоксазол-2-ил) -етил/-5-етил-6-метил-пиридин-2 (1Н) он. Синтезата на L-697,661 и L-696,229 е описана в ЕРО 484071 и ЕРО 462800.

Предпочитани комбинации са едновременно, периодично или алтернативно прилагане на L-743,726 със или без инхибитор на HIV протеаза. Евентуален трети компонент в комбинацията е нуклеозиден инхибитор на HIV обратна транскриптаза като AZT, ddc или ddl. Предпочитан инхибитор на HIV протеазата е L-735,524. Друг предпочитан инхибитор на HIV обратна транскриптаза е L-697,661. Тези комбинации могат да имат синергичен ефект при ограничаване разпространението на HIV. Предпочитани комбинации са следните: (I) L-743,726 с L-735,524 и евентуално някой от L-697,661, AZT, ddt или ddC; (2) L-743,726 и някой от 1-697,661, AZT, ddl или ddC.

Включени са също така и фармацевтично приемливи соли на тези комбинации.

Пример 1.

(+/-) 4-1,1,1-трифлуорометил)-4-(1-бутен-

4-ил) -6-хлоро-1,4-дихидро-2Н-3,1-бензоксазин-2он (съединение 15)

Етап А:

N - (4-хлорофенил) -2,2-диметилпропанамид

В 5 литрова тригьрлена облодънна колба, снабдена с бъркалка, се прибавя 4-хлороанилин (127,57 g, 1 mol), 1200 ml хлороформ и 1200 ml наситен воден разтвор на Na₂CO₃. Към колбата се свързва делителна фуния и в нея се поставя

2,2-диметилпропаноил хлорид (129 ml, 1,05 mol). Киселинният хлорид се прибавя на капки към енергично бърканата смес в продължение на 1 h. Получената смес се бърка при температура на околната среда допълнително още 23 h. Част от продукта се отделя от сместа като бели кристали. Тези кристали се отделят чрез филтруване. Филтратът се прехвърля в делителна фуния и слоевете се разделят. Хлороформеният слой се промива с вода и с наситен воден разтвор на сол. След сушене върху магнезиев сулфат, филтруване и отстраняване на разтворителя под вакуум, се получава допълнително количество от продукта. Двете порции продукт се събират и се прекристализират от кипящ етилацетат-хексан, за да се получат 185,6 g N-(4-хлорофенил)-2,2-диме тилпропанамид като бели кристали.

Етап В:

- (2-амино-5-хлорофенил) -2,2,2-трифлуороетанон

В изсушена в пещ трилитрова тригьрлена колба с обло дъно, снабдена с бъркалка, вход за аргон и изсушена в пещ 500 милилитрова делителна фуния, се прибавя N-(4-хлорофенил)-

2,2-диметилпропанамид (100 g, 472 mmol) и сух тетрахидрофуран (11). Този разтвор се охлажда в ледена баня до 0°С и във фунията се поставя норм-бутиллитий (387 ml от 2,5 М разтвор в хексан, 968 mmol). Разтворът на норм-бутиллитий се прибавя бавно на капки към амидния разтвор в продължение на 1 h, като температурата се поддържа под +5°С. Полученият разтвор се оставя да престои при 0°С 1 h, при което се образува оранжева утайка. Към тази смес се прибавя етил

1,1,1-трифлуороацетат (115 ml, 968 mmol) на капки в продължение 1 h. Полученият бистър разтвор се оставя да престои допълнително още 30 min. Към реакционната смес се прибавя 5%ен воден разтвор на НС1. Сместа се разрежда с 1 1 етилацетат и слоевете се разделят. Органичната фаза се промива със солна луга, суши се над магнезиев сулфат, филтрува се и се концентрира под вакуум, за да се получат 160 g жълто масло. То се суспендира в 1 1 3 N водна НС1 и разтворът се нагрява при кипене 24 h. Охладеният разтвор се разрежда с 11 етилацетат и сместа се алкализира с концентриран NH₄OH. Слоевете се разделят и органичната фаза се промива със солна луга, суши се над магнезиев сулфат, филтрува се и се концентрира под вакуум. Хроматографира се върху 1,5 kg силикагел, като за елуент се използва 15%-ен етилацетат в хексан. Хроматографираният продукт се прекристализира от кипящ хексан, за да се получат 57 g (54%) чист 1-(2-амино-5хлорофенил) -2,2,2-трифлуороетанон като ярко жълти кристали с т.т. 91-92°С. ‘Н NMR (CDClj): δ 6,46 (br, s, 2H), 6,69 (d, 1H, J=9,2 Hz), 7,32 (dd, 1H, J=2,4, 9,2 Hz), 7,70 (d, J=2,4 Hz).

Етап C:

(+/-) 2-(2-амино-5-хлорофенил)-1,1,1-трифлуоро-5-хексен-2-ол

В 300 милилитрова тригьрлена облодънна колба, изсушена в сушилна пещ и снабдена с бъркалка, вход за аргон, делителна фуния и обратен хладник, се прибавя магнезий (стружки, 3,03 g, 125 mmol) и сух тетрахидрофуран (75 ml). При добро бъркане към тази смес се прибавя 4-бромо

1-бутен (12,0 ml, 118,21 mmol) c такава скорост, че да се поддържа спокойно кипене. След приключване на прибавянето сместа се оставя да престои 30 min и след това се охлажда до 0°С на ледена баня. Към този разтвор при добро бъркане се накапва в продължение на 30 min разтвор на 1 - (2-амино-5-хлорофенил) -2,2,2-трифлуороетанон (5,00 g, 22,36 mmol) в тетрахидрофуран (35 ml). Охладителната баня се оставя да се затопли и сместа се бърка 20 h при температура на околната среда. Към сместа се прибавя след разреждане с етилацетат 10%-ен воден разтвор на лимонена киселина. Бърка се 4 h. Слоевете се разделят и органичната фаза се промива с воден разтвор на натриев бикарбонат и със солна луга. Суши се над магнезиев сулфат, филтрува се и разтворителят се отстранява под вакуум. Хроматографира се върху 300 g силикагел, като за елуент се използва 15% етилацетат в хексан, при което се получават 4,80 g (+/-) 2-(2-амино-5-хлорофенил)1,1,1 -трифлуоро-5-хексен-2-ол като жълта твърда маса.

