PT677116E - Processo para a producao de imuno-supressores e uma nova especie microbiana a ser utilizada para esse fim - Google Patents

Description

Descrição “Processo para a produção de imuno-supressores e uma nova espécie microbiana a ser utilizada para esse fim”

Campo da invenção A presente invenção descreve, uma nova espécie microbiana de Tolypocladium e um processo para a produção de ciclosporinas, especialmente ciclosponna A, mediante fermentação aèróbica de uma estirpe dessa espécie.

Descrição da técnicá anterior

As ciclosporinas são undecapéptidos cíclicos neutros, altamente lipófilos, com uma composição de ammo-ácidos variável. Preseritemente, conhecem-se 25 formas diferentes de ciclosporina (A-Z). Provou-se que a forma A era a mais valiosa do ponto de vista clínico (Rehácek Dexiu, Process Biochem, 1991, 26, 157-166).

Ongnalmente, isolou-se a ciclosponna nos anos 70 a partir das estirpes fúngicas de Cylindrocarpon lucidum Booth e Tolypocladium inflatum Gams, as quais foram isoladas a partir de amostras de solo dos Estados Unidos da Aménca e da Noruega. A estirpe de produção de Tolypocladium inflatum (NRRL 8044, ATCC 34921) foi pnmeiramente identificada como sendo a estirpe de Trichoderma polysporum (Link ex Pers) Rifai. A referida estirpe e as substâncias antibióticas produzidas a partir da mesma eneontram-se descritas, por exemplo, na patente de invenção finlandesa N° 54606. As condições de crescimento e a taxonomia da estirpe encontram-se igualmehte referidas no artigo de Dreyfuss et al.. Eur. J. Appl. Microbiol., 1976, 3,125 ' A estirpe mencionada anteriormente de Cylindrocarpon lucidum Booth (NRRL 5760) encontra-se descrita na patente de invenção finlandesa N° 52851. ?

Outras estirpes microbianas que produzem ciclosporinas encontradas na literatura incluem, por exemplo, a estirpe de Tolypocladium inflatum SF 136 descrita na patente de invenção alemã N.° 298276 que produz pelo menos ciclosporina A e a Tolypocladium variam descrita nò pedido de patente de invenção britânica N.° 2 227 489 que produz, entre outros, uma mistura de ciclosporinas A, B e C. No pedido de patente de invenção japonesa N° 826 3093 A2, descrevem-se duas estirpes de Fasarium as quais são mencionadas como produtoras de ciclosporina.

No seu artigo de revisão Isacc et al. (Antimicr. Agents Chemoter., 1990, 34, 121-127) comparam a produção de ciclosporina de algumas estirpes conhecidas de Tolypocladium. A ciclosporina A foi descoberta originalmente como um composto antibiótico antiíungico. O seu efeito excelente como imuno-supressor foi descoberto somente mais tarde (Borel et al , Immunology, 1977, 32, 1017). Deste modo, a ciclosporina é utilizada correntemente no tratamento pós-operatório de operações de transplante e é quase o único fármaco para esta finalidade. Isto foi referido pela primeira vez em associação com os rins (Calne, Lancet, 1978, 2, 1323) e com os transplantes da medula óssea (Powles, Lancet, 1978, 2, 1327). Além das operações de transplante, a ciclosporina pode ser utilizada no tratamento de diversas doenças autoimunes, tais como o reumatismo e a psoríase..

Os processos de produção de ciclosporina A através das estirpes microbianas descritas na literatura apresentam em alguns casos problemas com baixos rendimentos e longos tempos de fermentação. Mesmo que se obtenha um rendimento elevado, a quantidade relativa de ciclosporina A tem sido frequentemente pequena. Demonstrou-se também que as estirpes com rendimentos

mais baixos produzem quantidades relativamente elevadas de ciclosporina A (De--xiu et al., Folia Microbiol., 1991, 36(6) 549-556).

