PL177023B1

PL177023B1 - Sposób wytwarzania cyklosporyny A

Info

Publication number: PL177023B1
Application number: PL93309613A
Authority: PL
Inventors: Juhani Lundell; Anja Kopio; Timo Korpela; Matti Ankelo
Original assignee: Santen Oy
Priority date: 1992-12-30
Filing date: 1993-12-29
Publication date: 1999-09-30
Also published as: EP0677116B1; HK1014035A1; KR100283503B1; PT677116E; HU217683B; FI92334C; AU674723B2; JPH08505059A; CA2152963C; ES2150980T3; FI925940A0; AU5701494A; RU2112807C1; DE69329500D1; CA2152963A1; HUT72702A; KR960700346A; DE69329500T2; WO1994016091A1; HU9501951D0

Abstract

1. Sposób wytwarzania cyklosporyny A, znamienny tym, ze hoduje sie szczep nowego gatunku wybranego z Tolypocladium sp. LeA3 CBS 630.92 i szczepów majacych wszy- stkie cechy identyfikacyjne LeA3 CBS 630.92 w pozywce hodowlanej, az do wytworzenia wspomnianej cyklosporyny A, i w razie potrzeby wytworzona cyklosporyne A izoluje sie i oczyszcza. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania cyklosporyny A.

Cyklosporyny są obojętnymi, silnie lipofilowymi, cyklicznymi undekapeptydami o zmiennym składzie aminokwasowym. Obecnie znanych jest 25 różnych form cyklosporyn (A-Z). Wykazano, że najcenniejsza klinicznie jest forma A (Rehacek i Dex-iu, Process Biochem. 1991, 26,157-166).

Pierwotnie cyklosporynę wydzielono w latach 70-tych ze szczepów grzybów Cylindrocarpon lucidum Booth i Tolypocladium inflatum Gams, które wyizolowano z próbek gleby z USA i Norwegii. Pierwszy szczep produkcyjny Tolypocladium inflatum (NRRL 8044, ATCC 34921) zidentyfikowano najpierw jako szczep Trichoderma polysporum (Link ex Pers) Rifai. Wymieniony szczep i wytwarzane przez niego substancje antybiotykowe są ujawnione na przykład w opisie patentowym fińskim nr 54606. Warunki wzrostu i taksonomia szczepu zostały opisane także w artykule Dreyfussa i współpr. w Eur. J. Appl. Microbiol., 1976, 3,125.

Wymieniony wyżej szczep Cylindrocarpon lucidum (NRRL5760) ujawniono w opisie patentowym fińskim 52851. Do innych szczepów mikroorganizmów wytwarzających cyklosporyny znanych z literatury należą na przykład szczep Tolypocladium inflatum SF 136 ujawniony w opisie patentowym NRD 298276, wytwarzający co najmniej cyklosporynę A i Tolypocladium varium, ujawniony w brytyjskim zgłoszeniu patentowym nr 2227489, wytwarzający mieszaninę cyklosporyn A, B i C. W japońskim zgłoszeniu nr 8263093 A2 ujawniono dwa szczepy Fusarium, które wymieniono jako wytwarzające cyklosporynę.

Isaac i współpr. w artykule przeglądowym (Antimicrob. Agents Chemother., 1990, 34, 121-127) porównują wytwarzanie cyklosporyn przez niektóre znane szczepy Tolypocladium.

Cyklosporynę A odkryto pierwotnie jako przeciwgrzybiczy związek antybiotykowy. Jej doskonałe działanie jako immunosupresanta odkryto dopiero później (Borel i współpr., Immunology, 1977, 32, 1017). Tak więc cyklosporyna jest obecnie stosowana w pooperacyjnym postępowaniu po transplantacjach i jest prawie jedynym lekiem stosowanym do tego celu. Zostało to po raz pierwszy opisane w związku z transplantacjami nerek (Calne, Lancet, 1978, 2, 1323) i szpiku kostnego (Powles, Lancet, 1978, 2, 1327). Poza operacjami transplantacji cyklosporyna może być stosowana w leczeniu różnych chorób autoimmunologicznych, takich jak na przykład reumatyzm i łuszczyca.