Етап Д.

(+/-) 4-(1,1,1-трифлуорометил)-4-(1-бутен4-ил) -6-хлоро-1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2-он

В 200 ml облодънна колба, снабдена с бъркалка, вход за аргон и обратен хладник, се прибавя (+/-) 2-(2-амино-5-хлорофенил)-1,1,1трифлуоро-5-хексен-2-ол (4,80 g, 17,16 mmol), Ι,Γ-карбонилдиимидазол (13,91 g, 85,81 mmol) и сух тетрахидрофуран (75 ml). Тази смес се нагрява 18 h при 60°С. Охладената реакционна смес се разрежда с етилацетат и се промива с вода (3 х 200 ml) и със солна луга (250 ml). Суши се над магнезиев сулфат, филтрува се и под вакуум се отстранява разтворителят. Прекристализира се от кипящ етилацетат-хексан, при което се получават 3,22 g (+/-) 4-(1,1,1-трифлуорометил) -4- (1 -бутен-4-ил) -6-хлоро-1,4-дихидро2Н-3,1-бензоксазин-2-он като бяла кристална маса с т.т. 165-166°С.

Ή NMR (CDC1₃): δ 1,99 (m, 1Η), 2,09-

2,40 (m, ЗН), 5,00 (d, 1H, J=l,4 Hz), 5,03 (dd, 1H, J=l,4, 7,9), 5,78 (m, 1H), 6,85 (d, 1H, J=8,6 Hz), 7,21 (br, s, 1H), 7,35 (dd, 1H, >2,2, 8,6 Hz)

9,63 (br, s, 1H).

Пример 2.

(+/-) 6-хлоро-4-етинил-4-( 1,1,1 -трифлуорометил) -1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2-он (съединение 26)

Етап А:

2- (2-амино-5-хлорофенил) -1,1,1 -трифлуороЗ-бутин-2-ол

В тригьрлена облодънна колба с вместимост 500 ml, снабдена с фуния, вход за аргон и бъркалка, както и дигитален термометър, се поставя етинил магнезиев бромид (0,5 М в хексан 268 ml, 134 mmol) и се охлажда до -78°С. Накапва се разтвор на 1-(2-амино-5-хлорофенил)-

2,2,2-трифлуороетан (6,0 g, 26,8 mmol) в 50 ml тетрахидрофуран в продължение на 15 min, като при това температурата се поддържа с <55°С. Реакционната смес се бърка 16 h, след като бавно се затопли до стайна температура. Към тъмночервения разтвор се прибавя при -5°С на капки наситен воден разтвор на амониев хлорид (60 ml). Екстрахира се с етилацетат, екстрактите се промиват с 10%-на лимонена киселина, с наситен разтвор на натриев бикарбонат, с вода и със солна луга, при което се получават 8,5 g суров продукт, след като се суши над натриев сулфат, филтрува се и разтворителят се изпарява. Пречиства се чрез мигновена хроматография, като се използва 15-20% етилацетат:хексан. Получава се чист 2-(2-амино-5-хлорофенил)-1,1,1-трифлуоро-З-бутин-2-ол (5 g светлокафяво масло, 75% добив).

Етап В:

(+/-) 6-хлоро-4-етинил-4-(1,1,1-трифлуорометил) -1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2-он

Разтвор на 2-(2-амино-5-хлорофенил)-

1,1,1-трифлуоро-3-бутин-2-ол (5,0 g, 20,0 mmol в тетрахидрофуран 225 ml), взаимодействас Ι,Γкарбонилдиимидазол (13,0 g, 80,0 mmol) и се нагрява на маслена баня при 60°С 17 h. Тетрахидрофуранът се изпарява под вакуум, остатъкът се разтваря в етилацетат и се промива с 10%-на лимонена киселина, с натриев бикарбонат, с вода и със солна луга, след което се суши над натриев сулфат. Филтрува се и се изпарява под вакуум, като се получават 3,6 g суров продукт. Прекристализира се от етилацетат:хексан. Съединението (+/-) 6-хлоро-4етинил-4- (1,1,1 -трифлуорометил) -1,4-дихидро2Н-3,1-бензоксазин-2-он се изолира като бели кристали (3,22 g, 58,4%-ен добив) с т.т. 226227°С.

Ή-NMR (CDC1₃ + следи DMSO): δ 3,16 (s, 1Н), 6,98 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,35 (m, 1H),

7,51 (s, 1H), 10,66 (s, 1H).

Пример 3.

(+/-) 6-хлоро-4- (1,1,1-трифлуорометил) -4/(3-(1 -пирслидинил) )-1 -пропинил/-1,4-дихидро2Н-3,1-бензоксазин-2-он (съединение 7)

Разтвор на (+/ -) 6-хлоро-4-етинил-4- (1,1,1трифлуорометил) -1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин2-он (150 mg, 0,544 mmol), пиролидин (52,2 μΐ, 0,626 mmol), параформалдехид (20,5 mg, 0,681 mmol), оцетна киселина (31,1 μΐ, 0,544 mmol) и меден (I) хлорид (20,5 mg, 0,207 mmol) в диоксан (3,5 ml) се нагрява при 50°С на маслена баня в продължение на приблизително 2 h. Към реакционната смес се прибавя 2 N НС1 и се екстрахира с етилацетат. Водният слой се неутрализира с твърд калиев карбонат и се екстрахира с етилацетат (3 х). Събраните екстракти се промиват с вода и със солев разтвор и след това се сушат над натриев сулфат, за да се получат 140 mg суров продукт. Пречиства се хроматографски и се прекристализира от етилацетат:хексан, при което се получава кристален (+/-) 6-хлоро-4(1,1,1 -трифлуорометил) -4-/(3-(1 -пиролидинил)) 1 -пропинил/-1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2он (89 mg, 46 %-ен добив) с т.т. 160 - 161°С (с разлагане).

*Н NMR (CDC1₃): δ 1,85 - 1,89 (m, 4Н), 2,68, 2,71 (m, 4Н), 3,67 (s, 1Н), 6,88 (d, J = 8,55 Hz, 1H), 7,40 (dd, J = 2,19, 8,54 Hz, 1H), 7,55 (s, 1H), 9,45 (s, 1H).