Descrição da invenção A invenção da Requerente foi descobrir uma estirpe de produção que proporcionasse um rendimento máximo dentro de um tempo de fermentação curto e sob condições económicas.

Ao procurar possíveis estirpes de produção, descobriu-se uma estirpe de rendimento extremamente rápido de Tolypocladium que produz quantidades consideráveis de ciclosporina A e quantidades relativamente pequenas de outras formas de ciclosporina, permitindo assim uma purificação mais fácil de ciclosporina A. A referida estirpe foi isolada a partir de uma amostra de solo com origem na Rússia, perto de Moscovo.

Quando se examinou a estirpe descoberta na Holanda pelo Dr. W. Games (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holanda), o micróbio provou ser um representante de uma nova espécie de Tolypocladhim. À estirpe foi atribuído, o código Tolypocladium sp. LeA3 e a estirpe foi depositada de acordo com o tratado de Budapeste no centro de depósito Centraalbureau voor Schimmelcultures, Holanda em 7 de Dezembro de 1992, com o número de depósito CBS 630.92.

Deste modo, a presente invenção diz respeito a uma nova espécie de Tolypocladium que proporciona rapidamente rendimentos elevados e à sua utilização na produção de ciclosporina A clinicamente importante. O género Tolypocladium foi descrito primeiramente por W. Gams no ano de 1971 (W. Gams, Persoonia, 1971, vol. 6, parte 2, 185-191). Très espécies de Tolypocladium, T. inflatum, T. geodes e T. cylindrosponim, são estudadas na 4 publicação. Tipicamente, as espécies de Tolypocladium apresentam um crescimento lento, formam colónias floculosas brancas e uma grande quantidade de esporos.

Comparou-se a estirpe de Tolypocladium sp. LeA3 de acordo com a presente invenção com as espécies mencionadas anteriormente e é claramente diferente das mesmas por ter uma capacidade de formação de esporos mais fraca, cadeias de células inchadas e colónias' mais escuras com tendência para formar um pigmento acastanhado-cinzento no reverso. Por consequência, a referida estirpe de Tolypocladium foi classificada como um representante de uma nova espécie de Tolypocladium. A estirpe de Tolypocladium sp. LeA3 de acordo com a presente inverição pode ser descrita como segue: Uma colónia com a idade de sete dias sobre uma placa de extracto de malte/extracto de levedura tem um diâmetro de cerca de 10 mm e encontra-se coberta um micélio acinzentado que contém alguns esporos. Conidios irregulares e cadeias de células inchadas são típicas da estirpe. Como diferença em relação ao Tolypocladium inflatum, a estirpe de acordo com a presente invenção não usa rafmose mas é susceptível de utilizar galactose. As propriedades de crescimento da estirpe de Tolypocladium sp. LeA3 em comparação com as propriedades de Tolypocladium inflatum e Cylindrocarpon lucidum encontram-se resumidas no Quadro 1.

Qua. I

Ui

Quadro I Uso de fontes de carbono das estirpes microbianas

Fonte de Carbono Estirpe 25 A 51 52 Glicose 4- +· + Glicerol + + + 2KG + + + L-arabinose + + + D-xilose + + + Adonitol + + - Xilitol + . + - Galactose + - + Inositol + + + Sorbitol + + + MDG - - + NAG + + + Celobiose J- -L 1 + Lactose - - -f Mal to se + + + Sacarose + + + Trealose + 1 T MeLeZitose + + + Rafmose - + +

Abreviaturas usadas; 2KG = 2-ceto-D-gluconato, MDG = a-metil-D-glucosido, NAG = N-acetil-D--glucosamma O tempo de cultura foi de 4 d. 25 A = Tolypocladmm sp. LeA3 (CBS 630.92) 51 = Tolypocladmm inflatum Gams (ATCC 34921) 52 = Cylindrocarpon lackhtm Booth

No processo, de acordo com a presente invenção, para a produção. de ciclosporinas, especialmente ciclosporina A. uma estirpe da nova espécie de Tolypocladmm, Tolypocladmm. sp. LeA3. ..depositada pelo Centraalbureau voor Schimmelcultures sob o número de admissão CBS 630.92 é cultivada a uma 6 6

temperatura compreendida entre 20 e 30°C num meio de crescimento, o qual contém fontes de carbono, fontes de azoto e sais minerais e isola-se e purifica-se as ciclosporinas resultantes.