1ΊΊ 023

Ujawnione w literaturze sposoby wytwarzania cyklosporyny A przez szczepy bakteryjne stwarzają w niektórych przypadkach problemy związane z niską wydajnością i długimi czasami fermentacji. Nawet jeśli uzyskuje się wysoką wydajność, to względna ilość cyklosporyny A jest często mała. Wykazano także, że szczepy o niższej wydajności wytwarzają relatywnie dużo cyklosporyny A (De-xiu i współpr., Folia Microbiol., 1991, 36(6), 549-556).

Celem wynalazku jest znalezienie szczepu produkcyjnego, który dawałby maksymalną wydajność przy krótkim czasie fermentacji i w ekonomicznych warunkach.

Podczas badań przesiewowych potencjalnych szczepów produkcyjnych znaleziono wyjątkowo szybko produkujący szczep Tolypocladium, który wytwarza znaczne ilości cyklosporyny A i relatywnie małe ilości innych form cyklosporyny, co pozwala na łatwiejsze oczyszczanie cyklosporyny A. Wspomniany szczep wyizolowano z próbki gleby pochodzącej z Rosji, z okolic Moskwy.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania cyklosporyny A, polegający na tym, że hoduje się szczep nowego gatunku wybranego z Tolypocladium sp. LeA3 CBS 630.92 i szczepów mających wszystkie cechy identyfikacyjne LeA3 CBS 630.92 w pożywce hodowlanej, aż do wytworzenia wspomnianej cyklosporyny A, i w razie potrzeby wytworzoną cyklosporynę A izoluje się i oczyszcza.

Korzystnie hodowlę prowadzi się tlenowo w temperaturze 20-30°C. Również korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się szczep Tolypocladium sp. LeA3 CBS 630.92.

Korzystnie, cyklosporynę A wytwarza się stosując pożywkę hodowlaną zawierającą sacharozę i mączkę bawełnianą, równie korzystnie melasę i mączkę sojową.

Również korzystnie, cyklosporynę A wytwarza się stosując pożywkę hodowlaną zawierającą melasę i mączkę sojową.

Podczas badania szczepu w Holandii przez dr W. Gamsa (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holandia) okazało się, że mikroorganizm jest reprezentantem nowego gatunku Tolypocladium. Szczepowi nadano kod Tolypocladium sp. LeA3 i oddano go do depozytu zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim do Centraalbureau voor Schimmelcultures w Holandii dnia 7 grudnia 1992 pod numerem depozytu CBS 630.92.

Tak więc wynalazek dotyczy nowego gatunku Tolypocladium, który daje bardzo szybko wysokie wydajności, oraz jego zastosowania do wytwarzania ważnej klinicznie cyklosporyny A.

Rodzaj Tolypocladium został ujawniony po raz pierwszy przez W. Gamsa w roku 1971 (W. Gams, Persoonia, 1971, wol. 6, część 2, strony 185-191). W publikacji tej badano trzy gatunki Tolypocladium: T. inflatum, T. geodes i T. cylindrosporum.

Typowo gatunki Tolypocladium charakteryzują się powolnym wzrostem, tworzą białe, kłaczkowate kolonie i duże ilości spor.

Czysta biologicznie kultura szczepu Tolypocladium sp. LeA3 według wynalazku porównano z wyżej wymienionymi gatunkami i okazało się, że różni się on od nich wyraźnie tym, że posiada słabszą zdolność tworzenia spor, spęczniałe łańcuchy komórek i ciemniejsze kolonie mające tendencję do tworzenia brązowawo-szarego pigmentu na odwrocie. W konsekwencji wspomniany szczep Tolypocladium sklasyfikowano jako reprezentanta nowego gatunku Tolypocladium.