(+/-) 6-хлоро-4- (2-цианофенил) етинил-4(1,1,1 -трифлуорометил) -1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2-он (съединение 2)

Разтвор на 6-хлоро-4-етинил-4- (1,1,1 -трифлуорометил) -1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензокса-зин2-он (138 mg, 0,5 mmol) в 3 ml сух тетрахидрофуран се бърка при -78°С. Към този разтвор се прибавят 0,4 ml (1,0 mmol) норм.-бутиллитий,

2,5 М в хексан. Анионът се оставя да престои 10 min при -78°С и след това се прибавя 1 ml разтвор на цинков двухлорид (1М в етер). Реакционната смес се бърка при -78°С 15 min, ледената баня се отстранява и сместа се оставя бавно в продължение на 30 min да се затопли до 0°С. Към сместа се прибавя разтвор на 2йодобензонитрил (149 mg, 0,65 mmol) в 2 ml тетрахидрофуран и след това тетракис-(трифенилфосфин)паладий (0) (56 mg, 0,05 mmol). Реакционната смес се затопля до стайна температура и бъркането продължава още 15 h. Към реакционната смес се прибавят 10 ml 2 N НС1, екстрахира се 2 х 200 ml етилацетат и събраните екстракти се промиват с вода, със солна луга и се сушат над магнезиев сулфат. Разтворителят се отстранява, за да се получат 195 mg масло, което се подлага на мигновенна хроматография върху силикагел (20 % етилацетат в хексан), за да даде mg от нереагиралия изходен продукт и 35 mg от купелувания продукт. Последният се стрива с етер, за да даде 25 mg (+/-)6-хлоро-4-(2-цианофенил) етинил-4- (1,1,1 -трифлуорометил) -1,4дихидро-2Н-3,1-бензоксазин-2-он с т.т. 245 246°С. FAB.MS - 1 = 377 m/e.

Ή NMR (CDC1₃): δ 6,82 - 6,85 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,40 - 7,44 (dd, J = 2,1, 8,5 Hz, 1H),

7,56 - 7,79 (m, 5H), 8,00 (s, 1H).

Пример 4.

(+/ -) 4- (хлоро-1,1 -дифлуорметил) -4- (2-фенилетенил) -6-хлоро-1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2-он (съединение 5)

Етап А.

- (2-амино-5-хлорофенил) -2-хлоро-2,2-дифлуороетанон

В 300 милилитрова облодьнна колба с три гърла, изсушена в сушилня и снабдена с магнитна бъркалка, вход за аргон и 100 милилитрова, изсушена в сушилня, делителна фуния, се прибавя Ν(4-хлорофенил)-2,2-диметил пропанамид (10 g, 47,2 mmol) и сух тетрахидрофуран (100 ml). Разтворът се охлажда в ледена баня до 0°С и в делителната фуния се поставя норм.-бутиллитий (38,7 ml от

2,5 М разтвор в хексан, 96,8 mmol). Бутиллитиевият разтвор се накапва към амидния разтвор бавно в продължение на 1 h, като температурата се поддържа под +5°С. Полученият разтвор се оставя да престои при 0°С 1 h, през което време се образува оранжева утайка. Към тази смес се прибавя на капки в продължение на 15 min етил 1-хлоро-1,1-дифлуороацетат (10,2 ml, 96,8 mmol). Полученият бистър разтвор престоява още 30 min. Към реакционната смес се прибавя 5 %-ен воден разтвор на НС1. Сместа се разрежда с 11 етилацетат и слоевете се разделят. Органичната фаза се промива със солна луга, суши се над магнезиев сулфат, филтрува се и се концентрира под вакуум, за да се получат 160 g жълто масло. Продуктът се суспендира в 200 ml 3 N водна НС1 и разтворът се кипи в продължение на 24 h. Охладеният разтвор се разрежда с 500 ml етилацетат и сместа се алкализира с концентриран NH₄OH. Слоевете се разделят и органичната фаза се промива със солна луга, суши се над магнезиев сулфат, филтрува се и се концентрира под вакуум. Хроматографира се върху 350 g силикагел, като за елуент се използва 15 % етилацетат в хексан. Хроматографираният продукт се прекристализира от врящ хексан, при което се получават 5,5 g чист 1-(2-амино-5хлорофенил) -2-хлоро-2,2-дифлуороетанон като яркожълти кристали с т.т. 55 - 56°С.

Ή NMR (CDC1₃): δ 6,43 (br s, 2H), 6,69 (d, 1H, J = 9,0 Hz), 7,31 (dd, 1H, J = 2,4, 9,0 Hz), 7,80 (d, 1H, J = 2,4 Hz).

Етап B.

(+/ -) 2- (2-амино-5-хлорофенил) -4-фенил-1 хлоро-1,1 -дифлуоро-З-бутин-2-ол

В 100 милилитрова тригьрлена облодънна колба, снабдена с бъркалка, вход за аргон, обратен хладник и преграда, се поставя етинилбензен (2,13 g, 20,83 mmol), сух тетрахидрофуран (50 ml) и етилмагнезиев бромид (6,94 ml от 3,0 М разтвор в етер). Тази смес се оставя да престои 2 h при стайна температура, след което със спринцовка се прибавя разтвор на 1-(2-амино-5-хлорофенил)2-хлоро-2,2-дифлуороетанон (1,00 g, 4,17 mmol) в тетрахидрофуран (6 ml). Полученият оранжев разтвор се бърка при стайна температура 21,5 h. Към реакционната смес се прибавя 1 N НС1 и се разрежда с етилацетат. Разтворът се алкализира с концентриран амоняк и слоевете се разделят. Органичната фаза се промива с вода и със солна луга. Суши се над магнезиев сулфат, филтрува се, разтворителят се отстранява под вакуум и се хроматографира върху силикагел, като се използва 20 %-ен етилацетат в хексан като елуент. Получават се 1,02 g (+/-) 2- (2-амино-5хлорофенил) -4-фенил-1 -хлоро-1,1 -дифлуоро-3бутин-2-ол като белезникава твърда маса.

Ή NMR (CDC1₃): δ 4,42 (br s, 2H), 5,10 (brs, 1H),6,65 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 7,15 (dd, 1H, J = 2,4, 8,5 Hz), 7,38 (m, 3H), 7,55 (m, 2H), 7,70 (d, J = 2,4 Hz).