Descrição de formas de realização preferidas

No processo de acordo com a presente invenção utiliza-se a estirpe de Tolypocladhitn sp. LeA3 (CBS 630.92). A estirpe é especialmente preferível para as finalidades da invenção, visto que produz grandes quantidades de ciclosporinas logo após alguns dias de cultura. Além disso, produz uma quantidade proporcionalmente grande de ciclosporma A. Muito embora a estirpe produza também outras formas de ciclosporina (B, C, D e G), a quantidade destas últimas é consideravelmente menor do que a maior pane das estirpes conhecidas (veja-se Isaac et al., supra). A estirpe produz a forma C em apenas 10%, a forma B em apenas 4% e as formas D e G em conjunto 2%. Isto é o que se passa, a despeito do facto de a produção da forma A ser elevada, mesmo de 1,5 g/1. A estirpe mencionada anteriormente de acordo com a presente invenção é vantajosa também na medida em que cresce rapidamente e em meios de crescimento muito convencionais: A estirpe é susceptível de utilizar, por exemplo, glicose, sacarose, arabmose, xilose e galactose (ver o Quadro I) como fontes de carbono, bem como diversas fontes de azoto tanto orgânicas como inorgânicas, tais como peptona, farinha de soja, farinha de peixe, farinha de sementes de algodão e (NH4)2S04.

Além destes, os meios nutritivos utilizados contém habitualmente sais minerais, tais como sulfato de magnésio ou di-hidrogeno-fosfato de potássio.

De preferência, podem utilizar-se melaços com preços moderados como 7 fonte de carbono e farinha de soja como fonte de azoto.

Num processo preferido de acordo com a presente invenção, inocula-se um esporo é inoculo de micélio em um meio de pré-cultura, inoculo esse que foi obtido mediante suspensão em água de uma cultura recolhida a partir de uma rampa de Tolypocladiiim sp. LeA3. A cultura é pré-cultivada durante 2-4 dias e inocula-se o meio de .produção com o caldo de pré-cultura. Realiza-se a cultura actual a uma temperatura compreendida entre cerca de 20 e cerca de 30°C, de preferência entre 25 e 30°C, particularmente à temperatura de 25°C durante 5-7 dias (isto é 120 a 168 horas), mantendo o pH da cultura compreendido entre 3 e 8, de preferência entre 4 e 7 mediante adição de NaOH 1M ou HC1 1M, se necessário.

Mantêm-se as condições àeróbicas mediante arejamento por exemplo com 1 vol/min (um volume de ar q.ue corresponde ao da cultura por minuto), e agita-se a cultura.com a velocidade de 200 - 350 rpm.

Durante a fermentação seguem-se as quantidades de ciclosporina mediante cromatògrafia líquida de alta resolução (HPLC), tal como foi descrito, por exemplo, por Isaac et al.: (supra). Prossegue-se a fermentação até se ter formado uma quantidade máxima de ciclosporinas. A estirpe de acordo com a presente invenção produz ciclosporina A até 1500 mg/1 dentro de seis dias, sendo a proporção relativa de ciclosporina A de até 84%.