Szczep Tolypocladium sp. LeA3 może być opisany w sposób następujący: Siedmiodniowa kolonia na płytce ekstrakt słodowy/ekstrakt z drożdży ma średnicę około 10 mm i jest pokryta szarawą grzybnią, która zawiera kilka spor. Typowe dla szczepu są nieregularne konidia i spęczniałe łańcuchy komórek. W odróżnieniu od Tolypocladium inflatum szczep według wynalazku nie zużywa rafinozy, natomiast jest zdolny do zużywania galaktozy. Właściwości wzrostowe szczepu Tolypocladium sp. LeA3 w porównaniu z właściwościami Tolypocladium inflatum i Cylindrocarpon lucidum są zestawione w Tabeli I.

177 023

Tabela I

Zużywanie źródeł węgla przez szczepy mikroorganizmów	Szczep
Źródło węgla	25A	51	52
Glukoza	+	+	+
Gliceryna	+	+	+
2KG	+	+	+
L-arabinoza	+	+	+
D-ksyloza	+	+	+
Adonitol	+	+	-
Ksylitol	+	+	-
Galaktoza	+	-	+
Inozytol	+	+	+
Sorbitol	+	+	+
MDG	-	-	+
NAG	+	+	+
Cellobioza	+	+	+
Laktoza	-	-	+
Maltoza	+	+	+
Sacharoza	+	+	+
Trehaloza	+	+	+
MeLeZitose	+	+	+
Rafinoza	-	+	+

Stosowane skróty:

2KG = 2-keto-D-glukonian,

MDG = α-metylo-D-glukozyd,

NAGN = N-acetylo-D-glukozamina

Czas hodowli 4 dni

25A = Tolypocladium sp. LeA3 (CBS 630.92) = Tolypocladium inflatum Gams (ATCC 34921) = Cylindrocarpon lucidum Booth

177 023

W sposobie wytwarzania cyklosporyny A, szczep nowego gatunku Tolypocladium wybrany z Tolypocladium sp. LeA3 CBS 630.92 i szczepów mających wszystkie cechy identyfikacyjne LeA3 CBS 630.92 namnaża się tlenowo w temperaturze 20-30°C w pożywce wzrostowej zawierającej źródła węgla, źródła azotu i sole mineralne i w razie potrzeby uzyskane cyklosporyny izoluje się i oczyszcza.

W korzystnej postaci sposobu według wynalazku stosuje się szczep Tolypocladium sp. LeA3 CBS 630.92. Szczep jest szczególnie korzystny do celów wynalazku, ponieważ wytwarza on duże ilości cyklosporyny już po kilku dniach hodowli. Ponadto wytwarza on proporcjonalnie duże ilości cyklosporyny A. Chociaż szczep wytwarza także inne formy cyklosporyny (B, C, D i G), to ich ilość jest znacznie mniejsza niż w przypadku większości znanych szczepów (patrz Isaac i współpr, supra). Szczep wytwarza tylko 10% formy C, 4% formy B i form D i G łącznie 2%). Jest tak mimo faktu, że produkcja formy A jest wysoka, nawet 1,5 g/l.

Wymieniony wyżej szczep jest korzystny także z tego względu, że namnaża się szybko i w bardzo typowych pożywkach. Szczep jest zdolny do zużywania jako źródła węgla na przykład glukozy, sacharozy, arabinozy, ksylozy i galaktozy (patrz Tabela I), jak również kilku zarówno organicznych jak i nieorganicznych źródeł azotu, takich jak pepton, mączka sojowa, mączka rybna, mączka bawełniana i (NH4)2SO4.

Ponadto pożywka zawiera zwykle sole mineralne, takie jak siarczan magnezu lub diwodorofosforan potasu.

Korzystnie jako źródło węgla może być stosowana dość tania melasa, a jako źródło azotu mączka sojowa.

W korzystnej postaci sposobu według wynalazku inokulum spor i grzybni otrzymane przez zawieszenie w wodzie hodowli zebranej z fazy ustalonej Tolypocladium sp. LeA3 zaszczepia się na pożywce przedhodowlanej. Hodowlę namnaża się wstępnie przez 2-4 dni i zaszczepia się podłoże produkcyjne brzeczką przedhodowlaną. Faktyczną hodowlę prowadzi się w temperaturze około 20 do około 30°C, korzystnie 25-30°C, zwłaszcza 25°C przez 5-7 dni (to jest 120 do 168 godzin), utrzymując pH hodowli między 3 a 8, korzystnie między 4 a 7, przez dodanie w razie potrzeby 1M NaOH lub 1M NaCl.