Етап C.

(+/-)4-(1 -хлоро-1,1 -дифлуорометил) -4- (2фенилетинил) -6-хлоро-1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2-он

В 100 милилитрова облодънна колба, снабдена с обратен хладник, вход за аргон и бъркалка, се поставя (+/-)2-(2-амино-5-хлорофенил)-4фенил-1 -хлоро-1,1 -дифлуоро-З-бутин-2-ол (0,81 g, 2,37 mmol), сух тетрахидрофуран (25 ml) и Ι,Γ-карбонилдиимидазол (1,919 g, 11,84 mmol). Този разтвор се нагрява при 60°С 20 h. Охладената реакционна смес се разрежда с етилацетат и се промива с 0,5 N НС1, с вода и със солна луга. Суши се над магнезиев сулфат, филтрува се и след отделяне на разтворителя под вакуум се получава 890 mg масло. Маслото се хроматографира върху 80 g силикагел, като за елуент се използва 20 % етилацетат в хексан. Хроматографираният продукт се прекристализира от кипящ етилацетат-хексан и дава 507 mg (58 %) (+/-)4(1 -хлоро-1,1 -дифлуорометил) -4- (2-фенилетинил) -

6-хлоро-1,4-дихидро-2Н-3,1-бензоксазин-2-он под формата на бели игли с т.т. 154 - 155°С.

Ή NMR (CDClj): δ 6,89 (d, 1Η, J = 8,4 Hz), 7,35 - 7,48 (m, 4H), 7,56 (m, 2H), 7,64 (br s, Ш), 9,19 (brs, 1H).

Пример 5. (-) 6-хлоро-4-фенилетинил-4трифлуорометил-1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин2-он (съединение 4)

Етап А.

2- (2-амино-5-хлорофенил) -4-фенил-1,1,1трифлуоро-З-бутин-2-ол

Разтвор на литиев фенилацетилид, получен от 4,83 ml фенилацетилен (0,044 mol) и 17,2 ml

2,5 N разтвор на норм.-бутиллитий в хексан (0,043 mol) в 50 ml тетрахидрофуран при -78°С взаимодейства с 11,4 g магнезиев бромид етерат (0,044 mol) в продължение на 5 min. Сместа се оставя да се затопли до -20°С и бъркането в атмосфера на аргон продължава още 30 min. След това сместа се охлажда до -60°С и се прибавя разтвор, съдържащ 2,5 g (0,011 mol) 1-(2амино-5-хлоро)-2,2,2-трифлуорметилетанон, предварително комплексиран с един еквивалент (2,8 g, 0,011 mol) магнезиев бромид етерат в 25 ml тетрахидрофуран. Реакционната смес се бърка при 15° 1 h преди да се охлади до 0°С. Към нея се накапва смес от 30 ml наситен воден разтвор на амониев хлорид и 30 ml вода. Сместа се екстрахира 2 х 100 ml порции от етилов етер, събраните органични фази се промиват със солна луга и се сушат над магнезиев сулфат. След отстраняване на сушилното средство и разтворителите се получават 6 g масло, което се подлага на мигновенна хроматография върху силикагел, като се елуира с 20 % етилацетат в хексан. Получават се 2,5 g 2- (2-амино-5-хлорофенил) -4-фенил-1,1,1 трифлуоро-З-бутин-2-ол.

‘Н NMR (CDClj): δ 4,63 (br s, ЗН), 6,69 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,17 (d,J = 2Hz, 1H), 7,35-7,44 (m, 3H), 7,53 - 7,56 (m, 2H), 7,66 (d, J = 2 Hz, 1H).

FAB MS M + H = 326 m/e.

Етап B.

(±) 6-хлоро-4-фенилетинил-4-трифлуорометил-1,4-дихидро-2Н-3,1-бензоксазин-2-он (съединение 12)

Разтвор на 2-(2-амино-5-хлорофенил)-4фенил-1,1,1 -трифлуоро-З-бутин-2-ол (2,0 g, 6,1 mmol) и 11,0 (12,0 mmol) Ι,Γ-карбонилдиимидазол в 300 ml сух тетрахидрофуран се бърка под аргон при 55°С в продължение на 24 h. Разтворителят се отстранява на ротационен изпарител и остатъкът се разделя между 200 ml етер и 400 ml вода. Слоевете се разделят и водният се екстрахира още веднъж с етер. Събраните етерни екстракти се промиват 2 пъти с по 200 ml 10 % -на лимонена киселина и след това със солна луга. Сушат се над магнезиев сулфат. Филтрува се и се отстранява разтворителят, при което се получават 1,5 g (70 %) от съединението съгласно изобретението в суров вид под формата на масло. При стриване с етер-хексан се получават 875 mg (±)6-хлоро-4фенилетинил-4-трифлуорометил-1,4-дихидро-2Н-

3,1-бензоксазин-2-он като бяла твърда маса, която се стапя частично при 137° и цялостно при 147°С.

Ή NMR (CDClj): δ 6,92 (d, J = 8 Hz, 1Η), 7,30 - 7,49 (m, 4H), 7,58 - 7,65 (m, 3H), 8,99 (s, 1H).

Етап C.

6-хлоро-1 - (1S) -камфаноил-4-фенилетинил-

4-трифлуорометил-1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2-он

Към разтвор, съдържащ (±)6-хлоро-4фенилетинил-4-трифлуорометил-1,4-дихидро-2Н-

3,1-бензоксазин-2-он (2,24 g, 6,37 mmol), 4-диметиламинопиридин (0,10 g, 0,8 mmol) и (-) камфанов киселинен хлорид (2,07 g, 9,55 mmol) в 60 ml сух дихлорметан, при бъркане под аргон и на ледена баня се прибавя триетиламин (2,22 ml, 15,9 mmol). Охладителната баня се отстранява и реакционната смес се оставя да се затопли до стайна температура. След приключване на реакцията, което се установява чрез тънкослойна хроматография (силициев двуокис, 4 % етилацетат в хлороформ), разтворът се разрежда с 200 ml хлороформ и се промива два пъти с 10 %-на лимонена киселина и след това със солна луга. След като се суши над магнезиев сулфат, разтворителят се отстранява на ротационен изпарител и пенообразният остатък се подлага на мигновенна хроматография, като се елуира с хлороформ. Така се получават 575 mg диастереомер 1 на 6-хлоро- (lS)-kaMфаноил-4-фенилетинил-4-трифлуорометил-1,4дихидро-2Н-3,1-бензоксазин-2-он като масло.