Pode isolar-se a mistura das formas de ciclosporina e purificar-se mediante métodos convencionais Separa-se o micélio a partir do caldo de cultura quer mediante filtração ou centrifugação. Extrai-se as ciclosporinas a partir do micélio com um alcanol inferior, por exemplo metanol, etanol ou isopropanol, de preferência metanol. Concentra-se o extracto e volta a extrair-se um solvente orgânico insolúvel 8 8

em água, por exemplo acetato de butilo ou de etilo, de preferência acetato de etilo. Dissolve-se o resíduo da evaporação do extracto obtido num solvente orgânico apropriado, por exemplo tolueno, e separa-se a ciclosporina A com uma cromatografia de coluna, por exemplo numa coluna de gel de sílica. Analisa-se as fraeções que contêm a ciclosporina A desejada por meio de cromatografia em camada fina, concentra-se ás fraeções e recristaliza-se a ciclosporina A num solvente apropriado ou numa mistura de solventes, por exemplo éter-hexano.

Finalmente,· caracteriza-se o produto obtido, por exemplo, mediante determinação do seu ponto de fusão e da rotação óptica.

Os exemplos seguintes ilustram ainda a invenção.

Exemplo 1

Preparou-se um inoculo de esporo e de micélio a partir de uma rampa de Tolypóçladium sp. LeA3 (CBS 630.92) mediante suspensão da cultura em 5 ml de água estéril. Utilizou-se 1 ml desta suspensão para inocular 50 ml de meio nutritivo (E1) em um balão de erlenmeyer de 250 ml.

A composição do meio de pré-cultura EI glicose 30 g farinha de soja 15 g di-hidrogeno-fosfato de potássio 1 g sulfato de magnésio 0,5 g sulfato de amónio 5g h2o q.b.p. 1 litro

Esterilizou-se a mistura durante 20 minutos à temperatura de 121 °C. íncubou-se a cultura à temperatura de 25°C num agitador (340 rpm) durante 2 dias após o que transferiu 50 ml do caldo de pré-cultura em condições estéreis para 5 litros do meio de produção (T1) em um fermentador de 10 litros. 9

A composição do meio de produção TI melaços 150 g farinha de soja 17 g sulfato de amónio 5g di-hidrogeno-fosfa.to de potássio 1 S sulfato de magnésio 0,5 g H20 q.b.p. 1 litro

Esterilizou-se a mistura durante 20 minutos à temperatura de 121 °C.

Realizou-se a cultura à temperatura de 25°C, arejou-se com 1 vol/min, com . uma velocidade de agitação de 200 rpm. Seguiram-se as quantidades de ciclosporina no meio de cultura no decurso da cultura.com HPLC (Isaac et al., supra). Prosseguiu-se a fermentação durante 6 dias (144 horas), em consequência do que a concentração de ciclosporina A era igual a 1500 mg/l. As concentrações das outras formas foram as seguintes: C: 155 mg/l; B: 62 mg/l. D: 28 mg/l e G: 29 mg/l.

Isolou-se e purifícou-se a mistura das formas de ciclosporina como segue: filtrou-se 4,5 litros do caldo de fermentação e extraiu-se duas vezes a cultura com 1 litros de metanol. Reuniram-se os extractos e concentraram-se sob vazio. A partir do resíduo, extraíram-se duas vezes as ciclosporinas com 300 ml de acetato de etilo. Reuniram-se as soluções de acetato de etilo e secaram-se com sulfato de sódio. Concentrou-se ainda a solução e dissolveu-se o resíduo em 100 ml de tolueno. Aplicou-se a solução a uma coluna (5 cm x 40 cm) carregada com 200 g de gel de sílica (Merk, 0,063 - 0,2 mm) em tolueno. Eluiu-se a coluna com uma mistura que contém tolueno e acetona em uma proporção de 4: í. Recolheram-se as fracções que contêm ciclosporina A pura para tratamento ulterior (análise com placa de CCF, Kieselgel 60 F 254, solução de resolução de hexano/acetona a 1:1, detecção com vapor de iodo). Concentrou-se as fracções reunidas e cristalizou-se a ciclosporina A 10 a partir de éter-hexano. O rendimento foi de 4,5 g. O P.F. da ciclosporina A era 139-140°C e a rotação óptica-189° (0,5 MeOH).