Warunki tlenowe utrzymuje się przez napowietrzanie na przykład 1 objętością/min (objętość powietrza odpowiadająca objętości hodowli na minutę) i mieszanie hodowli z szybkością 200-350 rpm.

Podczas fermentacji ilości cyklosporyny śledzi się za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), na przykład tak jak opisali Isaac i współpr (supra). Fermentację kontynuuje się aż do utworzenia maksymalnej ilości cyklosporyn. Szczep według wynalazku wytwarza cyklosporynę A w ilości do 1500 mg/l w ciągu sześciu dni, przy czym względny udział cyklosporyny A wynosi do 84%.

Mieszanina form cyklosporyn może być wyizolowana i oczyszczona typowymi metodami. Grzybnię oddziela się od brzeczki hodowlanej przez filtrację albo wirowanie. Cyklosporyny ekstrahuje się z grzybni niższym alkoholem, na przykład metanolem, etanolem lub izopropanolem, korzystnie metanolem. Ekstrakt zatęża się i ponownie ekstrahuje rozpuszczalnym w wodzie rozpuszczalnikiem organicznym, na przykład octanem butylu lub etylu, korzystnie octanem etylu. Pozostałość po odparowaniu otrzymanego ekstraktu rozpuszcza się w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, na przykład toluenie, i wydziela się cyklosporynę A za pomocą chromatografii kolumnowej, na przykład na żelu krzemionkowym. Frakcje zawierające pożądaną cyklosporynę A analizuje się za pomocą chromatografii cienkowarstwowej, frakcje zatęża się i rekrystalizuje cyklosporynę A z odpowiedniego rozpuszczalnika lub mieszaniny rozpuszczalników, na przykład eter-heksan.

Na końcu otrzymany produkt charakteryzuje się, na przykład przez oznaczenie temperatury topnienia i skręcalności optycznej.

Wynalazek ilustrują dodatkowo poniższe przykłady.

177 023

Przykład 1. Sporządzono inokulum spor i grzybni z Tolypocladium sp. LeA3 (CBS 630.92) przez zawieszenie hodowli w 5 ml jałowej wody. 1 ml tej zawiesiny użyto do zaszczepienia 50 ml pożywki (El) w kolbie Erlenmayera o pojemności 250 ml.

Skład pożywki przedhodowlanej E1 glukoza 30 g mączka sojowa 15 g diwodorofosforan potasu 1 g siarczan magnezu 0,5 g siarczan amonu 5 g

H2O do 1 1

Mieszaninę wyjaławiano przez 20 minut w 121°C.

Hodowlę inkubowano w 25°C na wytrząsarce (340 rpm) przez 2 dni, po czym brzeczkę przedhodowlaną (50 ml) przeniesiono w jałowych warunkach do 51 pożywki produkcyjnej (T1) w fermentorze o pojemności 101.

Skład pożywki produkcyjnej Tl

Melasy 150 g mączka sojowa 17 g siarczan amonu 5 g diwodorofosforan potasu 1 g siarczan magnezu 0,5 g

H2O do 1 1

Mieszaninę wyjaławiano przez 20 minut w 121°C.

Hodowlę prowadzono w 25^OC przy napowietrzaniu 1 obj./min i szybkości mieszania 200 rpm. Ilość cyklosporyny w pożywce hodowlanej monitorowano w trakcie hodowli za pomocą HPLC (Isaac i współpr., supra). Fermentację kontynuowano przez 6 dni (144 godziny), po którym to czasie stężenie cyklosporyny wynosiło 1500 mg/l. Stężenia innych form były następujące: C: 155 mg/l, B: 62 mg/l, D: 28 mg/l i G: 29 mg/i.