Ή NMR (CDC1₃): δ 0,85 (s, ЗН), 1,08 (s, ЗН), 1,22 (s, ЗН), 1,73- 1,85 (m, 1H), 1,92-2,08 (m, 1H), 2,50 - 2,67 (m, 2H), 7,30 - 7,79 (m, 8H).

Следват 1,52 g смесени фракции (диастереомери I и II). При продължаване на елуирането се получават 680 mg от по-бавно придвижващия се диастереомер (II) от съединението от заглавието, който, след стриване със смес от етер/хексан, дава бели игли с т.т. 177 - 178,5°С.

Ή NMR (CDClj): δ 0,83 (s, ЗН), 1,12 (s, ЗН), 1,23 (s, ЗН), 1,73 - 1,86 (m, 1Н), 1,93 2,06 (m, 1H), 2,50 - 2,63 (m, 2H), 7,38 - 7,51 (m, 4H), 7,49 - 7,62 (m, 2H), 7,72 (d, J = 9 Hz, 1H), 7,76 (d, J = 2 Hz, 1H).

Изомерната смес (1,52 g), получена след мигновенната хроматография, се разтваря в 75 ml етер, разтворът се разрежда с 50 ml хексан и след това се поставят зародиши от кристали от изомер II. След бавно изкристализиране се получават допълнително 385 mg от изомер II, който се прекристализира от етер/хексан, за да се получи повече от 96 %-ен диастереометрично чист продукт чрез високоефективна течна хроматография.

Етап Д.

(-) 6-хлоро-4-фенилетинил-4-трифлуорометил-1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2-он

Кристалният диастереомер (II) наб-хлоро-1(15)-камфаноил-4-фенилетинил-4-лрифлуорометил-

1,2-дихидро-4(Н)-3,1-бензоксазин-2-он (53 mg, 0,10 mmol) се разтваря в 8 ml 2-пропанол при 45°С в атмосфера на аргон. Към разтвора се при-бавят 0,27 ml 10 %-ен воден разтвор на калиев карбонат. Бъркането продължава още 10 min, през което време целият изходен продукт е изконсумиран (тънкослойна хроматография, силициев двуокис, 4 % етилацетат в хлороформ). Разтворът се концентрира под вакуум и остатъкът се разтваря в етер. След промиване с 0,1 N НС1 и със солна луга етерният разтвор се суши над магнезиев сулфат, филтрува се и се изпарява под вакуум, за да се получи маслообразен твърд продукт, който се пречиства чрез хроматографиране върху силициев двуокис и елуира с 5 %-ен 2-пропанол в хексан. (-)6-хлоро-4-фенилетинил-4-трифлуорометил-1,4-дихидро-2Н-3,1 бензоксазин-2-он се получава като бели иглести кристали от етер/хексан с т.т. 178 - 179°С; /а/ ,,²⁰ = -92,5° (СНС1₃, с = 0,0012 g, ml¹).

Ή NMR (CDC1₃): δ 6,87 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,37 - 7,50 (m, 4H), 7,56 - 7,63 (m, 3H), 8,60 (s, 1H).

Етап E.

(+) 6-хлоро-4-фенилетинил-4-трифлуорометил-1,4-дихидро-2Н-3,1-бензоксазин-2-он (съединение 3) (+) 6-хлоро-4-фенилетинил-4-трифлуорометил-1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2-он се получава от некристалния продукт от етап С, диастереомер I, по начина на етап Д. Т.т. 178 - 179°С; /а/θ²⁰ - +87,6° (СНС1₃, с - 0,0050 g, ml¹).

Пример 6.

(-) 6-хлоро-4-циклопропилетинил-4-трифлуо-рометил-1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2он (L - 743, 726, съединение 37,2) и (+)6-хлоро4-циклопропилетинил-4-трифлуорометил-1,4дихидро-2Н-3,1-бензоксазин-2-он (L- 743, 725)

Етап А.

2- (2-амино-5-хлорофенил) -4-циклопропил1,1,1 -трифлуоро-З-бутин-2-ол

Разтвор на броммагнезиев циклопропилацетилид се получава от 23 g циклопропилацетилен (0,348 mol) в 250 ml тетрахидрофуран чрез накапване на 116 ml 3,0 М разтвор на етилмагнезиев бромид в етер (0,348 mol) в продължение на 1 h. Разтворът се държи при 0°С 1 h и след това при 40°С още 3 h. Охлажда се до 0°С и към него се прибавя като твърдо вещество 1-(2-амино-5-хлорофенил)-2,2,2трифлуоро-метилетанон (0,0696 mol, 15,56 g), на порции в продължение на 5 min. Реакционната смес се бърка 1,5 h при 0°С. Към реакционната смес се накапват при 0°С 700 ml наситен воден разтвор на амониев хлорид. Сместа се екстрахира 2 х 400 ml етилацетат, събраните органични фази се промиват със солна луга и се сушат над магнезиев сулфат. След отстраняване на магнезиевия сулфат и на разтворителите се получава жълта твърда маса. Тя се прекристализира от кипящ хексан (100 ml краен обем), за да се получат 14,67 g 2-(2-амино-5-хлорофенил)4-циклопропил-1,1,1 -трифлуоро-З-бутин-2-ол. Допълнително количество се получава при концентриране на матерните луги. Т.т. 153 154°С.

Ή NMR (CDC1₃): δ 0,84 (m, 2Η), 0,90 (m, 2Н), 1,38 (m, 1Н), 4,50 (br s, ЗН), 6,69 (d, J =

8,5 Hz, 1H), 7,13 (dd, J = 2,8, 8,5 Hz, 1H), 7,55 (d, J = 2,5 Hz, 1H).

Етап B.