Exemplo 2

Preparou-se o inoculo de esporos e de micélio tal como descrito no Exemplo 1. Utilizou-se 1 ml desta suspensão para inocular 50 ml do meio nutritivo (E2) em um balão de erlenmeyer de 200 ml. A composição de pré-cultura E2 maltose . 40 g sulfato de amónio 5 g farinha de sementes de algodão 10 g di-hidrogeno-fosfato de potássio 1 g ' sulfato de magnésio 0,5 g H20 q.b.p. 1 litro

Esterilizo.u-se a mistura durante 20 minutos à temperatura de 121°C. Incubou-se a cultura à temperatura de 25°C num agitador (230 rpm) durante 2 dias, após o que se transferiram 50 ml da solução de pré-cultura em condições estéreis para 5 litros do meio de produção (T2) em um fermentador de 10 litros. A composição do meio de produção T2 glicos 10 g maltose 10 g sacarose 60 g farinha de sementes de algodão 10 g óleo de sementes de algodão 5 g sulfato de amónio . 5 g di-hidrogeno-fosfato de potássio 1 g sulfato de magnésio 0,5 g H20 q.b.p. 1 litro

Esterilizou-se a mistura durante 20 minutos à temperatura de 121 °C. Realizou-se a cultura à temperatura de 24°C, com arejamento de 1 vol/min, e

velocidade de agitação igual a 200 rpm. Prosseguiu-se a fermentação durante 5 dias (120 horas), em consequência do que a concentração de ciclosporina A era igual a 1410 mg/1. Seguiram-se as quantidades de ciclosporina na solução de cultura no decurso da cultura com HPLC (Isaac et al., supra). As concentrações das outras formas eram.as seguintes: C 135 mg/1, B: 50 mg/1, G e D: 30 mg/1.

Purificou-se a ciclosporina A tal como no Exemplo 1.

Exemplos comparativos

Realizaram-se experiências para comparar nas mesmas condições a velocidade de. produção de ciclosporina A das estirpes fúngicas Tolypocladium injflaium Gams (ATCÇ 34921) e Tolypocladium sp. LeA3 (CBS 630.92) de acordo com a presente invenção.

Exemplo A. Realizou-se a cultura de acordo com Agathos, S. N. et al. (J. Industrial Microbiology .1, 39-48, 1986) em meio SSM utilizando 3% de sorbose (p/v). De acordo com a referência, utilizou-se o tempo de pré-cultura igual a 3 dias e o tempo de cultura de produção igual a 10 dias.

Os resultados foram os seguintes:

Tolypocladium inflatum Gams .

Quantidade de Ciclosporina A Peso seco g/1 - 11,75 - 11,30 9,25 , O crescimento foi bom mas a quantidade de Ciclosporina A produzida manteve-se dificilmente detectável. 12

Tolypocladium sp. LeA3

Quantidade dé Ciclospórina A mg/1 Peso seco g/1 Produção específica mg/g 212,5 8,35 25,45 214,0 7,80 27,44 249,5 6,80 36,69 O valor médio da velocidade de produção específica é de 29,86 mg/g. Exemplo B. Realizou-se uma segunda cultura de acordo com Margaritis, A. et al (Biotech. Letters 11(1-1), 765-768, 1989) em meio de frutose a 3%. De acordo' com os ensinamentos dã referência pré-cultivaram-se as estirpes durante 3+2 dias e realizou-se a cultura de produção durante 8 dias sob controlo do pH.

Os resultados foram os seguintes:

Tolypocladium inflatum Gams

Quantidade de ÇiA mg/1 Peso seco g/1 Produção específica mg/g 107,0 11,80 9,07 116,5 11,60 10,04 81,5 - ' . 11,15 7,31 O valor médio da velocidade de produção específica é de 8,81 mg/g.