Mieszaninę form cyklosporyny wyizolowano i oczyszczono w sposób następujący: 4,5 1 brzeczki fermentacyjnej odsączono i ekstrahowano kulturę dwukrotnie 1 l metanolu. Ekstrakty połączono i zatężono pod próżnią. Z pozostałości ekstrahowano cyklosporynę dwa razy po 300 ml octanu etylu. Roztwory w octanie etylu połączono i wysuszono siarczanem sodu. Roztwór dalej zatężono, a pozostałość rozpuszczono w 100 ml toluenu. Roztwór wprowadzono na kolumnę (5 cm x 40 cm) wypełnioną 200 g żelu krzemionkowego (Merck, 0,063 - 0,2 mm) w toluenie. Kolumnę eluowano mieszaniną toluenu i acetonu w stosunku 4:1. Frakcje zawierające czystą cyklosporynę A zebrano do dalszej obróbki (analiza na płytkach TLC, Kieselgel 60 F 254, roztwór rozwijający heksan/aceton 1:1, detekcja parami jodu). Połączone frakcje zatężono, a cyklosporynę A krystalizowano z mieszaniny eter-heksan. Wydajność wynosiła 4,5 g. T. t. cyklosporyny A była równa 139-140°C, a skręcalność optyczna -189° (0,5 MeOH).

Przykład 2. Inokulum spor i grzybni sporządzono jak w przykładzie 1. 1 ml tej zawiesiny użyto do zaszczepienia 50 ml pożywki hodowlanej (E2) w kolbie erlenmayera o pojemności 200 ml.

Skład pożywki przedhodowlanej E2

maltoza	40 g
siarczan amonu	⁵ g
mączka bawełniana	11 g
diwodorofosforan potasu	1 g
siarczan magnezu	0,5 g
H2O	do 1 l
Mieszaninę wyjaławiano przez 20 minut w 121°C.

177 023

Hodowlę inkubowano w 25°C na wytrząsarce (230 rpm) przez 2 dni, po czym brzeczkę przedhodowlaną (50 ml) przeniesiono w jałowych warunkach do 5 l pożywki produkcyjnej (T2) w fermentorze o pojemności 101.

Skład pożywki produkcyjnej T2 glukoza 10 g maltoza 10 g sacharoza 60 g mączka bawełniana 10 g olej bawełniany 5 g siarczan amonu 5 g diwodorofosforan potasu 1 g siarczan magnezu 0,5 g

H2O do 1 1

Mieszaninę wyjaławiano przez 20 minut w 121°C.

Hodowlę prowadzono w 24°C przy napowietrzaniu 1 obj./min i szybkości mieszania 200 rpm. Fermentację kontynuowano przez 5 dni (120 godzin), po którym to czasie stężenie cyklosporyny wynosiło 1410 mg/l. Dość cyklosporyny w pożywce hodowlanej monitorowano w trakcie hodowli za pomocą HPLC (Isaac i współpr., supra). Stężenia innych form były następujące: C: 135 mg/l, B: 50 mg/l, G i D: 30 mg/l.

Cyklosporynę A oczyszczano jak w przykładzie 1.

Przykłady porównawcze. Przeprowadzono eksperymenty w celu porównania szybkości produkcji cyklosporyny A w jednakowych warunkach przez szczepy grzybów Tolypocladium inflatum Gams (ATCC 34921) i Tolypocladium sp. LeA3 (CBS 630.92) według wynalazku.

Przykład A. Hodowlę prowadzono według Agathosa i współpr. (J. Industrial Microbiology 1, 39-48, 1986) w pożywce SSM, stosując 3% sorbozy (w/v). Zgodnie z odnośnikiem zastosowano czas prekultywacji 3 dni i czas hodowli produkcyjnej 10 dni. Uzyskano następujące rezultaty:

Tolypocladium inflatum Gams

Ilość cyklosporyny A	Sucha masa g/l
-	11,75
-	11,30
-	9,25

Wzrost był dobry, ale cyklosporyna A wytwarzana była w ilości ledwo wykrywalnej.