(±) -6-хлоро-4-циклопропилетинил-4-трифлуорометил-1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2он (L - 741, 211)

Разтвор на 2-(2-амино-5-хлорофенил)-4циклопропил-1,1,1-трифлуоро-3-бутин-2-ол (15,00 g, 0,0518 mol) и 41,98 g (0,259 mol) Ι,Γ-карбонилдиимидазол в 250 ml сух тетрахидрофуран се бърка в атмосфера на аргон при 55°С в продължение на 24 h.Разтворителят се отстранява на ротационен изпарител и остатъка се разделя между 500 ml етилацетат и 400 ml вода. Слоевете се разделят и водната фаза се екстрахира още веднъж с етилацетат. Събраните етилацетатни екстракти се промиват с 2 х 200 ml 2 % водна НС1, в наситен воден разтвор на натриев бикарбонат и със солна луга. Суши се над магнезиев сулфат, филтрува се и след отстраняване на разтворителя под вакуум се получават 16,42 g от съединението от заглавието като твърд продукт. След прекристализиране от етилацетат се получават 12,97 g аналитично чист (±)6-хлоро4-циклопропил етинил-4-трифлуорометил-1,4дихидро-2Н-3,1-бензоксазин-2-он като бели кристали с т.т. 178 - 180°С.

Ή NMR (CDCl₃):00,85 (m, 2H), 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, 1H), 6,81 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,37 (dd, J = 2,5, 8,5 Hz, 1H), 7,49 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 8,87 (br s, 1H).

Етап C.

6-хлоро-1-(1) -камфаноил-4-циклопропилетинил-4-трифлуорометил-1,4-дихидро-2Н-3,1 бензоксазин-2-он

Към разтвор, съдържащ (±)6-хлоро-4-циклопропилетинил-4-трифлуоромегил-1,4-дихидро-2Н-

3,1-бензоксазин-2-он (12,97 g, 0,041 mol), 4диметиламинопиридин (1,02 g, 0,0083 mol) и (-) камфанов киселинен хлорид (14,22 g, 0,06556 mol) в 350 ml сух дихлорометан, при бъркане под аргон на ледена баня се прибавя триетиламин (22,84 ml, 0,164 mol). Охладителната баня се отстранява и реакцията се оставя да допротече при стайна температура. След 75 min чрез тънкослойна хроматография се установява приключването на реакцията (силициев двуокис, 4 % етилацетат в хлороформ). Разтворът се разрежда с 500 ml хлороформ и се промива с 10 %на лимо-нена киселина (2 х), с вода (1 х) и със солна луга (1 х). Суши се над магнезиев сулфат, филтрува се и разтворителят се отстранява под вакуум, при което се получава безцветна шуплеста маса. Тя се стрива с 200 ml кипящ хексан. След охлаждане до стайна температура желаният диастереомерен камфанатимид се утаява. Твърдата фаза се филтрува, про-мива се с малко студен хексан и се суши под ваку-ум, за да се получат

7,79 g 6-хлоро-1-(IS)-камфаноил-4-циклопропилетинил-4-трифлуоро- метил-1,4-дихидро-2Н-3,1 бензоксазин-2-он като бели кристали. Т.т. 164 165°С. Чистота, установена чрез високоефективна течна хроматография (ВЕХТ): 99,2 % @ 254 нм.

Ή NMR (CDC1₃): δ 0,77 (s, ЗН), 0,86 0,96 (m, 4Н), 1,08 (s, ЗН), 1,19 (s, ЗН), 1,44 (m,

1Н), 1,76 (m, 1H), 1,95 (m, 1H), 2,51 (m, 2H), 7,42 (dd, J = 2,4, 9,0 Hz, 1H), 7,63 (m, 2H).

Етап Д.

(-)6-хлоро-4-циклопропилетинил-4-трифлуорометил-1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2он (L - 743, 726, съединение 37,2)

6-хлоро-1 - (I) -камфаноил-4-циклопропилетинил-4-трифлуорометил-1,2-дихидро-4(Н)-3,1бензоксазин-2-он (7,50 g, 0,001512 mol) се разтваря в 150 ml норм.-бутанол при 60°С в атмосфера на аргон. Към този разтвор се прибавят 10 ml I N НС1. Разтворът се държи при 60°С 72 h. Сместа се неутрализира с воден натриев бикарбонат и норм.-бутанол се отстранява под вакуум. Остатъкът се разтваря в 150 ml тетрахидрофуран и се взаимодейства с 50 ml 2 N LiOH в продължение на 3 h при стайна температура. Тази смес се разрежда с етилацетат и се промива с две порции вода и с една порция солна луга. Су-ши се над магнезиев сулфат, филтрува се и под вакуум се отстранява разтворителя, при което се получава бяла твърда маса. Тя се прекристализира от горещ хексан, за да даде 3,43 g (-) 6хлоро-4-циклопропилетинил-4-трифлуорометил1,4-дихидро-2Н-3,1-бензоксазин-2-он като бели кристали с т.т. 131 - 132°С; /01/^ = -84,7° (СНС1₃, с = 0,005 g, ml¹).

Ή NMR (CDC1₃): δ 0,85 (m, 2H), 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, 1H), 6,81 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,37 (dd, J = 2,5, 8,5 Hz, 1H), 7,49 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 8,87 (brs, 1H).

Етап E.

(+)6-хлоро-4-циклопропилетинил-4-трифлуорометил-1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2он (L - 743, 725)

Матерните луги от етапа С по-горе се пречистват чрез колонна хроматография върху силикагел, като за елуент се използва 10 %-ен етилацетат в хексан. Чистият, нежелан диастереомер (безцветна шуплеста маса) се хидролизира по начина, описан в етап Д. Енантиомерният бензоксазинон, (+) 6-хлоро-4-циклопропилетинил-4трифлуорометил-1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин2-он се получава като бели кристали с т.т. 131 132°С; /а/,,²⁰ = +84,4« СНС1₃, с = 0,005 g, ml¹.

Ή NMR (CDCl₃): δ 0,85 (m, 2H), 0,94 (m, 2H), 1,40 (m, 1H), 6,81 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,37 (dd, J = 2,5 Hz, 1H), 7,49 (d, J = 2,5 Hz, 1H),

8,87 (brs, 1H).

Опит за обратна транскриптаза

При изследването се измерва инкорпорирането на тритииран деоксигуанозин монофосфат чрез рекомбинантна HIV обратна транскриптаза (HIV RT_r) (или друга RT) в киселинно утаяваща се сДНК при К_т стойности на dGTP и поли г(С).oligo d(G) ₁₂₁₈. Инхибиторите от настоящото изобретение инхибират това инкорпориране.