Tolypocladium sp. LeA3

Quantidade de Ci A mg/1 Peso seco g/1 Produção específica mg/g 342 10,50 32,57 329 14,95 22,01. 318 17,10 18,60 O valor médio da velocidade de produção específica é de 24,39 mg/g. Exemplo C. Realizou-se uma terceira cultura tal como no Exemplo 1, sendo o tempo de pré-culturá igual a 2 dias e o tempo cultura de produção igual a 6 dias (144 horas).

Qs resultados foram os seguintes:

Tolypocladmm inflatum Gams

Quantidade de CiA mg/1 Peso seco g/1. Produção específica mg/g 74,5 · 59,80 1,25 88,0 63,30 1,39 69,0 61,05 1,13 O valor médio da velocidade de produção específica é de 1,26 mg/g.

Tolypocladiumsp. LeA3

Quantidade de CiA mgd Péso seco g/1 Produção específica mg/g 1393,0 78,00 17,86 1418,0 75,75 18,72 1336,5 75,15 17,78 O valor médio da velocidade de produção específica é de 18,12 mg/g.

Os resultados para cada cultura paralela são dados como um valor médio de três determinações paralelas.

Por consequência, os resultados obtidos mostram claramente que a presente estirpe., deTolypocladmm sp. LeA3 (CBS 630.92) produz em todos os três meios ensaiados quantidades superiores de Ciclosporina A conforme medido em miligramas.de CiA por litro de meio dê cultura. Em especial, a terceira cultura mostra que a estirpe LéA3 de acordo com a presente invenção produz grandes quantidades de Ciclosporina A num curto intervalo de tempo. Tolypocladmm inflatum Gamscrescebem em todos os meios ensaiados, mas a velocidade de produção, de CiA permanece baixa. As velocidades de produção especificas em mg/g de peso seco de biomassa. foram também calculadas para comparação, muito embora este valor não seja de especial significado quando do cálculo da importância de uma estirpe como produtora de Ciclosporina. A LeA3 mostra em cada cultura velocidades de produção específicas maiores do que T. inflatum Gams. 14

Microrganismos depositados O microrganismo seguinte foi depositado de acordo com o Tratado de

Budapeste no centro de depósito Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS,

Oosterstraat 1, P.O. Box 273, NL-3740 AG Baam, Holanda

Microrganismo Número de depósito Data de depósito

Tolypocladium CBS 630 92 7 de Dezembro de 1992 sp. LeA3

Lisboa, 30· de Outubro de 2000

Claims (5)

1. Reivindicações 1. Processo para produzir Ciclosporina A, que compreende a cultura da estirpe de Tolypoctadiam sp. LeA3 depositada no .Centraalbureau. voor Schimmelcultures sob o número de admissão CBS 630.92. num meio nutritivo, até se produzir a referida Ciclosporina A e o isolamento e a purificação da Ciclosporina A produzida.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se conduzir a cultura a uma temperatura de 20-30°C.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido meio nutritivo conter melaços e farinha de soja.
4. 4. Processo de. acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o meio nutritivo conter sacarose e farinha de sementes de algodão.
5. 5. Cultura biologicamente pura da estirpe de Tolypoclaciium sp. LeA3 depositada pelo Centraalbureau voor Schimmelcultures sob o número de admissão CBS 630.92. Lisboa, 30 de Outubro de 2000

   12S0 LISBOA I Resumo “Processo para a produção de imuno-supressores e uma nova espécie microbiana a ser utilizada para esse fim” A presente invenção diz respeito a um processo para a produção de.uma ciclosporiha, em especial ciclosporma A. mediante cultura de uma estirpe de uma nova espécie de Tolypucladium num meio nutritivo que contém fontes de carbono, fontes de azoto e sais minerais e, se assim se desejar, o isolamento e a purificação da ciclosporina resultante. Lisboa, 30 de Outubro de 2000