Tolypocladium sp. LeA3

Ilość cyklosporyny A	Sucha masa	Produkcja specyficzna
mg/ml	g/l	mg/g
212,5	8,35	25,45
214,0	7,80	27,44
249,5	6,80	36,69

Przykład B. Przeprowadzono drugą hodowlę według A. margaritis i współpr. (Biotech. Letters 11(11), 765-7(^6^, 1989) w 3% pożywce fruktozowej. Zgodnie z odnośnikiem hodowlę wstępną prowadzono przez 3+2 dni, a hodowlę produkcyjną przez 8 dni pod kontrolą pH.

Uzyskano następujące rezultaty:

177 023

Tolypocladium inflatum Gams

Ilość cyklosporyny A	Sucha masa	Produkcja specyficzna
mg/ml	g/l	mg/g
107,0	11,80	9,07
116,5	11,60	10,04
81,5	11,15	7,31

Średnia wartość produkcji specyficznej była równa 8,81 mg/g.

Tolypocladium sp. LeA3

Ilość cyklosporyny A	Sucha masa	Produkcja specyficzna
mg/ml	g/l	mg/g
342	10,50	32,57
329	14,95	22,01
318	17,10	18,60

Średnia wartość produkcji specyficznej była równa 24,39 mg/g.

Przykład C. Przeprowadzono trzecią hodowlę w sposób opisany powyżej w przykładzie 1, stosując czas hodowli wstępnej 2 dni i czas hodowli produkcyjnej 6 dni (144 godziny).

Uzyskano następujące rezultaty:

Tolypocladium inflatum Gams

Ilość cyklosporyny A mg/ml	Sucha masa g/l	Produkcja specyficzna mg/g
74,5	59,80	1,25
88,0	63,30	1,39
69,0	61,05	1,13

Średnia wartość produkcji specyficznej była równa 1,26 mg/g.

Tolypocladium sp. LeA3

Ilość cyklosporyny A mg/ml	Sucha masa g/l	Produkcja specyficzna mg/g
1393,0	78,00	17,86
1418,0	75,75	18,72
1336,5	75,15	17,78

Średnia wartość produkcji specyficznej była równa 18,12 mg/g. Wyniki dla każdej z równoległych hodowli podano jako wartość średnią z trzech równoległych oznaczeń.

Uzyskane wyniki pokazują jasno, że szczep Tolypocladium sp. LeA3 (CBS 630.92) według wynalazku wytwarza we wszystkich trzech testowanych pożywkach doskonałe ilości cyklosporyny A, mierzone w miligramach CyA na litr pożywki hodowlanej. Zwłaszcza trzecia hodowla wykazuje, że szczep LeA3 według wynalazku wytwarza duże ilości cyklosporyny A w krótkim czasie. Tolypocladium inflatum Gams wzrasta dobrze we wszystkich badanych pożywkach, ale szybkość wytwarzzmia CyA pozostaje niska. Dla porównania obliczono także szybkości produkcji specyficznej w mg/g suchej biomasy, chociaż wartość ta nie ma specjalnego znaczenia dla oceny ważności szczepu jako producenta cyklosporyny'. LeA3 w każdej hodowli wykazuje wyższe szybkości produkcji specyficznej niż T. inflatum Gams.

177 023

Depozyty mikroorganizmów

Poniższe mikroorganizmy złożono do depozytu zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim w organie depozytowym Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Oosterstraat 1, P. O. Box 273, NL-3740 AG Barn, Holandia

Mikroorganizm	Numer depozytu	Data depozytu
Tolypocladium sp. LeA3	CBS 630.92	7 grudnia 1992

177 023

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz

Cena 2,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania cyklosporyny A, znamienny tym, że hoduje się szczep nowego gatunku wybranego z Tolypocladium sp. LeA3 CBS 630.92 i szczepów mających wszystkie cechy identyfikacyjne LeA3 CBS 630.92 w pożywce hodowlanej, aż do wytworzenia wspomnianej cyklosporyny A, i w razie potrzeby wytworzoną cyklosporynę A izoluje się i oczyszcza.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się tlenowo w temperaturze 20-30°C.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się szczep Tolypocladium sp. LeA3 CBS 630.92.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się pożywkę hodowlaną zawierającą melasę i mączkę sojową.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się pożywkę hodowlaną zawierającą sacharozę i mączkę bawełnianą.