Изпитанията се провеждат в 55 мМ трие (pH 8,2) - 30 мМ KCI - 30 мМ MgClj-iMM дитиотреитол - 20 mkg rC:dG₁₂₁₈ за ml - 8 мМ /³Н/ dGTP (New England Nuclear) - 0,01 % Тритон X - 100 - 50 мМ етиленгликол-бис (β-амино-етилетер) -Ν,Ν,Ν’,Ν’тетраоцетна киселина (EGTA) - 1 mg говежди серумен албумин в ml. След 60 min инкубиране при 37°С киселинноутаяващият се продукт се събира върху стъклен фибърен филтър при използването на полуавтоматичен клетъчен събирач. Бактериалните клетъчни екстракти, съдържащи RT, се разреждат в линеарен порядък съгласно опита и активността се определя в присъствие и в отсъствие на инхибитор. Пречистена HIV-I RT хетеродимер, получена в E.coli, също се използва за контрола. Резултатите са дадени като концентрация на инхибитора, която дава 50 %-но инхибиране (1С_Ятегловно), в наномола за литър.

При двойно мутантно изпитание (dj в опита се използва A17RT. A17RT е резистентна към различни аминопиридони, както е описано от Nunberg, J. Н. et al., J. Virol. 65, 4887 (1991). Резултатите се измерват като IC_J0 d_m в наномола за литър.

Изпитания за разпространение в клетка

Инхибиране разпространението на HIV в клетъчна култура се измерва съгласно Nunberg, J. Н. et al., J. Virol. 65, 4887 (1991). При това изпитание МТ-4 Т-лимфоидни клетки се инфектират с HIV-Ι (див тип, освен ако е казано друго) чрез използване на предопределен инокулум и културите се инкубират в продължение на 24 h. След това време 1 % от клетките са позитивни при индиректна имунофлуоресценция. След това клетките се промиват интензивно и се разпределят в културални панички с 96 кладенчета. Към кладенчетата се прибавят серийни двукратни разреждания на инхибитора и култивирането продължава още три дни. На четвъртия ден след инфектирането 100 % от клетките в контролните култури се инфектират. Кумулирането на HIV-Ι р24 е в директна корелация с разпространението на вируса. Инхибиращата концентрация на клетъчната култура се определя като тази инхибираща концентрация в наномола за литър, която намалява разпространението на инфекцията най-малко с 95 %, или ^С1С«·

РЕЗУЛТАТИ ЗА СЪЕДИНЕНИЕ 37.2

А. Изпитания за обратна транскриптаза и разпространение в клетка

WT KI03N* У181С DM НТ-2

1С₅₀(мкМ) 0.0020.030

С1С₉₅(мкМ) <0.006(11=2)0.100

0.008 0.085

0.025 0.400

80.8

В. Фармакологични данни _т'

Резултат: 1мг кг 210мин

МГ кг“¹ P.O. (methocel)BC_max-4.4MKM@24l ^С24Ь⁼¹*^1мкМ

Ο.В.»0.55 (A.U.C.)

Протеиново свързване: 98,0 % нормална човешка плазма (ВЕХТ метод) ♦ Мутантите K103N и Y18IC са резистентни по отношение на лекарства HIV-Ι обратни транскриптази. DM е двойния мутант, както е обсъден в изпитанията за обратна транскриптаза. RTK-2 е обратната транскриптаза на HIV-2.

Синергитични ефекти

A. Получаване на суспензия от HIVинфектирани МТ-4 клетки

МТ клетки се инфектират в деня 0 в концентрация 250 000 за ml с 1:1000 разреждане на HIV-Ι щам ШЬ серия (крайно 125 pgp 24/ml; достатъчно, за да даде < 1 % заразени клетки в ден първи и 25 - 100 % в ден четвърти). Клетките се заразяват и отглеждат в следната среда: RPMI 1640 (Wittaker BioProd.), 10 % инактивиран зародишен говежди серум, 4 мМ глутамин (Gibco Labs) и 1:100 пеницилин-стрептомицин (Gibco Labs).

Сместа се инкубира една нощ при 37“С в атмосфера на 5 % СО₂.

B. Въздействие с инхибитори

Подготвя се матрица от наномоларни концентрации от двойни комбинации (виж. таблица S). В първия ден се прибавят аликвотни части от 125 mol от инхибиторите към равни обеми от инфектирани с HIV МТ-4 клетки (50 000 за кладенче) в 96 - кладенчева микротитърна клетъчна плочка. Инкубирането продължава 3 дни при 37°С в 5 %-на СО₂ атмосфера.

C. Измерване разпространението на вируса Като се използва многоканална пипетка утаените клетки се суспендират отново и 125 mol се събират в отделна микротитърна плочка. Течността се изпитва за HIV р24 антиген.

Концентрацията на HIV р24 се измерва чрез ензимно имуноизпитване както следва: Аликвотни части от р24 антиген, който ще се измерва, се поставят в микрокладенчета, покрити с моноклонално антитяло, специфично за HIV сърцевинен антиген. Микрокладенчетата се промиват в тази точка и в други подходящи етапи, които следват. След това се прибавя биотинилирано HTV-специфично антитяло, последвано от конюгирана стрепавидин - хрян пероксидаза. Появява се цветна реакция в резултат на прибавения водороден прекис и тетраметилбензидин субстрат. Интензитета на оцветяването е пропорционален на концентрацията на HIV р24 антигена.

Изчисляване степента на синергизъм

Намерено бе, че двойните комбинации от инхибитори (виж таблица 5) проявяват значително ускорена инхибиция на разпространението на вируса в сравнение с отделните инхибитори, приложени самостоятелно или в сравнение с чисто сумарното инхибиране на всеки от тях. Така например двойната комбинация от 726 и AZT бе намерено, че проявява значително ускорено инхибиране на разпространението на вируса в сравнение с 726 самостоятелно или AZT самостоятелно или в сравнение на сумата от инхибирането на 726 и AZT.

Тези данни се получават по следния начин: Фракционните инхибиращи концентрации (FIC) се изчисляват съгласно Elion, et al., J.

Biol. Chem., 208, 477 (1954). Минималната сума от FICS, която представлява максималния синергизъм, се определя за различни двойни комбинации. Алтернативно се изчислява и средната сума от FICS, което представлява средния синергизъм. Виж таблица S. Тези резултати показват съществен синергизъм при инхибиране разпространението на вируса. Колкото е по-малко числото, толкова е по-голям синергизма.

Таблица S.

Двойни комбинации	Среден синергизъм
726 + ddl	0,81
726 + AZT	0,62
726 + 524	0,65
726 + 524 + AZT

524 е L - 735, 524. Другите съединения са описани в таблица С по-горе.

Посоченото описание дава представа за принципите на изобретението, като примерите имат за цел да го илюстрират. Трябва да се подразбира, че в него се включват всички обичайни вариации, адаптации или модификации, които попадат в обхвата на следващите претенции.

Claims

1. Съединение с формула в която X означава халоген,

X¹ означава трихалогенметил или пентахалогенетил;

Z означава О;

R означава:

(a) С, ₈алкил, незаместен или заместен с А и А представлява халоген, С_{3 6}циклоалкил, CN, хидрокси, С, ₄алкокси, С₂_,алкинил-С, ₄алкокси, арилокси, С, ₄алкилкарбонил, нитро, ди(С₁₂алкил)амино, С_1чалкиламино-С₁₂алкил, хетероцикъл или арилтио-група (b) С_{2 4}алкенил, незаместена или заместена с (I) А или (II) арил, незаместен или заместен с А (c) С_{2 3}-алкинил, незаместен или заместен с

(I) А или (II) арил, незаместен или заместен с А или (d) С_{3 4}циклоалкил, незаместен или заместен с (I) А или (И) арил, незаместен или заместен с А, или тяхна фармацевтично приемлива сал.

2. Фармацевтичен състав, приложим за инхибиране HIV обратна транскрипция, съдържащ ефективно количество от съединение с формула II и фармацевтично приемлив носител, в която

X означава халоген

X^I означава трихалогенметил, пентахалогенетил, С_{2 5}алкил, С_{2 5}алкинил, С_{3 5}циклоалкил или арил;

Z означава О или S

R означава (a) С, ₈алкил, незаместен или заместен с А и А е халоген, С_{3 6}циклоалкил, CN, хидрокси, С_{[ 4}алкокси, С_{2 4}алкинил-С, ₄алкокси, арилокси, С, ₄алкилкарбонил, нитро, ди(С₁₂алкил)амино, С_]Чалкиламино-С₁₂алкил, хетероцикъл или арилтиогрупа;

(c) С_{2 5}алкинил, незаместен или заместен с (I) А или (II) арил, незаместен или заместен с А или (d) С_{3 4}циклоалкил, незаместен или заместен с (I) А или (II) арил, незаместен или заместен с А, или тяхна фармацевтично приемлива сол.

3. Съединение съгласно претенция 1, което представлява (-)6-хлоро-4-циклопропилетинил32

4-трифлуорометил-1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2-он;

(-) 6-хлоро-4-фенилетинил-4-трифлуорометил-1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2-он, (+/-) 6-хлоро-4- (2-цианофенил) етинил-4(1,1,1 -трифлуорометил) -1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2-он, (+/-) 4- (1 -хлоро-1,1 -дифлуорометил) -4- (2фенилетинил) -6-хлоро-1,4-дихидро-2Н-3,1-бензоксазин-2-он или (+/-) 4- (2- [диметиламинометил] етинил) -4трифлуорометил-6-хлоро-1,4-дихидро-2Н-3,1 -бензоксазин-2-он или тяхна фармацевтично приемлива сол.

4. Метод за инхибиране на HIV обратна транскриптаза, състоящ се в прилагане към бозайник на ефективно количество от съединение с формула I или II или от претенция 3.

5. Метод за предпазване от инфекция с HIV или за лечение на инфекция от СПИН или ARC, състоящ се в прилагане към бозайник на ефективно количество от съединение с формула I или II или съгласно претенция 3.

6. Фармацевтичен състав, приложим за инхибиране на HIV реверсивна транкрептаза, съдържащ ефективно количество от съединение съгласно всяка от претенциите 1, 2 или 3 и фармацевтично приемлив носител.

7. Фармацевтичен състав, приложим за предпазване или лечение на инфекция от HIV или за лечение на СПИН или ARC, съдържащ ефективно количество от съединение с формула I съгласно претенция 1 или с формула II, съгласно претенция 2 или съгласно претенция 3 и фармацевтично приемлив носител.

8. Комбинация на съединение с формула I от претенция 1 или с формула II съгласно претенция 2 и нуклеозиден аналог, притежаващ биологическа активност срещу HIV обратна транскриптаза.

5

9. Синергитична комбинация от противовирусни съединения срещу СПИН, които са L-743, 726 и L-735,524 [N-2(R)-хидрокси-1 (З)-инданил)2 (R) -фенилметил-4- (S) -хидрокси-5- (1-(4-(3пиридилметил) -2 (S) -Ν’- (трет.-бутилкарбоксами10 до) -пиперазинил)) -пентанамид или негова фармацевтично приемлива сол] и евентуално един или повече HTV инхибитори, подбрани от групата, състояща се от L-697,661 [3/([4,7-дихлоро-1,3бензоксазол-2-ил) -метил] амино) -5-етил-6-метил15 пиридин-2 (1Н) -он], AZT, ddl или ddC.

10. Синергитична комбинация от противовирусни съединения срещу СПИН, каквито са L-743,726 и един или повече HIV инхибитори, подбрани от групата, състояща се от L-697,661,

20 AZT, ddl или ddC.

11. Метод за синтезиране на (-)б-хлоро4-циклопропилетинил-4-трифлуорометил-1,4-дихидро-2Н-3,1-бензоксазин-2-он (L-743,726), състоящ се в етапите:

25 (а) осигуряване на количество от (+/-)6хлоро-4-циклопропилетинил-4-трифлуорометил1,4-дихидро-2Н-3,1-бензоксазин-2-он (L-741,211);

(b) кондензиране на съединенията от етап (а) с разтварящо средство;

30 (с) разделяне на получените диастереомери;

(d) отстраняване на разтварящото средство, което е модифицирано, за да се получи желаното съединение.

35 12. Метод съгласно претенция 2, при който разтварящото средство е (-) камфанил хлорид.